KR20020096576A - 다중 카피로 파로모마이신 내성을 보이는 유전자를 이용한효모형질전환 벡터 시스템 - Google Patents

다중 카피로 파로모마이신 내성을 보이는 유전자를 이용한효모형질전환 벡터 시스템 Download PDF

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Abstract

본 발명은 파로모마이신 내성유전자를 이용한 효모형질전환 벡터 시스템에 관한 것으로 다중 카피로 파로모마이신 내성을 보이는 유전자인MPA1을 분리하여 이MPA1유전자를 포함하는 벡터 pCABIOM101(기탁번호 : KCTC 1014BP)을 제작하고 상기 벡터 pCABIOM101과 이 벡터로부터 유래한 pCABIOM111 벡터를 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)와 메탄올자화 효모(Pichia pastoris)에 형질전환하여 파로모마이신 내성 형질전환체를 얻음으로써 효모들의 기초연구와 산업적 목적에 요구되는 효모형질전환 벡터 시스템에 이용할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

Description

다중 카피로 파로모마이신 내성을 보이는 유전자를 이용한 효모형질전환 벡터 시스템{Yeast transforming vector system using multicopy paromomycin-resistant gene}
본 발명은 파로모마이신 내성유전자를 이용한 효모형질전환 벡터 시스템에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 다중 카피로 파로모마이신 내성을 보이는 유전자인MPA1을 분리하여 이MPA1유전자를 포함하는 벡터 pCABIOM101을 제작하고 상기 벡터 pCABIOM101과 이 벡터로부터 유래한 pCABIOM111 벡터을 이용한 효모형질전환 벡터 시스템의 구축에 관한 것이다.
효모는 인체에 해가 없고 인류 역사와 더불어 오랜 세월 동안 제빵, 맥주, 소주, 포도주 및 청주 생산 등에 사용되어 왔으며, 현재 그래스(GRAS, g enerally r egarded a s s afe) 생물로 분류되어 있다. 효모에서 산업적으로 유용한 물질의 탐색과 더불어 기존의 산업효모들의 개량 노력이 꾸준히 이루어져 왔으나 산업효모가 대부분 이배체 또는 다배체여서 돌연변이가 용이하지 않고 또한 불임이어서 포자형성과 타 효모와의 결합이 잘 되지 않아 산업용 세균들에서만큼 성공하지 못하였다. 이러한 한계를 극복하기 위해 최근에 효모형질전환 시스템을 이용한 유전자 재조합 기술 등이 도입되어 효율성 및 생산성이 향상된 효모 개발이 이루어지고 있다. 미국의 필립스 피트롤리움(Phillips Petroleum, Bartlesville, OK) 회사나 독일의 라인 바이오텍(Rhein Biotech, Dusseldorf, Germany) 회사는 각기 다른 산업효모인 피키아 패스토리스(Pichia pastoris)나 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)의 형질전환 시스템을 개발하여 상품화 하였고 최근에 일본의 타카라 슈조(Takara Shuzo, Shiga, Japan)회사는 항생제 오리오바시딘 에이(Aureobasidin A)에 대한 내성유전자를 이용한 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)의 형질전환 시스템을 상품화하였다. 이외에 야생형 유전자나 항생제 혹은 화학물질 내성 유전자를 이용한 여러 효모 형질전환 벡터들이 사카로마이세스 세레비시에에서 많이 이용되고 있지만 산업 효모들에서는 주로 항생제 혹은 화학물질 내성유전자들 (aureobasidin A, chloramphenicol, G418/geneticin, zeocin, copper, methotrexate, methylglyoxal, sulfometuron, glyphosphate 내성유전자들)을 이용한 형질전환 벡터들이 사용되고 있다. 따라서 여러 효모의 기초연구와 산업적 목적에 요구되는 형질전환 벡터 시스템을 더욱 다양하게 하기 위해서 기존에 사용되고 있는 것과 다른 항생제 혹은 화학물질 내성 유전자의 개발을 계속 필요로 하고 있다.
아미노글라이코사이드(aminoglycoside)계 항생물질과 관련된 돌연변이체들은 원핵생물과 진핵생물 모두에서 단백질 합성 조절기작을 이해하는 데에 도움을 준다. 효모에서 사슬종결 돌연변이를 억제하는 사슬종결 억제자(nonsense suppressor)인sup35, sup45등이 분리되었는데, 이러한 형질을 가진 돌연변이체들의 대부분이 성장이 느리며 여러 표현형들(temperature sensitivity, osmotic sensitivity, drug sensitivity 등)을 나타냈다(Song, J.M.와 Liebman, S.W., Genetics 115, 451-460(1987)). 그리고 이러한 사슬종결 억제자(nonsense suppressor)의 작용에 영향을 미치는 여러 가지 유전자들이 효모에서 분리되었으며, 그 중asu9은sup45의 효율를 감소시키는 항억제자(antisuppressor)로서 작용한다.
또한 효모에서asu9과sup45는 모두 아미노글라이코사이드(aminoglycoside)계 항생물질인 파로모마이신(paromomycin)에 대해 감수성을 보였으며, 이러한asu9의 분석을 위해 번역돌연변이(translational mutation)인asu9-1에 상보적인 야생형 유전자ASU9 + 의 cloning이 시도되었다. 이 과정은asu9돌연변이를 지닌 효모균주를 효모염색체 DNA의Sau3A부분절편체들이 삽입된 YEp24 library로 형질전환시킴으로써 수행되었으며, 그 결과asu9-1의 파로모마이신 감수성에 상보적인 2개의 플라스미드가 분리되었다. 분리된 2개의 플라스미드인 pJS1과 pJS2는asu9-1의 파로모마이신 감수성에 대해 상보적이면서,ASU9 + 효모 균주에서도 강한 파로모마이신 내성표현형을 나타냈다. 그러나 pJS1과 pJS2의 삽입 DNA에 내재된 유전자로 인한 파로모마이신 내성형질의 발현이 효모 염색체상의ASU9 + 이 아닌 다른 유전자에 의한 것임이 테트라드 분석(tetrad analysis) 결과 밝혀졌으나(Song, J.M., Ph.D. Thesis, University of Illinois, Illinois, 1987), 효모 내에서 다중카피 수(multicopy number)로 존재할 때 파로모마이신 내성표현형을 보이는 유전자의 실체에 대한 규명이 아직 수행되지 못하였다. 따라서, 본 발명자는 플라스미드 pJS2에 삽입된 유전자에 대한 분자유전학적인 분석을 수행하여 그들 중 파로모마이신 내성에 관여하는 유전자를 분리하고 분석함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 플라스미드 pJS2에 삽입된 유전자들 중 파로모마이신 내성에 관여하는 유전자인MPA1을 분리하고 분석한 후 상기MPA1유전자를 포함하는 벡터 pCABIOM101을 제작함에 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기 벡터 pCABIOM101과 이로부터 유래하는 플라스미드를 이용하는 효모형질전환 벡터 시스템의 구축에 있다.
본 발명의 상기 목적은 다중 카피로 파로모마이신 내성을 보이는 유전자인MPA1을 분리하여 이MPA1유전자를 포함하는 벡터 pCABIOM101을 제작하고 상기 벡터 pCABIOM101과 이 벡터로부터 유래한 pCABIOM111 벡터로 형질전환하여 얻은 효모들이 파로모마이신 내성을 보여줌으로써 효모들의 기초연구와 산업적 목적에 이용될 수 있는 효모형질전환 벡터 시스템을 구축한 것으로 달성하였다.
이하, 본 발명의 구성 및 작용을 설명한다.
도 1은 플라스미드 pJS2의 deletion 분석도이다.
도 2는 다중 카피로 파로모마이신 내성을 보이는 유전자인MPA1을 포함하는 벡터 pCABIOM101의 제한효소 지도이다.
도 3은 파로모마이신 내성을 보이는 유전자인MPA1유전자의 ORF를 포함하는 벡터 pCABIOM111의 제한효소 지도이다.
본 발명은 플라스미드 pJS2의 삽입 DNA에 존재하는 파로모마이신 내성에 관여하는 유전자부위의 분리를 위해 플라스미드 deletion을 수행하는 단계; DNA sequencing에 의해 파로모마이신 내성에 관여하는 유전자인MPA1을 분리하고 분석하는 단계; 상기MPA1유전자를 포함하는 벡터 pCABIOM101을 제작하는 단계; 상기MPA1유전자의 카피 수에 따른 파로모마이신 내성을 분석하는 단계; 벡터 pCABIOM101을 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)에 형질전환하여 파로모마이신 내성 형질전환체를 선별하는 단계; 상기 벡터 pCABIOM101으로부터 유래한 pCABIOM111 벡터를 메탄올자화 효모(Pichia pastoris)에 형질전환하여 파로모마이신 내성 형질전환체를 선별하는 단계로 구성된다.
본 발명에서 사용한 플라스미드 pJS2는 본 발명자에 의해 1987년에 일리노이즈 주립대학의 박사논문에 공지된 것을 사용하였다(Song, J.M., Ph.D. Thesis, University of Illinois, Illinois, 1987).
이하 본 발명의 구체적인 방법을 실시 예를 들어 상세히 설명하고자 하지만본 발명의 권리범위는 이들 실시 예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 다중 카피로 파로모마이신 내성을 가지는 MPA1 유전자의 분리
제1공정: 플라스미드 pJS2의 삽입 DNA내의 deletion 수행
보유하고 있는 플라스미드 pJS2(Song, J.M., Ph.D. Thesis, University of Illinois, Illinois, 1987)는 2μ에 의해 효모에서 다중카피(multicopy number)로 복제되는 YEp24 벡터에 7.9kb의 효모 염색체 DNA 절편체가 삽입되어 구축된 재조합 플라스미드이다. 이전에 수행된 연구에서 pJS2의 삽입 DNA에 내재된 유전자들 중 파로모마이신 내성에 관여하는 유전자는SalI과NheI 제한효소부위가 있는 한쪽 끝에 있을 것으로 추측되어져 본 실시 예에서는 파로모마이신 내성에 관여하는 유전자의 분석을 위해 pJS2에 대한 deletion을 다음과 같이 실시하였다. 7.9kb의 삽입절편을 지닌 pJS2는 그 절편체 내에 하나 씩의SalI과NheI 제한효소부위를 가지고 있어, 이들을 절단한 결과 2개의 pJS2 deletions을 아래와 같이 얻을 수 있었다. 도 1에 도시한 바와 같이, pJS2로부터SalI 제한효소부위를 절단하였을 때 생성된 deletion은 pJS2의 5.8kbSalI DNA 절편체가 삭제된 것으로 pJS2-1으로 명명하였고, 상기 pJS2-1의NheI 제한효소부위를 절단하였을 때 생성된 deletion은 pJS2-1의 1.2kbNheI 절편체가 삭제된 것으로 pJS2-1-1으로 명명하였다.
pJS2 deletions인 pJS2-1와 pJS2-1-1들을 효모균주인 SL680-7A(αasu9-1 ade3-26 leu2-1 met8-1 trp1 his5-2 ura3-52)에 도입시켜 얻은 형질전환체의 표현형을 분석하였다. pJS2에서 각각의SalI이나NheI DNA 절편체가 삭제되어 만들어진이러한 플라스미드 deletions은 YEp24 벡터에 존재하는 2μ에 의해 효모내로 형질전환 되었을 때 다중카피(multicopy number)로 발현된다. 그리고 이들의 형질전환체는 플라스미드내의URA3선별표지 유전자로 인해 유라실(uracil) 결핍배지에서도 성장이 가능하므로, 유리실이 결핍된 배지에서 형질전환체를 선별하였다. 도입된 플라스미드유래 유전자의 파로모마이신 내성형질 발현여부를 분석하기 위하여 선별된 형질전환체를 5mg/ml 파로모마이신이 함유된 YPD 복합배지에 접종하였다. 파로모마이신 배지에 접종된 각 플라스미드의 형질전환체는 다음의 결과를 나타냈다. YEp24는URA3선별표지를 지닌 형질전환 벡터이며, YEp24의 형질전환체는 파로모마이신 존재하에서는 전혀 성장하지 못하였으나 pJS2의 형질전환체는 pJS2-1, pJS2-1-1와 더불어 파로모마이신에 강한 내성을 보였다(표 1).
형질전환체들의 표현형
Strain (Plasmid)* Growth** on:
YPD YPD+5mg/mlparomomycin SC SC-Ura
SL680-7A (None) + ­ + ­
(YEp24) + ­ + +
(pJS2) + + + +
(pJS2-1) + + + +
(pJS2-1-1) + + + +
(pCABIOM101) + + + +
[pCABIOM102] + ­ + +
* 이용된 효모균주는 SL680-7A (αasu9-1 ade3-26 his5-2 leu2-1 met8-1 trp1 ura3-52)이고, 플라스미드 pCABIOM102는 제한효소NcoI으로 처리된 후에 형질전환되었다.** 효모현탁액을 효모복합배지(YPD), 파로모마이신배지(YPD+5mg/ml paromomycin), 합성복합배지(SC, Synthetic complete) 및 유라실 결핍배지(SC-Ura)에 각기 스포팅방법으로 접종한 후 성장을 비교하였다. 효모 성장의 측정 기준: +, good growth by 4 day;­, no sign of growth by 7 day.
이러한 결과는 효모에서 파로모마이신 내성형질이 발현되는데 pJS2에 내재된 유전자의 전서열이 필요하지 않음을 의미하며, pJS2-1와 pJS2-1-1의 절편체 부위를 포함하는 유전자가 효모에서 다중카피(multicopy number)로 발현될 때 파로모마이신 내성에 관여한다는 것을 보여주고 있다.
제2공정: 파로모마이신 내성에 관여하는 MPA1 유전자의 분리 및 분석
상기 1공정에서 플라스미드 pJS2의 삽입 DNA중 파로모마이신 내성에 관여하는 유전자는 2.3kb의SalI-BamHI DNA 절편체와 1.2kb의SalI-NheI DNA 절편체에 존재하는 것으로 판단되어 이 부위의 DNA 염기서열분석이 DNA sequencing에 의해 수행되었다. 2.3kb의SalI-BamHI DNA 절편체의BamHI 부위의 1,952bp와 1.2kb의SalI-NheI DNA 절편체의NheI 부위의 770bp가 효모 염색체 Ⅳ내의 YDR407C 유전자의 N-terminal 과 일치하였다 (Goffeau 등, Science 274, 546-567(1997)). 이러한 결과는 YDR407C 유전자(총 3,871bp의 ORF)의 N-terminal 부위(770bp; ORF의 19.9%)만으로도 파로모마이신 내성형질 발현에 관여할 수 있음을 나타내고 있다. 아직까지 YDR407C 유전자의 DNA 염기서열이외에 그 유전자의 기능이나 그 산물의 작용기작에 대해 밝혀진 것이 없다. 따라서 본 공정에서 이 유전자가 다중 카피로 파로모마이신 내성을 보이는 유전자인 것으로 밝혀 이 유전자와 그 N-terminal 부위를MPA1( m ulticopy pa romomycin-resistant) 유전자로 명명하게 되었다.
제3공정: MPA1 유전자를 포함하는 벡터 pCABIOM101의 제작
상기 1공정에서 얻은 플라스미드 pJS2-1-1의 삽입 DNA인 1.2kbSalI-NheI DNA 절편체에 상기 2공정의MPA1유전자가 포함되어 있다는 것이 재확인되었다. 이를 위해서 플라스미드 pJS2-1-1을SalI과NheI 제한효소로 처리하여 1.2kb의SalI-NheI DNA 절편체를 얻은 후 이를 효모에서 다중카피(multicopy number)로 복제되는 YEp24 벡터의SalI과NheI 제한효소부위에 삽입하여 벡터 pCABIOM101을 제작하였다 (도 2). 이렇게 제작된 벡터 pCABIOM101을 효모균주 SL680-7A에 도입시켜 얻은 형질전환체들이 파로모마이신 내성(표 1)을 나타내기 때문에 벡터 pCABIOM101은 다중 카피로 파로모마이신 내성을 보이는 유전자인MPA1을 포함하고 있다고 확인하였다.
상기 파로모마이신 내성 관련 유전자MPA1을 YEP24 벡터에 삽입시켜 구축한재조합 벡터 pCABIOM101은 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 2001년 5월 28일자로 기탁하였다(기탁번호 KCTC 1014BP).
제4공정: MPA1 유전자의 카피 수에 따른 파로모마이신 내성 분석
상기 3공정에서 제작된 벡터 pCABIOM101으로부터 삽입벡터을 얻기 위하여, pCABIOM101으로부터 YEp24의 복제기점인 2μ DNA의 2.2kbEcoRI DNA 절편체를 제거하여 pCABIOM102을 구축하였다. 구축된 pCABIOM102는 벡터 내URA3의NcoI 제한효소부위를 절단하여 선형(linearized) DNA로 만든 상태로 효모 SL680-7A에 형질전환되었다. 이렇게 형질전환된 pCABIOM102는 다중카피(multicopy number)로 발현되지 못하고 효모 내의ura3-52부위에 삽입되어 단일카피(single-copy number)로 발현된다. 이들의 형질전환체는 플라스미드 내의URA3선별표지 유전자에 의해 유라실 결핍배지에서도 성장이 가능하므로, 유라실이 결핍된 배지에서 형질전환체를 선별한 후 선별된 형질전환체를 5mg/ml 파로모마이신이 함유된 YPD 복합배지에 접종하였을 때 전혀 성장하지 못하였다(표 1). 동일한 유전자가 내재되어 있는 pCABIOM101에서는 파로모마이신에 대한 강한 내성형질이 나타났는데도 불구하고 pCABIOM102의 형질전환체가 파로모마이신에 대해 감수성을 나타냈다는 사실은 바로 삽입 DNA에 내재되어있는 유전자가 다중카피(multicopy number)로 발현될 때만이 파로모마이신 내성에 관여한다는 것을 보여주는 결과이다
실시예 2: 벡터 pCABIOM101 을 이용한 사카로마이세스 세레비시에 균주 ( S.cerevisiae ) 의 형질전환
본 실시 예에서 상기 벡터 pCABIOM101을ASU9 + 효모(S. cerevisiae) 균주들인 S73 (αser1-171 ura3-52)와 JS143-7D (ａleu2 trp1-Δura3-52)에 도입시켜 얻는 형질전환체들의 표현형을 분석하였다. 형질전환체들은 플라스미드내의URA3선별표지 유전자로 인해 유라실(uracil) 결핍배지에서 성장이 가능하므로, 유리실이 결핍된 배지에서 형질전환체를 선별하였다. 도입된 플라스미드유래 유전자의 파로모마이신 내성형질 발현여부를 분석하기 위하여 선별된 형질전환체를 10mg/ml 파로모마이신이 함유된 SC-Ura 고체배지에 접종하였다. 파로모마이신 배지에 접종된 각 플라스미드의 형질전환체는 다음의 결과를 나타냈다. YEp24는URA3선별표지를 지닌 형질전환 벡터이며, YEp24의 형질전환체는 파로모마이신 존재하에서는 전혀 성장하지 못하였으나 pCABIOM101의 형질전환체들은 파로모마이신에 강한 내성을 보였다(표 2). 이러한 결과는 벡터 pCABIOM101로 형질전환된ASU9 + 효모에서도 파로모마이신 내성형질이 발현되어 벡터 pCABIOM101에 포함되어 있는MPA1유전자가 효모에서 다중카피(multicopy number)로 발현될 때 파로모마이신 내성에 관여한다는 것을 보여주고 있다.
실험실효모 형질전환체들의 표현형
Strain (Plasmid)* Growth** on:
SC SC-Ura SC-Ura+10mg/mlparomomycin
S73 (None) + ­ ­
(YEp24)(pCABIOM101) ++ ++ ­+
JS143-7D (None) + ­ ­
(YEp24)(pCABIOM101) ++ ++ ­+
* 이용된 효모균주들은 S73 (αser1-171 ura3-52)와 JS143-7D (ａleu2 trp1-Δ ura3-52)이다.** 효모현탁액을 합성복합배지(SC, Synthetic complete), 유라실 결핍배지(SC-Ura)와 파로모마이신배지(SC-Ura+10mg/ml paromomycin)에 각기 스포팅방법으로 접종한 후 성장을 비교하였다. 효모 성장의 측정 기준: +, good growth by 4 day;­, no sign of growth by 7 day.
실시예 3: 벡터 pCABIOM111을 이용한 메탄올자화 효모( Pichia pastoris )의 형질전환
본 실시예에서는 효모(S. cerevisiae)로부터 유래한 상기 다중 카피로 파로모마이신 내성을 보이는MPA1유전자가 메탄올자화 효모(Pichia pastoris)에 도입될 때 어떻게 발현되는 가가 조사되었다. 이를 위해서 벡터 pCABIOM101내의MPA1유전자의 염기배열에 기반을 둔 2개의 프라이머(primer)들, 5'-GGAGACAAAAACCATGGATATTCTTAAGCA-3'(forward primer:서열번호 4)과 5'-GTAGCTAGCTTTAGAGAAGCG-3'(reverse primer:서열번호 5)을 제작하였다. 프라이머들은 증폭된 DNA가 벡터 pCABIOM101내의MPA1유전자의 모든 ORF을 가지면서 5'-end에NcoI 제한효소부위, 3'-end에NheI 제한효소부위를 가지도록 디자인된 결과로MPA1ORF중 2번째 코돈의 첫 번째 염기가 A AT → G AT로 변하였으며 아미노산 염기는 Asn 2 → Asp 2로 변화였다. 따라서 상기 2개의 프라이머들로 PCR 증폭을 실시하여 증폭된 DNA를NcoI과NheI 제한효소로 처리하여 얻은 771bp의NcoI-NheI DNA 절편체를 다시 Klenow효소로 처리하여 blunt-end로 만든다. 이와 동시에Pichia의 발현벡터인 pHIL-D2를EcoRI 제한효소로 처리하고 다시 Klenow효소로 처리하여 blunt-end로 만든 것에 상기의 blunt-end로 변한 771bp의 DNA 절편체를 삽입하여 벡터 pCABIOM111을 제작하였다. 이렇게 제작된 벡터 pCABIOM111을 히스티딘 탈수소효소(Histidinol dehydrogenase) 활성이 결여된 영양요구주Pichia pastorisGS115 (his4) 균주에 형질전환 시켜 His+Mut+형질전환체를 만들기 위해 벡터 pCABIOM111를 제한효소SalⅠ으로 절단하였다. 이 경우 선형 DNA(linearized DNA)는Pichia의HIS4부위에 삽입되어 His+Mut+ Pichia형질전환체를 형성한다.
도입된 플라스미드유래 유전자의 발현여부를 분석하기 위하여 선별된 형질전환체를 10mg/ml 파로모마이신이 함유된 minimal methanol(MM) 배지에 접종하였다. 파로모마이신 배지에 접종된 각 플라스미드의 형질전환체는 다음의 결과를 나타냈다. pHIL-D2는HIS4선별표지를 지닌 형질전환 벡터이며, pHIL-D2의 형질전환체는 파로모마이신 존재하에서는 전혀 성장하지 못하였으나 pCABIOM111의 형질전환체들은 파로모마이신에 내성을 보였다(표 3). 이러한 결과는 벡터 pCABIOM111로 형질전환된Pichia효모에서도 파로모마이신 내성형질이 발현될 수 있다는 것을 의미하며 벡터 pCABIOM111에 포함되어 있는MPA1유전자가Pichia효모에서 발현될 때, 즉 다중 카피로 삽입되지는 않았지만Pichia의AOX1프로모터가 메탄올로인덕션(induction)됨으로써 파로모마이신 내성에 관여한다는 것을 보여주고 있다.Pichia pastoris의 염색체 DNA내로MPA1유전자가 도입되었는지에 여부는 PCR방법에 의하여 확인하였다. 즉, PCR을 통해서 유전자의 도입여부를 확인하기 위하여 5'AOX1프라이머와 3'AOX1프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 후 증폭된 DNA를 전기영동(gel electrophoresis)을 통해 확인할 때 2.2kb의 야생형AOX1유전자 밴드(gene band)와 약 0.8kb의MPA1유전자를 포함한 밴드가 나타났다.
Pichia형질전환체들의 표현형
Strain [Plasmid]* Growth** on:
MMH MM MM+10mg/mlparomomycin
GS115 [None] + ­ ­
[pHIS-D2] + + ­
[pCABIOM111] + + ±
*이용된 효모균주는Pichia pastorisGS115 (his4)이고, 플라스미드 pHIS-D2와 pCABIOM111은 제한효소SalI으로 처리된 후에 형질전환되었다.** 효모현탁액을 히스티딘첨가 메탄올최소배지(MMH), 메탄올최소배지(MM) 및 파로모마이신배지(MM+10mg/ml paromomycin)에 각기 스포팅방법으로 접종한 후 성장을 비교하였다.효모 성장의 측정 기준: +, good growth by 4 day; ±, some growth by 4 day;­, no sign of growth by 7 day.
이상, 상기 실시 예에서 설명한 바와 같이 본 발명은 다중 카피로 파로모마이신 내성을 보이는 유전자인MPA1을 분리하여 이MPA1유전자를 포함하는 벡터 pCABIOM101(기탁번호:KCTC 1014BP)을 제작하고 상기 벡터 pCABIOM101과 이 벡터로부터 유래한 pCABIOM111 벡터를 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)와 메탄올자화 효모(Pichia pastoris)에 형질전환하여 파로모마이신 내성 형질전환체를 얻음으로써 효모들의 기초연구와 산업적 목적에 요구되는 효모형질전환 벡터 시스템을 구축하는 뛰어난 효과가 있으므로 생물산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (6)

  1. 서열번호 1의 파로모마이신 내성 관련 유전자MPA1.
  2. 제 1항 기재의 파로모마이신 내성 관련 유전자MPA1에 코딩된 서열번호 2의 아미노산 서열.
  3. 제 1항 기재의 파로모마이신 내성 관련 유전자MPA1을 YEP24 벡터에 삽입시켜 구축한 재조합 벡터 pCABIOM101(기탁번호 KCTC 1014BP).
  4. 서열번호 3으로 표시되는MPA1유전자의 ORF를 pHIL-D2 벡터에 삽입시켜 구축한 재조합 벡터 pCABIOM111.
  5. 제 3항 기재의 재조합 벡터 pCABIOM101로 형질전환된 효모형질전환체Saccharomyces cerevisiaepCABIOM101.
  6. 제 4항 기재의 재조합 벡터 pCABIOM111로 형질전환된 효모형질전환체Pichia pastorispCABIOM111.
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