KR20020090036A

KR20020090036A - 피키아 파스토리스를 이용한 인간 h-서브유닛 페리틴의발현 및 이를 이용한 빈혈치료용 조성물

Info

Publication number: KR20020090036A
Application number: KR1020010029187A
Authority: KR
Inventors: 이유진; 정종문
Original assignee: 정종문
Priority date: 2001-05-25
Filing date: 2001-05-25
Publication date: 2002-11-30

Abstract

본 발명은 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)를 이용한 인간 철 저장 단백질 중의 하나인 페리틴(Ferritin)의 대량 생산 방법에 관한 것으로, 페리틴의 두가지 서브유닛 가운데 서브유닛 H 만을 재조합 단백질 형태(recombinant H-chain ferritin; rHN)로 발현하는 방법에 관한 것이다. 본 발명을 통해 효모에서 발현한 재조합 인간 페리틴 단백질은 철 저장 능력이 높아 빈혈치료제로서의 이용가치가 크다.

Description

피키아 파스토리스를 이용한 인간 H-서브유닛 페리틴의 발현 및 이를 이용한 빈혈치료용 조성물{OVEREXPRESSION METHOD OF RECOMBINANT HUMAN H-CHAIN FERRITIN IN PICHIA PASTORIS AND THERAPEUTIC COMPOSITION FOR ANEMIA USING THE SAME}

본 발명은 인간 H-서브유닛 페리틴 유전자를 포함하는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 유래의 재조합 발현 벡터, 이를 포함하는 피키아 파스토리스, 이를 이용한 재조합 인간 H-서브유닛 페리틴의 과다발현 방법 및 재조합 인간 H-서브유닛 페리틴의 빈혈치료제로서의 용도에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 인간 페리틴의 서브유닛 H와 L 중, 철 결합력이 뛰어난 H-서브유닛, 특히 인간 간으로부터의 H-서브유닛을 피키아 파스토리스에서 재조합 단백질 (동형질체; Homopolymer) 형태로 발현시키기 위한, 인간 H-서브유닛 페리틴 유전자를 포함하는 피키아 파스토리스 유래의 재조합 발현 벡터, 특히 재조합 연속 발현 벡터 (constitutive expression vector), 그를 포함하는 피키아 파스토리스, 상기 재조합 발현 벡터를 이용하여 피키아 파스토리스를 형질 전환시킨 후, 형질전환체를 제오신 포함 배지에서 배양하여 그의 게놈 내로 다중 카피 (multicopy)의 인간 H-서브유닛 페리틴 유전자가 통합된 피키아 파스토리스를 선별하고, 이렇게 선별한 형질전환체를 단백질 결핍 배지에서 배양하여 수용성 단백질 형태의 인간 H-서브유닛 페리틴을 세포 외로 분비되게 함으로써 재조합 인간 H-서브유닛 페리틴을 대량 생산하는 방법, 및 이렇게 수득된 재조합 인간 H-서브유닛 페리틴을 유효 성분으로 하는 빈혈치료제에 관한 것이다.

철 저장 단백질 중의 하나인 페리틴 (분자량 500,000 ～ 550,000)은 포유동물의 간장, 비장, 골수 등에 함유되어 있는 생체내 활성물질이다 (Tipton, I.H. and Cook, M.J. (1963) Health Phys. 9, 103-143), X-Ray와 전자현미경 검사에 의하면 분자 중앙의 철혼합물 주위를 24개의 유사한 단백질 서브유닛들이 둘러싸고 있다 (Harrison and Arosio, 1996). 페리틴 분자는 약 20,000 ～ 21,000의 분자량을 지닌 단백질 서브유닛이 24개 모여 평균 분자량 450,000정도인 아포페리틴이라는 구상의 단백질각(protein shell)을 구성하고, 중앙에는 20 - 38 ％의 철분이 폴리머릭 페릭 옥시하이드록사이드 (polymeric ferric oxyhydroxide)의 형태로 함유되어 있어(Ford, G.C., Harrison, P.M., Rice, D.W., Smith, J.M.A., Treffry, A., White, J.L. and Yariv, J. (1984) Phil. Trans. R. Soc. Lond. B 304, 551-565), 필요시 단백질에서 유리되어 바로 생체내에 이용될 수 있는 저장 철형태의 유일한 생리활성형 철 단백질이다. 조합된 페리틴 1분자가 완전히 철로 포화되면 4,500개의 철 원소를 수용할 수 있으며 이는 헤모글로빈 1200분자를 생합성할 수 있는 철 공급량이 된다.

페리틴은 H-서브유닛과 L-서브유닛으로 구성되는데, 유전자 서열 상에서 55％ 이상의 동일성 (identity)을 가지고 있다. H-서브유닛은 금속 결합 부위(metal-binding site)를 포함하고, 페록시데이즈 활성도(ferroxidase activitiy)를 소유하고 있으며, L-서브유닛은 철 코어(iron core)의 형성과 안정화에 기여한다 (Arosio, P., Adelman, T.G. and Drysdale, J.W. (1978) J. Biol. Chem. 253, 4451-4458; Levi, S., Luzzago, A., Cesareni, G., Cozzi, A., Franceschinelli, F., Albertini, A. and Cortese, R. (1988) J. Biol. Chem. 163, 18086-10892; Lawson, D.M., Artymiuk, P.J., Yewdall, S.J., Smith, J.M.A., Livingstone, J.C., Treffry, A., Luzzago, A., Levi, S., Arosio, P., Cesareni, G., Thomas,C.D., Shaw, W.V. and Harrison, P.M. (1991) Nature 349, 541-544; Levi, S., Yewdall, S.J., Harrison, P.M., Santambrogio, P., Cozzi, A., Rovida, E., Albertini, A. and Arosio, P. (1992) Biochem. J., 288, 591-596; Santambrogio, P., Levi, S., Cozzi, A., Rovida, E., Albertini, A. and Arosio, P. (1993) J. Biol. Chem., 268(17) 12744-12748). 반면에, L-서브유닛이 많이 존재하는 간과 비장의 경우 철을 저장하는 기능을 가지고 있어 평균적으로 비교적 높은 철 함량 (분자당 1,500 개나 그 이상의 철 원소 포함)을 가진다. 반면에 H-서브유닛이 많은 심장과 뇌의 경우 비교적 낮은 철 함량 (분자당 1,000개 이하의 철 원소 포함)을 가지고 있다. 생체내에서는 H-서브유닛 동형질체(homopolymer)가 분포하는 경우는 아직까지 발견되지 않았으며, 말 비장 페리틴에서 L-서브유닛이 85 ％이상 존재함이 밝혀졌다 (Ishitani, K., Listowsky, I., Hazard, J. and Drysdale, J.W. (1975) J. Biol. Chem. 250, 5446-5449). 특별한 비율로 H-서브유닛과 L-서브유닛이 이형질체 (heteropolymer)을 형성할 때 즉, 24개로 조합시 H-서브유닛이 5 - 8개 정도 포함될 때 이상적으로 철과의 결합률이 높아진다 (Santambrogio, P., Levi, S., Cozzi, A., Rovida, E., Albertini, A. and Arosio, P. (1993) J. Biol. Chem., 268(17) 12744-12748).

그러나, 생체내 (in vivo) 실험에서는 L-서브유닛 동형질체가 많은 양의 철을 수용한 경우를 보인 적이 없으며, 대장균 (Eschericia coli; E.coli)에서 발현시에도 동일 조건하에서 H-서브유닛 동형질체가 분자당 200 - 300 개 이상의 철 원소를 축적하는 반면에 L-서브유닛 동형질체의 경우 분자당 10 개 이하의 철 원소와결합하였다 (Levi, S., Salfeld, J., Franceschinelli, F., Cozzi, A., Dorner, M.H. and Arosio, P. (1989) Biochemistry, 28, 5179-5184).

철의 흡수는 거의 모든 장(intestine)에서 이루어지며, 특히 십이지장 및 공장 전반부에서의 철흡수가 가장 높고 그 이하로 내려갈수록 감소된다. 철의 흡수는 점막 방어 기전에 의해서 제한·조절된다. 무기염 형태의 철은 소장점막에서 흡수되기 전에 2가 형태의 페로스 철 (ferrous iron; Fe²⁺)의 형태로 전환되어야 한다. 염산과 비타민 C (Vitamin C) 가 존재할 때에는 3가 철 (Fe³⁺)이 2가 철 (Fe²⁺)형태로 전환되므로 흡수율이 높아진다. 소장의 점막세포는 아포 페리틴(apoferritin)이라는 거대 단백분자를 함유하고 있어 2가 철 (Fe²⁺)상태로 흡수된 철을 3가 철 (Fe³⁺)상태로 변화시킨 다음 아포페리틴과 결합하여 페리틴형으로 된다. 이 때 점막 방어가 아포 페리틴이 철로 포화되어 있는 경우 Fe²⁺흡수를 저지하는 역할을 함으로써 생체의 철요구에 따라 흡수조절을 막는다.

따라서, 대장에서 철의 흡수는 산화된 형태일 때 더욱 증가하는데, 페리틴 단백질은 산화된 형태로 철을 소유하고 있으므로 유효하게 철이 흡수될 수 있다.

지금까지 페리틴을 유효 성분으로 하는 경구용 빈혈치료제로는, 말 비장(Horse Spleen)에서 고농도의 페리틴을 추출, 정제, 엑기스화하여 동결건조시킨 분말 제제가 사용되어 왔다. 그러나, 이 경우에는 구제역 바이러스나 기타 미지의 병원성 세균과 바이러스 감염의 우려가 고려되는 바, 치료제 목적으로 적합하지못하였다. 이러한 도축 동물로부터의 혈장 혹은 조직 추출물 들로부터의 인체 적용 약품 생산은 점차 규제가 심화될 추세이기 때문에, 생산 단가 상승은 물론 궁극적으로 소비심리 하락으로 이어질 것이며, 말 비장 공급 역시 원활하지 않을 것이다.

따라서 병원성 세균과 바이러스 감염의 위험성을 철저히 배제한 기능성 페리틴 단백질을 생산하기 위해서는 저비용, 고수득율의 재조합 단백질 생산기술이 요구된다.

근래에 유전자 재조합 기술을 이용하여 목적하는 단백질을 발현시켜 정제하는 방법은 자주 이용되어지고 있으며 또 재조합 단백질을 생산하기 적합한 다수의 숙주세포들이 개발되어 있다. 그 중 효모인 피키아 파스토리스는 성장 속도가 빨라 연속 발현 벡터 내에 인위적으로 삽입한 재조합 유전자로부터 특정 단백질을 대량 생산할 수 있고, 일반적인 진핵생물의 단백질 발현 양상을 갖고 있어 다른 진핵생물 유래 단백질을 거의 동일하게 발현시킬 수 있다. 또한 피키아 파스토리스는 자체 단백질을 분비하는 정도가 매우 낮은 대신, 값싼 단백질 결핍배지에서 재조합 단백질을 리터당 그램 수준까지 세포 외로 분비시킬 수 있을 뿐만 아니라 발효조를 이용하여 배양할 경우, 플라스크에서보다 보통 20 내지 100배까지 발현양이 증가될 수 있다. 또한, 피키아 파스토리스에서의 단백질 발현은 메탄올 유도에 의한 것이 아니기 때문에, 메탄올 유도시의 여러 단점, 예를 들어 메탄올 유도에 의해 발현된 단백질을 식품 첨가제로서 사용할 경우 문제시되는 메탄올 잔류, 포름알데히드 등의 이차 대사산물, 일정 기간 후의 세포의 사멸, 매 24시간마다 메탄올을 첨가해야 하므로 그로 인한 공장단위 생산시의 단가 상승 등을 가지지 않으며, 단백질 양이적은 배지를 이용하기 때문에 분비된 단백질의 분리, 정제가 용이하여 궁극적으로 생산 비용을 크게 낮출 수 있고, 피키아 파스토리스 유래의 연속 발현 벡터를 사용하면, 상기 벡터를 통해 발현된 단백질을 정제하여 식품 첨가제로 용이하게 사용할 수 있으며, 몇번의 계대 배양 (신선한 배지로의 교체)만으로도 세포 유지가 가능하고, 유도제 (inducer)가 필요하지 않아 공장단위 생산시 단가가 절감된다.

상기에 언급한 바와 같이 다방면에서 그 가치를 인정받고 있는 피키아 파스토리스 발현체계는 이미 VEGF(vascular epithelial growth factor), TNF(tumor necrosis factor), 길안텐(ghilanten) 등과 같은 치료목적의 여러 포유동물 유래 단백질들의 발현에 이용된 바 있다. 피키아 파스토리스에 관한 특허는 미국특허공보 제 4,683,293호, 미국특허공보 제 4,808,537호, 미국특허공보 제 4,812,405호, 미국특허공보 제 4,818,700호, 미국특허공보 제 4,8 37,148호, 미국특허공보 제 4,855,231호, 미국특허공보 제 4,857,467호, 미국특허공보 제 4,879,231호, 미국특허공보 제 4,882,279호, 미국특허공보 제 4,885,242호, 미국특허공보 제 4,895,800호, 미국특허공보 제 4,92 9,555호, 미국특허공보 제 5,002,876호, 미국특허공보 제 5,004,688호, 미국특허공보 제 5,032,516호, 미국특허공보 제 5,122,465호, 미국특허공보 제 5,135,868호, 미국특허공보 제 5,166,329호 등으로 다양한 생리활성 단백질의 발현체계로서 공지되어 있으나 아직까지 인간 페리틴 발현에 관련된 내용은 전무하다.

따라서, 피키아 파스토리스 발현 체계를 이용한 재조합 인간 H-서브유닛 페리틴 제조방법의 개발에 대한 필요성이 대두되었고, 만일 상기와 같은 페리틴 제조방법이 개발된다면, 철 결합능을 가진 재조합 인간 H-서브유닛 페리틴을 대량으로 발현하여 수득할 수 있고, 또한 재조합 발현기술을 이용하면 말 비장과 같은 원천으로부터 단백질을 분리, 정제하는 단계에서 우려되는 세균과 바이러스 감염의 위험성과 말 비장 공급이 간헐적인데서 오는 원료공급상의 제약을 배제할 수 있으며, 궁극적으로 인간 H-사슬 페리틴을 안전하고 저렴한 가격으로 시장에 공급할 수 있게 될 것이다.

본 발명자들은 이러한 요구에 부응하여, 인간 H-서브유닛 페리틴 유전자를 포함하는 피키아 파스토리스 유래의 발현 벡터를 구축하고, 그로부터 재조합 인간 H-서브유닛 페리틴을 과다발현시키며, 이와 같이 과다발현된 인간-H 서브유닛 페리틴을 정제하여 그를 유효성분으로 하는 빈혈치료제를 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 인간 H-서브유닛 페리틴 유전자를 포함하는 피키아 파스토리스 유래의 재조합 발현 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기의 재조합 벡터로 형질 전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 단백질 발현 숙주로서 피키아 파스토리스와 연속 발현 벡터 pGAPZαA를 이용하여 빈혈치료제로서 이용할 목적으로 재조합 인간 페리턴 단백질을 고수율로 대량 생산하는 방법을 제공하는 것이다. 즉, (1) 본 발명에 따른 발현 벡터로 피키아 파스토리스를 형질전환시키는 단계; (2) 형질전환시킨 피키아 파스토리스를 제오신 포함 배지에서 배양하여 그의 게놈 내에 인간 H-서브유닛 페리틴 유전자가 다중 카피로 통합된 형질전환체를 선별하는 단계; (3) 상기(2)에서 수득된 형질전환체를 단백질 결핍 배지에서 배양하여 인간 H-서브유닛 페리틴 유전자를 발현시킴으로써 배양 배지 내로 인간 H-서브유닛 페리틴 단백질이 분비되게 하는 단계; 및 (4) 분비 단백질을 친화성 크로마토그래피로 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 H-서브유닛 페리틴의 대량 생산 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명의 재조합 벡터(pGAPZαA/rHN)의 제조 모식도를 도시한 것이고,

도 2는 본 발명의 재조합 미생물에서 재조합 단백질 인간 H-서브유닛 페리틴의 발현 여부를 SDS-PAGE 방법으로 확인한 것이고,

도 3은 본 발명의 재조합 단백질 인간 H-서브유닛 페리틴의 어셈블리(assembly) 여부를 네이티브 (native)-PAGE 방법으로 확인한 것이고,

도 4는 본 발명의 재조합 단백질 인간 H-서브유닛 페리틴의 철 결합 능력을 검증하고자 시험관내 (in vitro)에서 철(Ferrous ammonium sulfate; FeSO₄(NH₄)₂SO₄·6H₂O)과 재조합 인간 H-서브유닛 페리틴을 반응시킨 후, 철 염색된 밴드를 통해서 재조합 H-서브유닛 페리틴 단백질의 내부공간 내로의 철 결합 유무를 네이티브-PAGE 방법의 실행 후 프러시안 염색 (Prussian staining)으로 확인한 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2로 기재되는 HF1 프라이머 (즉, HF1센스 프라이머 : 5'- CTCGAG AAAAGAGAGGCTGAAGCTATGACGACCGCGTCC- 3')와 서열번호3으로 기재되는 HF2 프라이머(즉, HF2 안티센스 프라이머 : 5'- CTCGAG TTAGCTTTCATTATC-3')의 쌍을 이용하여 증폭된 인간 간의 H-서브유닛 페리틴 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

상기 재조합벡터는 도1의 pGAPZαA/rHN이 바람직하다.

본 발명의 재조합 벡터의 구축에는 상기한 pGAPZαA 외에도, 피키아 파스토리로부터 유래된 다른 발현 벡터, 예를 들어 인비트로젠사 (미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)로부터 입수가능한 pPICZ 및 pPICZαA, B, C, pPICZ-E 및 pPICZα-E, pPIC6 및 pPIC6αA, B, C, pGAPZ, pPIC9K 및 pPIC3.5K, pAO815, pHIL-D2 및 pHIL-S1 등이 또한 사용될 수 있다.

이어서 상기의 pCAPZαA/rHN 재조합 벡터로 피키아 파스토리스를 형질전환시켰다. 이때 사용되는 형질전환 방법으로는 통상의 방법, 예를 들어 전기천공법, 인산칼슘법, 스페로플라스트, 염화리튬법 등을 들 수 있다. pGAPZαA/rHN 재조합 벡터로 형질전환된 피키아 파스토리스는 미생물 기탁에 관한 부다페스트 조약 하의 기탁 기관인 한국미생물보존센터에 2001년 5월 23일자로 기탁되어 수탁번호 KCCM10279를 수여받았다.

본 발명에서는 또한 상기의 형질전환된 효모숙주를 단백질 결핍 배지에서 배양하여 연속적으로 재조합 H-서브유닛 페리틴의 발현을 유도하고, 이렇게 발현된 페리틴을 정제하여 빈혈치료제의 유효 성분으로 사용하였다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명자는 인간 H-서브유닛 페리틴 유전자를 클로닝하기 위하여 인간 간 cDNA 라이브러리를 주형으로 이용하였다.

서열번호 1은 본 발명의 인간 간의 H-서브유닛 페리틴을 암호화하는 cDNA의 염기서열과 아미노산 서열을 기재한 것으로 1에서 552로 표기된 아미노산들이 성숙된 H-서브유닛 페리틴을 이룬다. HF1 프라이머와 HF2 프라이머 위치는 재조합 벡터에 삽입되는 인간 H-서브유닛 페리틴 부분을 나타내기 위하여 표기한 것이다. HF1 프라이머는 pGAPZαA 벡터의 GAP 프로모터 (Promoter) 다음에 위치하는 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)의α-인자 리더 서열(α-factor leader sequence)중 끝부분의 24개 핵산을 포함하도록 디자인 되었다.

본 발명에서 HFN cDNA는 인간 간 cDNA 라이브러리를 주형으로 이용하여 PCR 방법으로 증폭하였고, 증폭되어진 H-서브유닛 페리틴 DNA 절편을 pGAPZαA벡터에삽입시켰다.

본 발명에 사용된 pGAPZαA 벡터에는 피키아 파스토리스에서 재조합 단백질을 연속적으로 발현시키기 위한, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 (GAPDH) 단백질을 암호화하는 유전자 (CAP)의 프로모터, 및 발현된 단백질을 효모 세포 밖으로 분비시키는 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces crevisiae)의α-인자 리더 서열(α-factor leader sequence)이 포함되어 있고, 숙주 내로 형질도입 여부를 확인할 수 있는 표지로 이용 가능한 제오신(Zeo^r) 유전자도 포함하고 있으며, 히스티딘 태그 (His tag) 암호화 서열도 포함되어 있다. 따라서 삽입되는 H-서브유닛 페리틴은 발현되면서 단독으로, 특히 수용성 단백질 형태로 숙주 밖으로 분비되기 때문에 고순도의 H-서브유닛 페리틴을 gel-filtration 등 통상의 방법으로 용이하게 정제 분리할 수 있다.

상기의 재조합 pGAPZαA/rHN 벡터는, 제오신-유전자를 선별가능한 유일한 마커로 포함하는 벡터로부터의 재조합 단백질 발현을 가능하게 하는 피키아 파스 토리스 X-33(Zeo)에 형질 전환 시켰다.

형질전환된 피키아 파스토리스는 YPD 배지(1 ％ 박토 효모추출액, 2 ％ 펩톤, 2 ％ 글루코오스)에서 종 배양한 후, 다시 이 배양액의 100 ㎕를 YPD 배지(1 ％ 박토 효모추출액, 2 ％ 펩톤, 2 ％ 포도당) 50 ㎖에 접종하여 H-서브유닛 페리틴을 효모 외로 발현시켰다.

배양액에 단독으로 분비된 H-서브유닛 페리틴은 원심분리방법으로 쉽게 분리한 결과 배양조건이나 배양조에 따라 발현량의 차이가 있지만 최적 조건인 호기성배양조에서 플라스크 내의 YPD 배양액에 연속 발현 후 120시간 발현시켰을 때 리터당 300 mg의 H-서브유닛 페리틴을 얻을 수 있었다.

본 발명에 의해 제조된 재조합 단백질 H-서브유닛 페리틴의 철 결합능은 네이티브-PAGE의 철 염색반응으로 확인해 본 바, 분자량이 24,000인 H-서브유닛 24개가 결합하여 분자량이 576,000인 동형질체를 형성함으로써 철과 결합함을 확인하였다.

한편, 본 발명의 페리틴을 유효 성분으로 함유하는 빈혈치료용 조성물은 통상의 방법에 따라 담체, 계면활성제, 부형제, 착색제, 안정화제, 완충제, 현탁제, 등장제, 및 기타 약학적으로 허용가능한 첨가제를 적절히 첨가하여 제조하였는데, 본 발명의 조성물은 상기한 성분 외에도, 빈혈치료 효과의 증강을 위하여 비타민 C, 철분 등의 기타 성분도 함유할 수 있다.

본 발명의 빈혈치료용 조성물은 경구 투여되거나 비경구적으로 투여될 수 있으나, 고체, 반고체 또는 액체의 형태로 경구 투여되는 것이 바람직하다. 경구 투여 제제로는 정제, 환제, 과립제, 연질 및 경질 캅셀제, 분산제, 현탁제 등의 통상의 제형을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물에 있어서, 그의 투여량 및 투여 횟수는 치료하고자 하는 질병, 예를 들어 빈혈의 심각성, 투여 방법, 환자의 연령, 치료 기간 등에 달라질 수 있으나, 통상 페리틴 140 내지 170 mg, 바람직하게는 150 내지 160 mg, 더욱 바람직하게는 155 mg을 전달할 수 있는 투여량으로 일일 1회 또는 수회 투여되는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 실시예를 통해 더욱 상세히 기술하고자 한다. 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 설명하는 것으로, 하기 실시예에 의해 본 발명의 범위가 제한되지는 않는다.

＜실시예 1＞

H-서브유닛 페리틴의 cDNA 클로닝

(1) 균주 및 플라스미드 벡터

본 실험에서 사용한 균주 및 플라스미드는 하기의 표 1 과 같다.

테트라사이클린 내성 유전자를 선별 마커로 포함하는 박테리아E. coliTop10 F'는 인비트로젠사(Invitrogen, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)로부터 구입하여 플라스미드 벡터의 유지 및 증폭에 사용하였으며, 피키아 파스토리스 X-33 역시 인비트로젠사 로부터 구입하여 인간 H-서브유닛 페리틴의 발현에 이용하였다.

(2) 재조합 벡터 구성

유전자 클로닝 및 발현을 위해 인비트로젠사의 피키아 파스토리스 발현 키트에 제공되는 연속 발현 벡터인 pGAPZαA를 이용하였다. 그리고, 클론텍사(Clonetech, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)로부터 구입한 마라톤-레디 인간 간 cDNA(Marathon-Ready Human Liver cDNA)을 주형으로 PCR(polymerase chain reaction)을 실시하여 인간 간의 H-서브유닛 페리틴 cDNA를 증폭하였다. PCR에는 통상의 PCR 기계, 예를 들어 미국의 MJ Research사의 PTC-100 (제품명)이 사용될 수 있다.

사용한 프라이머는 바이오니아사(한국)를 통해 합성한 2개의 유전자 특이적 프라이머(HF)였으며, 각각의 프라이머 염기서열은 서열번호2(HF1 센스 프라이머 : 5'- CTCGAG AAAAGAGAGGCTGAAGCTATGACGACCGCGTCC- 3') 및 서열번호3( HF2 안티센스 프라이머 : 5'- CTCGAG TTAGCTTTCATTATC-3')에 표시한 바와 같다. 특히, HF1과 HF2에는 제한효소XhoI의 인식부위(밑줄 친 이탤릭체)가 도입되어 있다.

PCR 반응은 하기에 표시한 조성물(클론텍사, Clontech, U.S.A.)로 1회 시행하였다.

PCR의 반응조건은 먼저 95 ℃에서 5분간 둔 후, 95 ℃에서 1분, 53 ℃에서 1분, 68 ℃에서 1분 순으로 30 사이클을 수행하고 마지막으로 68 ℃에서 10분간 반응 시켰다.

이러한 PCR을 통해 증폭된 약 580 kb의 H-서브유닛 페리틴 cDNA를 제한효소XhoI(Promega)으로 처리한 후, 반응물을 1 ％ 아가로즈 젤 상에서 전기이동하였다. 그 후, 에티디움 브로마이드(Ethidium bromide; EtBr)로 염색하여 UV상에서 H-서브유닛 페리틴 DNA 밴드만을 면도칼로 분리한 후, Qiagen사(Germany)의 진클린 키트(Gene-clean kit)를 사용하여 아가로즈 젤로부터 DNA를 순수 정제하여 3차 멸균수에 녹였다.

＜실시예 2＞

재조합 벡터(pGAPZ α A/rHN)의 제조와 형질전환

(1) 재조합 벡터의 제조

도 1에 도시한 바와 같이 본 발명의 재조합 벡터(pGAPZαA/rHN)를 제조하였으며 상세한 설명은 다음과 같다.

실시예 1에서 정제한 H-서브유닛 페리틴 DNA 절편을 발현벡터인 pGAPZαA에 삽입하고자 제한효소XhoI(Promega)으로 pGAPZαA벡터를 자른 뒤, 아가로즈 젤 상에서 전기영동 후, 효소로 잘린 벡터만을 젤에서 순수 분리, 정제하여 멸균수로 다시 녹였다. 그 뒤, 상기의 효소로 처리된 pCAPZαA벡터와 H-서브유닛 페리틴 cDNA를 섞은 다음 T4 DNA 라이게이즈(Promega)를 첨가하여 15 ℃에서 3시간 반응시켰다. 그리고 칼슘클로라이드 방법으로 대장균 균주 Top10 F'에 pGAPZαA/rHN를 형질전환시킨 후, 형질전환체를 항생물질인 제오신 포함 저염(low salt) LB 평판배지(1 ％ 트립톤, 0.5 ％ 효모 추출액, 0.5 ％ 염화나트륨, 1.5％ 아가)에서 선별하였다. 선별된 클론은 PCR과 제한효소처리를 통한 검증실험으로 확인하였고, 최종적으로 인간 H-서브유닛 페리틴 cDNA가 삽입된 재조합 벡터(pGAPZαA/rHN)와 형질전환체(pGAPZαA/rHN,E. coliTOP10 F')를 확보하였다.

(2) 재조합 벡터의 피키아 파스토리스로의 형질전환

pGAPZαA/rhHFN 벡터를 피키아 파스토리스로 도입하기 위해 제한효소AvrⅡ(New England Biolabs)을 pGAPZαA/rHN에 처리하여 선형화한 뒤, 이를 Qiagen사의 진클린 키트로 순수 정제하여 다시 3차 멸균수로 녹였다. 피키아 파스토리스 X-33 세포에 재조합한 pGAPZαA/rHN 벡터의 형질 전환법은 다음과 같다. 먼저 상기의 pGAPZαA/rHN 벡터 및 인비트로젠사의 이지컴 키트(Easycomp kit: 상품명)를 이용하여 리튬 클로라이드 (LiCl) 방법으로 제조시약 및 방법에 의해 피키아 파스토리스 X-33 세포를 형질전환시켰다. 피키아 파스토리스 X-33 단일 콜로니를 YPD 배지 10 ㎖에 접종후 28 - 30 ℃에서 250 - 300 rpm으로 12 - 15시간 동안 진탕 배양하였다. 이 진탕 배양한 배양액을 YPD 배지 10 ㎖에 흡광도(OD₆₀₀) 0.1 - 0.2정도로 희석한 후 28 - 30 ℃에서 미드-로그 상태(mid-log phase)까지 배양하여 500 x g로 수득한 후 용액 I(DMSO, 에틸렌 글리콜) 10 ㎖에 재부유시킨 후 다시 500 x g로 수득한다. 다시 용액 I 1 ㎖로 재부유시킨 후 1.5 ㎖ 멸균 처리된 튜브에 50 ㎕씩 분주한 후 스트로폼 박스에 담아 장기간 보존을 위해 -80℃에서 천천히 냉동, 보관하였다. 냉동 보관 되었던 피키아 파스토리스 X-33을 천천히 녹인 후 여기에 제한효소Avr Ⅱ처리로 선형화된 약 3 ㎍의 pGAPZαA/rHN DNA을 형질전환시켰다. 피키아 파스토리스 형질전환체의 선별을 위해 사용된 배지는 YPDS Zeo⁺평판배지이며 이의 조성은 1 ％ 효모추출물, 2 ％ 포도당, 2 ％ 펩톤, 1 M 소비톨, 2 ％ 아가, 0.1 mg/㎖ 제오신)이다.AvrII로 선형화된 재조합 DNA는 X-33 게놈의 GAP 프로모터와 제오신 항생제 사이에 삽입되어, GAP 위치의 위, 아래 위치로 하나 또는 그 이상으로 재조합 DNA의 삽입이 일어난다. 그러므로, 재조합 미생물은 pGAPZαA 벡터에 포함된 Zeocin유전자를 발현함으로써 상기의 YPDS Zeo⁺평판배지 상에서 형질전환체를 선별할 수 있었다.

또한, 여기서 일차로 선별된 형질전환체의 염색체 내로 유전자 복수 통합(multicopy integration) 여부를 선별하기 위하여 다양한 농도의 YPD-Zeocin ((1 ％ 효모추출액, 2 ％ 펩톤, 2 ％ 포도당, 다양한 양(0.1-2.0 mg/㎖)의Zeocin)) 평판배지에서 형질전환체를 배양하였다. pGAPZαA 벡터에는 세균에서 유래된 제오신 유전자를 가지고 있으며 이 유전자는 피키아 파스토리스가 제오신 항생제에 대한 내성을 가지게 하는 역할을 한다. pGAPZαA/rHN 재조합 유전자가 피키아 파스토리스 내로 형질전환시 제오신 유전자도 같이 삽입되므로 다수의 유전자가 삽입될수록, 즉, 유전자가 다중 카피로 삽입될수록 제오신 항생제 농도에 비례적인 내성균주가 만들어진다. 다수 유전자 삽입과 단백질 발현량은 절대적 것은 아니나, 보통 비례관계를 가지고 있기 때문에, 2차 균주 선별에서는 제오신 항생제에 대한 높은 내성 균주를 선발하였다. 본 발명에서는 0.1, 1, 2 mg/㎖의 Zeocin 항생제가 들어간 YPDS 평판배지에서 자란 형질전환체가 선별되었으며, 그 중에서도 안정적으로 자란 많은 2 mg/㎖의 Zeocin 항생제가 들어간 YPD-Zeocin 평판배지에서 자란 형질전환체를 선별하였다. 선별된 형질전환 피키아 파스토리스는 미생물 기탁에 관한 부다페스트 조약 하의 기탁 기관인 한국미생물보존센터에 2001년 5월 23일자로 기탁되어 수탁번호 KCCM10279를 수여받았다.

＜실시예 3＞

파키아 파스토리스에서 재조합 H-서브유닛 페리틴의 발현.

실시예 2의 pGAPZαA/rHN 재조합 미생물을 10 ㎖ YPD 배지에 각각 접종 후, 230 rpm으로 30 ℃에서 1일간 배양하였다. 그 뒤, 배양한 재조합 미생물 100 ㎕을 50 ㎕ YPD 배지로 재부유하였다. 재부유액은 배플드 플라스크(baffled flask)에서 200 rpm으로 30 ℃에서 7일간 배양하였다. 배양액은 배양 시간대별(24 hr, 48 hr, 72 hr, 96 hr, 120 hr, 144 hr)로 각각 1 ㎖씩 수득하여 원심분리하고, 상층액만을새 튜브에 모아 다음 분석 전까지 -80 ℃로 얼려 보관하였다. 위에서 준비된 배지 내로 발현, 분비된 H-서브유닛 페리틴 샘플들을 12 ％ SDS-PAGE (sodiumdodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis)로 분석하여 발현유도 후 120 시간이 최적 발현시간대임을 알 수 있었다.

도 2는 발현이 유도된 뒤, 배양 시간대별(96 hr, 120 hr, 144 hr)로 준비된 배양 상층액을 20 ㎕씩 취하여 각각 12 ％ SDS-PAGE에 전기이동하여 시간대별 재조합 H-서브유닛 페리틴의 발현양을 분석한 것이다.

M 은 분자량 표준 단백질을 위에서부터 97, 66, 45, 31, 21, 14 kDa의 분자량순으로 표시한 것이고,

1 번 레인은 재조합 미생물을 연속 발현으로 유도한지 96시간만에 모은 배양 상층액 20 ㎕를 전기영동한 것이고,

2 번 레인은 재조합 미생물을 연속 발현으로 유도한지 120 시간만에 모은 배양 상층액 20 ㎕를 전기영동한 것이고,

3 번 레인은 재조합 미생물을 연속 발현으로 유도한지 144 시간만에 모은 배양 상층액 20 ㎕를 전기영동한 것으로, 당질화 현상으로 21 kDa의 분자량보다 약 3 - 4 kDa가 커진 약 24 kDa의 분자량을 갖는 재조합 H-서브유닛 페리틴이 발현됨을 확인하였다.

＜실시예 4＞

재조합 단백질 H-서브유닛 페리틴의 어셈블리(assembly)확인.

실시예 3의 피키아 파스토리스에서 발현되어 배지 내로 분비된 재조합 H-서브유닛 페리틴의 어셈블리를 확인하고자 7.5 ％ 네이티브-PAGE에 전기이동하여 확인하였다.

도 3은 본 발명의 재조합 단백질 H-서브유닛 페리틴의 어셈블리를 7.5 ％ 네이티브-PAGE상에서 확인한 것이다.

HSF 는 말 췌장에서 분리, 정제된 페리틴(Horse spleen ferritin)의 분자량을 표지한 것이고,

1 - 4번 레인은 재조합 미생물을 연속 발현으로 유도한지 120 시간만에 모은 배양 상층액 20 ㎕씩을 전기영동한 것이다.

＜실시예 5＞

재조합 단백질 H-서브유닛 페리틴 철 결합성 확인.

실시예 3의 피키아 파스토리스에서 발현되어 배지 내로 분비된 재조합 H-서브유닛 페리틴의 철 결합능을 확인하고자 하기 1 mM 페로스 암모니움 썰페이트(ferrous ammonium sulfate) 소량을 시료에 첨가한 후 상온에서 1시간 동안 반응시켰다.

반응에서 사용된 페로스 암모니움 썰페이트는 쥰세이사(Junsei, Japan)의 것을 이용하였다.

도 4는 본 발명의 재조합 단백질 H-서브유닛 페리틴의 철 결합력을 7.5 ％ 네이티브-PAGE를 실행한 후 프러시안 염색(Prussian staining)한 것이다.

1 - 4번 레인은 재조합 미생물을 연속 발현으로 유도한지 120 시간만에 모은 배양 상층액 20 ㎕씩을 1 mM 페로스 암모니움 썰페이트와 1시간 반응시킨 후 전기영동한 것이다.

본 발명의 재조합 단백질 H-서브유닛 페리틴이 철 원소 존재시 철과 결합하여 단백질내로 저장함으로써 그 결과 철 코어(Core)가 형성됨을 확인하였다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 재조합 인간 H-서브유닛 페리틴 유전자를 포함하는 피키아 파스토리스 유래의 연속 발현 벡터가 형질전환된 피키아 파스토리스에 의하면, 철 결합능을 가진 재조합 인간 H-서브유닛 페리틴을 대량으로 발현하여 수득할 수 있다. 또한 본 발명의 재조합 발현기술을 이용하면 말 비장과 같은 원천으로부터 단백질을 분리, 정제하는 단계에서 우려되는 세균과 바이러스 감염의 위험성과 말 비장 공급이 간헐적인데서 오는 원료공급상의 제약을 배제할 수 있다. 그리고, 빈혈제제의 수요 증가 추세와 각종 질환에 대한 보조제로서 새로운 적용증이 창출되는 바, 본 기술은 궁극적으로 인간 H-사슬 페리틴을 안전하고 저렴한 가격으로 시장에 공급할 수 있다.

Claims

인간 H-서브유닛 페리틴 유전자를 포함하는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 유래의 발현 벡터 pGAPZαA/rHN으로 형질전환된 유전자 재조합 피키아 파스토리스(수탁번호: KCCM10279)
서열번호 2 및 서열번호 3으로 기재되는 프라이머 쌍으로 부터 증폭된 인간 H-서브유닛 페리틴 유전자를 포함함을 특징으로 하는, pGAPZαA, pPICZ, pPICZαA, B, C, pPICZ-E, pPICZα-E, pPIC6, pPIC6αA, B, C, pGAPZ, pPIC9K, pPIC3.5K, pAO815, pHIL-D2 및 pHIL-S1으로 구성된 군으로부터 선택되는 피키아 파스토리스 유래의 재조합 발현 벡터의 제조방법
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 인간 H-서브유닛 페리틴 유전자가 인간의 간으로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 발현 벡터
제1항 내지 제3항의 벡터 및 유전자 재조합 피키아 파스토리스를 이용하여 제조된 재조합 인간 H-서브유닛 페리틴
제4항에 있어서, 상기 재조합 인간 H-서브유닛 페리틴은 분자량 24,000의 H-서브유닛이 24개 결합된 분자량 576,000의 동형질체 (homopolymer)인 것을 특징으로 하는 페리틴
(1) 제1항 또는 제2항에 따른 발현 벡터로 피키아 파스토리스를 형질전환시키는 단계;

(2) 형질전환된 피키아 파스토리스를 제오신 포함 배지에서 배양하여 그의 게놈 내에 인간 H-서브유닛 페리틴 유전자가 다중 카피로 통합된 형질전환체를 선별하는 단계;

(3) (2)에서 수득된 형질전환체를 단백질 결핍 배지에서 배양하여 인간 H-서브유닛 페리틴 유전자를 발현시킴으로써 배양 배지 내로 인간 H-서브유닛 페리틴 단백질이 분비되게 하는 단계; 및

(4) 분비 단백질을 정제하는 단계

를 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 H-서브유닛 페리틴의 대량 생산 방법
제4항에 따른 피키아 파스토리스에 의해 생산된 재조합 인간 H-서브유닛 페리틴을 함유하는 것을 특징으로 하는 빈혈예방 및 치료용 조성물
제7항에 있어서, 인간 H-서브유닛 페리틴을 140 내지 170 mg함유하는 것을 특징으로 하는 조성물
서열번호 1로 기재되는 인간의 간 H-서브유닛 페리틴을 암호화하는 cDNA 염기서열과 아미노산 서열