KR20030010356A - 젖산균과 효모균주를 이용한 발효식혜 및 그 제조방법 - Google Patents

젖산균과 효모균주를 이용한 발효식혜 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 젖산균과 효모균주를 이용한 발효식혜 및 그 제조방법에 관한 것으로 전통안동식혜로부터 산생성력, CO2가스 생성능 및 성장이 우수한 젖산균과 효모균주를 분리하고 상기 분리한 젖산균 LLS 56, LBS 10, LAS 47과 효모 SCS 5 균주를 쌀, 무, 생강, 고춧가루 및 엿기름을 혼합한 다음 당화시킨 식혜에 단독접종 또는 혼합접종하여 발효한 후 균질화하고 안정제를 0.1∼1.0%(w/w) 첨가한 다음 0∼10℃에서 숙성하여 제조함으로써 기호성이 향상되고 저장성과 식미가 우수한 발효식혜 및 그 제조방법을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

젖산균과 효모균주를 이용한 발효식혜 및 그 제조방법{Fermented Sikhe usig lactic acid bacteria and yeast strain and process for preparation thereof}
본 발명은 젖산균과 효모균주를 이용한 발효식혜 및 그 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 전통안동식혜로부터 젖산균과 효모를 분리하고 당화시킨 식혜에 단독접종하거나 또는 혼합접종하여 발효하고 안정제를 첨가한 다음 숙성하여 제조한 식혜 및 그 제조방법에 관한 것이다.
식혜는 제조과정 중 전분 및 단백질 등의 분해로 생성되는 당분의 단맛, 신맛 및 구수한 맛에다 지방의 전통적인 특색에 따른 향신료 등이 잘 조화된 우리나라 고유의 기호식품이다. 안동식혜는 보리를 발아시켜 만든 엿기름에서 추출되어 나오는 아밀라아제에 의한 당화과정에서 생성된 맥아당 및 포도당 등의 감미와 무, 생강 및 고춧가루를 채소와 향신료를 혼합하여 발효하는 동안에 생성된 젖산과 잘조화된 기호음료이다.
복합 채소 발효 식품의 발효초기에는 에어로모나스 속(Aeromonassp.)과 바실러스 속(Bacillussp.)이 발현하고 이어서 젖산균이 발효을 주도하게 되고 효모가 알코올을 생성하여 향미 생성에 관여한다 [Fleming,H.P., Mcfeeters,R.F. and Thompson,R.L.J.Food Sci., 48,982-989 (1983)]. 한편, 젖산균은 장내 세균의 정장화 작용, 혈장 콜레스테롤의 저하, 위장관내 병원균 증식 억제 효과 등이 있는 것으로 알려져 있으며 식물 특히 채소나 향신료의 즙액이나 추출물을 인공배지에 첨가하면 젖산균의 생육이 촉진된다는 연구들이 보고된 바 있다 [Stamer,J.R. In Biotechnology, Reed,G.(ed.), Verlage Chemie.,5,369(1983); Lewus,C.B.,Sun,S. and Montvile,T.J. Appl. Environ. Microbiol.,58,143-150(1992)].
젖산균과 효모의 혼합 발효시 두 균주의 상호작용을 살펴보면, 먼저 젖산균이 채소류 발효에 관여하며, 효모는 젖산균의 증식이 거의 중단된 후 잔유당을 이용하여 성장한다고 한다. 주 발효과정 중에 당은 젖산균과 효모에 의해 젖산과 알코올 및 다른 최종산물로 전환되는데 당이 발효과정 중에 불충분하게 발효될 경우 그 대사 생성물은 효모에 의해 발효가 일어난다. 산도가 높아져 젖산균의 생육이 정지되어도 효모는 계속 생육을 하며 잔류당을 소비함으로서 발효당의 이용능이 높아지며 당을 알코올로 전환시켜 젖산균이 단독발효로 인해 생산되는 젖산량을 조절하여 주면 적정한 산도와 향미를 부여하여 준다 [Fleming. H.P., Mcfeeters,R.F., Thompson, R.L. and Sanders, D.C. J.Food Sci., 48,975-982(1983)].
그러나 아직까지 종래의 식혜로부터 분리한 젖산균과 효모를 당화시킨 식혜에 접종하여 발효시킴으로써 기호도가 향상된 발효식혜의 제조방법은 공지된바가 없다.
본 발명자들은 상기와 같은 점을 착안하여 안동식혜로부터 산생성능, CO2생성능 및 성장이 우수한 젖산균 및 효모를 분리하고 식혜의 당화과정 중에 단독접종또는 혼합접종하여 발효한 후 균질화한 다음 안정제를 첨가하고 저온에서 숙성하여 기호도와 저장성이 향상된 발효식혜를 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 젖산균과 효모를 이용한 발효식혜의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조된 저장성과 식미가 우수한 발효식혜를 제공하는 것이다.
본 발명의 상기 목적은 전통안동식혜로부터 산생성력, CO2가스 생성능 및 성장이 우수한 젖산균과 효모 균주를 분리하고 상기 분리한 젖산균 LLS 56, LBS 10, LAS 47과 효모 SCS 5 균주의 특성을 조사한 다음 증자된 쌀 1.6kg, 무 2.0kg, 생강 0.16kg, 고춧가루 0.08kg 및 엿기름 추출물의 혼합물을 40℃에서 4시간 당화한 후 상기 본 발명 공시균주 0.5%(v/v)를 단독으로 접종하여 발효시키거나 또는 혼합접종하여 5℃에서 2일간 저온발효하고 안정제를 0.1∼1.0%(w/w) 첨가한 후 0∼10℃에서 숙성 및 저장하여 발효식혜를 제조한 다음 일반성분함량, 비휘발성 유기산 및지방산 함량, 효소활성, 알코올 및 유리당 함량, 유리 아미노산 함량, 수용성 및 염용해성 단백질의 아미노산 함량, 안정제를 첨가한 식혜의 침전억제효과, 관능검사, 생균수 및 산생성 균수, 점도변화, 기호도 변화를 조사함으로써 달성하였다.
이하, 본 발명의 구성을 설명한다.
도 1은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 발효식혜의 제조공정도이다.
도 2는 본 발명 젖산균의 배양시 시간의 경과에 따른 생균수 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명 젖산균의 배양시 시간의 경과에 따른 pH의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명 젖산균의 배양시 시간의 경과에 따른 산도의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명 효모균주의 배양시 시간의 경과에 따른 알코올함량 변화를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명 효모균주의 배양시 시간의 경과에 따른 세포성장의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명 효모균주의 배양시 시간의 경과에 따른 생균수의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명 효모균주의 배양시 시간의 경과에 따른 pH의 변화 및 산도의변화를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명 젖산균과 효모균주를 단독접종하여 제조한 발효식혜의 pH변화를 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명 젖산균과 효모균주를 단독접종하여 제조한 발효식혜의 산도변화를 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명 젖산균과 효모균주를 단독접종하여 제조한 발효식혜의 생균수 변화를 나타낸 그래프이다.
도 12는 본 발명 젖산균과 효모균주를 혼합접종하여 제조한 발효식혜의 pH변화를 나타낸 그래프이다.
도 13은 본 발명 젖산균과 효모균주를 혼합접종하여 제조한 발효식혜의 산도변화를 나타낸 그래프이다.
도 14는 본 발명 젖산균과 효모균주를 혼합접종하여 제조한 발효식혜의 생균수 변화를 나타낸 그래프이다.
도 15는 본 발명 젖산균 상호간의 혼합접종에 의하여 제조한 발효식혜의 pH변화를 나타낸 그래프이다.
도 16은 본 발명 젖산균 상호간의 혼합접종에 의하여 제조한 발효식혜의 산도변화를 나타낸 그래프이다.
도 17은 본 발명 젖산균 상호간의 혼합접종에 의하여 제조한 발효식혜의 생균수 변화를 나타낸 그래프이다.
도 18은 본 발명 전처리를 달리하여 제조한 발효식혜의 pH변화를 나타낸 그래프이다.
도 19는 본 발명 전처리를 달리하여 제조한 발효식혜의 산도변화를 나타낸 그래프이다.
도 20은 본 발명 전처리를 달리하여 제조한 발효식혜의 생균수 변화를 나타낸 그래프이다.
도 21은 본 발명 발효식혜의 숙성 6일째 향기성분을 분석한 기체크로마토그램이다.
본 발명은 전통 안동식혜로부터 젖산균과 효모를 분리하기 위하여 시료를 m-엔테로코코스아가(m-Enterococcus agar)에 도말하고 30℃에서 3일간 배양하여 락토코코스속(Lactococcussp.)과 락토바실러스속(Lactobacillussp.)의 균주를 분리하는 단계; 맥아추출물 브로스(malt extract broth)에 안동식혜를 접종하여 48시간 배양한 다음 평판배지에서 도말하여 CO2생성능이 강한 효모를 분리하는 단계; 상기 단계에서 분리한 본 발명 젖산균 LBS 47, LAS 10 및 LLS 56 균주를 37℃에서 배양하면서 성장의 변화, pH 변화 및 적정산도의 변화를 조사하는 단계; 상기 단계에서 분리한 본 발명 효모균주 SCS 5를 맥아추출물에 배양하면서 알코올생성 정도를 조사하는 단계; 식혜재료의 조성비율을 결정하기 위하여 재료비율을 달리하여 식혜를 제조하고 관능검사를 실시하여 최적배합비율을 결정하는 단계; 증자된 쌀 1.6kg에 무 2.0kg, 생강 0.16kg 및 고춧가루 0.08kg을 혼합하고 15℃에서 7일간 발아한 다음 5℃에서 냉각한 후 여과한 맥아 상징액을 첨가하여 40℃에서 4시간 당화한 다음 상기 단계의 본 발명 젖산균과 효모를 각각 1.0%(v/v)씩 단독접종하여 5℃에서 2일간 저온발효하고 4℃에서 숙성 및 저장하면서 pH, 적정산도 및 균수의 변화를 조사하는 단계; 상기 단계와 동일하게 식혜를 제조하고 당화한 후 본 발명 젖산균과 효모를 혼합접종한 다음 발효하고 4℃에서 숙성 및 저장하면서 pH, 적정산도 및 균수의 변화를 조사하는 단계; 상기 단계와 동일하게 식혜를 제조하고 당화한 후 본 발명 젖산균을 상호 혼합하여 발효한 다음 숙성 및 저장하면서 pH, 적정산도 및 균수의 변화를 조사하는 단계; 식혜 제조시 저온 살균처리, 초기 pH조절 및 재료를 균질화하여 제조한 다음 pH, 적정산도 및 균수의 변화를 조사하는 단계; 상기 단계에서 제조한 발효식혜의 일반성분을 분석하는 단계; 상기 단계에서 제조한 발효식혜의 관능을 검사하는 단계; 상기 단계에서 효모와 젖산균을 혼합접종하여 발효한 식혜의 비휘발성 유기산 및 지방산 함량을 조사하는 단계; 상기 단계에서 효모와 젖산균을 혼합접종하여 발효한 식혜의 산성 프로테아제, 전분액화, 당화효소력 및 리파아제 활성을 측정하는 단계; 상기 단계에서 효모와 젖산균을 혼합접종하여 발효한 식혜의 질소화합물을 분석하는 단계; 상기 단계에서 효모와 젖산균을 혼합접종하여 발효한 식혜의 알코올 및 유리당을 분석하는 단계; 상기 단계에서 효모와 젖산균을 혼합접종하여 발효한 식혜의 비휘발성 유리 아미노산을 분석하는 단계; 상기단계에서의 효모와 젖산균을 혼합접종하여 발효한 식혜의 수용성 및 염용해성 단백질 아미노산을 분석하는 단계; 상기 단계의 본 발명 발효식혜의 향기성분을 기체크로마토그래피로 분석하고 동정하는 단계; 상기 단계에서의 효모와 젖산균을 혼합접종하여 발효한 식혜에 카라기난 0.3%(w/w)를 첨가하는 단계; 상기 단계의 효모와 젖산균을 혼합접종하여 발효한 식혜에 CMC 0.7%(w/w)를 첨가하는 단계; 상기 단계의 효모와 젖산균을 혼합접종하여 발효한 식혜를 균질화한 다음 카라기난 0.03%(w/w)를 첨가하는 단계; 상기 단계의 본 발명 식혜에 안정제를 종류별로 첨가하고 침전억제효과를 조사하는 단계; 상기 단계의 안정제를 첨가한 식혜의 관능을 검사하는 단계; 상기 단계의 안정제를 첨가한 식혜의 생균수 및 산생성 균수를 조사하는 단계; 상기 단계의 안정제를 첨가한 식혜의 점도변화를 조사하는 단계; 상기 단계의 안정제를 첨가한 식혜의 기호도 변화를 조사하는 단계로 구성된다.
상기 단계에서 식혜 제조시 재료의 배합비율은 멥쌀 또는 찹쌀 1∼2kg, 무 1∼3kg, 생강 0.1∼0.5kg 및 고춧가루 0.05∼0.1kg이였다.
상기 단계에서 식혜의 당화는 30∼50℃에서 2∼6시간 당화하였다.
상기 단계에서 식혜에 젖산균과 효모의 접종량은 0.1∼2.0%(v/v)이였으며 10∼30℃에서 10∼24시간 발효하였다. 발효된 식혜의 숙성은 0∼10℃에서 실시하였다.
상기 단계에서 안정제로는 카라기난, CMC 및 나트륨 알지네이트를 사용하였으며 이들의 첨가량은 0.01∼3.0%(w/w)이였다.
상기 단계에서 본 발명 발효식혜의 숙성 및 저장온도는 0∼10℃로 조절하였다.
이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예와 실험예를 들어 상세히 설명하고자 하지만, 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 젖산균의 분리 및 동정
최등(Korean J. Food Sci. Technol., 22, 724-731, 1990)이 보고한 전통안동식혜의 제조방법으로 식혜를 제조하고, 상기 제조한 식혜로부터 젖산균과 효모를 분리하였다. 젖산균의 분리는 Shiogeo와 Toshio등의 방법(Miyao, S. and Ogawa, T.Nippon Shoku hin Gakkaish, 35, 610-617(1998))에 따라 선택배지에서의 전형적인 집락(colony)으로 젖산균을 분리동정하였다. 안동식혜 시료 0.1mL를 m-엔테로코코스 아가(m-Entercoccus agar)에 도말하여 30℃에서 3일간 배양하여 락토코코스 속(Lactococcussp.)은 붉은색을 페디오코코스(Pediococcussp.) 속은 흰색의 집락으로 구분하였다. 또한, MRS 브로스에 0.002% 브로모페놀 블루(bromophenol blue)를 첨가한 선택배지에서 락토바실러스속(Lactobacillussp.)은 전체적으로 담청색 또는 전체적으로 흰색의 집락을, 루코노스톡속(Leuconostocsp.)은 전체적으로 암청색의 환이 나타나지 않는 집락으로 구분하여 분리하였다. 젖산균의 동정은 시료즙액을 엘라이커 아가(Elliker agar), MRS 아가(agar) 평판배지에서의 산 생성능으로 분리하여 그람염색(Gram -stain), 리트머스 밀크(litmus milk)의 변화, 카탈라제 테스트(catalase test), 디아세틸(diacetyl) 생성검사, 염내성 테스트(salt-toler ant test), 아르기닌(arginine)으로부터 NH3생성 등을 조사하고 그 결과를 Bergey's 매뉴얼, Sharpe [Sharpe,M.E.,Dairy Sci. Abstr.,24,165(1962)], Gibbs와 Skinner[Gibbs, B.M. and Skinner, F.A., A.P.London, New York(1996)]의 방법에 따라 동정하였다.
실험 결과, 젖산균 72주를 1차 분리하였고 이중 성장이 우수하고 산생성력이강한 3균주를 2차 선별하여 이들을 LLS 56, LBS 10, LAS 47이라고 명명하였다. 선별된 균들의 형태학적, 배양학적 및 생리학적 특성을 조사한 결과 표 1에 나타낸 바와 같이 3균주들은 그람(gram)양성이고, 운동성이 없으며 포자를 형성하지 않는 통성혐기성의 간균과 구균으로 카탈라제(catalase)와 옥시다제(oxidase)는 음성이었고 포도당(glucose)에서 젖산을 생성하는 등 모든 특성들이 젖산균의 일반적인 특성과 일치하였다. 한편, LLS 56은 아르기닌에서 NH3를 생성하고, 유당(lactose), 갈락토오스(galac tose), 맥아당(maltose) 및 과당(fructose)를 발효하였다. 상기와 같은 LLS 56의 특성은 락토코코스 락티스(Lactococcus lactis)와 거의 일치하므로 락토코코스 락티스 LLS 56(Lactococcus lactisLLS 56)으로 동정하였으며, LBS 47은 락토바실러스 불가리쿠스 LBS 47(Lactobacilus bulgaricusLBS 47)로 LAS 10은 락토바실러스 애시도필러스 LAS 10(Lactobacilus acidophilusLAS 10)으로 각각 동정하였다.
안동식혜로부터 분리한 젖산균의 특성
특성 L.bulgaricusLBS 47 L.acidophilusLAS 10 Lc.lactisLLS56
그람염색 +1) + +
형태 간균, 사슬형태 간균 쌍을 이룸, 사슬형태
세포크기 1.4 μm 0.9 μm 0.3 μm
운동성 -2) - -
집락 형태 둥근 형태 둥근 형태 둥근 형태
높이 솟아오름 솟아오름 솟아오름
가장자리 볼록함 볼록함 볼록함
색 노란색 노란색 노란색
브로스 침전 침전 침전
젤라틴 - - -
카탈라제 - - -
옥시다제 - - -
아르기닌으로부터암모니아생성 - - +
50℃에서 성장 + + -
10℃에서 성장 + + +
pH9.5에서 성장 - - -
전분 - - -
탄소원의 이용능
유당 + + +
갈락토오스 + + +
소르비톨 + - v3)
만니톨 + + v
맥아당 + + +
서당 + + -
과당 + + +
셀로바이오스 + - -
이노시톨 - - -
이눌린 - - -
L-아르기닌 - - +
D-포도당 + + +
사과산 - - -
구연산 - - -
〔보기〕 1) 양성반응, 2) 음성반응, 3) 변이반응
실시예 2: 효모균주의 분리 및 동정
효모의 분리는 전통 안동식혜를 균질화하여 냉각된 증류수에 혼합한 후 살균된 치즈 클로스(cheese cloth)로 여과하고 pH 3.5로 조정된 맥아추출물브로스(malt extract broth)에 1.0%(v/v) 접종하여 48시간 배양한 다음 맥아추출물 브로스(malt extract broth) 평판 배지에서 효모를 분리하였으며, 분리된 효모 집락 중 가장 강한 CO2가스 생성능을 나타내는 균주를 선발하였다. 동정은 형태학적 검사와 API(Analytical Profile Index) 20C AUX에 의한 생화학적 검사를 실시하여 Lodder[Lodder,T., North-Holland publishing Co.,Netherand, 1st(1970)]와 Kreger -van[Kreger-van Rij, N.J.W., Elserier Science publishers B.V. Amsterdam (1984)]의 분류기준에 의하여 동정하였다.
안동식혜로부터 효모균주를 분리한 결과, 470개의 순수효모를 분리하였으며 그 중 가장 CO2생성능이 강한 균주를 분리하여 SCS 5로 명명하였다. SCS 5의 형태학적, 배양학적 및 API 20 C AUX 분석 키트(analytab kits)를 이용한 생화학적 특성은 표 2와 표 3에 나타낸 바와 같다. 효모 SCS 5는 약간 긴 오보이드(ovoid)형이며 분열은 다면(multilateral)에 의해 분열되는 것으로 나타났다. 집락의 형태는 원형으로서, 가운데 부위는 약간 볼록하며, 가장자리는 매끄럽게 나타났다. 카로티노이드계 색소의 반응색체는 황갈색을 나타내었고, 집락의 표면과 색채는 흐리면서도 부드럽게 나타났으며, 조직은 점성이 있었다.
탄소원에 따른 이용능은 포도당, 갈락토오스, 맥아당, 서당 및 라피노오스 등은 발효하였으며 포도당, 갈락토오스, 소르비톨, α-메틸-D-글루코사이드, 맥아당, 서당 및 라피노오스 등은 자화하였다. 상기와 같은 결과로부터 SCS 5는 사카로마이세스 세레비지에 SCS 5(Saccharomyces serevisiaeSCS 5)로 동정하였다.
안동식혜로부터 분리한 효모균주의 특성
특성
액체배지(맥아추출물 브로스)
영양세포의 형태 오보이드(ovoid)형
분 열 출아(다면)
세 포 크 기 2.5∼5.5 μm
자 낭 포 자 존재하지 않음
슈도마이셀리움 존재함
트루마이셀리움 존재하지 않음
고체배지(맥아추출물 아가)
표 면 원형
가장자리 고르다
높 이
색 빛남
점 성 응집성이 있음
안동식혜로부터 분리한 효모의 탄소 이용능
탄소화합물 동화작용
24시간 48시간
포도당 + +
갈락토오스 + +
셀로바이오스 - -
유당 - -
맥아당 + +
서당 + +
트레할로스 - -
메리지토스 - -
라피노스 + +
탄소화합물 + +
포도당 - -
글리세롤 - -
2-케토-D-글루코네이트 - -
L-아라비노스 - -
D-자일로스 - -
아도니톨 + -
자일리톨 + +
갈락토오스 - -
이노시톨 + +
소르비톨 + +
α-메틸-D-글루코시드 - -
N-아세틸-D-글루코사민 - -
셀로바이오스 - -
유당 + +
맥아당 + +
서당 - -
트레할로스 - -
메리지토스 + +
라피노스
실험예 1: 본 발명 젖산균의 특성조사
상기 실시예 1에서 분리한 젖산균 LBS 47, LAS 10 균주를 MRS배지(pH6.5)에 각각 접종하여 37℃에서 배양하면서 성장의 변화, pH 변화 및 적정산도의 변화를 조사하였으며, 젖산균 LLS 56 균주는 엘리커(Elliker)배지(pH 6.5)에 접종하여 30℃에서 배양하면서 성장의 변화, pH 변화 및 적정산도의 변화를 조사하였다.
실험 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 젖산균 LBS 47과 LAS 10균주 모두 배양 12시간에 각각 5.2×108CFU/mL, 2.8×108CFU/mL로 성장유도기에 도달했으며 배양 20시간에 1.7×109CFU/mL로 성장정지기에 도달하였다. LLS 56 균주는 배양 12시간에 5.1×106CFU/mL로 성장유도기로 나타났으며 배양 24시간에 4.8×106CFU/mL로 정지기에 도달하였다. 또한 pH와 적정산도의 변화는 도 3과 도 4에 나타낸 바와 같으며 LLS 56균주의 경우 다른 균주들에 비해 pH가 급격히 떨어져서 배양 12시간에 pH 4.2에 달하였고 LBS 47과 LAS 10 균주는 배양 48시간까지 완만하게 낮아졌다. 그러나 3균주 모두 배양 12시간에서 48시간까지는 pH가 3.7∼4.2로 큰 변화는 나타나지 않았다. 적정산도는 LLS 56 균주가 배양 4시간에서 8시간 사이에 0.40∼0.62 %로 약간 증가하였고 그 이후에는 거의 변화가 없었다. LBS 47과 LAS 10균주의 경우에는 적정산도가 배양 48시간까지 0.40∼2.30%로 급격하고도 지속적인 증가를 나타내어 LAS 56 균주와는 전혀 다른 양상을 보였다.
실험예 2: 본 발명 효모균주의 특성 조사
상기 실시예 2에서 분리한 효모균주 SCS 5균주를 듀람관(Durham tube)을 이용하여 MB(맥아추출물 브로스, pH 5.4)에서 배양하고 알코올생성 정도를 조사하였다. 또한, MB 배지에 1.0%(v/v)의 SCS 5균주 현탁액을 접종하여 4∼45℃의 범위에서 36시간 진탕배양한 후 660nm에서 균의 성장을 측정하고 pH와 적정산도의 변화를 조사하였다. 진탕배양 중에 8시간 간격으로 배양물을 채취하여 균수를 측정하였다.
실험 결과, SCS 5 균주의 알코올생성 정도는 도 5에 나타낸 바와 같으며 배양 4시간대에 약 10%의 알코올이 생성되기 시작하여 배양 32시간에는 약 15%의 알코올이 생성되었다. SCS 5 균주의 성장은 도 6에 나타낸 바와 같으며 15℃에서 40℃의 넓은 범위에서 성장을 하였으며 30℃에서 가장 높게 나타났다. SCS 5 균주의 배양 중 균주의 변화는 도 7에 나타낸 바와 같으며 배양 32시간에 4.9×109CFU/mL로 성장정지기에 도달하였으며 배양 40시간에 1.8×109CFU/mL로 서서히 사멸기로 접어들었다. pH와 적정산도의 변화는 도 8에 나타낸 바와 같으며 배양 12시간에 pH가 4.5였으며 적정산도가 1.23%로 빠른 산생성을 보였다. 배양 28시간에는 pH 3.3과 산도 0.45%를 나타냈다.
실험예 3: 최적 식혜 재료의 조성비율 결정
식혜 재료의 최적 조성비율을 결정하기 위하여 각각 재료 비율을 달리하여 식혜를 제조하고 관능검사를 실시하였다. 식혜 재료로는 찹쌀, 엿기름가루, 무, 생강, 고춧가루 및 물을 사용하였으며 표 4에 나타낸 바와 같이 그 혼합비율을 각각 다르게 하여 제조하였다. 먼저 찹쌀을 12시간 침수하여 물빼기를 한 다음 증자하여 식혜밥을 제조하였고 맥아는 15℃에서 7일간 발아시켜 분쇄한 다음 물10L에 상기 엿기름 가루를 넣고 2시간 담구었다가 버물여 체를 받혀서 찌꺼기는 버리고 8시간 침전시킨 후 5℃에서 냉각하고 치즈 클로스(cheese cloth)로 여과하여 상징액을 사용하였으며 고춧가루는 여과된 엿기름물에 넣어 고추물을 추출하였다. 무는 깍뚝썰기 또는 채썰기를 하고 생강은 다져서 즙을 내어 사용하였다. 고춧가루는 주머니에 넣어 엿기름물에 넣고 끊여서 식힌 다음 고추물을 우려내었다. 상기와 같이 준비된 따뜻한 식혜밥과 잘게 썰은 무깍뚝이를 함께 넣어 섞은 다음 항아리에 담고 생강즙과 고춧가루 추출물을 첨가한 후 엿기름을 넣어 조정하여 30℃에서 15시간 발효하였다. 상기 제조한 식혜의 맛, 향기, 색에 관하여 관능검사를 실시하여 최적 배합비율을 결정하였다. 관능검사원은 식혜맛에 익숙한 안동지역 학생 10명과 식혜맛에 익숙치않은 대구지역 학생 10명으로 구성하여 3개월간 훈련을 통해 식혜의 맛을 익힌 능력을 갖춘 후 평가에 임하도록 하였다. 관능검사방법은 식혜를 검사실시 30분전에 냉장고에 꺼내어 충분히 흔든 후 50mL씩 유리잔에 담아 검사원에게 제공하였다. 관능검사는 오전11시에 진행하였으며 시료는 무작위로 검사원에게 제공순서를 다르게 제시하였고 시료의 균질성을 기하기 위하여 유리막대를 함께 제공하였다. 관능검사 방법은 스코링 방법에 의해 각 특성에 1에서 5까지 나뉘어진 등급을 사용하여 평가하였고, 1로 갈수록 특성강도가 약하고 5로 갈수록 특성강도가 강하다는 것을 나타낸다. 관능검사는 무작위완전블럭(randomized complete block) 디자인을 사용하였고 4회 반복실시한 결과는 이원배치 분산분석 및 최소 유의차 검증으로 분석하였다.
식혜 제조시 재료의 조성비율
식혜(g) 찹쌀(g) 엿기름(g) 물(L) 무(g) 생강(g) 고춧가루(g) 총당(%)
Ⅰ 1600 1000 10 1600 100 0 12
Ⅱ 1600 1000 10 1800 120 60 14
Ⅲ 1600 1000 10 2000 140 80 16
Ⅳ 1600 1000 10 2200 160 100 17
Ⅴ 1600 1000 10 2400 200 120 18
실험 결과, 표 5에 나타낸 바와 같이 5종류의 식혜 가운데 식혜 Ⅲ과 식혜 Ⅳ의 식혜가 단맛, 매운맛과 생성된 산들에 의하여 향신료와 잘 조화된 식혜로 판정되었다. 식혜의 종류별 맛, 향기 및 색에 대해 패널 그룹별 차이를 단측검정한 결과, 식혜 Ⅰ에서 향기가 현저한 통계적 유의성을 나타내고(t=1.90, df=18, p<0.05) 식혜Ⅱ에서는 색이 현저한 통계적 유의성을 보여주고 있다(p<0.05). 식혜 Ⅲ에서는 단맛(p<0.01), 매운맛(t=2.56, df=18, p<0.01)이 패널 그룹간에 통계적 유의성을 보여주고 있어서 단맛과 매운맛이 더 좋은 것으로 판정되었다. 향기(t=-0.46, df=18, p=0.722)와 색(t=-1.46, df=18, p=0.160)은 패널 그룹간에 통계적인 차이가 발견되지 않았다. 식혜 Ⅳ에서는 단맛(t=-3.29, df=18, p=0.01), 매운맛(t=-4.02, df=18, p=0.01)이 패널 그룹간에 통계적 유의성이 검정되었다.
식혜의 종류에 따른 관능검사 결과
식혜종류 안동지역 패널 대구지역 패널
단맛 매운맛 냄새 색 단맛 매운맛 냄새 색
Ⅰ 2.0 2.1 2.3 2.0 2.1 2.2 2.1 1.8
Ⅱ 2.4 2.5 2.6 2.2* 2.8 2.7 2.7 2.6
Ⅲ 3.5** 3.2** 3.8 3.5 4.2 4.1 3.9 3.3
Ⅳ 4.0** 4.1** 3.6* 4.0 3.3 3.3 3.7 4.2
Ⅴ 3.6 2.8 2.7 3.8 2.6 2.3 2.6 3.5
〔주〕*:p<0.05**:p<0.01
또한, 상기 5종류의 식혜의 종류별로 맛, 향기 및 색의 차이를 분산분석을 통해 검정한 결과 모두 유의성이 발견되었다. 식혜의 맛, 향기 및 색을 패널 그룹의 효과, 식혜 종류별 효과와 양자의 상호작용을 분산분석을 통해 종합적으로 검토할 때 그 결과, 표 6에 나타낸 바와 같이 가장 이상적인 식혜의 배합비율은 찹쌀 1.6kg, 엿기름 1kg, 물 10L에 무 2kg, 생강 160g, 고추 80g 이였으며 식혜가 완숙된 3일째 총당이 약 12%였으며 가당하여 총당이 16∼17%가 되었을 때였다. 이때 향기는 약간의 감주향에 매운맛, 단맛 및 산미가 잘 조화된 향취를 나타내었고 약간 붉은색을 띠었다.
식혜 종류에 따른 분산분석
변수 df 단맛 매운맛 향 색
그룹효과 1 0.01 0.06 0.23 0.063
식혜종류별효과 4 11.559** 10.262** 9.552** 16.559
상호효과 4 1.766** 1.674** 0.85** 0.469**
그외 90 0.218 0.172 0.2 0.139
〔주〕**: p<0.000
실시예 3: 젖산균 및 효모의 단독발효에 의한 식혜 제조
재료의 조성은 증자된 쌀 1.6kg, 무 2.0kg, 생강 0.16kg 및 고춧가루 0.08kg이였다. 쌀은 침지한 후 물빼기하고 증자하여 식혜밥을 제조하였다. 상기 실험예 3에서 결정된 최적 식혜재료 조성비율에 따라 식혜를 제조한 다음 40℃에서 4시간 당화한 후 상기 실시예 1과 2에서 분리한 본 발명 젖산균주와 효모균주를 각각 1.0%(v/v)씩 단독접종하여 22℃에서 16시간 발효한 다음 5℃에서 2일 동안 저온 숙성한 후 4℃에서 저장하면서 pH, 적정산도 및 세포수의 변화를 조사하였다.
실험 결과, pH의 변화는 도 9에 나타낸 바와 같이 LAS 10과 LBS 47균주의 경우 숙성 및 저장기간동안 pH 5.2에서 pH 4.9로 큰 변화는 없었으며 LLS 56균주의 경우 pH가 4.4로 가장 낮게 나타났다. 효모 SCS 5균주는 저장기간동안 pH 5.3으로 뚜렷한 변화를 보이지 않았지만 LAS 10과 LBS 47 균주에 비해 pH가 가장 높았다.
적정산도의 변화는 도 10에 나타낸 바와 같으며 초기숙성 2일에서 3일 사이에 LLS 56 균주는 0.40%에서 0.41%로 가장 높게 나타났으며 LAS 10과 LBS 47 균주는 초기 숙성 2일에서 3일에 각각 0.27%에서 0.28%, 0.31%에서 0.29%로 저장기간중 높은 값을 나타내었다. 효모 SCS 5균주는 숙성 2일째 0.25%에서 3일째 0.18%로 급격한 변화를 나타내어 젖산균에 비해 매우 낮았다.
균수의 변화는 도 11에 나타낸 바와 같으며 LLS 56균주가 초기 숙성 1일에서 2일째 약 109CFU/mL로 나타났으며 효모 SCS 5균주는 숙성 1일째 약 106CFU/mL, 숙성 4일째 103CFU/mL로 급격한 변화를 나타내었다.
실시예 4: 젖산균과 효모의 혼합발효에 의한 식혜 제조
상기 실시예 3의 방법과 동일하게 식혜를 제조한 후 당화과정 중에 상기 실시예 1과 2에서 분리한 젖산균 LAS 10, LBS 47 및 LLS 56균주를 효모 SCS 5와 혼합하여 접종한 후 식혜의 숙성 및 저장과정 중의 pH, 적정산도 및 균수의 변화를 조사하였다.
실험 결과, 도 12과 도 13에 나타낸 바와 같이 LAS 10과 SCS 5를 혼합접종한 경우 초기 숙성 3일에 pH 3.58과 적정산도 0.44%였으며 이는 LLS 56과 SCS 5균주를 혼합접종한 경우보다 pH는 낮게 나타난 것이며 산도는 높게 나타났다. 3개의 혼합접종구 모두 숙성 2일과 3일 사이에 pH와 적정산도는 변화가 높게 나타났으나 3일 이후 15일까지는 큰 변화가 나타나지 않았다. 이러한 결과는 식혜의 숙성 및 저장기간동안 젖산균이 생성하는 젖산이 효모가 분비하는 알코올과의 완충작용에 기인한 것이라고 사료된다.
균수의 변화는 도 14에 나타낸 바와 같이 모든 혼합접종구에서 약간의 차이는 있었으나 숙성 3일에 약 108CFU/mL로서 최대의 균수를 나타내었다. Vegarud [Vegarud,G., Castberg,H.B. and Langsrud,T.J. Dariy Sci., 66, 2294 -2298 (1983)]등에 의하면 발효채소물내에 존재하는 탄소원인 유당이 포도당으로 전환되었을 때 젖산균의 성장과 자가소화율이 증가된다고 하였다.
실시예 5: 젖산균간의 상호 혼합발효에 의한 식혜 제조
상기 실시예 3의 방법과 동일하게 식혜를 제조한 후 당화과정 중에 상기 실시예 1과 2에서 분리한 젖산균 LAS 10, LBS 47 및 LLS 56균주를 서로 혼합하여 접종한 후 식혜의 숙성 및 저장과정 중의 pH, 적정산도 및 균수의 변화를 조사하였다.
실험 결과, 도 15에 나타낸 바와 같이 LAS 10과 LLS 56균주를 혼합발효한 경우 식혜의 저장기간동안에 pH가 3.5로 큰 변화는 나타나지 않았다. LAS 10과 LBS 47균주의 혼합발효의 경우에도 숙성 4일까지 pH가 3.5로 유지되었다. 젖산균의 혼합발효에서 동속간이 이속간보다 낮은 pH 변화를 나타내었다. 산도의 변화는 도 16에 나타낸 바와 같았다.
균수의 변화는 도 17에 나타낸 바와 같이 LAS 10과 LBS 47 균주의 혼합발효시 저장초기에는 6.9×106CFU/mL로 높은 세포수를 나타내었으나 저장 5일에 8.3×101CFU/mL로 다른 시험구에 비하여 세포수가 가장 낮게 나타났다. LAS 10과 LLS 56의 혼합발효한 경우와 LBS 47과 LLS 56균주를 혼합발효한 경우 세포수가 초기 약 104CFU/mL에서 저장 5일에 102CFU/mL로 급격한 균수의 변화를 보이다가 그 후에는 큰 변화가 없었다.
젖산균간의 상호혼합 발효는 유제품에 있어서 요구르트 제조시 많이 이용되어왔는데 배양기간 동안 상호 성장촉진인자와 산생성을 높이기 위하여 사용되었다. 그러나 본 발명에 이용한 젖산균간의 상호성장관계는 나타나지 않았으며 Hull[Hull, R.R., Roberts, A.V. and Mayes, J.J.,J. Dairy Technol.,44, 164- 171(1984)]등에 의한 애시도필러스(acidophilus) 요구르트 제조에 있어서 3달간의 저장기간동안 균수변화와 비슷한 결과를 나타내었다. 저장중의 균수의 급격한 저하는 식혜내의 락토바실러스 속에 의한 과산화수소때문인 것으로 판단되어진다.
실시예 6: 저온살균, 초기 pH조절 및 재료의 균질화에 의한 발효식혜의 제조
상기 실시예 1과 2에서 분리한 젖산균 및 효모를 이용하여 상기 실시예 3과 동일한 조성비율로 식혜를 제조하였다. 이때, 80∼85℃에서 15분간 저온 살균처리하거나 또는 식혜를 제조한 후 젖산균의 초기성장 pH를 1 N NaOH를 사용하여 6.5로 조정하거나 또는 쌀을 제외한 식혜의 모든 재료를 균질화하여 식혜를 제조하고 상기 식혜를 각각 1일에서 15일간 숙성하고 저장하였을 때 pH, 적정산도 및 균수의 변화를 조사하였다.
실험 결과, 도 18에 나타낸 바와 같이 처리구 모두 저장 및 숙성 15일 동안 pH 3.5에서 4.0으로 뚜렷한 변화를 나타내지 않았다.
적정산도의 변화는 도 19에 나타낸 바와 같이 0.50∼0.78%로 저온열처리하여 제조한 식혜를 제외한 나머지는 모두 높게 나타났다. 초기 숙성일 2일에서 3일 사이에 쌀을 제외한 모든 재료를 균질처리한 시험구가 0.80%에서 0.84%로 높게 나타났다. 저온 살균처리한 구는 0.40%에서 0.42%로 가장 낮았다. 상기와 같은 결과는 열처리한 경우 식혜내 재료에 존재하는 젖산균과 효모가 사멸되었기 때문이라고 생각된다.
균수의 변화는 도 20에 나타낸 바와 같이 대조구의 경우 초기숙성 1∼2일째 106-7 CFU/mL로 균수의 급격한 감소를 나타내었으며 저장 15일까지 계속 감소하는 경향을 나타내었다. 상기와 같은 결과는 Teotiste와 Luh[Teotiste, W. and Luh, B.S.J.Food Sci., 46, 387-392(1981)] 등에 의한 20℃에서 3달간 저장한 후의 키위쥬스 pH가 3.5∼3.7로 나타난것과 비슷하였다.
실험예 4: 본 발명 발효식혜의 일반성분 분석
상기 실시예 3의 젖산균 및 효모를 단독발효하여 제조한 식혜, 상기 실시예 4의 젖산균과 효모를 혼합발효하여 제조한 식혜, 상기 실시예 5의 젖산균을 상호간 혼합발효하여 제조한 식혜 및 상기 실시예 6의 처리방법을 달리한 실험구의 숙성 3일째 일반성분을 조사하였다. 식혜의 수분, 조단백, 조지방, 조섬유, pH, 적정산도, 총당, 환원당 및 회분함량 분석은 AOAC[A.O.A.C.:Official methods analysis 14th ed. Association of official analytical chemists,washtion D.C.(1984)]에 준하여 측정하였으며 아미노태질소는 Formol적정법, 암모니아태 질소는 Folin법으로 측정하였다[Depatment of Food engineering Yonsei university: Experiment in food science and engineering, Tamgudang(1975)].
실험 결과, 표 7에 나타낸 바와 같이 조지질의 함량은 젖산균 단독발효한 경우가 효모의 단독발효한 경우와 젖산균과 효모를 혼합발효한 경우보다 조금 높게 나타났으며 효모 단독발효와 젖산균과 효모의 혼합발효한 경우 가장 낮게 나타났으며 젖산균 LBS 47과 효모 SCS 5를 혼합하여 발효한 경우 가장 낮게 나타났다. 조단백함량은 대조군보다 젖산균과 효모에 의한 단독 또는 혼합발효한 경우 대체로 높게 나타났다. pH와 적정산도의 변화는 저장 3일째 LAS 10과 LLS 56을 혼합발효한 경우 3.5로 가장 낮았으며, 적정산도는 대조군이 0.84로 높게 나타났고, 젖산균 단독발효시에는 pH가 4.5에서 5.2로 나타났고 혼합발효시에는 pH가 LAS 10과 LLS 56을 혼합한 경우 3.5로 가장 낮게 나타났다. 당도는 대조군이 11.2%인데 비하여 LBS 47과 SCS 5를 혼합발효한 경우 12.3%로 가장 높았다. 상기와 같은 결과는 Teotiste와 Luh에 의한 저장 3달 후 키위쥬스의 당도 13.9∼14.0과 수분 85.3∼85.5보다 당도는 낮았으며 수분함량은 높게 나타났다.
본 발명 발효식혜의 숙성 3일째 일반성분 함량
균주 수분 조지질 조단백 조섬유 NFE4) 회분 pH TA5) 당도6)
대조구 88.17 0.51 1.16 0.08 9.90 0.19 3.5 0.84 11.2
SS1) 89.90 0.47 1.17 0.07 9.11 0.18 4.2 0.47 11.6
SA2) 89.06 0.41 1.17 0.08 9.13 0.18 3.8 0.76 11.4
SH3) 89.07 0.42 1.16 0.07 9.10 0.19 3.9 0.89 11.7
LBS 89.07 0.45 1.17 0.08 9.64 0.18 5.2 0.28 12.2
LAS 89.06 0.41 1.18 0.08 9.31 0.18 5.1 0.30 11.9
LLS 89.09 0.42 1.18 0.08 9.12 0.18 4.5 0.42 11.8
SCS 88.00 0.38 1.19 0.08 9.20 0.18 5.1 0.17 10.4
LBS+SCS 88.07 0.31 1.20 0.09 9.31 0.19 3.8 0.43 12.3
LAS+SCS 88.04 0.33 1.19 0.07 9.24 0.19 3.7 0.45 11.9
LLS+SCS 88.03 0.39 1.18 0.08 9.42 0.18 4.4 0.39 11.7
LBS+LAS 89.08 0.41 1.19 0.08 9.14 0.19 3.5 0.35 11.2
LBS+LLS 89.06 0.48 1.19 0.07 9.27 0.19 4.2 0.31 11.3
LAS+LLS 89.07 0.49 1.17 0.07 9.31 0.20 3.5 0.26 11.6
〔주〕 1) SS: 80℃에서 15분간 저온살균처리한 실험구2) SA: 젖산균의 초기성장 pH를 6.5로 조정한 실험구3) SH: 쌀을 제외한 재료를 균질화한 실험구4) NFE:질소함량(Nitrogen free extraction)5) TA: 적정산도(Titratable acidity)6) 당도: °brix(Brix of sugar)
실험예 5: 본 발명 발효식혜의 관능검사
상기 실시예 3의 젖산균을 단독접종하여 제조한 식혜, 상기 실시예 4의 젖산균과 효모균주를 혼합접종하여 제조한 식혜, 상기 실시예 5의 젖산균을 상호 혼합접종하여 제조한 식혜 및 상기 실시예 6의 전처리 방법을 달리하여 제조한 식혜의 관능검사를 실시하였다. 관능검사는 영남대학교 식품가공학과 대학원생 및 본교 안동 지역 거주 대학생들 10명을 패널로 선정하여 본 발명 식혜를 4℃에서 30분간 두었다가 제공하여 맛, 향, 색태, 숙도 및 종합적 기호도를 조사하였다. 평가는 아주 나쁘다(1점), 나쁘다(2점), 보통이다(3점), 좋다(4점), 매우 좋다(5점)로 하였으며, 관능검사의 유의성은 아노바 테스트(ANOVA test)에 의하여 측정하였으며 데이터(data)간의 유의성은 던컨 다중검정 테스트(Duncan's multiple range test)에 의하였다.
실험 결과, 표 8에 나타낸 바와 같이 식혜 100mL에 젖산균 배양액 1.0 %(v/v) 접종하였을 때와 LBS 47과 SCS 5균주를 0.5%(v/v)접종한 SH, LAS 10균주를 1.0%(v/v)접종한 대조구, SS, SH, LBS+SCS, LLS+SCS, LBS+LAS, LBS+LLS, LAS+LLS군이 좋은 성적을 얻었으나 LBS+SCS군에 LBS 0.5%(v/v)와 SCS 0.5%(v/v)를 혼합하여 1.0%(v/v)를 접종했을 경우에 가장 좋은 성적을 얻었다.
맛의 차이를 분산분석을 통하여 검정한 결과로서 균주간의 접종량 첨가량과 젖산균과 효모에 의한 혼합발효에 각각의 현저한 유의성을 보였다. 따라서 당의 생성과 맛에 대한 차이는 현저한 유의성을 나타내고 있으며, 이상의 젖산균과 효모를 이용한 단독발효 또는 혼합발효에 의해 식혜를 제조한 후 관능검사를 실시한 결과 조단백질, 당도 및 산도가 잘 조화된 젖산균주 LBS와 효모 SCS 균주에 의한 발효가 가장 좋은 성적을 나타내었다.
젖산균과 효모균의 발효에 의한 본 발명 발효식혜의 관능검사
실험구/접종량 0.5% 1.0% 2.0%
대조구 4.1ab 3.3cd 2.5±
SS 2.3c 3.2cd 2.5±
SA 1.7c 3.4cd 1.5g
SH 4.2ab 3.3a 2.5±
LAS 4.2ab 4.3a 4.1a-d
LBS 4.4a 4.3a 4.1a-d
LLS 2.4c 3.4cd 3.6b-c
SCS 1.5c 2.7d 1.6g
LAS+LBS 4.3ab 3.3cd 4.3abc
LAS+LLS 4.2ab 3.5bc 3.3de±
LAS+SCS 3.5b 4.4a 4.4ab
LBS+LLS 4.2ab 4.2ab 3.5cde
LBS+SCS 4.0ab 4.5a 4.4a
LLS+SCS 3.4b 3.2cd 3.2e±
〔주〕컬럼내의 공통의 문자는 5%수준에서 유의적 차이가 없음.
실험예 6: 본 발명 젖산균과 효모균주를 혼합접종하여 제조한 발효식혜의 비휘발성 유기산 및 지방산함량 조사
상기 실험예 5에서 관능검사 결과를 우수한 기호도를 나타낸 LBS 47과 SCS 5를 혼합접종하여 제조한 식혜를 4℃에서 숙성 및 저장하면서 비휘발성 유기산 및 지방산함량을 조사하였다. 비휘발성 유기산의 분석은 Turkelsond와 Richard [Turke lson, V.T. and Richards, M.Anal. Chem.50, 1420-1429(1978)]등과 Buslig [Buslig, B.S., Wilson, C.W. and Sha, P.E.J. Agric. Food Chem., 30, 342- 345(1982)]등의 방법에 따라 일정량의 시료를 워링 블렌더(Waring blender)로 마쇄하고 10,000g에서 10분간 원심분리한 후 그 상징액 10mL를 Amberite IRA-900(Sigma)에 흡착한 다음 증류수로 수회 세척하여 당류를 제거하였다. 컬럼에 남아 있는 유기산은 6N 포름산(formic acid)로 용출하여 감압 농축기로 건조시킨 후 인산용액 5mL로 정용하고 0.45μ 멤브레인 필터(memberane filter)로 여과한 후 HPLC로 분석하였다.
실험 결과, 표 9에 나타낸 바와 같이 본 발명 식혜의 숙성 및 저장과정에서 젖산과 포름산의 함량증가가 관찰되었고, 특히 젖산의 증가는 다른 유기산보다 현저하였다. 이러한 양상으로 보아 젖산은 충분한 발효과정이 진행되면서 생성되는 반면 다른 유기산들은 충분히 발효가 일어나기 전에 이미 상당량 존재하고 있는 것으로 생각되며 산도변화의 경향이 젖산의 함량변화와 유사한 점으로 보아 식혜의 산도는 주로 젖산의 생성과 상관이 있을 것으로 생각된다. 상기와 같은 결과는 Yook[Yook, C. and Cho, S.C.Korean J. Food Sci. Technol., 28, 1119-1125 (1996)] 등과 Chen[Chen, K.H., Mcfeeters, R.F. and Fleming, H.P.J. Food Sci., 48, 967-972(1983)] 등이 보고한 김치 및 푸른콩 발효 중 유기산과 젖산의 함량변화에서도 비슷한 결과를 얻었다.
본 발명 발효식혜의 4℃ 숙성 및 저장과정 중 유기산 함량 변화
숙성 및 저장(일)
0 1 3 6
젖 산 0.49 6.25 18.10 19.37
수 산 1.24 1.18 1.04 0.99
숙 신 산 0.41 0.51 0.72 0.88
구 연 산 1.27 1.32 1.37 1.50
사 과 산 0.17 0.15 0.12 0.13
포 름 산 0.03 0.17 0.26 0.45
말로닉산 1.35 1.03 0.70 0.65
본 발명 발효식혜의 숙성 및 저장과정 중 지방산의 함량변화는 표 10에 나타낸 바와 같으며 리놀레산(linoleic acid), 팔미트산I(palmitic acid), 올레인산 (oleic acid)이 주요 지방산으로서 각각 43.3∼44.8%, 26.7∼31.5% 및 19.0∼24.5%를 차지하여 총지방산의 90% 이상을 차지하였다. 올레인산은 시간이 경과함에 따라서 점차감소하였고 팔미트산은 시간이 지남에 따라서 점차 증가하여 대조를 이루었으며 리놀레산을 포함한 다른 지방산들은 숙성 및 저장 중 함량의 변화가 거의 없었다.
본 발명 발효식혜의 숙성 및 저장과정 중 지방산 함량 변화
지방산함량(%) 일(Days)
0 1 2 3 4 6 8 10 15
12:0 미량 미량 미량 미량 미량 미량 미량 미량 미량
14:0 1.23 1.29 1.33 1.32 1.32 1.31 1.39 1.28 1.30
16:0 26.53 28.50 30.08 30.33 30.42 30.36 31.16 31.22 31.38
18:0 미량 미량 미량 미량 미량 미량 미량 미량 미량
18:1 24.38 23.36 22.02 21.74 21.47 21.29 18.87 19.47 19.50
18:2 44.67 44.06 43.59 43.15 43.81 43.87 44.15 44.38 4.16
18:3 2.19 2.09 1.98 2.46 2.00 2.14 2.80 2.65 2.66
실험예 7: 본 발명 젖산균과 효모균주를 혼합접종하여 제조한 발효식혜의 효소활성 조사
상기 실시예 4의 LBS 47과 SCS 5 균주를 혼합 발효하여 제조한 식혜를 4℃에서 숙성 및 저장하면서 산성 프로테아제(Protease), 전분액화 및 당화 효소력 그리고 리파아제의 활성을 측정하였다. 프로테아제 활성은 Anson [Anson, M.L. J. Physiol., 22, 79-85 (1938)] 및 Hagawara [Hagawara, S. Method of Enzymatic analysis V.2, 237-246, Tokyo, Japan (1956)]의 방법에 따라 0.6% 카제인을 기질로 30℃에서 10분간 반응조건으로 pH 3.0에서 산성 프로테아제 활성을 측정하였으며 프로테아제 역가단위는 효소액 1mL가 나타내는 660nm의 흡광도 값으로 표시하였다. 액화효소의 활성도[Department of Food engineering Yonsei university, Tamgudang (1975)]는 1% 가용성 전분액을 기질로 하여 pH 5.0, 40℃에서 30분간 반응시킨 뒤 I2로써 발색시켜 효소활성을 측정하였으며 효소단위는 효소액 1mL가 30분 동안 분해하는 1% 가용성 D_30^40 전분액의 mL수로서 그 작용력을 표시하였다. 당화효소의 활성도는 [Department of Food engineering Yonsei university, Tamgudang (1975)] 2.0% 가용성 전분액을 기질로 pH 4.4에서 30℃에서 10분간 트리부티린(tributyrin) 0.2mL에서 15분간 각각 반응시킨 다음 생성된 지방산을 0.05N NaOH로 페놀프탈렌(phenolphthalein)을 지식약으로 하여 적정함으로써 효소활성을 측정하였다. 효소단위는 매 분당 기질 중의 에스테르(ester)결합 1μmol을 가수분해하는 효소의 양을 1 unit로 하였다.
실험 결과, 식혜의 프로테아제의 주체인 산성 프로테아제는 3일째 1.92 unit/mL로서 식혜의 아미노태질소의 함량이 대체로 낮은 사실로 보아 본 발명에 사용한 식혜의 산성 프로테아제의 활성이 낮은 것으로 추측된다. 액화효소의 활성은 발효 2일째 12.94D_30^40 였으며, 3일째 13.79D_30^40로서 최고치를 나타내었으며 그 후부터 차차 감소하는 경향을 나타내었다. 당화효소의 활성은 3일째 3.56 unit/mL로서 최대의 활성을 나타내었으며 그 후 부터는 차차 감소하였다. 리파아제의 활성은 전 발효과정을 통하여 미약하였다. 본 발명 식혜의 아밀라아제 활성은 남[Nam, S.J. and Kim, K.O.Korean J. Food Sci. Technol., 21, 197-202(1989)] 등이 서울식혜에 있어서 당화력을 측정한 보고의 결과보다 월등히 높았다.
실험예 8: 본 발명 젖산균과 효모균주를 혼합접종하여 제조한 발효식혜의 질소화합물분석
상기 실시예 4의 LBS와 SCS 균주를 혼합발효하여 제조한 식혜의 아미노태 질소 및 암모니아태질소를 AOAC법에 따라 측정하였다.
실험 결과, 표 11에 나타낸 바와 같이 아미노태질소는 시간이 경과할수록 증가하였으며 15일째 42.68mg%였다. 암모니아태질소, 수용성 단백질과 염용성 단백질의 함량은 시간이 경과함에 따라 차차 감소하였다. 조단백질 함량의 변화는 숙성과정 4일째 1.27%로 그 함량이 가장 많았으나 그 후 차차 감소하였다.
본 발명 발효식혜의 질소화합물 분석
질소화합물 숙성 및 저장일수(Days)
0 1 2 3 4 6 8 10 15
조단백(%) 1.10 1.10 1.16 1.19 1.27 1.17 1.10 1.04 1.03
아미노태질소(mg%) 36.50 36.80 37.50 39.88 40.02 40.02 41.28 42.40 42.68
암모니아태질소(%) 0.21 0.20 0.19 0.05 0.05 0.04 0.04 0.04 0.02
수용성단백질(mg/mL) 1.83 1.43 1.24 1.08 1.01 0.97 0.95 0.94 0.93
염용성단백질(mg/mL) 3.11 3.02 2.86 2.71 2.59 2.52 2.45 2.40 2.32
실험예 9: 본 발명 젖산균과 효모균주를 혼합접종하여 제조한 발효식혜의 알코올 및 유리당 분석
상기 실시예 4의 LBS 47과 SCS 5균주를 혼합발효하여 제조한 식혜의 알코올과 유리당을 분석하였다. 알코올의 정량은 Bassette와 Ward 의 방법에 따라 실시하였으며 유리당 분석은 시료 200g을 5℃에서 30분간 균질기로 마쇄하고 여과한 후 여액 250mL를 취하여 Damon 등의 방법에 준하여 분석하였다. 즉, Sep·pak-C18과 Sep·pak silica를 이용하여 정제한 후 0.45μm 멤브레인 필터로 여과하고 여액 10μL를 Beckman gradient 액체 크로마토그래피(model 334, England)에 주입하여 분석하였다. 컬럼은 하이바 프리 팩키드 컬럼(Hibar pre-packed column) 250-4, 리크로솝(Lichrosorb) NH210μm 250mm×ID 4mm(E.Merk)를 사용하였다.
실험 결과, 알콜함량의 변화는 표 12에 나타낸 바와 같으며 에틸알코올(ethyl alcohol)을 포함하여 3종류가 동정되었다. 에틸알코올 함량은 숙성 및 저장이 진행됨에 따라 증가하였고 아밀알코올(amyl alcohol)의 함량은 차차 감소하였으며 메틸알코올(methyl alcohol)의 함량은 미량으로 나타났다. 상기와 같은 결과는 에틸알코올은 효모에 의하여 당이 분해되어 아세트알데히드(acetaldehyde)를 거쳐 생성되기도 하며 젖산균에 의하여 아세틸포스페이트(acetylphosphate)를 통하여 생성되기 때문이라 생각된다.
본 발명 발효식혜의 숙성 및 저장기간중의 알코올 함량 변화
숙성 및 저장일수(Days)
0 1 3 6
에틸알코올 2.02 4.90 10.69 11.28
아밀알코올 2.52 0.62 0.48 0.43
메틸알코올 미량 미량 미량 미량
유리당의 변화를 분석한 결과는 표 13에 나타낸 바와 같으며 포도당(Glucose)을 포함하여 6종류였으며 그외 말토트리오스(Maltotriose)I 이상의 분자량이 큰 물질로 추정되는 미확인 물질도 1종류가 검출되었다. 환원당의 함량은 맥아당(Maltose)이 가장 많았으며 점차 증가하여 4일째 가장 많았으며 그 후 점차 감소하였다.
본 발명 발효식혜의 유리당 변화
유리당(%) 숙성 및 저장 일수(Days)
0 1 2 3 4 6 8 10 15
과당 5.12 4.42 3.85 3.63 3.53 3.48 3.44 3.10 3.40
포도당 10.12 9.26 8.83 8.70 8.60 8.69 8.82 8.55 10.51
서당 0.65 1.08 0.72 0.28 0.24 0.18 0.14 0.13 0.13
맥아당 71.52 71.94 74.73 75.77 76.34 75.24 74.62 74.22 73.94
유당 3.45 3.01 2.27 1.67 1.01 0.08 0.86 1.10 1.32
말토트리오스 8.68 10.14 10.20 10.81 10.90 11.07 11.06 11.60 11.81
미확인 미량 미량 미량 미량 미량 미량 미량 미량 미량
실험예 10: 본 발명 젖산균과 효모균주를 혼합접종하여 제조한 발효식혜의 유리 아미노산 분석
상기 실시예 4의 LBS 47과 SCS 5균주를 혼합발효하여 제조한 식혜의 유리아미노산을 분석하였다. 유리아미노산의 추출은 허[Hawer,W.D., Ha,J.H., Seog,H.M., Nam,Y.J. and Shin,D.W, KoreanJ. Food Sci. Technol., 20, 511-516(1988)]등의 방법에 따라 시료 5mL에 탈이온 증류수 100mL를 가하고 마쇄한 후 여과하고 그 여액에 20% 트리클로로아세트산(TCA)를 15mL 가한 다음 하룻밤 냉장고에서 방치시켜 단백질을 침전제거 하였다. 상징액에 디에틸 에테르를 가하여 TCA, 지용성 방해물질 등을 제거한 후 수용액층을 40℃이하에서 감압 농축시키고 0.2M 나트륨 구연산 완충용액(sodium citrate buffer, pH 2.2)을 가하여 용해시켰다. 그리고 0.45μm 멤브레인 필터로 여과한 다음 아미노산 자동분석기(LKB 4151 Alpha plus amino acid analyzer, England)로 분석하였다.
실험 결과, 표 14에 나타낸 바와 같이 유리아미노산의 함량은 프롤린(proline), 아스파르트산(aspartic acid)이 100mL 당 각각 64.5, 25.8mg으로가장 많았으며 프롤린(proline) 함량은 3일째 114.0mg으로써 약 2배 가량 증가되었으며 그 후 시간이 지남에 따라 차차 감소하였다. 이것은 염용해성 단백질에 함유된 많은 프롤린이 단백질 분해효소 작용으로 분해되어 생성된 것으로 생각된다. 메티오닌은 시간이 경과함에 따라 점차 증가하였으나 리신(lysine)은 오히려 감소하였다. 트레오닌(threonine), 루신(leucine) 및 알라닌(alanine)의 함량은 거의 일정하였으며 그외 대부분의 유리아미노산들의 함량은 숙성 및 저장기간동안 대체로 증가하였다.
본 발명 발효식혜의 5℃ 숙성 및 저장기간 중 유리아미노산 함량의 변화
아미노산 숙성 및 저장일수(Days)
0 1 2 3 4 6 8 10 15
아스파르트산 25.8 26.1 26.3 27.2 27.7 27.9 28.1 28.2 28.3
트 레 오 닌 21.1 21.5 21.5 21.6 21.7 21.7 21.6 21.5 22.5
세 린 10.8 11.1 14.7 15.0 16.6 16.5 16.5 15.2 13.6
글 루 탐 산 10.7 10.0 10.9 10.9 11.0 11.2 11.3 11.6 11.8
프 롤 린 64.5 95.3 97.2 114.0 105.2 105.9 105.9 104.1 97.6
글 리 신 8.2 11.0 11.2 11.2 11.3 11.8 11.8 12.1 12.3
알 라 닌 14.0 15.1 15.3 15.5 15.6 17.5 17.5 15.2 14.9
시 스 틴 미량 미량 미량 미량 미량 미량 미량 미량 미량
발 린 10.9 11.0 12.0 11.1 11.3 11.5 11.5 10.3 10.0
메 티 오 닌 1.7 2.1 2.4 2.4 2.4 2.8 2.8 3.2 3.4
이 소 루 신 7.9 9.0 10.0 10.1 10.3 10.5 10.5 9.0 7.3
루 신 13.6 13.6 13.7 13.6 13.8 13.7 13.7 13.6 13.5
티 로 신 9.2 11.2 11.5 11.8 11.4 11.2 11.2 8.0 7.7
페닐 알라닌 12.0 14.4 13.6 14.7 15.0 15.0 15.0 15.1 14.9
히 스 티 딘 14.1 16.3 16.9 17.2 17.5 17.5 17.7 18.0 19.1
리 신 6.7 6.7 5.4 5.3 5.2 5.2 5.1 5.1 5.0
알 기 닌 13.9 16.2 19.1 24.2 20.3 20.5 20.2 20.2 12.7
실험예 11: 본 발명 젖산균과 효모균주를 혼합접종하여 제조한 발효식혜의 수용성 및 염용해성 단백질의 아미노산 분석
상기 실시예 4의 LBS 47과 SCS 5균주를 혼합발효하여 제조한 식혜를 균질기로 균질화한 다음 Wang[Wang,H.L., Swain, E.W., Hesseltine, C.W. and Gumbmann, M.R.J.Agric.Food Chem., 26, 309-314(1987)] 분류법에 따라 도 18에 나타낸 바와 같이 수용성 및 염용성 단백질을 분리하였다. 단백질 정량은 로우리[Lowry, C.H. and Rosebrongh, N.J.J.Biol.Chem., 193, 265-268(1951)] 등의 방법에 의하여 측정하였으며 단백질 함량은 소의 혈청 알부민(bovine serum albumin)을 사용한 표준곡선에 의하여 환산하였다. 수용성 및 염용해성 단백질의 아미노산 분석은 5mL 크기의 유리관에 20mg의 각각의 단백질을 넣은 후 6N HCl로 24시간 110℃에서 가수분해하여 실온에서 감압농축기로 염산을 완전히 제거한 다음 구연산 완충용액(pH 2.2) 8mL로 용해하여 아미노산 자동분석기로 분석하였다.
실험 결과, 표 15, 표 16에 나타낸 바와 같이 수용성 단백질의 아미노산 함량은 글루탐산(glutamic acid)과 아스파르트산(aspartic acid)이 각각 119.2, 105.4 mg/g으로 가장 많았으며 메티오닌(methionine)과 히스티딘(histidine)은 저장 및 숙성기간 중 거의 일정하였으며 대부분의 아미노산들의 함량은 숙성 및 저장기간 동안 차차 감소하는 경향을 나타내었다. 염용해성 단백질의 아미노산 함량은 글루탐산(glutamic acid), 아스파르트산(aspartic acid) 및 프롤린(proline)의 함량이 각각 142.7, 102.6 및 76.1 mg/g으로서 가장 많았다. 시스틴(cystine)과 메티오닌(methionine)의 함량이 낮은 것은 산분해 과정에 있어서 분해된 것으로 생각되며 메티오닌(methionine), 티로신(tyrosine) 및 페닐알라닌(phenylalanine)의 함량은 거의 일정하였으며 알기닌(arginine)은 시간이 경과함에 따라 점차 증가하였고 그외 대부분의 아미노산 함량은 숙성과정 중 감소하였다.
본 발명 발효식혜의 숙성 및 저장과정 중 수용성 단백질 아미노산 함량
아미노산 숙성 및 저장일수(Days)
0 1 2 3 4 6 8 10 15
아스파르트산 105.4 100.6 96.7 94.6 92.3 87.1 83.1 78.5 77.8
트 레 오 닌 54.3 51.0 48.2 46.1 44.3 44.3 39.9 37.7 37.2
세 린 46.0 46.0 45.2 44.9 44.1 41.2 34.7 33.9 30.5
글 루 탐 산 119.2 111.2 108.7 108.2 107.1 104.3 102.1 96.7 92.1
프 롤 린 83.7 84.8 89.2 93.8 99.5 97.3 89.9 82.3 70.7
글 리 신 54.6 49.5 47.2 45.1 44.7 43.9 43.4 41.0 39.2
알 라 닌 53.1 51.9 50.6 49.6 49.2 49.6 48.2 42.0 40.9
시 스 틴 미량 미량 미량 미량 미량 미량 미량 미량 미량
발 린 45.2 45.9 45.9 46.9 47.6 48.7 47.2 45.5 43.2
메 티 오 닌 2.5 2.6 2.4 2.4 2.5 2.5 2.4 2.4 2.8
이 소 루 신 50.2 49.8 46.1 44.3 43.4 42.0 38.4 34.3 32.9
루 신 73.6 72.6 69.2 68.7 67.5 66.9 61.3 55.4 54.9
티 로 신 36.7 31.0 21.9 17.3 14.9 13.1 15.5 21.3 26.6
페닐 알라닌 84.2 83.1 67.5 66.0 61.7 58.3 55.4 46.0 39.9
히 스 티 딘 47.8 48.0 48.1 48.0 48.2 48.2 48.0 47.9 47.8
리 신 52.2 52.6 52.9 53.0 56.0 59.0 48.7 47.7 47.0
알 기 닌 79.1 70.5 66.2 64.2 63.9 61.9 57.9 52.0 49.2
본 발명 발효식혜의 숙성 및 저장과정 중 염용해성 단백질 아미노산 함량
아미노산 숙성 및 저장일수(Days)
0 1 2 3 4 6 8 10 15
아스파르트산 102.6 100.4 98.5 93.1 93.2 91.9 91.7 91.4 91.3
트 레 오 닌 40.3 41.6 41.9 36.5 35.4 31.7 33.1 33.1 33.1
세 린 45.9 45.7 50.5 48.4 47.3 46.2 45.3 44.3 41.9
글 루 탐 산 142.7 136.9 134.9 117.9 109.9 105.2 104.8 104.7 104.5
프 롤 린 76.1 70.6 67.2 64.3 62.9 60.0 58.0 54.9 52.2
글 리 신 62.2 59.2 57.9 55.4 54.9 53.6 50.0 46.2 44.1
알 라 닌 57.2 55.9 54.3 52.0 50.2 47.9 47.6 41.1 41.8
시 스 틴 미량 미량 미량 미량 미량 미량 미량 미량 미량
발 린 69.7 66.0 58.4 53.3 52.2 51.9 51.5 51.0 50.7
메 티 오 닌 4.9 5.1 5.2 6.0 6.2 6.4 6.0 5.7 5.4
이 소 루 신 46.0 45.2 44.4 41.9 39.2 37.2 34.6 32.1 31.9
루 신 71.5 66.6 57.9 56.2 49.3 45.9 55.9 57.9 63.2
티 로 신 34.5 34.4 34.5 34.4 34.4 34.5 34.4 34.3 34.1
페닐 알라닌 42.3 42.2 42.2 42.3 42.2 42.2 42.3 42.2 42.2
히 스 티 딘 64.1 61.3 59.8 57.7 54.4 52.2 49.9 46.2 44.2
리 신 68.8 66.2 65.2 63.9 61.5 59.5 56.6 54.6 52.9
실험예 12: 본 발명 젖산균과 효모균주를 혼합접종하여 제조한 발효식혜의 향기성분의 동정 및 변화조사
상기 실시예 4에서 제조한 본 발명 발효식혜의 향기성분을 추출하고 동정하였다. 향기성분의 추출은 본 발명 발효식혜 1000g에 증류수 1000mL를 첨가하고 워링 브렌더로 10분간 마쇄한 후 분석용 시료를 제조하고 Weda등의 방법을 응용한 리켄슨-니커슨형의 계량형인 연속수증기증류추출(SDE:Simultameaus steam dist illation-extraction)장치를 사용하였다. 향기성분의 동정은 기체크로마토그래피 질량 분석기[gas chromatography-mass spectrometer(GC-MS)]로 분석하였으며 이때 분석조건으로 Ultra-2(HP-5, 50m×0.2mm×0.11μm) 컬럼이 장착된 Hewlett-packard 5988 MS 분석기기를 사용하였으며 주입온도는 300℃였고 검출기 온도는 320℃로 조절하였다. 운반가스(carrier gas)로는 헬륨을 사용하여 30mL/min을 속도로 흘려주었으며 이온 소스의 온도는 250℃, 이온화 전압은 70eV, 컬럼온도는 60℃(2℃/min)∼110℃(5℃/min)∼168℃(5min isothem, 10℃/min)∼300℃(10min)로 하였다. GC-MS의 전자충격 이온화법과 화학이온화법으로 분석된 질량스펙트럼은 Cornu와 Mass-sot, Stenhagen등 및 Jenning과 Shibamoto의 질량스펙트럼데이터에 준하여 동정하였다.
실험 결과, 도 21, 표 17a 및 17b에 나타낸 바와 같이 본 발명 발효식혜의 숙성과정 중 분리 동정한 향기성분은 사비넨 등을 포함하는 수산화탄소류 24종, 2-퓨란 카복실알데하이드, 2,4,6-옥타트리날을 포함하는 알데하이드류 6종, 파네솔, d-네디올 등을 포함하는 알코올류 9종, 테트라데카노산, α-벤젠 프로판산 등을 포함하는 케톤류 1종 기타 1종 등 총 47종을 확인동정하였다. 본 발명 발효식혜의 주된 향기성분은 캠펜, 사비넨, 1-(1,5-디메틸-4-헥실)-4-메틸벤젠, α-진기브렌, 파네센, 2,6-비스-(1,1-디메틸-에틸)-4-메틸-페놀, β-시스퀴페난드렌, 칼라인, 테트라데카노산, 헥사데카노산, 9,12-옥타데카노산 등 11종류 이었다. 본 발명 식혜의 숙성 및 저장에 있어서 생성된 향기성분은 2,4-운데카디날, 1H-인돌, 2,4-데카디날, 이소테피놀렌 및 D-네디올 5종류이었고 대조구(0day)에 비하여 사라진 향기 성분은 1,4-헤사디넨, 1-도데신, 2,3,4-트리메틸-1,3-페타놀 및 3,4-디플루로-4-메톡시-바이페닐 4종류이었다. 본 발명 식혜의 향기성분은 첨가된 향신료에 의하여 생성된 캠펜, α-진기브렌이 상당히 검출되었으며, 고춧가루에 의한 피라진 계통의 성분들이 검출되지 않은 것은 첨가량이 적었기 때문이라 생각된다.
본 발명 발효식혜로부터 분리동정된 향기성분
피크number 머무름시간(RT) 동정된 화합물 저장일수에 따른 피크면적
0 1 3 6
1 4.491 아세트산 2.68 2.71 3.24 3.28
2 6.523 2-퓨란 카보실알데히드 0.17 0.17 0.32 0.10
3 7.546 1,4-헥사디엔 0.43 - - -
4 9.014 L-리모넨 0.75 0.74 0.93 1.07
5 9.565 캠펜 2.21 1.85 2.20 3.33
6 10.890 4-이소티오시아나토-1-부텐 0.91 0.42 0.30 0.19
7 12.853 사비넨 3.04 2.57 4.37 4.69
8 15.699 α-테피노렌 0.17 0.14 0.14 0.11
9 16.652 리나롤 0.32 0.18 0.33 0.29
10 20.745 1-도데신 0.12 - - -
11 21.797 엔도-보넬 0.66 0.07 0.13 0.10
12 22.518 1-α-터피넬 0.79 0.54 0.44 0.43
13 23.798 2,3,4-트리메틸-3-펜타놀 0.46 - - -
14 240956 Z-시트랄 0.14 0.14 0.24 0.14
15 26.916 E-시트랄 0.39 0.31 0.43 0.49
16 27.559 알로시멘 0.20 0.14 0.14 0.23
17 27.821 2,4-운데카디날 - 0.06 0.13 0.13
18 28.006 1H-인돌 - 0.06 0.13 0.19
19 28.969 2,4-데카디날 - 0.21 0.51 0.34
20 29.947 이소터피노렌 - - 0.09 0.10
21 31.658 α-코파엔 0.26 0.21 0.34 0.32
22 31.958 D-네디돌 - 0.04 0.11 0.11
23 32.320 β-엘레멘 0.21 0.30 0.57 0.56
24 32.857 α-피넨 0.17 0.16 0.17 0.16
25 33.408 칼라렌 0.10 0.11 0.31 0.41
26 33.970 γ-엘레멘 0.24 0.50 1.21 0.96
27 36.187 1-(1,5-디메틸-4-헥실)-4메틸-벤젠 7.27 6.57 6.40 7.64
28 36.545 α-진기브렌 4.24 13.53 16.72 18.97
본 발명 발효식혜로부터 분리동정된 향기성분
피크number 머무름시간(RT) 동정된 화합물 저장일수에 따른 피크면적
0 1 3 6
29 37.070 파네센 5.66 5.21 6.86 11.11
30 37.229 2,6-비스(1,1-디메틸에틸)-4-메틸-페놀 0.91 2.30 2.19 0.20
31 37.666 β-세스퀴페란드렌 3.61 6.37 6.99 8.03
32 37.807 3,4-디플루로-4-메톡시-바이페닐 0.59 - - -
33 38.981 파네솔 0.66 0.54 0.43 0.56
34 40.315 2,4,6-옥타트리날 0.90 0.71 0.57 -
35 41.639 카랄렌 0.43 - 2.10 1.61
36 42.624 α-퀴주렌 1.93 0.61 0.76 0.74
37 43.410 2,4-비스-(1,1-디메틸에틸)-페놀 0.83 0.29 0.21 0.27
38 44.336 2-에틸-1,4-디메틸-벤젠 0.69 0.06 0.07 0.13
39 45.757 1,3-디페닐-1,3,5,5-테트라메틸-시클로트리시 0.28 2.17 0.44 0.50
40 46.862 테트라데카노산 7.49 3.39 2.80 2.81
41 47.155 6-메틸-2-메틸-비시클로(3,1,1)-헵탄 0.26 0.26 0.46 0.49
42 47.804 엔도-파네솔 2.14 0.04 0.34 0.49
43 48.732 α-벤젠 프로판산 0.81 0.63 0.57 0.44
44 49.390 1-메틸-4(1-메틸에틸)-벤젠 0.14 1.19 0.70 0.80
45 50.721 헥사데카노산 27.06 17.71 13.77 14.00
46 52.281 9,12-옥타데타노산 6.34 12.63 4.39 3.67
47 54.011 헥사네딕산 0.66 0.97 0.90 -
기타(알려지지 않음) 12.68 13.19 15.55 9.94
실시예 7: 안정제를 첨가한 발효식혜의 제조
상기 실시예 4의 LBS 47과 SCS 5균주를 혼합접종하여 제조한 식혜에 카라기난(Carrageenan)을 0.5%(w/w)를 첨가하였다.
실시예 8: 안정제를 첨가한 발효식혜의 제조
상기 실시예 4의 LBS 47과 SCS 5 균주를 혼합접종하여 제조한 식혜를 균질기로 균질화한 후 카라기난 0.05%(w/w)를 첨가하였다.
실험예 13: 안정제를 첨가한 발효식혜의 침전억제효과 조사
상기 실시예 4의 본 발명 식혜에 안정제를 종류별로 첨가하고 침전억제효과를 조사하였다. 안정제로는 CMC, 나트륨 알지네이트 및 카라기난 0∼1.0%(w/w)를 첨가하였으며 식혜를 균질화하 다음 안정제를 첨가한 경우와 균질화 하지 않은 식혜의 침전억제효과를 조사하였다. 조사방법은 상기 시료를 100mL 메스 실린더에 정확히 100mL씩 넣고 정지한 상태에서 시간마다 상징액의 분리상태를 관찰하여 표준구(안정제가 첨가되지 않은 식혜)와 비교하여 침전억제효과를 관찰하였다. 침전의 정도는 매스 실린더의 윗부분에 생기는 상징액의 mL 수로 나타내었다.
실험 결과, 표 18, 표 19 및 표 20에 나타낸 바와 같이 CMC 0.7%(w/w) 이상을 첨가한 경우 침전억제효과가 있었으나, 카라기난은 0.3%(w/w) 첨가시 침전억제효과를 나타내기 시작하여 0.5%(w/w)를 첨가하였을 때에는 완전히 침전을 억제하였다. 그러나 나트륨-알지네이트는 침전억제효과가 없었다.
본 발명 발효식혜에 CMC첨가에 의한 침전억제효과
시간(hr) 침전정도 (상징액의 mL)
CMC 첨가량(%)
0.00 0.05 0.10 0.20 0.30 0.50 0.70 1.00
0 0 0 0 0 0 0 0 0
1 90 90 90 90 90 90 35 25
3 90 90 90 90 90 90 37 25
6 90 90 90 90 90 90 39 26
12 90 90 90 90 90 90 52 26
24 90 90 90 90 90 90 55 26
48 90 90 90 90 90 90 55 27
72 90 90 90 90 90 90 55 27
본 발명 발효식혜에 나트륨-알지네이트 첨가에 의한 침전억제효과
시간(hr) 침전정도 (상징액의 mL)
나트륨-알지네이트 첨가량(%)
0.00 0.05 0.10 0.20 0.30 0.50 0.70 1.00
0 0 0 0 0 0 0 0 0
1 90 90 90 90 90 90 90 5
3 90 90 90 90 90 90 90 90
6 90 90 90 90 90 90 90 90
12 90 90 90 90 90 90 90 90
24 90 90 90 90 90 90 90 90
48 90 90 90 90 90 90 90 90
72 90 90 90 90 90 90 90 90
본 발명 발효식혜에 카라기난 첨가에 의한 침전억제효과
시간(hr) 침전정도 (상징액의 mL)
카라기난 첨가량(%)
0.00 0.05 0.10 0.20 0.30 0.50 0.70 1.00
0 0 0 0 0 0 0 0 0
1 90 90 90 83 36 0 0 0
3 90 90 90 90 37 0 0 0
6 90 90 90 90 37 0 0 0
12 90 90 90 90 39 0 0 0
24 90 90 90 90 39 0 0 0
48 90 90 90 90 40 0 0 0
72 90 90 90 90 40 0 0 0
식혜의 침전을 억제하기 위하여 균질화시킨 다음 안정제를 농도별로 첨가하여 침전억제효과를 조사한 결과, 표 21∼표 23에 나타낸 바와 같으며 카라기난 0.05%(w/w)를 첨가한 경우 억제효과가 나타나기 시작하여 0.3%(w/w)에서는 완전히 안정화되는 현상을 보였다.
균질화한 본 발명 발효식혜의 CMC첨가에 의한 침전억제효과
시간(hr) 침전정도 (상징액의 mL)
CMC 첨가량(%)
0.00 0.05 0.10 0.20 0.30 0.50 0.70 1.00
0 0 0 0 0 0 0 0 0
1 90 90 70 20 4 0 0 0
3 90 90 75 30 5 0 0 0
6 90 90 77 45 7 0 0 0
12 90 90 80 55 10 0 0 0
24 90 90 82 60 25 0 0 0
48 90 90 84 67 42 4 0 0
72 90 90 87 74 48 7 0 0
균질화한 본 발명 발효식혜의 나트륨-알지네이트 첨가에 의한 침전억제효과
시간(hr) 침전정도 (상징액의 mL)
나트륨-알지네이트 첨가량(%)
0.00 0.05 0.10 0.20 0.30 0.50 0.70 1.00
0 0 0 0 0 0 0 0 0
1 90 90 90 80 4 0 0 0
3 90 90 90 90 7 0 0 0
6 90 90 90 90 10 0 0 0
12 90 90 90 90 30 5 0 0
24 90 90 90 90 35 15 0 0
48 90 90 90 90 40 20 10 0
72 90 90 90 90 60 25 12 0
균질화한 본 발명 발효식혜의 카라기난 첨가에 의한 침전억제효과
시간(hr) 침전정도 (상징액의 mL)
카라기난 첨가량(%)
0.00 0.05 0.10 0.20 0.30 0.50 0.70 1.00
0 0 0 0 0 0 0 0 0
1 90 5 0 0 0 0 0 0
3 90 81 65 10 0 0 0 0
6 90 85 70 12 0 0 0 0
12 90 85 75 20 0 0 0 0
24 90 90 90 50 0 0 0 0
48 90 90 90 70 0 0 0 0
72 90 90 90 75 0 0 0 0
실험예 14: 안정제를 첨가한 발효식혜의 관능검사
본 발명 식혜에 CMC, 나트륨-알지네이트 및 카라기난을 0.00∼0.30%(w/w) 첨가하고 관능검사를 실시하였다. 관능검사는 영남대학교 식품가공학과 재학생 가운데 식혜맛을 잘 아는 안동지역 출신 10명과 안동식혜 맛을 모르는 대구지역 출신 10명과 식혜 맛을 잘 모르는 대구지역 출신 10명을 선발하여 실시하였다. 관능검사방법은 상기 실험예 5와 동일한 방법을 사용하였으며 실험설계는 완전임의 배치법으로 4회 반복 실시하였고, 그 결과를 이원배치 분산분석 및 최소 유의차 검정을 실시하였다.
실험 결과, 표 24에 나타낸 바와 같으며 안정제를 첨가하여 제조한 식혜의 경우 두 지역 관능검사 요원들 간의 맛에 현저한 통계적 유의차가 있었으며(t=6.07, p<0.000) 안동지역 관능검사 요원들이 대구에 비해 더 높게 평가하였다. CMC, 나트륨-알지네이트 및 카라기난의 3처리구 간에는 통계적 유의차가 인정되지 않았으며 (F=0.4124, p=0.6623) 안정제의 첨가량에 따른 결과는 현저한 통계적 유의성을 보이고 있어(F=369.9187, p=0.000) 첨가량이 높아질수록 점수가 떨어졌다.
안정제를 첨가한 본 발명 발효식혜의 관능평가
검사요원1) 안정제농도(%) CMC 나트륨-알지네이트 카라기난
안동 0.00 7.82) 7.8 7.8
0.03 8.1 8.2 8.0
0.05 8.2 8.4 8.8
0.10 5.7 5.5 5.7
0.15 5.4 5.5 5.3
0.20 5.3 4.7 5.5
0.30 4.3 3.9 4.6
대구 0.00 7.1 7.1 7.1
0.03 7.2 7.3 7.5
0.05 7.6 7.8 8.0
0.10 6.0 6.0 5.4
0.15 4.3 4.3 4.2
0.20 4.1 3.1 4.1
0.30 3.5 3.1 4.1
〔주〕1)관능검사요원들은 식혜맛에 익숙한 안동지역 사람 10명과 식혜맛에익숙하지 않은 대구지역 사람 10명으로 구성되었다.2)9: 극도로 좋다, 8:매우 좋다, 7: 좋다, 6: 조금좋다, 5:보통이다,4:조금나쁘다, 3:나쁘다, 2: 매우 나쁘다, 1: 극도로 나쁘다.
상기와 같은 3가지 독립변수와 맛이란 종속변수간의 관계를 종합하면 독립변수가 종속변수인 맛에 미치는 주효과는 통계적 유의성이(F=852.055, p=0.000) 없는 것으로 나타났으며(F=1.553, p=0.213) 안정제의 첨가 정도와 지역, 안정제의 첨가농도와 처리간의 상호작용 효과는 통계적 유의성을 보이고 있다(F=14.314, p=0.000; F=11.113, p=0.000).
또한, 표 25에 나타낸 바와 같이 식혜의 침전억제 효과를 높이기 위하여 균질화한 후 안정제를 첨가한 경우 지역간에 유의차가 있었으며(t=1.66, p=0.00), 안정제 처리구간의 차이는 없는 것으로 나타났다(F=0.3569, p=0.7001). 안정제의 농도에 따른 차이에서 유의성이 인정되어(F=231.1206, p=0.000) 침전억제를 위하여 첨가농도를 낮추는 것이 맛을 유지하는데 중요한 점으로 평가되었다.
균질화한 다음 안정제를 첨가한 본 발명 발효식혜의 관능검사
검사요원1) 안정제농도(%) CMC 나트륨-알지네이트 카라기난
안동 0.00 6.32) 6.3 6.3
0.03 6.3 6.3 6.5
0.05 6.4 6.4 6.8
0.10 5.4 5.7 5.3
0.15 4.8 5.0 4.9
0.20 4.6 4.4 4.8
0.30 4.6 4.0 4.3
대구 0.00 6.1 6.1 6.1
0.03 6.1 6.4 6.2
0.05 6.8 7.0 7.2
0.10 5.4 5.6 5.8
0.15 4.8 4.5 4.6
0.20 4.4 4.0 4.4
0.30 3.7 3.0 3.0
〔주〕1)관능검사요원들은 식혜맛에 익숙한 안동지역 사람 10명과 식혜맛에익숙하지 않은 대구지역 사람 10명으로 구성되었다.2)9: 극도로 좋다, 8:매우 좋다, 7: 좋다, 6: 조금 좋다, 5:보통이다,4:조금 나쁘다, 3:나쁘다, 2: 매우 나쁘다, 1: 극도로 나쁘다.
실험예 15: 안정제를 첨가한 발효식혜의 생균수 및 산생성 균수의 조사
상기 실시예 8에서 제조한 안정제를 첨가한 본 발명 식혜를 4℃에서 저장하면서 생균수 및 산생성균수의 변화를 조사하였다. 상기 시료를 100mL씩 살균된 폴리에틸렌 필름 및 테트라 팩에 넣어 4℃에서 20일간 보존하면서 생균수와 산생성균수를 측정하였다. 생균수는 표준한천배지를 이용한 퓨어플레이트(pureplate) 방법으로 37℃에서 48시간 배양하여 측정하였으며 산생성균수의 측정은 브로모크레졸 퍼플(BCP)배지로 생균수 측정법과 동일하게 하였다.
실험 결과, 표 26에 나타낸 바와 같이 생균수 및 산생성균은 발효 3일째 각각 29.90×107, 22.92×107으로 최고치를 나타냈으며 저장 8일째 완만히 감소하였다. 상기와 같은 현상은 발효 후 저장과정 중 생성된 산에 의하여 그 생육이 저해받은 것으로 생각된다. 우리나라 식품위생법에 의하면 젖산균 음료의 경우 젖산균수는 1mL당 106이상으로 규정하고 있는데 본 발명 식혜는 20일이 경과하여도 젖산균의 수가 1.20×106이상 유지하는 좋은 결과를 보였다.
본 발명 안정제를 첨가한 발효식혜의 생균수 및 산생성균수의 변화
발효시간(days)
0 1 2 3 4 6 8 10 15 20
생균수 1.00 3.29 26.90 29.90 15.80 3.72 1.00 0.18 0.15 0.14
산생성균수 0.20 2.19 20.90 22.92 14.10 3.02 0.20 0.16 0.15 0.12
실험예 16: 안정제를 첨가한 발효식혜의 점도변화 조사
본 발명 식혜에 CMC, 나트륨-알지네이트 및 카라기난을 0.05%(w/w) 첨가하고 점도의 변화를 조사하였다. 점도는 Ostwald형 점도계를 사용하고 0.05%의 안정제를 첨가한 구와 첨가하지 않은 표준구를 비교하여 측정하였다.
실험 결과, 표 27와 표 28에 나타낸 바와 같이 CMC, 나트륨-알지네이트 및 카라기난을 첨가하여 3일 발효시 최고값을 나타내었으며 그 후 점차 감소하였고 균질화시키지 않았던 것보다 안정성이 낮았다.
안정제 0.05%를 첨가한 본 발명 발효식혜의 점도 변화
발효일(4℃)
0 1 2 3 4 6 8 10 15 20
대조구 1.07 1.09 1.10 1.14 1.12 1.09 1.06 1.04 1.03 1.03
CMC 1.29 1.33 1.38 1.40 1.38 1.33 1.33 1.31 1.26 1.23
나트륨-알지네이트 1.24 1.34 1.35 1.38 1.27 1.27 1.26 1.22 1.21 1.20
카라기난 1.28 1.33 1.43 1.44 1.39 1.26 1.27 1.23 1.23 1.22
균질화한 후 안정제 0.05%를 첨가한 본 발명 발효식혜의 점도 변화
발효일(4℃)
0 1 2 3 4 6 8 10 15 20
대조구 1.05 1.07 1.10 1.12 1.13 1.14 1.13 1.09 1.05 1.03
CMC 1.27 1.32 1.31 1.30 1.29 1.29 1.29 1.29 1.27 1.26
나트륨-알지네이트 1.20 1.33 1.32 1.35 1.34 1.34 1.38 1.33 1.30 1.30
카라기난 1.26 1.31 1.34 1.41 1.37 1.27 1.27 1.27 1.27 1.26
실험예 17: 본 발명 안정제를 첨가한 발효식혜의 기호도변화 조사
본 발명 발효식혜에 안정제를 0.05% 첨가하여 숙성시킨 후 폴리에틸렌 필름으로 포장하여 안동지역 출신의 관능검사요원으로 하여금 저장기간별로 종합적으로 기호도변화를 조사하였다.
실험 결과, 표 29에 나타낸 바와 같이 본 발명 발효식혜의 저장기간과 맛에 대한 차이는 현저한 유의성을 보이고 있으며(F=68.592, p=0.000), 안정제별로 맛의 차이 또한 현저한 통계적 유의성을 나타냈었다(F=14.168, p=0.000). 또한 본 발명 식혜의 안정제 종류와 저장기간에 따른 유의성은 있으나 안정제별 상호작용 효과가 맛에 미치는 영향은 무시해도 좋다는 결론을 얻었다(F=0.295, p=0.990). 이상의 결과를 종합하여 본 발명 발효식혜를 가공식품으로 유통시킬 때 발효 후 7일까지는 보존성과 식미에 문제가 되지 않는다고 판단된다.
본 발명 안정제를 첨가한 발효식혜의 기호도변화 조사
발효일수
3 4 6 8 10 15 20
대조구 7.8 8.0 7.8 7.8 7.6 7.0 6.2
CMC 8.2 8.2 8.1 8.0 7.8 7.3 6.5
나트륨-알지네이트 8.4 8.5 8.5 8.4 8.2 7.3 6.3
카라기난 8.8 8.6 8.6 8.4 8.2 7.6 6.7
이상, 상기 실시예와 실험예를 통하여 설명한 바와 같이 본 발명 젖산균 및 효모를 이용한 발효식혜 및 그 제조방법은 산생성능, CO2가스 생성능 및 성장이 우수한 젖산균과 효모균주를 분리하고 식혜를 당화한 후 단독접종 또는 혼합접종하여 발효한 다음 안정제를 첨가하여 제조한 본 발명 발효식혜는 기호성이 향상되고 보존성이 우수한 효과가 있으며 기호성이 향상되는 뛰어난 효과가 있으므로 식품가공산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (2)

  1. (a) 증자된 멥쌀 또는 찹쌀 1∼2kg, 무 1∼3kg, 생강 0.1∼0.5kg 및 고춧가루 0.05∼0.1kg와 맥아추출물을 혼합하여 30∼50℃에서 2∼6시간 당화하는 단계;
    (b) 상기 (a)단계의 당화한 식혜 원료에 젖산균 또는 효모균주 0.1∼2.0%(v/v)를 단독으로 접종하거나 또는 혼합하여 접종하고 10∼30℃에서 10∼24시간 발효하는 단계;
    (c) 상기 (b)단계의 발효한 식혜를 균질화한 다음 안정제를 0.01∼3.0%(w/w)첨가하고 0∼10℃에서 숙성 및 저장하는 단계로 결합됨을 특징으로 하는 젖산균과 효모균주를 이용한 발효식혜의 제조방법.
  2. 제 1항 기재의 방법에 의해 제조되고 매운맛, 단맛 및 산미가 조화된 붉은 색을 띤 발효식혜.
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