KR20020029371A - 감소된 면역원성을 갖는 분자내 가교결합된 서브틸리신프로테아제 - Google Patents

감소된 면역원성을 갖는 분자내 가교결합된 서브틸리신프로테아제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 프로테아제의 제 1 잔기의 아미노산과 프로테아제의 제 2 잔기의 아미노산 사이에 공유결합을 포함하는 분자내 가교결합을 포함하는 서브틸리신 프로테아제를 개시한다. 본 발명의 프로테아제는 모 프로테아제에 비해 감소된 면역원성을 갖는다. 따라서, 이러한 프로테아제는 세탁, 식기, 경질 표면, 스킨 케어, 헤어 케어, 뷰우티 케어, 구강 케어 및 콘택즈 렌즈 조성물을 포함한 여러 유형의 조성물에서 사용하는데 적합하나 이에만 국한되는 것은 아니다.

Description

감소된 면역원성을 갖는 분자내 가교결합된 서브틸리신 프로테아제 {INTRAMOLECULARLY CROSS-LINKED SUBTILISIN PROTEASES HAVING REDUCED IMMUNOGENICITY}
효소는 천연 생성 단백질의 가장 큰 군을 구성한다. 효소의 한 군에는 다른 단백질의 가수분해를 촉매하는 프로테아제가 포함된다. 단백질을 가수분해하는 상기 능력은, 천연 생성 프로테아제 및 유전적으로 조작된 프로테아제를 세정용 조성물, 특히 세탁 용도와 관련된 것들에 도입함으로써, 통상적으로 이용되어 왔다.
세정 분야에서, 가장 널리 사용되는 상기 프로테아제는 세린 프로테아제이다. 상기 세린 프로테아제의 대부분은 박테리아성 유기체에 의해 생성되지만, 일부는 곰팡이와 같은 다른 유기체에 의해 생성된다. 문헌 [Siezen 등, "Homology Modelling and Protein Engineering Strategy of Subtilases, the Family of Subtilisin-Like Serine Proteases", Protein Engineering, Vol. 4, No. 7, pp. 719 - 737 (1991)] 을 참조. 불행하게도, 천연 환경에서의 야생형 프로테아제의유효성은 세정용 조성물의 인공 환경에서는 자주 활용되지 않았다. 구체적으로, 예컨대, 열 안정성, pH 안정성, 산화 안정성 및 기질 특이성과 같은 프로테아제 특징이, 프로테아제의 천연 환경 외부에서의 이용을 위해 반드시 최적화될 필요는 없다.
비천연 세정 환경에서의 프로테아제 유효성을 증가시키기 위한 목적으로, 세린 프로테아제의 야생형 아미노산 서열을 변화시키려는 일부 접근법이 채택되고 있다. 상기 접근법에는, 상당히 다양한 조건 하에서 열 안정성을 증강시키고, 산화 안정성을 개선하기 위한 프로테아제의 유전적 재설계 및/또는 화학적 변형이 포함된다.
그러나, 상기 변형된 프로테아제는 포유류에게 외부물이므로, 잠재적인 항원이다. 항원으로서, 상기 프로테아제는 포유류에서 면역원성 및/또는 알러지성 반응 (본원에서는 총체적으로 면역원성 반응으로 기재함) 을 일으킨다.
또한, 프로테아제의 유전적 재설계 및 화학적 변형이, 세탁 용도에 보다 크게 효과적인 프로테아제에 대한 계속적인 조사에 있어서 주도적이었지만, 상기 프로테아제는 퍼스널 케어 조성물 및 가사 경감 세제에 상업적으로 이용되어 오지 않았다. 예를 들어, 비누, 젤, 바디 워시, 샴푸 및 가사 경감 식기 세제와 같은 제품에 상기 프로테아제가 없는 일차적인 이유는, 바람직하지 않은 면역원성 반응을 일으키는 인간 감작의 문제 때문이다. 따라서, 면역원성 반응을 야기하지 않으면서 프로테아제의 세정 특성을 제공하는 퍼스널 케어 조성물 또는 가사 경감 세제를 제공하는 것이 매우 유익할 것이다.
최근에는, 화학적으로 변형된 프로테아제를 고정화, 과립화, 코팅 또는 용해시켜 이들이 풍매(風媒)화되는 것을 방지함으로써, 프로테아제에 대한 면역원성을 최소화할 수 있다. 상기 방법은, 소비자가 풍매화 프로테아제에 노출되는 것은 해결하지만, 최종 조성물과의 연장된 조직 접촉에 관련된 위험은 여전히 존재한다.
또한, 프로테아제의 면역원성 감소를 프로테아제에 중합체를 결합시킴으로써 달성할 수 있다고 제안된 바 있다. 예를 들어, 하기를 참조한다: 미국 특허 제 4,179,337 호, Davis 등, 1979. 12. 18. 허여; 미국 특허 제 5,856,451 호, Olsen 등, Novo Nordisk 에 양도, 1999. 1. 5. 허여; WO 99/00489, Olsen 등, Novo Nordisk 에 양도, 1999. 1. 7. 공개; WO 98/30682, Olsen 등, Novo Nordisk 에 양도, 1998. 7. 16. 공개; 및 WO 98/35026, Von Der Osten 등, 1998. 8. 13. 공개. 그러나, 상기 제안들은, 면역원성 반응을 가장 효과적으로 감소시키기 위한, 프로테아제의 특정 아미노산 영역으로의 중합체 결합의 중요성을 제시하지 못했다.
본 발명자는 놀랍게도 프로테아제를 분자내 가교결합시켜 프로테아제의 면역원성을 감소시킬 수 있음을 발견하였다. 추가로 이러한 분자내 가교결합된 프로테아제는 각각의 모 프로테아제의 활성을 보유함을 발견하였다. 또한, 본 발명자는 예컨대 프로테아제의 에피토프 영역 (즉, 면역반응에 관여하는 프로테아제의 위치) 또는 클립 부위 (즉, 생체내에서 가수분해가 발생하는 프로테아제의 위치)에 대한 입체적 위치로 인하여, 가교결합에 참여하는데 가장 바람직한 프로테아제내의 한정된 잔기를 발견하였다.
따라서, 본 발명자는 감소된 면역원성 반응을 일으키나 유효한 활성 프로테아제로서 이들의 활성을 보유하는 서브틸리신 프로테아제를 발견하였다. 따라서, 본 발명의 프로테아제는 세탁, 식기, 경질 표면, 피부케어, 모발케어, 뷰우티케어, 구강케어 및 콘택즈 렌즈 조성물을 포함한 여러 유형의 조성물에서 사용하는데 적합하나, 이에만 국한되는 것은 아니다.
본 발명의 개요
본 발명은 프로테아제의 제 1 잔기의 아미노산과 프로테아제의 제 2 잔기의 아미노산 사이에 공유결합을 포함하는 분자내 가교결합을 포함하는 서브틸리신 프로테아제에 관한 것이다.
본 발명의 프로테아제는 모 프로테아제에 비해 감소된 면역원성을 갖는다. 따라서, 이러한 프로테아제는 세탁, 식기, 경질 표면, 스킨 케어, 헤어 케어, 뷰우티케어, 구강 케어 및 콘택즈 렌즈 조성물을 포함한 여러 유형의 조성물에서 사용하는데 적합하나 이에만 국한되는 것은 아니다.
본 발명은, 예를 들어, 퍼스널 케어 조성물, 세탁 조성물, 경질 표면 세정용조성물 및 가사 경감(light duty) 세정용 조성물과 같은 조성물에 유용한, 변형된 서브틸리신 프로테아제에 관한 것이다.
본 발명의 필수 성분을 본원에서 하기에 설명한다. 또한, 본 발명의 구현에 유용한, 다양한 선택적이고 바람직한 성분들의 비제한적 설명이 포함된다.
본 발명은, 본원에 기재된 임의의 필요하거나 선택적인 성분들 및/또는 제한들을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 이들로 본질적으로 구성될 수 있다.
모든 퍼센트 및 비는 달리 명시되지 않으면 중량으로 계산된다. 모든 퍼센트는 달리 명시되지 않으면 전체 조성물을 기준으로 계산된다.
모든 성분 또는 조성물 레벨은 성분 또는 조성물의 활성 레벨을 기준으로 하였고, 시판원에 존재할 수 있는 불순물, 예를 들어 잔류 용매 또는 부산물은 배제된다.
모든 특허, 특허 출원 및 공보를 포함하는 본원에 참고된 모든 문헌은, 그들의 전문이 본원에 참고문헌으로 인용된다.
본원에서는, 효소를 포함한 재료의 상표명이 언급되어 있지만, 이에만 제한되지는 않는다. 발명자들은 본원에서, 재료를 특정 상표명에 제한하고자 하는 것이 아니다. 상표명으로 언급된 재료와 동등한 재료 (예로, 상이한 이름 또는 카탈로그 (참고) 번호로 상이한 회사에서 시판되는 것들)를 본원의 프로테아제 및 조성물에 대체하여 사용할 수 있다.
본원에서는, 약어를 사용하여 아미노산을 기재할 것이다. 표 I 은 본원에 사용되는 약어 리스트를 제공한다.
정의
본원에서 사용되는 용어 "돌연변이" 는, 유전자 서열 및/또는 이 유전자 서열에 의해 생성되는 아미노산 서열의 변경을 의미한다. 돌연변이에는 야생형 단백질 서열에 대한 아미노산 잔기의 결실, 치환 및 첨가가 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "모(parent)" 는, 본원에서 프로테아제 컨쥬게이트를 형성하기 위한 후속 변형에 이용되는 단백질 (야생형 또는 변이체) 을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "야생형" 은, 비돌연변이 유기체에 의해 생성되는 단백질, 예를 들어 프로테아제 또는 다른 효소를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "변이체" 는, 상응하는 야생형 단백질과 상이한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 의미한다.
본원에서 사용되는 모든 중합체 분자량은 중량 평균 분자량으로 표현된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 본 발명의 분자내 가교결합된 프로테아제는 서브틸리신 BPN' 및 이들의 변이체를 포함하는 것들에 제한되지는 않지만, 모든 아미노산 넘버링은 서열번호 1 에 나타내는 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열을 참고로 하였다. 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열은 문헌 [Wells 등, Nucleic Acids Research, Vol. Ⅱ, pp. 7911 - 7925 (1983)] 에서 더욱 설명된다.
여기에서 사용된 하이픈은 아미노산 잔기의 영역을 한정하기 위하여 사용된 것이며, 이는 상기 영역이 열거된 잔기 및 열거된 잔기들 사이에 존재하는 각각의 잔기를 포함함을 의미한다. 예컨대, 영역 70 - 84 를 설명하면, 이는 아미노산잔기 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 및 84 의 영역을 포함함을 의미한다.
본 발명의 분자내 가교결합된 프로테아제
본 발명은 분자내 가교결합을 포함하는 서브틸리신 프로테아제에 관한 것이며, 분자내 가교결합은 프로테아제의 제 1 잔기의 아미노산과 프로테아제의 제 2 잔기의 아미노산 사이의 공유결합을 포함한다. 이론에 의한 제한없이, 생성된 가교결합은 항원제공 세포의 엔도솜 구획에서 프로테아제 분해률을 감소시켜(즉, 안정성을 증가시켜), 이어 프로테아제의 에피토프의 표출을 방해하는 것으로 여겨진다.
본 발명에 따라 분자내 가교결합될 수 있는 프로테아제는 야생형 또는 이들의 변이체인 서브틸리신 유사 프로테아제이다. 본원에서 사용되는 용어 "서브틸리신 유사 프로테아제" 는, 서브틸리신 BPN' 의 서열과 50% 이상, 바람직하게는 80% 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 프로테아제를 의미한다. 야생형 서브틸리신 유사 프로테아제는, 예를 들어, 바실러스 알칼로필러스 (Bacillus alcalophilus), 바실러스 아밀로리케파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 아밀로사카리쿠스 (Bacillus amylosaccharicus), 바실러스 리케니포르미스 (Bacillus licheniformis), 바실러스 렌투스 (Bacillus lentus) 및 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 미생물에 의해 생성된다. 서브틸리신 유사 세린 프로테이제 및 이들의 동족체에 관한 논의는 문헌 [Siezen 등, "Homology Modelling and Protein Engineering Strategy of Subtilases, the Family of Subtilisin-LikeSerine Proteases", Protein Engineering, Vol. 4, No. 7, pp. 719 - 737 (1991)] 에서 찾아볼 수 있다.
본원에 따라 분자내 가교결합될 수 있는 바람직한 프로테아제의 예로는, 바실러스 아밀로리케파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 리케니포르미스 (Bacillus licheniformis) 및 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 에서 수득되는 것들, 서브틸리신 BPN, 서브틸리신 BPN', 서브틸리신 칼스베르그 (Carlsberg), 서브틸리신 DY, 서브틸리신 309, 프로티나아제 K, 및 A/S Alcalase(Novo Industries, Copenhagen, Denmark), Esperase(Novo Industries), Savinase(Novo Industries), Maxatase(Genencor International Inc.), Maxacal(Genencor International Inc.), Maxapem 15(Genencor International Inc.) 를 포함하는 테르미타아제, 및 상기물의 변이체가 포함된다. 본 발명에 따라 분자내 가교결합시킬 수 있는 특히 바람직한 프로테아제는 바실러스 아밀로리케파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens) 에서 수득되는 것들 및 이들의 변이체가 포함된다. 본원에서 가장 바람직한 프로테아제는 서브틸리신 BPN' 및 이들의 변이체이다.
이하에서 "프로테아제 A" 로 언급되는, 본원에서 사용하기에 특히 바람직한 서브틸리신 BPN' 의 변이체는 1991. 7. 9. 일자로 허여된 Venegas 의 미국 특허 제 5,030,378 호에 개시되어 있고, 하기 돌연변이를 갖는 서브틸리신 BPN' 아미노산 서열을 특징으로 한다:
(a) 위치 166 의 Gly 이 Asn, Ser, Lys, Arg, His, Gln, Ala 및 Glu 로부터 선택된 아미노산 잔기로 치환되고; 위치 169 의 Gly 이 Ser 으로 치환되고; 위치 222 의 Met 이 Gln, Phe, His, Asn, Glu, Ala 및 Thr 로부터 선택된 아미노산 잔기로 치환되거나;
(b) 위치 160 의 Gly 이 Ala 로 치환되고, 위치 222 의 Met 이 Ala 로 치환된다.
이하에서 "프로테아제 B" 로 언급되는, 본원의 분자내 가교결합에서 사용하기에 추가로 바람직한 서브틸리신 BPN' 의 변이체는 1988. 1. 7. 일자로 공개되어 Genencor International, Inc. 에 양도된 EP 251,446 에 개시되어 있고, 하나 이상의 하기 위치: Tyr21, Thr22, Ser24, Asp36, Ala45, Ala48, Ser49, Met50, His67, Ser87, Lys94, Val95, Gly97, Ser101, Gly102, Gly103, Ile107, Gly110, Met124, Gly127, Gly128, Pro129, Leu135, Lys170, Tyr171, Pro172, Asp197, Met199, Ser204, Lys213, Tyr214, Gly215 및 Ser221 에 돌연변이를 갖거나; 상기 기재된 두개 이상의 위치와, Asp32, Ser33, Tyr104, Ala152, Asn155, Glu156, Gly166, Gly169, Phe189, Tyr217 및 Met222 로부터 선택되는 하나 이상 위치에서의 돌연변이가 조합된 야생형 서브틸리신 BPN' 아미노산 서열을 특징으로 한다.
이하에서 "프로테아제 C" 로 언급되는, 본원의 분자내 가교결합에서 사용하기에 바람직한 기타 서브틸리신 BPN' 의 변이체는 1995. 4. 20. 일자로 공개되어 Genencor International, Inc. 에 양도된 WO 95/10615 에 기재되어 있고, 위치 Asn76 에서의 돌연변이와, Asp99, Ser101, Gln103, Tyr104, Ser105, Ile107,Asn109, Asn123, Leu126, Gly127, Gly128, Leu135, Glu156, Gly166, Glu195, Asp197, Ser204, Gln206, Pro210, Ala216, Tyr217, Asn218, Met222, Ser260, Lys265 및 Ala274 에서 선택되는 하나 이상의 다른 위치의 돌연변이가 조합된 야생형 서브틸리신 BPN' 아미노산 서열을 특징으로 한다.
이하에서 "프로테아제 D" 로 언급되는, 본원에서 사용하기에 바람직한 기타 서브틸리신 BPN' 의 변이체는 1988. 7. 26. 일자로 허여된 Estell 등의 미국 특허 제 4,760,025 호에 기재되어 있고, Asp32, Ser33, His64, Tyr104, Asn155, Glu156, Gly166, Gly169, Phe189, Tyr217 및 Met222 로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에 돌연변이를 갖는 야생형 서브틸리신 BPN' 아미노산 서열을 특징으로 한다.
본원에서 분자내 가교결합될 수 있는 보다 바람직한 프로테아제는, 서브틸리신 BPN', 프로테아제 A, 프로테아제 B, 프로테아제 C 및 프로테아제 D 로 구성된 군으로부터 선택되며, 프로테아제 D 가 가장 바람직하다.
본 발명의 분자내 가교결합된 프로테아제는 전술한 프로테아제의 두 아미노산 사이에 공유결합을 포함한다. 본원의 이러한 아미노산은 여기에서 제 1 잔기의 아미노산 및 제 2 잔기의 아미노산으로 독립적으로 지칭된다. 본원에서 사용하는 용어 "제 1 잔기" 및 "제 2 잔기" 는 각각 서브틸리신 BPN' 에 해당하는 위치 1 및 위치 2 를 의미하는 것으로 여겨서는 안된다. 오히려, 이 용어는 단순히 한 잔기 또는 다른 잔기의 언급을 명확히하기 위하여 사용된 것이다. 예컨대, 제 1 잔기는 서브틸리신 BPN'의 위치 27 에 해당하고, 제 2 잔기는 서브틸리신 BPN' 의위치 118 에 해당할 수 있다. 물론, 제 1 잔기가 서브틸리신 BPN' 의 위치 1 에 해당하거나 제 2 잔기가 서브틸리신 BPN'의 위치 2 에 해당하는 것도 본 발명의 범위내에서는 확실히 허용될 수 있다
또한 서브틸리신 BPN' 에 해당하는 특정 위치와 관련하여 "위치에 해당하는" 이라는 용어의 사용은 상기 위치에서 자연발생하는 아미노산을 규정하는 것으로 해석해서는 안된다. 오히려, 이러한 용어는 상기 위치에서 발생하는 특정 아미노산 잔기보다는 위치의 번호를 의미하는 것이다. 사실, 본 발명에 있어서, 시스테인(서브틸리신 BPN'에서 자연적으로 발생하지 않음)이 제 1 잔기 또는 제 2 잔기의 매우 바람직한 아미노산 잔기이다.
본 발명에 있어서, 서브틸리신 프로테아제의 분자내 가교결합은 프로테아제의 제 1 잔기의 아미노산과 프로테아제의 제 2 잔기의 아미노산사이의 공유결합을 포함한다. 이러한 공유결합은 제 1 잔기과 제 2 잔기를 브릿지시키는 연결부분을 포함한다. 연결 부분은 제 1 잔기와 제 2 잔기가 공유적으로 브릿지(결합)될 수 있는 임의의 구조적 메카니즘일 수 있다. 그러나, 여기에서 사용하는 연결부분은, 예컨대 단지 디술피드 결합을 형성하는 것과 같은 단순한 공유 결합이 아니다. 이론적 제한없이, 본 발명자는 상기의 디술피드 결합은 모 프로테아제와 비교시 감소된 면역원성을 갖는 분자내 가교결합된 프로테아제를 제공하는데 비효과적임을 발견하였다.
예컨대, 결합 부분은 임의의 소형 분자, 즉, 약 1600 미만, 바람직하게는 약 800 미만, 좀더 바람직하게는 약 400 미만, 가장 바람직하게는 약 300 미만의 분자량을 갖는 분자일 수 있다.
가장 바람직한 연결 부분에는 프로테아제의 하나 이상의 시스테인 잔기, 리신 잔기 및/또는 아미노 말단에 공유결합될 수 있는 것이 포함된다. 예컨대, 본 발명의 바람직한 구현예로서, 제 1 잔기의 아미노산은 아민기를 포함한다 (예, 비제한적 예로서, 제 1 잔기의 아미노산은 리신이거나 (자연적 발생 또는 돌연변이를 통해), 제 1 잔기의 아미노산은 프로테아제의 아미노 말단이다). 또한, 본원의 바람직한 구현예로서, 제 2 잔기의 아미노산은 티올기를 포함한다. 예컨대, 비제한적 예로서, 제 2 잔기의 아미노산은 시스테인이다 (자연적 발생 또는 돌연변이를 통해). 예컨대, 하기의 비제한적 시약이 본 발명의 분자내 가교결합 프로테아제의 공유 결합을 형성시키는데 사용될 수 있다 : N-[알파-말레이미도아세톡시]숙신이미드 에스테르; N-5-아지도-2-니트로벤조일옥시숙신이미드; 비스말레이미도헥산; N-[베타-말레이미도프로필옥시]숙신이미드 에스테르; 비스[2-(숙신이미딜옥시카르보닐옥시)-에틸]술폰; 비스[술포숙신이미딜]수베레이트; 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠; 디메틸아디피메이트 ·2 HCl; 디메틸피멜리미데이트 ·2 HCl; 디메틸수베르이미데이트 ·2 HCl; 디숙신이미딜 글루타레이트; 디숙신이미딜 수베레이트; m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르; N-히드록시숙신이미딜-4-아지도살리실산; N-숙신이미딜-6-[4'-아지도-2'-니트로페닐아미노]헥사노에이트; N-히드록시숙신이미딜-2,3-디브로모프로피오네이트; 숙신이미딜 4-[N-말레이미도메틸]시클로헥산-1-카르복실레이트; 숙신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)-부티레이트; 숙신이미딜-6-[(베타-말레이미도프로피온아미도)헥사노에이트]; 비스[2-(술포숙신이미딜옥시카르보닐옥시)-에틸]술폰; N-[감마- 말레이미도부티릴옥시]술포숙신이미드 에스테르; N-히드록시술포숙신이미딜-4-아지도벤조에이트; N-[카파-말레이미도운데카노일옥시]술포숙신이미드 에스테르; m-말레이미도벤조일-N­히드록시술포숙신이미드 에스테르; 술포숙신이미딜[4-아지도살리실아미도]헥사노에이트; 술포숙신이미딜 7-아지도-4-메틸쿠마린-3-아세테이트; 술포숙신이미딜 6-[4'-아지도-2'-니트로페닐아미노]헥사노에이트; 술포숙신이미딜 4-[p-아지도페닐]부티레이트; 술포숙신이미딜[4-요오도 아세틸]아미노벤조에이트; 술포숙신이미딜 4-[N-말레이미도메틸]시클로헥산-1-카르복실레이트; 및 술포숙신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)-부티레이트. 이러한 시약의 각각은 Pierce Chemical Co.(Rockford, IL)로부터 구입할 수 있다. 유사한 시약을 사용하는 본 발명의 분자내 가교결합된 프로테아제의 제제의 비제한적 예는 하기에 기재되어 있다.
결합 부분 및 관련 화학의 다른 예들은 미국 특허 제 5,446,090 호, Harris, 1995.8.29 허여; 미국 특허 제 5,171,264 호, Merrill, 1992.12.15 허여; 미국 특허 제 5,162,430 호, Rhee 등, 1992.11.10 허여; 미국 특허 제 5,153,265 호, Shadle 등, 1992.10.6 허여; 미국 특허 제 5,122,614 호, Zalipsky, 1992.6.16 허여; Goodson 등, "Site-Directed Pegylation of Recombinant Interleukin-2 at its Glycosylation Site", Biotechnology, Vol. 8, No. 4, pp. 343 - 346 (1990); Kogan, "The Synthesis of Substituted Methoxy-Poly(ethylene glycol) Derivatives Suitable for Selective Protein Modification", Synthetic Communications, Vol. 22, pp. 2417 - 2424 (1992); 및 Ishii 등, "Effects of theState of the Succinimido-Ring on the Fluorescence and Structural Properties of Pyrene Maleimide-Labeled aa-Tropomyosin", Biophysical Journal, Vol. 50, pp. 75 - 80 (1986). 가장 바람직한 연결 부분은 치환되거나 (예, 알킬) 또는 비치환된 숙신이미드이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 제 1 잔기의 아미노산은 아민기를 포함한다 (예, 비제한적 예로서, 제 1 잔기의 아미노산은 리신이거나 (자연적 발생 또는 돌연변이를 통해), 제 1 잔기의 아미노산은 프로테아제의 아미노 말단을 포함한다). 따라서, 제 1 잔기 및 제 2 잔기외의 위치에서 발생하는 리신 잔기를, 예컨대, 제 1 잔기에서 리신 잔기의 가교결합이 선택적이 되도록 하나 이상의 다른 아미노산으로 돌연변이시키는 것이 바람직하다. 예컨대, 리신 잔기는 본원에 정의된 바와 같이 제 1 인접 에피토프 영역내에 존재하는 서브틸리신 BPN' 의 위치 43 에서 발생한다. 프로테아제에서 발생하는 모든 다른 리신 잔기의 부위선택적 돌연변이를 수행후 위치 43 의 리신 잔기를 제 2 잔기에 선택적으로 가교결합시킬 수 있다. 이와 달리, 제 1 잔기의 자연발생적 아미노산은 리신으로 돌연변이후 (예로써), 프로테아제에서 발생하는 모든 다른 리신 잔기를 부위 선택적 돌연변이 및 리신 잔기를 제 2 잔기에 선택적으로 가교결합시킬 수 있다.
본원의 동일한 바람직한 구현예로서, 제 2 잔기의 아미노산은 티올기를 포함하며, 예컨대, 비제한적 예로서, 제 2 잔기의 아미노산은 시스테인인 것이 바람직하다 (자연적 발생 또는 돌연변이를 통해). 시스테인 잔기가 제 2 잔기외의 위치에서 발생하는 상기 예에서, 상기 위치들의 각각에서 시스테인을 또 다른 아미노산 잔기로 치환하여 제 1 잔기 및 제 2 잔기 사이에서 선택적 가교결합이 가능케 하는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 대안적 구현예로서, 제 1 잔기 및 제 2 잔기의 아미노산의 각각은 티올기를 포함한다. 비제한적 예로서, 제 1 잔기의 아미노산은 시스테인이고 (자연적 발생 또는 돌연변이를 통해), 제 2 잔기의 아미노산도 시스테인이다 (자연적 발생 또는 돌연변이를 통해). 제 1 및 제 2 잔기 이외의 위치에서 시스테인이 발생하는 상기 예에 있어서, 상기 위치들의 각각에서 시스테인을 또 다른 아미노산 잔기로 치환하여 제 1 잔기 및 제 2 잔기 사이에서 선택적 가교결합이 가능케 하는 것이 바람직하다.
본 발명의 추가의 바람직한 구현예로서, 제 1 잔기 및 제 2 잔기의 아미노산의 각각은 아민기를 포함한다. 비제한적 예로서, 제 1 잔기의 아미노산은 리신 또는 아미노 말단이고 (자연적 발생 또는 돌연변이를 통해), 제 2 잔기의 아미노산은 리신이다 (자연적 발생 또는 돌연변이를 통해). 제 1 및 제 2 잔기 이외의 위치에서 리신이 발생하는 상기 예에 있어서, 제 1 잔기 및 제 2 잔기 사이에서 선택적 가교결합이 가능한 위치들의 각각에서 리신을 또 다른 아미노산 잔기로 치환하는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명의 바람직한 구현예로서, 제 1 잔기의 아미노산은 리신이거나 아미노 말단을 포함하고, 제 2 잔기의 아미노산은 시스테인이다. 본 발명의 바람직한 대안적 구현예로서, 제 1 잔기의 아미노산은 시스테인이고, 제 2 잔기의 아미노산은 시스테인이다. 본 발명의 추가의 바람직한 구현예로서, 제 1 잔기의아미노산은 리신이거나 아미노 말단이고, 제 2 잔기의 아미노산은 리신이다.
본 발명의 바람직한 구현예로서, 제 1 및 2 잔기의 하나 이상은 한정된 영역내에서 발생한다. 서브틸리신 프로테아제는 3 개의 에피토프 영역을 포함함이 발견되었다. 따라서, 이론적 제한없이, 이러한 에피토프 영역의 하나 이상의 잔기가 가교결합에 관여하여, 에피토프의 표출의 방해로 인해 면역원성이 감소하는 것으로 여겨진다. 예컨대, 에피토프 영역의 하나 이상의 잔기가 프로테아제의 또 하나의 잔기에 가교결합하며, 에피토프의 표출전에 프로테아제의 다중 절단이 필요할 것이다. 제 1 에피토프 영역이 서브틸리신 BPN'의 위치 70-84 에 해당하고 ; 제 2 에피토프 영역은 서브틸리신 BPN' 의 위치 103-126 에 해당하며; 제 3 에피토프 영역은 서브틸리신 BPN' 의 위치 220-246 에 해당함이 발견되었다. 참조, 예컨대, 미국 특허 출원 시리얼 제 09/088,912 호, Weisgerber 등, The Procter & Gamble 에 양도, 1998.6.2 출원; 함께 심리중인 미국 가특허 출원 시리얼 제 60/144,991 호, Rubingh 등, "Serine Protease Variants Having Amino Acid Substitutions and Deletions in Epitope Regions" 1999.7.22 출원; 및 함께 심리중인 미국 가특허 출원 시리얼 제 60/144,980 호, Sikorski 등, "Serine Protease Variants Having Amino Acid Substitutions in Epitope Regions" 1999.7.22 출원.
또한 프로테아제의 특정 잔기는 프로테아제의 에피토프 영역에 매우 인접해 있음이 발견되었다. 본 발명자는 제 1, 2 및 3 인접 에피토프 영역의 잔기는 각각 제 1, 2 및 3 에피토프 영역에 매우 인접해 있음을 발견하였다. 따라서, 이론적 제한없이, 제 1, 2 또는 3 인접 에피토프 영역의 하나 이상의 잔기가 가교결합에 관여하여, 에피토프의 표출의 방해로 인해 면역원성이 감소하는 것으로 여겨진다. 제 1 인접 에피토프 영역은 서브틸리신 BPN' 의 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 12, 17, 36, 40, 41, 43, 44, 45, 67, 86, 87, 89, 206, 209, 210, 212, 213, 214, 215 및 216 에 해당하고; 제 2 인접 에피토프 영역은 서브틸리신 BPN' 의 위치 25, 26, 27, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 91, 99, 100, 101, 102, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 136, 137, 138, 140, 141, 144 및 145 에 해당하며; 제 3 인접 에피토프 영역은 서브틸리신 BPN' 의 위치 9, 10, 22, 23, 24, 62, 63, 143, 146, 154, 155, 156, 157, 172, 173, 187, 189, 195, 197, 203, 204, 253, 254, 256, 265, 267, 269, 271, 272 및 275 에 해당함이 발견되었다. 참조, 예컨대, 미국 가특허 출원 시리얼 제 60/144,979 호, Rubingh 등, "Protease Conjugates Having Sterically Protected Epitope regions", 1999.7.22 출원.
추가로, 또한 본 발명의 바람직한 구현예로서, 서브틸리신 프로테아제는 제 1 "클립 부위" 영역 및 제 2 "클립 부위" 영역 (즉, 생체내에서 가수분해가 발생하는 위치)을 포함하는 것이 발견되었다. 이론적 제한없이, 상기 클립 부위 영역내 하나 이상의 잔기가 가교결합에 관여하고, 프로테아제의 가수분해가 방해되어 에피토프의 표출이 유사하게 방해되는 것으로 여겨진다. 제 1 클립 부위 영역은 서브틸리신 BPN' 의 위치 156 - 165, 170, 186, 191 - 196 및 259 - 262 에 해당하고, 제 2 클립 부위 영역은 서브틸리신 BPN' 의 위치 12 - 24, 27, 84 - 88, 271 및 274 에 해당한다. 참조, 예컨대, 미국 가특허 출원 시리얼 제 60/144,981 호, Weisgerber 등, "Protease Conjugates Having Sterically Protected Clip sites",1999.7.22. 출원
따라서, 본 발명의 바람직한 구현예로서, 본 발명의 프로테아제는 분자내 가교결합을 포함하며, 이 분자내 가교결합은 프로테아제의 제 1 잔기의 아미노산과 프로테아제의 제 2 잔기의 아미노산 잔기 사이의 공유결합을 포함하며, 잔기의 하나 이상은 하기로 부터 선택된 영역내에서 발생한다 :
(a) 서브틸리신 BPN' 의 위치 1 에 해당하는 아미노 말단 영역;
(b)서브틸리신 BPN' 의 위치 70-84 에 해당하는 제 1 에피토프 영역;
(c)서브틸리신 BPN' 의 위치 103-126 에 해당하는 제 2 에피토프 영역;
(d)서브틸리신 BPN' 의 위치 220-246 에 해당하는 제 3 에피토프 영역;
(e)서브틸리신 BPN'의 위치 156 - 165, 170, 186, 191 - 196 및 259 - 262 에 해당하는 제 1 클립 부위 영역;
(f)서브틸리신 BPN'의 위치 12 - 24, 27, 84 - 88, 271 및 274 에 해당하는 제 2 클립 부위 영역;
(g)서브틸리신 BPN' 의 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 12, 17, 36, 40, 41, 43, 44, 45, 67, 86, 87, 89, 206, 209, 210, 212, 213, 214, 215 및 216 에 해당하는 제 1 인접 에피토프 영역 ;
(h)서브틸리신 BPN' 의 위치 25, 26, 27, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 91, 99, 100, 101, 102, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 136, 137, 138, 140, 141, 144 및 145 에 해당하는 제 2 인접 에피토프 영역 ; 및
(i)서브틸리신 BPN' 의 위치 9, 10, 22, 23, 24, 62, 63, 143, 146, 154,155, 156, 157, 172, 173, 187, 189, 195, 197, 203, 204, 253, 254, 256, 265, 267, 269, 271, 272 및 275 에 해당하는 제 3 인접 에피토프 영역.
여기에서 제 1 잔기 및 제 2 잔기중 단지 하나만이 전술한 영역내에서 발생하며, 다른 잔기는 프로테아제의 임의의 다른 위치에서 선택된다.
바람직하게는, 잔기의 적어도 하나는 아미노 말단 영역, 제 1 에피토프 영역, 제 2 에피토프 영역, 제 3 에피토프 영역, 제 1 클립 부위 영역 및 제 2 클립 부위 영역에서 선택된 영역내에서 발생한다. 좀더 바람직하게는, 잔기의 적어도 하나는 아미노 말단 영역, 제 1 에피토프 영역, 제 2 에피토프 영역 및 제 3 에피토프 영역에서 선택된 영역내에서 선택된다. 좀더 더 바람직하게는, 잔기의 적어도 하나는 제 1 에피토프 영역, 제 2 에피토프 영역 및 제 3 에피토프 영역에서 선택된 영역내에서 발생한다. 가장 바람직하게는, 잔기의 적어도 하나는 제 1 에피토프 영역내에서 발생한다.
본 발명의 추가의 바람직한 구현예로서, 프로테아제의 제 1 및 제 2 잔기의 각각은 아미노 말단 영역, 제 1 에피토프 영역, 제 2 에피토프 영역, 제 3 에피토프 영역, 제 1 클립 부위 영역, 제 2 클립 부위 영역, 제 1 인접 에피토프 영역, 제 2 인접 에피토프 영역 및 제 3 인접 에피토프 영역에서 선택된 영역내에서 발생한다. 좀더 바람직하게는, 제 1 잔기는 서브틸리신 BPN'의 위치 1 에 해당하고, 제 2 잔기는 제 1 에피토프 영역, 제 2 에피토프 영역, 제 3 에피토프 영역, 제 1 클립 부위 영역, 제 2 클립 부위 영역, 제 1 인접 에피토프 영역, 제 2 인접 에피토프 영역 및 제 3 인접 에피토프 영역으로 이루어진 군에서 선택된 영역내에서 발생한다.
본원에서 잔기의 적어도 하나는 제 1 에피토프 영역내에서 발생하고, 이 영역은 바람직하게는 서브틸리신 BPN'의 위치 75-83 에 해당한다. 좀더 바람직하게는, 이 영역은 서브틸리신 BPN' 의 위치 78 에 해당한다.
본원에서 잔기의 적어도 하나는 제 2 에피토프 영역내에서 발생하며, 이 영역은 바람직하게는 서브틸리신 BPN' 의 위치 109, 114 및 118 에 해당하고, 가장 바람직하게는 118 에 해당한다.
본원에서 잔기의 적어도 하나는 제 3 에피토프 영역내에서 발생하고, 이 영역은 바람직하게는 서브틸리신 BPN' 의 위치 240 에 해당한다 .
본원에서 잔기의 적어도 하나는 제 1 클립 부위 영역내에서 발생하고, 이 영역은 바람직하게는 서브틸리신 BPN' 의 위치 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 170, 186, 191, 192, 193, 194, 196, 259, 260, 261 및 262 에 해당한다. 좀더 바람직하게는, 이 영역은 서브틸리신 BPN'의 위치 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 170, 191, 192, 193, 194, 261 및 262 에 해당한다. 좀더 더 바람직하게는, 이 영역은 서브틸리신 BPN' 의 위치 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 192, 193, 194, 261 및 262 에 해당한다. 가장 바람직하게는, 이 영역은 서브틸리신 BPN'의 위치 160, 161, 162, 163 및 261 에 해당한다.
본원에서 잔기의 적어도 하나는 제 2 클립 부위 영역내에서 발생하고, 이 영역은 바람직하게는 서브틸리신 BPN' 의 위치 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20 및 21 에 해당한다. 좀더 바람직하게는, 이 영역은 서브틸리신 BPN'의 위치 14, 15, 16,18, 19, 20 및 21 에 해당한다. 가장 바람직하게는, 이 영역은 서브틸리신 BPN' 의 위치 18, 19, 20 및 21 에 해당한다.
본원에서 잔기의 적어도 하나는 제 1 인접 에피토프 영역내에서 발생하고, 이 영역은 바람직하게는 서브틸리신 BPN' 의 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 12, 17, 40, 41, 43, 67, 86, 87, 89, 206, 209, 214 및 215 에 해당한다. 가장 바람직하게는, 이 영역은 서브틸리신 BPN' 의 위치 2, 3, 4, 5, 17, 40, 41, 43, 67, 86, 87 및 214 에 해당한다.
본원에서 잔기의 적어도 하나는 제 2 인접 에피토프 영역내에서 발생하고, 이 영역은 바람직하게는 서브틸리신 BPN' 의 위치 25, 26, 27, 46, 47, 48, 49,50, 51, 52, 53, 54, 91, 99, 100, 101, 102, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 136, 137, 138, 140, 141, 144 및 145 에 해당한다. 가장 바람직하게는, 이 영역은 서브틸리신 BPN' 의 위치 27, 47, 48, 50, 52, 102, 127, 128, 130, 131, 132, 134, 138 및 141 에 해당한다.
본원에서 잔기의 적어도 하나는 제 3 인접 에피토프 영역내에서 발생하고, 이 영역은 바람직하게는 서브틸리신 BPN' 의 위치 9, 10, 22, 23, 24, 62, 63, 143, 146, 154, 155, 156, 157, 172, 173, 187, 189, 195, 197, 203, 204, 253, 254, 256, 265, 267, 269, 271, 272 및 275 에 해당한다. 가장 바람직하게는, 이 영역은 서브틸리신 BPN' 의 위치 22, 23, 24, 143, 146, 155, 173, 189, 197, 203, 204, 253, 254, 265 및 275 에 해당하다.
하기 표 2 에는 바람직한 분자내 가교결합된 서브틸리신 프로테아제의 비제한적 예가 기재되어 있고, 각각의 예에서, 열거된 위치 번호는 각각 제 1 잔기 및제 2 잔기를 나타낸다. 즉, 이를 통해 잔기의 분자내 가교결합이 발생한다. 본원의 개시와 일치하게, 모든 잔기 넘버링은 서브틸리신 BPN' 넘버링에 상응한다.
제 1 잔기 제 2 잔기
27 (제 2 클립 부위 영역내) 118 (제 2 에피토프 영역내)
141(제 2 인접 에피토프 영역내) 118 (제 2 에피토프 영역내)
114(제 2 인접 에피토프 영역내) 118 (제 2 에피토프 영역내)
25 (제 2 인접 에피토프 영역내) 118 (제 2 에피토프 영역내)
118(제 2 에피토프 영역내) 240 (제 3 에피토프 영역내)
25 (제 2 인접 에피토프 영역내) 240 (제 3 에피토프 영역내)
275 (제 3 인접 에피토프 영역내) 240 (제 3 에피토프 영역내)
137 (제 2 인접 에피토프 영역내) 109 (제 2 에피토프 영역내)
55 109 (제 2 에피토프 영역내)
133 (제 2 인접 에피토프 영역내) 109 (제 2 에피토프 영역내)
1 (아미노 말단 영역) 79 (제 1 에피토프 영역)
1 (아미노 말단 영역) 78 (제 1 에피토프 영역)
43 (제 1 인접 에피토프 영역내) 75 (제 1 에피토프 영역내)
43 (제 1 인접 에피토프 영역내) 82 (제 1 에피토프 영역내)
12 (제 2 클립 부위 영역내) 82 (제 1 에피토프 영역내)
24 (제 2 클립 부위 영역내) 82 (제 1 에피토프 영역내)
18 (제 2 클립 부위 영역내) 82 (제 1 에피토프 영역내)
4 (제 1 인접 에피토프 영역내) 82 (제 1 에피토프 영역내)
186 (제 1 클립 부위 영역내) 158 (제 1 클립 부위 영역내)
186 (제 1 클립 부위 영역내) 160 (제 1 클립 부위 영역내)
262 (제 1 클립 부위 영역내) 158 (제 1 클립 부위 영역내)
262 (제 1 클립 부위 영역내) 160 (제 1 클립 부위 영역내)
262 (제 1 클립 부위 영역내) 161 (제 1 클립 부위 영역내)
130 (제 2 인접 에피토프 영역내) 159 (제 1 클립 부위 영역내)
130 (제 2 인접 에피토프 영역내) 162 (제 1 클립 부위 영역내)
78 (제 1 에피토프 영역내) 212 (제 1 인접 에피토프 영역내)
선택적 부분
본 발명의 분자내 가교결합된 프로테아제는 프로테아제의 임의의 잔기에 공유결합된 하나 이상의 소형 분자, 폴리펩티드 및/또는 중합체 (여기에서는 "보조 부분"으로 칭한다), 특히 분자내 가교결합에 관여하는 잔기를 포함한 (예로서) 하나 이상의 다른 화학적 구조를 추가로 포함할 수 있다. 여기에서 사용하는 용어 "소형 분자" 는 약 1600 미만, 바람직하게는 약 800 미만, 좀더 바람직하게는 약 400 미만 및 가장 바람직하게는 약 300 미만의 분자량을 갖는 분자를 의미한다.여기에서 사용하는 용어 "폴리펩티드" 는 두개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 분자를 의미한다. 여기에서 사용하는 용어 "중합체" 는 두 개 이상의 동일한 (바람직하게는 5 개 이상이 동일한) 단량체 단위를 포함하는 임의의 분자를 의미한다.
보조 부분은, 예컨대, 하기에 기재된 바와 같이 폴리펩티드 부분, 중합체 부분 및 연결부분을 포함할 수 있다 : WO 96/17929, Olsen 등, Novo Nordisk A/S, 1996.6.13 공개; WO 96/40791, Olsen 등, Novo Nordisk A/S, 1996.12.19 공개; WO 96/40792, Olsen 등, Novo Nordisk A/S, 1996.12.19 공개; WO 97/30148, Bisgard-Frantzen 등, Novo Nordisk A/S, 1997.8.21 공개; WO 98/30682, Olsen 등, Novo Nordisk A/S, 1998.7.16 공개; WO 98/35026, Von Der Osten 등, Novo Nordisk A/S, 1998.8.13 공개; WO 99/00849, Olsen 등, Novo Nordisk A/S, 1999.1.7 공개; 미국 특허 제 5,856,451, Olsen 등, Novo Nordisk A/S, 1999.1.5 허여; WO 97/37007, Bott 등, Genencor International Inc., 1997.10.9 공개; 미국 특허 출원 시리얼 제 09/088,912, Weisgerber 등, The Procter & Gamble Co., 1998.6.2 출원; 미국 특허 출원 시리얼 제 08/903,298, Weisgerber 등, The Procter & Gamble Co., 1997.7.30 출원; 미국 가특허 출원 시리얼 제 60/144,979, Rubingh 등, "Protease Conjugates Having Sterically Protected Epitope Regions", 1999. 7.22 출원; 및 미국 가특허 출원 시리얼 제 60/144,981, Weisgerber 등, "Protease Conjugates Having Sterically Protected Clip Sites", 1999.7.22 출원.
제조 방법
하나 이상의 에피토프 부위 보호 위치 (또는 이 부분의 임의의 다른 위치)에 치환을 갖는 프로테아제 부분은, 모 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 돌연변이시켜 제조한다. 상기 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다; 상기 방법의 한 비제한적 예를 하기에 나타낸다:
야생형 서브틸리신 BPN' 유전자를 함유하는 파지미드 (pSS-5) 를 대장균 (Escherichia coli)dut- ung-균주 CJ236 에 형질전환시키고, 문헌 [Yuckenberg 등, "Site-Directed in vitro Mutagenesis Using Uracil-Containing DNA and Phagemid Vectors", Directed Mutagenesis - A Practical Approach, McPherson, M. J. eds, pp. 27 - 48 (1991)]에 의해 변형된 VCSM13 헬퍼 파지 [Kunkel 등, "Rapid and Efficient Site-Specific Mutagenesis Without Phenotypic Selection", Methods in Enzymology, Vol 154, pp. 367 - 382 (1987)]를 이용하여, 단일 가닥의 우라실 함유 DNA 주형을 제조한다. 문헌 [Zoller, M. J. 및 M. Smith, "Oligonucleotide - Directed Mutagenesis Using M13 - Derived Vectors: An Efficient and General Procedure for the Production of Point Mutations in any Fragment of DNA", Nucleic Acids Resesarch, Vol. 10, pp. 6487 - 6500 (1982)] 에 개시된 방법으로 변형된, 프라이머 부위 지정 돌연변이화를 이용하여, 모든 돌연변이체를 제조한다 (본질적으로, Yuckenberg 등의 상기 문헌이 나타낸 대로).
380B DNA 합성기 (Applied Biosystems Inc.) 를 이용하여 올리고뉴클레오티드를 제조한다. 돌연변이화 반응 생성물을 대장균 균주 MM294 (American Type Culture CollectionE. coli33625) 로 형질전환시킨다. 모든 돌연변이를 DNA 서열분석으로 확인하고, 단리된 DNA 를 바실러스 서브틸리스 발현 균주 PG632 로 형질전환시킨다 [Saunders 등, "Optimization of the Signal-Sequence Cleavage Site for Secretion fromBacillus subtilisof a 34-Amino Acid Fragment of Human Parathyroid Hormone", Gene, Vol. 102, pp. 277 - 282 (1991)] 및 [Yang 등, "Cloning of the Neutral Protease Gene ofBacillus subtilisand the Use of the Cloned Gene to Create an in vitro - Derived Deletion Mutation", Journal of Bacteriology, Vol. 160, pp. 15 - 21 (1984)].
발효는 하기와 같다. 대상 프로테아제를 함유한 바실러스 서브틸리스 세포 (PG632) 를, 글루코오스 10 g/L 함유 LB 브로스 1 리터 중에서 로그상 중간까지 배양하고, 총 9 리터 부피의 Biostat C 발효기 (Braun Biotech, Inc., Allentown, PA) 내에 접종한다. 발효 배지에는 효모 추출물, 카제인 히드로실레이트, 가용성-부분 가수분해된 전분 (Maltrin M-250), 소포제, 버퍼 및 미량 미네랄 (참조, "Biology of Bacilli: Applications to Industry", Doi, R. H. 및 M. McGloughlin eds. (1992)) 이 함유된다. 브로스는 발효 과정 중에 일정한 pH 7.5 로 유지된다. 돌연변이된 플라스미드의 항생제 선별을 위해, 카나마이신 (50 ㎍/mL) 을 첨가한다. A600이 약 60 이 될 때까지, 세포를 37℃ 에서 18 시간 동안 배양하여, 산물을 회수한다.
발효 브로스를 하기 단계를 따라 처리하여, 순수한 프로테아제를 수득한다. 브로스를 0.16 ㎛ 막을 통해 수직으로 흘려서, 바실러스 서브틸리스 세포를 제거한다. 이어서, 무세포 브로스를 8,000 분자량 컷오프 막으로 초여과하여 농축한다.진한 MES 버퍼 (2-(N-모르폴리노)에탄술폰산) 으로 pH 를 5.5 로 조정한다. S-세파로오스로 양이온 교환 크로마토그래피하고, NaCl 농도구배로 용출하여, 프로테아제를 후속 정제한다. 문헌 [Scopes, R. K. "Protein Purification Principles and Practice", Springer-Verlag, New York (1984)] 를 참조.
pNa 분석법 (DelMar 등, Analytical Biochemistry, Vol. 99, pp. 316 - 320 (1979)) 을 이용하여, 농도구배 용출 중에 수합된 분획들의 활성 프로테아제 농도를 측정한다. 상기 분석법은, 프로테아제가 가용성 합성 기질인 숙시닐-알라닌-알라닌-프롤린-페닐알라닌-p-니트로아닐린 (sAAPF-pNA) 을 가수분해함에 따라 p-니트로아닐린이 방출되는 속도를 측정한다. 가수분해 반응으로부터의 황색 생성 속도는 분광광도계로 410 nm 에서 측정하며, 활성 프로테아제 부분의 농도에 비례한다. 또한, 280 nm 에서의 흡광도 측정을 이용하여, 전체 단백질 농도를 측정한다. 활성 프로테아제/전체 단백질 비로 프로테아제 순도를 얻고, 원액을 풀링하기 위한 분획을 확인하는데 사용한다.
보관 중 프로테아제의 자가분해를 방지하기 위해, 동량의 프로필렌 글리콜을 크로마토그래피 칼럼으로부터 수득하여 풀링된 분획에 첨가한다. 정제 공정의 완료시, 프로테아제 원액의 순도를 SDS-PAGE (소듐 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동) 로 확인하고, 트립신 저해제 유형 Ⅱ-T 인 칠면조 난백 (Sigma Chemical Company, St.Louis, Missouri) 을 이용한 활성 부위 적정 방법을 통해 절대 효소 농도를 측정한다.
사용을 위한 제조에 있어서, 프로테아제 원액을 세파덱스-G25 (Pharmacia,Piscataway,New Jersey) 크기 배제 칼럼을 통해 용출하여, 프로필렌 글리콜을 제거하고 버퍼를 교환한다. 효소 원액 중의 MES 버퍼를 0.01 M KH2PO4용액, pH 5.5 로 교환한다.
본 발명의 분자내 가교결합된 프로테아제의 제조방법의 비제한적 예는 하기에 기재되어 있으며, 각각의 실시예에서 기호는 전술한 바와 같은 프로테아제를 나타낸다.
실시예 1
위치 217 에서 티로신이 루이신으로 치환되고, 위치 78 에서 세린이 시스테인으로 치환된 서브틸리신 BPN' 의 변이체를 제조한다. 이 변이체를 5 l 의 pH 5.5 버퍼중 5mM 디티오트레이톨(DTT; Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO)에 대하여 5 시간동안 투석한다 (약 2mg/mL 의 농도에서 100 mL). 이 변이체를 DTT 가 없는 새로운 버퍼로 옮겨, 약 16 시간동안 투석시킨다. 변이체 농도는 280 nm 에서의흡광도로 측정한다. 티올 농도를 측정하여 유리 티올 농도가 프로테아제 농도보다 더 큼을 확실히 한다 (참조, Deaken 등, Biochemical Journal, Vol. 89, p. 263 (1963)). N-(감마-말레이미도부티릴옥시)숙신이미드 에스테르 (Pierce Chemical, Rockford, IL)를 유리 티올 농도의 1.2 배의 과량으로 첨가한다. 5 분후 약 20 mL 의 1M pH 6.8 버퍼를 첨가한다. 추가로 30 분 후, 약 100 mL 의 1M pH 5.5 버퍼를 첨가한다. 이어서 반응 혼합물을 약 5 l 의 0.01 M pH 5.5 버퍼에 대하여 투석시킨다. 위치 78의 시스테인과 아미노 말단사이에 공유 결합을 포함하는 분자내 가교결합된 프로테아제를 이온교환 컬럼으로 정제시킨다.
실시예 2
위치 217 에서 티로신이 루이신으로 치환되고, 위치 240 에서 아스파라긴이 시스테인으로 치환되고, 위치 118 에서 아스파라긴이 리신으로 치환된 서브틸리신BPN' 의 변이체를 제조한다. 프로테아제의 모든 기타 리신 잔기를 리신 또는 시스테인외의 아미노산으로 치환시킨다. 이 변이체를 5 l 의 pH 5.5 버퍼중 5mM 디티오트레이톨(DTT; Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO)에 대하여 4 시간동안 투석한다 (약 2mg/mL 의 농도에서 100 mL). 이 변이체를 DTT 가 없는 새로운 버퍼로 옮겨 약 16 시간동안 투석시킨다. 변이체 농도를 280 nm 에서의 흡광도로 측정한다. 티올 농도를 측정하여 유리 티올 농도가 프로테아제 농도보다 더 큼을 확실히 한다. 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)-시클로헥산-1-카르복시(6-아미도카프로에이트) (Pierce Chemical, Rockford, IL)를 유리 티올 농도의 1.2 배의 과량으로 첨가한다. 5 분후, 약 20 ml 의 1M pH 6.8 버퍼를 첨가한다. 추가로 30 분 후, 약 100 mL 의 1M pH 5.5 버퍼를 첨가한다. 이어서 반응 혼합물을 약 5 l 의 0.01 M pH 5.5 버퍼에 대하여 투석시킨다. 위치 240 의 시스테인과 위치 118 의 리신사이에 공유 결합을 포함하는 분자내 가교결합된 프로테아제를 이온교환 컬럼으로 정제시킨다.
실시예 3
실시예 1 에서 사용한 N-(감마-말레이미도부티릴옥시)숙신이미드 에스테르 를 하기의 시약중 임의의 하나로 대체하여 위치 78 의 시스테인과 아미노 말단사이에 공유 결합을 형성시킨다 : N-(알파-말레이미도아세톡시)숙신이미드 에스테르, N-(베타-말레이미도프로필옥시)숙신이미드 에스테르, 또는 m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르. 상기 시약의 각각은 Pierce Chemical Company ( Rockford, IL)에 의해서 시판되고 있다. 이와 달리, 유사한 크기의 말레이미드 부분 및 숙신이미딜 에스테르 부분을 포함하는 임의의 시약을 합성하여 N-(감마­말레이미도부티릴옥시)숙신이미드 에스테르를 대체할 수 있다 (참조, Kalgutar 등, Journal of Medicinal Chemistry, Vol. 39, pp. 1692 - 1703 (1996) 및 이에 기재된 참고문).
실시예 4
실시예 2 에서 사용된 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)-시클로헥산-1-카르복시(6-아미도카프로에이트) 를 하기의 시약중 임의의 하나로 대체하여, 위치 240 의 시스테인과 위치 118 의 리신 사이에 공유 결합을 형성시킨다 : 숙신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)-부티레이트, 술포숙신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)-부티레이트, 또는 N-[카파-말레이미도운데카노일옥시]술포숙신이미드 에스테르. 상기 시약의 각각은 Pierce Chemical Company (Rockford, IL) 에 의해서 시판된다. 이와 달리, 유사한 크기의 말레이미드 부분 및 숙신이미딜 에스테르 부분을 포함하는 임의의 시약을 합성하여 N-(감마-말레이미도부티릴옥시)숙신이미드 에스테르를 대체할 수 있다 (참조, Kalgutar 등, Journal of Medicinal Chemistry, Vol. 39, pp. 1692 - 1703 (1996) 및 이에 기재된 참조문).
실시예 5
위치 217 에서 티로신이 루이신으로 치환되고, 위치 78 에서 세린이 시스테인으로 치환된 서브틸리신 BPN' 의 변이체를 제조한다. 프로테아제의 모든 표면 리신 잔기는 리신 또는 시스테인 이외의 아미노산으로 치환시킨다. 이 변이체를 5 l의 pH 7-8 버퍼중 5mM 디티오트레이톨(DTT; Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO)에 대하여 4 시간동안 투석한다 (약 2mg/mL 의 농도에서 100 mL). 이 변이체를 DTT 가 없는 새로운 버퍼로 옮겨, 약 4 시간동안 투석시킨다. 변이체 농도를 280 nm 에서의 흡광도로 측정한다. 티올 농도를 측정하여 유리 티올 농도가 프로테아제 농도보다 더 큼을 확실히 한다. N-숙신이미딜 (4-요오도아세틸)아미노벤조에이트 (Pierce Chemical, Rockford, IL)를 유리 티올 농도의 1.2 배의 과량으로 첨가한다. 30 분 후, 약 100 mL 의 1M pH 5.5 버퍼를 첨가한다. 이어서 반응 혼합물을 약 5 l 의 0.01 M pH 5.5 버퍼에 대하여 투석시킨다. 위치 78 의 시스테인과 아미노 말단 사이에 공유 결합을 포함하는 분자내 가교결합된 프로테아제를이온교환 컬럼으로 정제시킨다.
실시예 6
위치 217 에서 티로신이 루이신으로 치환되고, 위치 78 에서 세린이 시스테인으로 치환된 서브틸리신 BPN' 의 변이체를 제조한다. 이 변이체를 5 l의 pH 5.5 버퍼중 5mM 디티오트레이톨(DTT; Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO)에 대하여 4 시간동안 투석한다 (약 2mg/mL 의 농도에서 100 mL). 이 변이체를 DTT 가 없는 새로운 버퍼로 옮겨 약 16 시간동안 투석시킨다. 변이체 농도를 280 nm 에서의 흡광도로 측정한다. 티올 농도를 측정하여 유리 티올 농도가 프로테아제 농도보다 더 큼을 확실히 한다. N-말레이미도[4'-아지도-2'-니트로페닐아미노]부티레이트를 유리 티올 농도의 1.2 배의 과량으로 첨가한다. 5 분후 반응을 UV 선(320nm-350nm)에 10분간 노출시킨다. 이와는 달리, 반응을 표준 카메라 벌브의 10 플래쉬에 노출시킨다. 이어서 반응 혼합물을 약 2 l 의 0.01 M pH 5.5 버퍼에 대하여 투석시킨다. 위치 78 의 시스테인과 아미노 말단 사이에 공유 결합을 포함하는 분자내 가교결합된 프로테아제를 이온교환 컬럼으로 정제시킨다.
실시예 7
실시예 6 에서 사용된 GMAB 를 하기의 시약중 임의의 하나로 대체하여 위치 78 에서 치환된 리신과 아미노 말단사이에 공유 결합을 형성시킨다 (여기에서 프로테아제의 모든 다른 리신 잔기는 또하나의 아미노산으로 치환된다) : N-5-아지도-2-니트로벤조일옥시숙신이미드, N-숙신이미딜-6-(4'-아지도-2'-니트로페닐아미노)헥사노에이트, N-히드록시술포숙신이미딜-4-아지도벤조에이트, 술포숙신이미딜(4-아지도살리실아미도)헥사노에이트, 술포숙신이미딜 7-아지도-4-메틸쿠마린-3-아세테이트, 술포숙신이미딜 6-(4'-아지도-2'-니트로페닐아미노)헥사노에이트 및 술포숙신이미딜 4-(p-아지도페닐)부티레이트. 상기 시약의 각각은 Pierce Chemical Company (Rockford, IL)에 의해서 시판된다.
실시예 8
위치 217 에서 티로신이 루이신으로 치환되고, 위치 78 에서 세린이 시스테인으로 치환되고, 위치 1 에서 알라닌이 시스테인으로 치환된 서브틸리신 BPN'의 변이체를 제조한다. 이 변이체를 5 l 의 pH .55 버퍼중 5mM 디티오트레이톨(DTT; Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO)에 대하여 4 시간동안 투석한다 (약 2mg/mL 의 농도에서 100 mL). 이 변이체를 DTT 가 없는 새로운 버퍼로옮겨 약 16 시간동안 투석시킨다. 변이체 농도를 280 nm 에서의 흡광도로 측정한다. 티올 농도를 측정하여 유리 티올 농도가 프로테아제 농도보다 2 배 더 큼을 확실히 한다. 10 mL 1M (N-(2-히드록시에틸)피페라진-N'-(2-에탄술폰산)) (HEPES) / NaOH 버퍼 pH 7.0 를 프로테아제 용액에 첨가한다. 비스말레이미도헥산 (Pierce Chemical, Rockford, IL)를 프로테아제 농도의 1.2 배의 과량으로 첨가한다. 이어서, 1 시간후, 반응 혼합물을 20 부피의 0.01M pH 5.5 버퍼에 대하여 투석시킨다. 위치 78 의 시스테인과 아미노 말단의 시스테인 사이에 공유 결합을 포함하는 분자내 가교결합된 프로테아제를 이온교환 컬럼으로 정제시킨다.
분석 방법
본 발명의 분자내 가교결합된 프로테아제는 하기의 방법을 이용하여 효소 활성 및 면역원성 반응에 대하여 시험할 수 있으며, 이 두 방법은 당업자에게는 공지되어 있다. 당해 기술에 공지된 다른 방법들도 대안적으로 사용될 수 있다.
프로테아제 활성
본 발명의 분자내 가교결합된 프로테아제의 프로테아제 활성은 당해 기술에 공지된 방법으로 분석할 수 있다. 이러한 두 방법이 하기에 기술되어 있다 :
피부박편 활성 방법
스카치 #375OG 테이프를 이용하여, 사람의 피부 박편을 테이프가 박편에 의해서 실질적으로 불투명해질 때까지 반복적으로 피험자의 다리로부터 박리시킨다. 이어서, 테이프를 1 인치 x 1 인치로 절단하여, 준비하여 둔다. 10 mm x 35 mm 페트리 접시에, 2 mL의 대조군 효소(0.75 mg/mL) (예, 서브틸리신 BPN') 또는 시험코자하는 프로테아제를 0.01 M KH2PO4pH 5.5 버퍼에 첨가한다. 이 용액에, 1mL 의 2.5% 소듐 라우레이트 pH 8.6 용액을 첨가한다. 이 용액을 플래트폼 쉐이커에서 부드럽게 혼합시킨다. 계속하여 부드럽게 혼합시키면서 미리 준비된 테이프 조각을 상기 용액에 10분간 침지시킨다(박편을 위로하여). 이어서 테이프 조각을 15 초간 수돗물에 부드럽게 휑군다. Stevenel Blue Stain (3 mL, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)을 피펫으로 깨끗한 페트리 접시로 옮긴다. 휑궈진 테이프 조각을 부드럽게 혼합하면서 3 분간 염색시킨다 (박편을 위로함). 테이프 조각을 염색약으로부터 꺼내 연속적으로 2 개의 300 mL 증류수 비이커에서 15 초씩 휑군다. 이어서 테이프 조각을 공기건조시킨다. 대조군 효소로부터 수득한 테이프 조각과 프로테아제로부터 수득한 테이프 조각사이의 색상의 강도를 육안 또는 색도계를 이용하여 비교한다. 대조군 효소 테이프 조각에 비하여, 덜한 색상 강도를 보이는 프로테아제 테이프 조각이 더 높은 활성을 가진 프로테아제임을 나타낸다.
염색 콜라겐 활성 방법
0.01 M CaCl2를 함유하는 50 mL 의 0.1 M 트리스 버퍼 (트리스-히드록시메틸-아미노메탄) pH8.6 와 0.5g 아조콜 (아조 염료가 함침된 콜라겐, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)을 합친다. 이 혼합물을 플래트폼 쉐이커를 이용하여 부드럽게 혼합하면서 25 ℃ 에서 인큐베이션시킨다. 0.2 미크론 시린지 필터를 통해 2mL 의 상기 혼합물을 여과한 후, 분광광도계를 이용하여 520nm 에서의 값을 0 으로 하여, 혼합물의 흡광도를 읽는다. 1 ppm 의 대조군 효소 (예, 서브틸리신 BPN') 또는 시험코자하는 프로테아제를 남아있는 48 mL 의 트리스/아조콜 혼합물에 첨가한다. 2 mL 의 대조군/프로테아제 함유 용액을 0.2 미크론 시린지 필터를 통해 매 2 분씩 총 10 분간 여과시킨다. 각 여과된 시료에 대하여, 520 mn 바로 가까이의 흡광도를 읽는다. 결과를 시간에 대한 그래프로 작성한다. 대조군 및 시험 컨쥬게이트의 기울기는 시료의 상대적 활성을 나타낸다. 기울기가 클수록 더 높은 활성을 나타낸다. 시험 프로테아제 활성 (기울기)는 대조군 활성(기울기)의 백분율로 나타낼 수 있다.
면역원성에 대한 마우스 비강내 시험
본 발명의 분자내 가교결합된 프로테아제의 면역원성의 포텐셜은 당해 기술에 공지된 방법 또는 후술된 면역원성에 대한 마우스 비강내 시험으로 측정될 수 있다. 이 시험은 문헌Robinson et al.,"Specific Antibody Responses to Subtilisin Carlsberg (Alcalase) in Mice: Development of an Intranasal Exposure Model", Fundamental and Applied Toxicology, Vol. 34, pp. 15 - 24 (1996) andRobinson et al.,"Use of the Mouse Intranasal Test (MINT) to Determine the Allergenic Potency of Detergent Enzymes: Comparison to the Guinea Pig Intratracheal (GPIT) Test", Toxicological Science, Vol. 43, pp. 39 - 46 (1998)에 기재되어 있는 분석과 유사하며, 이 두 분석은 후술된 시험을 대신하여 사용될 수 있다.
체중이 약 18 내지 약 20g 인 암컷 BDF1 마우스 (Charles River Laboratories, Portage, MI)를 시험에 이용한다. 이 마우스는 약물투여전 1 주일간 격리시킨다. 이 마우스를 습도 (30 - 70%), 온도 (67 - 77℉) 및 12 시간의 명암 주기로 조절되는 실내에서 목재칩으로 잠자리가 마련된 케이지에 수용시킨다. 이 마우스에 Purina마우스 사료(Purina Mills, Richmond, IN) 및 물을 자유로이 공급한다.
시험코자하는 포텐셜 항원 (양성 대조군으로서 서브틸리신 BPN' 또는 본 발명의 분자내 가교결합된 프로테아제)을 5 마리로 이루어진 일군에 투여한다. 투여전, 각 마우스를 Ketaset (88.8 mg/kg) 및 Rompun (6.67 mg/kg)의 혼합물을 복강내 주사하여 마취시킨다. 마취된 동물을 손바닥에 뉘여 버퍼 용액(0.01 M KH2PO4, pH 5.5)중 5mL 프로테아제로 비강내 투여한다. 각 군에 동일한 용량을 투여하면서, 다양한 용량을 시험할 수 있다. 투여 용액은 각 비강의 외부에 부드럽게 놓아 마우스가 흡입토록 한다. 투여는 3, 10, 17 및 24 일째 반복한다.
혈청 시료를 29 일째 채취한다. 마우스 혈청내 효소특이적 IgG1 항체를 항원 캡춰 ELISA 방법으로 측정한다. 분자내 가교결합된 프로테아제의 면역원성은 표준 ED50값을 이용하여 서브틸리신 BPN' 의 면역원성과 비교할 수 있다.
본 발명의 조성물
본 분자내 가교결합된 프로테아제는 각각의 모(母) 프로테아제에 적합한 임의의 용도에서 사용할 수 있다. 이러한 예의 하나는 세정용 조성물이다. 본 발명의 분자내 가교결합된 프로테아제의 바람직한 감소된 면역원성 특성 때문에, 본 프로테아제는 역사적으로 프로테아제를 사용함으로써 별다른 혜택을 받지 못한용도들에서 사용될 수 있다. 이러한 용도들의 예로는 퍼스널 케어 조성물의 사용에서와 같은, 분자내 가교결합된 프로테아제가 포유류 피부 (특히, 인간 피부)와 필연적으로 밀접하게 접촉하게 되는 용도를 들 수 있다.
세정용 조성물
본 발명의 프로테아제는 세탁 조성물, 경질 표면 세정용 조성물, 식기 세정용 조성물을 포함한 가사 경감 세정용 조성물 및 자동 식기세척기 세제 조성물을 포함하는 세정용 조성물에서 사용될 수 있으며, 이에만 국한되는 것은 아니다.
본 세정용 조성물은 유효량의 본 발명의 하나 이상의 프로테아제 및 세정용 조성물 담체를 포함한다.
여기에서 사용하는, "유효량의 프로테아제" 등은 특정의 세정용 조성물에서 필요한 단백질분해 활성을 달성하는데 필요한 분자내 가교결합된 프로테아제의 양을 의미한다. 이러한 유효량은 당업자에 의해서 쉽게 확인되며, 많은 요소, 예컨대, 사용되는 특정의 프로테아제, 세정 용도, 세정용 조성물의 특이적 조성 및 액성 또는 건성 (예, 과립, 바아) 조성물의 필요 여부 등에 기초한다. 바람직하게는, 세정용 조성물은 약 0.0001% 내지 약 10%, 좀더 바람직하게는 약 0.001% 내지 약 1%, 가장 바람직하게는 약 0.01% 내지 약 0.1% 의 본 발명의 하나 이상의 프로테아제를 포함한다. 프로테아제가 사용될 수 있는 다양한 세정용 조성물의 여러 예가 하기에 추가로 토의된다.
본 발명의 프로테아제외에, 본 발명의 세정용 조성물은 추가로 프로테아제와 상용적인 하나 이상의 세정용 조성물 재료를 포함하는 세정용 조성물 담체를 포함한다. 여기에서 사용하는 용어 "세정용 조성물 재료" 는 목적하는 세정용 조성물의 특정 유형 및 제품의 형태 (예, 액체, 과립, 바아, 스프레이, 스틱, 페이스트, 겔)을 위해 선택된 임의의 재료를 의미하며, 이 재료들은 또한 조성물에서 사용하는 프로테아제와 상용적이다. 세정용 조성물 재료의 특정의 선택은 세정코자하는 표면의 재료, 사용동안 세정 상태에 대한 조성물의 목적하는 형태 (예, 워시 세제 사용을 통해)를 고려하여 용이하게 수행된다. 여기에서 사용하는 용어 "상용적" 은 세정용 조성물 재료가 정상적인 사용 환경동안 프로테아제가 목적하는 바와 같이 효과적이지 않은 정도로 프로테아제의 단백질 분해 활성을 감소시키지 않는 것을 의미한다. 특정 세정용 조성물 재료는 이하에 상세히 예시된다.
본 발명의 프로테아제는 고 거품성(sudsing) 및 양호한 세정성이 요망되는 다양한 세제 조성물에서 사용될 수 있다. 따라서, 본 프로테아제는 다양한 통상의 성분들과 함께 사용하여 완전히 제형화된 경질 표면 크리너, 식기세정용 조성물, 직물 세탁 조성물 등을 제공할 수 있다. 이러한 조성물은 액체, 과립, 바아 등의 형태일 수 있다. 이러한 조성물은 계면활성제를 약 30 중량% 내지 약 60 중량% 함유하는 "농축"세제로 제형화될 수 있다.
여기에서 세정용 조성물은 임의적으로, 바람직하게는 다양한 계면활성제 (예, 음이온성, 비이온성 또는 쯔비터이온성 계면활성제)을 포함할 수 있다. 이러한 계면활성제는 통상적으로 조성물의 약 5% 내지 약 35% 의 수준에서 제공된다.
여기에서 유용한 계면활성제의 비제한적 예에는 통상의 C11-C18알킬벤젠 술폰에이트 및 일차 및 랜덤 알킬 술페이트, 화학식 CH3(CH2)x(CHOS03 -M+)CH3및 CH3(CH2)y(CHOSO3 -M+)CH2CH3(식중, x 및 (y+l) 은 적어도 약 7, 바람직하게는 적어도 약 9 의 정수이고, M 은 수용성 양이온, 특히 나트륨이다)의 C10-C18이차 (2,3) 알킬 술페이트, C1O-Cl8알킬 알콕시 술페이트 (특히 EO 1-5 에톡시 술페이트), C1O-C18알킬 알콕시 카르복실레이트 (특히 EO 1-5 에톡시카르복실레이트), C10-Cl8알킬 폴리글리코시드 및 이들의 대응하는 술페이트화 폴리글리코시드, C12-C18a-술폰화 지방산 에스테르, C12-C18알킬 및 알킬 페놀 알콕실레이트 (특히 에톡실레이트 및 복합 에톡시/프로폭시), C12-C18베타인 및 술포베타인 ("술타인"), C10-C18아민 옥시드 등이 포함된다. 알킬 알콕시 술페이트 (AES) 및 알킬 알콕시 카르복실레이트 (AEC) 가 여기에서는 바람직하다. 이러한 계면활성제와 아민 옥시드 및/또는 베타인 또는 술타인 계면활성제를 조합하여 사용하는 것이, 제조자의 목적에 따라 또한 바람직하다. 기타 통상의 유용한 계면활성제가 표준 텍스트에 열거되어 있다. 특히 유용한 계면활성제에는 U.S. Pat. No. 5, 194,639,(cannor 등, 1993.3.16 허여)에 개시된 C1O-Cl8N-메틸 글루카미드가 포함된다.
세제 세정용 조성물에서 유용한 다양한 다른 성분들이, 예컨대, 기타 활성 성분, 담체, 하이드로트로프, 가공보조제, 염료 또는 안료 및 액체 제제용 용매를 포함하는 본 조성물내 포함될 수 있다. 만일 거품성의 추가의 증가가 필요하면,C1O-C16알콜아미드와 같은 거품 부스터(suds buster)를 조성물에 약 1% 내지 약 10% 수준으로 혼입시킬 수 있다. C1O-C14모노에탄올 및 디에탄올 아미드가 이러한 거품 부스터의 통상적인 종류이다. 이러한 거품 부스터와 함께 전술한 아민 옥시드, 베타인 및 술타인과 같은 고 거품성 보조 계면활성제의 사용이 또한 유리하다. 필요하다면, 가용성 마그네슘염, 예컨대, MgCl2, MgSO4등을 통상적으로 약 0.1% 내지 약 2% 의 수준으로 첨가하여 추가의 거품성을 제공할 수 있다.
본원에서 액체 세제 조성물은 담체로서 물 및 다른 용매를 함유할 수 있다. 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 이소프로판올로 대표되는 저분자량의 일차 또는 이차 알콜이 적합하다. 일가 알콜이 계면활성제의 용해를 위해 바람직하지만, 폴리올, 예를 들어 약 2 내지 약 6 개의 탄소 원자 및 약 2 내지 약 6 개의 히드록시기를 포함하는 것 (예컨대, 1,3-프로판디올, 에틸렌 글리콜, 글리세린 및 1,2-프로판디올) 또한 사용될 수 있다. 조성물은 약 5 % 내지 약 90 %, 통상적으로는 약 10 % 내지 약 50 % 의 상기 담체를 함유할 수 있다.
본원의 세제 조성물은 바람직하게는 수성 세정 작업에서 사용되는 동안, 세척수가 약 6.8 내지 약 11 의 pH 를 갖도록 제형화될 것이다. 따라서, 최종 생성물은 통상적으로는 상기 범위로 제형화된다. 권장되는 사용 수준으로 pH 를 조절하는 기술에는, 예컨대, 버퍼, 알칼리 및 산의 사용이 포함된다. 상기 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
본 발명의 경질 표면 세정용 조성물 및 직물 세정용 조성물을 제형화할 경우, 제형자는 약 5 중량% 내지 약 50 중량% 의 수준의 다양한 빌더 (builder)를 사용할 수 있다. 통상적인 빌더에는 1-10 미크론 제올라이트, 폴리카르복실레이트, 예컨대, 시트레이트 및 옥시디숙시네이트, 층화 (layered) 실리케이트, 포스페이트 등이 포함된다. 기타 통상의 빌더들이 표준 규정집에 열거되어 있다.
이와 같이, 제형자는 다양한 부가적 효소, 예를 들어 셀룰라아제, 리파아제, 아밀라아제 및 프로테아제를, 통상적으로는 약 0.001 중량% 내지 약 1 중량% 의 수준으로 상기 조성물에 사용할 수 있다. 다양한 세제 및 직물 케어 효소는 세탁 세제 분야에 널리 공지되어 있다.
다양한 표백 화합물, 예를 들어 퍼카르보네이트, 퍼보레이트 등이 상기 조성물에, 통상적으로는 약 1 중량% 내지 약 15 중량% 의 수준으로 사용될 수 있다. 바람직한 경우, 상기 조성물은 또한 표백 활성제, 예를 들어 테트라아세틸 에틸렌디아민, 노나노일옥시벤젠 술포네이트 등을 함유할 수 있고, 이들 역시 당 분야에 공지되어 있다. 사용 수준은 통상적으로는 약 1 중량% 내지 약 10 중량% 범위이다.
특히 음이온성 올리고에스테르 유형의 오염 방출제, 킬레이트화제, 특히 아미노포스포네이트 및 에틸렌디아민디숙시네이트, 점질토 제거제, 특히 에톡실화 테트라에틸렌 펜타민, 분산제, 특히 폴리아크릴레이트 및 폴리아스파라테이트, 광택제, 특히 음이온성 광택제, 거품 억제제, 특히 실리콘 및 이차 알콜, 직물 유연제, 특히 스멕타이트 점토 등이 모두 상기 조성물에, 약 1 중량% 내지 약 35 중량% 의 범위 수준으로 사용될 수 있다. 표준 규정집 및 공개된 특허에는 상기 통상의 재료의 다수의 상세한 설명이 포함되어 있다.
효소 안정화제가 또한 세정용 조성물에 사용될 수 있다. 이러한 효소 안정화제에는 프로필렌 글리콜 (바람직하게는 약 1 % 내지 약 10 %), 소듐 포르메이트 (바람직하게는 약 0.1 % 내지 약 1 %) 및 칼슘 포르메이트 (바람직하게는 약 0.1 % 내지 약 1 %) 가 포함된다.
본 발명의 변이체는 경질 표면 세정용 조성물에 유용하다. 본원에서 사용되는 "경질 표면 세정용 조성물" 은 경질 표면, 예를 들어 바닥, 벽, 욕실 타일 등을 세정하기 위한 액체 및 과립형 세제 조성물을 의미한다. 본 발명의 경질 표면 세정용 조성물은 하나 이상의 본 발명의 프로테아제 컨쥬게이트의 유효량, 바람직하게는 조성물의 프로테아제 컨쥬게이트의 약 0.001 중량% 내지 약 10 중량%, 더욱 바람직하게는 약 0.01 중량% 내지 약 5 중량%, 더욱 더 바람직하게는 약 0.05 중량% 내지 약 1 중량% 를 함유한다. 하나 이상의 프로테아제 컨쥬게이트를 함유하는 것 외에도, 상기 경질 표면 세정용 조성물은 통상적으로 계면활성제 및 수용성 격리 빌더를 함유한다. 그러나, 분사식 윈도우 클리너와 같이 특정의 구체화된 제품에서는, 유리 표면 상에 막 및/또는 줄무늬의 잔류물을 생성할 수 있으므로 계면활성제가 때때로 사용되지 않는다.
존재할 경우, 계면활성제 성분은 본원에서 조성물의 0.1 % 만큼이 함유될 수 있으나, 통상적으로는 조성물은 약 0.25 % 내지 약 10 %, 더욱 바람직하게는 약 1 % 내지 약 5 % 의 계면활성제를 함유할 것이다.
통상적으로는 조성물은 약 0.5 % 내지 약 50 %, 바람직하게는 약 1 % 내지약 10 % 의 세제 빌더를 함유할 것이다.
바람직하게는, pH 는 약 7 내지 12 의 범위에 있어야 한다. 조정이 요구되는 경우, 통상적인 pH 조정제, 예를 들어 수산화나트륨, 탄산나트륨 또는 염산이 사용될 수 있다.
용매가 조성물에 포함될 수 있다. 유용한 용매에는 글리콜 에테르, 예컨대, 디에틸렌글리콜 모노헥실 에테르, 디에틸렌글리콜 모노부틸 에테르, 에틸렌글리콜 모노부틸 에테르, 에틸렌글리콜 모노헥실 에테르, 프로필렌글리콜 모노부틸 에테르, 디프로필렌글리콜 모노부틸 에테르, 및 디올, 예를 들어 2,2,4-트리메틸-1,3-펜탄디올 및 2-에틸-1,3-헥산디올이 포함되지만, 이에만 국한되는 것은 아니다. 사용될 경우, 상기 용매는 통상적으로는 약 0.5 % 내지 약 15 %, 더욱 바람직하게는 약 3 % 내지 약 11 % 의 수준으로 존재한다.
또한, 조성물을 표면에 "완전 강도" 로 적용한 후 표면을 린스하지 않는 경우, 표면으로부터의 조성물의 더욱 빠른 증발을 촉진하기 위해, 고휘발성 용매, 예를 들어 이소프로판올 또는 에탄올이 본 조성물에 사용될 수 있다. 사용될 경우, 휘발성 용매는 통상적으로 조성물에서 약 2 % 내지 약 12 % 의 수준으로 존재한다.
실시예 7 - 12
액체 경질 표면 세정용 조성물
실시예 7 실시예 8 실시예 9 실시예 10 실시예 11 실시예 12
실시예 3 의 프로테아제 0.05 % 0.50 % 0.02 % 0.03 % 0.30 % 0.05 %
EDTA - - 2.90 % 2.90 % - -
소듐 시트레이트 - - - - 2.90 % 2.90 %
NaC12알킬-벤젠 술포네이트 1.95 % - 1.95 % - 1.95 % -
NaC12알킬술페이트 - 2.20 % - 2.20 % - 2.20 %
NaC12(에톡시)술페이트 - 2.20 % - 2.20 % - 2.20 %
C12디메틸아민 옥시드 - 0.50 % - 0.50 % - 0.50 %
소듐 쿠멘 술포네이트 1.30 % - 1.30 % - 1.30 % -
헥실 카르비톨 6.30 % 6.30 % 6.30 % 6.30 % 6.30 % 6.30 %
물 90.4 % 88.3 % 87.53 % 85.87 % 87.25 % 85.85 %
모든 제형물은 pH 7 로 조정된다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 식기세척 조성물은 본 발명의 하나 이상의 변이체를 함유한다. 본원에서 사용되는 "식기세척 조성물" 은 과립 및 액체 형태를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는, 모든 형태의 식기 세정용 조성물을 의미한다.
실시예 13 - 16
액체 식기 세제
실시예 13 실시예 14 실시예 15 실시예 16
실시예 1 의 프로테아제 0.05 % 0.50 % 0.02 % 0.40 %
C12-C14N-메틸 글루카미드 0.90 % 0.90 % 0.90 % 0.90 %
C12에톡시 (1) 술페이트 12.0 % 12.0 % 12.0 % 12.0 %
2-메틸 운데칸산 4.50 % 4.50 % 4.50 % 4.50 %
C12에톡시 (2) 카르복실레이트 4.50 % 4.50 % 4.50 % 4.50 %
C12알콜 에톡실레이트 (4) 3.00 % 3.00 % 3.00 % 3.00 %
C12아민 옥시드 3.00 % 3.00 % 3.00 % 3.00 %
소듐 쿠멘 술포네이트 2.00 % 2.00 % 2.00 % 2.00 %
에탄올 4.00 % 4.00 % 4.00 % 4.00 %
Mg2+(MgCl2로서) 0.20 % 0.20 % 0.20 % 0.20 %
Ca2+(CaCl2로서) 0.40 % 0.40 % 0.40 % 0.40 %
물 65.45 % 65 % 65.48 % 65.1 %
모든 제형물은 pH 7 로 조정된다.
실시예 17 - 19
액체 직물 세정용 조성물
실시예 17 실시예 18 실시예 19
실시예 4 의 프로테아제 0.05 % 0.03 % 0.30 %
소듐 C12-C14알킬 술페이트 20.0 % 20.0 % 20.0 %
2-부틸 옥탄산 5.0 % 5.0 % 5.0 %
소듐 시트레이트 1.0 % 1.0 % 1.0 %
C10알콜 에톡실레이트 (3) 13.0 % 13.0 % 13.0 %
모노에탄올아민 2.50 % 2.50 % 2.50 %
물/프로필렌 글리콜/에탄올 (100:1:1) 58.45 % 58.47 % 58.20 %
퍼스널 케어 조성물
본 발명의 프로테아제는 특히 퍼스널 케어 조성물, 예를 들어 리브-온 (leave-on) 및 린스-오프 (rinse-off) 헤어 컨디셔너, 샴푸, 리브-온 및 린스-오프 여드름 조성물, 페이셜 밀크 및 컨디셔너, 샤워 젤, 비누, 거품성 및 비-거품성 페이셜 클렌져, 화장품, 손, 페이스, 및 바디 로숀, 보습제, 패치 및 마스크, 리브-온 페이셜 보습제, 화장용 및 클렌징 와이프, 구강 케어 조성물, 생리대 및 콘택트 렌즈 케어 조성물에 사용하기 적합하다. 본 발명의 퍼스널 케어 조성물은 하나 이상의 본 발명의 프로테아제 및 퍼스널 케어 담체를 함유한다.
예시를 위하여, 본 발명의 프로테아제는 하기 참고문헌에 기재된 조성물에 포함되기에 적합하다: 미국 특허 제 5,641,479 호, Linares 등, 1997. 6. 24. 허여 (피부 클렌져); 미국 특허 제 5,599,549 호 Wivell 등, 1997. 2. 4. 허여 (피부 클렌져); 미국 특허 제 5,585,104 호, Ha 등, 1996. 12. 17. 허여 (피부 클렌져); 미국 특허 제 5,540,852 호, Kefauver 등, 1996. 7. 30. 허여 (피부 클렌져); 미국 특허 제 5,510,050 호, Dunbar 등, 1996. 4. 23. 허여 (피부 클렌져); 미국 특허제 5,612,324 호, Guang Lin 등, 1997. 3. 18. 허여 (항-여드름 제제); 미국 특허 제 5,587,176 호, Warren 등, 1996. 12. 24. 허여 (항-여드름 제제); 미국 특허 제 5,549,888 호, Venkateswaran, 1996. 8. 27. 허여 (항-여드름 제제); 미국 특허 제 5,470,884 호, Corless 등, 1995. 11. 28. 허여 (항-여드름 제제); 미국 특허 제 5,650,384 호, Gordon 등, 1997. 7. 22. 허여 (샤워 젤); 미국 특허 제 5,607,678 호, Moore 등, 1997. 3. 4. 허여 (샤워 젤); 미국 특허 제 5,624,666 호, Coffindaffer 등, 1997. 4. 29. 허여 (헤어 컨디셔너 및/또는 샴푸); 미국 특허 제 5,618,524 호, Bolich 등, 1997. 4. 8. 허여 (헤어 컨디셔너 및/또는 샴푸); 미국 특허 제 5,612,301 호, Inman, 1997. 3. 18. 허여 (헤어 컨디셔너 및/또는 샴푸); 미국 특허 제 5,573,709 호, Wells, 1996. 11. 12. 허여 (헤어 컨디셔너 및/또는 샴푸); 미국 특허 제 5,482,703 호, Pings, 1996. 1. 9. 허여 (헤어 컨디셔너 및/또는 샴푸); 미국 특허 제 Re. 34,584 호, Grote 등, 1994. 4. 12. 재허여 (헤어 컨디셔너 및/또는 삼푸); 미국 특허 제 5,641,493 호, Date 등, 1997. 6. 24. 허여 (화장품); 미국 특허 제 5,605,894 호, Blank 등, 1997. 2. 25. 허여 (화장품); 미국 특허 제 5,585,090 호, Yoshioka 등, 1996. 12. 17. 허여 (화장품); 미국 특허 제 4,939,179 호, Cheney 등, 1990. 7. 3. 허여 (손, 얼굴 및/또는 바디 로션); 미국 특허 제 5,607,980 호, McAtee 등, 1997. 3. 4. 허여 (손, 얼굴 및/또는 바디 로션); 미국 특허 제 4,045,364 호, Richter 등, 1977. 8. 30. 허여 (화장용 및 클렌징 와이프); 유럽 특허 출원 EP 0 619 074, Touchet 등, 1994. 10. 12. 공개 (화장용 및 클렌징 와이프); 미국 특허 제 4,975,217 호, Brown-Skrobot 등, 1990.12. 4. 허여 (화장용 및 클렌징 와이프); 미국 특허 제 5,096,700 호, Seibel, 1992. 3. 17. 허여 (구강 세정용 조성물); 미국 특허 제 5,028,414 호, Sampathkumar, 1991. 7. 2. 허여 (구강 세정용 조성물); 미국 특허 제 5,028,415 호, Benedict 등, 1991. 7. 2. 허여 (구강 세정용 조성물); 미국 특허 제 5,028,415 호, Benedict 등, 1991. 7. 2. 허여 (구강 세정용 조성물); 미국 특허 제 4,863,627 호, Davies 등, 1989. 9. 5. (콘택트 렌즈 세정용 용액); 미국 특허 제 Re. 32,672, Huth 등, 1988. 5. 24. 재허여 (콘택트 렌즈 세정용 용액); 및 미국 특허 제 4,609,493 호, Schafer, 1986. 9. 2. 허여 (콘택트 렌즈 세정용 조성물).
본 발명의 구강 세정용 조성물을 추가로 설명하면, 본 발명의 하나 이상의 프로테아제의 약학적으로 허용되는 양이 치아 또는 의치로부터 단백질성 얼룩 제거에 유용한 조성물 내에 함유된다. 본원에서 사용되는 "구강 세정용 조성물" 은 치마분, 치약, 크림 치약, 가루 치약, 구강청결제, 구강용 스프레이, 구강용 젤, 츄잉 검, 약용 박하 드롭스 (lozenge), 구강용 향 (sachet), 정제, 바이오젤, 예방용 페이스트, 치과용 치료 용액 등을 의미한다. 바람직하게는, 구강 세정용 조성물은 조성물의 약 0.0001 중량% 내지 약 20 중량%, 보다 바람직하게는 약 0.001 중량% 내지 약 10 중량%, 보다 더 바람직하게는 약 0.01 중량% 내지 약 5 중량% 의 하나 이상의 본 발명의 프로테아제 및 약학적으로 허용가능한 담체를 함유한다. 본원에서 사용되는 "약학적으로 허용가능한" 은, 부적절한 독성, 비상용성, 불안정성, 과민증, 알러지성 반응 등이 없이 인간 및 하등 동물의 조직에 접촉하여 사용되기에 적합하며, 합리적인 효과/위험 비로 균형잡힌 약물, 의약 또는 불활성 성분을 의미한다.
통상적으로는, 구강 세정용 조성물의 구강 세정 성분들의 약학적으로 허용가능한 구강 세정용 담체 성분은, 일반적으로 조성물의 약 50 중량% 내지 약 99.99 중량%, 바람직하게는 약 65 중량% 내지 약 99.99 중량%, 보다 바람직하게는 약 65 중량% 내지 약 99 중량%로 함유된다.
본 발명의 구강 세정용 조성물에 함유될 수 있는 약학적으로 허용가능한 담체 성분 및 선택적 성분은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 구강 세정용 조성물에 유용한 매우 다양한 조성물 유형, 담체 성분 및 선택적 성분이 상기에 인용된 참고 문헌에 개시되어 있다.
본 발명의 또다른 구현예에서, 구강 외부의 의치 세척을 위한 의치 세정용 조성물은 하나 이상의 본 발명의 프로테아제를 함유한다. 상기 의치 세정용 조성물은 유효량, 바람직하게는 조성물의 약 0.0001 중량% 내지 약 50 중량%, 보다 바람직하게는 약 0.001 중량% 내지 약 35 중량%, 보다 더 바람직하게는 약 0.01 중량% 내지 약 20 중량% 의 하나 이상의 프로테아제 및 의치 세정용 담체를 함유한다. 발포성 정제 등과 같은 다양한 의치 세정용 조성물 포맷이 당 분야에 널리 공지되어 있으며 (미국 특허 제 5,055,305 호, Young 참조), 일반적으로 의치로부터의 단백질성 얼룩 제거를 위한, 하나 이상의 본 발명의 프로테아제의 혼입에 적당하다.
본 발명의 또다른 구현예로서, 콘택트 렌즈 세정용 조성물은 본 발명의 하나이상의 프로테아제를 함유한다. 이러한 콘택트 렌즈 세정용 조성물은 유효량, 바람직하게는 조성물의 약 0.01 중량% 내지 약 50 중량%, 보다 바람직하게는 약 0.01 중량% 내지 약 20 중량%, 보다 더 바람직하게는 약 1 중량% 내지 약 5 중량%의 하나 이상의 프로테아제 및 콘택트 렌즈 세정용 담체를 함유한다. 정제, 액체 등과 같은 다양한 콘택트 렌즈 세정용 조성물 포맷은 당 분야에 널리 공지되어 있으며, 일반적으로 콘택트 렌즈로부터의 단백질성 얼룩 제거를 위한, 본 발명의 하나 이상의 프로테아제의 혼입에 적당하다.
실시예 20 - 23
콘택트 렌즈 세정용 용액
실시예 20 실시예 21 실시예 22 실시예 23
실시예 5 의 프로테아제 0.01% 0.5% 0.1% 2.0%
글루코오스 50.0% 50.0% 50.0% 50.0%
비이온성 계면활성제 (폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체) 2.0% 2.0% 2.0% 2.0%
음이온성 계면활성제 (폴리옥시에틸렌-알킬페닐에테르 소듐 술프릭에스테르) 1.0% 1.0% 1.0% 1.0%
염화나트륨 1.0% 1.0% 1.0% 1.0%
보락스 0.30% 0.30% 0.30% 0.30%
물 45.69% 45.20% 45.60% 43.70%
실시예 24 - 27
바디워시 제품
실시예 24 실시예 25 실시예 26 실시예 27
물 62.62% 65.72% 57.72% 60.72%
디소듐 EDTA 0.2% 0.2% 0.2% 0.2%
글리세린 3.0% 3.0% 3.0% 3.0%
폴리쿼터늄 10 0.4% 0.4% 0.4% 0.4%
소듐 라우레트 술페이트 12.0% 12.0% 12.0% 12.0%
코카미드 MEA 2.8% 2.8% 2.8% 2.8%
소듐 라우라포아세테이트 6.0% 6.0% 6.0% 6.0%
미리스트산 1.6% 1.6% 1.6% 1.6%
마그네슘 술페이트 헵타히드레이트 0.3% 0.3% 0.3% 0.3%
트리히드록시스테아린 0.5% 0.5% 0.5% 0.5%
PEG-6 카프릴산/카프르산 트리글리세리드 3.0% - - -
코토네이트 지방산의 수크로오스 폴리에스테르 3.0% - - -
베헤네이트 지방산의 수크로오스 폴리에스테르 3.0% - 4.0% -
페트롤라툼 - 4.0% 8.0% -
미네랄 오일 - - - 6.0%
DMDM 히단토인 0.08% 0.08% 0.08% 0.08%
실시예 6 의 프로테아제 0.1% 2.0% 2.0% 5.0%
시트르산 1.40% 1.40% 1.40% 1.40%
실시예 28 - 31
세안 제품
실시예 28 실시예 29 실시예 30 실시예 31
물 66.52% 65.17% 68.47% 68.72%
디소듐 EDTA 0.1% 0.1% 0.2% 0.2%
시트르산 - - 1.4% 1.4%
소듐 라우레트-3 술페이트 3.0% 3.5% - -
소듐 라우레트-4 카르복실레이트 3.0% 3.5% - -
라우레트-12 1.0% 1.2% - -
폴리쿼터늄 10 - - 0.4% 0.4%
폴리쿼터늄 25 0.3% 0.3% - -
글리세린 3.0% 3.0% 3.0% 3.0%
소듐 라우로암포아세테이트 - - 6.0% 6.0%
라우르산 6.0% 6.0% 3.0% 3.0%
미리스트산 - - 3.0% 3.0%
마그네슘 술페이트 헵타히드레이트 2.3% 2.0% 2.0% 2.0%
트리에탄올 아민 4.0% 4.0% 4.0% 4.0%
트리히드록시스테아린 0.5% 0.5% 0.5% 0.5%
베헤네이트 지방산의 수크로오스 폴리에스테르 2.0% 2.0% - -
코토네이트 지방산의 수크로오스 폴리에스테르 3.0% 2.0% - -
PEG-6 카프릴산/카프르산트리글리세리드 - - - 2.0%
페트롤라툼 - - 4.0% -
미네랄 오일 - - - 2.0%
코카미도프로필 베타인 2.0% 3.0% 1.8% 1.8%
라우릴 디메틸아민 옥시드 1.0% 1.2% 1.2% 1.2%
덱스 판테놀 1.0% 0.25% 0.25% -
DMDM 히단토인 0.08% 0.08% 0.08% 0.08%
실시예 2 의 프로테아제 1.0% 2.0% 0.5% 0.5%
향료 0.2% 0.2% 0.2% 0.2%
실시예 32 - 33
리브-온 피부 보습용 조성물
실시예 32 실시예 33
글리세린 5.0% -
스테아르산 3.0% -
C11-13이소파라핀 2.0% -
글리콜 스테아레이트 1.5% -
프로필렌 글리콜 - 3.0%
미네랄 오일 1.0% 10.0%
참기름 - 7.0%
페트롤라툼 - 1.8%
트리에탄올아민 0.7% -
세틸 아세테이트 0.65% -
글리세릴 스테아레이트 0.48% 2.0%
TEA 스테아레이트 - 2.5%
세틸 알콜 0.47% -
라놀린 알콜 - 1.8%
DEA-세틸 포스페이트 0.25% -
메틸파라벤 0.2% 0.2%
프로필파라벤 0.12% 0.1%
카르보머 (Carbomer) 934 0.11% -
디소듐 EDTA 0.1% -
실시예 4 의 프로테아제 0.1% 0.5%
물 84.32% 71.1%
실시예 34
세정용 와이프 조성물
프로필렌 글리콜 1.0%
암모늄 라우릴 술페이트 0.6%
숙신산 4.0%
소듐 숙시네이트 3.2%
Triclosan 0.15%
실시예 1 의 프로테아제 0.05%
물 91.0%
상기 조성물은, 셀룰로오스 및/또는 폴리에스테르로 구성되는 흡수용 직포 시트 상에 흡수용 시트의 약 250 중량% 로 함침시킨다.

Claims (12)

  1. 프로테아제의 제 1 잔기의 아미노산과 프로테아제의 제 2 잔기의 아미노산 사이에 결합부분을 포함하는 분자내 가교결합을 포함하는 것을 특징으로 하는 서브틸리신-유사 프로테아제.
  2. 하나 이상의 잔기가 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 영역 내에서 발생하는 프로테아제 :
    (a) 서브틸리신 BPN' 의 위치 1 에 해당하는 아미노 말단 영역;
    (b)서브틸리신 BPN' 의 위치 70-84 에 해당하는 제 1 에피토프 영역;
    (c)서브틸리신 BPN' 의 위치 103-126 에 해당하는 제 2 에피토프 영역;
    (d)서브틸리신 BPN' 의 위치 220-246 에 해당하는 제 3 에피토프 영역;
    (e)서브틸리신 BPN'의 위치 156 - 165, 170, 186, 191 - 196 및 259 - 262 에 해당하는 제 1 클립 부위 영역;
    (f)서브틸리신 BPN'의 위치 12 - 24, 27, 84 - 88, 271 및 274 에 해당하는 제 2 클립 부위 영역;
    (g)서브틸리신 BPN' 의 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 12, 17, 36, 40, 41, 43, 44, 45, 67, 86, 87, 89, 206, 209, 210, 212, 213, 214, 215 및 216 에 해당하는 제 1 인접 에피토프 영역 ;
    (h)서브틸리신 BPN' 의 위치 25, 26, 27, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52,53, 54, 91, 99, 100, 101, 102, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 136, 137, 138, 140, 141, 144 및 145 에 해당하는 제 2 인접 에피토프 영역 ; 및
    (i)서브틸리신 BPN' 의 위치 9, 10, 22, 23, 24, 62, 63, 143, 146, 154, 155, 156, 157, 172, 173, 187, 189, 195, 197, 203, 204, 253, 254, 256, 265, 267, 269, 271, 272 및 275 에 해당하는 제 3 인접 에피토프 영역.
  3. 제 2 항에 있어서, 제 1 인접 에피토프 영역은 서브틸리신 BPN' 의 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 12, 17, 40, 41, 43, 67, 86, 87, 89, 206, 209, 214 및 215 에 해당하고; 제 2 인접 에피토프 영역은 서브틸리신 BPN' 의 위치 27, 47, 48, 50, 52, 102, 127, 128, 130, 131, 132, 134, 138 및 141 에 해당하며; 제 3 인접 에피토프 영역은 서브틸리신 BPN' 의 위치 22, 23, 24, 143, 146, 155, 173, 189, 197, 203, 204, 253, 254, 265 및 275 에 해당하는 프로테아제.
  4. 제 3 항에 있어서, 제 2 클립 부위 영역은 서브틸리신 BPN' 의 위치 13 - 24 에 해당하는 프로테아제.
  5. 제 4 항에 있어서, 제 1 클립 부위 영역은 서브틸리신 BPN' 의 156 - 165, 170, 191 - 195, 261 및 262 에 해당하는 프로테아제.
  6. 제 1 항에 있어서, 제 1 에피토프 영역은 서브틸리신 BPN' 의 위치 75 - 83에 해당하는 프로테아제.
  7. 제 6 항에 있어서, 제 1 잔기의 아미노산은 리신이거나, 제 1 잔기는 서브틸리신 BPN' 의 위치 1 에 해당하고; 제 2 잔기의 아미노산은 시스테인인 프로테아제.
  8. 제 6 항에 있어서, 제 1 및 제 2 잔기가 각기 아미노 말단 영역, 제 1 에피토프 영역, 제 2 에피토프 영역, 제 3 에피토프 영역, 제 1 클립 부위 영역, 제 2 클립 부위 영역, 제 1 인접 에피토프 영역, 제 2 인접 에피토프 영역 및 제 3 인접 에피토프 영역으로 이루어진 군에서 선택된 영역내에서 발생하는 프로테아제.
  9. 제 8 항에 있어서, 제 1 잔기는 서브틸리신 BPN' 의 위치 1 에 해당하고, 제 2 잔기는 제 1 에피토프 영역, 제 2 에피토프 영역, 제 3 에피토프 영역, 제 1 클립 부위 영역, 제 2 클립 부위 영역, 제 1 인접 에피토프 영역, 제 2 인접 에피토프 영역 및 제 3 인접 에피토프 영역으로 구성된 군에서 선택된 영역내에서 발생하는 프로테아제.
  10. 제 9 항에 있어서, 연결 부분이 알킬 숙신이미드를 포함하고; 제 2 잔기는 제 1 에피토프 영역 내에서 발생하며; 제 2 잔기는 서브틸리신 BPN' 의 위치 78 에 해당하는 프로테아제.
  11. 제 1 항의 프로테아제 및 세정용 조성물 담체를 포함하는 세정용 조성물.
  12. 제 1 항의 프로테아제 및 퍼스날 케어 담체를 포함하는 퍼스날 케어 조성물.
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