KR20030002400A - 음식물찌꺼기의 습식발효를 위한 양돈 사료화 능력을보유한 신규한 균주 바실러스 세레우스 엔케이 204 - Google Patents

음식물찌꺼기의 습식발효를 위한 양돈 사료화 능력을보유한 신규한 균주 바실러스 세레우스 엔케이 204 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생활 폐기물 중 폐유기성자원인 음식물찌꺼기의 습식발효에 의한 양돈 사료화를 위한 신규한 미생물제제에 관한 것으로서, 균체성장이 빠르고 단백질 분해 효소활성 및 길항성이 뛰어난 신규한 미생물로서 바실러스 세레우스 엔케이 204(KCTC 18084P) 새로운 신균주를 고체배양하고 이를 이용하여 음식물찌꺼기를 습식발효방식을 통하여 사료화 함으로써 양돈사료로 이용할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

Description

음식물찌꺼기의 습식발효를 위한 양돈 사료화 능력을 보유한 신규한 균주 바실러스 세레우스 엔케이 204 {Novel Bacillus cereus NK 204 strain producing fermented swine feed utilizing food waste}
본 발명은 생활 폐기물 중 폐유기성자원인 음식물찌꺼기의 습식발효 사료화를 위한 미생물제제에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 균체 성장이 빠르고 단백질 분해 효소활성 및 길항능이 뛰어난 신규한 미생물로서의 바실러스 세레우스 엔케이 204 (KCTC 18084P) 균제제에 관한 것이다. 본 발명의 신규한 균주를 이용하여 음식물찌꺼기의 습식발효에 의하여 양돈사료를 제조하여 이용할 수 있다.
본 발명자들은 탈지강을 이용하여 본 발명의 신규한 균주를 고체배양하고 이를 이용하여 음식물찌꺼기를 습식발효하여 양돈 사료화를 성공함으로써 본 발명을 완성하였다.
음식물찌꺼기의 1일 배출량은 12,000~20,000톤에 이르며 이중 극히 일부가 사료화 또는 퇴비화하여 재활용되고 있으나 대부분이 매립 또는 소각방식 등에 의존하고 있어 이로 인한 환경오염문제는 실로 심각한 사회문제로 대두되고 있다.음식물찌꺼기의 가축사료로의 재활용은 원료의 96%를 수입에 의존하고 있는 배합사료의 수입대체에 의한 외화절약과 함께 축산업의 생산비 절감과 환경오염문제 등을 동시에 해결할 수 있는 중요한 수단이다.
우리나라의 경우 현재까지 남은 음식물찌꺼기를 사료로서 재활용함에 있어 체계적인 기술개발과 현장적용에 의한 효과 및 효능이 검증된 우수한 기술이 부재하여 실용화에 많은 어려움을 겪고 있다. 따라서 음식물찌꺼기를 사료로서의 가치성과 안정성이 확보된 기술에 의한 수입대체 효과의 증진과 더불어 환경문제 해결에 많은 노력을 하고 있으나 그 수준이 미흡하다(특허 제46453호 등 참조). 일본의 경우에는 폐유기성자원으로서 음식물찌꺼기의 재활용은 외식산업을 중심으로 감량 기술을 개발하고 있으며 최종목표는 감량화된 폐유기성자원의 후숙에 의한 퇴비화에 있다. 한편, 미국 및 유럽의 경우는 폐유기성자원의 재활용은 혐기성 발효에 의한 에너지 생산과 호기성 발효에 의한 퇴비생산으로 이용되고 있고 사료로의 이용은 극히 제한된 범위 내에서만 법률적으로 허용하고 있는 것이 현 실정이다.
따라서, 본 발명의 목적은 음식물찌꺼기의 양돈사료화에 적합한 신규한 균주를 제공하는데 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기균주를 이용한 미생물제제 및 양돈사료를 제공하는데 있다.
본 발명의 상기 목적은 음식물찌꺼기와 같은 폐유기성자원을 양돈 사료로서 이용하기 위하여 신규한 미생물균주를 선발하고 상기 미생물에 의한 습식발효를 통하여 사료화 함으로써 달성하였다. 음식물찌꺼기의 습식발효 사료화에는 음식물 중의 탄수화물, 조단백, 조지방, 조섬유 등 고분자 물질을 저분자로 전환시켜 가축의 소화흡수율을 향상시키고, 이때 작용하는 미생물의 생육과정에서 합성되는 이차 대사산물 및 미생물 균체 등이 가축의 면역력 증강 및 영양원으로 이용됨으로서 사료로서의 가치를 극대화 할 수 있다. 따라서 가축 사료로서의 가치성은 발효에 관여하는 미생물의 종류 및 특성에 따라 영향하는 바 크기 때문에 사료화 목적에 적절한 미생물만을 선별하여야 한다.
이하, 본 발명의 구체적인 구성 및 작용을 설명한다.
본 발명은 신균주 바실러스 세레우스 엔케이 204(KCTC 18084P)와 이를 포함하는 미생물제제로 구성된다.
본 발명은 음식물찌꺼기의 사료화를 위하여 효소활성과 길항능이 우수하고 증식속도가 빠른 미생물 균주를 분리하여 버어지스 매뉴얼(Bergy's Manual of Determinative Bacteriology)과 의약 박테리아의 동정 매뉴얼(Manual for the Identification of Medical Bacteria)에 따라 본발명 균주의 형태학적, 생리학적 및 생화학적 특성을 조사하여 균주 동정을 실시하였고, 균체 지방산 분석은 대수증식기의 습균체 40 - 50 mg에서 지방산을 추출하여 MIS(Microbial Identification System, 휴렛-팩커드 5890A)에 의해 가스액체크로마토그래피를 사용하여 분석하였다.
그 결과 다음 [표 1]에 나타낸 바와 같이 본 발명의 신규한 균주는 고체배지에서 원형의 집락(colony)를 형성하며, 집락 색깔은 미색을 띄었다. 본 발명 미생물 균주는 그램 음성균으로 생육에 적합한 pH 범위는 6.0 - 10.0이었고, 생육 온도 범위는 10 - 40℃이며, 호기성 세균으로 운동성과 포자형성능을 지니는 간균으로 크기는 직경이 0.9∼1.2㎛, 길이는 3.0∼5.0㎛로 확인되었다. 카탈라제 생성은 양성이며, 옥시다제 생성은 음성이고, citrate를 이용하였다. 젤라틴 액화, 전분, 카제인과 우레아 가수분해 및 nitrate 환원능이 있었다. 탄수화물 (carbohydrate)로 말토즈와 글루코즈로부터 호기적조건에서 산을 생성하였다.
이상의 결과로부터 본 발명 미생물 균주는 바실러스 세레우스로 추정되었지만 더 정확한 균주 동정을 위하여 균체 지방산 조성을 분석한 결과 주성분은 C 15:0 안테이소와 C 15:0 이소 및 C 17:0 이소로 확인되어 상기한 형태학적, 배양학적 및 생리학적 특성에 기초하여 [표 1] 본 균주가 바실러스 세레우스와 가장 유사한 균체 지방산을 나타내므로 본 발명에서 분리된 미생물 균주를 바실러스 세레우스 엔케이 204(Bicillus cereus NK 204)라 명명하고 미생물 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 유전자은행에 2001년 3월 16일 기탁하고 수탁번호 KCTC 18084P를 부여받았다.
본 발명 신규한 미생물균주(KCTC 18084P)의 특성
인 자 특 성
형태학적 특성그람염색모양크기(㎛)운동성포자형성 +간균0.9∼1.2 ×3.0∼5.0++
배양학적 특성호기적 배양혐기적 배양생육온도 5℃10℃30℃40℃5% 염화나트륨 ++-+++d
생리학적 특성카탈라제 생산옥시다제 생산글루코즈로부터 산 생성탄수화물(O/FI/-)탄수화물로부터 산 생성말토즈아라비노즈자이로즈시트레이트 이용니트레이트 환원젤라틴 액화카제인 가수분해전분 가수분해우레아가수분해지방산 주성분 +-+F+dd++++++15:0 안테이소(34%)15:0 이소(29%), 17:0 이소(14%)
¹산화-발효시험
d : 종에 따라 다른 반응을 나타냄
본 발명의 신규한 미생물 균주 바실러스 세레우스 엔케이 204(KCTC 18084P)의 배양은 LB, NB의 액체 및 고체배지를 이용하였으며, 중온(28℃)과 고온(50℃)에서 생육이 왕성하고, 군락(colony)형성능이 우수하다. 실험결과, [표 2]에 나타낸 바와 같이 대장균과 살모넬라 및 바실러스에 대하여 높은 길항능이 있는 것으로 나타났다.
본 발명 미생물균주의 길항능 조사 결과
길 항 균 주 대장균 살모넬라 스타필로코커스 캔디다 바실러스
길 항 능 ++ +++ - - ++
한편, 본 발명 미생물균주를 LB, NB의 액체 및 고체배지를 이용하여 배양한 결과, 중온(28℃)과 고온(50℃)에서 생육이 왕성하고, 군락(colony)형성능이 우수하며 실험결과, [표 3]에 나타낸 바와 같이 프로테아제 (protease)의 효소활성이 높은 것으로 나타났다.
본 발명 미생물 균주의 효소 활성
효 소 아밀라제 프로테아제 셀룰라제 리파제
활 성 - +++ - -
본 발명의 신규한 미생물 균주 바실러스 세레우스 엔케이 204(KCTC 18084P)를 이용하여 본 발명 미생물제제 및 양돈사료의 제조방법은 다음 실시예를 통하여 구체적으로 설명하는 바, 본 발명이 이들 실시예에 한정하는 것이 아니다. 어떠한 단계의 변경, 수치의 한정에도 본 발명의 권리범위가 미치는 것은 물론이다.
[실시예 1] 음식물찌꺼기의 습식발효를 통한 양돈사료화용 미생물제제 제조
본 발명의 신균주 바실러스 세레우스 엔케이 204(KCTC 18084P)는 고온에서도 생육이 왕성하고, 프로테아제 효소활성이 높으며 대장균에 길항능이 높아 경구독성 실험결과에서도 무해한 것으로 나타났으므로 규조토, 제올라이트, 탈지강 중 어느하나의 담체 또는 복합담체에 흡착하여 미생물제제를 제조하였다.
본 발명 미생물제제의 제조방법은 종균배양액을 일차 액체배지에 접종하여 30℃에서 24시간동안 배양한 후 분쇄된 탈지강을 생육기질 및 보존담체로 이용하여 40℃에서 48시간동안 이차 고체배양을 통하여 미생물제제를 제조하였다. 고체배양시에는 글루코즈 5%, 효모추출물 1%, 일인산칼륨 0.14%, 이인산칼륨 0.06%를 미생물의 생육에 필수성분인 탄소원, 질소원 및 인성분의 공급과 효소의 보조인자로 작용할 수 있게 첨가하였다. 본 실시예에서 분쇄된 탈지강을 배지로 하여 40℃에서 48시간동안 배양 후 총균수를 조사하였더니 1.8 ×1010CFU/g 이었으며 본 발명 균주로 확인되었다.
[실시예 2] 본 발명 미생물제제의 급성 경구독성 조사
상기 실시예 1의 방법에 의하여 제조된 미생물제제에 대한 급성 경구독성 실험을 실시하여 독성 유무를 확인하였다. 시험물질로는 미생물제제 원액(109cfu/ml)을 사용하였으며 사용직전까지 시험물질은 냉장보관하였다. 실험동물은 한국생명공학연구원에서 유지 관리되고 있는 특정병원체부재 (Specific Pathogens Free; 'SPF'로 약칭)상태의 5-6주령 암컷 ICR 마우스를 사용하였다. 실험동물은 온도 22±1℃, 습도55±5%, 조명12L/12D의 동물실내에서 유지하였다. 마우스는 실험에 사용하기 전에 1주일전에 순화시켰다. 실험동물용 사료 [(주)제일제당, 마우스 및 랫드용] 및 음수는 멸균한 후 공급하였으며 자유 섭취시켰다. 투여 방법은 먼저 그룹당 마우스를 7마리로 나눈 뒤 사료부산물 원액(109cfu/㎖)을 0.2㎖/20g 체중으로 경구 투여하였다. 시료는 1회 경구 투여하였으며 투여 후 10일 동안은 마우스 몸무게 변화 및 사망여부를 관찰하였다. 투여당일은 투여후 1시간, 4시간, 8시간 12시간 뒤에 투여 익일부터 10일째까지는 매일 오전, 오후 1회이상씩 일반 증상의 변화 및 사망동물의 유무를 관찰하였다. 또한 투여 10일째에 동물을 치사시켜 해부한 후 육안적으로 내부 장기를 검사하였다. 또한 투여 당일부터 2일 간격으로 체중의 변화를 측정하여 부산물에 의한 동물의 체중변화를 관찰하였다.
본 발명 미생물제제의 급성독성 조사결과를 [표 4]에 나타냈다. 본 시료에 대한 급성 경구독성 실험결과 시료 원액을 경구 투여한 후 10일간 치사동물은 관찰되지 않았다. 그리고 부검시 특별한 병변 육안 소견이 없었으며, 투여 익일부터 10일간 어떠한 체중의 감소 없이 정상적인 체중의 증가가 관찰되었다[표 5]. 본 발명 시료제품은 상기의 용량으로 경구 투여시 독성이 관찰되지 않았다.
본 발명 미생물제제의 급성 경구독성 조사결과
시 료 성별 마리수 치사동물의 수 (일) 비고
0 (시간) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 4 8 12
생리식염수 암놈 7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
미생물제제 암놈 7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
본 발명 제품시료의 증체 효과
시 료 성 별 마리수 평 균 체 중(g) 비고
0 2 4 6 8 10
생리식염수 암놈 7 29.9±1.2 30.1±1.8 30.2±2.0 30.8±2.4 31.0±2.6 31.6±3.3
미생물제제 암놈 7 30.4±1.6 30.6±1.4 30.7±1.4 30.8±1.7 31.1±1.2 31.7±1.2
[실시예 3] 본 발명 습식발효사료의 기호성 개선(식이성 향상 및 증체율 증가)
본 실시예에서는 상기 실시예 1에서 제조한 본 발명 미생물제제 시료를 이용하여 기호성 개선효과 실험을 실시하였다. 실험 실시는 발효공정 단계별로 효소활성 및 유기물의 변화 등을 조사하였다.
하기 [표 6] 은 각각의 시료에 대하여 각각의 기질이 함유된 고체평판배지를이용하여 아밀라제(amylase), 프로테아제(protease), 셀룰라제(cellulase) 및 리파제(lipase) 효소의 활성을 투명환의 크기로 측정한 결과이다. 본 발명 미생물제제를 사용하여 음식물찌꺼기의 양돈사료화를 수행하고 있는 두 군데 농장(경기도 이천 및 화성)에서 각각 발효공정 단계별 시료를 채취하여 효소활성을 측정한 결과 대부분의 시료에서 아밀라제와 프로테아제의 활성이 나타났다. 그러나 각 시료를 1일 동안 액체배지에서 배양한 후 효소활성을 측정한 결과 리파제와 셀룰라제의 활성도 나타내는 것으로 보아 본 발명 미생물제제에 사용된 균주는 발효과정 중에 활성을 크게 나타내는 것으로 확인되었다.
발효공정 단계별 효소 활성
시 료 아밀라제 프로테아제 셀룰라제 리파제
Y (음식물찌꺼기) 7 mm 4 mm - -
Y (저장조) 10 mm 6 mm - -
Y (발효조) 10 mm - - -
Y (숙성조 ) - - - -
W (음식물찌꺼기) 8 mm 8 mm - -
W (저장조) 10 mm 8 mm - -
W (발효조) - 8 mm - 6 mm
W (숙성조) 6 mm 10 mm - -
[보기] Y; 이천농장시료, W; 화성농장시료
하기 [표 7]은 본 발명 미생물제제를 이용하여 음식물찌꺼기의 발효전과 발효후의 유기물의 변화를 조사한 결과이다. 실험결과, 이천시료와 화성시료 모두에서 발효 후 수분함량은 각각 77%와 73% 정도로 감소하였고, 염분의 양은 각각0.41%와 0.47%로 감소하였다. 일반적으로 한국의 음식물찌꺼기 특성상 염분의 양이 많아 미생물을 이용한 발효는 문제가 발생할 것으로 생각되어 왔으나 실제로 염분의 양은 문제가 되지 않았다. 현장에서 첨가물의 양을 조절하여 염분의 양이 조절되면 [표 7]에서 보는 바와 같이 발효전의 전체 염분의 양은 상당히 낮은 것으로 나타났다. 그리고 조단백질, 조지방, 조섬유질의 양은 발효 후 두 군데 시료에서 모두 증가하였다. 이러한 결과는 첨가된 미생물제제의 효소활성에 의하여 고분자의 물질이 저분자의 물질로 분해되었음을 알 수 있다. 또한 최종적으로 발효 후 칼로리가 약 851 칼로리에서 약 1,350칼로리로 증가하여 음식물찌꺼기 사료의 식이성이 크게 개선된 효과가 있음이 확인되었다.
본 발명 미생물 제제를 이용한 음식물찌꺼기 발효전후의 유기물 변화
시 료 수분(%) 조단백질 조지방 조섬유 조회분 칼슘 인 염분l 칼로리
Y/ 전 80.45 4.24 3.63 0.61 2.68 0.41 0.22 0.66
Y/ 후 77.06 5.18 2.31 1.31 2.36 0.38 0.20 0.41
W/ 전 82.55 4.62 3.75 0.73 2.87 0.55 851.40
W/ 후 72.99 6.23 4.06 0.98 2.80 0.47 1349.60
[보기] Y; 이천농장시료, W; 화성농장시료
[실시예 4] 복합미생물제제의 효능 효과
본 실시예에 있어서는, 발효공정 단계별로 미생물상 변화와 길항능을 조사한 후 본 발명 복합 미생물제제의 효능 및 효과를 검토하였다. [표 8]은 음식물찌꺼기 사료화에 첨가되는 재료(배지)와 발효공정 단계별 미생물상의 변화를 NA와 LB 고체배지를 이용하여 생균수를 측정한 결과이다. 첨가되는 원료에서 측정된 생균수는 1.4 ×106/g에서 2.0×107/g정도로 측정되었으나 음식물찌꺼기 사료화에 이용되는 미생물제제의 생균수는 최고 5.8×107/g 생균수를 나타내었다. 또한 이천 및 화성농장의 발효공정 단계별 시료를 채취하여 생균수를 측정한 결과는 초기 음식물에서 높은 생균수를 나타낸 다음 발효조 및 숙성조로 이동되면서 미생물의 생균수는 감소되는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 발효조의 온도 및 반응시간이 각각 55℃와 약 2-3시간 정도로서 고온성 미생물은 제외하고 중온성 미생물은 사멸되는 것으로 판단되었다. 이러한 결과로부터 본 발명에 이용되고 있는 미생물제제의 대부분의 미생물 균주가 고온에서 생육정도가 높은 특성이 있어 음식물찌꺼기 발효과정 중에도 생육하고 효소를 충분히 생산하여 사료화 미생물로서 그 효과 및 효능이 있는 것으로 판단되었다. [표 9]는 음식물찌꺼기 발효과정 단계별로 시료를 채취하여 다양한 미생물이 첨가된 시험배지(test plate)를 이용하여 콜로니(colony) 주위에 투명환의 크기를 측정하여 길항능으로 나타내었다. 이천 및 화성 농장에서 채취한 시료 모두에서 초기 음식물에서는 길항능이 나타나지 않았으나, 그 이후 저장조, 발효조 그리고 숙성조에서는 살모넬라(Salmonella sp.) 균주와 대장균(E. coli)에서 높은 길항능을 보여주고 있고, 화성농장의 시료에서는 바실러스 (Bacillus sp.) 속 균주에서도 높은 길항능을 나타내었다. 그러나 스타필로코커스 (Staphylococcus sp.)속과 캔디다(Candida sp.)속 미생물에는 대부분의 시료에서활성을 보이지 않았다. 이러한 결과로부터 본 발명 미생물제제에 의한 음식물찌꺼기의 발효는 다른 미생물에 의한 음식물의 부패를 막아주고, 악취제거 및 파리 및 구데기의 출현을 방지하는 효능이 있음을 알수 있었다. 특히 양돈의 병원성 미생물에 의한 설사병을 방지할 수 있고, 음식물찌꺼기 발효사료의 보존성을 높여주는 장점이 있다. 따라서 음식물찌꺼기에 대한 본 발명 미생물제제를 이용한 사료화 방법은 사료의 기호성을 높여주어 양돈의 식이성 향상 및 증체율 증가라는 이중 효과 뿐만 아니라 재활용 측면에서 그 이용가치가 크다고 할 수 있다.
발효단계별 미생물 변화
배지 Y (음식물찌꺼기) Y (저장조) Y (발효조) Y (숙성조)
NA 2.4×108 4.0×107 2.0×104 8.0×104
LB 1.5×108 5.6×107 3.0×104 8.5×104
배 지 W (음식물찌꺼기) W (저장조) W (발효조) W (숙성조)
NA 5.1×107 4.6×108 2.0×104 7.0×104
LB 3.6×107 3.8×108 1.1×105 7.0×105
[보기] Y; 이천농장사료, W; 화성농장사료
발효단계별 미생물 길항능
시료 C SL R209 209 BE BS
Y (음식물찌꺼기) - - - - - -
Y (저장조) - ++ - - ++ -
Y (발효조) - ++ - - ++ +
Y (저장조) - ++ - - ++ +
W (음식물찌꺼기) - - - - - -
W (저장조) - ++ + + ++ +
W (발효조) + ++ - - ++ ++
W (숙성조) + + - - ++ ++
[보기] 1. Y; 이천농장사료, W; 화성농장사료, C; 캔디다속, SL; 살모넬라속,
2. R209, 209; 스타필로코커스속, BE; 대장균, BS; 바실러스속
3. -; 없음, +; 미약함, ++; 좋음
이상 설명한 바에 의하여 명백한 바와 같이, 본 발명은 길항능이 우수하고 급성 경구독성이 없는 신규한 미생물균주를 제공하는 효과가 있으며 적절한 담체를 흡착시킨 본 발명 미생물제제를 이용하여 저장조에 최종 0.02% 되도록 첨가하여 생활폐기물 중 음식물찌꺼기의 습식발효를 통하여 급성 경구독성이 없고 중체효과가 뛰어난 양돈 사료를 제공하는 뛰어난 효과가 있다. 또한, 본 발명 방법에 의해 제조된 습식사료는 효소활성이 높고 식이성이 크게 개선된 결과 양돈사료로 급여할 때 도체등급 A, B가 약 80% 도출되며, 육질, 연도, 등심 pH, 등심수분정량, 단백질함량, 육색함량에 있어서 일반 배합사료로 사육한 축돈과 큰 차이가 없어 사료제조산업 및 축산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (4)

  1. 프로테아제 효소활성이 있고 대장균, 살모넬라, 바실러스 속 균주에 길항능이 있으며 50℃의 고온 생육이 가능하고 경구독성이 없는 바실러스 세레우스 엔케이 204(Bacillus cereus NK 204) 균주 KCTC 18084P.
  2. 제1항 기재의 미생물 바실러스 세레우스 엔케이 204 균주를 생육기질 및 보존 담체에 흡착하여서 되는 미생물제제.
  3. 제2항에 있어서, 상기 생육기질 및 보존 담체는 규조토, 제올라이트, 탈지강 중 어느하나 또는 이들의 혼합물로부터 선택됨을 특징으로 하는 미생물제제.
  4. 분쇄된 탈지강을 미생물균주의 생육기질 및 보존담체로 이용하여 폐유기성자원(음식물찌꺼기)의 분해활성을 나타내는 상기 세균 1균주 또는 그 이상의 균주를 조합하여 습식발효하여서 되는 양돈사료
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