KR20030039541A

KR20030039541A - 표적지향형 항암특성을 가지는 암세포 특이 전달자

Info

Publication number: KR20030039541A
Application number: KR1020010070490A
Authority: KR
Inventors: 변영로; 박경순; 김성철
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2001-11-13
Filing date: 2001-11-13
Publication date: 2003-05-22

Abstract

본 발명은 암 세포의 특성 중의 하나인 신규관형성현상(angiogenesis)을 이용하여 항암제가 결합된 생분해성 고분자를 이용해 암세포의 주위에 존재하는 효소에 의해 분해되어 항암제가 목적하는 세포에만 방출될 수 있도록 하는 표적지향형 항암특성을 가지는 암세포 특이 전달자에 관한 것이다.

본 발명은 모든 암세포에 특이적으로 관찰되는 신규관형성현상을 기본개념으로 하여 이에 관여하는 기질 금속 단백 분해효소에 의해 분해되는 단백질 또는 펩타이드를 항암물질의 전달매체로 함으로써 정상세포에서의 세포독성은 제거되면서 적은 양의 투약으로도 소기의 항암효과를 달성할 수 있는 항암물질을 함유하는 신규 고분자 전달자를 제공함을 목적으로 한다.

Description

표적지향형 항암특성을 가지는 암세포 특이 전달자{Polymeric anticancer drug carrier having specific cancer targeting property}

지금까지 암 치료를 위해 수많은 항암제와 다양한 암 치료법이 개발되어 왔지만, 항암제는 암세포 뿐만 아니라 정상세포에 대해서도 독성효과를 보이고, 암세포가 성장, 증식과 전이를 일으키는 과정에서 변이되면서 항암제에 대한 저항성을 보이는 등 암 치료의 커다란 문제점으로 대두되고 있다. 이러한 원인은 대부분의 항암제가 1,000 이하의 분자량을 가지고 있기 때문에, 항암제를 투여하였을 경우 암 조직 뿐 아니라 정상조직에도 침투하여 정상조직에 영향을 끼치고, 뿐만 아니라 작은 분자량을 가지고 있기 때문에 체내에서 오줌으로 쉽게 배출되어 암 치료에 있어서 많은 양의 약물이 요구되는데서 기인된다. 그러므로, 항암제가 지니는 정상세포에 대한 독성, 몸밖으로의 배출, 그리고 암세포의 저항성이 암 치료에 있어서 가장 큰 문제로 대두되며, 이는 현대 의학이 반드시 풀어야만 하는 과제이다.

상기와 같은 항암제의 부작용을 줄이기 위한 방안으로 마이크로스피어, 나노입자, 나노스피어, 리포좀, polymer-drug conjugates 와 같은 많은 약물제재가 연구, 개발되어 왔지만 지금까지 개발된 약물제재들은 모두 낮은 약물의 봉입율과 방출특성으로 상기와 같은 문제점이 거의 그대로 노출되고 있어 이에 대한 해결방안의 마련이 매우 절실한 실정이다.

본 발명에서는 암세포에서만 특이적으로 분해되는 단백질 또는 펩타이드에 항암제를 결합함으로써 상기한 문제점을 해결하고자 하였다. 보다 구체적으로는 모든 암세포에 특이적으로 관찰되는 신규관형성현상을 기본개념으로 하여 이에 관여하는 기질 금속 단백 분해효소에 의해 분해되는 단백질 또는 펩타이드를 항암물질의 전달매체로 함으로써 정상세포에서의 세포독성은 제거되면서 적은 양의 투약으로도 소기의 항암효과를 달성할 수 있는 항암물질을 함유하는 신규 고분자 전달자를 제공함에 본 발명의 목적이 있다.

또한 본 발명은 단백질 또는 펩타이드의 용해성을 증진시키기 위해 생분해성 고분자가 도입된 신규 고분자 전달자를 제공함에 또 다른 목적이 있다.

도 1은 DGM의 합성과정.

도 2는 MPEG의 카르복시화 과정도.

도 3은 (a) MPEG-OH 와 (b) MPEG-COOH의 적외선 분광스펙트럼 결과도.

도 4는 MPEG-COOH의 수소핵자기공명 분석 스펙트럼.

도 5는 활성화된 MPEG의 수소핵자기공명 분석 스펙트럼.

도 6은 (a) 젤라틴, (b) 젤라틴-MPEG, (c) 활성화된 젤라틴-MPEG, (d) 독소루비신, (e) DGM의 적외선 분광분석 스펙트럼.

도 7은 (1) 젤라틴, (2) 독소루비신, (3) DGM의 자외선-가시광선 분광분석 스펙트럼.

도 8은 DLS를 이용한 DMG의 크기분석결과.

도 9는 AFM을 이용한 DMG의 크기와 모양 분석결과.

도 10은 타입 Ⅳ 콜라겐분해효소로 분해된 (1) 젤라틴, (2) DGM의 전기영동 에 의한 분해경향성 분석결과.

도 11은 타입 Ⅳ 콜라겐분해효소로 분해된 (a) 젤라틴, (b) DGM의 젤투과크로마토그래피에 의한 분해경향성 분석결과.

도 12는 LLC 세포에 대한 독소루비신과 DGM의 독성실험결과.

본 발명은 기질 금속 단백 분해효소에 의해 분해가능한 단백질 또는 펩타이드를 전달 매체로 하고, 상기 전달 매체에 존재하는 적어도 1이상의 작용기에 표적세포에 전달하고자 하는 항암 물질이 화학적으로 결합되어진 암세포 특이 전달자를 포함한다.

또한 본 발명은 상기 암세포 특이 전달자의 용해성을 높이기 위한 수단으로 상기 전달 매체에 존재하는 적어도 1이상의 작용기에 소정의 생분해성 고분자가 화학적으로 결합된 암세포 특이 전달자를 포함한다.

본 발명은 암세포의 특징 중의 하나인 신규관형성현상(angiogenesis)의 개념을 도입하여 암세포에 특이적으로 발현되는 기질 금속 단백 분해효소(matrix metalloproteinase, MMPs)를 이용한다. 신규관형성현상은 암세포의 가장 중요한 특성 중의 하나로 암세포가 성장하기 위해 산소와 영양분을 공급해줄 새로운 혈관을 형성하는 현상으로 모든 암에 공통적이다. 이와 같이 새로운 혈관이 형성될 수 있도록 암세포는 여러 종류의 효소들(이하 MMPs라 칭함)을 방출하며, 방출된 효소들은 타입Ⅳ콜라겐을 분해하여 새로운 혈관이 형성될 수 있도록 한다. 따라서 정상세포와는 달리 암세포 주변에는 상기 효소들의 농도가 매우 증가되어 있으며 이는 암의 발전단계가 높을수록 더욱 그러하다.

본 발명은 상기와 같이 암세포에 특이적으로 다량으로 존재하는 MMPs에 의해 분해되는 단백질 또는 펩타이드를 항암 물질의 전달매체로 하여 표적세포에서만 분해될 수 있도록 함으로써 암세포로의 약물전달효과를 극대화한다.

이하 본 발명의 암세포 특이 전달자에 관하여 구체적으로 설명한다.

상기 MMPs에 의해 분해가능한 전달 매체로는 특별한 한정을 요하지는 아니한다. 이들 전달 매체의 예를 들면 젤라틴, 콜라겐 및 이들의 유사체 등이 있다. 바람직하기로는 상기 전달매체는 분자량이 500∼1,000,000 달튼인 것에서 선택된다. 만일 분자량이 500 이하이면 전달매체로서의 기능수행이 효과적이지 아니하며, 1,000,000 달튼 이상을 초과하면 약물 전달자로 사용하기에 용해도가 좋지 않아 바람직하지 않다.

상기 전달 매체를 구성하는 아미노산의 작용기로는 아민기, 카르복시기, 하이드록시기 등이 있으며 이들 중 적어도 1이상 항암물질과의 화학적 결합에 제공되어질 수 있다.

생분해성 고분자는 전달 매체가 체내에서 젤화되는 우려가 있는 경우 사용될 수 있다. 이와 같은 생분해성 고분자는 전달 매체의 용해성 증진을 위한 용도로 제공가능한 한 특별한 종류로의 한정을 요하지는 아니한다. 이러한 용도로 제공가능한 생분해성 고분자의 예로서는 폴리에틸렌글리콜, 폴리히드록시에틸메타크릴레이트, 폴리히드록시메틸메타크릴레이트, 폴리아클릴산, 폴리아마이드, 폴리피롤리돈 등이 있으며 또한 이들 분자에 혈액에 존재하는 단백질의 흡착과 면역세포에 의한 공격을 감소시키기 위해 일측 말단을 알킬기로 치환한 것도 본 발명에 적합하다.

상기 생분해성 고분자는 용해성 증진을 위해 바람직하기로 분자량은 400∼100,000 달튼인 것을 사용할 수 있지만 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

항암제는 전달매체인 단백질 또는 펩타이드와 화학적으로 결합가능한 것인 한 특별한 한정을 요하지 아니한다. 즉 기존에 사용되어 오던 독소루비신, 시스플라스틴(cisplastin), 파크리탁셀(paclitaxel), 아이비엠엑스(IBMX) 등을 포함한 다양한 항암제가 이에 포함된다. 상기 항암제와 전달매체와의 화학적 결합으로는 특별히 한정되지 아니하며, 전달매체와 약물의 종류에 따라 상이하다. 이들 가능한 화학결합의 예를 들면 펩티드 결합, 에스테르 결합, 우레탄 결합, 우레아 결합 등이 있으며, 이 이외의 많은 종류의 결합이 여기에 포함된다.

이하 본 발명의 암세포특이적 고분자의 제조방법을 구체적인 예(전달매체: 젤라틴, 생분해성 고분자: 모노메톡시폴리에틸렌글리콜, 항암제: 독소루비신)를 들어 설명하고자 한다.

젤라틴은 18 종류의 필수아미노산으로 구성되어 있으며, 1,000개의 아미노산 잔기로 이루어져 있어서 카르복시기, 아민기, 하이드록시기 등의 다양한 작용기를 가지고 있다. 따라서 목적하는 고분자를 합성하기 위해서는 여러 과정을 거쳐야 한다. 본 발명에서는 젤라틴의 아민기에 활성화된 폴리에틸렌글리콜을 결합한 후, 젤라틴의 카르복시기를 소정의 활성화제[예로 디사이클로헥실카르보디이미드(DCC)와 하이드록시숙신이미드(HOSu)]로 활성화한 다음 활성화된 젤라틴-모노메틸폴리에틸렌글리콜에 독소루비신의 아민기와 결합하는 과정을 통해 독소루비신-젤라틴-모노메틸폴리에틸렌글리콜로 구성되는 암세포특이적 고분자를 합성한다.

젤라틴에 활성화된 모노메톡시폴리에틸렌글리콜을 결합시킬 때 활성화된 모노메톡시폴리에틸렌글리콜은 pH 8.4인 수용액에서 반감기가 45초 정도로써 수용액에서 용이하게 가수분해되므로 가수분해의 최소화를 위해 DMSO:물의 9:1혼합용매에서 반응을 수행함이 바람직하다.

한편 상기 DCC와 HOSu를 이용해 젤라틴의 카르복시기를 활성화하는 단계에서 활성화된 카르복시기와 젤라틴의 아민기와의 결합에 의한 가교가 일어나는 것을 방지하기 위해 젤라틴 카르복시기의 활성화 이전에 아민기를 아세트알데히드 등을 이용하여 보호하도록 한다.

상기 제조방법에 사용되는 항암제인 독소루비신은 전세계적으로 널리 임상에서 적용되고 있으며, 다종의 암에 대한 항암효과가 매우 우수하다. 하지만 독소루비신은 실온에서 그리고 빛에 노출이 되면 글리코시딕 결합이 가수분해될 우려가 있으므로 반응의 수행 중에 빛을 차단할 필요가 있다.

이하 본 발명의 내용을 실시예를 통해 설명하고자 한다. 다만 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 예시일 뿐 본 발명의 권리 범위가 이에 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 지닌 자에게 자명하다 할 것이다.

<실시예> 독소루비신-젤라틴-모노메틸폴리에틸렌글리콜의 제조

도 1에는 독소루비신-젤라틴-모노메틸폴리에틸렌글리콜(DGM)의 제조과정이 정리되어 있다. 이하 상기 과정을 분설하여 상세히 설명하기로 한다.

[모노메톡시폴리에틸렌글리콜(MPEG-OH)의 카르복시화]

재결정된 MPEG-OH 50g(MW 5,000)을 400ml 톨루엔에 녹인 후 130℃에서 azeotropical 방법을 이용해 남아 있는 물을 2∼3시간 정도 제거한 후, 온도를 실온으로 낮추고 2.92g의 포타슘 터셔리-뷰톡사이드[(CH₃)CO^-K⁺]를 첨가하고 6시간 동안 저어주었다. 이때 포타슘 터셔리-뷰톡사이드가 완전히 녹지 않을 경우, 온도를 약 60∼70℃로 올려서 완전히 녹인다. 6시간 후, 4.32 ml의 에틸브로모아세테이트를 주사기를 이용하여 반응기에 넣고 24시간 동안 반응시켰다. 반응이 진행되는 동안 포타슘브로마이드(KBr)가 침전되었다. 침전된 KBr은 여과하여 제거하고, 여과 액은 4℃에서 격렬히 저어주면서 에테르에 침전시켰다. 침전된 고분자를 여과하여, 하루동안 진공상태에서 건조시킨 후, 얻어진 고분자를 250ml의 NaOH 용액에 녹이고, 15 g의 NaCl을 첨가하였다. 2시간 후, 6 N HCl을 이용하여 용액을 pH 3으로 하여 산성화시켰다. 산성화된 용액을 클로로포름을 사용하여 추출한 후, 클로로포름을 분리하고, 마그네슘 설페이트를 넣어 물을 제거하였다. 그런 다음 상기 용액을 여과하여 클로로포름을 어느 정도 날려 용액을 농축시킨 후 에테르에 침전시켰다. 침전된 고분자를 여과하고 이틀 정도 진공상태에서 건조시켜서 카르복시화된 MPEG (MPEG-COOH)를 얻었다(도 2의 과정 참고).

[카르복시화된 모노메톡시폴리에틸렌글리콜(MPEG-COOH)의 활성화]

15g의 카르복시화된 MPEG-COOH를 디클로로메탄에 녹이고, 0.43 g의 하이드록시숙신이미드(HOSu)와 0.74g의 디사이클로헥실카르보디이미드(DCC)를 첨가하였다. 아르곤 조건하에서, 반응 초기 약 1시간 정도는 0℃에서 반응시키고, 그 후 20시간 이상 실온에서 반응시켰다. 침전된 디사이클로헥실유레아(DCU)는 여과하고 여과액은 에테르에 침전하고, 얻어진 활성화된 MPEG를 진공에서 하루 정도 건조시켜 활성화된 MPEG를 얻게되었다. 활성화된 MPEG는 실온에서 불안정하기 때문에 영하 20℃이하의 진공상태인 데시케이터에 보관하였다.

[젤라틴-모노메톡시폴리에틸렌글리콜(Gelatin-MPEG)의 합성]

200mg의 젤라틴(MW 100,000)을 20ml의 디메틸설폭사이드:물(DMSO:H₂O = 9:1) 혼합용액에 넣어 완전히 녹인 후, 활성화된 MPEG 0.66g을 넣고 30분간 반응시킨 후, 0.4ml의 아세트알데히드를 첨가하고 1시간동안 저어주었다. 반응한 후, 불순물 즉 미반응된 DCC, HOSu 그리고 용매인 DMSO를 투석멤브레인(Dialysis membrane, MWCO 50,000)을 이용하여, 45℃ 증류수에 하루 동안 투석하여 반응물을 분리하였다. 투석한 후 얻은 용액을 디클로로메탄을 이용하여 미반응의 MPEG를 제거한 후 2일 정도 동결건조 하여 젤라틴-MPEG를 얻었다.

[젤라틴-MPEG의 활성화와 독소루비신-젤라틴-MPEG(DGM)의 합성]

활성화된 젤라틴-MPEG를 합성하기 위해, 젤라틴-MPEG 200mg을 디메틸설폭사이드에 완전히 녹이고, 0.202g의 DCC와 HOSu 0.113g을 첨가하고, 40시간 동안 실온에서 반응시켰다. 반응 후, 침전된 DCU는 여과하고 여과액은 12시간 동안 증류수에서 투석하여 미반응물을 분리하였다. 투석과정 중에 침전되는 DCU는 여과하고, 여과액은 하루동안 동결건조 하여 활성화된 젤라틴-MPEG를 얻었다. 활성화된 젤라틴-MPEG는 실온에서 불안정하기 때문에, 동결건조하여 얻은 후 반응을 수행하였다.

75mg의 활성화된 젤라틴-MPEG를 2ml의 디메틸포름아미드(DMF)에 녹였다. 10mg의 독소루비신·하이드로클로라이드(Doxorubicin·hydrochloride, DOX)에 1ml의 DMF를 넣고, 100㎕의 트리에틸아민(TEA)를 첨가하였다. TEA가 첨가된 독소루비신 용액을 활성화된 젤라틴-MPEG 용액에 넣고, 24시간 동안 실온에서 반응시켰다. 독소루비신은 빛에 의해 분해될 수 있기 때문에, 반응과정 중에 빛은 차단시켰다. 반응종결 후, DMF에서 이틀 정도 투석하여 미반응의 독소루비신, TEA, 트리에틸암모늄클로라이드를 제거하고, 다시 하루 정도 증류수에서 투석하였다. 투석 후, 2일 정도 동결 건조하여 DGM를 얻었다.

<시험예 1> 화합물의 분석

카르복시화된 MPEG(MPEG-COOH)가 성공적으로 합성이 되었는지를 확인하기 위해 적외선 분광스펙트럼(IR)과 핵자기 공명법(¹H NMR)을 이용하였다. 카르복시화된 MPEG의 적외선 분광스펙트럼(b)에서는 1734 cm^-1에서 카르보닐기(C=O)에 해당하는 피크가 확인되었다(도 3). 카르복시화된 MPEG의¹H NMR 스펙트럼에서는 카르보닐기 옆에 존재하는 -CH₂-에 해당하는 피크가 4.152 ppm에서 나타나는 것으로 보아 성공적으로 카르복시화된 MPEG를 얻어졌음을 알 수 있다(도 4).

카르복시화된 MPEG를 DCC와 HOSu를 이용하여 활성화 한 후, 카르복시화된MPEG가 활성화되었는지를 확인하기 위해서 핵자기 공명법(¹H NMR)을 이용하여 분석하였다. 활성화된 MPEG는 HOSu의 영향 때문에, 카르보닐기와 근접한 -CH₂-의 수소피크는 4.152 ppm에서 4.527 ppm으로 변경되는 것이 확인되었다(도 5). 이 반응의 수득율은 99 %이었다.

합성된 젤라틴-MPEG, 활성화된 젤라틴-MPEG, DGM의 반응은 적외선 분광스펙트럼을 이용하였으며, 젤라틴에 MPEG를 결합한 후, 개질된 정도를 알아보기 위해서는 TNBS(2,4,6-트리니트로벤젠술폰산) 분석방법을 이용하였다. 또한, DGM의 합성여부는 자외흡광분석법(UV-vis 스펙트로스코피)을 이용하여 반응을 확인하였고, 형광분석에 의해 젤라틴-MPEG에 결합된 독소루비신의 양을 결정하였다. 마지막으로, 빛 산란장치(DLS)와 AFM(아로마틱 포스 마이크로스코피)을 이용하여 DGM의 크기와 모양을 결정하였다.

도 6은 상기 적외선 분광스펙트럼의 측정결과로서 젤라틴에 MPEG를 결합한 후, 3300 cm^-1이상에서 젤라틴의 아민기에 해당하는 피크의 크기가 감소하였고, 2800∼2900 cm^-1에서 MPEG의 -CH₂-에 해당하는 피크가 보였고, 1150 cm^-1에서는 MPEG의 -C-O-에 해당하는 피크가 보였다(b). 젤라틴-MPEG를 활성화한 후, 1734 cm^-1에서 보이던 젤라틴의 카르복시기에 해당하는 피크의 크기가 감소하였고, 1753 cm^-1에서 결합 후 형성되는 에스테르기에 해당하는 새로운 피크가 형성되었다. 또한, 3300cm^-1에서 카르복시기의 -OH-에 해당하는 피크의 크기가 감소하였다(c).

활성화된 MPEG와 아세트알데히드를 젤라틴의 아민기와 결합한 후에, 젤라틴 아민기의 개질된 정도를 알아보기 위해 TNBS(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid) 시험을 수행하였다. 4% NaHCO₃1ml과 0.5% TNBS 1ml에 11mg의 시료를 넣고 녹인 후, 40℃에서 4시간 동안 반응 혼합물들을 서서히 흔들어주었다. 4시간 후, 녹지 않은 물질을 가수분해하고 녹이기 위해서 6N HCl 3ml을 첨가하고 1시간 동안 70℃로 열을 가해주었다. 1시간 후, 5ml의 증류수로 희석을 한 후, 희석용액을 20ml의 에테르로 추출하여 과량의 미반응물인 TNBS와 TNP-α-아민기를 제거하였다. 5ml의 수용액 상을 제거하고 15분 정도 뜨거운 물에서 가열하여 남아있는 에테르를 제거하였다. 그리고 나서, 346nm에서 자외선-가시광선 스펙트럼을 이용하여 흡광도를 측정한 결과는 표 1과 같았다.

<표 1>. 활성화된 MPEG와 아세트알데히드로 개질된 젤라틴의 ε-아민기의 수

시료	흡광도	ε-아민기의 수
젤라틴	1.34	33
젤라틴-MPEG	0.583	22
AA-젤라틴-MPEG	0.178	7

활성화된 젤라틴-MPEG에 독소루비신(도 6의 (d))의 아민기를 커플링(coupling)한 결과, 활성화된 젤라틴-MPEG에서 보여주었던 에스테르기의 피크가 사라지고, -OH-에 해당하는 피크의 크기가 증가함을 확인할 수 있었다(도 6의 (e)).

합성된 DGM은 자외선-가시광선 흡광스펙트럼을 이용해서 반응을 확인하였다. 자외선-가시광선 흡광스펙트럼에서, 젤라틴은 280nm이하에서 피크를 보이고 있다(도 7(1)). 독소루비신은 발색단을 가지고 있어서 여러 파장, 즉 253nm, 290nm, 460nm, 481nm, 그리고 519nm 에서 흡광도를 보인다(도 7(2)). DGM에서는 젤라틴과는 달리, 독소루비신에서 보이는 여러 파장에서 흡광도를 보여주었다(도 7(3)).

합성된 DGM에 결합된 독소루비신의 양을 결정하기 위해 형광분석기를 이용하였다. 독소루비신은 495 nm에서 여기하고, 595 nm에서 방출하기 때문에 형광분석이 가능하다. 형광분석 결과, 젤라틴-MPEG 1mg당 18.6㎍의 독소루비신이 결합된 것을 확인하였다.

DLS와 AFM을 이용하여 DGM의 크기와 모양을 결정하였다. DLS를 이용해 분석한 결과, 크기조절을 하지 않은 DGM은 평균적으로 216 nm의 크기를 보였고, 6분 동안 40W와 80W에서 소니케이션한 DGM은 276nm와 266nm의 평균 크기를 가지고 있었다(도 8). 이 결과로부터, DGM은 약 200nm정도의 나노입자의 크기를 지니고 있으며, 크기 조절을 하지 않고도 자가응집형 나노입자를 잘 형성하는 것을 알 수 있다.

또한, AFM(Park Scientific, Inc.)을 이용하여 DGM 나노입자의 모양과 크기를 결정한 결과 DGM 나노입자의 평균 크기는 대략 200 nm이며, DGM 나노입자는 거의 구형의 형태를 보여주었다(도 9).

<시험예 2> 효소에 의한 분해실험

암세포 주위에는 정상조직에서와는 달리 콜라겐 분해효소 타입 IV(젤라틴 분해효소 A와 B)가 높은 농도로 존재한다. 본 실험에서는 젤라틴과 DGM이 상기 효소에 의해 분해되는지 여부를 확인하고자 한다.

젤라틴과 DGM의 효소에 의한 분해는 다양한 시간과 다양한 효소 농도에서 수행되었다. 200㎍의 젤라틴과 DGM을 pH가 7.5이고 0.01M CaCl₂와 0.25M NaCl을 함유하는 0.05M 트리스-HCl 버퍼 100㎕에 녹였다. 효소농도는 젤라틴에 대해서는 100ng/ml, 1㎍/ml, 10㎍/ml이고, DGM에 대해서는 1㎍/ml, 10㎍/ml, 100㎍/ml로 변화시켰으며, 37 ℃에서 효소반응시간은 1분, 5분, 10분, 30분으로 하였다. 각 효소반응은 20mM EDTA용액으로 종결시켰다.

젤라틴과 DGM의 효소에 의한 분해 경향성을 분석하기 위해, 전기영동과 젤투과크로마토그래피(GPC) 분석을 수행하였다. 전기영동은 실온에서 13.5% 폴리아크릴아미드젤에서 수행하였으며, 젤라틴은 0.2% 쿠바시 블루 R-250을 이용하여, 그리고 DGM은 실버나이트레이트를 사용하여 염색하였다. GPC에서는 분해된 젤라틴과 DGM을 동결 건조하여 파우더 형태의 시료를 얻었으며, 0.4wt%의 농도로 0.1N 소듐설페이트에 녹여 시료를 측정하였다(도 10의 (1) 젤라틴, (2) DGM)).

1㎍/ml의 효소농도에서 젤라틴은 10분 이내에 작은 분자들로 분해되었고(a),10㎍/ml(b)에서의 효소농도에서는 1분 이내에 더 작은 분자들로 분해가 되었다. 한편, DGM은 효소농도가 증가하면서 분해되는 정도는 증가하였지만(c,d,e), 젤라틴의 효소에 의한 분해속도를 서로 비교하였을 경우 DGM의 효소에 의한 분해속도는 감소하는 것을 알 수 있었다.

비슷한 결과가 GPC 분석에서도 관찰되었다(도 11). 젤라틴은 10㎍/ml의 효소농도에서 1분 이내에 아주 작은 분자량을 가진 분자들로 분해가 되었다(a). 한편, DGM은 10㎍/ml의 농도에서 분해가 되고 있지만, 매우 느리게 분해가 되고 있는 것을 보여주고 있다(b).

전기영동과 GPC결과로부터, DGM이 타입 IV 콜라겐 분해효소에 의해 분해가 되는 것을 확인하였다. 하지만, 그 분해속도는 젤라틴과 비교하였을 경우 느리다는 것을 알 수 있었다. 이것은, 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 개질된 단백질들은 개질되지 않은 단백질보다 효소분해에 대한 저항성이 크기 때문에 효소에 의한 분해속도가 감소하는 것으로 사료된다.

<시험예 3>

합성된 DGM이 암세포에 약물효과를 보이는지를 확인하기 위해 Lewis Lung Carcinoma (LLC)에 대해 DGM의 독성시험을 수행하였다. Lewis Lung Carcinoma(LLC)에 대한 독소루비신과 DGM의 독성시험은 MTT[3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨브로마이드)] 시험을 바탕으로 실행하였다. MTT 시험은 세포의 생존력(viability), 증식(proliferation)을 측정하는데 사용하는 방법이다. LewisLung carcinoma (LLC)를 96 웰 마이크로플레이트에 웰 당 5000개의 세포를 넣고 하루 동안 배양하였다. 약을 0.01㎍/ml, 0.1㎍/ml, 1㎍/ml의 농도로 변화시키면서 3시간 동안 처리하였다. 3시간 후, 배양액을 교체하고 각각의 웰에 MTT시약을 첨가하였다. 3시간 후, 반응종료액(0.04N HCl in isopropanol)을 이용하여 형성된 포마잔 결정(formazan crystal)을 완전히 녹인 후, microELASA reader를 이용하여 570nm에서 optical density를 측정하였다. MTT 시험 결과, 약물을 처리하지 않은 경우의 optical density 값은 0.152±0.014 이었다. 그러나, 독소루비신의 농도를 증가시키면서 처리한 경우, optical density값은 0.01㎍/ml에서 0.106±0.024, 0.1㎍/ml에서 0.079±0.005, 1㎍/ml에서 0.040±0.004로 감소하였다. DGM으로 처리한 경우, optical density값은 독소루비신으로 처리한 경우와 비교했을 때, 0.01㎍/ml에서 0.118±0.007, 0.1㎍/ml에서 0.104±0.004, 1㎍/ml에서 0.078±0.012의 값을 보였으며, 약물농도가 증가함에 따라 optical density값은 감소하였다(도 12). Optical density 값은 살아있는 세포의 수와 직접적으로 비례하기 때문에, optical density 값이 감소한다는 것은 DGM이 암세포에 대해 독성을 보이는 것으로 여길 수 있다. MTT 시험의 결과로부터, DGM은 암세포인 Lewis Lung Carcinoma에 대해 약물효과를 보임을 확인하였다.

본 발명에 의한 고분자는 신규관형성현상을 이용한 암세포 특이적인 것으로 적은 양의 약물로서도 높은 항암효과를 기대할 수 있으며, 용해도가 높아 임상단계에서 안전하게 적용이 가능하다.

Claims

기질 금속 단백 분해효소에 의해 분해가능한 단백질 또는 펩타이드를 전달 매체로 하고, 상기 전달 매체에 존재하는 적어도 1이상의 작용기에 표적세포에 전달하고자 하는 항암 물질이 화학적으로 결합되어진 암세포 특이적 전달자.
제 1항에 있어서,

상기 전달 매체에 존재하는 적어도 1이상의 작용기에 용해성 증진을 위한 생분해성 고분자가 화학적으로 결합된 암세포 특이적 전달자.
제 2항에 있어서,

상기 전달 매체는 젤라틴, 콜라겐 또는 이들의 유도체에서 선택된 적어도 1종인 암세포 특이적 전달자.
제 3항에 있어서,

전달매체는 분자량이 500∼1,000,000 달튼인 암세포 특이적 전달자.
제 2항 또는 제 3항에 있어서,

상기 생분해성 고분자는 폴리에틸렌글리콜, 폴리히드록시에틸메타크릴레이트, 폴리히드록시메틸메타크릴레이트, 폴리아클릴산, 폴리아마이드, 폴리피롤리돈에서 선택된 적어도 1종인 암세포 특이적 전달자.
제 5항에 있어서,

생분해성 고분자의 분자량은 400∼100,000 달튼인 암세포 특이적 전달자.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,

상기 항암 물질은 전달 매체의 적어도 1이상의 작용기와 펩티드 결합, 에스테르 결합, 우레탄 결합, 우레아 결합에서 선택된 적어도 1이상의 화학결합을 포함하는 암세포 특이적 전달자.
제 7항에 있어서,

상기 작용기는 아민기, 카르복시기, 하이드록시기에서 선택된 적어도 1이상인 암세포 특이적 전달자.
제 1항 또는 제 2항의 고분자를 유효성분으로 함유하는 항암제재.