KR20020086812A - A new Myrothecium roridum Tode ex Fries F000252(KCTC 0980BP), and its use - Google Patents

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Abstract

PURPOSE: Provided are a new Myrothecium roridum Tode ex Fries F000252(KCTC 0980BP) which shows herbicidal activity to paddy weeds, and its use as a biocontrol agent. CONSTITUTION: The new Myrothecium roridum Tode ex Fries F000252(KCTC 0980BP) is characteristically separated by collecting a soil sample and dilution plating the sample on a potato dextrose agar medium or a Littman oxgall agar medium and separating a microorganism showing in vivo and in vitro herbicidal activity to paddy weeds. The biocontrol agent comprises the Myrothecium roridum To de ex Fries F000252(KCTC 0980BP), its culture liquid or extract, and an agriculturally acceptable carrier.

Description

신균주 미로쎄시움 로리둠 F000252(KCTC 0980BP)및 이의 용도{A new Myrothecium roridum Tode ex Fries F000252(KCTC 0980BP), and its use}A new Myrothecium roridum Tode ex Fries F000252 (KCTC 0980BP), and its use}

본 발명은 신균주 미로쎄시움 로리둠(Myrothecium roridumTode ex Fries) KF000252(KCTC 0980BP) 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 불완전균류인 하이포마이세테(Hyphomycete) 강(綱)에 속하는 미로쎄시움 로리둠(Myrothecium roridumTode ex Fries) F000252(KCTC 0980BP) 균주, 이의 배양액 또는 이의 배양 추출물이 까마중, 자귀풀, 도꼬마리, 메꽃, 토끼풀 등의 밭잡초종과 물달개비 등의 논잡초종에 대하여 제초활성을 나타내고, 또한 식물병에 대한 방제효과도 지님으로써 생물농약(biocontrol agent)으로서 이용 가능한 신균주 미로쎄시움 로리둠 F000252(KCTC 0980BP) 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to Myrothecium roridum Tode ex Fries KF000252 (KCTC 0980BP) and uses thereof, and more particularly, to the mythocysis of the mycoccus myopycete (Hyphomycete) The herbicidal activity of Myrothecium roridum Tode ex Fries F000252 (KCTC 0980BP) strain, its culture or its extracts against non-weed weeds such as field weeds such as black nymphs, silkworms, skewers, buckthorns and shamrocks The present invention also relates to a new strain Myrosium loridium F000252 (KCTC 0980BP) and its use which can be used as a biocontrol agent by having a control effect on plant diseases.

농업생태계에서 잡초종은 대단히 종류가 많고 그 피해는 막대하다. 잡초는 작물의 생장에 필수적인 수분, 영양분, 그리고 태양광선을 작물과 경쟁함으로써 작물의 질과 수량을 저하시켜 작물생산성을 떨어뜨리는 중요한 제한요인이 되고 있다. 현재 잡초방제를 위하여 여러 종류의 유기합성 제초제가 사용되고 있음에도 불구하고 잡초에 의한 작물의 생산 손실은 여전히 많은데 이는 제초제의 지속적 사용에 따른 잡초군락의 생태학적 변화, 제초제 저항성 유발, 그리고 현재 사용되고 있는 제초제로서는 방제가 어려운 새로운 잡초가 발생하기 때문이다. 지금까지 잡초방제를 위해 유기합성 제초제의 다량 사용에 따른 환경오염 및 인축독성 문제가 매우 심각하여 저독성이고 환경에 친화적인 새로운 미생물 제초제의 개발이 요구되어왔다. 그 결과, 지난 30여 년 간 100 여종 이상의 미생물(대부분이 곰팡이)이 잡초 방제효과가 있는 것으로 밝혀졌고, 현재 이 중 10 여종의 미생물제초제(microbial herbicide)가 등록되어 사용되고 있다. 최근 전통적인 방법에 의한 우점 잡초종(dominant weed species)의 방제는 한계에 와 있으며, 경종적 방법과 병행하여 생물학적 방제법을 사용해야 한다는 필요성이 대두되면서 생물 제제의 사용이 선택적 잡초관리 및 방제는 물론 지구생물 다양성 보존 차원에서 매우 적절한 방제방법으로 받아들여지고 있다.Weed species in agricultural ecosystems are very numerous and the damage is enormous. Weeds are an important limiting factor in reducing crop productivity by competing with crops for the moisture, nutrients, and sunlight that are essential for crop growth. Although various types of organic synthetic herbicides are currently used for weed control, the production loss of crops by weeds is still high, which is due to the ecological changes of weed colonies, herbicide resistance, and the current herbicides. This is because new weeds are difficult to control. Until now, the development of new microbial herbicides with low toxicity and environment friendliness has been required due to the serious pollution and human toxicity problems caused by the large use of organic synthetic herbicides for weed control. As a result, more than 100 kinds of microorganisms (mostly fungi) have been found to have a weed control effect in the past 30 years, and about 10 kinds of microbial herbicides are currently registered and used. In recent years, the control of dominant weed species by traditional methods has reached its limit, and the necessity of using biological control methods in parallel with the seedling method has emerged. In terms of preservation of diversity, it is a very appropriate control method.

현재 병원성 미생물을 이용한 미생물 제초제의 개발과 관련 보고된 균주로서는 시클포드(sicklepod) 방제용으로서 알터나리아 카시아(Alternaria cassiae), 스퍼드 아노다(spurred anoda) 방제용으로서 알터나리아 마크로스포라(Alternaria macrospora), 이탤리안 티슬(Italian thistle) 방제용으로서 알터나리아 속(Alternariasp.), 프릭크리 시다(prickly sida) 방제용으로서 콜레토트리쿰 말바리움(Colletotrichum malvarium), 벨벳리프(velvetleaf) 방제용으로서 푸사리움 레터리툼(Fusarium lateritium), 텍사스 가드(Texas gourd) 방제용으로서 푸사리움 솔라니(Fusarium solani), 존슨그라스(Johnsongrass) 방제용으로서 필로스틱타 속(Phyllostictasp.), 감귤밭의 밀크위드 바인(milkweed vine) 방제용으로서 파이토프또라 팔미보라(Phytophthora palmivora), 논의 콩과식물인 자귀풀 (Aeschynomene) 방제용으로서 콜레토트리쿰 글로에오스포리오이데스(Colletotrichum gloeosporioides), 아제라티나 리파리아(Ageratina riparia) 방제용으로서 엔타이로마 에이저라티나(Entyloma ageratinae), 아카시아 살리그나(Acacia saligna) 방제용으로서 유로마이클라디움(Uromycladium), 크립토스테기아 그란디플로라(Cryptostegia grandiflora) 방제용으로서 마라발리아 크립토스테지아(Maravalia cryptostegiae) 등이 이용되고 있다.As reported in connection with the development of microbial herbicides using the current pathogenic microorganism strain Sickle Pod (sicklepod) control as Alterna Ria Cassia (Alternaria cassiae), Spud cyano is (spurred anoda) as for the control Alterna Ria MACROSS Fora (Alternaria for macrospora ), Alternaria sp. for Italian thistle control, Colletotrichum malvarium , velvetleaf for control of prickly sida Fusarium lateritium for the control, Texas gourd Fusarium solani for the control, Phyllosticta sp., The citrus field for the control of the Johnsongrass. milk Weed bar (milkweed vine) as a control for the pie Saratov ttora palmitate Bora (Phytophthora palmivora), Colle Saturday as discussed leguminous plants for the Aeschynomene indica (Aeschynomene) control Tree Qom global Eos Forest cucumber Death (Colletotrichum gloeosporioides), azelaic Tina Lipa Ria (Ageratina riparia) As for controlling Yen Thai Roma teenager Latina (Entyloma ageratinae), Acacia live League or (Acacia saligna) As for controlling flow My Cloud Stadium ( For the control of Uromycladium and Cryptostegia grandiflora , Maravalia cryptostegiae and the like are used.

한편, 국내에서는 에피코코소루스(Epicoccosorus) 균주를 이용하여 논잡초의 하나인 올방개를 방제할 수 있는 미생물 제초제가 특허 출원된 바 있으며, 논잡초 가운데 가장 문제가 되는 피를 방제하기 위하여 엑세로힐룸 모노세라스(Exserohilum monoceras) 균주를 분리하고 이를 이용하고자 하는 연구가 진행되고 있다. 또한, 벗풀과 올미의 방제를 위한 플렉토스포리움(Plectosporium tabacinum)을 이용한 생물 제제의 개발이 시도되고있다. 1991년에는 역병 증상을 나타내는 칡 병반을 수집하여 파이토프또라 에리뜨로셉티카(Phytophthora erythroseptica) 역병균주를 분리하고, 이 역병균의 포자를 재접종하여 발병정도를 관찰하고 생물 제제로서의 가능성을 제시한 바 있다. 최근 한국생명공학연구원에서는 토끼풀(Trifolium repens), 까마중(Solanum nigrum), 자귀풀(Aeschynomene indica), 도꼬마리(Xanthium strimarium), 메꽃(Calystegia japonica) 등 몇 종류의 밭잡초를 효과적으로 방제할 수 있는 페니실리움 옥살리쿰(Penicillium oxalicum) 균주를 선발하여 초지용 미생물 제초제로서 개발하고 특허를 획득하는 등 밭잡초 방제용 미생물제초제로서의 활용 가능성을 보여주고 있다.On the other hand, in Korea, a microbial herbicide has been patented to control the alligator , one of the weeds using Epicoccosorus strain, and Exero Hill Room to control the most problematic blood among the weeds. A study is being conducted to isolate and use a monosera strain ( Exserohilum monoceras ). In addition, the development of biologics using Plectosporium tabacinum for the control of peel and snare has been attempted. In 1991, ill lesions showing symptoms of late blight were collected to isolate Phytophthora erythroseptica late blight strains, and the spores of the late blight were re-inoculated to observe the incidence and suggest potential as biologics. I've done it. Recently, the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology has been able to effectively control several types of field weeds, such as shamrock ( Trifolium repens ), Solanum nigrum , Aeschynomene indica , Xanthium strimarium , and Calystegia japonica . Oxalicum strain (Penicillium oxalicum ) strains have been selected and developed as a microbial herbicide for grasslands , and shows the possibility of application as a microbial herbicide for field weed control.

한편, 미국 농업연구국(ARS) 잡초연구팀은 문제잡초인 시클포드(sicklepod)식물에서 분리한 미로쎄시움 베루카리아(Myrothecium verucarria) 균주를 이용하여 미남부지방의 토마토 재배지역에서 문제시되고 있는 칡을 방제고자 하였다. 또한, 미로쎄시움균을 이용 토마토 재배에서 매우 문제시되는 잡초종인 쇠비름과 대극류 방제에 적용한 바 있다. 또한, 푸사리움 솔라니(Fusarium solani)와 콜레토트리쿰 트룬카툼(Colletotrichum truncatum)과 같은 곰팡이를 조합하여 잡초를 방제하는 연구를 진행시키고 있다. 이러한 미생물 제초제는 기존의 합성제초제인 메틸브로마이드(methylbromide)를 대체할 수 있는 자연친화적인 방제법으로 받아들여지고 있다. 또한, 1997년 미국 농무부(USDA)의 Yang과 Brenner는 털비름(Amaranthus retroflexus)에 대한 3종의 미로쎄시움 균주(Myrotheciumsp.)의 병원성과 기주범위 등을 조사하여 잡초방제 가능성이 있음을 시사한 바 있다.그러나, 국내에서는 아직까지 미로쎄시움균을 이용한 생물학적 잡초방제를 위한 연구는 시도된 바 없다.Meanwhile, the US Department of Agricultural Research (ARS) Weed Research Team is using a Myrothecium verucarria strain isolated from the problem weed, Sicklepod , to trouble the tomato growing region in the southwestern United States. To control. In addition, it has been applied to the control of purslane and tropospheric weed species, which are very problematic in tomato cultivation using myrosium bacteria. In addition, research is being conducted to control weeds by combining fungi such as Fusarium solani and Colletotrichum truncatum . Such microbial herbicides have been accepted as a natural control method that can replace methyl bromide, a conventional synthetic herbicide. In addition, in 1997, USDA's Yang and Brenner suggested the possibility of weed control by investigating the pathogenicity and host range of three Myrothecium sp. Strains against Amaranthus retroflexus . However, there have been no attempts to control biological weeds using myrosium bacteria in Korea.

이에, 본 발명자들은 토양유래 미생물을 이용하여 국내 주요 잡초종을 생물학적인 방법으로 방제하는 방법을 연구 개발하던 중, 국내 잡초종에 대해 높은 제초효과를 나타내는 신균주를 분리하였으며, 동정 결과 미로쎄시움 로리둠임을 확인하였다. 본 발명자들은 이 균주 자체(포자 등)를 접종하여 제초 활성효과를 얻음은 물론 균 배양액 및 그 추출물을 이용하여 잡초방제 및 식물병방제 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.Therefore, the present inventors, while researching and developing a method for controlling the major domestic weed species by biological methods using soil-derived microorganisms, separated the new strains showing a high herbicidal effect on the domestic weed species, the identification result I confirmed it was Lori Doom. The present inventors have completed the present invention by inoculating the strain itself (spores, etc.) to obtain the herbicidal activity effect, as well as confirming the effect of weed control and plant disease control using the bacterial culture solution and its extract.

따라서, 본 발명은 잡초종에 대하여 선택적 제초효과를 나타내는 하이포마이세테 강 곰팡이에 속하는 미로쎄시움 로리둠 F000252(KCTC 0980BP) 균주 자체가 논 및 밭잡초방제를 위한 환경친화형 미생물 제제원으로서 제공됨은 물론 그 배양액 및 배양추출물을 이용한 잡초 및 식물병 방제를 하는데 그 목적이 있다.Therefore, the present invention is that the Myersium Lorydum F000252 (KCTC 0980BP) strains belonging to the Hypomycete fungi exhibiting selective herbicidal effect against weed species are provided as an environmentally friendly microbial agent for paddy and field weed control. Of course, the purpose of the control of weeds and plant diseases using the culture solution and culture extract.

도 1은 미로쎄시움 로리둠 F000252(KCTC 0980BP) 균주의 소병자포자 형태를 보여주는 사진이다.Figure 1 is a photograph showing the small spore spore morphology of the myroseceum Loridum F000252 (KCTC 0980BP) strain.

도 2는 미로쎄시움 로리둠 F000252(KCTC 0980BP) 균주의 소병자 형태를 보여주는 사진이다.Figure 2 is a photograph showing the microbial morphology of the myrosium loridium F000252 (KCTC 0980BP) strain.

도 3은 미로쎄시움 로리둠 F000252(KCTC 0980BP) 균주의 온도 및 수분활성 조건에 따른 균사생장을 보여주는 그래프이다.Figure 3 is a graph showing the mycelial growth according to the temperature and water activity conditions of the myrosium loridium F000252 (KCTC 0980BP) strain.

도 4는 미로쎄시움 로리둠 F000252(KCTC 0980BP) 균주 배양액의 좀개구리밥(Lemna paucicostata)에 대한 제초활성을 나타낸 그래프이다[제초지수는 1 ∼ 5범위이며 5는 완전저해를 나타냄].Figure 4 is a graph showing the herbicidal activity against Lemna paucicostata ( Lmna paucicostata ) of the mycecium Loridum F000252 (KCTC 0980BP) strain culture (the herb index is in the range of 1 to 5, 5 represents complete inhibition).

도 5는 미로쎄시움 로리둠 F000252(KCTC 0980BP)균주 배양액 용매추출물의 좀개구리밥에 대한 제초활성을 나타낸 그래프이다[제초지수는 1 ∼ 5범위이며 5는 완전저해를 나타냄].5 is a graph showing the herbicidal activity of the extract of the myrosium Loridum F000252 (KCTC 0980BP) strain culture extract against the frog frog rice (herb index is in the range of 1 to 5, 5 represents complete inhibition).

도 6은 습지가 깔려있는 페트리디쉬(petri dish) 상에서 미로쎄시움 로리둠F000252(KCTC 0980BP) 균주의 라디노클로버 종피감염에 의한 종자발아억제 활성을 보여주는 사진이다.Figure 6 is a photograph showing the seed germination inhibitory activity by radianoclover epithelial infection of the myroseium Loridum F000252 (KCTC 0980BP) strain on a petri dish (wet).

도 7은 미로쎄시움 로리둠 F000252(KCTC 0980BP) 균주에 의해 라디노클로버가 심하게 종피감염된 것을 보여주는 사진이다.FIG. 7 is a photograph showing that the radinoclover was severely epithelially infected by the mycecidium lorydum F000252 (KCTC 0980BP) strain.

도 8은 미로쎄시움 로리둠 F000252(KCTC 0980BP) 균주의 라디노클로버 종피감염에 의한 떡잎 침입과정을 보여주는 사진이다.Figure 8 is a photograph showing the cotyledon invasion process by radianoclover epithelial infection of the myroseceum Loridum F000252 (KCTC 0980BP) strain.

도 9는 미로쎄시움 로리둠 F000252(KCTC 0980BP) 균주 배양액의 밭잡초종에 대한in vivo제초활성 범위를 보여주는 그래프이다.Figure 9 is a graph showing the in vivo herbicidal activity range for the field weed species of the myroseium Lori dom F000252 (KCTC 0980BP) strain culture.

도 10은 미로쎄시움 로리둠 F000252(KCTC 0980BP) 균주 배양액의 논잡초종에 대한in vivo제초활성 범위를 보여주는 그래프이다.FIG. 10 is a graph showing the in vivo herbicidal activity range for nonweed weeds of Myrosium loridium F000252 (KCTC 0980BP) strain culture.

본 발명은 신균주 미로쎄시움 로리둠 F000252(KCTC 0980BP)를 그 특징으로 한다.The present invention is characterized by the new strain Mirosedium loridium F000252 (KCTC 0980BP).

또한, 미로쎄시움 로리둠 F000252(KCTC 0980BP) 균주, 이의 배양액 및 이의 배양 추출물이 제초활성과 식물병 방제효과가 있음을 확인하고 생물농약으로서의이용가능성을 포함한다.In addition, it was confirmed that the myroseceum Loridum F000252 (KCTC 0980BP) strain, its culture solution and its culture extract have herbicidal activity and plant disease control effect, and include the potential as biopesticides.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.Referring to the present invention in more detail as follows.

잡초 방제를 위한 새로운 미생물을 탐색하고자 전국 각지로부터 많은 토양시료를 수집하고, 수집한 토양시료로부터 감자 한천(potato dextrose agar)배지 및 리트만 옥스갈 한천(Littman oxgall agar) 배지를 이용하여 희석평판(dilution plating)법으로 균을 분리하였으며 잡초종에 대하여in vitroin vivo제초활성을 조사하고 이로부터 고도의 제초활성을 나타내는 균주를 선발한다.In order to explore new microorganisms for weed control, many soil samples are collected from all over the country, and dilution is carried out from the collected soil samples using potato dextrose agar medium and Litman oxgall agar medium. Bacteria were isolated by plating method, and weeds were tested for in vitro and in vivo herbicidal activity, and strains showing high herbicidal activity were selected.

제초활성 검정은 렘나 파우시코스타타(Lemna paucicostata) 및 라디노클로버(Ladino clover) 등의in vitro생물검정을 통하여 특이적이고 고도의 제초활성을 갖는 균주가 일차적으로 선발되었으며, 선발된 균주를 이용하여in vivopot 실험 등을 실시하여 생물농약 개발 잠재성을 평가하였다.The herbicidal assays were primarily selected for specific and highly herbicidal strains through in vitro bioassays such as Lemna paucicostata and Ladino clover. In vivo pot experiments were conducted to evaluate the potential for biopesticide development.

상기 균주의 동정 및 배양에 관하여 설명하면 다음과 같다.Referring to the identification and culture of the strain is as follows.

가. 균주의 분리, 배양 및 동정end. Isolation, Culture and Identification of Strains

1) 균의 분리 및 동정1) Isolation and Identification of Bacteria

분리된 곰팡이 균주의 분리와 동정은 감자 한천(potato dextrose agar), 리트만 옥스갈 한천(Littman's oxgall agar)배지, 맥아즙 한천(malt extract agar)배지를 사용하여 실시하며, Dematiaceous Hyphomycetes[M. B. Ellis 저], Compendium of Soil Fungi[D. M. Anderson 저], Soil and Seed Fungi[T. Watanabe 저] 등을 참조한다. 특히, 본 균주의 분생포자좌(sporodochia),분생포자병(conidiophore), 소병자(phialide), 소병자포자(phialoconidia) 및 균사(mycelia) 등의 형태적 특징을 광학 현미경으로 관찰한 후 동정한다.Isolation and identification of isolated fungal strains were carried out using potato agar, Potato dextrose agar, Litman's oxgall agar and malt extract agar. Dematiaceous Hyphomycetes [M. By B. Ellis, Compendium of Soil Fungi [D. By M. Anderson, Soil and Seed Fungi [T. See Watanabe et al. In particular, the morphological characteristics of sporodochia, conidiophore, phialide, phialoconidia, and mycelia of the present strains are identified after optical microscopy. .

2) 균의 배양적 특성2) Culture Characteristics of Bacteria

분리된 균의 균사생장은 감자 한천(potato dextrose agar) 및 몰트 한천(malt extract agar) 배지를 사용하여 조사한다. 또한,in vitroin vivo활성검정에 사용할 액체 배양액은 감자즙액(potato dextrose broth) 및 이스트-펩톤-설탕용액[yeast-peptone-sucrose solution(YpSs)] 배지를 사용하여 25 ℃에서 7일간 배양한 것을 사용한다. 즉, 액체배양시는 감자 20%, 가용성 녹말 10%를 함유한 감자즙액(potato dextrose broth) 배지(pH 7.2)와 거친 콩가루 25%, 육즙 1%, 효모추출액 4%, NaCl 2%, K2HPO40.25%, CaCO32%를 함유한 이스트-펩톤-설탕용액 배지(pH 7.2)를 사용한다. 배양체의 준비는 500 ㎖의 배플드 플라스크(baffled flask) 2개에 각각 50 ㎖씩 분주한 액체배지를 121 ℃에서 20분간 살균하고, 이것에 균주의 한천 조각(agar plug)을 접종하고 28 ℃, 150 rpm에서 2일간 진탕 배양하여 사용한다. 고체배양시는 밀기울(wheat bran) 200 g에 멸균수 120 ∼ 200 ㎖을 부어 밀기울에 수분이 완전히 스며들도록 한 다음 삼각플라스크(1 ℓ)에 넣어 121 ℃에서 30분간 멸균하고, 충분히 식힌 다음 균을 접종한다. 그 후 25 ℃에서 10 ∼ 14 일간 배양하여 포자가 충분히 형성되도록 한다.Mycelial growth of isolated bacteria is investigated using potato dextrose agar and malt extract agar medium. In addition, the liquid culture medium to be used for in vitro and in vivo activity assays was incubated at 25 ° C. for 7 days using potato dextrose broth and yeast-peptone-sucrose solution (YpSs). Use it. That is, in liquid culture, potato dextrose broth medium containing 20% potato and 10% soluble starch (pH 7.2), coarse soy flour 25%, gravy 1%, yeast extract 4%, NaCl 2%, K 2 East-peptone-sugar solution medium (pH 7.2) containing 0.25% HPO 4 , 2% CaCO 3 is used. For the preparation of the culture, two 500 ml baffled flasks (50 ml each) were sterilized for 20 minutes at 121 ° C, and the agar plugs of the strain were inoculated at 28 ° C, Shake culture is used for 2 days at 150 rpm. In solid culture, pour 120 ~ 200 ml of sterile water into 200 g of wheat bran to completely soak the bran into water, and then put it in a Erlenmeyer flask (1 L) for 30 minutes at 121 ° C, cool it thoroughly Inoculate. Thereafter, incubated at 25 ° C. for 10 to 14 days to ensure sufficient spore formation.

나. 접종원의 제조I. Production of inoculator

접종원은 액체배양체와 담체기질을 이용한 고체배양체로부터 얻어진다. 첫째, 액체배양체는 앞서 설명한 바와 같이 이스트-펩톤-설탕용액 배지(YpSs)(pH 7.2)를 사용한다. 액체배양체 접종방법은 균을 접종한 후 배양한 후 얻은 배양액을 이용하는 방법으로서, 이미 균의 대사산물은 물론 균사와 포자 등의 균체가 상당량 포함된 배양액 자체가 접종원으로 이용되는 것이다. 균 접종을 위하여는 배양액내 균사체 및 펠렛(pellet)을 일정크기로 갈아 분무기를 통해 분무가능하도록 하며 tween 20 등을 미량 섞어 균체가 쉽게 잘 퍼지도록 하며, 또한 접종원이 작용점에 도달한 후에도 잘 정착할 수 있도록 한다.Inoculum is obtained from a liquid culture and a solid culture using a carrier substrate. First, the liquid culture medium uses yeast-peptone-sugar solution medium (YpSs) (pH 7.2) as described above. The liquid culture inoculation method is a method of using a culture solution obtained after inoculation after inoculation of bacteria, and a culture solution itself containing a considerable amount of bacteria, such as mycelia and spores, as well as metabolites of bacteria is used as the inoculum. For inoculation, the mycelium and pellets in the culture medium are changed to a certain size so that they can be sprayed through a nebulizer, and a small amount of tween 20 or the like is mixed to spread the bacteria easily. To be able.

둘째로, 밀기울 등 담체로 만들어진 제제를 접종원으로 사용하는 것이다. 포장에서의 안전성과 지속적인 제초활성을 유지하도록 하기 위하여 농학적 허용 담체 등을 이용하여 미생물제초제로 제제화한다. 생물농약 제제화를 위한 담체로는 쌀기울, 밀기울, 보리기울, 밀짚, 보리짚, 볏짚 등을 사용할 수 있다. 밀기울 고체배지는 특정한 영양원을 밀기울 등에 첨가하고 기질: 수분함량 비율을 3:5, 4:5, 5:5(v/v)로 조정한 후 균을 접종하고 균배양체에 옥수수전분을 이용하여 젤라틴화 된 것을 첨가하여 섞은 후 응고시키고 이를 분쇄, 건조 등의 방법을 통하여 제제화한다. 상기의 조성물을 정리하면, 미로쎄시움균의 포자와 밀기울 25%, 옥수수전분2.5%, 한천 0.9% 등의 비교적 저렴하고 간단한 조성물을 함유하고 있다. 미생물 제초제의 미생물 포자 농도범위는 그램당 105∼ 1010포자를 사용하며, 일반적으로 사용되는 유효농도는 그램당 105∼ 108포자농도이다.Secondly, a preparation made of a carrier such as bran is used as an inoculum. In order to maintain safety and continuous herbicidal activity in the packaging, it is formulated with a microbial herbicide using an agriculturally acceptable carrier. Examples of carriers for biopesticide formulation may include rice bran, wheat bran, barley bran, straw, barley straw, rice straw and the like. Bran solid medium adds specific nutrients to bran and adjusts the substrate: moisture ratio to 3: 5, 4: 5, 5: 5 (v / v), inoculates the bacteria, and adds gelatin to the cultures using corn starch. It is added by mixing and coagulation, and then formulated by pulverizing and drying. In summary, the composition contains relatively inexpensive and simple compositions, such as spores of wheat microorganism and 25% of wheat bran, 2.5% of corn starch, and 0.9% of agar. The microbial spore concentration range of the microbial herbicide uses 10 5 to 10 10 spores per gram, and the effective concentration generally used is 10 5 to 10 8 spore concentrations per gram.

본 발명에서는 미생물 제초제로 사용시 용량은 미로쎄시움 로리둠 균주의 포자량을 108포자/g으로 계산하여 1a당 미생물 제초제 80 ∼ 90g 정도를 사용하는 것이 적당하다.In the present invention, when used as a microbial herbicide, it is appropriate to use 80 to 90 g of microbial herbicide per 1a by calculating the amount of spores of the myrosium loridium strain as 10 8 spores / g.

셋째, 배양추출물은 상기 액체배양체를 이용하여 에틸아세테이트(ethyl acetate)로 용매 추출하고 이를 다시 감압농축한 후 동결건조하여 얻는다. 본 발명에서는 추출액을 농축하여 농축액을 0.1 ∼ 100 ppm의 농도별로 조정하여 렘마 분석법(Lemnaassay) 등을 실시한다.Third, the culture extract is obtained by solvent extraction with ethyl acetate using the liquid culture medium, concentrated again under reduced pressure, and lyophilized. In the present invention, the extract is concentrated, and the concentrate is adjusted for each concentration of 0.1 to 100 ppm to perform a Lemna assay or the like.

다. 제초활성 검정All. Herbicidal activity assay

분리된 균주에 대해 소형 pot를 이용하여 공시 14종의 잡초종에 대하여in vitroin vivo활성검정을 실시한다.In vitro and in vivo activity assays were performed on 14 weed species using small pots.

1)in vitro활성검정1) In vitro activity assay

분리균의in vitro제초활성 실험은 렘나 분석법 및 라디노클로버(ladino clover) 종자발아 저해법을 통하여 실시한다. 먼저, 렘나 분석법은 좀개구리밥의 일종이며 미니플랜트인 렘나 파우시코스타타를 이용한 검정방법으로 균주 배양액 또는 추출액을 농도별로 희석하여 렘나가 자라는 24 웰의 플레이트에 치상하여 5일 후 렘나의 생육저해여부를 조사하는 방법이다. 제초활성지수는 0 ∼ 5의수리점수를 두었으며 렘나의 생육저해율에 따라 결정된다. 즉, 활성지수는 다음과 같다.In vitro herbicidal activity of the isolates was carried out by remna assay and ladino clover seed germination. First, remna analysis is a kind of moth frog rice, assay using a mini plant rem or fausciuta. Diluting strain culture or extract by concentration, it is placed on a 24 well plate in which remna grows. How to investigate. The herbicidal activity index has a repair score of 0 to 5 and is determined by the rate of growth inhibition of Lemma. That is, the activity index is as follows.

<10% 생육저해: 0, 11 ∼ 30% 생육저해: 1, 31 ∼ 50% 생육저해: 2, 51 ∼ 70% 생육저해: 3, 71 ∼ 90% 생육저해: 4, 91 ∼100% 생육저해: 5><10% Growth Inhibition: 0, 11-30% Growth Inhibition: 1, 31-50% Growth Inhibition: 2, 51-70% Growth Inhibition: 3, 71-90% Growth Inhibition: 4, 91-100% Growth Inhibition : 5>

한편, 렘나를 이용한 제초활성 조사는 무균의 허트너 영양배지(Hutner's nutrient medium)에서 검정한다. 둘째로, 라디노클로버 종자발아법은 라디노 클로버 종자를 습실 처리된 플레이트 상에 깔고 그 위에 균을 접종 처리한 후 종자발아 및 유묘신장 정도를 조사하는 것과, 3 ∼ 4 일간 미리 종자발아를 유도시킨 후 유묘체에 직접 균을 접종 처리하는 방법이다. 즉, 여과지 3장을 살균수에 묻혀 플레이트에 깐 후 이 위에 병원균 포자(포자현탁액은 0.1% Tween 20이 포함된 살균수 용액에서 희석됨)를 ㎖당 105∼ 108농도로 균포자를 일정농도로 처리하고 광이 쪼이는 습실 배양기에서 치상하는 방법이다.On the other hand, the herbicidal activity using remna is assayed in sterile Hutner's nutrient medium. Secondly, radianoclover seed germination method is to inoculate the seed on the wet plate and inoculate the bacteria on the wet plate, and to check the seed germination and seedling height, and induce seed germination in 3-4 days in advance. This is a method of inoculating bacteria directly to seedlings. That is, three filter papers were immersed in sterilized water and placed on a plate, and then the pathogen spores (spore suspension diluted in a sterilized water solution containing 0.1% Tween 20) were placed at a concentration of 10 5 to 10 8 per ml. It is treated by concentration and dentured in a humidified incubator.

2) 온실 조건하in vivopot 활성 실험2) In vivo pot activity experiment under greenhouse conditions

잡초에 병원성 및 제초 활성이 있는 균주를 선발하기 위하여 1차 스크리닝은 대상잡초(수수, 돌피, 개밀, 바랭이, 미국개기장, 까마중, 자귀풀, 어저귀, 도꼬마리, 메꽂, 바랭이, 돌피, 명아주 및 토끼풀 등)의 잎에 균 배양액 또는 포자 현탁액을 직접 pot에 처리하여 검정한다. 즉, 균 배양액을 여과하지 않고 균질기(homogenizer)를 이용하여 분무기를 통과할 정도로 미세하게 갈아서 사용하며 약제 처리 전까지 냉장고에 보관하면서 스크리닝에 이용한다.In order to select strains with pathogenic and herbicidal activity in weeds, the primary screening is the target weeds (sorghum, dolpi, wheat, barley, American larvae, crows, larvae, tabby, lizard, buckwheat, barley, dolpi, tusks and shamrock The leaves of) are assayed by directly treating the culture medium or spore suspension with pots. In other words, the microbial culture solution is used to grind fine enough to pass through the nebulizer using a homogenizer without filtration and used for screening while being stored in the refrigerator until drug treatment.

In vivo제초활성 검정을 위한 식물체는 멸균되지 않은 사질토양에 적당량의 비료를 혼합시킨 다음, 시험용 폿트(350 cm2)에 담고 파종구를 만들어 잡초 또는 작물종자를 파종한 후 곱게 친 흙으로 복토한 후 온실에서 자란 것을 공시한다. 처리할 배양액(0.1%의 Tween 20 용액)을 손분무기(hand sprayer)로 처리하며 경엽 처리한다.Plants for in vivo herbicidal activity assay should be mixed with an appropriate amount of fertilizer in unsterilized sandy soil, and then placed in a test pot (350 cm 2 ) to make sowing spheres, sowing weeds or crop seeds, and covering them with fine soil. Discuss growing up in the greenhouse. The culture to be treated (0.1% Tween 20 solution) is treated with a hand sprayer and treated with foliage.

배양액을 처리한 후 온실에서 2주일간 생육시키면서 처리 4일 및 14일 후에 나타나는 제초활성 효능을 형태학적, 생리학적 관찰근거에 의해 달관 조사한다. 처리는 발아 전(pre-emergence)과 발아 후(post-emergence)로 나누어 제초활성을 조사한다. 즉, 무방제의 경우를 0%, 완전방제의 경우를 100%로 하여 각각의 제초활성 정도를 평가하는데 70이상의 등급을 가지면 실제적으로 그 식물에 대하여 제초효과가 있는 것으로 간주하며 80%이상의 제초효과를 보인 초종을 방제가능 초종으로 간주한다.After treating the culture solution, the herbicidal efficacy of 4 and 14 days after the treatment for 2 weeks in the greenhouse is investigated by morphological and physiological observations. Treatment is divided into pre-emergence and post-emergence to examine herbicidal activity. In other words, 0% of uncontrolled and 100% of complete control were used to evaluate the degree of herbicidal activity. If it had a grade of 70 or higher, it was regarded as having a herbicidal effect on the plant. Seeds that are indicated as are considered controllable species.

다. 식물병 방제제로서의 특성All. Characteristics as plant disease control

In vivo상에서의 활성검정 방법은 방제대상균에 따라 다음과 같다.The activity assay method in vivo is as follows according to the control bacteria.

?? 벼 도열병 (RSB): 벼도열병균(Pyricularia oryzae) 포자 (106포자/㎖)를 벼 낙동벼 (본엽 2 ∼3엽기)에 흘러내릴 정도로 충분히 분무 접종한다. 접종된 벼는 습실상에서 암상태로 24시간 놓아둔 뒤 상대습도 80%이상 26 ℃인 항온항습실에서5일간 발병시킨 후 병반면적을 조사한다.?? Rice Blight (RSB): Pyricularia oryzae spores (10 6 spores / ml) are spray-inoculated enough to flow down the rice Nakdong rice (two to three leaves). The inoculated rice is left in the dark for 24 hours, and then incubated in a constant temperature and humidity room with a relative humidity of 80% or higher at 26 ° C for 5 days, and then examined the area of disease.

?? 벼 잎집무늬마름병: 배양된 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)의 균사덩어리를 적당히 잘게 마쇄하여 약제처리된 3 ∼ 4 엽기의 낙동벼가 자란 포트에 고르게 접종하여 습실상(25 ℃)에서 1 일간 배양 후 상대습도 80%이상인 항온항습실에서 4일간 발병시킨 다음 잎집에 발병된 병반면적을 조사한다.?? Rice leaf beetle blight: After inoculating the hyphae mass of cultured Rhizoctonia solani into small pieces, the inoculated evenly in the pot where Nakdong rice of 3-4 leaf stage treated with medicinal treatment was incubated for 1 day in a wet room (25 ℃). After 4 days in a constant temperature and humidity room with a relative humidity of more than 80%, the diseased area of the leaf sheath was investigated.

?? 토마토 및 고추 역병: 파이토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans) 및 파이토프토라 캡사이시(Phytophthora capsici)의 포자농도를 105포자낭(sporangia)/㎖로 포자현탁액을 만들어 13 ℃에서 2.5시간 저온 처리하여 유주자를 유출시킨후 약제처리된 토마토 및 고추유묘 (제 2 ∼ 3엽기)에 분무접종한다. 토마토 유묘는 20 ℃ 습실 상에서 48시간 습실처리한 후 20 ℃ 항온항습실상 (상대습도 95% 이상)에서 3일간 발병시킨 다음 병반면적을 조사한다.?? Tomato and Pepper Plague: Spore Concentrations of Phytophthora infestans and Phytophthora capsici were made at 10 5 sporangia / ml and cold treated at 13 ° C. for 2.5 hours. After spilling the strainer, sprayed inoculated to the pharmaceutical treated tomato and pepper seedlings (second to third leaf). Tomato seedlings were treated for 48 hours in a 20 ° C wet room and then incubated for 3 days in a 20 ° C constant temperature and humidity room (relative humidity above 95%), and then examined the area of disease.

?? 밀 붉은녹병: 푸시니아 레콘디타 (Puccinia recondita)는 활물기생균이므로 실험실에서 식물체에 직접 계대배양하면서 밀유묘에 형성된 하포자를 접종원으로 사용한다. 일회용 포트 (6.5 cm)에 5립씩의 밀종자(조광)를 파종하여 온실에서 8일간 재배한 알엽기 밀유묘에 약제처리하고 1일 동안 풍건 시킨 후 포자현탁액(포자 0.67 g/liter)을 분무 접종한다. 접종된 밀유묘는 20 ∼ 23 ℃, 상대습도 70%인 항온항습실상에서 7일간 발병시킨 후 병반면적을 조사한다.?? Wheat rust: Puccinia recondita is a live parasite, so it is used in the laboratory for direct passage to plants, using seedlings formed in wheat seedlings as inoculum. Sowing seeds (light) of 5 grains in a disposable pot (6.5 cm), treated with seedlings seedlings grown for 8 days in a greenhouse, air-dried for 1 day, and then sprayed with a spore suspension (spore 0.67 g / liter) do. Inoculated wheat seedlings are incubated for 7 days in a constant temperature and humidity room of 20-23 ° C. and a relative humidity of 70%, and the lesion area is examined.

?? 보리흰가루병: 에리시페 그라미니스 호르다이(Erysiphe graminisf. sp.hordei)는 절대활물기생균이므로 실험실에서 식물체에 직접 계대배양하면서 보리유묘에 형성된 포자를 접종원으로 사용한다. 일회용 포트 (6.5 cm)에 5립씩의 보리종자를 파종하여 온실에서 8일간 재배된 보리유묘에 약제처리하고 1일 동안 풍건 시킨 후 포자현탁액을 분무 접종한다. 접종된 보리유묘는 18 ∼ 20 ℃, 상대습도 70%인 항온항습실상에서 7일간 발병시킨 후 병반면적을 조사한다.?? Barley powdery disease: Erysiphe graminis f. Sp.hordei is an absolute fungi parasite, so the spores formed on barley seedlings are used as the inoculum during direct passage to plants in the laboratory. Five barley seeds are seeded in a disposable pot (6.5 cm) and treated with barley seedlings grown in a greenhouse for 8 days, air-dried for 1 day, and then sprayed with a spore suspension. Inoculated barley seedlings are incubated for 7 days in a constant temperature and humidity room with a temperature of 18 to 20 ° C. and a relative humidity of 70%.

이하, 본 발명을 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세하게 설명하겠는 바, 본 발명이 다음 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on the following examples, but the present invention is not limited to the following examples.

실시예 1: 신균주 미로쎄시움 로리둠 F000252(KCTC 0980BP)의 분리, 동정 및 배양Example 1: Isolation, Identification and Culture of Mycobacterium myrosesium Rorydum F000252 (KCTC 0980BP)

본 발명자들은 잡초 방제를 위한 새로운 미생물을 탐색하고자 전국 각지로부터 100여 점의 토양시료를 수집하고, 수집한 토양시료로부터 감자 한천(potato dextrose agar)배지 및 리트만 옥스갈 한천(Littman oxgall agar)배지를 이용하여 희석평판법으로 1,000여 균주를 분리하였다. 분리된 곰팡이를 렘나 파우시코스타타 및 라디노클로버 종자발아법 등을 이용한in vitro제초활성 검정을 통하여 활성균주를 일차 선발하고 선발된 균주를 이용하여in vivopot 실험 등을 실시하여 미생물 제제 개발 잠재성 후보 균주로 최종 선발하였다.The present inventors collected more than 100 soil samples from all over the country to search for new microorganisms for weed control, potato agar (potato dextrose agar) and littman oxgall agar (Littman oxgall agar) from the collected soil samples 1,000 strains were isolated by dilution plate method. The isolated fungi were selected first through the in vitro herbicidal activity assay using rem, faucostata, and radinoclover seed germination methods, and the potential for microbial product development by performing in vivo pot experiments using selected strains. Final selection was made as candidate strains.

상기 균주의 동정 및 배양에 관하여 설명하면 다음과 같다.Referring to the identification and culture of the strain is as follows.

가. 균주의 분리동정end. Isolation and Identification of Strains

분리된 곰팡이 균주의 동정은 감자 한천(potato dextrose agar) 및 몰트 한천(malt extract agar)배지를 사용하여 실시하였다. 분리된 균의 분생포자병(conidiophore), 분생포자좌(sporodochia), 소병자(phialide) 및 소병자포자(phialoconidia) 등의 형태적 특징을 광학현미경 하(50 ∼ 400배율)에서 조사하였다. 그 결과, 본 활성균은 자연계에서 주로 기생 또는 부생체로 자주 발견되는 미로쎄시움균으로 동정되었으며 격막이 있는 균사가 잘 발달하여 하이포마이세테 강(綱)에 속하는 불완전균류인 미로쎄시움 로리둠이었다. 본 발명에 따른 균주는 배양기간이 지나면서 배지가 함유된 플레이트상에 최고 1.5 mm 이상의 분생포자좌(sporodochia)를 형성하는 특징을 나타냈다. 분생포자좌는 쿠션모양이었으며 균사상에서 처음에 진한 녹색을 띠다가 차차 검은색을 띠었으며 종종 분생포자좌끼리 합쳐지기도 하였다. 특히, 건조한 상태에서 딱딱하고 검은 분생포자좌를 잘 형성하였다. 분생포자병은 반투명내지 유색이며 조밀한 분지와 빗자루모양의 분생포자병을 형성하였다. 포자덩어리는 점성을 띠었으며 처음에 녹색을 띠다가 차차 견고해지면서 검은색을 띠었다. 분생포자는 분생포자병위에 위치한 소병자끝에 착생하였으며 소병자의 크기는 8.5 ∼ 15.3 ×1 ∼ 2 ㎛이었으며 소병자포자의 크기는 6 ∼ 8 ×1.5 ∼ 2.5 ㎛이었다. 소병자포자의 색깔은 반투명 내지 검은색을 띠며 단일세포이고 난형(ovoid)내지 간형(elongate)이었다. 이상의 결과를 종합하여 본 활성균주는 균분류학상 넓게는 불완전균류(Imperfect fungi)에 속하며 격막의 균사를 잘 형성하고 분생포자병과 같은 스트럭쳐(structure) 상에 포자를 만드는 특징을 갖는 하이포마이세테 강(綱) 곰팡이에 속하는 미로쎄시움 로리둠 종(species)으로 동정되었다. 본 발명에 따른 신균주 미로쎄시움 로리둠 F000252는 한국생명공학연구원 유전자은행에 2001년 3월 31일자로 기탁하여 수탁번호 KCTC 0980BP를 부여받았다.Identification of isolated fungal strains was carried out using potato agar (potato dextrose agar) and malt extract agar medium. Morphological characteristics of isolated bacteria, such as conidiophore, sporodochia, small spore (phialide), and small spore spore (phialoconidia) were investigated under an optical microscope (50-400 magnification). As a result, this active bacterium was identified as myrosium bacteria, which are frequently found as parasitic or by-products in nature, and mycelial with diaphragm developed well and was an incomplete fungus belonging to the hypomycete river, Myrosium spp. . The strain according to the present invention was characterized by the formation of up to 1.5 mm or more sporodochia on the plate containing the medium over the culture period. The conidia were cushioned, initially dark green on mycelia, gradually black, and often combined with the conidia. In particular, the hard and dark conidia formed well in the dry state. Conidia were semitransparent to colored, forming dense branches and broom-shaped conidia. The spore mass was viscous, initially green, and gradually black. The conidia sporadized at the tip of the small bottle located above the conidia. The small bottle size ranged from 8.5 to 15.3 × 1 to 2 µm and the small spore size ranged from 6 to 8 × 1.5 to 2.5 µm. The virulent spores were translucent to black, single cell, ovoid to elongate. Based on the above results, this active strain belongs to imperfect fungi, which is widely classified as an imperfect fungi, forms hyphae of the diaphragm well and has spores on the structure such as conidia. (I) identified as the mycecidium lorydum species belonging to the fungus. The new strain Myrosium Lolidium F000252 according to the present invention was deposited on March 31, 2001 with the Korea Biotechnology Research Institute Gene Bank and was granted accession number KCTC 0980BP.

나. 환경조건에 따른 균생장I. Fungal growth according to environmental conditions

분리균은 감자한천 및 몰트한천 배지 상에 온도 및 수분 활성조건을 달리하여 균사 생육정도를 조사하였다. 그 결과, 본 균주의 생육은 25 ℃에서 가장 좋았으며 비교적 고온(30 ℃)에서도 대체로 양호하였으며, 낮은 온도(18 ℃)에서도 균사생육은 잘 이루어져 최적온도인 25 ℃에서와 큰 차이를 나타내지 않았다. 또한, 수분 활성조건을 달리하여 맥아즙한천배지(MEA; malt extract agar) 상에서 배양한지 10일 후에 균사생육을 조사한 결과, 수분활성이 높은 0.995 aw에서 균사생장이 가장 양호하였으며 0.964 aw의 대체로 낮은 수분조건에서도 균사생장이 대체로 잘 이루어지지만 이보다 더 낮은 0.95 aw에서는 거의 균사생장이 이루어지지 않았다[도 3]. 분생포자좌의 형성은 고온에서보다는 20 ∼ 25 ℃부근에서 잘 형성되었으며 배양기간 중에 온도변화(고온보다는 저온조건하)가 있을 경우 더 잘 형성되는 것으로 관찰되었다. 배양초기에는 배지 상에 흰색 내지 연한 살색의 기균사를 잘 형성하였으며 색소는 거의 분비하지 않았으며 플레이트 배면의 색은 살색을 띠었으며 플레이트 상에서 형성된 기균사를 긁어주거나 아가플러그로 찍어줄 경우 다량의 액체성의 분생포자층을 포함하는 분생포자좌의 형성이 급격히 유도되는 것으로 나타났다. 한편, 액체배양의 경우 감자한천 배지에 진탕배양할 경우 약한 적색을 띠었으며 배양체의 점성이 맥아즙(malt extract broth) 배지에 비해 더 높은 점성을 나타냈다.The isolates were examined for mycelial growth by varying the temperature and water activity conditions on potato agar and malt agar medium. As a result, the growth of this strain was the best at 25 ℃ and was relatively good even at a relatively high temperature (30 ℃), mycelial growth was well even at low temperature (18 ℃) did not show a significant difference from the optimum temperature 25 ℃. In addition, unlike the water activity conditions, wort agar; generally of whether cultured on (MEA malt extract agar) investigated the mycelial growth after 10 days results, were the mycelial growth of the well at a high water activity 0.995 a w 0.964 a w Mycelial growth was generally good even under low moisture conditions, but almost no mycelial growth was achieved at the lower 0.95 a w [Fig. 3]. The formation of conidia spores was well formed near 20 ~ 25 ℃ rather than at high temperature, and was observed to form better when there is a temperature change (under low temperature rather than high temperature) during the culture period. In the early stage of culture, white to light fleshy mycelia were formed well on the medium, and pigments were hardly secreted. The color on the back of the plates was fleshy, and when the scratched or agaplug was applied to the mycelia on the plate, It was shown that the formation of conidia spores, including the conidia of sex, was induced rapidly. On the other hand, the liquid culture was weakly red when shaken on potato agar medium, and the viscosity of the culture was higher than that of malt extract broth medium.

실시예 2:Example 2: in vitroin vitro 제초활성조사Herbicide Activity Survey

상기 실시예 1에서 얻은 배양액 및 배양추출물을 사용하여 렘나 파우시코스타타(Lemna paucicostata)에 대한 제초활성을 검정하였다. 본 검정에 사용된 피검 생물인 렘나 파우시코스타타에 대하여 배양액 및 배양추출물 모두 높은 활성을 보였다[도 4, 5]. 렘나 파우시코스타타에 대하여in vitro상에서 배양액을 50,000 ∼ 0.8 ppm범위로 조정하여 제초활성(1 ∼ 5지수범위)을 조사한 결과, 렘나에 대하여 배양원액을 16배 희석한 6,250 ppm에서 저해지수 4, 또한 1,250 ppm에서도 제초활성지수 2로 매우 높은 활성을 나타냈으며, 배양액의 에틸아세테이트 추출물의 경우 1.6 ppm에서도 매우 높은 제초활성[제초지수 3]을 나타냈다. 한편, 본 배양체의 아세톤 추출물이 여러 종류의 그램음성 및 양성세균 및 아스퍼질러스(Aspergillus), 캔디더스(Candidus)균 등에는 거의 활성을 나타내지 않았다.Herbicide activity against Lemna paucicostata was assayed using the culture solution and the culture extract obtained in Example 1. Both the culture medium and the culture extract showed high activity against the remnant Pauschostata, the test organism used in the assay [FIGS. 4, 5]. In vitro culture of remnant faux costata was adjusted to 50,000 to 0.8 ppm and herbicidal activity (range of 1 to 5) was examined. In addition, the herbicidal activity index 2 showed very high activity even at 1,250 ppm, and the ethyl acetate extract of the culture broth showed very high herbicidal activity [3. On the other hand, the number of grams of the acetone extract of the type cultures negative and positive bacteria and Aspergillus (Aspergillus), candy Ranges (Candidus) bacteria or the like did not show nearly activity.

실시예 3: 클로버 종자 및 유묘에 대한 제초활성 조사Example 3: Investigation of herbicidal activity on clover seeds and seedlings

본 발명에 따른 균주의 소병자포자 현탁액(㎖당 1 ×107소병자포자 농도)을라디노클로버 종자가 습실 처리된 플레이트에 발아전 접종 처리한 후 라디노클로버 종자발아저해 및 떡잎 생육 저해 정도를 조사한 결과, 처리 3 ∼ 4일 후에도 종자발아가 현저히 억제되었으며, 또한 발아된 유묘에 처리할 경우에도 라디노클로버 유묘의 생육이 매우 억제되었다. 미로쎄시움균의 침입과정을 육안 및 현미경 하에서 조사한 결과 종자표피 및 떡잎 상에 2일 후부터 균의 감염이 이루어지는 것이 관찰되었고, 4 ∼ 5일 후부터는 특히 종자 및 떡잎 상에 진한 녹색-검정색의 분생포자좌(sporodochia) 및 균사가 잘 형성되어가는 것이 관찰되었으며 종피 및 떡잎 이외에도 줄기 및 뿌리의 감염으로 진전되면서 클로버의 생육이 매우 억제되는 것이 관찰되었다[도 6, 7 및 8].Inoculation of the small bottle spores of the strain according to the present invention (concentration of 1 × 10 7 small bottle spores per ml) before the seed germination was inoculated into the wet-treated plate of radiano clover, and the degree of inhibition of radinoclover seed germination and inhibition of cotyledon growth was observed. As a result, seed germination was remarkably suppressed even after 3 to 4 days of treatment, and growth of radinoclover seedlings was very suppressed even when treated with germinated seedlings. Investigation of the invasion process of myrosium bacteria was observed by microscopic and microscopic observation of bacterial infections on the seed epidermis and cotyledon after 2 days, and dark green-black conidia on the seed and cotyledon after 4-5 days. (sporodochia) and mycelia were well formed, and the growth of clover was greatly inhibited as the stem and roots progressed in addition to the seed and cotyledon [Figs. 6, 7 and 8].

실시예 4:Example 4: in vivoin vivo 제초활성 조사Herbicide Activity Survey

In vivo상에서 여러 잡초종에 대하여 제초효과가 있는지를 식물에 직접 처리하여 그 활성을 검정하였고, 그 결과 까마중, 자귀풀, 어저귀, 도꼬마리, 메꽃, 토끼풀 등의 밭잡초와 물달개비 등의 논잡초에 대하여 95%이상의 매우 높은 제초효과를 나타냈으며 바랭이와 올미에는 각각 70 및 80%의 대체로 높은 제초활성을 나타냈다[도 9, 10]. 제초활성은 처리 수일 후부터 급격히 나타나며 4일과 14일 후 제초활성 수준은 큰 차이가 없었다. 한편, 작물의 일종인 수수에 대한 제초활성은 성숙체 식물에 대하여 매우 미약하였으며 종자에 처리한 경우는 그 효과가 극히미약하였다. 또한, 작물에 대한 약해는 토마토, 오이 등의 채소류와 밀보리 식물체에 대하여 배양원액에 대해서 미약하였다. 따라서, 본 미생물 제제는물달개비 등의 논에서 발생하는 잡초종, 채소류 재배시에 발생하는 잡초종 및 잔디밭의 토끼풀의 방제에 효과적으로 사용될 수 있을 것으로 판단된다. In vivo , we tested the activity of various weed species directly on plants and tested their activities. As a result, weeds on field weeds such as crows, larvae, scallops, skewers, buckthorns and shamrocks and paddy weeds, etc. The herbicidal effect was over 95%, and the herbicides of 70 and 80% were found in the varieties and the slivers respectively [Figs. 9 and 10]. The herbicidal activity appeared rapidly after several days of treatment and there was no significant difference in herbicidal activity level after 4 and 14 days. On the other hand, the herbicidal activity against sorghum, a kind of crop, was very weak against mature plants, and the effect was very weak when treated with seeds. In addition, the damage to crops was weak with respect to the culture stock solution for vegetables such as tomatoes, cucumbers and wheat barley plants. Therefore, the present microbial preparations can be effectively used for the control of weed species occurring in paddy fields such as watering canes, weed species generated when growing vegetables, and shamrock on the lawn.

실시예 5: 미생물제초제의 제초효과Example 5 Herbicide Effect of Microbial Herbicide

상기 실시예에서와 같은 방법으로 제제화된 미생물 제초제를 1 ×105, 1 ×106, 1 ×107및 1 ×108포자/g의 농도별로 멸균수에 현탁하여 토끼풀을 비롯한 잡초종에 처리하고 그 제초작용을 1-2주일 후에 관찰하였다. 균주의 제초작용을 상기 실험예 1에서와 유사한 기준에 의해서 평가하였다. 그 결과는 다음 표 1에서 나타낸 바와 같다.Microbial herbicides formulated in the same manner as in the above examples are suspended in sterile water at concentrations of 1 × 10 5 , 1 × 10 6 , 1 × 10 7, and 1 × 10 8 spores / g and treated to weed species including shamrock The herbicidal action was observed after 1-2 weeks. The herbicidal action of the strain was evaluated by similar criteria as in Experimental Example 1 above. The results are shown in Table 1 below.

상기 표 1의 결과로부터 신균주는 여러 밭잡초종과 몇몇 논잡초종에 대하여 높은 제초활성을 가지며, 특히 까마중, 자귀풀, 도꼬마리, 메꽃, 토끼풀 등의 밭잡초종과 물달개비 등의 논잡초종에 대하여 높은 선택적 제초효과를 보여 주었다.From the results of Table 1, the mycobacteria have high herbicidal activity against various field weeds and some non-weeds, in particular, field weeds such as camellias, silkworms, doemari, buckthorns, shamrocks, and non-weeds such as seaweed. It showed high selective herbicidal effect.

실시예 6:Example 6: in vivoin vivo pot 상에서의 식물병 방제활성 조사Investigation of plant disease control activity in pot

in vivopot 상에서의 식물병 방제실험을 실시한 결과 특히 수도작물인 벼에는 전혀 해를 입히지 않았으며 도열병에 대한 방제효과가 대체로 높게 나타났는데, 대체로 배양액의 1/2, 1/4 희석농도에서 각각 100, 70% 이상의 방제효과를 나타냈다. 또한, 본 균주는 밀녹병과 보리흰가루병 방제효과가 원액을 사용하였을 경우 100% 방제효과를, 그리고 1/8 희석농도에서도 80%의 높은 방제효과를 나타냈다[표 2].Plant disease control experiments on in vivo pots showed no damage to rice crops, especially rice crops, and the control effect on blast bottles was generally high. , More than 70% control effect. In addition, this strain showed 100% control effect when the stock solution was used to control wheat rust and barley flour disease, and high control effect of 80% even at 1/8 dilution concentration [Table 2].

이상에서 상세히 설명하였듯이, 본 발명은 미로쎄시움 로리둠 F000252(KCTC 0980BP) 균주의 잡초종에 대한 특이적 제초활성을 나타내는 우수한 신균주를 분리 동정하고, 이 균주를 배양하여 밭 잡초종 및 논 잡초종에 대하여 강한 제초활성을 나타내는 것을 알게 되었다. 따라서, 상기 신균주가 환경친화형 잡초방제용 생물농약으로서 이용 가능하고 작물에는 약해가 적고 단엽 및 광엽 잡초종과 같은 국내 문제 잡초종의 방제에 매우 유용한 효과를 가진다. 또한, 본 균주의 배양액 및 배양 추출물이 상기 잡초종의 방제에 효과적으로 이용될 수 있음을 확인하였다.As described in detail above, the present invention isolates and identifies excellent mycobacteria exhibiting specific herbicidal activity against the weed species of Myrosium spp. Loridum F000252 (KCTC 0980BP) strain, and cultured the field weeds and paddy field weeds. It was found that it exhibits strong herbicidal activity against the species. Therefore, the new strain can be used as a biopesticide for environmentally friendly weed control, less harmful to crops and has a very useful effect in controlling domestic problem weed species such as single-leaf and broad-leaf weed species. In addition, it was confirmed that the culture solution and the culture extract of the present strain can be effectively used for the control of the weed species.

Claims (5)

생물농약으로 유효한 미로쎄시움 로리둠(Myrothecium roridumTode ex Fries) F000252(KCTC 0980BP). Myrothecium roridum Tode ex Fries F000252 (KCTC 0980BP), which is effective as a biopesticide. 미로쎄시움 로리둠 F000252(KCTC 0980BP) 균주, 이의 배양액 또는 이의 배양 추출물과 농학적 허용 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 제초제.Herbicides characterized in that it comprises a Myrosium Loridum F000252 (KCTC 0980BP) strain, its culture or its culture extract and an agriculturally acceptable carrier. 제 2 항에 있어서, 상기 제초제는 밭잡초종 또는 논잡초종에 적용하는 것을 특징으로 하는 제초제.The herbicide of claim 2, wherein the herbicide is applied to field weed or non-weed weed. 미로쎄시움 로리둠 F000252(KCTC 0980BP) 균주, 이의 배양액 또는 이의 배양 추출물과 농학적 허용 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물병 방제제.Plant disease control agent, characterized in that it comprises a myrosium Loridum F000252 (KCTC 0980BP) strain, its culture or its culture extract and an agriculturally acceptable carrier. 제 4 항에 있어서, 상기 식물병은 도열병, 녹병 및 흰가루병인 것을 특징으로 하는 식물병 방제제.5. The plant disease control agent according to claim 4, wherein the plant disease is blast, rust and powdery mildew.
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