KR20030074273A - 피부 염증 또는 자극을 측정하기 위한 방법 및 키트 - Google Patents

피부 염증 또는 자극을 측정하기 위한 방법 및 키트 Download PDF

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KR20030074273A
KR20030074273A KR10-2003-0014066A KR20030014066A KR20030074273A KR 20030074273 A KR20030074273 A KR 20030074273A KR 20030014066 A KR20030014066 A KR 20030014066A KR 20030074273 A KR20030074273 A KR 20030074273A
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KR10-2003-0014066A
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후앙켈리
티어니니나
위간드벤자민
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존슨 앤드 존슨 컨수머 캄파니즈, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 피부의 국소 피부 케어 제품에 대한 노출, 외부 침해에 대한 노출 또는 이의 복합 요인에 대한 노출로 인한 포유동물 피부의 준임상적 또는 임상적 염증 또는 자극을 측정하기 위한 비침해성 생체내 방법에 관한 것이다. 하나의 양태에서, 당해 방법은 비침해성 수거 장치를 사용하여 피부로부터 에이코사노이드를 수거하는 단계 및 피부로부터 수거된 에이코사노이드의 수준을 분석하는 단계를 포함한다. 또한, 본 발명은 피부 자극이나 염증의 마커를 측정하기 위한 키트에 관한 것이다. 당해 키트는 피부 표면으로부터 분비물을 수거하는 비침해성 수거 장치 및 당해 분비물 중의 에이코사노이드의 수준을 측정하기 위한 면역분석법을 포함한다.

Description

피부 염증 또는 자극을 측정하기 위한 방법 및 키트{Method and kit for measuring skin inflammation or irritation}
관련 출원에 대한 참조
본 출원은 2001년 9월 6일에 출원된 공동-계류중인 가출원 제60/317638호의 이익을 주장한다.
본 발명은 피부 염증 또는 자극을 측정하기 위한 방법 및 키트에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 피부 염증 또는 자극을 측정하기 위한 비침해성 생체내방법 및 키트에 관한 것이다.
피부는 신체의 가장 넓은 기관이며, 이의 외관은 개개인의 자신감과 삶의 질에 지대한 영향을 미친다. 실제로, 오랫 동안 지속되는 개인의 첫인상은 종종 개개인의 시각적 외모(얼굴 생김새, 머리색 등)에 의해 주어진다.
소비자는 그들의 피부 상태(예: 여드름, 건선, 잔주름 및 주름살)를 치료하고, 피부 건강(예: 건성의 벗겨지는 피부; 지성 피부)을 개선하고, 피부 기미를 가리기 위하여 피부 케어(skin care) 제품을 사용한다. 이러한 다양한 피부 상태의 치료의 속도와 효능을 개선하기 위한 새로운 제품을 개발하고자 대단히 많은 연구가 계속되어왔으며, 이 결과 수 많은 새로운 피부 케어 제형이 개발되었다. 이들 제품은 종종 특정 피부 케어 목적을 위해 사용되지만, 이러한 목적을 최대화하기 위하여 장기간(8 내지 12주 이상)이 요구된다.
이들 국소 피부 케어 제품의 최종 이점이 정기간에 걸쳐 전달되기 때문에, 소비자를 상대로 장기간에 걸쳐 이들을 시험하지 않고도 이들 제품의 자극 프로파일을 측정할 수 있는 측정 수단을 개발하는 것이 바람직할 것이다. 실제로, 시각적 부작용(즉, 준임상적 효과), 예를 들면, 염증, 자극, 부종 및 홍반이 없는 경우, 1회 사용 후 자극 프로파일을 측정할 수 있는 민감한 측정이 매우 바람직할 것이다. 또한, 외부 침해에 대한 노출, 예를 들면, 마모, 마찰, 문지름, 일광 노출, 바람 노출, 매연 노출, 기타 환경적 노출, 또는 붕대와 같은 접착 장치의 피부에 대한 적용 또는 피부로 부터의 제거는 염증 또는 자극을 일으키는 피부 손상을 유발할 수 있으며, 이의 정도를 측정할 수 있다. 본 발명은 상기와 같은 준임상적 또는 임상적 효과를 측정하여 정량화하기 위한 신규 방법 및 장치를 제공한다.
피부 케어 제품에 대한 노출 또는 외부 침해에 대한 노출에 의해 유발된 피부의 염증 반응은, 두 개의 별개의 경로, 즉 사이토킨 경로 및 아라키돈산 경로를 통해 주로 피부내의 각질세포에 의해 조절된다. 이들 경로에 있어서, 발현되거나, 분비되거나 방출된 각종 매개체는 1차 또는 2차 염증 매개체인 것으로 여겨진다. 인터류킨-1 알파(IL-1α)는 사이토킨 경로내의 1차 예비-염증 매개체인 것으로 여겨지는 반면에, 프로스타글란딘 E2(PGE2)는 아라키돈산 경로의 1차 예비-염증 매개체인 것으로 여겨진다.
자극 또는 염증의 측정을 위해 존재하는 모델에 대한 두 개의 주요 방법, 즉 시험관내 또는 생체내 측정법이 있다. 문헌[참조: "Strategies for the assessment of acute skin irritation potential", Robinson et al., J. Pharmacol. Toxical., 1999]은 현재 시험관내 피부 노화 및 자극 시험 방법론에 대한 개관을 휼륭히 제공하고 있으며, 이는 본원에 이의 전문이 참조로서 인용된다. 대표적인 피부 노화 및 자극 시험 방법론은 본원에 참조로서 그 전문이 인용된 US-A-6,020,148에 기술되어 있으며, 이 문헌은 국소 피부 케어 제품의 눈 또는 피부 자극을 측정하기 위한 시험관내 방법의 사용을 기술하고 있다. 눈 또는 피부 자극은, 피부 케어 제품의 적용 후, 모델 세포 배양계의 생존력을 측정함으로써 정량화될 수 있다. 이러한 기법을 사용하여, 시간에 따라 모니터될 수 있는 상이한 최종 마커를 측정할 수 있다. 또 다른 방법이 본원에 참조로서 그 전문이 인용된 EP-A-0,497,39에 기술되어 있으며, 이 문헌은 세포독성 및 예비-염증 말기를 통한 계면활성제의 자극을 평가하기 위해 각질세포 및 섬유모세포의 사람 피부 공동-배양을 포함하는 시험관내 모델의 사용을 기술한다. 이들 방법이 잠재적 자극 또는 다른 임상적 안전성 문제에 관한 직접적 정보를 제공하지만, 이러한 시험관내 방법이 사람 피부에 의해 나타나는 염증 및 자극을 정확히 나타내지는 못한다.
부가로, 생체내 방법이 또한 피부 케어 제품의 임상적 안전성을 평가하는데 사용되었다. 생체내 방법의 예로는: 제품 패칭 후 홍반의 평가와 함께, 4 시간 패치 시험[참고문헌: Robinson, et al., review or Robinson et al., in Contact Dermatitis, 1998, "Application of a 4-h human patch test method for comparative and investigative assessment of skin irritation"]; 24시간 패치 노출 후 IL-1α 및 에이코사노이드를 측정하기 위한 흡입 물집 유체의 사용[참고문헌: Muller-Decker et al., in Toxicology and Applied Pharmacology, 1998. "Arachidonic Acid Metabolism in Primary Irritant Dermatitis Produced by Patch Testing of Human Skin with Surfactants"]; 및 급성 피부 자극에서 에이코사노이드 및 사이토킨 수준을 측정하기 위해서 테이프 박피 및 캡사이신의 사용[참고문헌: Reilly and Green, in Acta. Derm. Venereol., 1999, "Eicosanoid and Cytokine Levels in Acute Skin Irritation in Response to Tape Stripping and Capsaicin"]을 포함한다. 문헌[참고문헌: Rheins, et al. WO 00/10579, "Methodfor Detection of Biological Factors in Epidermis"]에 교시된 부가의 방법은 사용자의 피부를 긁거나 접착 테입을 사용하여 피부를 박리하고, 이어서 특이적 폴리뉴클레오타이드/사이토킨에 대해 분석할 것을 교시한다. 이들 방법은 사람 모델을 사용하는 반면, 이들은 진행 동안 과도한 사용 조건 또는 높은 수준의 침해성을 내포하고, 이는 임상 평가 도구로서 이들의 유용성을 제한하다. 이는 준임상적 자극을 평가하는 경우 특히 적절하다.
지난 수년에 걸쳐, 로빈슨(Robinson et al.) 등은 염증의 마커로서 예비 염증성 사이토킨을 흡수하기 위해서, 접착-피복된 미공질 플라스틱 필름인 Sebutape(Cuderm Corporation, Dallas, Texas)을 사용하여 비침해성 방법을 기재하였다. 1997년에, 이 방법론이 상이한 체내 부위상의 자극의 측정 뿐만 아니라 상이한 연령의 사람에 대해 적용할 수 있음이 증명되었다[참고문헌: Perkins, et al., Meeting of the Society of Toxicology, 1997, "Development of a noninvasive method for assessing human skin irritation"]. 후속적 발달이 이들 염증성 마커가 피부 상태와 관련있다는 것을 나타냈다. 이들 방법론의 적용의 예는 인터류킨-1 수용체 길항제(IL-1ra)와 기저귀 발진 중증도와의 관계[참고문헌: Perkins, et al., Society of Toxicology Annual Meeting, 1998, "Further Development of a noninvasive method for assessing human skin irritation"], 나트륨 라우릴 설페이트(SLS) 적용으로 인한 IL-1α와 준임상적 자극(가시적 홍반이 없는)과의 관계[참고문헌: Perkins, et al., Society of Investigative Dermatology Annual Meeting. 1999, "Noninvasive method for assessinginflammatory changes in chemically treated human skin"], 및 염증성 두피 상태의 중증도 평가[참고문헌: Cardin, et al., Society of Toxicology Annual Meeting, 2001, "Development of a noninvasive method for recovery of molecular markers of normal and compromised scalp conditions"]를 포함한다. 염증의 마커로서 인터류킨 또는 다른 단백질을 사용하는 경우 발생할 수 있는 잠재적인 문제중의 하나는 시험되는 피부 케어 제품과의 이들의 잠재적 상호작용이다. 예를 들어, 이들 단백질과 몇몇 피부 케어 제품에서 발견되는 음이온 게면활성제와의 상호작용은 단백질 변성을 야기할 수 있는 것으로 여겨지고, 이는 분석 동안 이들의 겉보기 수준에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 다양한 피부 케어 제품 또는 기타 시험 화합물의 존재에서 안정성을 유지하는 지질-기재의 마커의 개발이 바람직하고, 염증/자극 마커로서 인터류킨과 같은 단백질을 사용하는 것과 관련된 상기 언급된 난점을 극복할 것이다. 추가로, 당해 방법은 피부상의 국소 피부 케어 제품의 효과 뿐만 아니라 상기 참조된 외부 침해에 대한 노출의 효과를 측정할 수 있어야 한다.
도 1은 본 발명의 몇몇 양태에서 사용되는 PGE2의 측정을 위한 면역분석용 보정 곡선이다.
도 2는 본 발명의 몇몇 양태에서 사용되는 IL-1α의 측정을 위한 면역분석용 보정 곡선이다.
발명의 간단한 요약
한가지 양태에서, 본 발명은 피부 표면상에 존재하는, 에이코사노이드, 바람직하게는 프로스타글란딘, 보다 바람직하게는 프로스타글란딘 E2(PGE2)을 수거하여 이의 양을 측정함으로써 포유동물(동물 또는 사람) 피부의 준임상적 또는 임상적염증, 또는 자극의 마커를 측정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은,
(a) 비침해성 수거 장치를 사용하는 비침해성 수거 과정을 이용하여 피부 표면으로부터 분비물을 수거하는 단계; 및
(b) 상기 장치에 의해 피부 표면으로부터 수거된 분비물에서 하나 이상의 에이코사노이드의 수준을 분석하는 단계를 포함한다.
에이코사노이드의 측정은 매우 순한 피부 케어 제품 또는 외부 자극에 대한 노출을 구분하는데 필요한 민감성을 제공하면서, 선행 기술 분야의 방법과 관련된 단백질 변성의 우려를 미연에 방지한다.
본 발명의 또 다른 양태는 국소 피부 케어 제품, 외부 침해 또는 이의 복합 요인에 대한 피부의 노출로 인한 포유동물 피부의 준임상적 또는 임상적 염증 또는 자극을 측정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법의 이러한 양태는,
(a) 비침해 수거 장치를 포함하는 비침해성 수거 과정을 사용하여 당해 피부 표면으로부터 분비물을 수거하는 단계,
(b) 당해 피부 표면으로부터 수거된 분비물 속의 에이코사노이드의 기저 수준을 측정하는 단계,
(c) 당해 피부를, 하나 이상의 국소 피부 케어 제품, 하나 이상의 외부 침해 또는 이의 복합 요인에 대해 노출시키는 단계,
(d) 단계 (c) 후 비침해성 수거 장치를 포함하는 비침해성 수거 과정을 사용하여 당해 피부 표면으로부터 분비물을 수거하는 단계,
(e) 단계 (c) 후 당해 피부 표면으로부터 수거된 분비물 속의 에이코사노이드의 수준을 측정하는 단계 및
(f) 단계 (b)에서 측정한 에이코사노이드의 기저 수준과 단계(e)에서 측정한 에이코사노이드의 수준을 비교하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 에이코사노이드는 프로스타글란딘이고, 보다 바람직하게는, 프로스타글란딘 E2이다. 바람직하게는, 당해 방법의 단계 (d)는 단계 (c) 후 약 24시간만에 수행된다.
비침해성 수거 장치는 피복되지 않은 비다공성 플라스틱 필름, 피복되지 않은 미공질 플라스틱 필름, 접착 피복된 무공질 플라스틱 필름, 접착 피복된 미공질 플라스틱 필름, 섬유 직물, 섬유 부직포, 천연 스폰지, 합성 스폰지 및 플라스틱 발포체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 장치를 포함할 수 있다.
또 다른 양태에 있어서, 당해 방법은 당해 장치에 의해 피부 표면으로부터 수거된 분비물 속에 하나 이상의 사이토킨의 수준을 분석하는 단계를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 사이토킨은 인터류킨-1α이다. 가장 바람직하게는, 사이토킨은 인터류킨-1α이고, 에이코사노이드는 프로스타글란딘 E2이다.
또 다른 양태에 있어서, 당해 방법은 피부 분비물 속의 단백질 수준을 측정하는 단계와 에이코사노이드 수준을 단백질 수준으로 표준화하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 또 다른 국면은 포유동물 피부의 임상적 또는 준임상적 염증 또는 자극을 위한 마커를 측정하기 위한 키트에 관한 것이다. 당해 키트는,
(a) 피부 표면으로부터 분비물을 수거하기 위한 비침해성 수거 장치와
(b) 당해 분비물 속의 에이코사노이드의 기저 수준을 측정하기 위한 면역분석을 포함한다.
피부 상에서 발현 또는 분비되는 특정 마커, 예를 들면, 사이토킨(인터류킨-1α 포함) 또는 에이코사노이드(프로스타글란딘, 예를 들면, PGE2포함)의 수준을 사용하여, 국소적 피부 케어 제품, 외부 침해에 대한 피부의 노출 또는 이들의 복합 요인에 의해 피부에 유도되는 준임상적 또는 임상적 피부 자극 또는 염증을 정량화할 수 있다. 또한, 에이코사노이드 및 사이토킨과 같은 마커들의 혼합물을 측정하여 준임상적 또는 임상적 피부 자극 또는 염증 양을 보다 완전한 모양으로 제공할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "국소적 피부 케어 제품"은 개인용 화장품, 세면용품, 또는 건강보호 제품, 예를 들면, 마른 또는 젖은 수건, 화장수(wash), 욕수(bath), 샴푸, 겔, 비누, 스틱, 향유, 샤쉐, 베게, 무스, 스프레이, 로션, 크림, 세정 조성물, 파우더, 오일, 탈취제, 목욕용 오일 및 욕조에 첨가할 수 있는 다른 목욕용 조성물을 의미한다. 국소적 피부 케어 제품은 또한 에어로졸, 캔들(candle) 및 분무기로 사용할 수 있는 물질을 포함하지만 이로 제한되는 것은 아니다. 앞서 언급한 국소적 피부 케어 제품은 당해 분야의 숙련가들에게 익히 공지되어 있다.
본원에 사용된 용어 "외부 침해"는 피부에 자극 또는 염증을 일으킬 수 있는 신체 케어 제품 이외의 다른 자극을 의미한다. 외부 침해의 예로는, 마모, 마찰,문지름, 일광에 대한 노출, 바람에 대한 노출, 매연 노출, 기타 환경적 노출 또는 접착성 붕대와 같은 접착제 피복된 장치의 피부에 대한 적용, 부착 및 피부로부터의 제거가 있다.
본원에 사용된 용어 "비침해성 수거 과정"은 수거 동안 가시적인 홍반을 유발하지 않는 피부 표면으로부터 분비물을 수거하는 과정을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "비침해성 수거 장치"는 수거 동안 가시적인 홍반을 유발하지 않는 피부 표면으로부터 분비물을 수거하는 장치를 의미한다.
본 발명의 방법은 국소적 피부 케어 제품으로 처리, 외부 침해 및 이들 복합 요인에 대한 노출에 반응하는 피부의 자극을 측정한다. 국소적 피부 케어 제품은, 이에 한정되는 것은 아니나, 패치, 면봉, 와이프, 쳄버 등을 포함한 각종 장치를 사용하여 피부에 적용될 수 있다. 국소적 피부 케어 제품에 피부를 노출시키는 데 사용될 수 있는 폐색 패치의 예로는, 힐 탑 쳄버(Hill Top chamberR)[공급원: 미국 오하이오주 신시내티 소재의 힐 탑 리서치(Hill Top Research)]가 있다. 당해 패치는, 내부에서 부직포 웨브릴(WebrilR) 패드[공급원: 미국 사우쓰 캐롤리나주 심슨빌 소재의 비비에이 논워번즈(BBA Nonwovens)]가 국소적 피부 케어 제품을 지탱하고 있는 성형 플라스틱 쳄버를 포함한다. 당해 챔버는 반폐쇄된 저알레르기성 접착 테이프를 사용하여 피부에 적용된다. 국소적 피부 케어 제품은 다양한 시간 동안, 예를 들어, 1분 내지 24시간 동안 피부에 적용될 수 있다. 외부 침해 노출에 대한 예로는, 이에 한정되는 것은 아니나, 걸레, 와이프, 퍼프, 수영복에 의한 문지름; 일광, 매연, 바람 또는 기타 환경적 제제로의 피부 노출, 또는 의복 착용으로 인한 마찰이 있다. 외부 침해의 노출 시간은, 예를 들어, 1분 내지 1년일 수 있으며, 일부 경우, 심지어 평생 노출될 수도 있다.
국소적 피부 케어 제품 또는 외부 침해에 의한 피부 노출에 이어, 비침해성 수거 장치를 사용하여, 피부 표면에 존재하는 피부 분비물 속에 함유된 염증성 매개체를 흡수하거나 수거한다. 매개체를 피부로부터 흡수하거나 수거하는 데 적합한 비침해성 장치의 예로는, 약하게 접착제 피복된 미공질 플라스틱 필름, 예를 들어, 세부테이프(SebutapeR)[공급원: 미국 텍사스주 달라스 소재의 쿠덤 코포레이션(Cuderm Corporation)]가 있다. 염증성 매개체의 수거는 국소적 피부 케어 제품 또는 외부 침해에 의한 노출 후에 다양한 시간 동안, 예를 들어, 노출 직후 내지 노출 후 24시간 이상 동안 발생할 수 있다. 예를 들어, 염증성 매개체는 국소적 피부 케어 제품 또는 외부 침해에 의한 피부 노출 후, 1시간, 3시간 또는 24시간 이내에 수거될 수 있다. 본 발명자들은 PGE2발현 역학에 관한 연구에서, PGE2의 수준이 보다 짧은 시간에 비해 노출 후 24시간일 때 최고임을 발견하였다. 그러나, 누적 효과의 경우, 평생 노출에 걸친 시간의 함수로서 측정하는 것이 적합할 수 있다.
또 다른 적합한 비침해성 수거 장치는 피복되지 않은 무공질 플라스틱 필름, 피복되지 않은 미공질 플라스틱 필름, 접착제 피복된 무공질 플라스틱 필름, 접착제 피복된 미공질 플라스틱 필름, 섬유 직물, 섬유 부직포, 천연 스폰지, 합성 스폰지 및 플라스틱 발포체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 장치를 포함한다.
비침해성 수거 장치에 의해 수거한 다음에, 염증성 매개체의 수준을 다양한 상이한 분석 기술 중의 하나 이상을 사용하여 분석한다. 본 발명의 실시에 유용한 예시적인 분석 기술은 면역 분석 기술 및 기구 분석 기술을 포함하나, 이로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 실시에 유용한 예시적인 면역 분석 기술은 면역 분석 기술, 예를 들면, 방사성 면역 분석(RIA), 형광 면역 분석(FLA), 효소 면역 분석(EIA) 및 효소 결합된 면역 흡착 분석(ELISA)을 포함한다. 면역 분석 기술은 항체-항원 반응을 사용하여 분석물을 확인하고 정량하는데 사용된다. 면역 분석에 사용되는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체일 수 있다. "샌드위치" 면역 분석으로 공지된 하나의 방법에서, 측정하고자 하는 분석물에 대한 항체를 고체 표면, 예를 들면, 비드 또는 플라스틱 (미세역가) 플레이트에 고정시킨다. 측정하고자 하는 분석물을 함유하는 시험 샘플을 항체 비드와 혼합하거나 플라스틱 플레이트에 위치시켜, 항체-분석물 복합체를 형성시킨다. 지시제를 포함하거나 이에 결합된 제2 항체로 이루어진 지시제 시약을 혼합물에 가한다. 지시제는 RIA용 방사성 동위 원소, ELA 또는 ELISA용 효소 또는 FIA용 형광단일 수 있다. ELA 또는 ELISA에서 가장 통상적으로 사용되는 효소는 서양 고추냉이 퍼옥시다제 및 알칼린 포스파타제이다. 항체-지시제 결합체는 제1 항체-분석물 복합체에 결합되고, 유리 항체-지시제 결합체는 세척되고, 항체-분석물-항체-지시제는 지시제 시약과 양립 가능한 방법을 사용하여 정량된다. 예를 들면, 효소 면역 분석의 경우에, 효소와 반응하는 기질의 첨가에 의해 정량한다.
경쟁 결합 면역 분석으로서 공지된 또 다른 방법에서, 측정하고자 하는 샘플에서 분석물을 고정화된 항체에 결합된 지시제(분석물-지시제 결합체)로 표지된 첨가한 분석물의 공지된 양과 경쟁시킨다. 반응 후, 유리 분석물-분석물-지시제 용액을 고체 상으로부터 세척한다. 고체 상 또는 세척액에 잔류하는 분석물-지시제는 분석물-지시제 만을 사용하는 대조군 분석물에 대하여 측정하여 샘플에 존재하는 분석물의 양을 정량하는데 사용한다. 이는 분석, 예를 들면, 효소 활성, 형광 및 방사성 등에 적합한 방법을 사용하여 수행한다.
치환법으로서 공지된 또 다른 방법에서, 경쟁 반응보다는 치환 반응이 사용되는데, 여기서, 분석물이 항체에 결합된 분석물 지시제를 대체한다.
결합은 방사성 동위원소, 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타제 또는 글루코스 옥시다제와 같은 효소, 또는 플루오로세인 또는 로다민 B와 같은 형광단과 같은 또 다른 분자에 대한 항체 또는 항원의 화학 결합을 포함한다. 항체 및 항원을 결합시키기 위한 비공유 방법도 사용될 수 있다. 예를 들면, 하나의 방법으로서, 항원 및/또는 항체를 비오틴 또는 스트레트아비딘을 사용하여 표지시킨 다음, 결합체를 경쟁형 또는 대체형 면역분석법에 사용할 수 있다. 이러한 결합체의 사용시 이점은 대략 1014ℓ/몰로 측정되는, 아비딘-비오틴 착물의 극히 높은 친화성 상수이다.
통상적으로, EIA는 예를 들면, 분석용 고정화 지지체, 반응 용기 및, 스펙트럼광 분석기계 판독기와 연결되는 경우, 기질과 항체-항원-효소 복합체와의 상호작용에 의한 색상을 검출 및 정량화하기 위한 신속한 수단을 제공하는, 96-웰 미세역가 플레이트와 같은 다중 웰 플레이트로 개발되어 왔다.
기본 EIA의 수 많은 변형체가 있다. 예를 들면, EIA는 면역분석법의 속도와 감도를 증가시키기 위하여 효소 증폭을 이용할 수 있다. 본 방법에서, EIA내의 효소 라벨에 의해 매우 짧은 시간내에 색상의 큰 부분을 생성시킬 수 있는 제2의 효소계 시스템을 유도하는 기질이 생성된다. 따라서, 항원-항체-효소 복합체의 효소 활성을 갖는 생성물을 직접 검출하지 않아도 되며, 이들은 제2 반응을 개시시키기 위한 촉매로서 작용할 수 있다. 제2 효소 시스템은 비교적 다량으로 존재할 수 있으며, 신속한 색상 형성을 용이하게 하는데, 왜냐하면 제1 반응 생성물이 생성될 때까지 제2 효소는 본 분석에 대해 불활성이며, 상호작용하지 않기 때문이다.
보족 그룹 표지 면역분석법(PGLIA)으로 지칭되는, 효소 활성화를 위한 또 다른 방법에 의해서 EIA를 어떠한 세척 단계도 필요없는 균일한 형식으로 수행시킬 수 있다. 본 방법의 이점은 당해 분석법에 어떠한 분리 단계도 필요없다는 사실이다.
본 발명의 방법의 실시에서 PGE2의 수준을 정량화하는데 사용할 수 있은 전형적인 면역분석은 고 민감도 PGE2효소 면역분석(미시간주 앤 아버 소재의 애세이 디자인스 인코포레이티드(Assay Designs, Inc.)의 93001번)이다.
본 발명의 실시에 유용한 전형적인 기기 분석 기술은 비색 또는 분광 측정 방법 뿐만 아니라, 기체 크로마토그래피/질량 분광 측정기(GC/MS), 고 성능 액체크로마토그래피(HPLC), 박층 크로마토그래피(TLC) 등을 포함한다. 본 발명의 실시에 유용한 전형적인 비색 측정 방법은 비신코닌산(BCA)(Kit #23225, Pierce Chemical Company, Rockford, II)을 사용하는 총괄 단백질 분석이다.
실시예
본 발명의 이점 및 방법의 특수한 양태 및 본 발명의 키트는 하기의 실시예에 의해 설명된다. 그러나, 본 발명은 개별적인 실시예에 기재된 양태에 특별히 한정되지는 않고, 첨부되는 특허청구범위로 제한된다.
하기한 실시예에서 PGE2, IL-1α 및 단백질의 수준은 애세이 디자인스 인코포레이티드에서 제조한 면역분석 키트 93001번 및 엔도겐 인코포레이티드(Endogen, Inc.)에서 제조한 면역분석 키트 EH2-IL1A 및 피어스 BCA 단백질 분석 시약 키트를 각각 사용하여 측정한다. 이들 분석은 다음과 같이 요약된다.
애세이 디자인스 인코포레이티드의 PGE 2 효소 면역분석
공급된 고트 안티-마우스(Goat anti-Mouse) IgG 96-웰 미세역가 플레이트에서 분석을 수행한다.
일련의 8개의 PGE2표준 용액은 50,000pg/ml PGE2를 포함하는 표준용액을 순차적으로 희석하여 제조한다. 8개의 표준 용액은 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15.63 및 7.81pg/ml의 PGE2를 각각 포함한다.
분석 완충액 100㎕을 비-특이성 결합(NSB) 및 B0(0pg/ml) 웰로 피펫을 사용하여 옮긴다.
각각의 PGE2표준 용액 100㎕를 적절한 웰로 피펫을 사용하여 옮긴다.
각각의 샘플 100㎕를 적합한 웰로 피펫을 사용하여 옮긴다.
분석 완충액 50㎕를 NSB 웰로 피펫을 사용하여 옮긴다.
청색 결합체(PGE2와 결합된 알칼란 포스파타제의 청색 용액) 50㎕를 전체 활성(TA) 및 블랭크 웰을 제외한 각각의 웰로 피펫을 사용하여 옮긴다.
황색 항체(PGE2에 대한 모노클로날 항체의 황색 용액) 50㎕를 블랭크, TA 및 NSB 웰을 제외한 각 웰에 피펫을 사용하여 옮긴다.
제조된 플레이트 밀봉제로 보호된 플레이트를 4℃에서 밤새(18 내지 24시간) 항온처리한다.
웰을 비우고 각각의 웰에 세척액 200㎕를 가하여 세척한다. 세척을 2회이상 반복하여 총 3회 세척한다. 최종 세척 후, 웰을 비우고 플레이트를 린트 없는 종이 타월 위에 강하게 두드려 어떠한 잔존하는 세척 완충액이라도 제거한다.
청색 결합체 5㎕를 TA 웰에 가한다.
p-NPP(p-니트로페닐 포스페이트) 200㎕ 기질 용액을 각각의 웰에 가한다.
플레이트를 덮고 37℃에서 1시간 동안 흔들지 않고 항온처리한다.
정지 용액(인산삼나트륨) 50㎕를 각각의 웰에 가한다. 플레이트를 정지 용액을 가한 즉시 판독한다.
플레이트는 블랭크 웰에 대하여 플레이트 판독기에서 블랭크시킨다. 웰의 광학 밀도를 405nm에서, 바람직하게는 570 내지 590nm에서 보정하면서 판독한다.
샘플 중의 PGE2의 농도 계산은 바람직하게는 "AssayZap"(판매원: Biosoft(Ferguson, MO) 등의 4-매개변수 로그 곡선 핏팅 프로그램을 이용한 면역분석 소프트웨어로 수행한다. 또 다른 방법으로, PGE2의 농도는 다음과 같이 계산할 수 있다:
각각의 표준물 및 샘플에 대해 결합된 평균 순 광학 밀도(OD)를 결합된 평균 OD에서 평균 NSB OD를 공제하여 계산한다.
최대 결합 웰(B0)의 %로서의 각각의 표준물 웰 쌍의 결합을 다음의 수학식 2를 사용하여 계산한다:
표준물에 대한 결합률(%) 대 PGE2의 농도를 로짓-로그지를 사용하여 플로팅한다. 밝혀지지 않은 물질 중의 PGE2의 농도는 내삽법으로 측정할 수 있다.
결합률(%) 대 PGE2농도의 통상적인 표준 곡선을 도 1에 나타낸다.
엔도겐 인코포레이티드의 인터류킨-1α ELISA
분석은 제공된 항사람 IL-1α예비 피복 스트립웰(stripwell) 플레이트에서 수행한다.
보정 곡선을 만들기 위해, IL-1α농도를 400, 160, 64, 25.6, 10.24, 6.12, 3.06 및 0pg/mL으로 연속 희석하여 표준물을 제조한다.
각 표준물 및 샘플 50μL를 시험 웰에 2회 가한다. 당해 플레이트는 접착 플레이트 커버로 덮고 실온에서 20 내지 25℃로 한 시간 동안 항온처리한다.
비오티닐화된 항체 시약 50μL를 각 웰에 가한다. 당해 플레이트는 접착 플레이트 커버로 덮고 실온에서 한 시간 동안 추가로 항온처리한다.
항온처리 기간 말기에, 플레이트의 커버를 조심스럽게 제거하고 플레이트를 세척 완충액으로 3회 세척한다. 세번째 세척물을 제거한 후, 플레이트를 종이 타올 및 기타 흡수재 위에서 약하게 두드린다.
스트렙트아비딘-고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 100μL를 각 웰에 가한다. 새로운 접착 플레이트 커버를 부착하고, 플레이트를 실온에서 30분 동안 항온처리한다.
항온처리 기간 말기에, 플레이트의 커버를 제거하고 웰을 세척 완충액으로 3회 세척한다. 이어서 플레이트를 종이 타올 또는 기타 흡수재 위에서 약하게 두드린다.
3,3'5,5'-테트라메틸 벤지딘 디하이드로클로라이드(TMB) 기질 용액 10μL를 각 웰에 가한다. 플레이트를 실온, 암실에서 30분 동안 기질과 반응시킨다. 30분 후, 정지 용액 100μL를 각 웰에 가하여 반응을 정지시킨다.
반응이 중지된 지 30분 이내에 플레이트를 450 및 550nm로 설정된 플레이트 판독기에서 판독한다. 450nm의 판독에서 550nm의 판독을 공제한다. 이중 파장의 판독을 미세역가 플레이트에서 광학 결함에 대하여 보정한다.
표준 곡선을 사용하여 미지의 샘플 중의 IL-1α의 양을 결정한다. 표준 곡선은 각각의 표준 농도 대 IL-1α농도에 대하여 수득되는 평균 흡수(450-550nm)를 플롯팅하여 결정한다. 통상적인 플롯은 도 2에 나타낸다. 4-매개변수 로그 곡선을 플롯팅하기 위해 그래프 용지 또는 곡선 조정 통계 소프트웨어 패키지를 사용하여 수동으로 결정하는 것이 공지되어 있지 않다. 각 시료중의 IL-1α의 양은 표준 곡선을 이용하여 흡수값에서 IL-1α농도로 기입하여 결정한다.
피어스 BCA 시약을 사용한 단백질 분석
피어스 BCA 단백질 분석은 알칼린 매질에서 단백질에 의한 Cu2+의 Cu+1로의 널리 공지된 환원을 비신코닌산을 함유하는 시약을 사용한 구리 이온의 고도의 감도 및 선택성 비색 검출과 조합한다. 당해 분석의 자색 반응 생성물은 BCA의 2개 분자를 1개의 구리 이온으로 킬레이트화시켜 형성한다. 수용성 복합체는, 단백질 농도의 광범위한 작동 범위에 걸쳐 선형인, 562nm에서 강력한 흡광도를 나타낸다.
BCA 단백질 분석은 2개의 BCA 시약 및 알부민 표준물로 구성된다. BCA 시약A는 수산화나트륨 용액에 탄산나트륨, 중탄산나트륨, 비신코닌산 및 나트륨 타르트레이트를 함유한다. BCA 시약 B는 4% 황산구리를 함유한다. BCA 작동 시약(WR)은 BCA 시약 A 50부를 BCA 시약 B 1부와 혼합하여 제조한다. WR은 실온의 밀폐 용기에서 수일 동안 안정하다.
알부민 표준물은 0.9% 염수 및 0.05% 나트륨 아지드 중에 소 혈청 알부민(BSA)을 2.0mg/mL(2,000㎍/mL)의 농도로 함유한다. 표준물을 희석제로 희석시켜 농도가 5㎍/ml 이하인 표준물을 제조한다.
표준물과 비공지된 샘플 각각 25㎕를 적절한 마이크로웰 플레이트 웰로 피펫팅한다. 희석물 25㎕가 블랭크 웰로서 사용된다.
WR 200㎕를 각 웰에 가한다. 플레이트를 30초 동안 플레이트 진탕기로 양호하게 혼합한다. 플레이트를 덮고, 37℃에서 30분 동안 항온처리한다. 이어서, 플레이트를 실온으로 냉각시키고, 각 웰의 흡광도를 562nm에서 플레이트 판독기로 판독한다.
블랭크의 평균 562nm 흡광도를 다른 모든 개개 표준물 및 미지의 샘플의 판독치로부터 공제한다. 표준 곡선은 표준물 각각에 대한 평균 블랭크 보정된 판독치를 이의 농도(㎍/mL)에 대해 플롯팅하여 작성한다. 표준 곡선을 사용하여 미지의 샘플 각각의 단백질 농도를 측정한다. 또는, 위에 언급된 곡선 조정 소프트웨어를 미지의 샘플의 정량화에 사용할 수 있다.
실시예 1 - 피부에 미치는 수분의 자극 효과를 측정하는 방법
준임상적인 효과를 측정하는 방법의 감도를 정하기 위한 수단으로서, 2개의자극이 적은 유체를 선택하여 제품 노출 후의 염증 유발 가능성을 측정한다. 고려할 수 있는 가장 자극이 적은 유체 중의 몇가지로는 피부 세정 동안 존재할 뿐만 아니라 다수의 국부 피부 케어 제품의 주성분으로서 존재하는 상이한 유형의 물이 있다. 당해 실시예에서, 본 발명자들은 피부를 탈이온수와 용수에 노출시킨 후 PGE2를 마커로서 사용하여 피부의 염증 반응을 측정하였다.
방법은 다음과 같다:
1. 피부 표면에 존재하는 분비물 중에 함유되어 있는 PGE2의 기저(비처리 대조군 값에 상응함) 수준을 시험 패널의 전완 아랫쪽을 따라, 자극이 적은 접착제로 피복된 미공질 플라스틱 필름[제품명; 세부테이프(Sebutape)R, 제조원; Cuderm Corporation]을 접착면이 아래로 향하도록 하여 피부 위에 놓고 피부와 직접 접촉시킴으로써 측정한다. 1분 후 세부테이프R를 피부에서 떼어낸 다음 500㎕ 염수가 있는 바이알에 넣는다. 이러한 세부테이프R수거 공정을, 각각의 세부테이프R의 접촉시간을 1분으로 하여, 3회 이상 반복 수행한다. 수거한 샘플을 분석(아래에 기재함)할 때까지 -70℃에서 보관한다.
2. 시험 유체(탈이온수 또는 수돗물) 400㎕를 함유한 힐 탑 챔버(Hill Top chamber, 제조원; Hill Top Research)를 시험 패널의 전완 아랫쪽에 적용한다. 노출시킨지 4시간 후, 힐 탑 챔버를 떼어내고 시험 부위를 용수로 세정하고 가볍게 두드리면서 말린다.
3. 힐 탑 챔버를 떼어내고 팔을 헹구어 가볍게 두드리면서 말린지 24시간 후에, 피부 표면에 발현된 PGE2를 함유하는 피부 분비물을 앞서 단계 #1에서 이미 언급한 세부테이프 흡수법을 사용하여 수거한다. 피부에 시험 제품 또는 공정을 노출한 후의 어느 시점에서도 염증 매개체를 수거할 수 있지만, 노출시킨지 약 24시간 후에 피부에 발현된 PGE2의 수준을 측정하는 것이 바람직한데, 그 이유는 PGE2발현에 대한 동력학적 연구에서 PGE2의 수준은 노출 직후보다는 노출시킨지 24시간 경과 후에 가장 높은 것으로 밝혀졌기 때문이다.
수거한 세부테이프R샘플을 다음의 방법을 사용하여 분석한다. 샘플을 해동시킨 후, 15분 동안 초음파 처리하여 격렬하게 교반한다. 추출된 단백질과 에이코사노이드를 함유한 용액에 대해, 면역분석(분석 디자인 고감도 PGE2효소 면역분석 #93001)을 통해 PGE2수준을 분석하고 비신코닌산(BCA) 단백질 분석(키트 #23225, 제조원; Pierce Chemical Company)을 사용하여 총 단백질 농도를 분석한다.
각각의 시험 부위로부터 4개의 세부테이프R를 취한다. 측정한 PGE2수준(단위 pg/㎖)을 각각의 세부테이프R스트립으로부터 추출한 단백질 총량(단위 ㎍/㎖)에 대해 표준화시킨다. 이어서, 표준화된 4개의 값을 평균하여 각 시험 부위에 대한 PGE2수준(단위 pg/㎖)을 결정한다. 개인별 차이를 설명하기 위해, 각 패널의 PGE2수준을 비처리 대조군을 대상으로 측정한 PGE2수준에 대해 표준화시킨다.
상기한 방법을 사용하여 용수에 의해 가해지는 자극도를 탈이온수와 비교하여 표 1에 나타낸다.
PGE2의 표준화된 수준(무차원 단위)
패널 탈이온수 용수
1 0.40 0.52
2 0.56 0.85
3 0.62 0.89
4 0.69 0.72
5 0.92 1.41
6 0.84 1.51
7 0.93 1.40
8 1.71 1.45
9 1.01 2.33
10 0.94 2.08
평균 0.86 1.32
표 1에서 입증된 바와 같이, 당해 방법은 상이한 유형의 물에 의해 유도된 염증 또는 자극의 정도를 구별할 수 있는데, 용수가 탈이온수보다 피부 표면에 대해 염증 매개체 PGE2를 대략 35% 더 많이 발현시킨다.
실시예 2 - 음이온성 계면활성제와 인터류킨-1 알파(IL-1α)와의 상호작용 가능성
IL-1α를 염증 또는 자극의 마커로서 사용하는 경우의 우려들 중의 하나는 종종 국소 피부 케어 조성물에 함유되어 있는 계면활성제와 이의 상호작용 가능성이다. 당해 실시예는 피부에 대해 발현된 겉보기 IL-1α의 수준에 의해 측정된 바와 같은 상호작용을 시험 유체 속의 나트륨 라우릴 설페이트[SLS, 미국 일리노이주 노쓰필드에 소재하는 스테판 캄파니(Stepan Co.)]의 농도 함수로서 설명한다.
SLS 농도 함수로서 묽은 SLS 용액에 의해 발생된 자극도를 실시예 1에서 기재한 방법을 사용하여 평가하는데, 단 PGE2가 아니라 인터류킨-1α(IL-1α)의 농도가 자극도를 평가하는 데 사용된다. 면역분석법[Human IL-1α Kit #EH2-IL1a, 미국 매사추세츠주 우번에 소재하는 엔도겐, 인코포레이티드(Endogen, Inc.)]을 통해 IL-1α의 농도를 측정한다. AGE2를 사용하는 경우와 마찬가지로, 측정된 IL-1α의 수준(pg/ml)을 각각의 세부테이프(SebutapeR)로부터 추출된 단백질의 총량(μg/ml)에 대해 표준화한다. 사람간의 다양성을 고려하기 위해서, 각각의 처리 부위에 대한 IL-1α 수준을 미처리 대조군에 대해 측정된 IL-1α의 기저 수준을 사용하여 추가로 표준화한다. 데이타를 다음 표 2에 기재한다.
IL-1α의 표준화된 수준(무차원 단위)
탈이온수 속의 SLS 농도(w/w%) IL-1α의 농도(무차원 단위)
0 1.35
5 2.83
10 2.71
20 1.00
표 2는 피부를 다양한 농도의 SLS에 노출시킨 후에 IL-1α의 농도 의존성 데이타를 나타낸다. 염증 또는 반응 마커의 양은 음이온성 계면활성제 SLS의 농도가 증가함에 따라 증가할 것으로 예상된다. 낮은 SLS 수준에서는 이러한 현상이 관찰되지만, 연구 동안에 시험된 최고 SLS 농도에서는 이러한 현상이 관찰되지 않아서 방법의 신뢰성에 대한 이의가 제기될 수 있다. 이론에 결부시키고 싶지 않지만, 고농도의 SLS와 같은 음이온성 계면활성제는 IL-1α와 같은 단백질과 상호작용을하여 단백질을 변성시킬 수 있는 것으로 생각된다. 이러한 과정은 면역 측정법에 영향을 미치고 당해 실험에서 최고 SLS 농도에서 보다 낮은 겉보기 수준의 IL-1α가 관찰될 수 있다. 면역분석법을 사용하여 IL-1α의 농도를 분석하는 경우, SLS는 단백질의 형태를 변화시킬 수 있어, 이는 분석에 사용된 항체가 인지 못할 수 있다. 따라서, 자극도를 평가하기 위해 IL-1α의 수준을 사용하는 것은 이러한 계면활성제-단백질 상호작용 가능성으로 인해 제한된다.
실시예 3 - 온순한 세안제(mild facial cleanser)에 의한 자극
실시예 1의 방법을 확장하여, 탈이온수의 염증 또는 자극도와 비교하여 온순한 세안제[Neutrogena Fresh Foaming Cleanser, 미국 캘리포니아주 로스앤젤레스에 소재하는 류트로지나 코포레이션(Neutrogena Corporation)] 희석용액(탈이온수 속의 8w/w%)에 의해 유도된 염증 또는 자극도를 측정한다.
당해 클렌저 조성물의 성분을 표 3에 기재한다.
온순한 세안제의 조성
정제수
글리세린
라우릴 클루코사이드
데실 클루코사이드
코코미도프로필 베타인
코크아미드 DEA
글리세레트-7
암모늄 라우레트 설페이트
나트륨 코코일 사르코시네이트
글리콜 스테아레이트
PEG-120 메틸 글루코스 디올레에이트
사나트륨 EDTA
DMDM 하이단토인
시트르산
방향제
위에 기재된 방법을 사용하여 PGE2의 발현된 수준에 의해 지적되는 바와 같이 탈이온수의 자극도와 비교하여 세안제에 의해 유도된 자극도를 표 4에 나타낸다.
PGE2의 표준화된 수준(무차원 단위)
패널 탈이온수 세안제
1 1.98 1.81
2 1.48 1.26
3 1.30 0.67
4 0.83 2.11
5 1.49 1.72
6 2.12 3.07
7 1.25 2.38
8 1.60 3.03
9 1.77 3.05
10 1.45 0.85
평균 1.53 2.00
표 4의 결과는 이들 온순한 세안제 제품의 염증 반응이 위에서 언급한 방법론을 사용하는 경우 다를 수 있음을 입증한다. 이들 온순한 세안제에 피부를 노출하는 경우, 탈이온수보다 염증 또는 자극이 보다 크지만, 온순한 세안제에 의해 발생된 자극도는 탈이온수만으로 발생된 경우보다 약 24%정도만 크다.
본원에서 인용된 다수의 자극 결과가 절대적이지 않고, 이들이 1년중 특정 시기에 특정 패널 집단에 대해 수득된다는 것을 인식하는 것이 중요하다. 사람 각각은 동일한 국소 피부 케어 제품에 노출시 상이한 염증 반응을 나타내는 것으로 공지되었다. 또한, 1년중 보다 덥고 보다 눅눅한 시기(즉, 여름) 동안 각질층의 외상은 1년중 보다 춥고, 건조한 시기(즉, 겨울) 동안보다 적은 효과를 갖는다는 것도 또한 공지되었다. 따라서, 이러한 변수를 고려하지 않고 상이한 연구 각각에대해 측정된 실제 가치를 비교하지 않는 것이 중요하다.
실시예 4- 외부 침해로의 노출
본 발명의 방법을 확대하여 외부 침해, 예를 들어 국소 피부 케어 제품을 도포기로 제공한 자극을 시험한다. 당해 실시예에서, 베이비 수건(GerberRBaby Washcloth)으로 문지름으로써 유발되는 염증 또는 자극 수준을 보통 수건(St.Mary'sR-Division of Fieldcrest Cannon, Inc.)을 사용함으로써 유발되는 자극 수준과 비교한다.
염증 또는 자극을 평가하는데 사용된 방법은 자극제를 팔에 도포하기 위해 Hill Top ChamberR을 사용하는 대신, 다음과 같은 닦기 프로토콜을 사용하는 것 이외에는 실시예 1의 방법과 유사하다. 각각의 수건(베이비 면 수건 대 일반 면 수건)을 용수 중의 Johnson'sRHead-to-ToeTM베이비 바쓰(Johnson & Johnson Consumer Products Company, Skillman, New Jersey, 표 5에 제시된 성분 목록)용 8%(w/w) 희석액으로 포화시킨다. 손바닥 전완 상의 각 위치를 2분 동안 문지른다. 세척 후, 팔을 물로 세정하고, 가볍게 두드려 건조시킨다. PGE2수준을 분석하여 표 6에 기록한다.
베이비 바쓰 조성물
물
PEG-80 소르비탄 라우레이트
나트륨 라우레쓰 설페이트
코크아미도프로필 베타인
PEG-150 디스테아레이트
나트륨 라우로암포 PG-아세테이트 포스페이트
글리세린
폴리쿠아테르늄-10
방향제
쿠아테르늄-15
사나트륨 EDTA
표준화된 PGE2의 수준(무차원 단위)
패널 베이비 목욕수건 일반 목욕수건
1 0.84 1.31
2 1.08 0.88
3 1.13 1.19
4 1.02 1.08
5 0.87 1.29
6 1.35 0.89
7 1.17 0.92
8 0.70 1.13
9 1.17 1.29
10 0.57 1.10
평균 0.99 1.11
표 6으로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 방법은 외부 침해에 노출시킴으로써 유발되는 염증 또는 자극 수준 사이를 구별하는데 유용하다. 본 발명의 방법은 베이비 수건으로 닦는 것 대 일반 수건으로 닦는 것 사이의 방향적 차이를 나타내고, 베이비 수건으로 닦는 것이 일반 수건으로 닦는 것보다 자극을 덜 유발한다.
실시예 5- 국소 피부 케어 제품과 관련하여 외부 침해
본 발명의 방법을 외부 침해에 동시에 노출시키면서 상이한 국소 피부 케어제품을 비교하는데 적용할 수 있다. 당해 실시예에서, 베이비 바쓰의 묽은 용액으로의 문지름을 용수 만으로의 문지름과 비교한다. 베이비 바쓰는 용수 중의 Johnson'sRHead-to-ToeTM베이비 바쓰(Johnson & Johnson Consumer Products Company, Skillman, New Jersey, 상기 표 5에 제시된 성분 목록)의 10%(w/w) 희석액이다.
염증 또는 자극은 손바닥 전완을 Dia-stronRWash Simulator(cyberDerm, Inc., Media, Pennsylvania)를 사용하여 세척하는데 Hill Top ChamberR을 사용하는 대신, 물 2ml 또는 베이비 바쓰의 묽은 용액 2ml를 사용하는 것 이외에는, 실시예 1에 기술된 바와 같이 평가한다. 각 부위를 2분 동안 닦는다. 닦은 후, 팔을 물로 세정하고, 가볍게 두드려 건조시킨다. PGE2결과를 표 7에 기록한다.
표준화된 PGE2의 수준(무차원 단위)
패널 용수로 닦음 베이비 바쓰로 닦음
1 0.68 0.62
2 0.76 0.62
3 1.22 0.50
4 1.28 0.30
5 1.29 0.67
6 0.90 0.65
7 0.47 0.44
8 1.40 0.66
9 0.21 0.11
10 0.11 0.17
평균 0.83 0.47
표 7에서 입증되는 바와 같이, 본 발명의 방법은 외부 침해에 동시 노출하는동안 국소 피부 케어 제품의 상대적인 자극을 시험하는데 사용될 수 있다. 용수로만 목욕하면 온순한 베이비 바쓰로 목욕하는 것보다 자극을 더 많이 유발한다.
실시예 6- IL-1α의 수준을 통해 외부 침해의 평가
상기 실시예들은 국소 피부 케어 제품에 대한 노출 또는 외부 침해에 대한 노출로 인한 염증 또는 자극 수준 사이를 구별하는 PGE2의 능력을 입증했다. 또한, 이전의 작업은 심각한 질환 상태를 특성화하는 사이토킨의 용도 뿐만 아니라, 사이토킨 수준, 예를 들어 IL-1α와 나트륨 라우릴 설페이트 도포에 의해 유발되는 염증량 사이의 상관관계를 보여준다. 당해 실시예에서, 본 발명자들은 본 발명의 방법이 외부 침해에 의해 유발되는 염증 또는 자극 수준의 척도로서 IL-1α의 수준을 모니터하는데 어떻게 적용되는지, 예를 들어 국소 피부 케어 제품을 피부에 도포하는 방법을 보여준다. 당해 실시예에서, 베이비 수건으로 닦음으로써 유발되는 염증 또는 자극 수준을 보통 수건을 사용할 때의 자극 수준과 비교한다.
2개의 도포기에 의해 유발되는 상대적인 자극을 다음과 같은 닦기 프로토콜이 힐 탑 탬버R대신 사용되는 것 이외에는, 실시예 1의 방법을 사용하여 평가한다. 각 수건(Baby Cotton Washcloth- GerberRBaby Washcloth, Regular Cotton Washcloth- St.Mary'sR-Division of Fieldcrest Cannon, Inc,)을 용수 중의 Johnson'sRHead-to-ToeTM베이비 바쓰(Johnson & Johnson Consumer Products Company, Skillman, New Jersey, 상기 표 5에 제시된 성분 목록)의 8%(w/w) 희석액으로 포화시킨다. 손바닥 전완 상의 각 위치를 2분 동안 닦는다. 세척 후, 팔을 물로 세정하고, 가볍게 두드려 건조시킨다. 또한, 실시예 1과 반대로, PGE2보다 IL-1α 수준을 염증 또는 자극 수준의 척도로서 모니터한다. 면역분석(Endogen Human IL-1αKit #EH2-IL 1a)을 통해 IL-1α 수준을 평가하고, 이 값을 표 8에 기록한다.
표준화된 IL-1α의 수준(무차원 단위)
패널 베이비 목욕수건 일반 목욕수건
1 0.73 0.52
2 1.59 0.79
3 0.97 1.44
4 0.92 1.78
5 0.50 0.46
6 0.42 0.36
7 0.27 1.00
8 1.54 1.96
9 1.23 2.62
평균 0.91 1.22
표 8로부터 알 수 있는 바와 같이, Il-1α 측정이 상이한 형태의 수건으로 닦는 것과 같이 외부 침해에 노출시킴으로써 유발되는 염증 또는 자극 수준 간격을 구별하는데 사용될 수 있다. 베이비 수건으로 닦는 것이 일반 수건으로 닦는 것보다 자극을 덜 유발한다.
또한, 국소 피부 케어 제품 및/또는 외부 침해에 대한 노출에 의해 유발되는 염증 또는 자극의 보다 완전한 징후는 PGE2와 관련하여 IL-1α 수준을 모니터함으로써 수득될 수 있다. 실시예 4에서 PGE2에 대해 이미 제시된 결과와 당해 실시예의결과를 혼합하면 상이한 형태의 수건으로 닦아 발생하는 염증에 대한 효과의 보다 광범위한 숙지를 제공하는데, 이는 본 발명자들이 아라키돈산 경로 뿐만 아니라 사이토킨 경로의 1차 전염증 매개체를 측정하는 것이기 때문이다.
피부의 국소 피부 케어 제품에 대한 노출, 외부 침해에 대한 노출 또는 이의 복합 요인에 대한 노출로 인한 포유동물 피부의 준임상적 또는 임상적 염증 또는 자극을 측정하기 위한 본 발명의 생체내 방법은 생체내 염증 또는 자극에 대한 각종 매개체의 양을 측정함으로써 신체 또는 외모를 손상시키지 않으면서 신속하고 고감도로 이를 비침해적으로 측정할 수 있다.

Claims (36)

  1. (a) 비침해성 수거 장치를 사용하는 비침해성 수거 과정을 이용하여 피부의 표면으로부터 분비물을 수거하는 단계 및
    (b) 상기 장치에 의해 피부 표면으로부터 수거된 분비물 중의 하나 이상의 에이코사노이드의 수준을 분석하는 단계를 포함하여, 포유동물 피부의 임상적 또는 준임상적 염증 또는 자극의 마커를 측정하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 비침해성 수거 장치가 비피복된 무공질 플라스틱 필름, 비피복된 미공질 플라스틱 필름, 접착제-피복된 무공질 플라스틱 필름, 접착제-피복된 미공질 플라스틱 필름, 섬유 직물, 섬유 부직포, 천연 스폰지, 합성 스폰지 및 플라스틱 발포체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 장치인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 비침해성 수거 장치가 접착제-피복된 미공질 플라스틱 필름인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 에이코사노이드가 프로스타글란딘인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 프로스타글란딘이 프로스타글란딘 E2인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 에이코사노이드의 수준을 RIA, EIA 및 ELISA로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 면역분석 기술을 이용하여 분석하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 에이코사노이드의 수준을 GC/MS, HPLC 및 TLC로 이루어진 그룹으로부터 선택된 분석 기술을 이용하여 분석하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 비침해성 수거 장치에 의해 피부 표면으로부터 수거된 분비물 중의 하나 이상의 사이토킨의 수준을 분석하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 사이토킨이 인터류킨-1α인 방법.
  10. 제8항에 있어서, 사이토킨이 인터류킨-1α이고, 에이코사노이드가 프로스타글란딘 E2인 방법.
  11. (a) 비침해성 수거 장치를 포함하는 비침해성 수거 과정을 이용하여 피부 표면으로부터 분비물을 수거하는 단계,
    (b) 피부 표면으로부터 수거된 분비물 중의 에이코사노이드의 기저 수준을 측정하는 단계,
    (c) 피부를 국소 피부 케어 제품, 외부 침해 또는 이의 복합 요인에 노출시키는 단계,
    (d) 단계 (c) 후에 비침해성 수거 장치를 사용하여 피부 표면으로부터 분비물을 수거하는 단계,
    (e) 단계 (c) 후에 피부 표면으로부터 수거된 분비물 중의 에이코사노이드의 수준을 측정하는 단계 및
    (f) 단계 (e)에서 측정된 에이코사노이드의 수준을 단계 (b)에서 측정된 에이코사노이드의 수준과 비교하는 단계를 포함하여, 피부의 국소 피부 케어 제품, 외부 침해 또는 이의 복합 요인에 대한 노출로부터 포유동물 피부의 준임상적 또는 임상적 염증 또는 자극을 측정하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 비침해성 수거 과정이 비피복된 무공질 플라스틱 필름, 비피복된 미공질 플라스틱 필름, 접착제-피복된 무공질 플라스틱 필름, 접착제-피복된 미공질 플라스틱 필름, 섬유 직물, 섬유 부직포, 천연 스폰지, 합성 스폰지 및 플라스틱 발포체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 비침해성 수거 장치를 사용함을 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 비침해성 수거 장치가 접착제-피복된 미공질 플라스틱 필름을 포함하는 방법.
  14. 제11항에 있어서, 에이코사노이드가 프로스타글란딘인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 프로스타글란딘이 프로스타글란딘 E2인 방법.
  16. 제11항에 있어서, 에이코사노이드의 수준을 RIA, EIA 및 ELISA로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 면역분석 기술을 사용하여 측정하는 방법.
  17. 제11항에 있어서, 에이코사노이드의 수준을 GC/MS, HPLC 및 TLC로 이루어진 그룹으로부터 선택된 분석 기술을 사용하여 측정하는 방법.
  18. 제11항에 있어서, 단계 (c) 전후에, 비침해성 수거 장치에 의해 피부 표면으로부터 수거된 분비물 중의 하나 이상의 사이토킨의 수준을 분석하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 사이토킨이 인터류킨-1α인 방법.
  20. 제18항에 있어서, 사이토킨이 인터류킨-1α이고, 에이코사노이드가 프로스타글란딘 E2인 방법.
  21. 제11항에 있어서, 단계 (d)가 단계 (c)이후 약 24시간 만에 수행되는 방법.
  22. 제11항에 있어서, 피부 분비물 중의 단백질의 수준을 측정하고, 에이코사노이드의 수준을 단백질의 수준으로 표준화시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  23. (a) 피부 표면으로부터 분비물을 수거하기 위한 비침해성 수거 장치 및
    (b) 당해 분비물 중의 에이코사이노이드의 수준을 측정하기 위한 면역분석법을 포함하는, 포유동물 피부의 준임상적 또는 임상적 염증 또는 자극의 마커 측정용 키트.
  24. 제23항에 있어서, 비침해성 수거 장치가 비피복된 무공질 플라스틱 필름, 비피복된 미공질 플라스틱 필름, 접착제-피복된 무공질 플라스틱 필름, 접착제-피복된 미공질 플라스틱 필름, 섬유 직물, 섬유 부직포, 천연 스폰지, 합성 스폰지 및 플라스틱 발포체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 장치인 키트.
  25. 제24항에 있어서, 비침해성 수거 장치가 접착제-피복된 미공질 플라스틱 필름을 포함하는 키트.
  26. 제23항에 있어서, 면역분석법이 RIA, EIA 및 ELISA로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 키트.
  27. 제23항에 있어서, 면역분석법이 ELISA인 키트.
  28. 제23항에 있어서, 에이코사노이드가 프로스타글란딘인 키트.
  29. 제28항에 있어서, 프로스타글란딘이 프로스타글란딘 E2인 키트.
  30. 제23항에 있어서, 면역분석법이 에이코사노이드에 대한 항체 및 당해 면역분석용 다중-웰 플레이트를 포함하는 키트.
  31. 제30항에 있어서, 면역분석법이 에이코사노이드 또는 항체와 결합된 효소를 추가로 포함하는 키트.
  32. 제31항에 있어서, 효소에 대한 기질을 추가로 포함하는 키트.
  33. 제23항에 있어서, 분비물 중의 사이토킨의 수준을 추가로 측정하기 위한 면역분석법을 추가로 포함하는 키트.
  34. 제33항에 있어서, 사이토킨이 인터류킨-1α인 키트.
  35. 제33항에 있어서, 에이코사노이드가 프로스타글란딘 E2이고, 사이토킨이 인터류킨-1α인 키트.
  36. 제23항에 있어서, 하나 이상의 국소 피부 케어 제품, 하나 이상의 외부 침해 또는 이의 복합 요인에 대한 피부의 노출로 인한 포유동물 피부의 준임상적 또는 임상적 염증 또는 자극을 측정하는데 사용됨을 특징으로하는 키트.
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