KR20030075871A - 조류분해활성을 갖는 박테리아 아시도보락스템퍼란스(Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘｔｅｍｐｅｒａｎｓ)ＫＦＣＣ 11294 균주 및 이를 이용한조류제거방법 - Google Patents

조류분해활성을 갖는 박테리아 아시도보락스템퍼란스(Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘｔｅｍｐｅｒａｎｓ)ＫＦＣＣ 11294 균주 및 이를 이용한조류제거방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 조류제거에 효과적인 미생물 및 이를 이용한 조류제거방법에 관한 것으로, 조류분해활성을 가지며 서열번호 1을 포함하는, 한국종균협회에 KFCC 11294호로 기탁된 미생물의 성질을 갖는 아시도보락스 템퍼란스(Acidovorax temperans) 균주, 이를 이용한 조류제거방법 및 조류제어용 생물제재(bio-agent)가 제공된다.
본 발명의 균주 아시도보락스 템퍼란스(Acidovorax temperans) KFCC 11294는 조류, 특히 아나베나 실린드리카(Anabaena cylindrica)를 분해하는 활성이 우수하여, 우리나라 호수 또는 강 생태에서 효과적으로 남조류에 의한 환경문제를 해결할 수 있다.

Description

조류분해활성을 갖는 박테리아 아시도보락스 템퍼란스(Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ｔｅｍｐｅｒａｎｓ) ＫＦＣＣ 11294 균주 및 이를 이용한 조류제거방법{ALGAE-LYSING BACTERIA ACIDOVORAX TEMPERANS KFCC 11294 AND THE METHOD FOR REMOVING ALGAE USING THE SAME}
본 발명은 조류제거에 효과적인 미생물 및 이를 이용한 조류제거방법에 관한 것으로, 특히 강이나 하천에서의 녹조현상 발생시 원인생물인 시아노박테리아중아나베나 실린드리카(Anabaena cylindrica)를 제거하는데 효과적인 박테리아 아시도보락스 템퍼란스(Acidovorax temperans) KFCC 11294 및 이를 이용한 조류제거방법에 관한 것이다.
부영양화에 의한 조류, 특히 남조류의 대발생에 의한 폐해 및 생태계에 미치는 영향은 상당히 크다. 우선 시각적인 측면에서, 조류오염에 의한 착색 또는 녹조현상시료(scum)의 형성, 물고기의 집단 폐사 등으로 인한 시각적인 불쾌감 유발 및 이로인한 레크레이션 활동의 저해 등을 들 수 있다. 또한, 생태학적인 면에서, 생태계 파괴로인한 토종 생물의 사멸 또는 서식처 이동, 개체군 변화, 먹이 손실 등을 들 수 있다. 경제적으로도 조류에 의한 오염은 레크레이션 활동 및 여행의 저해로 인한 지역경제의 손실, 농업용수 및 산업용수 부족으로 인한 경제적 손실을 가져다준다. 그리고, 동물 건강에도 해로운 영향을 미칠 수 있으며, 예를들어 남조류 독소에 의한 가축이나 야생 동물의 폐사, 대량 증식한 조류의 사멸시 세균의 분해작용에 의해 산소가 소모됨으로써 수중 용존 산소의 부족으로 인한 물고기 및 수중 생물의 폐사를 들 수 있다. 또한 상수원에 미치는 영향으로서, 남조류 독소 발생, 이취미 생성, 상수처리과정중 여고지 폐쇄 및 불충분한 정수처리시의 응집침전 저해 등이 발생할 수 있다(박혜경, 2000, 환경자료집 2집4장 수질분야-환경관련미생물 21. 녹조현상)
최근 우리나라에서는 상수원으로 사용되는 댐 저수지나 하천에서 시아노박테리아(Cyanobacteria)에 의한 녹조 대발생이 빈번히 발생하고 있어(박혜경, 2000, 환경자료집 2집4장 수질분야-환경관련미생물 21. 녹조현상), 시아노박테리아 제어를 위한 기술 개발이 시급한 실정이다. 이러한 부영양화에 의한 녹조현상(water blooming)을 방지하기위하여 하기 표 1에 나타낸 방법들과 같은 물리 화학적인 방법들이 이용될 수 있으나, 이러한 방법들은 기술적, 경제적 측면에서 제한이 있고생태계 보존차원에서 2차적 오염을 유발할 수 있는 가능성이 있다.
녹조제어 기술 특징
화학약품을 통한 살조 칼륨(potassium salts), 황산구리(copper sulfate), 클로린(chlorine) 등을 이용한 조류의 살조
조류흡착제에 의한 침전법 규산질 다공체, 황토 및 황산동 등의 흡착원리를 이용한 흡착
응집제 첨가에 의한 인 제거법 부영양화를 방지하기위한 방법으로 황산 알루미늄(황산반포), 염화 제 1철 등을 사용
용존공기 가압부상법 공기의 가압용해를 통해 휘발성 유기오염물 및 미량유기오염물질을 제거
여과법 입상의 활성탄 및 목탄을 이용한 여과
체류시간 단축 수계의 체류시간을 줄여 오염물질의 희석을 유발하여 조류 성장 억제
생물조작 및 생물복원기술 공격성 기능 미소생물과 천적 등을 이용한 다기능 복합 생태청정기술
부영양화된 수역에서의 수화조절을 위하여, 적극적인 제어책이 요구되어 구리(copper)(Gibson, C. E. (1972) The algicidal effect of copper on a green and a blue-green alga and some ecological implications. [Anabaena flos-aquae, Scenedesmus quadricauda]. J appl ecol. Aug. 9(2): 513-518.), 황산구리(copper sulfate)나 클로린(chlorine), 칼륨(Potassium salts)(Parker, D. L., Kumar, H. D., Rai, L. C. and Sin호, J. B. (1997) Potassium salts inhibit growth of the Cyanobacteria Microcystis spp. in pond water and defined media: inplications for control of Microcystin-producing aquatic blooms. Appl. Environ. Microbiol. 63: 2324-2329) 등과 같은 화학물질들을 부분적으로 사용하고 있지만, 이러한 화학물질들은 녹조현상의 원인생물에 대한 특이성을 가지 않을 뿐만 아니라, 이 화학물질들에 의해 영향을 받은 조류들은 독소 화합물(toxic compound)을 생성하는 등 생태계 구성 생물들의 생존에 악영향을 미치는 단점을 갖는다.
따라서, 근래에는 수질의 부영양화를 억제하기위해, 여러 생태공학적 처리기법의 개발이 활발히 진행되고 있으며, 파지(phage)나 균류(fungi), 동물플랑크톤(zooplankton), 원생동물(protozoa) 등을 이용한 남조류의 생장을 억제함으로써 부영양화를 조절하고자하는 연구가 진행된 바 있다((Sigee D. C., Glenn, R., Andrews, M. J., Bellinger, E. G., Butler, R. D., Epton, H. A. S. and Hendry, R. D. (1999) Biological control of cyanobacteria: principles and possibilities. Hydrobiologia. 395/396: 161-172) 그러나, 시아노파지(Cyanophage)는 남조류에 대해 극히 특이적으로 작용한다는 장점이 있지만, 각각의 남조류에 대한 시아노파지를 개별분리하여 이용해야하며, 시아노파지 저항성 돌연변이주의 출현으로인해 대규모 생태계로의 적용에 많은 제약이 있는 것으로 알려져 있다. 먹이사슬을 통한 녹조현상의 제어는 일부 시아노박테리아가 생성하는 마이크로시스틴(Microcystin, 시아노박테리아의 간세포 독소(Cyanobacterial Hepatotoxins)), 독성 화합물 대사 억제제(toxic compounds metabolic inhibitors)(Dawson, R. M. (1998) The toxicology of microcystins. Toxicon. 36: 953-962)에 의한 생물독 작용 가능성을 배제할 수 없다. 또한, 박테리아를 이용한 제어방법의 개발에 대한 연구도 활발히 이루어지고 있으며, 특히 마이크로시스티스(Microcystis) 속에 대한 연구가 많이 행하여지고 있다(Manage, P.M., Kawabata, Z. aakano, S. (2000) Algicidal effect of the bacterium Alcaligenes denitrificans on Microcystis spp.. Aquatic Microbial Ecology. 22:111-117; Wu, J. T. Kuo-Huang, L. H. and Lee. J. (1998) Algicidal effect of Peridinium bipes on Microcysits aeruginosa. Current Microbiology. 37: 257-261).
이에 본 발명의 목적은 우리나라 호수 또는 강 생태에 적합한 조류제거용 박테리아 아시도보락스 템퍼란스(Acidovorax temperans) KFCC 11294 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 균주를 이용한 조류 제거방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주 또는 그 배양물을 포함하는 조류제어용 생물 제재(bio-agent)를 제공하는 것이다.
도 1은 남조류와 본 발명의 분리 균주를 혼합배양한 후, 남조류 세포의 세포수를 Chl. a 농도변화로 나타낸 그패프(화살표는 남조류 배양 배지에 본 발명의 분리 균주를 투여한 시점을 나타냄)이며,
도 2는 남조류와 본 발명의 분리 균주를 첨가혼합배양한 배지와 남조류만을 배양한 배지의 비교사진이다.
본 발명의 일견지에 의하면, 조류분해활성을 갖는 아시도보락스 템퍼란스(Acidovorax temperans) KFCC 11294 균주가 제공된다.
본 발명의 다른 견지에 의하면, 상기 균주를 배양하고, 배양된 아시도보락스 템퍼란스 KFCC 11294 균주 배양물을 조류서식처에 투여함을 포함하는 조류제거방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 견지에 의하면, 상기 균주 또는 그 배양물을 포함하는 조류제어용 생물 제재가 제공된다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.
본 발명자들은 석촌호수의 저니(sediment)로부터 분리된 균주 아시도보락스 템퍼란스(Acidovorax temperans) KFCC 11294가 예기치않게 우수한 조류분해 활성을 나타냄을 발견하였다.
본 발명의 조류분해 활성을 갖는 균주는 녹조현상이 심하게 일어나고 있던 석촌호수로부터 분리되었다. 석촌호수의 저니에서 시료를 채취하고, 그 시료를 적당량 희석하여 0.1% 효모 추출액(yeast extract)이 첨가된 BG-11 배지에 접종하고 배양하였다. 배양된 균을 다시 상기 0.1% 효모 추출액이 첨가된 BG-11 배지에 도말(streaking)하여 배양한 결과, 어두운 백색의 점성이 있는 원형의 단일 콜로니가 형성되었다. 그 다음, 상기 형성된 콜로니를 연속 계대배양하여 순수한 균주를 얻었다.
이러한 균주는 조류배양액, 특히 남조류 배양액에 투여하여 혼합배양하였을때, 우수한 조류제거활성을 나타냄을 알 수 있었다(하기 실시예 2 참조).
특히, 상기 균주는 우리나라 수계에서 발견가능한 남조류 아나베나 실린드리카(Anabaena cylindrica)의 영양세포를 효과적으로 분해할 수 있다. 또한 상기 균주는 실린드리카 종을 비롯한 시아노박테리아 배양시 pH가 8∼10 범위내에서도 아나베나 실린드리카를 분해하는 활성을 가져, 수화(water bloom) 발생시에 형성되는 높은 pH 조건(pH 9∼10)에서도 남조류의 생장을 억제할 수 있어, 남조류의 제거기술에 크게 기여할 수 있다. 본 발명의 균주의 조류분해기작은 직접 조류 세포를 공격하거나 효소같은 세포외(extracellular) 물질을 분비하여 조류의 세포벽을 분해하는 것으로 예측된다.
상기 균주를 이용한 조류제거시, 상기 균주를 배양하고 원심분리법으로 농축하여 그 농축된 배양물을 조류서식처에 투여하는 것이 바람직하다.
이와 같은 조류분해활성을 갖는, 상기 균주의 16S rDNA를 분리하여 염기서열을 분석하였으며, 그 결과를 하기 서열번호 1에 나타내었다.
또한, 상기 분석된 염기서열을 Genebank상에서 블라스트 서치(blast search)를 통해 상기 균주를 동정한 결과, 아시도보락스 템퍼란스(Acidovorax temperans)와 99%의 상동성을 나타내었다(참고로, Genbank에 개시되어 있는 아시도보락스 템퍼란스(Acidovorax temperans) 16S rDNA 염기서열을 하기 서열번호 2에 나타내었다.). 본 발명에서 분리한 상기 균주를 한국종균협회에 기탁하고 아시도보락스 템퍼란스(Acidovorax temperans) KFCC 11294로 명명하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
<실시예 1>
아시도보락스 템퍼란스( Acidovorax temperans ) KFCC 11294 균주의 분리
본 발명의 조류분해 활성을 갖는 균주는 석촌호수의 저니에서 시료를 채취하고, 그 시료를 효모 추출액(yeast extract) 0.1% 가 첨가된 BG-11 배지로 10, 10-1, 10-2으로 희석한 다음, 또한 효모 추출액 0.1% 가 첨가된 BG-11 배지에 접종하여 2일동안 28℃에서 배양하였다. 그 다음, 배양된 균을 다시 상기 효모 추출액(yeast extract) 0.1%가 첨가된 BG-11 배지(1% 아가로즈 함유 반고체배지)에 도말(streaking)하여 2∼3일동안 28℃에서 배양하였다. 배양 결과, 어두운 백색의 점성이 있는 원형의 단일 콜로니가 형성되었다. 그 다음, 상기 형성된 콜로니를 연속 계대배양하여 순수한 균주를 분리하였다.
상기 분리된 균주들을 효모 추출액 0.1%가 함유된 BG-11 배지에서 2일동안 28℃, 190 rpm에서 혼탁배양한 후, 원심분리법으로 농축하여 배양 농축액을 얻었다. 그 다음, 남조류의 한 속인 아나베나 실린드리카(Anabaena cylindrica)를 BG-11 배지에서 6일간 배양하였다. 이 남조류 배양액 5ml에 상기 분리된 균주의 배양 농축액 1ml을 첨가혼합하여 28℃에서 혼합배양하여 남조류 분해 세균을 분리하였다.
<실시예 2>
아시도보락스 템퍼란스( Acidovorax temperans ) KFCC 11294 균주의 조류분해활성 시험
상기 남조류 분해 세균을 효모 추출액 0.1%가 함유된 BG-11 배지에서 4일간 배양한 다음, 원심분리법으로 농축하여 5ml의 배양 농축액을 얻었다. 이러한 남조류 분해 세균 배양 농축액(5ml)을 상기한 바와 같은, 6일간 배양된 남조류 배양액(50ml)에 첨가혼합하여, 28℃에서 170rpm으로 교반하면서 10일간 더 배양하였다. 또한, 대조군으로서 상기 남조류 배양액(50ml)을 동일한 조건하에 배양하여 비교관찰하였다.
배양도중 아나베나 실린드리카(Anabaena cylindrica)의 Chl. a 농도를 분광 광도 측정법으로 2일마다 측정하여 그 결과를 도 1에 그래프로 나타내었다. 도 1에서 화살표는 남조류 배양 배지에 본 발명의 분리 균주를 투여한 시점을 나타낸다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 균주 아시도보락스 템퍼란스(Acidovorax temperans) KFCC 11294를 첨가혼합한 경우, 배양 10일째(본 발명의 균주 투여 4일째)부터 현저히 Chl. a의 농도가 감소되기시작하여 배양 16일째(본 발명의 균주 투여 10일째)에는 Chl. a의 농도가 거의 0에 가까운 수준으로 감소하였으나, 이에 비해 본 발명의 균주가 투여되지않은 대조군은 계속해서 Chl. a의 농도가 증가하였다.
또한, 상기 관찰시 각 플라스크의 변화를 도 2에 사진으로 나타내었으며, 각 플라스크내 조류의 양은 육안으로도 현저히 감소됨을 알 수 있었다(모두 혼합배양한지 7일째의 사진이며, 좌측 3개의 플라스크는 대조구, 오른쪽 2개는 실험구를 나타냄). 본 발명의 균주가 투여되지않은 대조구에서는 아나베나 실린드리카가 잘 성장하여 배지의 색상이 초록색을 나타내었으며, 본 발명의 균주가 투여된 실험구의 살조된 배지에서는 흰색이나 우유빛 또는 엷은 황색을 나타내었다.
<실시예 3> 아시도보락스 템퍼란스( Acidovorax temperans ) KFCC 11294 균주의 16S rDNA 염기서열 분석
이와 같은 조류분해활성을 갖는, 상기 균주의 16S rDNA를 분리하여 염기서열을 분석하였다. 상기 균주의 배양액으로부터 Blood & Cell Culture DNA Midi Kit(Qiagen, Germany)를 사용하여 지노믹 DNA를 추출하였다. 그 다음, 하기 프라이머를 이용해 PCR(중합효소 연쇄 반응)을 수행하여 16S rDNA를 얻었다. 분석시 이용된 프라이머는 universal primer를 이용하였으며, 그 염기서열 및 PCR 수행조건은 다음과 같다.
프라이머:
BSF 8/20: 5'-AGA-GTT-TGA-TCC-TGG-CTC-AG-3'
BSR IS41: 5'-AAG-GAG-GTG-ATC-CAG-CCG-CA-3'
PCR 반응물:
지노믹 DNA 1㎕
100 pmol BSF 8/20 2㎕
100 pmol BSR IS41 2㎕
10mM dNTP mix 2.5㎕
MgCl24㎕(최종 농도 2mM)
10×Han-OMNI PCR 완충액 5㎕
Taq DNA 중합효소(Genenmed, Korea) 0.5㎕
dH2O 33㎕
총 50㎕
PCR 반응조건(25싸이클):
초기변성과정 95℃, 6분
변성과정 95℃, 30초
어닐링과정 60℃, 40초
연장(중합)과정 72℃, 1분
최종 연장과정 72℃, 7분
상기 PCR 반응을 통해 얻어진 16S rDNA에 대한 염기서열을 분석하여 그 결과를 하기 서열번호 1에 나타내었으며, 이러한 염기서열은 Genebank상에서 블라스트 서치(blast search)를 통해 상기 균주를 동정한 결과, 아시도보락스 템퍼란스(Acidovorax temperans)의 16S rDNA(서열번호 2)와 99%의 상동성을 나타내었다. 본 발명의 분리 균주를 한국미생물보존센터에 기탁하고 아시도보락스 템퍼란스(Acidovorax temperans) KFCC 11294 이라 명명하였다.
우리나라 석촌호수에서 분리된 본 발명의 균주 아시도보락스 템퍼란스(Acidovorax temperans) KFCC 11294는 조류, 특히아나베나실린드리카(Anabaena cylindrica)를 분해하는 활성이 우수하여, 본 발명의 균주를 이용하여 우리나라 호수 또는 강 생태에서 효과적으로 남조류에 의한 녹조대발생 문제를 해결할 수 있다.

Claims (6)

  1. 조류분해활성을 가지며 서열번호 1을 포함하는, 한국종균협회에 KFCC 11294호로 기탁된 미생물의 성질을 갖는 아시도보락스 템퍼란스(Acidovorax temperans) 균주.
  2. 제 1항의 균주를 배양하고, 그 균주 배양물을 조류 서식처에 투여함을 특징으로하는 조류 제거방법.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 균주 배양물은 아시도보락스 템퍼란스 KFCC 11294 균주를 BG-11 배지에 접종하여 배양한 후 원심분리법으로 농축된 배양물임을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 2항에 있어서, 상기 조류는 남조류임을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 남조류는아나베나 실린드리카(Anabaena cylindrica)임을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항의 아시도보락스 템퍼란스 KFCC 11294 균주 또는 그 배양물을 포함하는 조류제어용 생물제재(bio-agent).
KR10-2002-0015343A 2002-03-21 2002-03-21 조류분해활성을 갖는 박테리아 아시도보락스템퍼란스(Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘｔｅｍｐｅｒａｎｓ)ＫＦＣＣ 11294 균주 및 이를 이용한조류제거방법 KR100431585B1 (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR100955452B1 (ko) * 2009-01-23 2010-04-29 로하스코리아 주식회사 이끼ㆍ녹조류 제거용 미생물 배양액 제조방법 및 이로부터 제조된 미생물 배양액
CN109279700A (zh) * 2018-09-06 2019-01-29 中海新世纪量子生物科技（深圳）有限责任公司 治理蓝藻污染水体的发酵剂、复合菌剂、制备方法及用途

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CN109279700A (zh) * 2018-09-06 2019-01-29 中海新世纪量子生物科技（深圳）有限责任公司 治理蓝藻污染水体的发酵剂、复合菌剂、制备方法及用途

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