KR20020076001A - 사구체 경화증 발생을 효과적으로 억제하는 ｉｌ-１０발현 재조합 바이러스 벡터 및 이를 이용한 신부전증의유전자 요법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 사구체 경화증 (glomerulosclerosis) 발생을 효과적으로 억제하는 IL-10 발현 재조합 바이러스 벡터 (Recombinant virus vector) 및 이를 이용한 신부전증 (renal failure)의 유전자 요법 (gene therapy)에 관한 것으로, 구체적으로 강력한 항염증 활성을 나타내는 인터루킨 IL-10 (interleukin-10)을 포함하는 재조합 바이러스 벡터와 이를 분절성 사구체신염 (focal segmental glomerulosclerosis, FSGS)을 자연적으로 발생시키는 동물모델에 투여하여 사구체 경화증과 단백뇨의 생성을 효과적으로 억제시키는 IL-10을 이용한 신부전증의 유전자 요법에 관한 것이다. 본 발명의 IL-10 발현 재조합 바이러스 벡터는 분절성 사구체신염 발생 동물모델에서 단핵구의 침윤을 억제하여 염증세포에 의한 파괴작용을 방지함으로써 사구체 경화증의 진행을 예방할 수 있을 뿐 아니라 단백뇨의 생성을 효과적으로 억제함으로써 신부전의 치료를 위한 유전자 요법에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

사구체 경화증 발생을 효과적으로 억제하는 ＩＬ-１０ 발현 재조합 바이러스 벡터 및 이를 이용한 신부전증의 유전자 요법{Recombinant virus vector expressing human IL-10 effective for inhibition of glomerulosclerosis and a gene therapy using them for curing renal failure}

본 발명은 사구체 경화증 (glomerulosclerosis) 발생을 효과적으로 억제하는 IL-10 발현 재조합 바이러스 벡터 (Recombinant virus vector) 및 이를 이용한 신부전증 (renal failure)의 유전자 요법 (gene therapy)에 관한 것으로, 구체적으로 강력한 항염증 활성을 나타내는 인터루킨 IL-10 (interleukin-10)을 포함하는 재조합 바이러스 벡터와 이를 분절성 사구체신염 (focal segmental glomerulosclerosis, FSGS)을 자연적으로 발생시키는 동물모델에 투여하여 사구체 경화증과 단백뇨의 생성을 효과적으로 억제시키는 IL-10을 이용한 신부전증의 유전자 요법에 관한 것이다.

최근 발견된 림포카인인 인터루킨-10 (interleukin-10, 이하 'IL-10'이라 약칭함)은 본래 인터페론-γ-합성의 억제제이면서 체액성 면역 반응의 주요 조절자로서 추정된다 (Fiorentino, D. F., et al.,J. Exp. Med., 170:2081, 1989; Moore et al., K. W., et al.,Science,248:1230-1234, 1990). IL-10은 많은 작용 또는 효과를 매개할 수 있는 사이토카인 (cytokine)으로서 마우스 및 사람 세포 모두에서 분리되었으며, 헬퍼 T (helper T, 이하 'Th'라 약칭함) 세포의 상이한 부류 또는 서브세트의 면역 반응을 조절하는데 관련된다. Th 세포는 이들의 사이토킨 생성 특성에 의해 구분되는 상이한 서브세트로 분류될 수 있으며, 이는 종종 서로간에 배타적인 면역 반응을 나타내는 체액성 (항체-매개된) 및 지연형 과민성 반응의 2가지 계열로 분류된다.

이들 2가지 상이한 면역 반응은 2가지 타입의 헬퍼 T-세포 클론, 즉 Th1 및 Th2 세포로부터 야기될 수 있는데, 이것은 사이토카인의 분비 패턴이 구분됨을 입증한다 (Moore et al., K. W., et al.,Science,248:1230-1234, 1990; Vieira, P. et al.,Proc. Nat. Acad. Sci. USA,Vol. 88:1172, 1991). 마우스 Th1 세포 클론은 인터페론-γ 및 IL-2를 분비하고 주로 지연형의 과민성 반응을 유도하는 반면, Th-2 세포 클론은 IL-4, IL-5 및 IL-10을 분비하여 체액성 반응을 지원한다 (Fiorentino, D. F., et al.,J. Exp. Med., 170:2081, 1989). Th1 세포 클론에 의해 분비되는 인터페론-γ는 시험관 내에서 Th2 클론 증식을 억제하는 반면, Th2 세포 클론에 의해 분비되는 IL-10 세포 클론에 의한 사이토카인 분비를 억제하기 때문에 면역반응에 있어서 대조적이다 (Fiorentino, D. F., et al.,J. Exp. Med., 170:2081, 1989; Moore et al., K. W., et al.,Science,248:1230-1234, 1990). 따라서, 상기 2가지 헬퍼 T 세포 타입은 상호간에 억제성이며 2가지 유사하지 않은 면역 반응에 대한 근거를 제공할 수 있다.

IL-10은 Th1 세포에 의한 인터페론-γ와 같은 사이토킨의 생성을 억제하고 (Fiorentino et. al.,J. Exp. Med., 170:2080-2090, 1989) IL-2 및 IL-4에 대한 반응에 있어서 마우스 흉선 세포의 증식을 증진시키는 (Suda, et. al.,Cell. Immunol.,129:228-240, 1990) Th2 세포 생성물로서 원래 기술되어 왔다. 그 결과, IL-10은 단핵세포/대식세포의 존재하에서 사람 T 세포 및 T 세포 클론의 증식및 사이토킨 합성 (deWaal Malefyt et. al.,J. Exp. Med., 174:915-924, 1991; Taga and Tosato,J. Immunol., 148:1143-1148, 1992)과 마우스 T 세포 클론의 증식 및 사이토킨 합성 (Ding and Shevach,J. Immunol., 148:3133-3139, 1992)을 억제하는 것으로 밝혀졌다.

IL-10은 정상적으로 마우스 Th2 클론, B 세포 임파구, T 세포, 활성화된 유방 세포주, 활성화된 대식 세포, 케라틴 세포 (keratinocyte) 및 CD5+ B 세포에 의해 생성된다 (Fiorentino et. al.,J. Exp. Med., 170:2081-2095, 1989; Moore et. al.,Science, 248:1230-1234, 1990; O'Garra et. al.,Int. Immunol., 2:821-832, 1990; MacNeil et. al.,J. Immunol., 145:4167-4173, 1990; Fiorentino et. al.,J. Immunol., 147:3815-3821, 1991; Hisatsune et. al.,Lympokine Cytokine Res., 11:87-93, 1992; Lin et. al.,Ann. NY Acad. Sci., 651:581-583, 1992).

상기 나열한 IL-10의 효과 이외에, IL-10은 시험관 내 실험 모델에서 B 임파구 세포 계열의 자극 특성을 지니는 것으로 보고되었다. B 세포는 외부 항원에 대한 반응시 항체를 생성함으로써 숙주 면역 반응에 있어 중요한 역할을 한다. IL-10은 생쥐, 소밀도 B 세포상에서 제 Ⅱ 부류의 주요 조직적합성 복합체 항원의 표면 발현을 상승 조절하고 (Fei Go et. al.,J. Exp. Med., 172:1625-1631, 1990), 활성화된 사람 편도의 B 세포의 증식을 증강시키고 면역글로불린 M (IgM), IgG1, IgG3 및 TGFβ와 협조하여 IgA를 분비할 수 있는 (Defrance et. al.,J. Exp. Med.,175:671-682, 1992; Briere et. al.,J. Exp. Med., 179:757-762, 1994) 항체 분비 세포 내로 이들의 분화를 유도하는 (Rousset et. al.,Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 89:1890-1893, 1992) 것으로 밝혀졌다. IL-10은 또한 상이한 사이토카인의 존재하에서 면역글로불린 생산을 차등 조절하는 것으로 밝혀졌다 (Pencanha et. al.,J. Immunol., 148:3427-3432, 1992). 생후 8주 이내의 마우스에 항-IL-10 항체의 생체 내 투여는 혈청 IgM 및 IgA를 감소시키며 2개의 세균 항원에 대한 생체 내 항체 반응을 감소시키고, 혈청 IgG2a 및 IgG2b 수준을 증가시키며 복강 내에서 CD5+ B 세포의 생성 및 작용에 관여한다 (Ishida et. al.,J. Exp. Med., 175:1213-1220, 1992). 이러한 항 IL-10 투여의 생체 내 효과는 내인성 인터페론-γ 수준을 증가시키는데 기여한다.

한편, 유전자 요법 (gene therapy)은 유전자 이상에 의하여 유발되는 각종 유전병과 암 등을 치료하기 위하여, 질병과 관련이 있는 유전자를 환자의 체내에 직접적으로 주입하고 상기 유전자를 세포 내에서 발현시켜 그의 기능을 정상화시키는 방법이다. 이러한 유전자 요법은 특정 유전자를 체내에 주입하여 인체 내에 새로운 기능을 부여할 수 있으므로 치료 이외에 각종 질병을 예방하거나 치료 효과를 강화하는데도 널리 이용될 수 있다.

유전자 요법으로 질병을 치료하는데 있어서 가장 중요한 요건은 주입된 유전자가 성공적으로 목표 세포의 핵에 전달되어 이로부터 유전자가 다량으로 발현되는 것이다. 이때 사용된 유전자는 목표 세포에 도달하여 엔도사이토시스 (endocytosis)라는 과정을 거쳐 세포 내부로 들어간 후 핵 내로 전달되어 발현된다. DNA 자체로 이루어진 유전자는 세포를 통과하는 효율이 극히 떨어지므로 리포좀 (liposome)과 같은 운반체를 사용하여 유전자를 주입할 수도 있는데, 이 경우에도 핵으로 전달되는 과정에 리포좀이 대부분 파괴되어 그 효율이 떨어진다. 하지만, 인체에 감염성이 있는 바이러스를 이용하면 세포 내에 외래 유전자를 효과적으로 주입할 수 있으므로 바이러스를 유전자 요법에 응용하는 것이 매우 바람직하다. 구체적으로, 치료에 사용될 수 있는 유전자를 유전자 재조합 방법으로 바이러스 DNA에 삽입하고 이를 자신의 게놈으로 하는 바이러스를 생체 외에서 대량 생산하여 인체에 직접적으로 감염시킴으로써 세포 내에 효율적으로 원하는 유전자를 전달하여 발현시킬 수 있다.

이와 같이 유전자 요법에서 가장 중요한 물질은 치료 유전자를 생체 내로 전달하는 유전자 전달체로서, 유전자 전달체로는 바이러스성 벡터와 나출 DNA (naked DNA; 리포좀 등 화학물질과 섞은 경우 포함)가 사용되고 있다. 이중에서 바이러스성 벡터로는 레트로바이러스 (retrovirus), 아데노바이러스 (adenovirus), AAV (adeno-associated virus) 등이 사용되고 있는데, 현재 유전자 요법에 사용되는 유전자 전달체 중 가장 빈번하게 사용되는 것은 레트로바이러스 벡터로서, 전세계적으로 허가를 받은 유전자 요법의 임상 시험의 50% 이상에서 레트로바이러스 벡터가 사용되고 있다 (Wiley - The Journal of Gene Medicine Website; http://www.wiley.co.uk/genetherapy). 유전자 요법에 사용되는 대부분의 레트로바이러스 벡터는 뮤린 류케미아 바이러스 (Murine Leukemia Virus, MLV) 게놈을 기본 게놈으로 사용하고 있는데, 이러한 레트로바이러스 벡터는 현재 높은 빈도로 사용되고 있지만 아직도 많은 개선의 여지가 있으며 그 중 가장 중요한 문제는 안전성 문제이다. 즉, 레트로바이러스 벡터는 바이러스성 벡터로서 거의 모든 경우 유전학적으로 조작하여 증식이 불가능하도록 만들어져 있으나, 동형 재조합 (homologous recombination) 등에 의해 복제 가능 바이러스 (replication competent virus, RCV)가 발생할 가능성이 제기되어 왔다. 따라서, 증식하는 바이러스의 존재여부가 바이러스성 벡터의 유전자 요법 안전성 판단에 있어서 큰 비중을 차지하게 된다.

반면, 아데노바이러스 (Adenovirus)는 DNA 바이러스로서, 게놈 DNA의 크기는 약 36 kbp이며 그 게놈에 바이러스가 증식하는데 필수적인 유전자인 E1a 유전자 부위와 바이러스가 패키징되는데 필수적인 유전자 등이 포함되어 있다. 이러한 아데노바이러스가 유전자 요법에 이용되기 위해서는 바이러스가 체내에서 스스로 증식하여 온몸에 감염됨으로써 또 다른 질병이 유발되지 않도록 바이러스 증식에 사용되는 유전자를 제거하여야 한다. 따라서, 아데노바이러스 게놈 중에 바이러스가 증식하는데 관여하는 E1a 유전자 부위를 제거하면 바이러스가 스스로 정상 세포에서 증식할 수 없어 아데노바이러스를 유전자 요법에 이용할 수 있다. 특히, 아데노바이러스는 세포의 핵 내에 그의 유전자를 전달하는 특별한 기전을 가지고 있어 다른 바이러스 보다 그의 DNA를 핵 내에 전달하는 효율이 높으므로 유전자 요법에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 아데노바이러스를 이용하면 외래 유전자를 리소좀에 의해 분해되지 않으면서 인간 세포에 효율적으로 주입할 수 있고, 바이러스 자체가 매우 안정하여 바이러스 스톡을 손쉽게 분리하여 농축할 수 있으며, 세포에 대한 감염도가 커서 유전자 요법에 유용하게 사용될 수 있다는 장점을 갖는다.

구체적으로, 아데노바이러스 p53 유전자를 이용하는 치료 요법은 로스 (J. Roth) 등이 미국에서 임상적으로 후두암을 치료하는데 시도하였고 간지 (Canji) 등은 간암을 치료하는데 시도하였으며, 현재까지 유전자 요법의 안전성은 어느 정도 인정되고 있다. 그러나, 유전자 요법에 의해 후두암 및 다른 종류의 암이 치료된 효과 등에 대해서는 아직까지 뚜렷하게 보고된 바가 없었다. 바이러스의 안전성 측면에서 중요한 것은 감염된 세포 내에서 바이러스가 증식하여 인체 전체가 감염되는 위험을 막는 것인데, 로스 및 간지 등이 개발한 아데노바이러스 발현벡터 보다 재조합 아데노바이러스 게놈이 상대적으로 더 적게 포함된 아데노바이러스 벡터를 개발하면 동형 재조합에 의해 복제 가능 바이러스가 생성될 가능성이 감소하므로 더욱 안전성이 우수한 아데노바이러스를 개발할 수 있고 이는 다양한 질병의 유전자 요법에 유용하게 사용될 수 있다.

유전공학적으로 최근에는 목적하는 항원을 코딩하는 유전자를 아데노바이러스에 삽입하는 DNA 벡터 시스템이 안전하고 효과적인 유전자 요법을 제공할 수 있으므로, 이에 대하여 많은 연구가 진행되고 있는 실정이다. 특히, 사람 아데노바이러스는 다른 바이러스 벡터들 보다 작은 게놈 유전자를 가지고 있어 제작이 용이할 뿐만 아니라 외래 유전자를 근육, 상피, 신경 및 임파구 세포에 도입시킬 수 있는 감염력을 가지고 있고, 바이러스 DNA가 세포질에 수개월 동안 존재함으로써 지속적인 면역을 유발할 수 있을 뿐만 아니라 개, 돼지, 소, 마우스, 토끼, 침팬지, 고양이 등 많은 포유동물에서 외래 유전자에 대한 면역반응이 확인된 바 있어 유전자 요법이나, 백신을 목적으로 외래 유전자를 운반하고 발현하는 훌륭한 수용체로서 알려져 있다. 따라서, 이들에 관한 연구가 많이 진행되고 있으며 가장 활발히 연구되고 있는 것이 사람 아데노바이러스 5형을 이용한 발현벡터 시스템이다. 특히, 사람 아데노바이러스 5형을 이용한 발현벡터는 수의학 분야에서도 각종 동물에 질병을 일으키는 병원체의 항원을 코딩하는 유전자를 삽입하여 생체 내에서 발현항체를 유발시키므로서 질병을 예방할 수 있으므로 효과적이다.

한편, 국소성 분절성 사구체 경화증 (focal segmental glomerulosclerosis; FSGS)은 점진적인 신장 기능 소실을 초래하는 만성 병변으로서, 특발성 신증후군의 한 형태일 뿐만 아니라 역류성 신병증, 헤로인으로 초래되는 신병변 및 각종 사구체 신장염의 말기에 나타난다 (Goldszer, R, C. et al.,Ann. Rev. Med.,35:42-449, 1984). FSGS에서는 사구체 모세혈관의 일부가 경화되는 사구체 경화증이 주 병변이지만 이와 함께 신간질의 섬유화, 세뇨관의 위축 및 염증세포의 침윤이 심한 것을 관찰할 수 있다 (Bogenschuz, O. et al.,Am. J. Nephrol., 10:137-147, 1990).

신사구체 질환은 신세뇨관의 위축과 간질의 섬유화의 정도가 환자의 혈청 크레아티닌 (creatinine) 농도의 증가, 크레아티닌 청소율 감소 등 신장기능의 저하에 직접적인 상관관계가 있고 이러한 변화가 사구체질환의 종류나 원인보다는 환자의 생존율과 더욱 밀접한 관계가 있는 것으로 알려져 있다 (Newman, J. W. et al.,Medicine, 55:67-87, 1976; Mackenson-Haen, S. et al.,Clin. Nephrol., 37:70-77, 1992; Wehrmann, M. et al.,Clin. Nephrol., 23:115-122, 1990; Bohle, A. etal.,Int. Suppl., 67:S186-188, 1998). 이러한 간질과 세뇨관의 변화는 그 주변으로 침윤된 림프구 및 단핵세포들에 의한 염증성 상해의 결과로 여겨지며 이 염증세포의 침윤 혹은 활성도를 감소시킨다면 만성 신질환으로의 진행을 지연 내지는 예방할 수 있을 것이다 (Kitching, A. R. et al.,Kideny Int., 52:52-59, 1997; Rui-Mei, L. et al.,Kideny Int., 53:845-852, 1998)

진행된 신장 질환 환자의 신생검 조직을 보면 분절성 사구체 경화증과 더불어 염증세포의 침윤을 동반한 신간질의 섬유화 및 세뇨관 상피세포의 파괴와 위축이 심함을 볼 수 있다. 어떤 원인에 의해 사구체에 손상이 가해져서 단백뇨가 생기면 근위 세뇨관에서 재흡수가 일어나는데 이 정도가 심할 경우 과흡수되어 세뇨관 자체에서 분비되는 sIgA, sIgG, sIgM에 의해 흡수된 단백질이 비정상적인 단백질로 변성된다. 이 물질이 림프구, 탐식세포, 단핵세포 등을 불러들이는 화학적 주성인자 (chemotatic factor)로 작용하는 것으로 생각되어 왔다 (Bohle, A. et al.,Clin. Nephrol., 29:28-34, 1988). 이러한 과정에 의해서 침윤된 염증세포들에서 분비되는 사이토카인과 그 자극에 의해 세포 외 기질 물질의 생산이 증가되어 간질에 섬유화가 일어난다고 보고되었다 (Ratschek, M. et al.,Clin. Nephrol., 25:22-226, 1986; Bohle, A. et al.,Kidney Blood Press Res., 19:191-195, 1996). 염증세포들에 의해 세뇨관이 손상을 받으면 세뇨관 주위를 주행하는 사구체와 연결되는 혈관 역시 손상을 받게 되어서 사구체는 결국 고립되어 고사된다. 따라서, 이 염증반응을 예방, 억제함으로써 신장질환의 치료 혹은 진행 억제 등을 이루고자 하는 시도들이 이루어지고 있다 (Baud, L. et al.,Kidney Int.,53:1118-1126, 1998; Kluth, D. C. et al.,Semin. Nephrol., 16:576-582, 1996; Engelhardt, M. et al.,J. Clin. Oncol., 14:1405-1406, 1996; Matsumoto, K. et al.,Nephron., 73:305-309, 1996; Gerritsma, J. S. et al.,J. Am. Soc., Nephrol., 8:1510-1516, 1997). 예를 들어 염증 유발성 사이토카인의 발현억제, 염증 억제성 사이토카인의 발현촉진 및 외부주입 등의 연구가 행해지고 있다.

이러한 연구의 일환으로서 본 발명자들은 항 염증성 물질인 IL-10 유전자를 발현하는 재조합 아데노바이러스 벡터를 개발하여 이를 선천적으로 신부전증을 나타내는 신질환 동물모델인 FGS/Kist 생쥐의 신장에 직접 주입하는 유전자 요법을 시도하였다. 그 결과, 본 발명자들은 IL-10이 신장에 침윤되는 염증세포의 기능을 억제하여 본 발명의 IL-10을 이용한 유전자 요법이 사구체 경화증의 발생을 저지하고 만성 사구체 질환으로의 진행을 억제하여 난치성 질환인 신부전증의 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 난치병성 질환인 신부전증을 효과적으로 치료하기 위하여 사이토킨 IL-10을 이용한 유전자 요법의 가능성을 제공하는 것이다.

도 1a는 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터 AdCMVhIL-10이 도입된 HeLa 세포에서 인간 IL-10이 발현되는지를 RT-PCR을 수행하여 확인한 결과이고,

M; 분자량 크기 마커, 레인 1; 비처리군,

레인 2; AdCMVLacZ가 도입된 HeLa 세포,

레인 3; AdCMVhIL-10가 도입된 HeLa 세포

도 1b는 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터 AdCMVhIL-10이 도입된 HeLa 세포에서 인간 IL-10이 발현되는지를 RT-PCR을 수행한 후 서던 블럿 분석 (sourthern blot analysis)으로 확인한 결과이고,

M; 분자량 크기 마커, 레인 1; 비처리군,

레인 2; AdCMVLacZ가 도입된 HeLa 세포,

레인 3; AdCMVhIL-10가 도입된 HeLa 세포

도 2는 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터 AdCMVhIL-10이 신장의 피질에주사된 FGS/Kist 생쥐에서 신장조직에 대한 감염여부를 X-gal을 이용한in situ염색으로 확인한 결과이고,

A 및 B; PBS만 주입,

C 및 D; AdCMVLacZ 감염

도 3은 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터 AdCMVhIL-10이 감염된 FGS/Kist 생쥐의 신장조직에서 인간 IL-10 전사체가 생성됨을in situRT-PCR로 확인한 결과이고,

A; AdCMVLacZ 감염,

B; AdCMVhIL-10 감염

도 4는 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터 AdCMVhIL-10이 감염된 FGS/Kist 생쥐의 신장조직에서 혈청 내 인간 IL-10 단백질의 생성유무 및 농도를 ELISA로 측정한 결과이고,

도 5는 본 발명의 재조합 아데노바이러스 AdCMVhIL-10이가 감염된 FGS/Kist 생쥐에서 분절성 사구체 경화증이 억제되었음을 나타내는 병리조직학적 검사결과를 나타낸 것이다.

A; 5 주령의 신장조직 (대조군 Ⅰ, PAS, ×200),

B; 10 주령의 신장조직 (대조군 Ⅱ, PAS, ×100),

C; AdCMVLacZ가 감염된 10 주령의 신장조직 (대조군 Ⅲ, PAS, ×200),

D; AdCMVhIL-10이 감염된 10 주령의 신장조직 (실험군, PAS, ×100)

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 강력한 항염증 활성을 나타내는 사이토카인 IL-10 (interleukin-10)을 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 제공한다.

본 발명에서는 상기 IL-10 발현 재조합 바이러스 벡터를 분절성 사구체신염 (focal segmental glomerulosclerosis, FSGS)을 자연적으로 발생시키는 동물모델에 투여하여 분절성 사구체 경화증과 단백뇨의 생성이 효과적으로 억제됨을 밝힌다.

또한, 본 발명은 상기 IL-10 발현 재조합 아데노바이러스 및 이로부터 생산된 IL-10 단백질을 유효성분으로 하는 신부전증의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 이용한 신부전증의 유전자 요법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 강력한 항염증 활성을 나타내는 사이토카인 IL-10 (interleukin-10)을 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 제공한다.

인터루킨-10 (interleukin-10, IL-10)은 사람 및 뮤린 T 세포로부터 클론화하여 서열이 밝혀졌으며 (Fiorentino, D. F., et al.,J. Exp. Med., 170:2081, 1989; Moore et al., K. W., et al.,Science,248:1230-1234, 1990), 두 서열은 18개 아미노산의 N-말단 소수성 리더 서열을 갖는 178개 아미노산의 폴리펩타이드를 암호화하는 개방 판독 프레임을 함유하고, 73%의 아미노산 서열 상동성을 가지며 이로부터 전사된 35 kD의 동형 이량체 (homodimeric) 단백질로 구성이 되어 있다.

IL-10은 헬퍼 T 세포 2 (helper T cell 2, Th2)에서 분비되는 사이토카인 (cytokine)으로 단핵세포의 MHC 클래스 Ⅱ (major histocompatibility complex class Ⅱ)의 발현을 감소시키고 Th1의 작용을 억제하는 역할을 한다. 또한, 대식세포의 사이토카인 분비를 억제함으로써 염증세포의 화학적 주성 (chemotaxis)을 방해하여 염증을 억제하는 작용을 한다. 따라서, 본 발명자들은 선천적으로 만성 신부전증에 이르는 동물모델에서 인체형 IL-10을 발현하는 재조합 아데노바이러스 벡터를 주사하여 신기능 악화 및 간질과 세뇨관의 변화를 유발하게 하는 염증반응의 감소와 이로 인한 간질의 파괴나 섬유화의 감소에 다른 만성 신기능 부전이 발생하는 것을 예방할 수 있는지를 관찰하고자 하였다.

이러한 목적으로 인간 IL-10을 신부전증의 유전자 요법에 이용하기 위하여, 본 발명자들은 이를 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 제조하였다.

우선, 인간 IL-10을 이용한 신부전증의 유전자 요법을 위해 치료 유전자를 생체 내로 전달하는 유전자 전달체로는 레트로바이러스 (retrovirus), 아데노바이러스 (adenovirus), AAV (adeno-associated virus), 허피스 심플렉스바이러스 (herpes simplex virus) 등의 바이러스성 벡터를 사용하거나 나출 DNA (naked DNA) 혹은 나출 DNA의 생체내 전달 효율을 높이기 위해 사용되는 리포좀 (liposome), 폴리케타이오닉 리피드 (polycationic lipid), 폴리에틸렌 이민 (polyethyleneimine), 폴리L-라이신 (polyL-lysine), 폴리D-라이신 (polyD-lysine), 불활성화된 바이러스 벡터 (adenovirus, sendai virus, AAV 등)와의 복합체를 이용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 바이러스성 벡터로 E1a가삭제되어 자체적 복제가 결여된 인간형 (human type) 5 아데노바이러스 (adenovirus)를 사용하였다. 인간 IL-10 유전자는서열번호 1로 기재되는 염기서열로 구성되는 cDNA 단편을 사용하였으며 (NM_000572, NCBI), 상기 아데노바이러스에 인간 IL-10 발현을 위해 싸이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus, CMV) 프로모터와 소 성장 호르몬 (bovine growth hormone, BGH)의 폴리아데닐화 신호 (polyadenylation signal)를 삽입하여 재조합 아데노바이러스 벡터를 제조하였고 이를 AdCMVhIL-10라 명명하였다.

이와 같이 제조된 본 발명의 인간 IL-10 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터 AdCMVhIL-10는 2001년 2월 12일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다 (수탁번호: KCTC-0958BP).

상기에서 제조된 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터 AdCMVhIL-10이 감염세포에서 효율적으로 hIL-10 유전자를 발현하여 hIL-10 단백질을 생성하는지 확인하기 위하여 HeLa 세포에 AdCMVhIL-10을 감염시킨 후 일차적으로 RT-PCR을 사용하여 hIL-10의 전사체 생성을 확인하였다. 그 결과, 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터 AdCMVhIL-10이 도입된 HeLa 세포에서는 hIL-10의 전사체가 증폭되어 생성된 535 bp 크기의 RT-PCR 산물을 확인할 수 있었다 (도 1a참조, 레인 3). 반면, 재조합 아데노바이러스 벡터가 도입되지 않은 대조구인 sham 감염 세포 (레인 1) 또는 AdCMVLacZ가 감염된 세포 (레인 2)에서는 상기와 같이 hIL-10의 전사체가 증폭되어 생성된 PCR 산물이 관찰되지 않았다.

또한, RT-PCR에 의해 증폭된 DNA 밴드가 hIL-10 전사체에서 유래한 것인지를 재확인하기 위하여 이를 서던 블럿 분석 (Sourthern blot analysis) 후 혼성화 내부 시발체 (hybridizing internal primer)를 사용하여 조사한 결과, 535 bp의 증폭된 DNA 밴드만이 혼성화 내부 시발체에 결합하는 것을 확인하였다 (도 1b참조)

상기에서 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터 AdCMVhIL-10이 감염된 세포에서 인간형 IL-10 유전자가 발현됨을 확인한 본 발명자들은 AdCMVhIL-10이 감염된 세포에서 hIL-10 단백질의 생성을 조사하기 위하여 ELISA를 사용하여 혈청 내 hIL-10의 농도를 측정하였다. 그 결과, AdCMVhIL-10이 감염된 세포는 효과적으로 hIL-10을 분비하여 배양액에 275 ng/㎖의 hIL-10이 존재하고 있음을 확인하였다 (표 1참조).

상기 결과들로부터 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터인 AdCMVhIL-10은 세포 감염후 hIL-10을 효율적으로 생산하여 이를 세포 밖으로 분비하는 것을 알 수 있었다.

또한, 본 발명에서는 상기 IL-10 발현 재조합 아데노바이러스 벡터를 분절성 사구체신염 (focal segmental glomerulosclerosis, FSGS)을 자연적으로 발생시키는 동물모델에 투여하여 분절성 사구체 경화증과 단백뇨의 생성이 효과적으로 억제됨을 밝힌다.

본 발명자들은 상기와 같이 제조된 재조합 아데노바이러스 벡터 AdCMVhIL-10이 감염된 신장 조직에서 hIL-10 전사체가 실제로 생성되는지를 확인하기 위하여in situRT-PCR을 수행한 결과, 본 발명의 AdCMVhIL-10이 감염된 신장 조직에서는 hIL-10 전사체 발현을 나타내는 갈색의 염색부위가 나타난 (도 3의 B 참조) 반면, AdCMVLacZ를 감염시켰거나 형질전환 유전자 (transgene)을 발현하지 않는 AdNull을 감염시킨 대조군에서는 hIL-10 전사체가 검출되지 않았다 (도 3의 A 참조).

상기에서 재조합 아데노바이러스 벡터가 감염된 신장에서 hIL-10 전사체가 발현됨을 확인한 본 발명자들은 AdCMVhIL-10이 감염된 신장세포에서 hIL-10 단백질의 생성여부을 조사하기 위하여 ELISA를 사용하여 혈청 내 hIL-10의 농도를 측정하였다. 그 결과, hIL-10 생산은 처리 1일 후에 2000 pg/㎖로 가장 높게 측정되었고, 점차적으로 감소하여 19일째는 hIL-10 발현이 소멸되는 것을 관찰하였다 (도 4참조).

또한, 본 발명자들은 AdCMVhIL-10 감염에 따른 hIL-10의 생성이 단백뇨의 발생에 어떠한 영향을 주는지를 조사하기 위하여 단백뇨가 사구체 경화에 선행해서 나타나는 FGS/Kist 생쥐에 상기 재조합 아데노바이러스 벡터를 도입한 후 단백뇨를 측정하였다. 본 발명에서 동물모델로 사용한 FGS/Kist 생쥐는 생후 약 40일 정도가 지나면 자연적으로 단백뇨가 나타나면서 점차 신기능이 나빠져서 약 1년 이내에 신부전증을 나타내는 선천성 신질환 모델로서 (Hyun, B. H. et al.,Lab. Animal. Science, 35:519-526, 1991), 조직학적으로는 사구체 경화와 함께 신간질의 섬유화 및 세뇨관의 위축이 관찰되어 사구체질환의 말기에서 보이는 일련의 변화를 연구하기에 좋은 모델이다. 그 결과, 단백뇨는 대부분의 예에서 생후 40일 전후에 나타나기 시작하였다. 대조군에서는 전 실험기간에 걸쳐서 지속적인 단백뇨를 보였으며 10주령에서는 심한 단백뇨를 나타내었다. 실험시작 시점인 6주령에서는 단백뇨의 등급이 3⁺이상은 없었으나 10주령 대조군과 AdCMVLacZ 감염 실험군에서는 약 50%에서 3⁺의 단백뇨를 보였다. 반면, AdCMVhIL-10 감염 실험군에서는 단백뇨가 현저히 줄어서 0 혹은 1⁺정도의 단백뇨만이 나타났다 (표 2참조).

상기에서 실험동물로 사용한 FSG/Kist 생쥐는 시간이 지나면서 자연적으로 사구체에 경화증이 생기는 동물모델로서 약 6주령에서 경화증이 시작된다. 6주령에서 시작된 사구체 경화증은 10주령이 되면서 모세혈관 내강의 소실과 경화 및 세뇨관의 위축, 염증세포의 침윤과 더불어 섬유화가 현저하게 발생하는 것을 관찰할 수 있다. 신장에 본 발명의 재조합 바이러스 벡터 AdCMVhIL-10을 주사하면 혈청 내 hIL-10 발현이 2주이상 발현되므로 본 발명자들은 상기 기간 동안 FGS/Kist 생쥐에서 IL-10에 의한 사구체 경화증 발생의 억제가 일어나는지 조사하였다.

그 결과, 실험시작 시점인 생후 6주령의 대조군 Ⅰ의 수컷에서는 약 5%의 사구체가 경화증을 보였으며 사구체 경화율은 0.05 ±0.03 이였고, 암컷에서는 약 3%의 사구체에서 경화증이 나타났으며 사구체 경화율은 0.06 ±0.06 이였다 (도 5의 A 참조). 질병의 발생이 이루어지는 시점이어서 주위의 간질 및 세뇨관은 거의 정상이었다. 그러나, 생후 10주령의 대조군 Ⅱ에서는 수컷 사구체의 약 44%에서 경화증이 나타났으며 경화율은 0.69 ±0.32 이였고, 암컷에서는 사구체의 약 12%에서 경화증이 관찰되었으며 경화율은 0.12 ±0.08 이였다 (도 5의 B 참조). 주위의 간질 및 신세뇨관은 위축, 염증세포 및 간질의 섬유화가 보였으며 이들이 차지하는 영역은 피질 부위의 약 20% 정도였다. 대조군 Ⅲ인 AdCMVLacZ 감염 실험군에서는, 무 처리군처럼 생후 10주령에 현저한 신장경화증 및 염증세포의 침윤이 관찰되었다 (도 5의 C 참조). 반면, 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터인 AdCMVhIL-10이 감염된 실험군에서는, 생후 10주령의 수컷 사구체에서 약 1.25%만이 경화증을 보였으며 경화율은 0.01 ±0.02 이였고, 암컷에서는 약 0.25%의 사구체에서 경화증이 관찰되었으며 경화율은 무시할 수 있는 수준 (0.0025 ±0.0046) 이였다 (도 5의 D 참조). 또한, 실험군의 암수 모두에서 간질의 염증세포 침윤은 거의 없었다 (표 3참조).

이러한 결과는 AdCMVhIL-10 감염에 따라 생성된 hIL-10이 단핵구의 침윤을 억제하여 염증세포에 의한 파괴작용을 방지함으로써 자연적으로 발생하는 분절성 사구체 경화증의 진행을 예방할 뿐 아니라 단백뇨의 생성을 효과적으로 억제하여 IL-10 유전자 요법이 신부전의 치료에 유용하게 사용될 수 있는 가능성을 제시하는 것이다.

신기능 부전에 대한 종래의 치료방법은 대중 요법, 즉 스테로이드 등으로 단백뇨를 완화시키고 혈압 강하제를 사용하여 전신적 및 신장 내 고혈압을 방지하여 신 기능 상실을 지연시키는 것이 대부분이었다. 치료제로 주로 사용되는 스테로이드나 사이클로스포린 (cyclosporin)은 면역억제기능이 있어서 본 발명의 IL-10 처럼 염증세포의 작용 혹은 침윤을 억제함으로써 효과가 있을 것으로 생각된다. 그러나, 이들 약제들의 장시간 사용은 전신적 부작용을 유발할 수 있는 문제점으로인해 그 사용이 제한적인 반면에 소량의 국소적 IL-10의 투여는 이러한 단점을 보완하는데 도움이 될 수 있으므로 신부전증의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

아울러, 본 발명에서는 상기 hIL-10 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터 AdCMVhIL-10 또는 이로부터 생성된 hIL-10 단백질을 유효성분으로 하는 약학적 조성물을 제공한다.

상기 약학적 조성물은 난치성 질환인 신부전증의 예방, 진단 또는 치료에 사용될 수 있는데, 보다 상세하게는 단핵구의 침윤에 기인하거나 염증세포에 의한 파괴작용에 기인하는 질환 또는 단백뇨의 증가로 인한 질환을 예방, 진단 또는 치료하기 위해 사용할 수 있다. 상기 질환들은 분절성 사구체신염 등의 신부전증 질환 등을 포함한다.

이때 상기 약학적 조성물의 유효성분으로는 재조합 아데노바이러스 벡터 AdCMVhIL-10으로 형질감염된 세포에서 대량으로 생산된 hIL-10 단백질을 사용할 수도 있으며, 보다 바람직하게는 그 발현벡터 자체를 사용하는 것이 좋은데 이는 발현벡터를 투여하면 그로부터 지속적으로 융합단백질이 생산될 수 있기 때문이다. 상기 발현벡터를 유효성분으로 하는 약학적 조성물을 비경구로 생체 조직에 투여하면 투여된 생체 조직은 높은 수준으로 hIL-10을 생산한다. 따라서, 본 발명의 발현벡터는 유전자 요법 (gene therapy)에 사용되는 약학적 조성물의 유효성분으로서 이용할 수 있다.

상기 재조합 아데노바이러스 벡터 AdCMVhIL-10 또는 상기 hIL-10 단백질은임상투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며, 특히 비경구 주사 투여가 바람직하다.

즉, 상기 재조합 아데노바이러스 벡터 AdCMVhIL-10 또는 상기 hIL-10 단백질은 실제 임상투여시에 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (Calcium carbonate), 수크로스 (Sucrose) 또는 락토오스 (Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 재조합 아데노 바이러스 벡터의 유효용량은 생쥐의 경우 5 ×10¹⁰~ 10⁸pfu (plaue forming unit)이고 바람직하기로는 5 ×10⁹pfu이며, 상기 hIL-10 단백질의 유효용량은 혈청내에서 10 ~ 2000 pg/㎖이고, 바람직하기로는 10 ~ 2000 pg/㎖이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 재조합 아데노바이러스 벡터의 제조

본 발명자들은 인간형 IL-10을 신부전증의 유전자 요법에 이용하기 위하여, 이를 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 제조하였다.

우선, 바이러스성 벡터로는 E1a가 삭제되어 자체적 복제가 결여된 인간형 (human type) 5 아데노바이러스 (adenovirus)를 사용하였다. 인간 IL-10 발현을 위해 싸이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus, CMV) 프로모터와 소 성장 호르몬 (bovine growth hormone, BGH)의 폴리아데닐화 신호 (polyadenylation signal)를 갖는 재조합 아데노바이러스 벡터 AdCMVhIL-10을 제조하였다. 대조군 실험을 위해서는 대장균 (E. coli) β-갈락토시다아제 (β-galactosidase) 유전자를 포함하는 재조합 벡터 AdCMVLacZ를 사용하였다.

아데노바이러스의 전달 (shuttle)벡터는 pΔE1sp1A (Mcgrory, M. J. et al.,Virology, 163:614-617, 1988)의BglⅡ와HindⅢ를 절단한 다음, 싸이토메갈로바이러스의 프로모터를 삽입하였다. 프로모터가 삽입된 플라스미드를BamHI,ClaI,NheI과ApaI 제한효소 작용지점을 가진 링커 (linker)와ApaI과PvuⅡ로 절단된 소성장 호르몬의 폴리아데닐화 신호를 갖는 유전자를 동시에 접합하였다. 이로부터 제작된 전달벡터의XbaI,EcoRI 부위에는 인간형 IL-10을 삽입하였고,EcoRI과BamHI 부위에는 LacZ를 삽입하였다. 구체적으로, 상기 재조합 아데노바이러스 벡터는 발현 카셋트 (expression casette)에 또는 LacZ 유전자를 포함하고 있는 아데노바이러스 전달 (shuttle) 벡터와 pJM17 아데노바이러스 구조 (rescue) 벡터를 293 세포에 동시형질감염 (cotransfection)시킨 후 동형 재조합 (homologous recombination)을 통하여 생산하였다 (Berker, K. L. et al.,Biotechniques, 6:616-629, 1998; Mcgroy, M. J. et al.,Virology, 163:614-617, 1991). 동시형질감염시킨 293 세포는 EMEM 배지에서 37℃, 5% CO₂배양기에서 배양하였고, 이로부터 생산된 재조합 아데노바이러스 벡터는 증폭 후 CsCl 밀도구배 (density gradient)를 사용하여 순수 분리하여 PBS-10% 글리세롤 (glycerol) 용액에 투석한 후 사용하였다.

이와 같이 제조된 본 발명의 IL-10 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터 AdCMVhIL-10는 2001년 2월 12일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다 (수탁번호: KCTC-0958BP).

본 발명의 IL-10 발현 재조합 아데노바이러스 벡터의 농도를 측정하기 위하여 상기와 같이 분리된 바이러스 용액을 순차적으로 희석한 후, 1시간 동안 293 세포에 감염시킨 뒤 감염된 293 세포에 아가로오스를 상층하여 7일 동안 배양한 후 나타나는 플라크 (plaque)의 수를 세어 농도를 결정하였다 (Graham, F. L. et al.,Virology, 52:456-467, 1973).

<실시예 2> 조직과 세포상에서의 재조합 아데노바이러스 벡터의 감염여부 및 hIL-10 유전자의 발현 조사

상기 실시예 1에서 제조된 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터 AdCMVhIL-10가 감염세포에서 효율적으로 hIL-10 유전자를 발현하여 hIL-10 단백질을 생성하는지 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

<2-1> 역전사 중합반응을 이용한 hIL-10 전사체 생성조사

우선, 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터 AdCMVhIL-10가 감염세포에서 효율적으로 hIL-10 유전자를 발현하는지 조사하기 위하여 HeLa 세포에 AdCMVhIL-10을 감염시킨 후 일차적으로 RT-PCR을 사용하여 hIL-10의 전사체 생성을 확인하였다.

구체적으로, 5 X 10⁵의 HeLa 세포에 50 MOI (multiplicity of infection)로 5 X 10⁹pfu/㎖ 농도의 AdCMVhIL-10을 감염시킨후, 열처리된 10% FBS, 페니실린 (penicillin, 100 U/㎖)과 스트렙토마이신 (streptomycin, 100 ㎍/㎖)을 포함하는DMEM 배지에서 24시간 동안 37℃, 5% CO₂배양기에서 배양하였다. 전체 RNA는 Tri-Pure^TM(Roche Molecular Biochemicals, Germany)을 사용하여 분리하였고, RT-PCR은 Access^TMRT-PCR system (Promega, USA)을 사용하여 수행하였다. 반응조건은 cDNA 합성을 위하여 48℃에서 45분 동안 반응한 후, 94℃에서 30초, 56℃에서 1분, 68℃에서 2분 동안 35회 반복하였다. hIL-10 전사체에 대한 PCR은서열번호 2로 기재되는 상류부위 시발체 (upstream primer)와서열번호 3으로 기재되는 하류부위 시발체 (downstream primer)를 사용하여 수행하였다. PCR 산물은 1.2% 아가로오스 겔 (agarose gel)에서 전기영동한 후 니트로셀룰로오스 막 (nitrocellulose membrane)에 이동하였다. 플루오르세인-11-dUTP (Fluorescein-11-dUTP, Amersham, UK)로 표지된서열번호 4로 기재되는 내부 올리고뉴클레오티드 (internal oligonucleotide)를 상기 니트로셀룰로오스 막과 배양한 후 ECL 검출 시스템 (ECL detection system)으로 신호를 확인하였다.

AdCMVhIL-10을 HeLa 세포에 10 moi로 4시간 동안 감염시킨 후 RT-PCR을 수행한 결과,도 1에 나타난 바와 같이 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터 AdCMVhIL-10가 도입된 HeLa 세포에서는 hIL-10의 전사체가 증폭되어 생성된 535 bp 크기의 RT-PCR 산물을 확인할 수 있었다 (도 1a, 레인 3). 반면, 재조합 아데노바이러스 벡터가 도입되지 않은 대조구인 sham 감염 세포 (레인 1) 또는 AdCMVLacZ가 감염된 세포 (레인 2)에서는 상기와 같이 hIL-10의 전사체가 증폭되어 생성된 PCR 산물이 관찰되지 않았다.

또한, RT-PCR에 의해 증폭된 DNA 밴드가 hIL-10 전사체에서 유래한 것인지를 재확인하기 위하여 이를 서던 블럿 분석 (Sourthern blot analysis) 후 혼성화 내부 시발체 (hybridizing internal primer)를 사용하여 조사한 결과, 535 bp의 증폭된 DNA 밴드만이 혼성화 내부 시발체에 결합하는 것을 확인하였다 (도 1b)

<2-2> 혈중 인간형 IL-10의 측정

상기에서 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터 AdCMVhIL-10가 감염된 세포에서 인간형 IL-10 유전자가 발현됨을 확인한 본 발명자들은 AdCMVhIL-10이 감염된 HeLa 세포에서 hIL-10 단백질의 생성을 조사하기 위하여 ELISA를 사용하여 혈청 내 hIL-10의 농도를 측정하였다.

구체적으로, 혈청 내 hIL-10 농도를 측정하기 위하여 AdCMVhIL-10 20 ㎕ (5 X 10⁹pfu/㎖)를 주입한 생쥐 5 마리의 혈액을 모아서 사용하였다. 실험동물은 CBA/Nga 생쥐와 RFM/Nga 생쥐의 교배에서 만들어진 FGS/Kist 생쥐를 한국 생명공학연구원에서 주령 5주의 암수 총 36마리를 공급받아 플라스틱 쥐 장에서 사육하였다. 실험 전기간 동안 펠렛형 고형사료로 사육하였고 물은 자유롭게 먹였다. 약 1주일 동안의 적응 기간을 거친 후 단백뇨를 이용한 단백 검사 후 인체 IL-10 유전자 요법군으로 암수 각각 6마리씩을 정하고 (실험군), 시작 시점의 신장의 조직학적 상황을 조사하기 위한 대조군으로 암수 각각 6마리씩을 사용하였다 (대조군 Ⅰ). 치료 효과 후를 비교하기 위한 대조군으로 암수 각각 6마리씩을 정해 사육하여 (대조군 Ⅱ) 실험군과 함께 4주 후에 희생하여 관찰하였다. 재조합 아데노바이러스 주입의 대조군으로서 AdCMVLacZ를 실험군과 동일한 양으로 암수 각각 3마리씩을 정해 주입하였고 4주 후에 관찰하였다 (대조군 Ⅲ).

상기와 같이 준비된 실험동물의 신장에 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터를 주입하기 위하여 각 군의 생쥐를 에테르 (ether)로 마취시킨 후 등쪽 신장부위의 털을 제거하고 소독하였다. 소독포로 왼쪽 신장부위를 제외한 나머지 부위를 가린 후 약 1 ㎝ 정도를 'I'자 형태로 피부 및 근육을 절개하였다. 왼쪽 신장을 완전히 노출시킨 후 해밀톤 주사기를 이용하여 상기 실시예 1에서 제조한 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터 20 ㎕ (5 X 10⁹pfu/㎖)를 신 피질에 주사하였다. 주사부위를 소독된 거즈로 약 30초간 가볍게 눌러준 후 근육과 피부를 봉합하였다.

hIL-10의 측정방법은 Biosource International (Camarillo, USA)로부터 구입한 ELISA 킷트를 사용하여 제조사의 지침에 따라 수행하였다. 요약하면, hIL-10에 대한 항체를 96-웰 플레이트 (96-well plate)에 코팅한 후 바이오틴화 항-IL-10 항체 (biotinylated anti-IL-10 antibodies)를 각각의 웰에 첨가하여 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 상기 플레이트를 PBS-0.05% Tween 20으로 세척한 후 스트렙타비딘-서양고추냉이 퍼옥시다아제 복합체 (streptavidin-horseradish peroxidase conjugate)를 첨가하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이를 다시 상기와 동일한 용액으로 세척한 후, 플레이트에 2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤즈띠아졸린-6-설폰산) (2,2'-Azino-bis-[3-ethybenzthiazoline-6-sulfonic acid], Sigma, USA)을 첨가하여 효소활성을 확인하였고, 405 nm에서 O.D 값을 측정하였다. 반복된 웰로부터 얻은 O.D 값을 평균한 후 대조군 혈청의 값을 빼어 결정하였으며, 혈청 내 hIL-10의 농도는 분리된 hIL-10을 순차적으로 희석하여 얻은 표준화 곡선을 사용하여 결정하였고 그 결과를 하기표 1에 나타내었다.

HeLa 세포 배양액 내 인간 IL-10의 농도

재조합 아데노바이러스 벡터	인간 IL-10 농도
AdNull	검출되지 않음
AdCMVLacZ	검출되지 않음
AdCMVhIL-10	275 ng/㎖

그 결과, 상기표 1에 나타난 바와 같이 AdCMVhIL-10이 감염된 세포는 효과적으로 hIL-10을 분비하여 배양액에 275 ng/㎖의 hIL-10이 존재하고 있음을 확인하였다.

상기 결과들로부터 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터인 AdCMVhIL-10은 세포 감염후 hIL-10을 효율적으로 생산하여 이를 세포 밖으로 분비하는 것을 알 수 있었다.

<실시예 3> 신장세포에 대한 재조합 아데노바이러스 벡터의 감염여부 및 hIL-10의 발현조사

본 발명의 재조합 아데노바이러스를 신장의 피질에 주사했을 때 신장조직에대한 감염 여부 및 감염 부위 그리고 감염의 효율성을 확인하기 위하여 본 발명자들은 AdCMVLacZ를 FGS/Kist 생쥐의 신장에 주사한 후 하기와 같은 실험을 수행하였다.

<3-1> In situ 염색을 이용한 신장세포에 대한 재조합 아데노바이러스 벡터의 감염여부 조사

헤밀톤 주사기를 이용하여 AdCMVLacZ 20 ㎕ (1 X 10⁹pfu/㎖)를 FSG/Kist 생쥐에 감염시키고 48시간 경과 후 에테르로 마취하여 안락사시켰다. 상기 생쥐로부터 적출한 신장을 반으로 절단하여 10% 완충용 포르말린 (buffered formalin)으로 밤새 고정하였다. 고정된 조직을 37℃에서 X-gal 용액 (1.5 mM potassium ferricyanide, 1.5 mM potassium ferrocyanide, 1% X-gal)에 6시간 동안 침투시겨 염색한 후 PBS로 세척하였다. 염색된 조직을 파라핀 (paraffin)으로 포매한 후 4 ㎛ 두께로 절단하여 현미경하에서 관찰하였고, 대조염색으로 헤마톡실린 (hematoxylin)과 에오신 (eosin)으로 염색하였다.

그 결과, AdCMVLacZ가 감염된 신장세포에서는 X-gal 염색 후 푸른색으로 나타났으며 푸른색 염색은 신장전체의 모든 세포에서 관찰되었다 (도 2의 C 및 D). 반면, PBS만이 처리된 대조군에서는 푸른색 염색이 관찰되지 않았다 (도 2의 A 및 B). 이러한 결과는 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터가 사구체를 포함한 신장세포 전체에 효율적으로 감염된다는 사실을 나타내는 것이다.

<3-2> in situ RT-PCR을 이용한 신장세포에서의 hIL-10의 발현조사

상기 실시예 <43-1>에서 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터가 신장세포 전체에 효율적으로 감염됨을 확인한 본 발명자들은 AdCMVhIL-10이 감염된 신장 조직에서 hIL-10 전사체가 생성되는지를 확인하기 위하여in situRT-PCR을 수행하였다.

구체적으로, FGS/Kist 생쥐는 신장에 AdCMVhIL-10을 감염시키고 3일 경과 후 에테르로 마취하여 안락사시켰다. 이로부터 신장을 적출한 후 고정시킨 조직을 OCT 화합물 (OCT compound)을 사용하여 Poly-Prep^TM(Sigma, USA) 슬라이드에 상층하였다. 절편된 조직의 OCT 화합물을 DEPC-PBS로 세척하고 에탄올로 지질을 제거한 후 0.1% Triton X-100에서 90초 동안 반응시켰다. DEPC-PBS로 세척한 후 조직에 프로테나아제 K (proteinase K, 1 ㎎/㎖) 20 ㎕를 처리하여 10분 동안 37℃에서 반응시킨 후 95℃에서 5분 동안의 반응을 통하여 프로테나아제 K를 비활성화시켰다. RNase-free DNase I (5 units)을 조직에 첨가하고 37℃에서 밤새 배양한 후 75℃에서 DNase Ⅰ을 비활성화시키고in situRT-PCR을 수행하였다.

in situRT-PCR의 반응용액은 5 ×완충용액, 10 ×DIG 표지 혼합물 (10×DIG labeling Mix, Roche Molecular Biochemicals, Germany),AMV역전사효소 (AMVreverse transcriptase),Tfl중합효소 (Tflpolymerase), MgSO₄의 조성으로 구성되어 있으며, 반응조건은 48℃에서 45분으로 cDNA를 합성한 후 94℃에서 30초,58℃에서 1분, 68℃에서 2분 동안의 증폭 과정을 35회 반복하였다. RT-PCR 후 조직을 2 ×SSC, 1 ×SSC , 0.5 ×SSC에서 각 10분 동안 세척하였다. 세척된 조직을 1% BSA와 5% 송아지 혈청 (calf serum)을 포함하는 100 mM 말레산 (maleic acid)과 150 mM NaCl 용액 내에서 30분동안 블러킹 (blocking)한 후 0.1% BSA를 포함하는 항-딕 알칼라인 인산화효소 복합 항체 (anti-dig alkaline phosphatase congugated antibody)를 2000배 희석하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 조직을 PBS로 세척한 후 알칼라인 인산화효소의 기질인 NBT/BCIP를 첨가하여 반응시켰다. 10분 동안 반응시킨 후 0.5 M EDTA를 첨가하여 반응을 정지시키고 슬라이드를 탈수시킨 뒤 인산화된 글리세롤로 상층하여 광학현미경으로 관찰하였다.

그 결과,도 3에 나타난 바와 같이 AdCMVhIL-10이 감염된 신장에서는 hIL-10 전사체 발현을 나타내는 갈색의 염색부위가 나타난 (도 3의 B) 반면, AdCMVLacZ를 감염시켰거나 형질전화 유전자 (transgene)을 발현하지 않는 AdNull을 감염시킨 대조군에서는 hIL-10 전사체를 확인할 수 없었다 (도 3의 A).

<3-3> 신장세포 내 hIL-10 단백질의 생성유무 및 농도 측정

본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터가 감염된 신장에서 hIL-10 전사체가 발현됨을 확인한 본 발명자들은 AdCMVhIL-10가 감염된 신장세포에서 hIL-10 단백질의 생성여부을 조사하기 위하여 ELISA를 사용하여 혈청 내 hIL-10의 농도를 측정하였다. AdCMVhIL-10 20 ㎕ (5 X 10⁹pfu/㎖)를 생쥐의 신장에 직접 주사한 후 상기실시예 <2-2>와 동일한 방법으로 ELISA를 수행하여 혈청에서의 hIL-10 존재를 확인하였으며, 재조합 아데노바이러스 감염 1일부터 19일까지 생쥐의 안(眼) 정맥으로부터 혈액을 채취하여 혈청을 분리한 후 hIL-10 생산을 조사하였다.

그 결과,도 4에 나타난 바와 같이 hIL-10 생산은 처리 1일 후에 2000 pg/㎖로 가장 높게 측정되었고, 점차적으로 감소하여 19일째는 hIL-10 발현이 소멸되는 것을 관찰하였다.

<실시예 4> 단백뇨 측정과 병리조직학적 검색

<4-1> hIL-10 유전자 요법에 의한 단백뇨 생성의 억제

FGS/Kist 생쥐에서는 단백뇨가 사구체 경화에 선행해서 나타나므로 본 발명자들은 AdCMVhIL-10 감염에 따른 hIL-10의 생성이 단백뇨의 발생에 어떠한 영향을 주는지를 조사하였다. 구체적으로, 단백뇨의 측정은 각 개체당 한번 배설하는 소변을 마이크로피펫 (micropipette)으로 모아서 Lab-stix (Ames)로 측정하였고 단백뇨의 수치는 0, 1⁺, 2⁺, 3⁺의 등급으로 구분하였으며 각 실험군에서 6마리를 사용하였다. 상기 측정결과를 하기표 2에 나타내었다.

AdCMVhIL-10이 도입된 FGS/Kist 생쥐에서 단백뇨의 측정

그룹/주령 (주)	단백뇨 등급
	0	1	2	3
	수컷	암컷	수컷	암컷	수컷	암컷	수컷	암컷
대조군 Ⅰ (6)	36.7	41.3	40.0	43.7	23.3	15.0	0	0
대조군 Ⅱ (10)	0	1.7	20.7	15.0	29.3	35.0	50.0	48.3
AdCMVLacZ (10)	0	1.3	15.3	12.3	30.3	24.0	50.0	50.0
AdCMVhIL-10 (10)	43.7	50.0	54.6	50.0	1.7	0	0	0

그 결과, 단백뇨는 대부분의 예에서 생후 40일 전후에 나타나기 시작하였다. 상기표 2에 나타난 바와 같이, 대조군에서는 전 실험기간에 걸쳐서 지속적인 단백뇨를 보였으며 10주령에서는 심한 단백뇨를 나타내었다. 실험시작 시점인 6주령에서는 단백뇨의 등급이 3⁺이상은 없었으나 10주령 대조군과 AdCMVLacZ 감염 실험군에서는 약 50%에서 3⁺의 단백뇨를 보였다. 반면, AdCMVhIL-10 감염 실험군에서는 단백뇨가 현저히 줄어서 0 혹은 1⁺정도의 단백뇨만이 나타났다.

<4-2> hIL-10 유전자 요법에 의한 분절성 사구체 경화증의 억제

FSG/Kist 생쥐는 시간이 지나면서 자연적으로 사구체에 경화증이 생기는 동물모델로서 약 6주령에서 경화증이 시작된다. 6주령에서 시작된 사구체 경화증은 10주령이 되면서 모세혈관 내강의 소실과 경화 및 세뇨관의 위축, 염증세포의 침윤과 더불어 섬유화가 현저하게 발생하는 것을 관찰할 수 있다. 신장에 본 발명의 재조합 바이러스 벡터 AdCMVhIL-10을 주사하면 혈청 내 hIL-10 발현이 2주이상 발현되므로 상기 기간 동안 FGS/Kist 생쥐에서 IL-10에 의한 사구체 경화증 발생의 억제가 일어나는지 조사하였다. 이를 위하여, 6주령의 FGS/Kist 생쥐에 AdCMVhIL-10을 신장에 주입한 후 10주령이 되었을 때 무처리 혹은 비특이 재조합 아데노바이러스 벡터를 처리한 대조군과 비교하여 사구체 경화증을 현미경으로 관찰하였다.

구체적으로, 대조군과 실험군을 에테르로 마취한 후 안락사시켜 적출한 신장을 2.5% 포르말린-히스토초이스 (Formaline-Histochoice, Amresco, USA) 용액에 고정시킨 뒤 통상적인 방법으로 파라핀에 포매하고 2 ㎛ 두께로 박절한 뒤 PAS 염색을 시행하여 관찰하였다. 각 군의 신장조직에서 한 개체당 100개의 사구체를 검사하였고 사구체 경화는 분절성으로 모세혈관들이 파괴되어 내강의 소실 및 경화증을 보일 때를 양성으로 하여 경화가 있는 사구체의 백분율 (glomerulosclerosis percentage)을 구하였다. 경화가 있는 사구체에서 병변이 차지하는 범위에 따라 0은 경화가 없는 사구체, 1⁺는 경화가 사구체 면적의 1/2 미만, 2⁺는 경화가 사구체 면적의 1/2 이상 차지하는 경우로 구분한 후 관찰한 총 사구체 수에 대한 경화율 (sclerosis score)을 하기 수학식 1에 의해 계산하여 그 결과를표 3에 나타내었다.

AdCMVhIL-10이 도입된 FGS/Kist 생쥐에서 분절성 사구체 경화증의 관찰

그룹/주령 (주)	경화율 지수 (sclerosis index)
	수컷	암컷
Sham 대조군 Ⅰ(6)	0.05 ±0.03	0.06 ±0.06
Sham 대조군 Ⅱ(10)	0.69 ±0.32	0.12 ±0.08
AdCMVLacZ (10)	0.54 ±0.43	0.10 ±0.06
AdCMVhIL-10 (10)	0.01 ±0.02	무시할 수 있는 정도

그 결과,표 3및도 5에 나타난 바와 같이 실험시작 시점인 생후 6주령의 대조군 Ⅰ의 수컷에서는 약 5%의 사구체가 경화증을 보였으며 사구체 경화율은 0.05 ±0.03 이였고, 암컷에서는 약 3%의 사구체에서 경화증이 나타났으며 사구체 경화율은 0.06 ±0.06 이였다 (도 5의 A). 질병의 발생이 이루어지는 시점이어서 주위의 간질 및 세뇨관은 거의 정상이었다. 그러나, 생후 10주령의 대조군 Ⅱ에서는 수컷 사구체의 약 44%에서 경화증이 나타났으며 경화율은 0.69 ±0.32 이였고, 암컷에서는 사구체의 약 12%에서 경화증이 관찰되었으며 경화율은 0.12 ±0.08 이였다 (도 5의 B). 주위의 간질 및 신세뇨관은 위축, 염증세포 및 간질의 섬유화가 보였으며 이들이 차지하는 영역은 피질 부위의 약 20% 정도였다. 대조군 Ⅲ인 AdCMVLacZ 감염 실험군에서는, 무 처리군처럼 생후 10주령에 현저한 신장경화증 및 염증세포의 침윤이 관찰되었다 (도 5의 C). 반면, 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터인 AdCMVhIL-10이 감염된 실험군에서는, 생후 10주령의 수컷 사구체에서 약 1.25%만이 경화증을 보였으며 경화율은 0.01 ±0.02 이였고, 암컷에서는 약 0.25%의 사구체에서 경화증이 관찰되었으며 경화율은 무시할 수 있는 수준 (0.0025 ±0.0046) 이였다 (도 5의 D). 또한, 실험군의 암수 모두에서 간질의 염증세포 침윤은 거의 없었다.

이러한 결과는 AdCMVhIL-10 감염에 따라 생성된 hIL-10이 자연적으로 발생하는 분절성 사구체 경화증과 단백뇨의 생성을 효과적으로 억제하며 IL-10 유전자 요법이 신부전의 치료에 유용하게 사용될 수 있는 가능성을 제시하는 것이다.

한편 재조합 아데노바이러스 벡터 AdCMVhIL-10의 급성 독성을 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

<실시예 5> 랫트에 대한 비경구투여 급성 독성실험

6주령의 특정병원부재(SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. AdCMVhIL-10 벡터를 1 ㎖의 생리식염수에 현탁하여 10¹⁰pfu (plaque forming unit)/g의 용량으로 상기 랫트 2 마리의 전경골근 (anterior tibialis)에 근육내 주사 투여하였다. 시험물질 투여후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다. 시험결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과 AdCMVhIL-10 벡터는 랫트에서 10¹⁰pfu/g까지 독성변화를 나타내지 않았다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 IL-10 발현 재조합 바이러스 벡터의 감염에 의해 생성된 hIL-10은 단핵구의 침윤을 억제하여 염증세포에 의한 파괴작용을 방지함으로써 사구체 경화증의 진행을 예방할 수 있을 뿐 아니라 단백뇨의 생성을 효과적으로 억제시키므로, 본 발명의 IL-10 발현 재조합 바이러스 벡터는 IL-10을 이용한 신부전증의 유전자 요법에 유용하게 이용될 수 있다.

Claims (8)

1. 사구체 경화증 (glomerulosclerosis) 발생을 효과적으로 억제하는 IL-10 발현 재조합 바이러스 벡터 (Recombinant virus vector).
2. 제 1항에 있어서, 재조합 바이러스 벡터는 레트로바이러스 (retrovirus), 아데노바이러스 (adenovirus), AAV (adeno-associated virus), 허피스 심플렉스바이러스 (herpes simplex virus)의 바이러스성 벡터; 나출 DNA (naked DNA); 및 나출 DNA의 생체내 전달 효율을 높이기 위해 사용되는 리포좀 (liposome), 폴리케타이오닉 리피드 (polycationic lipid), 폴리에틸렌 이민 (polyethyleneimine), 폴리L-라이신 (polyLlysine), 폴리D-라이신 (polyDlysine), 불활성화된 바이러스 벡터 (adenovirus, sendai virus, AAV)와의 복합체로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자 전달체를 이용하는 것을 특징으로 하는 IL-10 발현 재조합 바이러스 벡터.
3. 제 1항에 있어서, Il-10 유전자는 인간 유래의 서열번호 1로 기재되는 cDNA인 것을 특징으로 하는 IL-10 발현 재조합 바이러스 벡터.
4. 제 1항에 있어서, 재조합 바이러스 벡터는 진핵세포에서 유전자 표현에 사용되는 프로모터와 폴리 아데닐화 신호를 포함하는 것을 특징으로 하는 IL-10 발현 재조합 바이러스 벡터.
5. 제 1항에 있어서, 재조합 바이러스 벡터는 아데노바이러스에 인간 IL-10 유전자, 싸이토메갈로바이러스 프로모터를 포함하는 고효율의 유전자 발현 프로모터와 소 성장 호르몬의 폴리아데닐화 신호 혹은 여타 유전자의 폴리아데닐화 신호가 삽입된 것을 특징으로 하는 AdCMVhIL-10 IL-10 발현 재조합 바이러스 벡터 (수탁번호 : KCTC-0958BP).
6. 제 1항의 IL-10 발현 재조합 바이러스 벡터로부터 생산된 IL-10 단백질.
7. 제 1항의 IL-10 발현 재조합 바이러스 벡터를 유효성분으로 하는 신부전증의 예방, 진단 및 치료용 약학적 조성물.
8. 제 6항의 IL-10 단백질을 유효성분으로 하는 신부전증의 예방, 진단 및 치료용 약학적 조성물.