KR20030020490A - 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 특정 이종 단백질의효율적인 분리를 위한 개선된 헬퍼 파아지 시스템 - Google Patents

파아지 디스플레이 라이브러리로부터 특정 이종 단백질의효율적인 분리를 위한 개선된 헬퍼 파아지 시스템 Download PDF

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Abstract

본 발명은 천연형 소수 외피 단백질 (minor coat protein) 유전자 전부 또는 일부가 결실되거나 불완전한 필라멘트성 바이러스 (filamentous bacteriophage) 게놈을 포함하는 파아지미드 (phagemid) 벡터를 패키징 (packaging)하기 위한 헬퍼 파아지 (helper phage)로서, 그 게놈 내에 상기 천연형의 소수 외피 단백질 유전자를 포함하되, 상기 소수 외피 단백질의 N-말단 부위 유전자에 조건부 억제성 번역 종결 코돈이 도입되어 있는 변이형 헬퍼 파아지; 상기 변이형 헬퍼 파아지를 이용하여 다양한 이종 단백질을 표면 발현하는 파아지 디스플레이 라이브러리 (phage display library)를 제작하는 방법; 및 상기 라이브러리의 이용에 관한 것이다.

Description

파아지 디스플레이 라이브러리로부터 특정 이종 단백질의 효율적인 분리를 위한 개선된 헬퍼 파아지 시스템{METHOD FOR THE CONSTRUCTION OF PHAGE DISPLAY LIBRARY USING HELPER PHAGE VARIANTS}
본 발명은 파아지 디스플레이 기술에 있어 파아지 표면에 발현되는 외래 단백질의 수준을 향상시키기 위한 변이형 헬퍼 파아지와 상기 변이형 헬퍼 파아지의 이용에 관한 것이다.
분자 다양성 라이브러리 (Combinatorial Library)는 수개 내지 수십개의 단위 분자들을 조합하여, 수천 내지 수만가지의 다양성 분자들을 만들어 놓은 체계적인 혼합물질의 모음을 일컫는다. 생물학적인 접근방법으로 유전자 조작이 쉬운 박테리오파아지의 외피 단백질 (envelope protein)의 일부 펩티드 부위에 아미노산 조합을 변화시켜 수천만 내지 수억 종류의 서로 다른 파아지들을 만들어 놓은 파아지-디스플레이 펩티드 라이브러리 (phage-displayed peptide library)가 대표적인 예이다 (Cwirlaet al., Proceedings of National Academy of Science USA, 87: 6578, 1990). 이러한 예로, 짧은 펩티드들을 아미노산 조합을 바꾸면서 합성하여 만든 혼합물이나, 일정한 골격에 여러 가지 조합의 치환기를 바꾸어 만들어낸 저분자 물질 혼합물 등을 들 수 있다. 이들의 특징은 수천 내지 수억 종류의 파아지나 분자들로 구성되어 있지만, 일일이 하나씩을 검사하지 않고서도 이들로부터 목적하는 새롭고, 생리적인 효과가 있는 종류를 찾아낼 수 있다는 점 (High Throughput Screening)에서 최근에 신약 개발을 위한 탐색의 중요한 대상으로 부각되고 있다.
일반적인 파아지-디스플레이 라이브러리 방법은 ① 파아지의 외피 단백질 (coat protein) pⅢ (또는 pⅧ) N-말단에 해당하는 유전자 부위에 무작위서열의 올리고뉴클레오티드 (oligonucleotide)를 삽입하는 단계; ② 천연형의 외피 단백질 일부와 상기 무작위 서열의 올리고뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 융합 단백질을 발현시키는 단계; ③ 상기 올리고뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드와 결합할 수 있는 수용체 물질을 처리하는 단계; ④ 수용체에 결합된 펩티드-파아지 입자들을 낮은 pH나 결합 경쟁력 있는 분자를 이용하여 용출 (elute)하는단계 (Biopanning); ⑤ 패닝 (panning)에 의하여 용출된 파아지를 숙주 세포 내에서 증폭시키는 단계; ⑥ 원하는 양을 얻기 위해 상기 방법을 반복하는 단계; 및 ⑦ 패닝에 의해 선별된 파아지 클론들의 DNA 서열로부터 활성이 있는 펩티드의 서열을 결정하는 단계로 구성된다.
상기 파아지-디스플레이 펩티드 라이브러리를 이용하여 EcoRⅠ 제한효소를 소수 캡시드 단백질 (minor capsid protein) pⅢ에 융합시켜 M13 바이러스 입자의 표면상에 EcoRⅠ-gⅢ 융합 단백질을 발현시킨 바 있으며, 이를 기초로 무작위적 펩티드 또는 항체와 같은 이종유래 단백질을 표현하는 거대한 라이브러리의 제조가 가능해졌다. 지금까지 광범위한 단백질 및 단백질 도메인들이 분자의 방향성 진화를 수행하기 위하여 파아지 입자 상에서 표현되어 왔는데, 일례로 수용체에 대한 보다 강력한 결합 리간드, 효소 억제제, DNA 결합 단백질, 길항제 (antagonist) 또는 다양한 항원에 특이적인 항체들이 파아지 디스플레이 기술을 사용하여 동정되었다.
일반적으로, 파아지-디스플레이 라이브러리에서 필라멘트성 파아지의 표면상에 이종 유전자의 표현을 위해 사용되어 온 벡터에는 두 가지 형태가 있다. 하나는 fUSE5, fAFF1, fd-CAT1 또는 fdtetDOG 등의 파아지 벡터이고 다른 하나는 pHEN1, pComb3, pComb8 또는 pSEX 등의 파아지미드 벡터이다.
파아지 벡터 시스템에서, 합성된 유전자를 파아지 게놈 내에 직접적으로 클로닝함으로써 목적 펩티드들을 저가 (oligovalent) 발현하기 위한 pⅢ 융합 단백질(Scott J. K. and Smith G. P.,Science249: 386-390, 1990) 또는 다가 (multivalent) 발현을 위한 pⅧ 융합 단백질 (Greenwood J.et al.,J. Mol. Biol. 220: 821-827, 1991)이 파아지 표면에 발현된다. 따라서, 파아지 벡터 시스템은 모든 pⅢ 분자들이 원래 융합 단백질로서 존재하는 한 외래 펩티드 또는 단백질 절편의 높은 표현 수준을 제공한다. 그러나, pⅢ의 N-말단에 커다란 외래 단백질 절편의 존재는 파아지 감염의 초기 단계에서 절대적으로 요구되는 pⅢ와 세균의 성 필리 (sex pili)와의 상호작용을 방해하기 때문에 pⅢ와 융합되는 이종 단백질 절편의 크기에 제한이 있다. 일례로, pⅧ의 경우에 10개 아미노산 잔기보다 큰 절편과의 융합은 외피 단백질 (coat protein)의 기능을 손상시키는 것으로 보고된 바 있다 (Sidhu S. S.,Curr. Op. Biotechnol. 11: 610-616, 2000).
그러므로, 항체와 같이 보다 큰 분자들의 표현을 위해서는 파아지미드 벡터 시스템이 더욱 적당하다. 상기 시스템은 보다 큰 크기의 라이브러리 제작과 목적하는 특징을 파아지미드 내로 도입하기 위한 유전학적 조작이 상대적으로 용이한 효율적인 연결-형질전환 (ligation-transformation) 단계를 포함한다. 파아지미드 벡터 시스템에서 이종 단백질의 DNA는 파아지미드 벡터 내에 존재하는 gⅢ (또는 gⅧ) 내로 클로닝되고, 재조합 파아지미드 DNA의 패키징과 융합 단백질의 표현은 M13KO7 또는 VCSM13과 같은 헬퍼 파아지에 의해 제공된다. 그로 인해, 파아지미드는 융합 단백질로서 변형된 캡시드 단백질을 제공하고, 헬퍼 파아지는 증폭을 위한 재조합 파아지의 성공적인 재감염을 위해 요구되는 야생형 외피 단백질을 제공한다. 그 결과 생성되는 재조합 파아지 입자는 헬퍼 파아지로부터 발현되는 야생형pⅢ와 재조합 파아지미드로부터 발현되는 pⅢ-이종 단백질의 융합 단백질을 모두 표현한다.
그러나, 실제로는 대장균의 세포질 부위 (periplasmic space)에서 pⅢ 융합 단백질의 단백질 분해 (proteolytic degradation)로 인해 파아지 입자 표면에 나타나는 pⅢ 분자들의 대부분은 야생형으로 존재하기 때문에 파아지 입자들의 대부분이 파아지미드 디스플레이 시스템 내에서 매우 낮은 수준으로 융합 단백질을 표현하게 되고, 이로 인해 라이브러리로부터 특이적 결합 분자들의 분리 효율이 저하된다. 따라서, 파아지미드 디스플레이 시스템에서 제조합 파아지의 표면상에 pⅢ:융합 단백질의 표현을 고효율로 얻기 위한 새로운 전략이 요구되고 있다.
이러한 문제점을 해결하기 위하여, gⅢ 결실을 갖는 M13 헬퍼 파아지 (M13δg3) (Griffiths A. D.et al.,EMBO J. 12: 725-734, 1993)가 표현 수준의 증가를 위하여 고안되었으나 상기 방법에 의해 제조되는 헬퍼 파아지들은 그 역가가 너무 낮아 (약 109/ℓ) 일반적으로 패키징을 위해 필요한 헬퍼 파아지의 양을 충족시키기 어려워 실용적이지 못하였다. 최근 들어 이를 바탕으로 대장균 DH5α 세포의 염색체 내로 M13 gⅢ를 삽입하여 제조된 패키징 세포주 (DH5α/pⅢ) 내로 M13KO7△pⅢ 헬퍼 파아지 DNA의 형질전환에 의해 고역가의 하이퍼파아지 (hyperphage)가 생산되었으나 야생형 M13KO7보다는 아직 증폭 수율면에서 부족함을 보여 주였다 (Rondot S.et al.,Nat. Biotech. 19: 75-78, 2001). 또한, 신호 서열 (signal sequence)의 돌연변이 및 트립신-절단성 pⅢ 외피 단백질 (trypsincleavable pⅢ coat protein)의 사용이 필라멘트성 파아지 표면상의 단백질 표현을 증가시키기 위해 사용되었음이 보고된 바 있으나 하이퍼파아지를 사용하는 경우보다 단백질 표현이 많이 증가하지는 않았다 (Jestin J.et al.,Res. Microbiol.152: 187-191, 2001).
이에 본 발명자들은 파아지미드 디스플레이 시스템에서 재조합 파아지의 표면상에 pⅢ:융합 단백질의 표현을 고효율로 얻기 위한 보다 효율적인 전략으로 천연형 소수 외피 단백질 유전자 전부 또는 일부가 결실되거나 불완전한 필라멘트성 바이러스 게놈을 포함하는 파아지미드 벡터를 패키징하기 위한 헬퍼 파아지로서, 그 게놈 내에 상기 천연형의 소수 외피 단백질 유전자를 포함하되, 상기 소수 외피 단백질의 N-말단 부위 유전자에 조건부 억제성 번역 종결 코돈이 도입되어 있는 변이형 헬퍼 파아지를 제조하고 이를 이용하여 다양한 리간드 결합 단백질을 표면 발현하는 파아지 디스플레이 라이브러리를 제작하는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 표적 항원에 특이적이고 보다 다양한 항체를 얻기 위하여 특이적 항원 결합을 효율적으로 증가시키는 변이형 헬퍼 파아지와 이를 이용하여 유전적으로 다양성을 갖는 이종 단백질을 표면에 발현하는 파아지 디스플레이 라이브러리를 제공하는 것이다.
도 1은 M13KO7 헬퍼 파아지 게놈 내 gⅢ 유전자의 5' 부위에서 특정부위 돌연변이법 (site-directed mutagenesis)에 의해 2개의 Glu 코돈 (GAA)을 앰버 코돈 (amber codon, TAG)으로 치환하여 본 발명의 변이형 헬퍼 파아지를 제작하는 과정을 나타낸 것이고,
도 2는 두 번의 연속적인 돌연변이 유발 후 무작위적으로 선별된 플라크를 TG1 또는 JS5 세균성 균체 (bacterial lawn)가 배양된 배지에 적가하여 대장균 균주 상에서 Ex-파아지에 의해 증식할 수 있는 파아지를 결정하는 플라크 형성 실험 결과를 나타난 것이고,
도 3a는 PCR 증폭에 의해 본 발명의 재조합 파아지미드 pIGT2 및 pIGT3를 제작하는 과정을 나타낸 모식도이고,
도 3b는도 3a에 의해 제작된 재조합 파아지미드 pIGT3의 유전자 지도를 나타낸 것이고,
도 4는 본 발명의 변이형 헬퍼 파아지인 Ex-파아지를 이용한 파아지 디스플레이 라이브러리 시스템의 모식도를 나타낸 것이고,
도 5는 본 발명의 파아지 디스플레이 라이브러리 시스템으로부터 scFv:pⅢ 융합 단백질의 발현을 면역블럿 분석에 의해 결정한 것이고,
레인 1: M13KO7 헬퍼 파아지 (pIGT3/M13KO7)의 감염에 의한 재조합 파아지
레인 2: Ex-파아지 (pIGT3/Ex-파아지)의 감염에 의한 재조합 파아지
도 6a는 파아지 ELISA를 이용하여 M13KO7 또는 Ex-파아지로 패키징된 재조합 파아지의 항원-결합 특이성을 조사한 것이고,
도 6b는 파아지 ELISA를 이용하여 M13KO7 또는 Ex-파아지로 패키징된 재조합 파아지의 항원-결합 민감성을 조사한 것이고,
도 7은 본 발명의 파아지 디스플레이 라이브러리 시스템에 의한 패닝 효율의 증가를 나타낸 것으로,도 7a는 패닝 후 % 수율을 나타낸 것이고,도 7b는 패닝 후 인간 HSP-70 단백질에 대한 다클론성 파아지 ELISA를 수행한 결과이고,도 7c는 인간 HSP-70 단백질에 대한 단클론성 파아지 ELISA를 수행한 결과이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 천연형 소수 외피 단백질 유전자 전부 또는 일부가 결실되거나 불완전한 필라멘트성 바이러스 게놈을 포함하는 파아지미드 벡터를 패키징하기 위한 헬퍼 파아지로서, 그 게놈 내에 상기 천연형의 소수 외피 단백질 유전자를 포함하되, 상기 소수 외피 단백질의 N-말단 부위 유전자에 조건부 억제성 번역 종결 코돈이 도입되어 있는 변이형 헬퍼 파아지를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 변이형 헬퍼 파아지를 이용하여 다양한 리간드 결합 단백질을 표면 발현하는 파아지 디스플레이 라이브러리를 제작하는 방법 및 상기 라이브러리의 용도를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서 "조건부 억제성" 번역 종결 코돈이란, 억제성 균주 내에서는 단백질의 번역을 종결시키지만 비억제성 균주 내에서는 해당 아미노산으로 번역되어 정상적인 단백질로 합성되는 코돈을 말한다.
본 발명의 변이형 헬퍼 파아지 또는 상기 헬퍼 파아지가 패키징하는 파아지미드는 필라멘트성 바이러스의 전체 게놈 또는 일부를 포함할 수 있는데, 상기 필라멘트성 바이러스로는 fd, M13, f1, If1, Ike, Zj/Z, Ff, Xf, Pf1 또는 Pf3 등이있다.
상기에서 발현시키고자 하는 다양성 단백질이 융합하는 소수 외피 단백질은 fd, M13, f1, If1, Ike, ZJ/Z 또는 Ff의 pⅢ 단백질이거나 XF, PF1 또는 Pf3에 존재하는 그의 상응물이 바람직하다.
상기 변이형 헬퍼 파아지에 도입되는 조건부 억제성 번역 종결 코돈은 UAG (Amber), UAA (Ocher) 또는 UGA (Opel) 코돈이며, 이들의 도입은 번역 종결 코돈을 첨가하거나 또는 상기 N-말단 부위 유전자 내의 코돈을 치환함으로써 이루어질 수 있다. 소수 외피 단백질의 N-말단 부위 유전자에 조건부 억제성 번역 종결 코돈이 2개 이상 도입되는 것이 더욱 바람직한데, 예를 들어 번역 종결 코돈으로의 치환은 소수 외피 단백질 N-말단의 글루탐산 코돈을 UAG (Amber) 코돈으로 치환시켜 이루어질 수 있다. 이때, 소수 외피 단백질 N-말단 부위 유전자는 pⅢ의 선도 서열을 포함하여 N-말단 90개의 아미노산을 코딩하는 유전자 부위인 것이 바람직하다.
상기에서 파아지미드 벡터를 패키징하기 위하여 번역 종결 코돈이 도입되는헬퍼 파아지로는 바람직하게는 공지의 M13KO7, M13R408, M13-VCS 또는 Phi X174 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서는 바람직한 실시예로서 파아지미드 벡터를 패키징하기 위한 기본 골격으로서의 헬퍼 파아지가 M13KO7이고, 소수 외피 단백질이 pⅢ이며, 상기 pⅢ N-말단 부위의 20번째 및 32번째 글루탐산 코돈이 UAG 코돈으로 치환된 변이형 헬퍼 파아지를 제공한다. Ex-파아지로 명명된 상기 변이형 헬퍼 파아지는 게놈 내 gⅢ의 5' 말단에 두 개의 앰버 코돈을 포함하는서열번호 10으로 기재되는 염기서열을 가지며 (도 1참조), 한국생명공학연구원 유전자은행에 2001년 7월 24일자로 기탁되었다 (수탁번호: KCTC 10022BP).
pⅢ의 N-말단의 첫 번째 Glu 잔기에 앰버 코돈이 도입되거나 신호 펩티드의 말단 또는 두 번째 Glu 위치에 앰버 코돈을 갖는 변이형 M13KO7 헬퍼 파아지들이 여전히 비억제성 JS5 세포에서 플라크를 형성하고, 복귀돌연변이체 (revertant)를 나타내는 문제점이 있는 반면, 본 발명의 변이형 Ex-파아지는 TG-1 또는 XL-1 Blue (supE 유전형)와 같은 억제성 숙주세포에서는 선명하게 플라크를 형성하지만, JS-5 또는 MV1184와 같은 비억제성 숙주세포에서는 플라크를 전혀 형성하지 못한다 (도 2참조). 이는 앰버 코돈이 Glu로 전사되어 비억제성 대장균 균주 내에서는 상기 변이형 헬퍼 파아지가 증식할 수 있지만, 억제성 대장균 균주 내에서는 두 개의 정지 코돈에 의해 전사가 비성숙하게 정지되어 증식할 수 없기 때문이다.
또한, 본 발명은 상기 변이형 헬퍼 파아지를 이용하여 다양한 리간드 결합 단백질을 표면 발현하는 파아지 디스플레이 라이브러리를 제작하는 방법 및 상기 라이브러리의 용도를 제공한다.
상기 파아지 디스플레이 라이브러리를 제작하는 방법은
1) pⅢ의 앵커 도메인 (anchor domain)과 융합된 형태로 활성형의 외래 단백질을 발현하는 재조합 파아지미드를 만드는 단계;
2) 단계 1의 파아지미드와 본 발명의 변이형 헬퍼 파아지를 억제성 숙주세포에 공감염시키는 단계; 및
3) 상기 숙주세포를 배양하여 바이러스 외피를 구성하는 pⅢ 단백질 중 하나 이상이 pⅢ-이종 단백질의 융합 단백질인 형태로 발현되는 재조합 바이러스를 생산하는 단계를 포함한다.
상기 단계를 구체적으로 살펴보면, 단계 1)의 파아지미드는 fd, M13, f1, If1, Ike, Zj/Z, Ff, Xf, Pf1 또는 Pf3 등의 필라멘트성 바이러스 게놈을 포함하는 것이 바람직하다.
단계 1)에서 pⅢ의 앵커 도메인과 융합된 형태로 발현되는 활성형의 이종 단백질은 포유동물 단백질 (mammalian protein)로서 항체 단백질 또는 리간드 결합 단백질이 바람직하다. 예를 들면, 성장 호르몬 (growth hormone), 인간 성장 호르몬, 데스-N-메티오닐 (des-N-methionyl) 성장 호르몬, 소 (bovine) 성장 호르몬, 부갑상선 (parathyroid) 호르몬, 싸이록신 (thyroxine), 인슐린 A-사슬 (insulin A-chain), 인슐린-B 사슬, 프로인슐린 (proinsulin), 릴랙신-A 사슬 (relaxin A-chain), 릴랙신-B 사슬, 프로릴랙신 (prorelaxin), 황체 자극 호르몬 (follicle stimulating hormone, FSH), 갑상선 (thyroid) 자극 호르몬 (TSH), 황체화 호르몬 (luteinizing hormone, LH), 당단백질 호르몬 수용체 (glycoprotein hormone receptor), 칼시토닌 (calcitonin), 글루카곤 (glucagon), 인자 Ⅶ (factor Ⅶ), 폐 표면활성물질 (lung surfactant), 유로키나제 (urokinase), 스트렙토키나제 (streptokinase), 인간 조직-타입 플라스미노겐 활성인자 (human tissue-type plasminogen activator), 봄베신 (bombesin), 인자 Ⅸ, 트롬빈 (thrombin), 조혈성장 인자 (hemopoietic growth factor), 종양 괴사 인자-알파 및 베타 (timor necrosis factor-α 및 -β), 엔케팔리나아제 (enkephalinase), 인간 혈청 알부민 (human serum albumin), 뮐러리안-억제 기질 (mullerian-inhibiting substance), 마우스 고나도트로핀-연계 펩티드 (mouse gonadotropin-associated peptide), 베타-락타메이즈 (β-lactamase), 조직 인자 단백질 (tissue factor protein), 인히빈 (inhibin), 액티빈 (activin), 혈관 상피세포 (vascular endothelial) 성장 인자, 인테그린 수용체 (integrin receptor), 트롬보포이에틴 (thrombopoietin), 단백질 A 및 D, 류마토이드인자 (rheumatoid factor), 신경 (nerve) 성장 인자, 혈소판 (platelet) 성장 인자, 형질전이 (transforming) 성장 인자 (TGF), TGF-알파 및 TGF-베타, 인슐린-유사 성장 인자-Ⅰ 및 Ⅱ (insulin-like growth factor Ⅰ 및 Ⅱ), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 (binding protein), CD-4, DNase, 잠복기-관련 펩티드 (latency associated peptide), 에리쓰로포이에틴 (erythropoietin), 헤레글린 2 리간드 (heregulin 2 factors, HER2), 골형성 유도 인자 (osteoinductive factor), 인터페론-알파 (interferon-α), 베타 및 감마, 콜로니 자극 인자 (colony stimulating factor, CSFs), M-CSF, GM-CSF 및 G-CSF, 인터루킨 (interleukin, ILs), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, 과산소 디스뮤타아제 (superoxide dismutase), 부패-촉진 인자 (decay-stimulating factor), 바이러스성 항원 (viral antigen), HIV 외피 단백질 (HIV envelope protein) GP120 및 GP140, 심방성 나트륨이뇨 펩티드 (atrial natriuretic peptide) A, B 및 C, 면역글로블린 (immunoglobulin) 또는 상기 언급된 단백질들의 단편들이 사용될 수 있다.
본 발명의 실시예에서는 이종 단백질로 인간 면역글로블린 단백질을 사용하였는데, 이때 인간 면역 글로블린의 중쇄 가변 영역 도메인과 경쇄 가변 영역 도메인을 포함하는 것이 바람직하며, 인간 면역 글로블린의 중쇄 가변 영역 도메인과 경쇄 가변 영역 도메인이 링커로 연결되어 있는 scFv (single chain Fv)를 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 단계 1)의 재조합 파아지미드는 pⅢ의 앵커 도메인과 활성형의 이종 단백질 사이에 엔테로키나제 절단 부위를 추가적으로 포함하는 융합 단백질을 발현할 수 있다.
본 발명에서는 바람직한 실시예로서도 3b에 개시된 유전자 지도를 갖는 재조합 파아지미드를 제조하였고 이를 pIGT3로 명명한 후 한국생명공학연구원 유전자은행에 2001년 7월 24일자로 기탁하였다 (수탁번호: KCTC 10021BP).
상기 재조합 파아지미드는 비억제성 대장균 균주 내에서 pⅢ와 융합되고 파아지의 단백질 분해 용출 (proteolytic elution)을 위한 트립신 및 엔테로키나제 절단 부위를 포함하는 항체 융합 단백질을 생산한다.
본 발명에서 변이형 헬퍼 파아지의 바람직한 일례로서 제시된 Ex-파아지는 억제성 (suppressing) 대장균 균주에서는 기능적인 야생형 pⅢ를 생산하지만 비억제성 (non-suppressing) 대장균 균주에서는 어떠한 pⅢ도 생산하지 못하는 돌연변이 pⅢ 유전자를 가지고 있다. 따라서, Ex-파아지를 갖는 F+ 비억제성 대장균 균주 내에서 항체-pⅢ 융합 단백질을 암호화하는 상기 패키징 파아지미드는 재조합 파아지 입자의 표면상에 항체 절편의 표현 수준을 증가시킴으로써 매우 높은 특정항원과의 친화적 결합 활성을 나타내게 된다.
단계 2)에서 억제성 숙주세포는 대장균 균주 DH5αF', JM101, JM109, JM110, KK2186, TG1 또는 XL-1 Blue 등이 사용될 수 있으며, 이때 재조합 파아지미드와 변이형 헬퍼 파아지를 1:10 내지 1:20의 비율로 공감염시키는 것이 높은 역가의 재조합 바이러스를 생산하는데 바람직하다 .
상기 단계 1)과 단계 2) 사이에 변이형 헬퍼 파아지를 비억제성 숙주세포에 감염시켜 배양함으로써 변이형 헬퍼 파아지를 대량 생산하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있으며, 이때 비억제성 숙주세포로 대장균 균주 MV1184, MV1193, XS101, XS127 또는 JS5 등이 사용될 수 있다.
상기 방법에 따라 제작된 파아지 디스플레이 라이브러리는 특정 항원과 특이적으로 결합하는 항체 단백질을 생산하기 위하여 상기 라이브러리로부터 특정 항원과의 친화적 결합 여부를 통해 이에 결합하는 항체 단백질을 발현하는 재조합 바이러스를 선별할 수 있다. 이로부터 선별된 재조합 바이러스로부터 발현된 항체 단백질은 트립신 또는 엔테로키나아제 처리에 의한 프로테아제 용출에 의해 융합 단백질로부터 용이하게 분리될 수 있다.
본 발명의 파아지 디스플레이 라이브러리 시스템은 ① 두 개 이상의 조건부 억제성 번역 종결 코돈을 포함하여 유전적으로 변형된 gⅢ를 발현하는 변이형 헬퍼 파아지를 사용하고; ② 기존에 수용성 항체 분자를 생산하기 위하여 사용된 비억제성 대장균 균주를 이용하여 상기 균주 내에서 파아지 디스플레이 라이브러리를 형성하며; ③ 파아지 용출을 위해 트립신보다 특이적인 프로테아제인 엔테로키나제를 사용하여 트립신 사용시 야기되는 패닝 과정의 복잡한 문제점을 피할 수 있다는 장점을 가지고 있다. 따라서, 본 발명의 파아지 디스플레이 라이브러리는 목적하는 항원에 특이적이고 다양한 항체들을 동정하여 치료학적 항체 약제의 개발을 위한 후보물질을 탐색하는데 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 변이형 헬퍼 파아지의 제작
앰버 코돈 (TAG)은 제조사의 지침에 따른 돌연변이-K 효소 및 벡터 셋트 (MutantTM-K enzyme and vector set, Takara사)를 이용한 특정부위 돌연변이법 (site-directed mutagenesis, Kunkel, T. A.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA82: 488-491, 1985)에 의해 M13KO7 헬퍼 파아지 게놈 (Stratagene사) 내 gⅢ의 5' 부위에 도입되었다. 구체적으로, 데옥시우리딘 (deoxyuridine)을 포함하는 M13K07 헬퍼 파아지의 단쇄 DNA는 파아지를 효소 dUTPase 및 우라실-N 글리코실라아제 (uracil-N glycosylase)가 결여된 CJ236 지시자 세포 (indicator cell)에 감염시켜 준비하였다. M13KO7의 단일 플라크를 CJ236 세포를 포함하는 3 ㎖ 2×YT 배지 (30㎍/㎖ 클로르암페니콜)에 접종하여 37℃에서 6시간 동안 배양하였다. 원심분리하여 배양 상등액을 얻은 후 상등액 100 ㎖을 CJ236 세포를 포함하는 100 ㎖ 2×YT 배지 (30 ㎍/㎖ 클로르암페니콜)에 첨가하고 37℃에서 6시간 동안 배양하였다. 다시 원심분리하여 배양 상등액을 모은 후 증폭된 파아지에 PEG/NaCl 용액 (1/4 vol)을 첨가하여 침전시키고 8,000 g에서 10분 동안 원심분리하였다. 이로부터 얻은 파아지 펠렛을 5 ㎖의 TE 완충용액에 재현탁한 후 단쇄 파아지 DNA를 페놀/클로로포름 추출에 의해 분리·정제하였다.
gⅢ의 5'-부위에서 Glu의 앰버 코돈으로의 치환을 위해서열번호 1및2로 기재되는 두 개의 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. gⅢ에서 상기 올리고뉴클레오티드에 대한 상보적 서열의 위치는도 1에 나타내었는데, gⅢ의 선도서열은 굵게, 특정부위 돌연변이법에 사용된 올리고뉴클레오티드에 상보적인 서열은 밑줄로, 앰버 코돈의 위치는 별표로 나타내었다.서열번호 1의 올리고뉴클레오티드 10 pmole을 10 단위의 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 (T4 polynucleotide kinase, Roche사)로 37℃에서 15분 동안 인산화시켰다. 상보적 가닥은 60 단위의 대장균 리가아제 (ligase) 및 1 단위의 T4 DNA 중합효소를 25℃에서 2시간 동안 처리한 후 0.2 pmol의 단일가닥 파아지 DNA 및 O.1 pmol의 인산화 올리고뉴클레오티드를 첨가하여 합성하였다. 그리고 나서, 10 ㎕의 DNA를 BMH71-18mutS컴피턴트 세포 (competent cell) (Takara사) 100 ㎕와 혼합한 후 세포를 형질감염을 위해 42℃에서 45초 동안 가열 진동시켰다. 상기 세포를 1 ㎖ LB 배지에서 37℃, 1시간 동안배양한 후 배양 상등액을 원심분리로 모아 LB 배지를 사용하여 10-1, 10-2및 10-3배로 일련의 희석액을 제조하였다. 상기 희석액들을 100 ㎕ XL-1 Blue 세포 (Stratagene사)와 혼합하고 3 ㎖ 탑 아가 (top agar)를 첨가한 후 LB 플레이트에 부어 37℃에서 밤새 플라크가 형성되도록 하였다.
이로부터 형성된 몇몇 플라크들을 무작위적으로 선별한 후 파아지를 실온에서 2시간 동안 500 ㎕ LB에 방출 (release)시켰다. 2 ㎕ 파아지 현탁액을 TG1 (Amersharm Pharmacia사) 또는 JS5 (Biorad사) 세균성 균체 (bacterial lawn)를 포함하는 탑 아가 LB 플레이트에 적가한 후 37℃에서 밤새 배양하였다. 변이형 헬퍼 파아지는 TG1 (억제성 균주) 또는 JS5 (비억제성 균주) 상에 플라크 형성을 비교함으로써 분리되었다. TG1 세포에서는 선명한 플라크를 형성하지만 JS5 세포에서는 플라크를 형성하지 않는 변이형 헬퍼 파아지를 분리한 후 이로부터 단일가닥 DNA를 정제하였고,서열번호 2의 올리고뉴클레오티드를 이용하여 상기와 동일한 방법으로 두 번째 특정부위 돌연변이법을 수행하였다.
그 결과, gⅢ의 5' 말단에 두 개의 앰버 코돈을 가지는 변이형 헬퍼 파아지를 선별하여 이를 Ex-파아지로 명명하였고 한국생명공학원 유전자은행에 2001년 7월 24일자로 기탁하였다 (수탁번호: KCTC 10022BP). Ex-파아지는 TG-1 세포 (supE 유전형)에서는 선명하게 플라크를 형성하지만, JS-5 세포에서는 플라크를 전혀 형성하지 못하였다 (도 2).
<실시예 2> 재조합 파아지미드의 제작
상기 실시예 1에서 제작된 Ex-파아지를 파아지 디스플레이에 적용하기 위하여, pCANTAB-5E (Amersham Pharmacia사)의 유전적 변형에 의해 (그러나, pCANTAB-5E의 pUC19 기본주형은 유지함) 재조합 파아지미드를 하기와 같이 제작하였다 (도 3a및3b).
(2-1) pCANTAB-5E/hsp70의 제작
인간 HSP-70에 특이적인 scFv를 포함하는 pCANTAB-5E/hsp70를 재조합 인간 HSP-70 단백질을 패닝에 사용하여 반-합성 scFv 라이브러리로부터 분리하였다.
우선 반-합성 라이브러리 (Semi-Synthetic Library)를 제작하기 위하여, 무작위적으로 선출한 40명의 혈액에서 임파구 (PBL)를 분리한 후 RNA STAT-60 (TEL-TEST)을 사용하여 전체 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA 1 ㎍을 이용하여 1st 가닥 cDNA 합성 키트 (Roche사)를 사용해 1st 가닥 cDNA를 합성한 후 이를 scFv의 중사슬과 경사슬 유전자를 획득하기 위한 PCR의 주형으로 사용하였다. 또한, 인간 골수 (Human Bone Marrow-BM) 5'-STRETCH PLUS cDNA 라이브러리 (Clontech사)와 인간 태아 간 (Human Fatal Liver-FL) 5'-STRETCH PLUS cDNA 라이브러리 (Clontech사)로부터 λ DNA를 λ DNA 정제 키트 (Promega사)를 사용하여 분리한 후 이로부터 분리된 골수와 태아 간 λ DNA 역시 중사슬과 경사슬 유전자를 획득하기 위한 PCR의 주형으로 이용하였다. PBL, BM, FL cDNA를 주형으로 하여 천연형 (original) 및 합성 (synthetic) 중사슬 및 경사슬을 인간 특이적인 시발체 (human specific primer, Amersham Pharmacia사)를 사용하여 증폭하였다. 중사슬 및 경사슬을 연결하기 위한 링커 (linker) 절편은 pHEN1 (영국 Cambridge Antibody Technology, Ltd., Daly Research Laboratories의 Dr. Greg Winter로부터 제공받음) 내에 클로닝된 인간 scFv의 링커 절편 부분을서열번호 11로 기재되는 인간 링커 특이적 센스 시발체와서열번호 12로 기재되는 인간 링커 특이적 안티센스 시발체를 이용하여 PCR로 획득하였다. 얻어진 각 중사슬, 경사슬 및 링커 절편을 저융점 아가로스 겔 (low melting agarose gel) 상에서 분리한 후 정량하여 40 ng의 중사슬 유전자, 40 ng의 경사슬 유전자와 80 ng의 링커 절편을 넣어 조립 (assembly) PCR을 수행하였다. PCR 후 얻어진 반응액을 최종적으로 SfiⅠ과 NotⅠ 제한효소 인식부위를 포함하는 전장 시발체 (pull length primer, Amersham Pharmacia사)를 사용하여 약 750 bp의 scFv 전체 길이를 증폭하였다. 증폭된 scFv 절편 역시 저융점 아가로스 겔을 이용하여 분리한 후 SfiⅠ, NotⅠ 제한효소로 절단하였다. 4.5 kb 길이의 pCANTAB-5E 벡터 역시 동일한 제한효소로 절단한 후 CIP (Calf Intestinal Alkaline Phosphatase, Roche사) 처리하였다. 이로부터 얻어진 scFv 유전자와 벡터를 T4 DNA 리가아제 (ligase, Promega사)를 사용하여 연결한 후 TG1 초-감응성 세포 (ultra-competent cell)에 넣어 형질전환시켜 약 5 × 108크기의 최종 라이브러리를 획득하였다.
상기와 같이 제작된 라이브러리 저장액 1 ㎖을 2 × YT/AG (100 ㎍/㎖ Ampicillin, 2% Glucose) 배지에 접종하여 키운 후 M13K07 헬퍼 파아지로 감염시켜 재조합 바이러스를 증폭시켰다. 증폭된 항체 재조합 바이러스를 1 × 1012정도 첨가하여 패닝을 수행하였다. 먼저 50 ㎍/㎖의 분리된 HSP-70 단백질을 코팅 완충용액에 희석한 후 96-웰 플레이트에 첨가하고 4℃에서 밤새 코팅하였다. 상기 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 3% BSA로 블로킹시킨 후 증폭된 파아지를 넣어 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 0.1% PBS/tween으로 세척한 후 0.1 M HCl로 결합된 파아지를 용출하였다. 용출된 파아지의 역가를 측정하고, 다시 TG1 세포에 감염시켜 증폭시킨 후 이 같은 패닝 과정을 4번 반복하였다.
패닝 결과, 재조합 바이러스의 수율이 초기보다 2차에서 100배, 4차에서는 1,000배 가량 증가한 것을 알 수 있었다. 3차 패닝에서는 2차에서보다 10배 감소하였지만, 초기의 패닝 때보다는 10배 가량 증가하였다. 이러한 결과를 토대로 하여 각 패닝 단계의 증폭된 파아지를 1012가량 첨가하여 다클론성 ELISA를 실시하여 3차와 4차의 패닝에서 선별된 재조합 바이러스의 HSP-70 결합 특이성이 증가한 것을 확인하였다.
패닝 ELISA에서 가장 강하게 검출된 3차의 증폭된 파아지를 TG1 세포에 감염시켜 콜로니를 형성시킨 후 무작위로 100개의 콜로니를 접종하여 각각의 파아지를 증폭시켰다. HSP 70과 BSA가 코팅된 마이크로 타이터 플레이트를 블로킹시킨 후 각 파아지를 넣고 항-M13 항체 (Amersharm Pharmacia사)로 반응시킨 후 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 100개의 콜로니 중 15개 정도는 흡광도 값이 0.5를 넘는 높은 수치를 보였으며, 대부분이 BSA와는 현저하게 높은 반응 활성을 나타내었다. 이 중 가장 HSP-70과 반응 수치가 높은 클론 한 개를 선별하였고 이를 pCANTAB-5E/hsp70라 명명하였다.
(2-2) pIGT2의 제작
우선, pIGT2는 pCANTAB-5E/hsp70의 E-표지 (E-tag)를 myc 표지로 치환시키고 엔테로키나제 (EK) 절단 부위를 벡터 내에 도입하여 제작되었다. 구체적으로, pCANTAB-5E 내 NotⅠ 및 BamHⅠ 부위 사이에 위치한 600 bp의 gⅢ 절편을 PCR 증폭에 의해 확보하였다.서열번호 3으로 기재되는 센스 프라이머 P1은 NotⅠ 제한효소 부위, myc 표지, XbaⅠ 제한효소 부위, 앰버 코돈 및 gⅢ의 5'에 상보적인 서열을 가지도록 고안되었고,서열번호 4로 기재되는 안티센스 프라이머 P2는 BamHⅠ 제한효소 부위를 포함하는 gⅢ 부위의 중간에 상보적인 서열을 가지도록 고안되었다.
이로부터 증폭된 600 bp PCR 산물을 NotⅠ/BamHⅠ으로 처리한 후 위자드 DNA 클린 키트 (Wizard DNA clean up kit, Promega사)를 이용하여 정제하였다. 정제된 pCANTAB-5E/hsp70을 동일한 제한효소로 절단한 후 E-표지를 포함하는 원래 크기의 600 bp NotⅠ/BamHⅠ DNA 절편을 제거하기 위하여 1% 저융점 아가로오스 겔 (low melting temperature agarose gel)에 전기영동을 수행하여 정제하였다. 이로부터 얻은 벡터 절편 및 PCR 산물을 T4 DNA 리가아제 (Promega사)를 이용하여 16℃에서 밤새 서로 연결시킨 후 전기천공법 (electroporation)에 의해 컴피턴트 세포 대장균 HB2151 (Amersham Pharmacia사)에 형질전환시켰다. 세균성 콜로니들을 37℃에서 밤새 2×YT/Amp 플레이트 (100 ㎍/㎖ ampicillin)에서 배양한 후 무작위적으로선별하여 1 mM IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside, Sigma사)가 첨가된 LB/Amp 플레이트 (100 ㎍/㎖ ampicillin)에서 배양하였다. 총 세포성 단백질을 12% SDS-PAGE로 분리하여 니트로셀룰로오스 막 (Biorad사)에 옮긴 후 그의 C-말단에 myc 표지가 융합된 인간 항-hsp-70 scFv를 발현하는 클론들을 9E10 항-myc mAb (ATCC NO. CRL-1729) (Evan G. I.et al.,Mol. Cell. Biol.5: 3610-3616, 1985)를 사용한 면역블럿 분석에 의해 분리하였다.
(2-3) pIGT3의 제작
pIGT3는 pIGT2의 NotⅠ 제한효소 부위를 SfiⅠ으로 치환하고 pIGT2의 myc 표지와 EK 절단 부위 사이에 트립신 절단 서열을 도입하였으며, gⅢ 앞의 앰버 코돈을 제거하여 제작되었다. 이러한 변형을 위해 오버랩핑 PCR (overlapping PCR)을 수행하였고, pIGT2는도 3a에 나타난 바와 같이 PCR 주형으로 사용되었다. pIGT2의 NotⅠ 클로닝 부위를 SfiⅠ으로 치환하기 위한 첫 번째 PCR 절편 (800 bp)은서열번호 5로 기재되는 센스 프라이머 P3과서열번호 6으로 기재되는 안티센스 프라이머 P4를 이용하여 94℃ 1분, 62℃ 1분 및 72℃ 1분의 조건으로 25회 반복하여 얻었다. pIGT2의 트립신 절단 서열의 도입과 앰버 코돈의 제거를 위한 두 번째 PCR 산물 (600 bp)은서열번호 7로 기재되는 센스 프라이머 P5와서열번호 4로 기재되는 안티센스 프라미어 P2를 이용하여 84℃ 1분, 62℃ 1분 및 72℃ 1분의 조건으로 25회 반복하여 얻었다. 이로부터 증폭된 두 개의 PCR 절편은 첫 번째 PCR 산물 및 두 번째 PCR 산물이 각각 80 ng씩 혼합된 혼합물을 주형으로 사용하고서열번호 5및4로 기재되는 프라이머 쌍 P3 및 P2를 이용한 오버랩핑 PCR에 의해 서로 연결되었다. PCR은 94℃ 1분, 60℃ 1분 및 72℃ 1분의 조건으로 20회 반복하여 수행하였다. 이로부터 증폭된 1,400 bp 크기의 PCR 절편을 HidⅢ/BamHⅠ으로 처리한 후 원래 pIGT2의 HindⅢ/BamHⅠ 절편과의 치환에 의해 pIGT2 내로 클로닝하여 pIGT3을 형성하였다.
본 발명의 재조합 파아지미드 pIGT3은 한국생명공학연구원 유전자은행에 2001년 7월 24일자로 기탁되었다 (수탁번호: KCTC 10021BP).
<실시예 3> ELISA에 의한 파아지 정량
JS5 세포 내에서 항-hsp70 scFv-pⅢ 융합 단백질을 암호화하는 pIGT3 (pIGT3/hsp70)을 Ex-파아지 (pIGT3/Ex-파아지) 또는 M13KO7 헬퍼 파아지 (pIGT3/M13KO7)로 패키징한 후 기능적 파아지 항체 입자의 조립을 관찰하기 위하여, pIGT3/Ex-파아지 및 pIGT3/M13KO7의 수율을 항-M13 다클론성 항체를 이용한 파아지 ELISA에 의해 결정하였다.
구체적으로, JS5 세포 내에 항-hsp70 scFv-pⅢ 융합 단백질을 암호화하는 pIGT3 (pIGT3/hsp70)을 배양하여 흡광도 값 (OD600)이 0.5가 되도록 키운 후 Ex-파아지 (pIGT3/Ex-파아지) 또는 M13KO7 헬퍼 파아지 (pIGT3/M13KO7)을 20 M.O.I (multiplicity of infection) 농도로 감염시켰다. 이를 1시간 동안 진탕배양한 후 원심분리하여 얻어진 침전 세포를 신선한 2× YT/AP 배지에 현탁하여 밤새 배양하였다. 배양액을 원심분리한 후 상등액만 취해 25% PEG/NaCl로 파아지를 침전, 획득하였다. 이로부터 얻은 일련의 파아지 희석액을 마이크로타이터 플레이트에 코팅 완충용액 (0.1 M NaHCO3, pH 8.6)을 이용하여 4℃에서 밤새 코팅하였다. 플레이트에 인산염 완충용액에 용해된 1% BSA를 첨가하여 반응을 종결시킨 후 결합된 파아지를 HRPO (horse radish peroxidase)가 접합된 항-M13 항체 (Amersharm Pharmacia사)로 검출하였다. 검출신호는 ABTS (2,2'-azio-di-[3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) 기질로 가시화시켰으며, ELISA 판독기 (Biorad사)로 정량하였다. 이때, 플라크 형성 단위 (pfu)가 알려진 M13KO7 헬퍼 파아지를 표준화에 이용하였다 (Rondot S.et al.,Nat. Biotech. 19: 75-78, 2001).
그 결과, 본 발명의 Ex-파아지로 패키징되어 생산된 파아지 입자의 수는 야생형 M13KO7로 패키징되어 생산된 파아지 입자의 수와 동일하였으며, 이는 본 발명의 변이형 헬퍼 파아지가 기능적 파아지 입자의 조립에 효율적으로 사용될 수 있음을 나타내는 것이다.
<실시예 4> 면역블럿 분석
pIGT3 파아지 입자의 표현 수준의 증가에 Ex-파아지 패키징이 미치는 영향을 조사하기 위하여, 동일한 수의 pIGT3/Ex-파아지 및 pIGT3/M13KO7을 M13의 gⅢ에 특이적인 마우스 항체를 사용한 면역블럿 분석에 의해 조사하였다.
구체적으로, M13KO7 헬퍼 파아지 및 Ex-파아지를 100 ㎖ LB 내 TG1 세포 (Amersham Pharmacia사)에 감염시킨 후 배양기 내에서 교반해 주면서 37℃에서 6시간 동안 배양하였다. 재조합 파아지를 얻기 위하여, pIGT3/hsp70 파아지미드를 포함하는 JS5 세포를 암피실린을 포함하는 50 ㎖ LB 배지에서 0D600=0.5 까지 현탁 배양한 후 상기에서 준비된 M13KO7 또는 Ex-파아지로 M.O.I 10 ∼ 20의 값으로 2시간 동안 감염시킨 후 여기에 1 mM IPTG와 50 ㎍/㎖ 카나마이신을 최종 농도로 첨가하고 30℃에서 밤새 배양하였다. 배양액으로부터 재조합 파아지를 원심분리하여 회수한 후 PEG 침전에 의해 분리하였다. 10% SDS-PAGE의 각 레인에 약 1010재조합 파아지를 로딩하여 파아지 단백질을 분리한 후 니트로셀룰로오스 막 (Amersham Parmacia사)에 옮겼다. 상기 막을 PBS에 용해된 3% 탈지유 (skim milk)로 실온에서 1시간 동안 처리하여 블러킹시킨 후 항-gⅢ 단클론성 항체 (mAb, Mobitec사)를 사용하여 면역블럿 분석을 수행하였으며, HRPO가 접합된 염소 항-마우스 IgG 항체 (Sigma사)를 이차 항체로 사용하였다. 검출신호는 ECL 기질 (Amersham Parmacia사)을 이용하여 X-선 필름 (Roche사) 상에 가시화시켰다.
그 결과, pIGT3/Ex-파아지 내에서는 scFv-pⅢ 융합 단백질이 pⅢ의 주된 형태로 존재하는 반면, pIGT3/M13KO7 내에서는 대부분의 pⅢ가 야생형으로 존재하였다 (도 5). 밀도측정 분석 (densitometry analysis) 결과, pIGT3/M13KO7 경우에는 단지 pⅢ의 5%만이 scFv:pⅢ 융합 단백질을 형성하였으나, 본 발명의 pIGT3/Ex-파아지 경우에는 5개의 pⅢ 소수 외피 단백질 중 3 내지 4개가 상기 모든 파아지의 표면상에 scFv:pⅢ 융합 단백질로서 표현되었다.
<실시예 5> 파아지 ELISA에 의한 항원-결합 활성의 결정
(5-1) 항원-결합 특이성 조사
재조합 파아지 입자의 항원-결합 특이성을 조사하기 위하여, 코팅 완충용액 내 100 ng의 BSA, 라이소자임 (Sigma사), 재조합 글루타치온 S-전이효소 (GST) 또는 재조합 인간 HSP-70을 마이크로타이터 플레이트 (Falcon사)에 4℃에서 밤새 처리하여 코팅하였다. 재조합 GST 단백질은 1 mM IPTG의 존재 하에서 pGEX 벡터 (Amersham Parmacia사)로 형질전환된 대장균 DH5α의 배양에 의해 생산되었고, 글루타치온 아가로오스 비드 (Sigma사)를 사용하여 친화적으로 분리되었다. 재조합 인간 HSP-70 단백질은 인간 hsp-70 cDNA 삽입체를 갖는 pET28 벡터 (Invitrogen사)를 포함하는 BL21 (DE3) 세포의 배양에 의해 생산되었고 프로본드 수지 (Probond resin, Invitrogen)를 사용하여 친화적으로 분리되었다. 플레이트를 PBS에 용해된 1% BSA로 블러킹시킨 후, 1% BSA 내 M13KO7 또는 Ex-파아지로 팩키징된 1010scFv 파아지를 각 웰에 분주하고 실온에서 1시간 동안 방치하였다. 이때, 1010M13KO7 파아지를 음성 대조군으로 사용하였다. 상기 플레이트를 0.1% 트윈-20을 포함하는 PBS (PBS-tween)로 4번 세척한 후 결합된 파아지를 HRPO와 접합된 항-M13 항체로 검출하였다. 검출신호는 ABTS 기질로 가시화하여 ELISA 판독기로 OD405에서 정량하였다.
그 결과,도 6a에 나타난 바와 같이, pIGT3/Ex-파아지 및 pIGT3/M13KO7 파아지 입자들은 오직 인간 재조립 HSP-70 단백질과 반응할 뿐 BSA, 라이소자임 및 재조합 GST 단백질과는 전혀 반응하지 않았다. 또한, pIGT3/Ex-파아지는 pIGT3/M13KO7에 비하여 HSP-70 단백질에 대해 최소한 2배 이상 높은 검출신호를 나타내었는데, 이는 표현 수준의 증가가 특정 항원에 대한 친화적 결합력을 증가시켜 항원-결합 신호가 높아진 것을 의미한다.
(5-2) 항원-결합 민감성 조사
M13KO7 또는 Ex-파아지로 패키징된 파아지 입자의 항원-결합 활성의 민감성을 조사하기 위하여, 서로 다른 농도의 인간 재조합 HSP-70 단백질 (0 내지 10 ㎍)을 마이크로타이터 플레이트에 코팅한 후 1010pIGT3/Ex-파아지 또는 pIGT3/M13KO7를 이용하여 상기와 동일한 방법으로 파아지 ELISA를 수행하여 항원-결합 활성을 조사하였다.
그 결과, pIGT3/Ex-파아지는 동일한 ELISA 검출신호 (OD405= 0.15)에서 pIGT3/M13KO7에 비하여 100배 낮은 항원 농도에서도 결합하였고, 훨씬 적은 양의 항원에 대해서도 양성 신호를 나타내었는데, 이는 pIGT3/Ex-파아지에 의한 scFv:pⅢ 융합 단백질의 표현 증가가 직접적으로 재조합 파아지 입자의 항원-결합 민감성을 증가시킴을 의미하는 것이다 (도 6b).
<실시예 6> 패닝 과정
상당 부분의 비특이적 결합체들 중에서 특이적 결합체를 효율적으로 선별하기 위한 Ex-파아지의 가능성을 입증하기 위하여, pIGT3/M13KO7 및 pIGT3/Ex-파아지를 다양한 비율로 희석한 후 과량의 M13KO7 헬퍼 파아지와 혼합하여 2회의 패닝 과정을 수행하였다.
구체적으로, 코팅 완충용액에 용해된 100 ng의 재조합 인간 HSP-70 단백질로 마이크로타이터 플레이트를 4℃에서 밤새 코팅하였다. M13KO7 또는 Ex-파아지로 pIGT3/hsp70의 패키징에 의해 확보된 재조합 파아지를 1:104, 1:106또는 1:108비율로 비특이적 배경 (non-specific background)을 위해 M13KO7 헬퍼 파아지와 혼합하였다. PBS 내 3% BSA로 플레이트를 블러킹한 후, 각각의 희석 혼합물로부터 총 1010파아지를 각 웰에 첨가하고 실온에서 2시간 동안 방치하였다. 비결합된 파아지는 PBS-트윈을 이용하여 6번의 격렬한 피펫팅으로 세척하여 제거하였고 (Chae J.et al.,Mol. Cells11: 7-12, 2001), 결합된 파아지는 1 ㎍/㎖ 트립신 (Sigma사) 처리에 의해 용출시켰다 (Rondot S.et al.,Nat. Biotech. 19: 75-78, 2001).
패닝은 두 번 반복하여 실시하였다. 용출된 파아지의 수는 50 ㎍/㎖ 암피실린을 포함하는 LB 플레이트 (LB/Amp 플레이트)에 배양된 JS5 세포에 적가하여 이로부터 형성된 플라크의 pfu에 의해 계산하였고 (Sambrook J.et al.,Molecular cloning, A laboratory manualEdn. 2. [Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY], 1989), 증폭된 파아지는 상기 실시예 5에 기술된 바와 같이 표준품으로서 M13KO7 헬퍼 파아지를 사용하여 파아지 ELISA에 의해 정량하였다. 구체적으로, 첫 번째 및 두 번째 과정의 패닝으로부터 용출된 파아지를 M13KO7 또는 Ex-파아지 고감염 (superinfection)에 의해 50 ㎖ JS5 세포 내에서 증폭한 후 PEG/NaCl 침전에 의해 정제하였다. 각 과정의 패닝 후 항원-특이적인 파아지의 증가를 결정하기 위하여, 재조합 인간 HSP-70 단백질로 코팅된 마이크로플레이트로 ELISA를 수행하였다.
다클론성 ELISA를 수행하기 위하여, 패닝 후 용출된 재조합 파아지를 실시예 3에서와 같이 JS5 세포에 20분 동안 감염시키고 50 ㎖ LB/Amp 브로쓰 (broth) (100 ㎍/㎖ ampicillin)에서 0D600=0.5까지 현탁 배양한 후 M13KO7 또는 Ex-파아지로 M.O.I 10 ∼ 20의 값으로 2시간 동안 감염시켰다. 여기에 1 mM IPTG와 50 ㎍/㎖ 카나마이신을 최종 농도로 첨가하고 30℃에서 밤새 배양하였다. 배양액으로부터 재조합 파아지를 원심분리하여 회수한 후 PEG 침전에 의해 분리하였다. 이렇게 증폭된 재조합 파아지 1010을 마이크로타이터 플레이트에 첨가한 후 실시예 5와 동일한 방법으로 파아지 ELISA를 수행하였다. 이러한 다클론성 ELISA를 통하여 패닝과정이 항원과 특이적으로 결합하는 항체를 발현하는 재조합 바이러스를 성공적으로 선별 증가시켰음을 확인할 수 있었다.
단클론성 ELISA를 수행하기 위하여, 2차 패닝 후 용출된 재조합 파아지를 JS5 세포에 20분 동안 감염시킨 후 LB/Amp 플레이트 (100 ㎍/㎖ ampicillin)에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 이로부터 선별된 대장균 콜로니들을 멸균된 96-웰 플레이트 (Corning사) 내 200 ㎕ LB (100 ㎍/㎖ ampicillin)에 접종하였다. 상기 플레이트에 M13K07 또는 Ex-파아지를 첨가하여 대장균 클론들을 30℃에서 밤새 고감염시켜 개별적인 파아지 클론을 얻었다. 상기 플레이트로부터 파아지 입자를 포함하는 배양 상등액 100 ㎕를 마이크로타이터 플레이트에 첨가한 후 실시예 5와 동일한 방법으로 파아지 ELISA를 수행하였다. 이러한 단클론성 ELISA를 통하여 항원과 특이적으로 결합하는 항체를 발현하는 재조합 파아지의 클론을 확보하고 그 빈도수를 측정할 수 있었다. 이때, BSA를 항원 음성 대조군으로 사용하였고 M13K07 헬퍼 파아지를 파아지 음성 대조군으로 사용하였다.
그 결과, pIGT3/M13KO7 및 pIGT3/Ex-파아지 모두 1:108희석 비율에서는 아무런 증가를 나타내지 않았다. 항원-특이적인 파아지의 증가는 1:106희석 배율의 pIGT3/Ex-파아지에서 분명하게 관찰되었다 (도 7a,7b및7c).도 7a는 각 회의 패닝 과정 후 % 수율을 나타낸 것으로, pIGT3/M13KO7 및 pIGT3/Ex-파아지의 2번째 패닝 후 % 수율은 1번째 패닝의 % 수율보다 약 100배 증가하였는데, 이는 pIGT3/M13KO7 및 pIGT3/Ex-파아지 모두에서 두 번의 연속적인 패닝 동안 선택적인 증가가 야기되었음을 나타내는 것이다. pIGT3/Ex-파아지는 pIGT3/M13KO7 보다 약10,000배 이상 높은 % 수율을 나타내었는데, 이는 실시예 5에서 입증된 바와 같이 Ex-파아지의 증가된 표현 수준에 의한 항원에 대한 높은 결합 활성에 기인하는 것이다 (도 7a).
도 7b는 패닝 후 인간 HSP-70 단백질에 대한 다클론성 파아지 ELISA를 수행한 결과로서, M13 헬퍼 파아지를 사용하여 재조합 바이러스를 패키징 (pIGT3/M13KO7)하는 경우 패닝에 의해 재조합 바이러스의 항원 특이적인 선별이 이루어지지 않은 반면, Ex-파아지를 사용하여 재조합 바이러스를 패키징 (pIGT3/Ex-파아지)하는 경우에는 BSA와 HSP-70 항원의 ELISA 신호의 차이에서 볼 수 있는 바와 같이 1st 및 2nd 패닝 모두에서 재조합 바이러스의 항원 특이적인 선별이 효과적으로 이루어짐을 확인하였다.
상기 결과는도 7c에 나타난 단클론성 ELISA에 의해 명확하게 입증되는데, 무작위적으로 선별된 45개 pIGT3/M13KO7 파아지 클론들 중 오직 두 개의 클론만이 인간 HSP-70 단백질에 대해 양성인 반면, 45개 pIGT3/Ex-파아지 클론들 중 43개 클론이 인간 HSP-70 단백질에 대해 특이적인 결합 신호를 나타내어 2번째 패닝 후 pIGT3/Ex-파아지의 95%가 양성임을 확인하였다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 변이형 헬퍼 파아지는 비억제성 균주 내에서 대량으로 복제가 가능하므로 재조합 파아지미드의 패키징에 필요한 충분한 역가의 헬퍼 파아지 생산이 용이하며, 억제성 균주 내에서는 기능적인 pⅢ를 생산하지 않기 때문에 재조합 파아지미드 패키징시 입자 표면에 융합 단백질의 표현 수준을 현저하게 향상시킨다. 따라서, 본 발명의 변이형 헬퍼 파아지와 재조합 파아지미드를 이용하여 파아지 입자 표면의 융합 단백질의 표현 수준을 증가시킨 파아지 디스플레이 라이브러리 시스템은 항체 분자들의 표현 수준을 급격히 증가시켜 패닝 (panning)에 의해 상기 라이브러리로부터 특이적으로 결합하는 파아지 항체를 효율적으로 분리할 수 있으므로 목적하는 항원에 특이적이고 보다 다양한 항체를 개발하기 위하여 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 파아지 디스플레이 라이브러리 시스템은 항체뿐만 아니라 단백질 또는 폴리펩티드와 같은 특정 표적 분자에 고친화력으로 결합하는 폴리펩티드 리간드를 개발하는데도 적용될 수 있다.

Claims (23)

  1. 천연형 소수 외피 단백질 (minor coat protein) 유전자의 전부 또는 일부가 결실되거나 불완전한 필라멘트성 바이러스 게놈을 포함하는 파아지미드 벡터를 패키징하기 위한 헬퍼 파아지로서, 그 게놈 내에 상기 천연형의 소수 외피 단백질 유전자를 포함하고, 상기 소수 외피 단백질의 N-말단 부위 유전자에 조건부 억제성 번역 종결 코돈이 도입된 것을 특징으로 하는, 변이형 헬퍼 파아지.
  2. 제 1항에 있어서,
    필라멘트성 바이러스가 fd, M13, f1, If1, Ike, Zj/Z, Ff, Xf, Pf1 및 Pf3으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 변이형 헬퍼 파아지.
  3. 제 1항에 있어서,
    소수 외피 단백질이 pⅢ인 것을 특징으로 하는 변이형 헬퍼 파아지.
  4. 제 1항에 있어서,
    조건부 억제성 번역 종결 코돈이 UAG (Amber), UAA (Ocher) 또는 UGA (Opel) 코돈인 것을 특징으로 하는 변이형 헬퍼 파아지.
  5. 제 1항에 있어서,
    조건부 억제성 번역 종결 코돈의 도입이 번역 종결 코돈을 첨가하거나 또는 상기 N-말단 부위 유전자 내의 코돈을 치환함으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는 변이형 헬퍼 파아지.
  6. 제 5항에 있어서,
    번역 종결 코돈으로의 치환이 소수 외피 단백질 N-말단의 글루탐산 코돈을 앰버 (Amber) 코돈으로 치환함으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는 변이형 헬퍼 파아지.
  7. 제 1항에 있어서,
    소수 외피 단백질의 N-말단 부위 유전자에 조건부 억제성 번역 종결 코돈이 2개 이상 도입된 것을 특징으로 하는 변이형 헬퍼 파아지.
  8. 제 1항에 있어서,
    소수 외피 단백질 N-말단 부위 유전자는 pⅢ의 선도 서열을 포함하여 N-말단 90개의 아미노산을 코딩하는 유전자 부위인 것을 특징으로 하는 변이형 헬퍼 파아지.
  9. 제 1항에 있어서,
    파아지미드 벡터를 패키징하기 위한 기본 골격으로서의 헬퍼 파아지가 M13KO7, M13R408, M13-VCS 또는 Phi X174인 것을 특징으로 하는 변이형 헬퍼 파아지.
  10. 제 1항에 있어서,
    파아지미드 벡터를 패키징하기 위한 기본 골격으로서의 헬퍼 파아지가 M13KO7이고, 소수 외피 단백질이 pⅢ이며, 상기 pⅢ N-말단 부위의 20번째 및 32번째 글루탐산 코돈이 앰버 코돈으로 치환된 변이형 헬퍼 파아지 (수탁번호: KCTC 10022BP).
  11. 1) pⅢ의 앵커 도메인 (anchor domain)과 융합된 형태로 활성형의 이종 단백질을 발현하는 재조합 파아지미드를 만드는 단계;
    2) 단계 1의 파아지미드와 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 변이형 헬퍼 파아지를 억제성 숙주세포에 공감염시키는 단계; 및
    3) 상기 숙주세포를 배양하여 바이러스 외피를 구성하는 pⅢ 단백질 중 하나 이상이 pⅢ-이종 단백질의 융합 단백질인 형태로 발현되는 재조합 바이러스를 생산하는 단계를 포함하는, 유전적으로 다양성을 갖는 이종 단백질을 표면에 발현하는 재조합 바이러스 라이브러리를 제작하는 방법.
  12. 제 11항에 있어서,
    단계 1)의 파아지미드가 fd, M13, f1, If1, Ike, Zj/Z, Ff, Xf, Pf1 및 Pf3으로 구성된 군으로부터 선택되는 필라멘트성 바이러스 게놈을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 11항에 있어서,
    단계 1)의 pⅢ의 앵커 도메인 (anchor domain)과 융합된 형태로 발현되는 활성형의 이종 단백질이 인간 면역 글로블린인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13항에 있어서,
    단계 1)의 pⅢ의 앵커 도메인 (anchor domain)과 융합된 형태로 발현되는 활성형의 이종 단백질이 인간 면역 글로블린의 중쇄 가변 영역 도메인과 경쇄 가변 영역 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14항에 있어서,
    단계 1)의 활성형의 이종 단백질은 인간 면역 글로블린의 중쇄 가변 영역 도메인과 경쇄 가변 영역 도메인이 링커로 연결되어 있는 scFv (single chain Fv)인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 11항에 있어서,
    단계 1)의 재조합 파아지미드는 pⅢ의 앵커 도메인 (anchor domain)과 활성형의 이종 단백질 사이에 엔테로키나제 및 트립신 절단 부위를 추가적으로 갖는 융합 단백질을 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 16항에 있어서,
    단계 1)의 재조합 파아지미드가도 3b에 개시된 유전자 지도를 갖는 pIGT3 (수탁번호: KCTC 10021BP)인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 11항에 있어서,
    단계 2)의 억제성 숙주세포가 대장균 균주 DH5αF', JM101, JM109, JM110, KK2186, TG1 또는 XL-1 Blue인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 11항에 있어서,
    단계 2)는 재조합 파아지미드를 지니는 박테리아와 변이형 헬퍼 파아지를 1:10 내지 1:20의 비율로 공감염시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 11항에 있어서,
    단계 1)과 단계 2) 사이에 변이형 헬퍼 파아지를 비억제성 숙주세포에 감염시켜 배양함으로써 변이형 헬퍼 파아지를 대량 생산하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 20항에 있어서,
    비억제성 숙주세포가 대장균 균주 MV1184, MV1193, XS101, XS127 또는 JS5인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 특정 항원과의 친화적 결합 여부를 기준으로 제 11항의 방법으로 제작된 라이브러리로부터 상기 항원과 결합하는 항체 단백질을 발현하는 재조합 바이러스를 선별하는 방법.
  23. 제 22항에서 선별된 바이러스를 트립신 또는 엔테로키나아제로 처리함으로써 항체 단백질을 분리·획득하는 방법.
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