KR20020034166A

KR20020034166A - 트랜스포존을 매개로 한 감별 혼성화법

Info

Publication number: KR20020034166A
Application number: KR1020027001136A
Authority: KR
Inventors: 찰스이안저지; 마스켈던컨존
Original assignee: 애로우 쎄라퓨틱스 리미티드
Priority date: 1999-07-26
Filing date: 2000-07-26
Publication date: 2002-05-08
Also published as: GB2369676B; GB2369676A; WO2001007651A3; IL147843A0; GB0204495D0; AU6454400A; GB9917531D0; EP1218540A2; WO2001007651A2; CA2380171A1; JP2003505091A

Abstract

하기의 단계를 포함하는, 개체의 필수 유전자를 동정하는 방법: (i) 전기 개체의 트랜스포존 변이체 라이브러리를 준비하는 단계; (ii) 삽입된 트랜스포존에 접해 있는 전기 라이브러리에서 폴리누클레오티드 서열을 분리하는 단계; (iii) 전기 폴리누클레오티드 서열을 전기 개체의 폴리누클레오티드 라이브러리에 혼성화하는(hybridising) 단계; 및, (iv) 전기 폴리누클레오티드 라이브러리내에서 전기 폴리누클레오티드 서열이 혼성화하지 않는 폴리누클레오티드를 동정하여 전기 개체의 필수 유전자를 결정하는 단계.

Description

트랜스포존을 매개로 한 감별 혼성화법{Transposon Mediated Differential Hybridisation}

다수의 개체 내에서 변이를 일으키고 그것을 특성화하는, 트랜스포존(transposon) 돌연변이에 기초한 다양한 방법이 기술되어 왔다. 이러한 접근 방법들은 돌연변이 유발 후 전기 개체가 생존하는지에 의존하며, 따라서 단지 트랜스포존이 비필수 유전자 내로 삽입된 변이체만을 검출한다. 실험실적 조건하에서의 배양과 생체내 생존을 비교하는 어떤 조건화된 상태의 돌연변이유발법(mutagenesis protocol)이 개발되어 왔으며, STM(SignatureTaggedMutagenesis) 접근법은 병원성에 중요한 변이체를 동정하는 데 특히 성공적이었다. 그러나, 이 조건화된 방법들은, 그 변이가 치사 표현형(lethal phenotype)으로 나타날 때는 세균의 생존에 필수적인 유전자에서의 변이를 검출할 수 없다.

그러나, 필수 유전자 및 특히 이들이 암호화하는 단백질은 항생제, 구충제, 살진균제, 살충제 및 제초제로의 선별에 사용하기 좋은 대상물이다. 예를 들어, 항생제-내성 세균의 증가는 항생제에 대한 새로운 표적을 조사하는데 새로운 관심을 불러일으켰다. 필수 유전자 및 이들의 단백질 산물들은 이러한 표적으로서의 잠재력을 갖고 있다.

게다가, 조건부 필수 유전자, 즉, 특정 환경에서 개체의 생존에 필수적인 유전자를 동정하는 데 관심이 모아지고 있다. 예를 들어, 병원성 세균의 경우, 필수 유전자는 숙주에서 생존하는 데 필요한 유전자들이다. 이러한 유전자 및 이들이 암호화하는 단백질은 항생제로의 선별에 사용하기 좋은 표적일 수 있다. 이러한 유전자 내에 변이를 갖고 있는 세균은 약독화된 생백신(attenuated live vaccine)에 있어서 유용할 수 있다.

발명의 요약

본 발명자들은 트랜스포존 돌연변이유발법을 사용하여 세균 게놈내의 모든 필수 유전자를 동정하는 일반적인 방법을 고안하고, 그것을 TMDH(TransposonMediatedDifferentialHybridisation)라고 명명하였다. 필수 유전자는, 그들을 제거하거나(예를 들어, 염색체 결실(deletion)때문으로) 또는 그들이 기능적이지 못하도록 변이시켰을 때, 치사 표현형으로 나타나는 유전자들이다. 즉, 그것 없이는 세균이 살아남을 수 없는 유전자이다.

전기 방법은 또한 조건부 필수 유전자의 동정에 사용될 수 있다. 조건부 필수 유전자는 세균의 생존에 절대적으로 필수적인 것은 아니지만, 다양한 조건적인 제약(conditional restraint)하에서의 생존에는 필수적인 유전자를 말한다. 특정한 조건적 제약의 예로서 증가된 온도에서의 생존 및 숙주내에서 병원체(pathogen)의 생존이 있다.

본 발명에 따르면, 하기의 단계를 포함하는, 개체의 필수 유전자를 동정하는 방법이 제공된다:

(i) 전기 개체의 트랜스포존 변이체 라이브러리를 준비하는 단계;

(ii) 전기 라이브러리에서 삽입된 트랜스포존들의 측면에 위치한 폴리누클 레오티드 서열을 분리하는 단계;

(iii) 전기 폴리누클레오티드 서열을 전기 개체의 폴리누클레오티드 라이브러리와 혼성화하는(hybridising) 단계; 및,

(iv) 전기 폴리누클레오티드 라이브러리에서 전기 폴리누클레오티드 서열과 혼성화하지 않은 폴리누클레오티드를 동정하여 전기 개체의 필수 유전자를 결정하는 단계.

본 발명은 또한 하기의 것들을 제공한다:

- 하기의 단계를 포함하는, 개체의 조건부 필수 유전자를 동정하는 방법:

(i) 전기 개체의 트랜스포존 변이체 라이브러리의 첫번째 표본(투입 (input) 라이브러리)을 준비하는 단계;

(ii) 전기 라이브러리의 두번째 표본을 준비하고 전기 표본을 어떤조건적 제약하에 두는 단계;

(iii) 단계 (ii)에서의 조건적 제약에서 생존하는 변이체들을 수집 하여 새로운 라이브러리(산출(output) 라이브러리)를 생성하는 단계; 및,

(iv) 단계 (i)의 투입 라이브러리 및 단계 (iii)의 산출 라이브러리 상에서 개체의 필수 유전자를 동정하는 방법을 수행하여 그 개체의 조건부 필수 유전자를 결정하는 단계;

- 본 발명의 방법에 의하여 동정된 필수 또는 조건부 필수 유전자 또는 전기

유전자에 의하여 암호화되는 폴리펩티드의, 그 유전자의 전사 (transcription) 및/또는 번역(translation) 및/또는 그 유전자에 의하여 암호화되는 폴리펩티드의 활성을 억제하는 인자(inhibitor)를 동정하는 방

법에 사용하기 위한 용도;

- (i) 본 발명의 방법에 의하여 동정된 필수 또는 조건부 필수 유전자의 전

사 및/또는 번역 억제인자; 및/또는

(ii) 전기 유전자에 의하여 암호화되는 폴리펩티드의 활성 억제인자를 동 정하는 방법(이 방법은 시험 물질(test substance)이 전기 유전자의 전사 및/또는 번역 및/또는 전기 유전자에 의하여 암호화되는 폴리펩 티드의 활성을 억제하는지 결정하는 단계를 포함한다);

- 본 발명의 방법에 의하여 동정된 필수 또는 조건부 필수 유전자의 전사 및/또는 번역 및/또는 그 유전자에 의하여 암호화되는 폴리펩티드의 활성을 억제하는 인자를 동정하는 방법에 의하여 동정된 억제인자;

- 필수 또는 조건부 필수 유전자의 전사 및/또는 번역 및/또는 그 유전자에

의하여 암호화되는 폴리펩티드의 활성을 억제하는 인자;

- 본 발명의 억제인자(이 때, 그 필수 또는 조건부 필수 유전자는 세균, 진 균 또는 진핵 기생체의 필수 또는 조건부 필수 유전자이다);

- 인간 또는 동물의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 억제인자;

- 세균, 진균 또는 진핵 기생체 감염의 치료에 사용할 약제의 제조를 위한 본 발명의 억제인자의 용도;

- 본 발명의 억제인자 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제(diluent) 를 포함하는 약학적 조성물

- 본 발명의 억제인자를 치료에 유효한 양으로 숙주에 투여하는 단계를 포함 하는, 세균, 진균 또는 진핵 기생체에 감염된 숙주를 치료하는 방법;

- 본 발명의 억제인자(이 때, 그 필수 또는 조건부 필수 유전자는 세균, 진 균 또는 페스트(pest)의 필수 또는 조건부 필수 유전자이다);

- 본 발명의 억제인자의, 식물 살세균제(bacteriocide), 살진균제 또는 살충 제로 사용하기 위한 용도;

- 본 발명의 억제인자(이 때, 그 필수 또는 조건부 필수 유전자는 식물 조건 부 또는 필수 유전자이다);

- 본 발명에 따른 억제인자의 제초제로 사용하기 위한 용도;

- 개체의 조건부 필수 유전자를 동정하는 방법(이 때, 개체는 세균이며, 조건적 제약은 숙주내에서의 그 세균의 성장이다);

- 개체의 조건부 필수 유전자를 동정하는 방법에 의하여 동정된 하나 이상의 유전자내의 비복귀(non-reverting) 변이에 의하여 약독화된 세균;

- 본 발명의 세균 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 백신;

- 인간 또는 동물을 예방접종하는(vaccinating) 방법에 사용하기 위한 본 발 명의 세균;

- 본 발명의 세균의, 인간 또는 동물의 예방접종을 위한 약제 제조에 사용하 기 위한 용도;

- 본 발명의 세균을 숙주에 투여하는 단계를 포함하는, 포유류 숙주에서 면 역 반응을 증가시키는 방법.

본 발명은 한 개체가 항생제(antibacterial), 살진균제(fungicide), 구충제(antiparasitic), 살충제(pesticide) 및 제초제(herbicide)에 대하여 생존하는 데 필수적인 유전자들을 분리하는 방법에 관한 것이다.

도 1은 TMDH(TransposonMediatedDifferentialHybridisation)를 수행하는 한 가지 가능한 실험전략의 모식도이다.

트랜스포존으로 미리 돌연변이를 유발시킨 세균의 라이브러리에서 분리한 게놈 DNA를 왼쪽 및 오른쪽 팔(arm)의 트랜스포존-특이적(TS) 및 유전자-특이적(GS) 제한효소로 절단한다. 트랜스포존 TnphoA에 대하여, 왼쪽 팔의 제한효소 쌍은DraI/HaeIII이고, 오른쪽 팔의 제한효소 쌍은HpaI/HaeIII이다.

겔 전기영동 후, 200 내지 600 bp 범위의 제한절편(restriction fragment)을분리정제하고, 전기 정제된 절편에 호환 말단을 가진 벡토렛 단위(vectorette unit)들을 연결(ligation)한다. 이 단계에서 추가적으로 그 결과적인 분리된 절편 패널(즉, 왼쪽 팔 및 오른쪽 팔 패널)을 정제할 수 있다.

트랜스포존 서열에 특이적인 올리고누클레오티드 및 벡토렛 서열에 특이적인 두번째 올리고누클레오티드를 포함하고 있는 프라이머 쌍을 사용하여 왼쪽 팔 및 오른쪽 팔의 절편 패널에 대해 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행한다. 이렇게 생성된 두 PCR 절편 패널은 트랜스포존 삽입으로 파손된 유전자들의 서열을 나타내는 왼쪽 및 오른쪽 팔의 공통 탐침(consensus probe)을 구성한다. 그 PCR 절편 패널들은 방사능으로 표지하여 혼성화(hybridization) 실험에 사용할 수 있다.

도 2는 왼쪽 및 오른쪽 팔의 공통 탐침이 서로 다른 신호를 생성할 수 있다는 것을 보여준다. TMDH는, 트랜스포존 삽입 부위에 인접한 왼쪽 및 오른쪽 팔에서 유래한 탐침을 사용한다. 도 2는 필수 유전자(유전자 b)가 두 비필수 유전자 사이에 인접해있는 이론적 상황을 개략적으로 보여준다. 도식 A 및 B에서, 트랜스포존은 비필수 유전자 a의 영역안으로 삽입되었다. 왼쪽 및 오른쪽 팔의 공통 탐침은 주로 비필수 유전자 a의 서열을 포함한다. 그러나, 트랜스포존이 a의 말단쪽으로 삽입된 C에서는, 그 결과적인 오른쪽 팔 공통 탐침의 일부가 필수 유전자 b와 혼성화할 수 있다. 비필수 유전자 c 내로 트랜스포존 삽입시, 또한 유사한 상황이 일어날 수 있는데, 여기서는 왼쪽 팔의 공통 탐침의 구성 요소가 필수 유전자 b와 혼성화할 수 있다. 두 탐침으로부터 생겨난 혼성화 신호를 감별 분석하여 그 유전자가 필수적인지 아닌지에 관한 해석을 할 수 있다.

도 3은 λTnphoA 트랜스포존 라이브러리 왼쪽 및 오른쪽 팔 PCR 산물의 아가로즈 겔 전기영동을 보여준다. 레인 1 및 6은 100bp 크기 마커(size marker)이고; 레인 2는 왼쪽 팔의 PCR 산물이며; 레인 4는 오른쪽 팔의 PCR 산물이다. 레인 3 및 5는 각각 왼쪽 팔 및 오른쪽 팔의 PCR 프라이머를 가진 숙주 주(E. coliXAC) DNA의 PCR이다. 대조군인 레인 3 및 5로부터는 어떤 PCR 산물도 존재하지 않음을 주목해야 한다.

도 4는 공통 탐침들을E. coliORF(open reading frame)들의 격자형 배열(gridded array)에 혼성화한 것을 보여준다. (a)에서는, 파노라마 진 어레이(Panorama Gene Array, Sigma-Genosys Ltd)에 대한³³P로 표지된 왼쪽 팔 탐침의 혼성화를 보여준다. 세 영역은E. coli모든 단백질을 암호화하는 유전자를 나타내는 4290개의 PCR-증폭된 ORF를 포함하고 있다. 양성 혼성화 신호는 트랜스포존 삽입으로 파손된 유전자에 해당하며, 그것으로 비필수 유전자를 동정한다.

(b)에서는, 파노라마 진 어레이에 대한³³P로 표지된 오른쪽 팔 탐침의 혼성화를 보여준다. 세 영역은E. coli모든 단백질을 암호화하는 유전자를 나타내는 4290개의 PCR-증폭된 ORF를 포함하고 있다. 양성 혼성화 신호는 트랜스포존 삽입으로 파손된 유전자에 해당하며, 그것으로 비필수 유전자를 동정한다.

[서열목록의 설명]

서열번호 1은 T7 RNA 중합효소 부위의 서열을 개시한다.

서열번호 2는 pT7Blue 벡터로부터 T7 RNA 중합효소 부위를 증폭하는 데 사용하기 위한 프라이머 서열을 개시한다.

서열번호 3은 pT7Blue 벡터로부터 T7 RNA 중합효소 부위를 증폭하는 데 사용하기 위한 프라이머 서열을 개시한다.

서열번호 4는 PHO2 프라이머 서열을 개시한다.

서열번호 5는 INV1 프라이머 서열을 개시한다.

본 발명은 개체의 필수 유전자를 동정하는 방법을 제공한다. 전기 방법에는, 일반적으로 특정 개체의 트랜스포존 변이체 라이브러리를 구축하는 것이 필요하다.

트랜스포존 변이체 라이브러리는 라이브러리내에 변이체의 폴리누클레오티드 서열의 복합 풀(pool)을 가진 "공통 탐침"을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 이 공통 탐침은 트랜스포존 삽입 부위와 접해 있는 폴리누클레오티드 서열을 포함하며, 따라서 필수적이지 않은 유전자의 서열을 포함한다. 이 공통 탐침을 생성하기 위해 사용되는 특정 방법으로 트랜스포존과 접해 있는 한쪽 또는 양쪽 영역의 서열을 분리할 수 있다. 일반적으로, 공통 탐침을 생성하기 위하여 두 단계를 이용한다. 첫째로, 트랜스포존에 접해 있는 서열을 분리하고, 둘째로, 이들을 증폭시킨다.

이 공통 탐침을 트랜스포존으로 표지된(transposon-tagged) 변이체 생성을 위하여 사용되는 개체의 폴리누클레오티드에 혼성화한다. 이 공통 탐침에 혼성화하지 않는 폴리누클레오티드는 그 개체의 생존에 필수적인 유전자에 해당할 것이다.

트랜스포존 변이체 라이브러리의 구축

일반적으로, 트랜스포존 변이체 라이브러리를 생성한다. 간혹 전위요소 (transposable element)로 불리는 트랜스포존은 이동성 폴리누클레오티드이다. 트랜스포존이라는 용어는 당업계의 숙련된 자에게 잘 알려져 있으며, 서열 구성-예를 들어 각 말단에서의 짧은 역반복 서열(inverted repeat); 양 말단에서 직접적으로 반복된 긴 말단 반복 서열(long terminal repeat, LTR); 및, 간혹 5´말단이 절단된 RNA 전사물의 3´말단에서의 polyA와 같은-을 기초로 구별될 수 있는 여러 부류의 트랜스포존이 있다. 어떤 종류의 바이러스, 예를 들어 레트로바이러스는 또한 숙주 게놈내로 통합되며, 따라서 삽입 변이체 라이브러리 생성에 사용할 수 있다. 그러나, 트랜스포존은 일반적으로 병원성에 관련된 안전상의 문제를 피할 수 있는 바이러스가 선호된다.

적절한 트랜스포존은 어떤 것이라도 트랜스포존 라이브러리 생성에 사용될 수 있다.

적절한 세균성 트랜스포존은 Tn3, γδ, Tn10, Tn5, TnphoA, Tn903, Tn917, 박테리오파지 Mu 및 관련 바이러스 등이다. 상기 언급한 트랜스포존 중 어떤 것이라도 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 바람직한 트랜스포존은 Tn5, Tn10및 TnphoA 등의, 항생제 내성 유전자(이것은 트랜스포존을 가진 변이체를 동정하는 데 유용할 수 있다)를 가진 것들이다. 예를 들어, Tn10은 그 삽입서열(IS element)들 사이에 테트라사이클린(tetracycline) 내성 유전자를 갖고 있으며, Tn5는 카나마이신(kanamycin), 스트렙토마이신(streptomycin) 및 블레오마이신(bleomycin)에 대한 내성을 부여하는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 갖고 있다. 물론, 그 삽입서열들 사이에 항생제 내성 유전자들을 서로 다르게 조합하여 삽입하거나 또는, 예를 들어, 한 항생제 내성 유전자의 암호 영역(coding region)내에 과잉 염기 대체(redundant base substitution)를 일으킨다든지 하여 트랜스포존의 폴리누클레오티드 서열을 바꿈으로써 새로운 트랜스포존을 생성하는 것이 가능하다. 이러한 트랜스포존이 본 발명의 영역에 포함됨은 자명할 것이다.

적절한 진균성 전위요소에는Saccharomyces cerevisiae의Ty1요소(element) 및Fot1/Pogo-유사 및Tc1/Mariner-유사 요소 등의 사상(filamentous) 진균 요소(사상 진균은Erysiphe graminis,Magnaporthe grisea등 농업상 중요한 식물 병원체를 포함한다)가 있다(참조: Kempen 및 Kuck, Bioessays20, 652-659, 1998).

적절한 식물 요소로는Ac/Ds,Tam3및 기타Tam요소들,cin4및spm이 있다.

적절한 동물 요소로는Drosophila에서 사용될 수 있는P및hobo, 및Caenorhabditis elegans에서 사용될 수 있는Tc1이 있다.

트랜스포존 변이체 라이브러리는 당업계에 숙련된 자에게 알려진 방법이라면 어떠한 것이든지 그에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 세균성 트랜스포존 변이체 라이브러리는 트랜스포존 및 선발 표지(selectable marker)를 함유한 플라스미드(plasmid) 또는 박테리오파지 벡터 둘 중 하나를 사용하여 작제할 수 있다. 예로서 λTnphoA와 같은 박테리오파지 λ는 적절한 수용(recipient) 세균주, 예를 들어E. coliXAC를 감염시키는 데 사용할 수 있다. 이 대장균주는 박테리오파지가 복제하고 이어서 용균하는(lysing) 것을 막는 억제 변이를 갖고 있으며, 또한 전위된 염색체 DNA를 가진 집락(colony)의 선별을 가능하게 하는 항생제 내성 유전자를 갖고 있다. 그 벡터는 λ염색체가 숙주(세균) 염색체내로 통합되는 것을 막는 변이를 갖고 있으며, 따라서 변이된 E. coli 유전자가 없는 가양성(false positive) 집락은 성장하지 못한다. 수용 균주는 강화배지(예를 들어 Luria Broth)로 배양하고, 대수 증식 중기(mid log phase)에 있는 37℃에서 1시간동안 λ트랜스포존 벡터로 감염시킨다. 감염된 세포의 부분표본(aliquot)들을 적절한 선별 항생제가 함유된 L-아가 위에 플레이팅하고 37℃에서 하룻밤동안 배양한다. 이 집락들은 트랜스포존 라이브러리를 구성하며, 추가적으로 본 출원에서 기술된 TMDH 방법으로 분석될 수 있다.

이러한 라이브러리의 증식으로 수천의 변이가 생성되며, 이것은 변이시 세포의 사멸로 이끌지 않는 유전자, 즉, 비필수 유전자내에 필요시 모두 존재하는 변이로부터의 결과이다. 일반적으로, 이러한 라이브러리는 비필수 유전자의 적어도80%내에, 바람직하게는 적어도 90%내에, 좀더 바람직하게는 적어도 95%내에, 및 가장 바람직하게는 적어도 99%내에, 최소한 하나의 트랜스포존 삽입을 포함할 것이다.

특정 게놈의 일부 영역은, 예를 들어 특정 트랜스포존이 접근하기 어려운 이차 또는 삼차 구조를 가진 등의 이유로 특정 트랜스포존이 삽입되기 어려울 수 있다. 따라서, 두 트랜스포존 라이브러리를 결합시켜 더 많은 유전자내로 트랜스포존 삽입 가능성을 높이는 것이 유익할 수 있다. 예를 들어, 세균성 라이브러리, 예로서 Tn5및 Tn10라이브러리의 경우에, 결합될 수 있다.

공통 탐침의 제조

공통 탐침은 트랜스포존에 접해 있는 폴리누클레오티드 서열로부터 제조된다. 공통 탐침은 트랜스포존의 한쪽 또는 양쪽의 폴리누클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 이는 일반적으로 공통 탐침을 제조하는 방법의 유형에 따라 좌우될 것이다. 예로서, 역 PCR(inverse PCR)은 트랜스포존의 양쪽 폴리누클레오티드 서열의 분리를 유발하는 반면, 벡토렛 PCR은 일반적으로 트랜스포존의 한쪽 폴리누클레오티드 서열의 분리를 유발한다.

일반적으로, 인접(flanking) 서열은 특정 변이체 라이브러리, 패널 또는 풀내에서 변이체의 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 좀더 바람직하게는 적어도 95% 및 가장 바람직하게는 적어도 99%로부터 분리될 것이다.

당업계에 있는 자에게 알려진 어떠한 방법이라도 트랜스포존에 인접한 폴리누클레오티드 서열을 분리하고 따라서 공통 탐침을 제조하는 데 사용할 수 있다.

바람직한 방법은 두 공통 탐침의 분리를 수반한다: (트랜스포존의 왼손 쪽에 접해 있는 서열을 포함한) 왼쪽 팔 공통 탐침 및 (트랜스포존의 오른손 쪽에 접해 있는 서열을 포함한) 오른쪽 팔 공통 탐침. 각 공통 탐침은 일반적으로 제한효소에 의한 절단으로 분리되며, 보통 PCR 등의 증폭 단계가 이어진다. 제한효소로 절단 후, 증폭 단계 전에 벡토렛 단위 등의 링커(linker)를 연결시킬 수 있다(도 1).

본 발명의 바람직한 방법에서는, 트랜스포존 변이체 라이브러리에서 게놈 DNA를 분리하고, 트랜스포존 말단 근처를 자르는 첫번째 제한효소로 그것을 절단한다. 일반적으로, 헥사누클레오티드(hexanucleotide) 서열을 인식하는 제한효소가 적합하다. 사용되는 제한효소는 트랜스포존-표지된 라이브러리를 제조하는데 사용된 트랜스포존 서열에 좌우된다. 이 효소들은 트랜스포존 특이적(T-특이적) 제한효소로 언급된다. TnphoA의 경우에, 적합한 T-특이적 제한효소는 트랜스포존의 왼손 말단 가까이를 절단하는DraI 및, 트랜스포존의 오른손 말단 가까이를 절단하는HpaI이다(도 1). 일반적으로는, 라이브러리의 한 부분표본을 왼손 T-특이적 제한효소로 절단하며, 추가적인 부분표본은 오른손 T-특이적 제한효소로 개별적으로 절단한다.

그런 다음, 그 결과로서 생긴 절편 풀을 추가적인 제한효소로 개별적으로 절단할 수 있는데, 그 제한효소는 일반적으로 T-특이적 제한효소와 다른 것이다. 두번째 제한효소인 유전자-특이적(G-특이적) 제한효소는 트랜스포존에 의하여 파손된 게놈 서열내의 어딘가를 자르기 위한 것이다. 보통, G-특이적 제한효소는 4개의염기쌍 인식 서열을 가지며, 하기 표 1에 적절한 예가 나와 있다:

표 1: TMDH에 사용하기 적합한 4bp 인식 유형 II 제한효소의 예

효소	인식 부위	효소	인식 부위
AciI	C^↓CGCGGC_↑G	MseI	T^↓TAAAAT_↑T
AluI	AG^↓CTTC_↑GA	MspI	C^↓CGGGGC_↑C
BfaI	C^↓TAGGAT_↑C	NlaIII	^↓CATGGTAC_↑
BstuI	CG^↓CGGC_↑GC	RsaI	GT^↓ACCA_↑TG
DpnI	^↓GATCCTAG_↑	Sau3a	^↓GATCCTAG_↑
HaeIII	GG^↓CCCC_↑GG	TaqI	T^↓CGAAGC_↑T
HinpI	G^↓CGCCGC_↑G	Tsp509	^↓AATTTTAA_↑

어떤 경우에는, T- 및 G-특이적 제한효소 둘 다로서 동일한 제한효소를 사용하는 것, 즉, 동일 효소를 트랜스포존내 및 단절된 서열내를 절단하는 데 사용하는 것이 편리할 수 있다. 추가적으로, 동일 효소를 트랜스포존의 왼손 쪽 및 오른손쪽 둘 다에서의 절단에 사용하는 것이 또한 편리할 수 있다.

그 후, 결과로서 생긴 절편들을 크기별로 선별한다. 일반적으로, 대략 200 내지 600 bp 크기의 절편을 예를 들어 겔 등으로부터 분리하고 정제한다. 분리된 절편의 크기가 작을수록, 트랜스포존이 개재된 유전자에 인접해 있는 유전자의 서열을 포함한 공통 탐침일 가망은 줄어든다. 일반적으로, 그 후 절편들의 왼쪽 및 오른쪽 팔 풀을 증폭한다.

증폭은 왼쪽 및 오른쪽 팔 절편 풀에 링커, 바람직하게는 벡토렛 단위를 연결함으로 수행된다. 링커들이 왼쪽 및 오른쪽 팔 풀에 연결되면, 그 결과로 생긴 절편들을 예를 들어 겔을 통해 또는 스펀-컬럼(spun-column) 크로마토그래피를 사용하여 재정제한다. 그런 다음, 주형(template)으로 절편들의 그 왼쪽 및 오른쪽 팔 풀을 사용하고, 트랜스포존 서열에 특이적인 올리고누클레오티드 및 링커(예를 들어 벡토렛) 서열에 특이적인 두번째 올리고누클레오티드로 구성된 프라이머 쌍을 사용하여 PCR을 수행한다(도 1g). 트랜스포존- 및 벡토렛-특이적 PCR 프라이머를 사용할 경우, 트랜스포존 삽입 부위에 인접한 서열이 특이적으로 증폭된다.

다르게는, 절편들의 왼쪽 및 오른쪽 팔 풀을 순환적 프라이머 확장(cycle primer extension)으로 증폭시킬 수 있다. 적절한 표지된 올리고누클레오티드 프라이머를 사용하면, 트랜스포존 삽입 부위에 인접한 서열을 증폭할 수 있다. 이 표지된 증폭 서열은 혼성화 실험에 직접 사용될 수 있다.

다르게는, 왼쪽 및 오른쪽 팔 풀을 역 PCR(IPCR)로 증폭시킬 수 있다. 따라서, 절편들의 왼쪽 및 오른쪽 팔 풀을 자가연결(self-ligation)시키고, 이어 트랜스포존 특이적인 프라이머를 사용하여 증폭시킨다. IPCR 방법을 사용하면, "스터퍼(stuffer)" 절편이 자가연결 반응으로 연결될 가능성이 있는데, 그것은 트랜스포존으로 파손된 서열을 따라 증폭될 것이다. 이 물질이 표지 실험(labelling experiment)에 사용된다면, 그 스터퍼 서열은 그 폴리누클레오티드 라이브러리에 결합함에 따라 비특이적 기저 신호를 생성할 수 있을 것이다. 이러한 스터퍼 절편을 제거하기 위하여, 비오틴을 함유한(biotinylated) 프라이머를 IPCR 반응에 사용할 수 있다. IPCR 후, 처음에 인접 서열을 분리하기 위해 사용한 아무 효소로 그 공통 서열을 다시 절단할 수 있다. 이로써 그 스터퍼 절편은 유리되며, 그 후 자기 구슬(magnetic bead)-스트렙타비딘(streptavidin) 접합체를 사용하여 공통서열을 그 "스터퍼" 절편으로부터 분리할 수 있다. 그런 다음, 정제된 DNA를 표지하여 격자형 배열 등의 폴리누클레오티드 라이브러리에 혼성화하는 데 사용할 수 있다.

따라서, 상기한 방법으로 트랜스포존의 양쪽에 접해 있는 서열이 분리될 수 있다. 이러한 인접 절편들의 풀, 즉, 왼쪽 및 오른쪽 팔 공통 탐침들은 필수 유전자를 결정하는 혼성화 실험에 사용될 수 있다.

공통 탐침을 제조하는 추가적인 방법에는 RNA 중합효소 결합 부위 서열을 포함하는 인공적(artificial) 트랜스포존을 사용하는 것이 있다. 이러한 트랜스포존은 트랜스포존 삽입 라이브러리를 제조하는데 사용될 수 있다. 상기한 바대로 분리, 절단하고 크기별로 선별된 트랜스포존 라이브러리의 DNA에 RNA 중합효소를 첨가하여 이러한 라이브러리 내의 트랜스포존 인접 서열을 분리할 수 있다. 이렇게 생성된 RNA 전사물은 표지되어 하기에 기술된 혼성화 실험에 사용될 수 있다. 다르게는, 이 RNA 전사물을 역전사하고, 이렇게 제조된 상보성(complementary) DNA를 표지하여 혼성화 실험에 사용할 수 있다. 양쪽 말단 각각에 상이한 중합효소 결합 부위를 가진 트랜스포존을 사용하면, 절편들의 왼쪽 및 오른쪽 팔 풀을 분리할 수 있다.

공통 탐침을 제조하는 추가적인 방법에는 예로서, 스플링커렛 PCR(splinkerette-PCR), 표적 유전자 워킹(targetted gene walking) PCR, 제한 부위(restriction site) PCR, 캡쳐(capture) PCR, 팬핸들(panhandle) PCR 및 부메랑 DNA 증폭(boomerang DNA amplification)이 있다(참조: Huiet al., Cell Mol. Life Sci.54:1403-1411, 1998).

공통 탐침을 제조하는 상기한 방법들에서는 일반적으로 트랜스포존 변이체 라이브러리에서 분리한 게놈 DNA를 G-특이적 제한효소(예로서, 도 1에서의HaeIII)로 절단하는 것이 필요하다. 어떤 실험에서 사용되는 특정한 G-특이적 제한효소는 트랜스포존이 삽입된 유전자 내를 자르지 않거나 또는 삽입 부위로부터 예를 들어 2kb 이상 크게 떨어진 곳을 자를 수 있다. 따라서, 이러한 유전자로부터의 서열은 공통 탐침의 일부분을 형성하지 않을 것이다. 따라서, 공통 탐침을 생성시키기를, 매번 상이한 G-특이적 제한효소를 사용하여 여러 번 수행할 수 있다. 공통 탐침을 만드는 데 이용하는 효소의 수가 많을수록, 공통 탐침에서 비필수 유전자의 서열이 나타날 가능성은 더 커진다. 공통 탐침을 제조하는 둘 이상의 방법을 조합해도 유사한 결과를 얻을 수 있다.

공통 탐침의 폴리누클레오티드 라이브러리에로의 혼성화

혼성화 실험에서 탐침으로 사용하기 위하여, 공통 탐침들을 포함한 서열을 표지할 수 있다. 적합한 표지에는³²P,³³P 또는³⁵S 등의 방사성 동위원소, 효소 표지 또는 비오틴 또는 디곡시제닌(digoxigenin) 등의 기타 표지 또는 형광 표지가 있다. 이러한 표지들은 당업계에 숙련된 자에게 잘 알려진 방법들을 사용하여 검출할 수 있다.

일반적으로 공통 탐침을, 연구 대상 개체에서 분리한 폴리누클레오티드에 혼성화시킨다. 폴리누클레오티드는 일반적으로 라이브러리의 형태로 사용하고, 보통 야생형(wild type) 개체의 폴리누클레오티드를 사용한다. 라이브러리내에서 공통 탐침에 혼성화하지 않는 폴리누클레오티드는 필수 유전자의 전부 또는 일부를 포함하고 있을 것이다.

혼성화 실험에 사용하기에 이상적인 라이브러리의 형태는 격자형 배열 형태일 것이다. 격자형 배열에서, 배열상의 각 위치에는 일반적으로 상이한 클론(clone)이 배치되며, (만약 게놈 DNA 배열이라면) 그 배열에 개체의 게놈 전체를 위치시키는 것이, 즉, 예를 들어 세균일 경우, 그 배열이 세균 게놈 전체를 위치시키는 것이 바람직하다. 다르게는, 그 배열은 발현 배열일 수 있는데, 이 경우, 배열이 특정 개체의 모든 발현 부분(message)을 포함하는 것이 바람직하다. 특별히 바람직한 라이브러리는 격자형 배열의 각 위치에 그 개체의 한 ORF가 위치하며, 또한 그 배열에 그 개체의 모든 ORF가 나타나는 라이브러리이다. 이러한 방식으로, 단백질을 암호화하는 모든 폴리누클레오티드 서열을 위치시킨다. 격자형 배열 사용시 장점은, 한 번의 실험에서 전체 게놈을 매우 빠르게 분석할 수 있다는 것과, 공통 탐침에 혼성화하지 않는 클론들을 즉시 정제된 형태로 이용가능하다는 것이다. 게다가, 예를 들어E. coli또는S. cerevisiae등과 같이 전체 게놈 서열이 밝혀져 있는 개체의 경우, 게놈 내의 모든 ORF의 순서가 알려져 있다. 따라서, 격자형 배열 상에 나타난 모든 ORF의 순서를 알 수 있다. 이것은 하기에 기술된 바와 같이, 혼성화 결과를 해석하는 데 유용하다.

혼성화 실험은 일반적으로 격자형 배열 두 사본(copy)을 사용하여 수행한다. 이러한 실험에서, 첫번째 배열에는 왼쪽-팔 공통 탐침을 혼성화시키고, 두번째 배열에는 상응하는 오른쪽-팔 공통 탐침을 혼성화시킨다.

왼쪽- 및 오른쪽-팔 두 배열 상에 어떠한 혼성화도 보이지 않는 위치는 필수 유전자에 해당할 가능성이 크다. 그러나, 도 2는, 어떤 경우 필수 유전자에 인접한 비필수 유전자의 말단 가까이에 트랜스포존이 삽입되었을 때, 필수 유전자 서열의 작은 부분이 공통 탐침 내로 분리될 수 있다는 것을 보여준다. 따라서, 필수 유전자는 한 배열상에서 작은 혼성화 신호를 생성할 수 있다. 필수 유전자는 오른쪽 및 왼쪽 팔 두 배열 중 하나의 특정 위치에서만 혼성화 신호를 낼 수 있다. 따라서, 한 배열상에서 양성 신호를 생성하는 모든 클론을 비필수 유전자로 분류해서는 안된다.

그러나, 필수 유전자의 혼성화 양은, 일반적으로 인접한 비필수 유전자의 혼성화 양보다 훨씬 적다. TMDH의 두 중요한 양상을 보여주는 도 2로부터 이를 알수 있다. 첫째로, 연구 대상 게놈내의 가능한 한 많은 유전자내로 상이한 삽입을 수행하는 것이 바람직하다. 둘째로, 전체 게놈 서열이 밝혀져 있고, 따라서 게놈 내의 유전자 순서가 알려진 개체의 배열을 사용하는 것이 혼성화의 결과 해석에 중요할 수 있다.

조건부 필수 유전자의 동정

전기 방법은 또한 조건부 필수 유전자를 동정하는데 사용될 수 있다. 조건부 필수 유전자는 세균의 생존에 절대적으로 필수적인 것은 아니지만, 특정한 환경에서의 생존, 예로서 숙주내에서의 생존(병원성 세균의 경우) 또는 증가된 온도에서의 생존에 필수적인 유전자이다. 이러한 환경은 조건적 제약(conditional restraint)으로 알려져 있다.

조건부 필수 유전자를 분리하기 위하여, 트랜스포존 변이체 라이브러리를 대조 환경(control condition)(예로서, 37℃ 완전배지(complete media)내에서 배양)하에서 생성시킨다. 그 후, 전기 변이체 라이브러리를 어떤 조건적 제약하에 둔다. 예를 들어, 병원체라면, 전기 변이체 라이브러리를 적절한 숙주내로 접종한다. 다르게는, 전기 변이체 라이브러리를 어떤 증가된 온도에서 배양시킬 수 있다. 전기 변이체 라이브러리를 전기 조건적 제약하에 둔 후, 회수할 수 있다.

전기 조건적 제약하에 둔 변이체 라이브러리에는 전기 조건적 환경하에서 성장하는 데 필수적인 유전자내에 트랜스포존이 삽입된 변이체들이 결여되어 있을 것이다.

전기 대조 환경 및 조건적 제약하의 라이브러리들을 상기한 바처럼 TMDH에 적용시킬 수 있다. 선택적으로, 전기 대조(control) 라이브러리로부터의 오른쪽- 및 왼쪽-팔 공통 탐침으로 풀(pool)을 제조하고, 전기 조건적 제약하의 라이브러리로부터의 오른쪽- 및 왼쪽-팔 공통 탐침으로 풀을 제조한다. 그 후, 전기 두 제조한 풀을, 바람직하게는 격자형 배열 형태의 폴리누클레오티드 라이브러리에 개별적으로 혼성화시킬 수 있다. 다르게는, 전기 풀 제조 단계를 수행하지 않을 경우, 네 번의 혼성화가 필요하다: 대조 왼쪽-팔 공통 탐침; 대조 오른쪽-팔 공통 탐침; 조건적 제약하의 왼쪽-팔 공통 탐침; 및, 조건적 제약하의 오른쪽-팔 공통 탐침.

전기 대조 및 조건적 제약하의 라이브러리들로 얻은 결과들을 비교하여, 조건적 제약하에서 생존할 수 있게 하는 유전자들을 동정할 수 있다. 전기 조건적 제약하의 라이브러리에서는 생존에 필수적이나, 대조 환경하에서의 생존에는 필수적이지 않는 것으로 확인된 유전자들은 전기 조건적 제약하에서의 생존에 필수적인 유전자를 대표한다.

어떤 병원체의 조건부 변이를 분석하는 경우에, 예를 들어Salmonella typhimurium트랜스포존 변이체 라이브러리를 마우스(mouse)에 감염시킬 수 있다. 감염 후, 세균은 간(liver) 및 비장을 표적으로 삼으며, 전기 기관들에서의 생육가능한 세균 수를 측정함으로써 감염의 진행 상태를 간편하게 좇을 수 있다. 전기 간 및 비장에서 회수한 세균을 적절한 플레이트(plate) 상에서 배양할 수 있는데, 증가된 온도를 조건적 제약으로 하는 경우에, 트랜스포존-표지된 라이브러리를 42℃에서 배양시킬 수 있다.

기타 조건적 제약에는 항생제 내성 세균을 항생제의 존재하에서 배양하는 것이 있다. 이것으로 항생제 내성에 필수적인 유전자를 밝혀낼 수 있다. 이러한 유전자는 특정 항생제에 대한 세균의 내성을 약화시키는 효력을 가진 약물의 목표물이 될 수 있다. 개체를 발암물질(carcinogen), UV 또는 산화적 스트레스를 유발하는 기타 시약의 존재하에서 배양할 수 있는데, 이로써 전기 조건하에서의 성장에 내성을 갖게 하는 유전자를 동정할 수 있다.

표현형의 검증

TMDH 실험 전략으로 동정된 잠재적 필수 유전자 서열 및 조건부 필수 유전자 서열은 대립유전자 교환(allelic exchange)에 기초한 방법을 사용하여 검증할 수 있다. 이 방법은 특히 세균의 유전자 분석에 적합하다. PCR 프라이머를 사용하여 전기 표적 유전자 서열에 해당하며 카나마이신-내성 암호화 유전자 카세트(kanamycin-resistance encoding gene cassette)에 연길된 왼쪽- 및 오른쪽-팔 서열을 제조할 수 있다. 결과로서 생긴 카세트를 플라스미드에 기초한 벡터(plasmid-based vector) 등의 숙주 세균내에서 복제될 수 없는 자멸 벡터(suicide vector)내로 도입할 수 있다.

필수 유전자일 가능성이 큰 유전자의 경우에, 전기 결과적으로 생긴 작제물을 전기 유력한 유전자가 유래한 세균주내로 도입할 수 있다. 전기 표적 유전자가 필수 유전자일 경우, 전기 표적 유전자가 파손된 대립유전자-교환 변이체를 분리해낼 수 없어야 한다. 유력한 조건부 필수 유전자의 경우에, 전기 필수 유전자를 전기 유력한 유전자가 유래한 세균주내로 도입하고, 대립유전자-교환 변이체를 분리해 내어 조건적 제약하에서 배양시킨다. 전기 유력한 유전자가 조건부 필수 유전자일 경우, 전기 대립유전자-교환 변이체가 전기 조건적 제약하에서 생존할 수 없어야 한다.

다른 개체들에 대해서도 유사한 샐험을 수행할 수 있다.

생물정보학(Bioinformatics)

생물정보학을 사용하면, 추가적인 필수 및 조건부 필수 유전자를 빠르게 분리해낼 수 있다. TMDH로 동정된 어떤 유전자로 다른 종(species)들의 서열 정보를 갖고 있는 데이타베이스를 탐색하여 전기 다른 종(species)들로부터의 오르토로거스(orthologous) 유전자들을 동정할 수 있다. 이렇게 동정한 유전자들에 대하여 상기한 유전적 방법들을 사용하여 필수적 또는 조건부 필수적인지 검사할 수 있다. 예를 들어, 어떤E. coli유전자를 상기한 어떤 방법을 사용하여 필수 유전자로 동정한다. 이것으로Salmonella로부터 어떤 추정되는 오르토로그(orthologue)를 동정할 수 있는데, 전기Salmonella유전자를 상기한 바처럼Salmonella내에서 대립유전자 교환 및 조건부 변이체 작제로 검사할 수 있다. 추가적인 오르토로그를 Plasmodium 종 등 계통적으로 좀 더 멀리 떨어진 개체들내에서 동정할 수 있다.

바람직한 생물정보학 프로그램들이 당업계에 숙련된 자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) 프로그램(참조: Altschulet al., J. Mol. Biol.215:403-410(1990) 및 Altschulel al., Nucl. Acids Res.25:3389-3402(1997))을 사용할 수 있다. 탐색용으로 적절한 데이타베이스로는 EMBL, GENBANK, TIGR, EBI, SWISS-PROT 및 trEMBL 등이 있다.

본 발명에 유용한 개체

본 발명에서 사용될 수 있는 개체는, 트랜스포존 돌연변이유발을 수행할 수 있는 개체, 따라서 트랜스포존 변이체 라이브러리를 생성할 수 있는 개체들이다. 분명히, 게놈이 클수록 좀 더 많은 변이체가 생산되고, 포화 변이(saturation mutagenesis)를 시킬 수 있는 더 좋은 기회를 얻는다.

적절한 개체에는 원핵(prokaryotic) 및 진핵(eukaryotic) 개체들이 있는데, 적절한 원핵생물은 세균이다. 바람직한 세균은 동물 또는 인간 또는 식물 병원체인 세균이다.

세균으로는 그람-음성(Gram-negative) 또는 그람-양성(Gram-positive)이 사용될 수 있다. 전기 세균은 Escherichia, Salmonella, Vibrio, Haemophilus, Neisseria, Yersinia, Bordetella, Brucella, Shigella, Klebsiella, Enterobacter, Serracia, Proteus, Vibrio, Aeromonas, Pseudomonas, Acinetobacter, Moraxella, Flavobacterium, Actinobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, Mycobacterium, Listeria, Clostridium, Pasteurella, Helicobacter, Campylobacter, Lawsonia, Mycoplasma, Bacillus, Agrobacterium, Rhizobium, Erwinia 또는 Xanthomonas 속(genera) 등이다.

상기 언급한 속의 일부 예로는, 인간에 설사증(diarrhoea)을 유발하는Escherichia coli; 여러 동물 종에서 살모넬라증(salmonellosis)을 유발하는Salmonella typhimurium; 인간에 장티푸스(typhoid fever)를 유발하는Salmonella typhi; 인간에 식중독을 유발하는Salmonella enteritidis; 돼지에 살모넬라증을 유발하는Salmonella choleraesuis; 소(cattle), 특히 갓 태어난 소에서 전신성(systemic) 및 설사병 둘 다를 유발하는Salmonella dublin; 수막염(meningitis)을 유발하는Haemophilus influenzae; 임질(gonorrhoea)을 일으키는Neisseria gonorrhoeae; 인간에 위장염(gastroenteritis)으로부터 치명성 패혈증(septicemic disease)에 이르는 다양한 질병을 유발하는Yersinia enterocolitica; 백일해(whooping cough)를 유발하는Bordetella pertussis; 소에 유산(abortion) 및 불임증(infertility)을 유발하고, 인간에 파상열(undulant fever)로 알려진 질환을 유발하는Brucella abortus; 콜레라를 유발하는Vibrio cholerae; 파상풍(tetanus)을 유발하는Clostridium tetani; 탄저병(anthrax)을 유발하는Bacillus anthracis등이 있다.

적절한 진핵생물에는 진균, 식물 및 동물이 있다. 바람직한 진핵생물로는 동물 또는 인간 기생체 및 식물 페스트가 있다.

적절한 진균에는 아구창(thrush)을 유발하는Candida albicans, 아동에 백선(ringworm) 및 성인에 무좀(athlete's foot)을 유발하는Trichophytonspp. 등의 동물 병원체가 있다. 그 외의 적절한 진균에는 식물 병원체들인Phytophthora infestans,Plasmopara viticola,Peronosporaspp.,Saprolegniaspp.,Erysiphespp.,Ceratocystis ulmi,Monilinia fructigena,Venturia inequalis,Clavicepspurpurea,Diplocarpon rosae,Puccinia graminis,Ustilago avenae가 있다.

적절한 동물 기생체에는 Plasmodium spp., Trypanasoma spp., Giarda spp., Trichomonas spp. 및 Schistosoma spp.가 있다. 기타 동물 기생체로는 다양한 편충(platyhelminth), 선충(nematode) 및 환형 기생충(annelid parasite)이 있다.

적절한 식물 페스트에는 곤충, 선충 및 민달팽이(slug) 및 달팽이(snail) 등의 연체동물(mollusc)이 있다.

적절한 식물에는 단자엽식물(monocotyledon) 및 쌍자엽식물(dicotyledon)이 있다.

바람직한 개체는 전체 게놈 서열이 밝혀져 있는, 따라서, 전체 게놈을 또는 모든 ORF를 망라하는 격자형 배열을 작제할 수 있는 개체들이다.

필수 및 조건부 필수 유전자의 억제인자(inhibitor) 선별

세균의 필수 및 조건부 필수 유전자 및 이들이 암호화하는 폴리펩티드는 항생 물질의 표적(target)이 될 수 있다. 유사하게, 진균 및 진핵 기생체, 페스트 및 식물의 필수 및 조건부 필수 유전자 및 이들이 암호화하는 단백질들은, 각각 살진균제, 살충제, 살충제 및 제초제의 표적이 될 수 있다. 살진균제는 동물 및 식물 둘 다에 응용될 수 있다.

게다가, 어떤 특정 유전자가 여러 상이한 세균, 진균, 기생체, 페스트 또는 식물에 필수적이거나 또는 조건적으로 필수적일 경우, 전기 유전자 및 그 유전자가 암호화하는 폴리펩티드는 광범위한 활성을 가진 물질의 표적이 될 수 있다.

상기한 방법으로 동정된 어떤 필수 또는 조건부 필수 유전자 및 전기 유전자가 암호화하는 폴리펩티드는 전기 유전자의 전사 및/또는 번역 및/또는 전기 유전자에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 활성을 억제하는 인자를 동정하는 방법에 사용될 수 있다. 그러한 물질은 어떤 필수 또는 조건부 필수 유전자의 억제인자로 지칭될 수 있다. 따라서, 어떤 필수 또는 조건부 필수 유전자의 억제인자는 전기 필수 유전자의 발현 및/또는 번역 및/또는 전기 필수 또는 조건부 필수 유전자에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 활성을 억제하는 물질이다.

시험 물질이 필수 또는 조건부 필수 유전자의 억제인자인지를 결정하기 위하여 적합한 어떠한 검정법이라도 수행될 수 있다. 예를 들어, 필수 또는 조건부 필수 유전자의 프로모터를 어떤 리포터(reporter) 폴리펩티드의 코드화 서열(coding sequence)에 연결한 후, 이 작제물을 전기 시험 물질의 부재시에 전기 리포터 폴리펩티드가 발현되는 조건하에서 시험 물질과 접촉시킨다. 이것으로, 전기 시험 물질이 전기 필수 또는 조건부 필수 유전자의 발현에 미치는 영향을 측정할 수 있다.

어떤 필수 또는 조건부 필수 유전자의 번역을 억제하는 물질은, 예를 들어 어떤 시험 물질의 부재시에 전기 폴리펩티드의 활성을 허락하는 조건하에서 전기 폴리펩티드를 전기 폴리펩티드 및 전기 시험 물질에 대한 어떤 기질(substrate)에 접촉시킴으로 분리해낼 수 있다. 이 방법으로, 전기 시험 물질이 전기 필수 또는 조건부 필수 유전자에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 활성에 미치는 영향을 측정할 수 있다.

적절한 대조 실험(control experiment)을 수행할 수 있는데, 예를 들어, 다른 프로모터들, mRNA 또는 폴리펩티드에 대하여 어떤 잠재적인 억제인자의 활성을 측정하여 그것이 유전자 전사, 번역 또는 폴리펩티드 활성의 일반적인 억제인자인지를 결정할 수 있다.

시험 물질

필수 또는 조건부 필수 유전자의 억제인자로서의 적합한 시험 물질은 조합(combinatorial) 라이브러리, 한정된 화학 물질, 펩티드 및 펩티드 유사체(peptide mimetic), 올리고누클레오티드 및 자연 산물 라이브러리(natural product library) 등이다. 전기 시험 물질들을, 예를 들어, 반응 당 10개 물질 선별 등의 초벌 선별하고, 억제작용을 보이는 군(batch)의 물질들을 개별적으로 테스트할 수 있다. 추가적으로, 항체 산물(예로서, 단클론성(monoclonal) 및 다클론성(polyclonal) 항체, 단일 사슬(single chain) 항체, 키메라 항체(chimeric antibody) 및 CDR-접목된(CDR-grafted) 항체)을 사용할 수 있다.

필수 유전자의 억제인자

어떤 필수 또는 조건부 필수 유전자의 억제인자는 전기 필수 유전자의 발현 및/또는 번역 및/또는 전기 필수 또는 조건부 필수 유전자에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 활성을 억제하는 물질이다. 바람직한 억제인자는, 1㎍㎖^-1, 10㎍㎖^-1, 100㎍㎖^-1, 500㎍㎖^-1, 1㎎㎖^-1, 10㎎㎖^-1, 100㎎㎖^-1의 억제인자 농도에서, 필수 유전자의 발현 및/또는 번역 및/또는 활성을 최소 10%, 최소 20%, 최소 30%, 최소 40%, 최소 50%, 최소 60%, 최소 70%, 최소 80%, 최소 90%, 최소 95% 또는 최소 99%로 억제하는 물질들이다. 전기 억제율은, 전기 시험 물질의 존재 및 부재하의 검정 결과를 비교하였을 때, 전기 유전자의 발현 및/또는 번역 및/또는 활성에 있어서의 감소율을 나타낸다. 상기 언급한 억제율 및 억제인자 농도의 어떠한 조합이라도 본 발명의 억제인자를 규정하는데 사용될 수 있는데, 좀더 낮은 농도에서의 좀더 높은 억제율이 바람직하다.

상기 기술된 물질 등의, 검정에서 활성을 나타내는 시험 물질을 항생 활성 측정을 위해 어떤 감염된 동물 모델 또는 제초(herbicidal) 활성 측정을 위해 어떤 감염된 식물 모델 등의 생체내 계(in vivosystem)에서 테스트할 수 있다. 따라서, 잠재적 억제인자들에 대하여, 항생제의 경우, 마우스에서 세균 감염을 약화시키는 능력이 있는지, 또는 제초제의 경우, 식물의 성장을 억제하는 능력이 있는지 테스트할 수 있다.

치료적 용도

세균, 진균 또는 진핵 기생체의 필수 또는 조건부 필수 유전자의 억제인자들을 인간 또는 동물을 치료하는데 사용할 수 있다. 특히, 이러한 물질들을 세균, 진균 또는 진핵 기생체 감염의 치료에 사용할 수 있다. 또한, 이러한 물질들을 세균, 진균 또는 진핵 기생체 감염의 치료에 사용할 약제의 제조에 사용할 수 있다. 어떤 억제인자를 투여함으로써 이러한 감염 환자의 상태를 호전시킬 수 있는데, 어떤 억제인자를 치료에 유효한 양으로 이를 필요로 하는 환자에 투여할 수 있다.

세균, 진균 또는 진핵 기생체의 필수 또는 조건부 필수 유전자의 억제인자들을 다양한 형태로 투여할 수 있다. 즉, 이들을 예를 들어, 정제(tablet), 트로치(troch), 로젠지(lozenge), 수용성 또는 지용성 현탁액, 분산 분말 또는 과립 등으로 경구적으로 투여할 수 있다. 또한, 전기 억제인자들을 피하로(subcutaneously), 정맥내로, 근육내로, 장내로, 경피적으로 또는 주입법(infusion technique) 등 비경구적으로 투여할 수 있다. 또한, 전기 억제인자들을 좌약(suppository)으로 투여할 수 있다. 의사는 각 특정 환자에 필요한 투여 경로를 결정할 수 있을 것이다.

세균 또는 진균 감염을 예방 또는 치료하는데 사용할 억제인자의 제제화(formulation)는 약제용인지 수의용(veterinary use)인지 등의 전기 억제인자의 성질 등의 요인에 따라 좌우된다. 억제인자는 동시 투여용, 개별 투여용 또는 순차적 투여용으로 제제화될 수 있다.

본 발명에서 억제인자는 일반적으로 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 함께 투여되도록 제제화된다. 전기 약학적 담체 또는 희석제는 예를 들어, 등장액(isotonic solution)일 수 있다. 예를 들어, 경구 투여용 고체 형태는 전기 활성 화합물과 함께, 유당(lactose), 덱스트로스(dextrose), 자당(saccharose), 셀룰로오스(cellulose), 옥수수 전분(corn starch) 또는 감자 전분 등의 희석제; 실리카(silica), 활석(talc), 스테아르산(stearic acid), 마그네슘 또는 칼슘 스테아레이트(stearate) 및/또는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol) 등의윤활제(lubricant); 전분들, 검 아라빅(gum arabic), 젤라틴, 메틸셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스 또는 폴리비닐 피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone) 등의 결합제; 전분, 알긴산(alginic acid), 알기네이트(alginate) 또는 소듐 스타치 글리콜레이트(sodium starch glycolate) 등의 분해제(disintegrating agent); 비등 혼합물(effervescing mixture); 염료(dyestuff); 감미제(sweetener); 레시틴(lecithin), 폴리소르베이트(polysorbate), 로릴설페이트(laurylsulphate) 등의 습윤제(wetting agent); 및, 일반적으로 약학적 제제에 사용되는 비독성(non-toxic) 및 약학적으로 불활성인 물질을 포함할 수 있다. 이러한 약학적 조제물은 혼합, 과립화, 정제화, 당-코팅(sugar-coating) 또는 막-코팅(film-coating) 등의 알려진 방법으로 제조할 수 있다.

경구 투여용 액상 분산제는 시럽; 유제(emulsion) 또는 현탁액(suspension)일 수 있다. 시럽은 담체로 자당 또는 글리세린(glycerine) 및/또는 만니톨(mannitol) 및/또는 솔비톨(sorbitol)을 가진 자당 등을 포함할 수 있다.

현탁액 및 유제는 담체로 천연 고무(nature gum), 한천(agar), 알긴산 나트륨(sodium alginate), 펙틴(pectin), 메틸셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스 또는 폴리비닐 알콜 등을 포함할 수 있다. 근육내 주사용 현탁액 도는 용액은 전기 활성 화합물과 함께, 멸균수(sterile water), 올리브유, 에틸 올레이트(ethyl oleate), 프로필렌 글리콜 등의 글리콜 등의 약학적으로 허용가능한 담체 및 희망시 리도카인 하이드로클로라이드(lidocaine hydrochloride) 적정량을 포함할 수 있다.

정맥내 투여 또는 주사용 용액은 담체로 멸균수 등을 포함하거나 또는 멸균, 수용성, 등장 식염 용액의 형태일 수 있다.

치료에 유효한 양의 억제인자가 어떤 환자에 투여된다. 억제인자의 투여량은 여러 지표(parameter)들에 따라 결정되는데, 특히 사용되는 물질; 치료 대상 환자의 나이, 체중 및 상태; 투여 경로; 및, 필요한 요법에 따라 결정된다. 특정 환자에 필요한 투여경로 및 양을 결정하는 것은 역시 의사가 할 수 있다. 일반적인 일일 투여량은 그 특정 억제인자의 활성, 치료 대상자의 나이, 체중 및 상태, 질병의 유형 및 경중도 및 투여 빈도 및 경로에 따라, 체중 1kg 당 대략 0.1에서 50mg까지이다. 바람직하게는, 일일 투여량의 수준은 5mg 내지 2g이다.

약독화된 생백신

예방접종의 원리는 숙주내에 면역 반응을 유도하여 어떤 병원체의 이 후의 침입에 대한 방어할 수 있게 하는 것이다. 이는, 전기 병원체의 살아있는 약독화된 균주, 즉, 독성이 감소되어 전기 독성 병원균에 의해 유발되는 질병을 일으키지 않는 균주를 접종함으로 수행될 수 있다. 상기한 방법에 의해 분리된, 어떤 숙주내에서 생존하는데 필요한 조건부 필수 유전자내에 변이를 가진 세균은 약독화된 생백신에 사용하기에 좋은 후보균이다.

일반적으로, 전기 백신내로 도입된 변이는 전기 유전자의 기능을 완전히 상실시킨다. 이는, 전기 유전자로부터 어떠한 폴리펩티드도 합성되지 못하게 하거나또는 비기능성 폴리펩티드가 합성되게 하는 변이를 도입함으로써 수행될 수 있다. 폴리펩티드의 합성을 막기 위하여는, 그 전체 유전자 또는 그 5'-말단 둘 중 하나를 결실시킨다. 어떤 유전자의 코드화 서열내로 결실 또는 삽입을 수행하여 오로지 비기능성 폴리펩티드(예를 들어, 야생형(wild-type) 단백질의 N-말단 서열만을 가진 폴리펩티드)만을 합성하는 유전자를 작제할 수 있다.

전기 세균은 하나 이상의, 예를 들어 둘, 셋 또는 넷의 조건부 필수 유전자들내에 변이를 가진다. 전기 변이는 비복귀 변이인데, 이들은 본질적으로, 전기 세균이 백신으로 사용될 때 야생형으로 복귀되지 않는 변이이다. 이러한 변이에는 삽입 및 결실이 있다. 삽입 및 결실은 바람직하게는, 10 내지 600개까지의 누클레오티드 등 일반적으로 적어도 10개 누클레오티드의 큰 부분으로 수행된다. 바람직하게는, 그 전체 코드화 서열을 결실한다.

백신에 사용되는 세균은 바람직하게는 단지 한정된 변이, 즉, 특성화된 변이들만을 가진다. 특성화되지 않은 변이는 전기 세균에 원치 않는 부작용을 유발하는 특성을 부여할 수 있기 때문에, 그 게놈내에 특성화되지 않은 변이를 가진 세균을 백신으로 사용하는 것은 바람직하지 않다.

당업계에 숙련된 자에게 잘 알려진 방법으로, 전기 약독화 변이를 도입할 수 있다. 적절한 방법에는, 플라스미드 등의 어떤 벡터내로 전기 야생형 유전자의 DNA 서열을 클로닝하고 전기 클로닝된 DNA 서열내로 선별가능한 마커(marker)를 삽입하거나, 또는 전기 DNA 서열의 일부분을 결실하여 전기 DNA의 불활성화를 유발하는 방법 등이 있다. 전기 코드화 서열내의 두 지점 또는 그 바깥의 두 지점을 절단하는 제한 효소들을 사용하여 전기 DNA 서열을 절단하고, 항생제 내성 결정인자를 가진 남아있는 서열내의 두 말단을 서로 연결하는 등의 방법으로 결실을 도입할 수 있다. 전기 불활성화된 DNA 서열을 가진 플라스미드를 일렉트로포레이션 (electroporation) 또는 접합(conjugation) 등의 알려진 방법들을 사용하여 전기 세균내로 도입하여 형질전환시킨다. 그 후, 적절한 선별 방법을 사용하여 전기 불활성화된 DNA 서열이 전기 세균의 염색체내로 재조합되고, 그 야생형 DNA 서열이 상동 재조합(homologous recombination)에 의해 비기능적이 된 어떤 변이체를 동정할 수 있다.

본 발명의 전기 약독화된 세균을 유전적으로 조작하여 그 본래의 세균에서는 발현되지 않는 어떤 항원("이종 항원(heterologous antigen)")을 발현하게 하여, 전기 약독화된 세균이 전기 이종 항원의 담체로 작용하도록 할 수 있다. 전기 백신이 다른 개체에 대한 방어작용을 제공하게 할 수 있도록 또 다른 개체로부터 전기 항원을 유도할 수 있다. 이로써, 전기 약독화된 세균의 독성 모체(virulent parent)에 대한 면역성을 제공할 뿐 아니라, 전기 다른 개체에 대한 면역성 또한 제공하는 다가(multivalent) 백신을 제조할 수 있다. 게다가, 전기 약독화된 세균을 조작하여 하나 이상의 이종 항원을 발현하도록 할 수 있는데, 이 경우에, 전기 이종 항원은 동종의 또는 상이한 개체로부터의 것일 수 있다.

전기 이종 항원은 어떤 완전한 단백질 또는 어떤 항원결정기(epitope)를 포함하는 단백질의 일부일 수 있다. 전기 항원은 또다른 세균, 효모, 진균 또는 진핵 기생체 등의 바이러스, 원핵 생물 또는 진핵 생물의 것일 수 있다. 전기 항원은 세포외 또는 세포내 단백질의 것일 수 있다. 좀더 특별히, 전기 항원성 서열은E. coli, 파상풍균(tetanus), A형, B형 또는 C형 간염 바이러스, 유형 2 또는 유형 14 등의 인간 리노바이러스(rhinovirus), 단순포진 바이러스(herpes simplex virus), 유형 2 또는 3의 폴리오바이러스(poliovirus), 구제역(foot-and-mouth disease) 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 콕삭키(coxsackie) 바이러스 또는Chlamydia trachomatis의 것일 수 있다. 유용한 항원에는,E. coli이열성(heat labile) 독소의 비독성 성분,E. coliK88 항원, ETEC 집락형성인자(colonization factor) 항원, B.pertussis의 P.69 단백질 및 파상풍독 절편 C(tetanus toxin fragment C)가 있다.

전기 이종 항원을 암호화하는 DNA는 생체내에서 활성을 가진 프로모터로부터 발현된다. 살모넬라의nirB 프로모터 및htrA 프로모터는 그 개체내에서 잘 기능하는 것으로 나타났다. 전기 야생형 프로모터들은 ETEC 집락형성인자 항원을 발현시키는데 사용될 수 있다.

전기 이종 항원을 암호화하는 DNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한 DNA 작제물을 제조하고 이를 통상의 방법을 사용하여 전기 약독화된 세균내로 도입하여 형질전환시킨다. 전기 DNA 작제물을 가진 형질전환체를, 전기 작제물상의 선별가능한 마커를 이용하는 등의 방법으로 선별한다. 전기 작제물을 가진 세균을 예방접종용으로 숙주내에 투여하기 위해 제제화하기 전에, 실험실적 조건하에서 배양한다.

약독화된 세균 백신을 제제화하는 알려진 방법들을 사용하여 전기 백신을 제제화한다. 전기 백신을, 동결건조되고 피막화된 형태 등으로 경구 투여용으로 제공하는 것이 바람직하다. 이러한 캡슐을, Eudragate "S"(상표), Eudragate "L"(상표), 셀룰로오스 아세테이트, 셀룰로오스 프탈레이트 또는 하이드록시프로필메틸 셀룰로오스 등을 포함한 장용 피복(enteric coating)할 수 있다. 이 캡슐들을 이렇게 사용하거나 또는 다르게는, 전기 동결건조물을 투여 전에 현탁액 등으로 가공하여 사용한다. 가공은, 바람직하게는, 전기 세균이 생존할 수 있는 적당한 pH의 완충액에서 수행한다. 위액 산도(gastric acidity)로부터 전기 약독화된 세균 및 백신을 보호하기 위하여, 전기 백신의 각 투여 전에 탄산수소나트륨 조제물을 투여하는 것이 바람직하다. 다르게는, 전기 백신을 비경구적 투여, 비강 투여 또는 근육내 투여용으로 제조한다.

전기 백신을 포유류 숙주, 특히 인간 및 동물의 예방접종에 사용한다. 본 발명에 의해 제조된 백신을 어떤 유효한 양으로 투여함으로써, 미생물, 특히 병원체에 의해 유발된 감염을 예방할 수 있다. 투여량은 궁극적으로는 의사의 재량에 달려있으나, 숙주의 신장 및 체중 및 제제화된 백신의 종류를 포함한 다양한 요인에 좌우될 것이다. 그러나, 체중 70kg의 성인의 경우, 한 번에 10⁷내지 10¹¹의 세균이 구강 투여되는 투여량이 적절하다.

농업상의 용도

세균, 진균 또는 페스트 감염을 예방 또는 치료하기 위하여, 세균, 진균 또는 페스트의 필수 또는 조건부 필수 유전자의 억제인자를 식물에 투여할 수 있다; 페스트라는 용어는 어떤 식물을 공격하는 모든 동물을 지칭한다. 따라서, 본 발명의 억제인자는 살충제로서 유용할 수 있다. 식물의 성장을 감소시키거나 중단시키기 위하여, 즉, 제초제로서 사용하기 위하여, 식물 필수 또는 조건부 필수 유전자의 억제인자를 식물에 투여할 수 있다.

본 발명의 억제인자는 일반적으로 하나 이상의 농업적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 함께 혼합물의 형태로 적용되며, 추가의 화합물과 동시적으로 또는 연속적으로 농지 또는 처치될 식물에 적용할 수 있다.

본 발명의 억제인자는 필요시 제제화 방법에서 통상적으로 사용하는 추가적인 담체, 계면활성제(surfactant) 또는 도포-촉진 보조제(adjuvant)와 함께, 선택적인 제초제, 살균제(bactericide), 살진균제 또는 살충제 또는 이러한 여러 조제물의 혼합물일 수 있다. 적당한 담체 및 희석제에는, 제제 기술에서 흔히 사용되는 천연 또는 재생 무기 물질(mineral substance), 용매, 분산제, 습윤제, 점착제(tackifier), 결합제 또는 비료(fertilizer)등의 물질이 있다.

본 발명의 활성 성분 또는 전기 활성 성분 중 적어도 하나를 포함한 농업용 화학 조성물을 적용하는 바람직한 방법은 식물의 잎에 적용하는 것이다. 적용 빈도 및 적용률은 병원체가 만연된 정도에 좌우된다. 그러나, 또한, 액상 조성물형태로 식물 주위에 스며들게 하거나 또는 과립 등의 고체 형태로 토양에 적용함으로써(토양 적용) 활성 성분을 토양을 거쳐 식물 뿌리를 통해 식물내로 들어가게 할 수 있다(전신 작용(systemic action)). 활성 성분을 또한, 식물의 종자(seed)에적용할 수 있는데, 전기 종자를 활성 성분을 함유한 액상 제제에 담그거나, 또는 고형 제제로 코팅할 수 있다. 특별한 경우, 예를 들어 식물의 줄기 또는 싹(bud)을 선택적으로 치료할 경우, 추가적인 형태의 적용이 또한 가능하다.

전기 활성 성분은 변형되지 않은 형태로 또는, 바람직하게는 제제화 방법에서 통상적으로 사용하는 보조제와 함께 사용되며, 따라서, 알려진 방법으로 유화 농축물(emulsifiable concentrate), 바를 수 있는 연고(paste), 직접 분무가능하거나 희석가능한 용액, 담유화제(dilute emulsion), 습윤성 분말(wettable powder), 가용성 분말, 분진(dust), 과립자 및 또한 고분자 물질내 등으로 포장된 캡슐로 제제화된다. 전기 조성물의 성질과 같이, 분무, 분쇄(atomizing), 분진화(dusting), 분산 또는 다량 주입(pouring) 등의 적용 방법은 대상 개체 및 지배적 환경에 따라 선택된다. 유익한 적용률은 헥타르(hectare)("ha", 대략 2.471에이커(acre))당 활성 성분(a.i.) 50g 내지 5kg, 바람직하게는 100g 내지 2kg a.i./ha, 가장 바람직하게는 200g 내지 500g a.i./ha이다.

전기 활성 성분 및, 적절한 곳에서 고형 또는 액상 보조제를 함유한 제제, 조성물 또는 조제물은, 활성 성분들을 용매, 고형 담체 및, 적절한 곳에서 표면-활성 화합물(계면활성제) 등의 연장제(extender)와 함께 균일하게 혼합하거나 및/또는 분쇄하는 등의 알려진 방법으로 제조한다.

적당한 용매에는 방향족 탄화수소, 바람직하게는 자일렌(xylene) 혼합물 또는 치환된 나프탈렌 등의 8 내지 12개의 탄소 원자를 가진 방향족 탄화수소, 디부틸 프탈레이트(dibutyl phthalate) 또는 디옥틸 프탈레이트(dioctyl phthalate) 등의 프탈레이트, 씨클로헥산 또는 파라핀(paraffin) 등의 지방족(aliphatic) 탄화수소, 에탄올, 에틸렌 글리콜, 모노메틸 또는 모노에틸 에테르 등의 알콜 및 글리콜 및 이들의 에테르 및 에스테르, 씨클로헥사논(cyclohexanone) 등의 케톤, N-메틸-2-피롤리돈, 디메틸 설폭시드(sulfoxide) 또는 디메틸 포름아미드(formamide) 등의 강한 극성 용매(polar solvent) 및, 에폭시화된(epoxidized) 코코넛유 또는 대두유 등의 에폭시화된 식물성유; 또는 물이 있다.

분진 및 분산가능 분말 등에 사용되는 고형 담체는 일반적으로 방해석(calcite), 활석(talcum), 고령토(kaolin), 몬모릴로나이트 (montmorillonite) 또는 아타풀자이트(attapulgite) 등의 천연 광물 부형제이다. 그 물리적 성질을 향상시키기 위하여, 고도로 분산된 규산(silicic acid) 또는 고도로 분산된 흡수성 고분자(absorbent polymer)를 첨가하는 것 또한 가능하다. 적당한 과립형 흡착 담체는 부석(pumice), 파손된 벽돌, 해포석(sepiolite) 또는 벤토나이트(bentonite) 등의 다공성 형태이며; 및, 적당한 비흡착 담체는 방해석 또는 모래 등의 물질이다. 부가적으로, 상당수의 무기 또는 유기성의 전과립성(pregranulated) 물질이 사용될 수 있는데, 그 예로서 특히 백운석(dolomite) 또는 분쇄된 식물 잔재물이 있다.

제제화에 사용되는 활성 성분의 성질에 따라, 적당한 표면-활성 화합물은, 양호한 유화, 분산 및 습윤성을 가진 비이온성, 양이온성 및/또는 음이온성 계면활성제들이다. "계면활성제들"이라는 용어는 또한 계면활성제들의 혼합물을 포함하는 것이다.

적당한 음이온성 계면활성제는 수용성 비누(soap) 및 수용성 합성 표면-활성 화합물 둘 다 가능하다.

적절한 비누는 알칼리 금속염, 알칼리성 토금속염(alkaline earth metal salt) 또는, 올레산 또는 스테아르산의, 또는 코코넛유 또는 우지유(tallow oil) 등으로부터 수득할 수 있는 천연 지방산 혼합물의 나트륨 또는 칼륨 염 등의 고급 지방산(10 내지 22개 탄소 원자 사슬)의 치환되지 않은 또는 치환된 암모늄염이다. 지방산 메틸타우린(methyltaurin) 염 또한 사용가능하다.

그러나, 좀더 빈번히는, 특히 설폰산 지방(fatty sulfonate), 황산 지방(fatty sulfate), 설폰산화된 벤지미다졸 유도체(sulfonated benzimidazole derivative) 또는 알킬아릴설포네이트(alkylarylsulfonate) 등의 소위 합성적 계면활성제들이 사용된다.

설폰산 또는 황산 지방은 보통 알칼리 금속염, 알칼리 토금속염 또는 치환되지 않은 또는 치환된 암모늄염의 형태이며, 8 내지 22개의 탄소 알킬 라디칼(radical)을 갖고 있는데, 이에는 또한 알킬 라디칼의 알킬 부분, 예로서 리그논설폰산(lignonsulfonic acid), 도데실설페이트 또는 천연 지방산으로부터 수득된 황산 지방 알콜(fatty alcohol sulfate) 혼합물의 나트륨 또는 칼슘염 등이 있다. 이 화합물들은 또한 지방 알콜/에틸렌 옥사이드(oxide) 첨가 생성물(adduct)의 황산(sulfuric acid) 에스테르 및 설폰산 염을 포함한다. 전기 설폰산화된 벤지미다졸 유도체는 바람직하게는 2개의 설폰산 기(group) 및 8 내지 22개의 탄소 원자를 가진 하나의 지방산 라디칼을 갖는다. 알킬아릴설포네이트의 예로서는 도데실벤젠설폰산, 디부틸나프탈렌설폰산 또는 나프탈렌설폰산/포름알데히드 축합(condensation) 산물의 나트륨, 칼슘 또는 트리에탄올아민 염이 있다. 또한, 4 내지 14 몰(mole)의 에틸렌 옥사이드에 대한 p-노닐페놀(p-nonylphenol)의 첨가 생성물의 인산 에스테르 염 등의 인산염도 적당하다.

비이온성 계면활성제는 바람직하게는 지방족 또는 씨클로알리패틱(cycloaliphatic) 알콜, 또는 치환된 또는 치환되지 않은 지방산 및 알킬페놀의 폴리글리콜 에테르 유도체이며, 전기 유도체는 그 (지방족) 탄화수소 부분에 3 내지 30개의 글리콜 에테르 기 및 8 내지 20개의 탄소 원자 및 알킬페놀의 알킬 부분에 6 내지 18개의 탄소 원자를 갖고 있다.

추가적으로 적당한 비이온성 계면활성제는, 알킬 사슬에 1 내지 10개의 탄소 원자를 가진 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌디아민 프로필렌 글리콜 및 알킬폴리프로필렌 글리콜에 대한 폴리에틸렌 옥사이드의 수용성 첨가 생성물이다. 전기 첨가 생성물은 20 내지 250개의 에틸렌 글리콜 에테르 기 및 10 내지 100개의 프로필렌 글리콜 에테르 기를 갖고 있다. 이 화합물들은 보통 한 프로필렌 글리콜 단위(unit) 당 1 내지 5개의 에틸렌 글리콜 단위를 갖고 있다.

비이온성 계면활성제의 대표적인 예로서는, 노닐페놀폴리에톡시에탄올, 피마자유(castor oil) 폴리글리콜 에테르, 폴리프로필렌/폴리에틸렌 옥사이드 첨가 생성물, 트리부틸페녹시폴리에톡시에탄올, 폴리에틸렌 글리콜 및 옥틸페녹시에톡시에탄올이 있다. 폴리옥시에틸렌 솔비탄(sorbitan) 및 폴리옥시에틸렌 솔비탄 트리올레인산(trioleate)의 지방산 에스테르 또한 적당한 비이온성 계면활성제이다.

양이온성 계면활성제는 바람직하게는, N-치환기로서 적어도 하나의 C₈-C₂₂알킬 라디칼을 갖고 있으며, 추가적인 치환기로서 저급 치환되지 않은 또는 할로겐화된 알킬, 벤질 또는 저급 하이드로옥시알킬 라디칼을 가진 4차 암모늄 염이다. 전기 염은 바람직하게는, 스테아릴트리메틸암모늄 클로라이드 또는 벤질디(2-클로로에틸)에틸암모늄 브로마이드 등의, 할로겐화물(halide), 메틸설페이트 또는 에틸설페이트 형태이다.

제제화 방법에서 통상 사용되는 계면활성제는 "McCutcheon's Detergents and Emulsifiers Annual"(MC Publishing Corp. Ringwood, 뉴저지, 1979) 및 시슬리(Sisely) 및 우드(Wood)의 "Encyclopaedia of Surface Active Agents"(Chemical Publishing Co., Inc. 뉴욕, 1980) 등에 기술되어 있다.

전기 농업용 화학 조성물은 보통, 전기 활성 성분을 약 0.1 내지 약 99%, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 95%, 및 가장 바람직하게는 약 3 내지 약 90%로, 어떤 고형 또는 액상 보조제를 약 1 내지 약 99.9%, 바람직하게는 약 1 내지 99%, 및 가장 바람직하게는 약 5 내지 약 95%로, 및 어떤 계면활성제를 약 0 내지 25%, 바람직하게는 약 0.1 내지 25%, 및 가장 바람직하게는 약 0.1 내지 약 20%로 함유한다.

상업적 제품들이 바람직하게 농축물로 제제화되어 있으나, 최종 사용자는 일반적으로 희석된 제제를 사용할 것이다.

특별히 지적되지 않는 한, 사용된 방법들은 표준적인 생화학적 방법들이다(참조: Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 1989; 및, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1995).

실시예 1

도 1은 TMDH 과정을 개술한 공정도를 보여준다. 트랜스포존 라이브러리 제조 후, 대략 20,000개의 집락에서 DNA를 정제한다(도 1a 및 1b). 감별 혼성화(differential hybridization)용 탐침을 제조하기 위하여, 이중 제한효소 절단을 수반하는 전략으로 트랜스포존 삽입 부위에 인접한 유전자 서열을 회수한다(도 1c). 겔 전기영동으로 200 내지 600bp 크기의 왼쪽 및 오른쪽 팔 절편을 정제하고(도 1d 및 1e), 그 말단들에 벡토렛 단위들을 연결한다(도 1f).

이어진 유전자 배열 필터(gene array filter)에 혼성화시키는 단계에 사용할 특이적 탐침 군(population)을 제조하기 위하여, 트랜스포존 및 벡토렛에 특이적인 프라이머쌍으로 PCR을 수행한다(도 1g). 도 3은 이러한 방법으로 제조한 왼쪽 및 오른쪽 팔의 PCR 증폭을 겔로 분석한 것을 보여준다. 이 PCR 단계는 트랜스포존 삽입으로 파손된 서열들(도 3의 레인 2 및 레인 4)만을 증폭하도록 되어 있다. 레인 3 및 5는 트랜스포존을 지니지 않은E. coli분리주(isolate)의 DNA를 동일한 프라이머로 PCR 수행한 결과인데, 인지될 만한 증폭이 보이지 않으므로, 이것으로 이 단계의 유효성이 입증된다. 증폭 후, 왼쪽 및 오른쪽 팔로부터 생산된 두 탐침군을 방사능으로 표지하고(도 1h),E. coli의 격자형 배열 라이브러리에 혼성화한다(도 1i).

도 4a 및 4b는 왼쪽 및 오른쪽 팔 탐침의 혼성화 후의 결과를 보여준다. 배열 상의 양성 혼성화 신호는 트랜스포존 삽입으로 파손된, 따라서 필수적일 가능성이 적은 유전자에 해당한다.

실시예 2

TMDH 방법에 사용할 트랜스포존-특이적 탐침(공통 탐침)을 제조하기 위하여 사용한 세 가지 상이한 방법의 실험적 세부 사항을 전달하기 위하여 하기의 실험을 수행하였다.

(i) 트랜스포존 벡터내로 DNA-의존성(DNA-dependent) T7 RNA 중합효소 부위의 클로닝(cloning)

고도로 특이적이고 조절된 방식으로 RNA 주형을 제조하는 간편한 방법으로서, DNA-의존성 T7 RNA 중합효소 부위를 여러 플라스미드 벡터내로 통합하였다. 이 RNA 산물을 '유출(run-off) 전사물'이라고 명명하였다. TMDH 실험방법내에서 표지된 유출 RNA 전사물을 사용하기 위하여, 본 발명자들은 DNA-의존성 T7 RNA 중합효소 부위를 트랜스포존 EZ::TN pMOD<MCS> 벡터(Epicentre Technologies)내로 삽입하였다. 그 RNA 중합효소 부위를 MCS(multiple cloning site)내로 삽입하였다. 전위(transposition) 후, 이 신규한 트랜스포존은 트랜스포존 삽입 부위에 직접적으로 접한 유전자 부위에 해당하는 RNA의 특이적 절편을 생성할 것이다. 이러한 방식으로 제조된 표지된 탐침은 상기한 것처럼, 격자형 배열 등의 폴리누클레오티드 라이브러리에 혼성화하는데 사용될 수 있다(참조: '발명의 상세한 설명'의 "공통 탐침의 폴리누클레오티드 라이브러리에로의 혼성화" 단원).

접해 있는 인식 모티프(motif)(2830-62의 염기)이면 어느 것이라도 편입시키기 위하여, pT7Blue 벡터의 중앙의 DNA-의존성 T7 RNA 중합효소 부위(Novagen):

5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′(서열번호 1)

를 80 bp의 5′-서열과 함께 증폭시켰다. 하기의 프라이머를 사용하였다:

1. 5′-CCGGCTCGTGTCGACTGTGGAATTG-3′(2830-2854)(서열번호 2);

2. 5′-CTGCAGGCATGCAAGCTTTCCCTATAG-3′(62-35)(서열번호 3)

프라이머 1(서열번호 2)은 SalI 부위(밑줄친 부분)를 갖고 있고; 프라이머 2(서열번호 3)는 HindIII 부위를 갖고 있다.

주형으로서 pT7Blue 벡터 및 프라이머 1과 2 및 3과 4의 쌍을 사용하고, 하기 변수들을 사용하여 PCR을 수행하였다: 95℃ 5분; (94℃ 1분; 55℃ 1분; 72℃ 1분)을 30회 반복; 72℃ 5분으로 마지막 확장. PCR 산물을 겔 추출하고(Qiagen), TOPO 클로닝 벡터(Invitrogen)내로 클로닝하였다.

프라이머 1과 2의 쌍으로부터의 PCR 산물을 SalI 및 HindIII를 사용하여 TOPO로부터 절단하고, EZ::TN pMOD<MCS> 벡터(Epicentre Technologies)내로 클로닝한 후, JM109 세포(Promega)내로 주입하여 형질전환시키고, 암피실린(ampicillin)으로 선별하였다.

서열분석을 수행하여 DNA-의존성 T7 RNA 중합효소 부위의 존재를 확인하였다.

RiboMAX RNA 대량 생산 시스템(Promega)을 사용한 실험실적 조건하의 전사로 RNA를 제조하였다. 5㎍의 DNA(클로닝된 T7 프로모터 부위를 가진 EZ:TN 벡터)를 37℃에서 1시간 동안AflIII로 절단하고, QIAquick 컬럼(Qiagen)으로 정제하였다. RNA 제조에 앞서, DNA 표본에 22℃에서 15분간 클레나우(Klenow) 중합효소 5 유닛(unit)을 처리하여 둔단(blunt-end)이 되게 하였다.

전기 반응물에 누클레오티드 혼합물 및 T7 RNA 중합효소(rNTP 100mM 혼합물 30㎕ 및 T7 RNA 중합효소 10㎕)를 첨가하여 RNA 유출 전사물을 제조하였다. 이 반응물을 37℃에서 4시간 동안 방치하였다.AflIII로 절단된 DNA 주형은 200bp의 RNA 전사물을 산출하였는 바, 클로닝된 T7 RNA 중합효소 부위 삽입이 기능적임을 입증하였다.

TMDH 실험방법에서 사용하기 위해서는, (클로닝된 T7 프로모터 부위를 가진 EZ:TN 트랜스포존으로 제조된) 트랜스포존 라이브러리를 제조하고, DNA를 분리하여 상기한 제한효소들을 사용하여 절단하고, 크기별로 선별한다. 클로닝된 T7 프로모터로부터 생성된 유출 RNA 전사물을 표지하고, 일반적으로는 격자형 배열의 형태인폴리누클레오티드 라이브러리에 혼성화하는데 사용한다.

(ii) 역 PCR로 트랜스포존 특이적인 탐침 제조

본 발명자들은 TMDH 실험방법에서 사용할 트랜스포존 특이적 탐침을 역 PCR로 제조하는 개선된 방법을 고안하였다. TnphoA 트랜스포존 돌연변이유발 실험에서 분리한 DNA를 대상으로 하기의 실시예를 수행하였다.

트랜스포존 돌연변이유발 실험에서 분리한 게놈 DNA를 40㎕ 부피로 65℃에서 4시간동안 제한효소 Tru91(MseI의 이소스키조머(isoschizomer))로 절단하였다. 이 DNA를 3M NaOAc 4㎕ + 100% 에탄올 200㎕를 첨가하여 에탄올 침전시키고, 상층액을 제거하고, 남아있는 펠렛(pellet)을 75% 에탄올 200㎕로 세척하였다. 이 펠렛을 5분간 원심분리하고, 그 상층액을 제거한 후, 10분동안 진공 건조하고, 20㎕의 H₂O로 재현탁하였다.

그 후, 이 DNA 표본 1㎕를 저분자량의 마커(marker) 2㎕와 함께 겔에서 전기영동하여 정량하였다. 그런 다음, 전기 DNA 표본을 100㎕의 연결(ligation) 혼합물[20㎕ 5X 연결 완충액, 5㎕ 리가아제(ligase)(5 유닛, GIBCO BRL), 75㎕ DNA + H₂O]내 200ng 농도로 희석하였다. 반응물을 상온에서 2시간동안 방치하였다. 연결된 DNA를 상기한 바처럼 에탄올 침전시킨 후, 10㎕ H₂O로 재현탁하였다.

연결 직후, PCR 프라이머 쌍PHO2및INV1으로 하기와 같이 PCR을 수행하였다:

다음의 25㎕ 반응 혼합물내에 상기 DNA 1㎕ 첨가:

Reddymix 12.5㎕(PCR 반응 혼합물, Abgene, UK)

H₂O 9.5㎕

DNA 1㎕

PHO2 프라이머(12μM) 1㎕

INV1 프라이머(12μM) 1㎕

PHO2는 하기의 서열을 갖는다:

5′-AGGTCACATGGAAGTCAGATCCTGG-3′(서열번호 4)

INV1은 하기의 서열을 갖는다:

5′-CTAAATCTGTGTTCTCTTCGGCGGC-3′(서열번호 5)

하기의 조건 하에서 PCR을 수행하였다: 95℃ 5분; 94℃ 1분; 64℃ 1분을 30회 반복 후, 72℃ 5분. PCR후, 분석을 위하여 PCR 산물 5㎕를 겔에서 전기영동하였다.

역 PCR 실험 방법의 가능한 인공 산물 중 하나는 전기 단계 3에서 개술한 자가-연결 단계를 거쳐 연결되는, 의도하지 않은 '스터퍼' 절편의 봉입체이다. PCR을 거치면서, 이 '스터퍼' 절편은 트랜스포존-삽입된 서열과 함께 증폭될 것이다. 이것이 TMDH 실험 방법에서 표지 실험에 사용된다면, 이 짧은 '스터퍼' 절편이 폴리누클레오티드 라이브러리에 혼성화함으로 생기는 비특이적인 기저 신호가 생성될 것이다. 이 '스터퍼' 절편을 제거하기 위하여, DNA를 PCR 후 Tru91로 재절단할 수 있다. TMDH 실험 방법에서 중요한 트랜스포존-유전자 결합부(junction)를 비오틴으로 표지된(biotin-labelled) PHO2 프라이머에 의하여 증폭시킨다면, 이 절편을 자기-구슬-스트렙타비딘 접합체를 이용하여 불순 '스터퍼' 절편으로부터 간편하게 정제할 수 있다. 그 후, 정제된 DNA를 표지하여 격자형 배열 등의 폴리누클레오티드 라이브러리에 혼성화하는데 사용할 수 있다.

(iii) 순환적 프라이머 확장(cycle primer extension) 특이적 탐침 제조

순환적 프라이머 확장을 이용하여 트랜스포존 삽입 부위에 인접한 DNA 절편을 증폭시킬 수 있다. 이 실험절차에서 표지된 올리고누클레오티드 프라이머를 사용하면, 특이적 혼성화 탐침을 제조할 수 있다.

HPLC로 정제된, 비오틴으로 표지되지 않은 PHO2(오른쪽 팔) 프라이머 50pmol을 하기와 같은 Gibco BRL 5′DNA 표지(labelling) 시스템의 전방 반응을 이용하고 T4 폴리누클레오티드 인산화효소(kinase) 10유닛을 사용하여 총 50㎕ 반응 부피로 30μCi[γ³³P]ATP로 표지하였다(10pmol/㎕의 HPLC로 정제된 PHO2 프라이머 5㎕, H₂O 30㎕, 5X 전방 반응 완충액 10㎕, 10μCi/㎕[γ³³P]ATP 3㎕, 5유닛/㎕의 T4 폴리누클레오티드 인산화효소 2㎕).

37℃에서 30분간 방치 후, 전기 표지된 프라이머를 Qiagen Qiaquick 누클레오티드 제거 키트를 사용하여 정제하였다. 표지된 프라이머를 최종 부피 30㎕로 회수하였다.

유출(run-off) 주형을 제조하기 위하여, 어떤 알려진 부위(lamB) 내에 트랜스포존을 함유한E. coli게놈 DNA를 Wizard 게놈 DNA 정제 키트(Promega)를 사용하여 정제하였는데, DNA의 최종 농도는 대략 1㎍/㎖ 였다. 이 게놈 DNA 20㎍을 65℃에서 2시간 동안 Tru91 25유닛으로 절단하고, 효소 25유닛을 더 첨가한 후 2시간 동안 추가로 절단하였다.

그 후, DNA를 전기영동하고, 200 내지 500bp사이에 해당하는 겔 단편을 잘라내었다. 이 겔 단편내의 DNA를 Qiagen 겔 추출 키트를 사용하여 추출하고 최종 부피 30㎕로 용출시켰다.

그 후,Tru91로 절단된 200 내지 500bp 크기의 선별된 DNA 약 3㎍을 사용하여, 표지된 PHO2 프라이머 7 pmole, 0.2 mM dNTP, 및 Boehringer Expand Taq 중합효소(2유닛) 및 완충액으로 구성된 최종 부피 100㎕의 반응 혼합액내에서 유출 주형을 제조되었다.

반응 조건은, 94℃에서 2분간 초기(initial) 변성(denaturation) 후, 94℃에서 30초간, 55℃에서 30초간 및 72℃에서 2분간을 60회 반복이었다.

전기 순환적 프라이머 확장 반응 후, 그 표지된 산물을E. coli격자형 배열 라이브러리에 혼성화하였다.

Claims

하기의 단계를 포함하는, 개체의 필수 유전자를 동정하는 방법:

(i) 전기 개체의 트랜스포존 변이체 라이브러리를 준비하는 단계;

(ii) 삽입된 트랜스포존에 접해 있는 전기 라이브러리에서 폴리누클레오티드 서열을 분리하는 단계;

(iii) 전기 폴리누클레오티드 서열을 전기 개체의 폴리누클레오티드 라이브러리에 혼성화하는(hybridising) 단계; 및,

(iv) 전기 폴리누클레오티드 라이브러리내에서 전기 폴리누클레오티드 서열이 혼성화하지 않는 폴리누클레오티드를 동정하여 전기 개체의 필수 유전자를 결정하는 단계.
제 1항에 있어서,

폴리누클레오티드 라이브러리는 격자형 배열(gridded array)의 형태인 것을 특징으로 하는

개체의 필수 유전자를 동정하는 방법.
제 1항 또는 2항에 있어서,

개체는 세균(bacterium), 효모(yeast), 진균(fungus), 식물 또는 동물

인 것을 특징으로 하는

개체의 필수 유전자를 동정하는 방법.
제 1항 내지 3항의 어느 한 항에 있어서,

단계 (ii)에서 트랜스포존의 한쪽에 접한 폴리누클레오티드 서열을 분리하여 한 서열 풀(pool)을 수득하고, 그 트랜스포존의 나머지 한쪽에 접한 폴리누클레오티드 서열을 분리하여 별개의 두번째 서열 풀을 수득하며; 및,

단계 (iii)에서 첫번째 서열 풀을 전기 폴리누클레오티드 라이브러리의 첫번째 표본에 혼성화시키고 두번째 서열 풀을 전기 폴리누클레오티드 라이브러리의 두번째 표본에 혼성화시키는 것을 특징으로 하는

개체의 필수 유전자를 동정하는 방법.
제 4항에 있어서,

단계 (ii)에서 각 서열 풀은 하기의 단계:

(a) 트랜스포존으로 표지된(transposon-tagged) 변이체 라이브 러리에서 분리한 게놈 DNA를 트랜스포존내를 절단하는 제한효소(T-특이적 제한효소) 및 파손된 서열내를 절단하는 두 번째 상이한 제한효소(G-특이적 제한효소)로 절단하는 단 계;

(b) 결과적으로 생성된 DNA 절편을 어떤 링커에 연결하는 단계;

(c) 결과적으로 생성된, 트랜스포존 서열에 특이적인 올리고누 클레오티드 및 링커 서열에 특이적인 올리고누클레오티드를 가진 DNA 절편에 대하여 PCR을 수행하는 단계

를 포함하는 방법으로 분리되는 것을 특징으로 하는

개체의 필수 유전자를 동정하는 방법.
제 4항 또는 5항에 있어서,

트랜스포존 변이체 라이브러리는 TnphoAE. coli변이체 라이브러이인 것을 특징으로 하는

개체의 필수 유전자를 동정하는 방법.
제 6항에 있어서,

첫번째 서열 풀 분리에서, 트랜스포존내를 절단하는 제한효소는DraI이고, 두번째 효소는 4 염기쌍의 제한효소이며; 및,

두번째 서열 풀 분리에서, 트랜스포존내를 절단하는 제한효소는HpaI이고, 두번째 효소는 4 염기쌍의 제한효소인 것을 특징으로 하는

개체의 필수 유전자를 동정하는 방법.
하기의 단계를 포함하는, 개체의 조건부 필수 유전자를 동정하는 방법:

(i) 전기 개체의 트랜스포존 변이체 라이브러리의 첫번째 표본(투입 (input) 라이브러리)을 준비하는 단계;

(ii) 전기 라이브러리의 두번째 표본을 준비하고 전기 표본을 어떤 조건적 제약(conditional restraint)하에 두는 단계;

(iii) 단계 (ii)에서의 조건적 제약에서 생존하는 변이체들을 수집 하여 새로운 라이브러리(산출(output) 라이브러리)를 생성하는 단계; 및,

(iv) 단계 (i)의 투입 라이브러리 및 단계 (iii)의 산출 라이브러리 상에서 제 1항 내지 7항의 어느 한 항에 따른 방법을 수행하여 그 개체의 조건부 필수 유전자를 결정하는 단계.
제 1항 내지 7항의 어느 한 항의 방법에 의하여 동정된 필수 유전자 또는 제 8항에 따른 조건부 필수 유전자 또는 전기 유전자에 의하여 암호화되는 폴리펩티드의, 그 유전자의 전사 및/또는 번역 및/또는 그 유전자에 의하여 암호화되는 폴리펩티드의 활성을 억제하는 인자(inhibitor)를 동정하는 방법에 사용하기 위한 용도.
(i) 제 1항 내지 7항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 동정된 필수 유전자 또는 제 8항의 방법에 의하여 동정된 조건부 필수 유전자의 전사 및/또 는 번역 억제인자; 및/또는

(ii) 전기 유전자에 의하여 암호화되는 폴리펩티드의 활성 억제인자를 동정하는 방법(이 방법은 시험 물질이 전기 유전자의 전사 및/또는 번역 및/또는 전기 유전자에 의하여 암호화되는 폴리펩티드의 활성을 억제하는지 결정하는 단계를 포함한다).
제 10항의 방법으로 동정된 억제인자(inhibitor).
필수 또는 조건부 필수 유전자의 전사 및/또는 번역 및/또는 그 유전자에 의하여 암호화되는 폴리펩티드의 활성을 억제하는 인자.
제 11항 또는 12항에 있어서,

필수 또는 조건부 필수 유전자는 세균, 진균 또는 진핵 기생체 (eukaryotic parasite)의 필수 또는 조건부 필수 유전자인 것을 특징으로 하는

억제인자.
제 13항에 있어서,

인간 또는 동물의 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는

억제인자.
제 14항에 있어서,

세균, 진균 또는 진핵 기생체 감염의 치료에 사용하는 것을 특징으로 하는

억제인자.
세균, 진균 또는 진핵 기생체 감염의 치료에 사용할 약제의 제조를 위한 제13항의 억제인자의 용도.
제 13항의 억제인자 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물.
제 13항의 억제인자를 치료에 유효한 양으로 숙주에 투여하는 단계를 포함하는, 세균, 진균 또는 진핵 기생체에 감염된 숙주를 치료하는 방법.
제 11항 또는 12항에 있어서,

필수 또는 조건부 필수 유전자는 세균, 진균 또는 페스트(pest)의 필수 또는 조건부 필수 유전자인 것을 특징으로 하는

억제인자.
제 19항의 억제인자의 식물 살세균제(bacteriocide), 살진균제 또는 살충제로 사용하기 위한 용도.
제 11항 또는 12항에 있어서,

필수 또는 조건부 필수 유전자는 식물의 조건부 또는 필수 유전자인 것을 특징으로 하는

억제인자.
제 21항의 억제인자의 제초제로서 사용하기 위한 용도.
제 8항에 있어서,

개체는 세균이며, 조건적 제약은 숙주내에서의 그 세균의 성장인 것을 특징으로 하는

개체의 조건부 필수 유전자를 동정하는 방법.
제 23항의 방법에 의하여 동정된 하나 이상의 유전자내의 비복귀(non-reverting) 변이에 의하여 약독화된 세균.
제 24항의 세균 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 백신.
제 24항에 있어서,

인간 또는 동물을 예방접종하는(vaccinating) 방법에 사용하는 것을 특징으로 하는

세균.
제 24항의 세균의, 인간 또는 동물의 예방접종을 위한 약제 제조에 사용하기 위한 용도.
제 24항의 세균을 숙주에 투여하는 단계를 포함하는, 포유류 숙주에서 면역 반응을 증가시키는 방법.