CZ2002210A3 - Proteasa podobající se subtilisinu obsahující intramolekulární zesí»ování a její pouľití - Google Patents
Proteasa podobající se subtilisinu obsahující intramolekulární zesí»ování a její pouľití Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2002210A3 CZ2002210A3 CZ2002210A CZ2002210A CZ2002210A3 CZ 2002210 A3 CZ2002210 A3 CZ 2002210A3 CZ 2002210 A CZ2002210 A CZ 2002210A CZ 2002210 A CZ2002210 A CZ 2002210A CZ 2002210 A3 CZ2002210 A3 CZ 2002210A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- protease
- region
- epitope
- residue
- subtilisin bpn
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
- C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Cosmetics (AREA)
Description
Proteasa podobající se subtilisinu obsahující intramolekulámí zesíťování a její použití
Oblast techniky
Předložený vynález se týká proteasy podobající se subtilisinu, která obsahuje intramolekulámí zesíťování. Tyto proteasy jsou vhodné pro použití v čistícím prostředku a prostředku pro osobní péči.
Dosavadní stav techniky
Enzymy představují největší skupinu přirozeně se vyskytujících proteinů. Mezi jednu skupinu enzymů patří proteasy, které katalyzují hydrolýzu jiných proteinů. Tato schopnost hydrolyzovat proteiny je typicky využita zahrnutím přirozeně se vyskytujících a geneticky sestavených proteas do čistících prostředků, zvláště těch, které jsou vhodné pro prací aplikace.
V oblasti čištění jsou nejvíce používanými proteasami serinové proteasy. Většina z těchto serinových proteas je vyráběna bakteriálními organismy, při čemž některé jsou vyráběny jinými organismy, jako jsou houby. Viz Siezen a spol.: Homology Modelling and Protein Engineering Stratégy of Subtilases, the Family of Subtilisin-Like Serine Proteases, Protein Engineering 1991, 4(7), strana 719 až 737. Naneštěstí účinnost přírodních proteas v jejich přirozeném prostředí není často optimální v umělém prostředí čistícího prostředku. Konkrétně - takové vlastnosti proteas, jako je například tepelná stabilita, stabilita při pH, oxidační stabilita a substrátová specifičnost, nejsou nutně optimalizovány pro použití mimo přirozené prostředí proteasy.
Pro změnu přírodní aminokyselinové sekvence serinových proteas bylo použito několik přístupů. Cílem bylo zvýšení účinnosti proteas v nepřirozeném pracím prostředí. Mezi tyto přístupy patří genetické navržení proteasy a/nebo chemická modifikace proteasy kvůli zvýšení tepelné stability a zlepšení stability vůči oxidaci za zcela odlišných podmínek.
cs '
Jelikož však takto modifikované proteasy jsou pro savce cizí, jsou potenciálními antigeny. Jako antigeny tyto proteasy způsobují imunologickou a/nebo alergenní odpověď (zde souhrnně popisovány jako imunogenní odpověď) u savců.
Dále - i když genetický návrh a chemická modifikace proteas byly nejdůležitější v pokračujícím hledání účinnějších proteas pro prací aplikace, tyto proteasy nebyly komerčně využívány v prostředcích osobní péče a v nízkoúčinných detergentních prostředcích. Primárním důvodem nepřítomnosti těchto proteas v produktech jako například v mýdlech, gelech, tělových kapalinách, šamponech a nízkoúčinných detergentech pro mytí nádobí, je citlivost člověka, která vede k nežádoucím imunogenním odpovědím. Bylo by tedy vysoce výhodné získat prostředek pro osobní péči nebo nízkoúčinné detergentní činidlo, které by poskytovalo čistící vlastnosti proteas bez vyvolání imunogenní odpovědi.
V současné době se imunogenní odpověď na proteasy může minimalizovat imobilizováním, granulací, potažením nebo rozpuštěním chemicky modifikovaných proteas, čímž se lze vyhnout tomu, že u nich dochází k přenosu vzduchem. Tyto způsoby, i když je zákazník vystaven působení proteas přenášejících se vzduchem, stále ještě nesou rizika související s prodlouženým kontaktem tkáně s konečným prostředkem.
Bylo také navrženo, aby snížení imunogenicity proteasy bylo dosaženo připojením polymerů k protease. Viz např. USA patent č. 4 179337, Davis a spol., vydán 18. prosince 1979, USA patent č. 5 856 451, Olsen a spol., Novo Nordisk, vydán 5. ledna 1999, spis WO 99/00489, Olsen a spol., Novo Nordisk, publikován 7. ledna 1999, spis WO 98/30682, Olsen a spol., Novo Nordisk, publikován 16. července 1998, a spis WO 98/36026, Von der Osten a spol., publikován 13. srpna 1998. Tyto návrtiy však nenavrhovaly důležitost připojení polymerů na příslušné aminokyselinové oblasti, aby se nejúčinněji snížila imunogenní odpověď.
• 4 • 4 • 4 ·
Autoři předloženého vynálezu překvapivě objevili, že intramolekulámím zesíťováním proteasy se sníží imunogenicita proteasy. Dále bylo objeveno, že tyto intramolekulámě zesíťované proteasy si uchovávají aktivitu příslušné rodičovské proteasy. Navíc autoři přeloženého vynálezu objevili definované zbytky v protease, které jsou nejvýhodnější pro účast při zesíťování díky například sterickému umístění na epitopových oblastech (tj. místech proteasy, která jsou zodpovědná za imunitní odpověď) nebo místech štěpení (tj. místech proteasy, kde dochází k hydrolýze in vivo) proteasy.
Autoři předloženého vynálezu tedy objevili subtilisinové proteasy, které vyvolávají sníženou imunogenní odpověď i když si uchovávají svoji aktivitu jako účinná a aktivní proteasa. Předložené proteasy jsou tedy vhodné pro použití v několika typech prostředků, mezi něž patří, ale bez omezení na ně, prací prostředky, prostředky pro mytí nádobí a ošetřování tvrdých povrchů, prostředky péče o kůži, péče o vlasy, péče o krásu, péče o ústní dutinu a prostředky pro kontaktní čočky.
Podstata vynálezu
Předložený vynález se týká subtilisinových proteas, které obsahují intramolekulámí zesíťování, při čemž toto intramolekulámí zesíťování obsahuje kovalentní vazbu mezi aminokyselinou prvního zbytku proteasy a aminokyselinou druhého zbytku proteasy.
Protesy prodle předloženého vynálezu mají sníženou imunogenicitu vzhledem k rodičovské protease. Takové proteasy jsou tedy vhodné pro použití v několika typech prostředků, mezi něž patří, ale bez omezení na ně, prací prostředky, prostředky pro mytí nádobí, prostředky pro tvrdé povrchy, prostředky péče o kůži, péče o vlasy, péče o krásu, péče o ústní dutinu a prostředky pro kontaktní čočky.
V následující části spisu je vynález popsán podrobně.
• ·
Podstatné složky předloženého vynálezu jsou zde popsány níže. Zahrnuty jsou zde také neomezující popisy různých případných a výhodných složek užitečných v provedeních podle předloženého vynálezu.
Předložený vynález může obsahovat, sestávat z nebo sestávat v podstatě z jakýchkoliv požadovaných nebo případných složek a/nebo omezeních zde popsaných.
Všechna procenta a poměry jsou vypočtena jako hmotnostní, pokud není jinak uvedeno. Všechna procenta jsou vypočtena vzhledem k celému prostředku, pokud není jinak uvedeno.
Množství všech složek nebo prostředků jsou uváděna jako aktivní množství takové složky nebo prostředku a jsou uváděna bez nečistot, například zbylých rozpouštědel nebo vedlejších produktů, které mohou být přítomny v komerčně dostupných zdrojích.
Všechny dokumenty, na které je zde odkazováno, včetně všech patentů, patentových přihlášek a publikací, jsou zde celé zahrnuty jako odkazy.
Ve spisu je odkazováno na obchodní názvy pro materiály včetně enzymů, ale bez omezení na ně. Autoři tohoto vynálezu nezamýšlejí být omezeni materiály pod jistým obchodním názvem. Pro proteasy a prostředky podle předloženého vynálezu lze použít ekvivalentní materiály (např. ty, které jsou získány z různých zdrojů pod různými názvy nebo čísly katalogu) vedle těch, na které je zde odkazováno obchodním názvem.
Jak se zde dále používá, pro popis aminokyselin budou používány zkratky. Tabulka I ukazuje seznam zkratek, které jsou zde používány.
Tabulka I
| aminokyselina | třípísmenková zkratka | jednopísmenková zkratka |
| alanin | Ala | A |
| arginin | Arg | R |
| asparagin | Asn | N |
| kyselina aspartová | Asp | D |
| cystein | Cys | C |
| glutamin | Gin | Q |
| kyselina glutamová | Glu | E |
| glycin | Gly | G |
| histidin | His | H |
| isoleucin | fle | 1 |
| leucin | Leu | L |
| lysin | Lys | K |
| methionin | Met | M |
| fenylalanin | Phe | F |
| prolin | Pro | P |
| serin | Ser | S |
| threonin | Thr | T |
| tryptofan | Trp | W |
| tyrosin | Tyr | Y |
| valin | Val | V |
V následující části popisu jsou vysvětleny některé definice.
Pojem mutace, jak se zde používá, označuje změnu genové sekvence a/ne bo aminokyselinové sekvence produkované těmito genovými sekvencemi. Mezi muta
ce patří delece, substituce a adice aminokyselinových zbytků k sekvenci přírodního proteinu.
Pojem rodičovský, jak je zde používán, znamená protein (přírodní nebo variantu), který se používá pro další modifikaci za vzniku konjugátu proteasy podle vynálezu.
Pojem přírodní, jak je zde používán, označuje protein, například proteasu nebo jiný enzym, produkovaný nemutovanými organismy.
Pojem varianta, jak se zde používá, znamená protein, který má aminokyselinovou sekvenci, která se odlišuje od odpovídajícího přírodního proteinu.
Všechny molekulové hmotnosti polymerů, jak se zde používají, jsou vyjádřeny jako vážený průměr molekulových hmotností.
I když intramolekulámě zesíťované proteasy podle předloženého vynálezu nejsou omezeny na ty, které obsahují subtilisin BPN' a jeho varianty, číslování všech aminokyselin, jak se zde používá, je odkazováno na aminokyselinovou sekvenci subtilisinu BPN', která je representována sekv. id. č. 1.
| Ala 1 | Gin | Ser | Val | Pro 5 | Tyr | Gly | Val |
| His | Ser | Gin | Gly 20 | Tyr | Thr | Gly | Ser |
| Ser | Gly | Ile 35 | Asp | Ser | Ser | His | Pro 40 |
| Ser | Met 50 | Val | Pro | Ser | Glu | Thr 55 | Asn |
| Gly 65 | Thr | His | Val | Ala | Gly 70 | Thr | Val |
| Val | Leu | Gly | Val | Ala 85 | Pro | Ser | Ala |
| Gly | Ala | Asp | Gly | Ser | Gly | Gin | Tyr |
| Ser | Gin 10 | Ile | Lys | Ala | Pro | Ala 15 | Leu |
| Asn 25 | Val | Lys | Val | Ala | Val 30 | Ile | Asp |
| Asp | Leu | Lys | Val | Ala 45 | Gly | Gly | Ala |
| Pro | Phe | Gin | Asp 60 | Asn | Asn | Ser | His |
| Ala | Ala | Leu 75 | Asn | Asn | Ser | Ile | Gly 80 |
| Ser | Leu 90 | Tyr | Ala | Val | Lys | Val 95 | Leu |
| Ser 105 | Trp | Ile | Ile | Asn | Gly 110 | Ile | Glu |
100
| Trp | Ala | Xle 115 | Ala | Asn | Asn | Met | Asp 120 | Val | Ile | Asn | Met | Ser 125 | Leu | Gly Gly | |
| Pro | Ser 130 | Gly | Ser | Ala | Ala | Leu 135 | Lys | Ala | Ala | Val | Asp 140 | Lys | Ala | Val | Ala |
| Ser 145 | Gly | Val | Val | Val | Val 150 | Ala | Ala | Ala | Gly | Asn 155 | Glu | Gly | Thr | Ser | Gly 160 |
| Ser | Ser | Ser | Thr | Val 165 | Gly | Tyr | Pro | Gly | Lys 170 | Tyr | Pro | Ser | Val | Ile 175 | Ala |
| Val | Gly | Ala | Val 180 | Asp | Ser | Ser | Asn | Gin 185 | Arg | Ala | Ser | Phe | Ser 190 | Ser | Val |
| Gly | Pro | Glu 195 | Leu | Asp | Val | Met | Ala 200 | Pro | Gly | Val | Ser | Ile 205 | Gin | Ser | Thr |
| Leu | Pro 210 | Gly | Asn | Lys | Tyr | Gly 215 | Ala | Tyr | Asn | Gly | Thr 220 | Ser | Met | Ala | Ser |
| Pro 225 | His | Val | Ala | Gly | Ala 230 | Ala | Ala | Leu | Ile | Leu 235 | Ser | Lys | His | Pro | Asn 240 |
| Trp | Thr | Asn | Thr | Gin 245 | Val | Arg | Ser | Ser | Leu 250 | Glu | Asn | Thr | Thr | Thr 255 | Lys |
| Leu | Gly | Asp | Ser 260 | Phe | Tyr | Tyr | Gly | Lys 265 | Gly | Leu | Ile | Asn | Val 270 | Gin | Ala |
Ala Ala Gin 275
Aminokyselinová sekvence subtilisinu BPN' je dále popsána Wellsem a spol.: Nucleic Acids Research 1983, //, 7911 až 7925.
Když je pro definování oblasti zbytků aminokyselin použita pomlčka, jak se zde používá, je to míněno tak, že tato oblast znamená oblast včetně vyjmenovaných zbytků a každého zbytku vyskytujícího se mezi vyjmenovanými zbytky. Například oblast 70 až 84 je míněna tak, že zahrnuje aminokyselinové zbytky 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 a 84.
Intramolekulámě zesíťované proteasy podle předloženého vynálezu: Předložený vynález se týká subtilisinových proteas, které obsahují intramolekulámí zesí·« ·· ·· ··
ťování, při čemž intramolekulámí zesíťování obsahuje kovalentní vazbu mezi aminokyselinou prvního zbytku proteasy a aminokyselinou druhého zbytku proteasy. Bez ohledu na teorii se předpokládá, že výsledné zesíťování snižuje rychlost degradace endosomálních kompartmentů buněk presentujících antigen (tj. zvyšuje stabilitu), což dále překáží presentaci epitopů proteasy.
Proteasy, které mohou být intramolekulámě zesíťovány podle předloženého vynálezu, znamenají proteasy podobající se subtilisinu, buď přírodního typu nebo jeho varianty. Pojem proteasa podobající se subtilisinu, jak je zde používán, znamená proteasu, která má alespoň 50%, s výhodou 80% identitu aminokyselinové sekvence se sekvencemi subtilisinu BPN'. Přírodní proteasy podobající se subtilisinu jsou produkovány například mikroorganismy Bacillus alcalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus amylosaccharícus, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus a Bacillus subtilis. Diskusi týkající se setinových proteas podobajících se subtilisinu a jejich homologů lze nalézt v Siezen a spol.: Homologe Modelling and Protein Engineering Stratégy of Subtilases, the Family of Subtilisin-Like Serine Proteases, Protein Engineering 1991, 4(7), 719 až 737.
Mezi výhodné proteasy, které mohou být intramolekulámě zesíťovány podle předloženého vynálezu, patří například ty, které jsou získány z Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis a Bacillus subtilis, subtilisin BPN, subtilisin BPN', subtilisin Carisberg, subtilisin DY, subtilisin 309, proteinasa K a thermitasa včetně A/C Alcalase(R) (komerčně dostupná od Novo Industries, Kodaň, Dánsko), Esperase(R) (Novo Industries), Savinase(R) (Novo Industries), Maxatase(R) (komerčně dostupná od Genencor International lne.), Maxacal(R) (Genencor International lne.), Maxapem 15(R) (Genencor International lne.) a varianty předcházejících proteas. Zvláště výhodné proteasy, které mohou být intramolekulámě zesíťovány podle předloženého vynálezu, jsou ty, které jsou získány z Bacillus amyloliquefaciens a jejich varianty. Nejvýhodnějšími proteasami podle předloženého vynálezu jsou subtilisin BPN' a jeho varianty.
Zvláště výhodné varianty subtilisinu BPN', zde dále označované jako Protease A, pro použití podle předloženého vynálezu jsou popsány v USA patentu č. 5 030 378, Venegas, vydaném 9. července 1991, které se vyznačují aminokyselinovou sekvencí subtilisinu BPN' s následujícími mutacemi:
a) Gly v poloze 166 je substituován aminokyselinovým zbytkem vybraným z Asn, Ser, Lys, Arg, His, Gin, Ala a Glu; Gly v poloze 169 je substituován Ser a Met v poloze 222 je substituován aminokyselinovým zbytkem vybraným z Gin, Phe, His, Asn, Glu, Ala a Thr, nebo
b) Gly v poloze 160 je substituován Ala a Met v poloze 222 je substituován Ala.
Další výhodné varianty subtilisinu BPN', zde dále označované jako Protease B, pro použití pň intramolekulámím zesíťování podle předloženého vynálezu jsou popsány v evropském patentu č. 251 446, Genencor International, lne., publikovaném 7. ledna 1988, které se vyznačují aminokyselinovou sekvencí přírodního subtilisu BPN' s mutacemi v jedné nebo více z následujících poloh: Tyr21, Thr22, Ser24, Asp36, Ala45, Ala48, Ser49, Met50, His67, Ser87, Lys94, Val95, Gly97, Ser101, Gly102, Gly103, lle107, Gly110, Metl24, Gly127, Gly128, Pro129, Leu135, Lys170, TyR171, Pro172, Asp197, Met199, Ser204, Lys213, Tyr214, Gly215 a Ser221, nebo dvě nebo více ze shora uvedených poloh kombinovaných s jednou nebo více mutacemi v polohách vybraných z Asp32, Ser33, Tyr104, Ala152, Asn155, Glu156, Gly166, Gly169, Phe189, Tyr217 a Met222.
Další výhodné varianty subtilisinu BPN' pro použití při intramolekulámím zesíťování podle předloženého vynálezu, které jsou zde dále označovány jako Protease C a jsou popsány ve spisu WO 95/10615, Genencor International, lne., publikovaném 20. dubna 1995, se vyznačují aminokyselinovou sekvencí přírodního subtilisinu BPN' s mutací v poloze Asn76 v kombinaci s mutacemi v jedné nebo více z dalších poloh vybraných z Asp99, Ser101, Gln103, Tyr104, Ser105, Ile107, Asn109, Asn123, Leu126, Gly127, Gly128, Leu135, Glu156, Gly166, Glu195, Asp197, • * · · · · ·· ···· ·· ····
Ser204, Gln206, Pro210, Ala216, Tyr217, Asn218, Met222, Ser260, Lys265 a Ala274.
Další výhodné varianty subtilisinu BPN' pro použití při intramolekulámím zesíťování podle předloženého vynálezu jsou zde dále označovány jako Protease D a jsou popsány v USA patentu č. 4 760 025, Estell a spoL, vydaném 26. července 1988, a vyznačují se aminokyselinovou skevencí přírodního subtilisinu BPN' s mutacemi v jedné nebo více z poloh vybraných ze skupiny sestávající z Asp32, Ser33, His64, Tyr104, Asp155, Glu156, Gly166, Gly169, Phe189, Tyr217 a Met222.
Výhodnější proteasy, které mohou být intramolekulámě zesíťovány, jsou vybrány ze skupiny sestávající ze subtilisinu BPN', Protease A, Protease B, Protesase C a Protease D s tím, že nejvýhodnější je Protease D.
Intramolekulámě zesíťované proteasy podle předloženého vynálezu obsahují kovalentní vazbu mezi dvěma aminokyselinami předcházející proteasy. Tyto aminokyseliny jsou zde nezávisle označovány jako aminokyselina prvního zbytku a aminokyselina druhého zbytku. Pojmy první zbytek a druhý zbytek, jak jsou zde používány, by neměly být konstruovány tak, že se týkají polohy 1 a polohy 2 odpovídajících subtilisinu BPN'. Spíše se tyto pojmy používají jednoduše pro objasnění vztahu k jednomu zbytku nebo k jinému. Například první zbytek může odpovídat poloze 27 subtilisinu BPN' a druhý zbytek může odpovídat poloze 118 subtilisinu BPN'. Ovšem, že je možné v rozsahu předloženého vynálezu to, že první zbytek odpovídá poloze 1 subtilisinu BPN' nebo že druhý zbytek odpovídá poloze 2 subtilisinu BPN’.
Dále pak použití pojmu odpovídající poloze, s ohledem na příslušnou polohu odpovídající subtilisinu BPN', by nemělo být zkonstruováno jako vyžadující aminokyselinu, která se v této poloze přirozeně vyskytuje. Spíše je tento výraz zamýšlen tak, že označuje číslo polohy než příslušný aminokyselinový zbytek, který se v této poloze vyskytuje. A skutečně, v souladu podle předloženého vynálezu cystein (který se • 4 · * • ·· • · · « » · ·
44· *· • 4 ··
4 · · • · ·
4 · · · • 4 4444
4* ·
4 · • 44 4 • 4 4 •4 4444 přirozeně nevyskytuje v subtilisinu BPN') je vysoce výhodným aminokyselinovým zbytkem prvního zbytku nebo druhého zbytku.
Podle předloženého vynálezu intramolekulámí zesíťování subtilisinové proteasy obsahuje kovalentní vazbu mezi aminokyselinou prvního zbytku proteasy a aminokyselinou druhého zbytku proteasy. Tato kovalentní vazba obsahuje vazebnou část, která tvoří můstek mezi prvním zbytkem a druhým zbytkem. Vazebná část může znamenat jakýkoliv strukturní mechanismus, kterým může být první zbytek kovalentně spojen můstkem s druhým zbytkem (napojen). Vazebná skupina, jak se zde používá, však neznamená jednoduše kovalentní vazbu jako takovou, která tvoří například pouhý disulfidový můstek. Bez ohledu na teorii autoři předloženého vynálezu objevili, že takové disulfidové můstky nejsou účinné při získání intramolekulámě zesíťované proteasy, která má sníženou imunogenicitu vzhledem k rodičovské sloučenině.
Vazebná část může například znamenat jakoukoliv malou molekulu, tj. molekulu, která má molekulovou hmotnost menší než asi 1600, s výhodou menší než asi 800, výhodněji menší než asi 400 a nejvýhodněji menší než asi 300.
Mezi nejvýhodnější vazebné části patří ty, které jsou schopny být kovalentně navázány na jeden nebo více cysteinových zbytků, lysinové zbytky a/nebo aminové konce proteasy. Například ve výhodném provedení podle předloženého vynálezu aminokyselina prvního zbytku obsahuje aminovou skupinu (např. jako neomezující příklady aminokyselina prvního zbytku znamená lysin (buď přirozeně se vyskytující nebo mutaci) nebo aminokyselina prvního zbytku znamená aminový konec proteasy). Dále pak v tomto výhodném provedení aminokyselina druhého zbytku obsahuje thiolovou skupinu, např. jako neomezující příklad aminokyselina druhého zbytku znamená cystein (buď přirozeně se vyskytující nebo mutaci). Například k vytvoření kovalentní vazby intramolekulámě zesíťovaných proteas podle předloženého vynálezu se mohou používat následující neomezující reakční činidla: N-[alfa-maleimidoacetoxyjsukcinimidový ester, N-5-azido-2-nitrobenzoyloxysukcinimid, bismaleimidohexan, N-[beta-maleimidopropyloxy]sukcinimidový ester, bis[2-(sukcinimidyloxykarbonyloxy)12
-ethyljsulfon, bis[sulfosukcinimidyl]suberát, 1,5-difluor-2,4-dinitrobenzen, dimethyladipimát.2 HCI, dimethylpimelimidát.2 HCI, dimethylsuberimidát.2 HCI, disukcinimidyl-glutarát, disukcinimidyl-suberát, 2-maleimidobenzoyl-N-hydroxysukcinimidový ester, N-hydroxysukcinimidyl-4-azidosalicylová kyselina, N-sukcinimidyl-6-[4'-azido-2'-nitrofenylaminojhexanoát, N-hydroxysukcinimidyl-2,3-dibrompropionát, sukcinimidyl-4-[N-maleimidomethyl]cyklohexan-1-karboxylat, sukcinimidyl-4-(4-maleimidofenyl)-butyrát, sukcinimidyl-6-[(beta-maleimidopropionamido)hexanoát], bis[2-(sulfosukcinimidyloxykarbonyloxy)-ethyl]sulfon, N-[gama-maleimidobutyryloxy]sulfosukcinimidový ester, N-hydroxysulfosukcinimidyl-4-azidobenzoát, N-[kapa-maleimidoundekanoyloxy]sulfosukcinimidový ester, 3-maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosukcinimidový ester, sulfosukcinimidyl[4-azidosalicylamido]hexanoát, sulfosukcinimidyl-7-azido-4-methylkumarin-3-acetát, sulfosukcinimidyl-6-[4'-azido-2'-nitrofenylamino]hexanoát, sulfosukcinimidyl-4-[4-azidofenyl]butyrát, sulfosukcinimidyl[4-jodacetyl]aminobenzoát, sulfosukcinimidyl-4-[N-maleimidomethyl]cyklohexan-1 -karboxylat a sulfosukcinimidyl-4-(4-maleimidofenyl)-butyrát. Každé z těchto reakčních činidel je komerčně dostupné od Pierce Chemical Co., Rockford, II. Neomezující příklady přípravy předložených intramolekulámě zesilovaných proteas používajících podobná reakční činidla je zde dále níže uveden.
Další příklady zesíťujících částic a související chemie jsou popsány v USA patentu č. 5 446 090, Harris, vydaném 29. srpna 1995, v USA patentu č. 5 171 264, Merril, vydaném 15. prosince 1992, v USA patentu č. 5162 430, Rhee a spol., vydaném 10. listopadu 1992, v USA patentu č. 5 153 265, Shadle a spol., vydaném 6. října 1992, v USA patentu č. 5 122 614, Zalipsky, vydaném 16. června 1992, v práci Goodson a spol.: Site-Directed Pegylation of Recombinant lnterleukin-2 at its Glycosylation Site, Biotechnology 1990, 8(4), 343 až 346, Kogan: The Synthesis of Substituted Methoxy-Poly(ethylen glycol) Derivatives Suitable for Selective Protein Modification, Synthetic Communications 1992, 22, 2417 až 2424; a Ishii a spol.: Effects of the State of the Succinimido-Ring on the Fluorescence and Structural Properties of Pyrene Maleimide-Labeled αα-Tropomyosin, Biophysical Journal 1986, ·· · · ·· · · • ·· · · · · · • · · · · ·
50, 75 až 80. Nejvýhodnější vazebnou částí je substituovaný (například alkylem) nebo nesubstituovaný sukcinimid.
Ve výhodném provedení předloženého vynálezu aminokyselina prvního zbytku obsahuje aminovou skupinu (např. jako neomezující příklady, aminokyselina prvního zbytku znamená lysin (buď přirozeně se vyskytující nebo mutaci) nebo aminokyselina prvního zbytku obsahuje aminový konec proteasy). Je proto výhodné mutovat lysinové zbytky, které se vyskytují v jiných polohách než první a druhý zbytek, na jeden nebo více jiných aminokyselinových zbytků tak, že zesíťování lysinového zbytku např. v prvním zbytku je selektivní. Například lysinový zbytek se vyskytuje v poloze 43 subtilisinu BPN', který je v oblasti první blízkého epitopu, jak je zde definováno. Může se provést místně selektivní mutace všech ostatních lysinových zbytků vyskytujících se v protease následovaná selektivním zesíťováním lysinového zbytku v poloze 43 druhého zbytku. Také se může přirozeně se vyskytující aminokyselina prvního zbytku mutovat na lysin (například) a následující místně selektivní mutací všech ostatních lysinových zbytků vyskytujících se v protease a selektivním zesíťováním lysinového zbytku na druhý zbytek.
V tomto stejném výhodném provedení je výhodné, aby aminokyselina druhého zbytku obsahovala thiolovou skupinu, např. jako neomezující příklad aminokyselina druhého zbytku znamená cystein (buď přirozeně se vyskytující nebo mutaci). V tomto příkladu, v němž se cysteinový zbytek vyskytuje v. jiné poloze než ve druhém zbytku, je výhodné substituovat jiný aminokyselinový zbytek za cystein v každé z oněch poloh, aby se umožnilo selektivní zesíťování mezi prvním zbytkem a druhým zbytkem.
V jiném výhodném provedení podle předloženého vynálezu jak aminokyselina prvního zbytku tak aminokyselina druhého zbytku obsahuje thiolovou skupinu. Jak neomezující příklad - aminokyselina prvního zbytku znamená cystein (buď přirozeně se vyskytující nebo mutaci) a aminokyselina druhého zbytku znamená cystein (buď přirozeně se vyskytující nebo mutaci). V tomto příkladu, když se cysteinový zbytek vyskytuje v jiné poloze než první a druhý zbytek, je výhodné substituovat jiný • ·
aminokyselinový zbytek za cystein v každé z oněch poloh, aby se umožnilo selektivní zesíťování mezi prvním a druhým zbytkem.
V dalším výhodném provedení podle předloženého vynálezu jak aminokyselina prvního tak druhého zbytku obsahuje aminovou skupinu. Jako neomezující příklad - aminokyselina prvního zbytku může znamenat lysin nebo aminový konec (buď přirozeně se vyskytující nebo mutaci) a aminokyselina druhého zbytku znamená lysin (buď přirozeně se vyskytující nebo mutaci). V tomto příkladu, když se lysinový zbytek vyskytuje v jiné poloze než první a druhý zbytek, je výhodné substituovat jiný aminokyselinový zbytek za lysin v každé z oněch poloh, aby se umožnilo selektivní zesíťování mezi prvním a druhým zbytkem.
Ve výhodném provedení předloženého vynálezu tedy aminokyselina prvního zbytku znamená lysin nebo obsahuje aminový konec a aminokyselina druhého zbytku znamená cystein. V jiném výhodném provedení podle předloženého vynálezu aminokyselina prvního zbytku znamená cystein a aminokyselina druhého zbytku znamená cystein. V dalším výhodném provedení podle předloženého vynálezu aminokyselina prvního zbytku znamená lysin nebo obsahuje aminový konec a aminokyselina druhého zbytku znamená lysin.
Ve výhodném provedení předloženého vynálezu alespň jeden zbytek, první nebo druhý zbytek, se vyskytuje v definované oblasti. Bylo objeveno, že subtilisinová proteasa obsahuje tři epitopové oblasti. Bez ohledu na teorii se tedy předpokládá, že zbytek jedné nebo více oblastí těchto epitopů se účastní zesíťování, imunogenicita je snížena, protože presentace epitopu je zhoršena. Například jestliže zbytek jedné nebo více oblastí epitopů je zesíťován s jiným zbytkem proteasy, budou před presentací epitopu vyžadována násobná štěpení proteasy. Bylo objeveno, že oblast prvního epitopu odpovídá polohám 70 až 84 subtilisinu BPN', oblast druhého epitopu odpovídá polohám 103 až 126 subtilisinu BPN' a oblast třetího epitopu odpovídá polohám 220 až 246 subtilisinu BPN'. Viz např. USA patentová přihláška č. 09/088 912, Weisgerbera spol., The Procter & Gamble Co., podaná 2. června 1998, doprovázející ··
provizorní USA patentová přihláška č. 60/144 991, Rubingh a spol.: Serine Protease Variant Having Amino Acid Susbtitutions and Deletions in Epitope Regions, podaná 22. čevence 1999, a doprovázející USA provizorní patentová přihláška č. 60/144 980, Sikorski a spol.: Serine Protease Variants Having Amino Acid Substitutions in Epitope Regions, podaná 22. července 1999.
Dále bylo objeveno, že některé zbytky proteasy jsou v těsné blízkosti epitopových oblastí proteasy. Autoři předloženého vynálezu objevili, že zbytky první, druhé a třetí oblasti blízkého epitopu jsou v těsné blízkosti k oblastem prvního, druhého a třetího epitopu. Bez ohledu na teorii se tedy předpokládá, že když se zbytky jedné nebo více, první, druhé nebo třetí, oblasti blízkého epitopu účastní zesíťování, imunogenicita je snížena díky tomu, že presentace epitopu je zhoršena. Bylo objeveno, že oblast prvního blízkého epitopu odpovídá polohám 2, 3, 4, 5, 6, 7, 12, 17, 36, 40, 41, 43, 44, 45, 67, 86, 87, 89, 206, 209, 210, 212, 213, 214, 215 a 216 subtilisinu BPN', oblast druhého blízkého epitopu odpovídá polohám 25, 26, 27, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 91, 99, 100, 101, 102, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 136, 137, 138, 140, 141, 144 a 145 subtilisinu BPN', a oblast třetího blízkého epitopu odpovídá polohám 9, 10, 22, 23, 24, 62, 63, 143, 146, 154, 155, 156, 157, 172, 173, 187, 189, 195, 197, 203, 204, 253, 254, 256, 265, 267, 269, 271, 272 a 275 subtilisinu BPN'. Viz například USA provizorní patentová přihláška č. 60/144 979, Rubingh a spol.: Protease Conjugates Having Sterically Protected Epitope Regions, podaná 22. července 1999.
Dále bylo objeveno, také jako výhodné provedení předloženého vynálezu, že subtilisinová proteasa obsahuje oblast prvního místa štěpení a druhého místa štěpení (tj. místa proteasy, kde dochází k hydrolýze in vivo). Bez ohledu na teorii se předpokládá, že když se jeden nebo více zbytků v těchto oblastech místa štěpení účastní zesíťování, hydrolýza proteasy je zhoršena a tedy je podobně zhoršena presentace epitopu. Bylo objeveno, že oblast místa prvního štěpení odpovídá polohám 156 až 165, 170, 186, 191 až 196 a 259 až 262 subtilisinu BPN' a oblast místa druhého štěpení odpovídá polohám 12 až 24, 27, 84 až 88, 271 a 274
I* · · · · subtilisinu BPN'. Viz např. USA provizorní patentová přihláška č. 60/144 981, Weisgerber a spol.: Protease Conjugates Having Sterically Protected Clip Sites, podaná 22. července 1999.
Ve výhodném provedení tedy předložená protesá obsahuje intramolekulámí zesíťování, při čemž intramolekulámí zesíťování obsahuje kovalentní vazbu mezi aminokyselinou prvního zbytku proteasy a aminokyselinou druhého zbytku proteasy, pň čemž alespoň jeden zbytek se vyskytuje v oblasti vybrané ze skupiny sestávající z:
a) aminové koncové oblasti odpovídající poloze 1 subtilisinu BPN',
b) oblasti prvního epitopu odpovídající polohám 70 až 84 subtilisinu BPN',
c) oblasti druhého epitopu odpovídající polohám 103 až 126 subtilisinu BPN',
d) oblasti třetího epitopu odpovídající polohám 220 až 246 subtilisinu BPN',
e) oblasti místa prvního štěpení odpovídajícího polohám 156 až 165, 170, 186,191 až 196 a 259 až 262 subtilisinu BPN',
f) oblasti místa druhého štěpení odpovídajícího polohám 12 až 24, 27, 84 až 88, 271 a 274 subtilisinu BPN',
g) oblasti místa prvního blízkého epitopu odpovídajícího polohám 2, 3, 4, 5, 6, 7, 12, 17, 36, 40, 41, 43, 44 45, 67, 86, 87, 89, 209, 210, 212, 213, 214, 215 a 216 subtilisinu BPN',
h) oblasti místa druhého blízkého epitopu odpovídajícího polohám 25, 26, 27, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 91, 99, 100, 101, 102, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 136, 137, 138, 140, 141, 144 a 145 subtilisinu BPN', a
i) oblasti místa třetího blízkého epitopu odpovídajícího polohám 9,10, 22, 23, 24, 62, 63, 143, 146, 154, 155, 156, 157, 172, 173, 187, 189, 195, 197, 203, 204, 253, 254, 256, 265, 267, 269, 271, 272 a 275 subtilisinu BPN'.
Jestliže pouze jeden, buď první zbytek nebo druhý zbytek se vyskytuje v předcházející oblasti, další zbytek je vybrán z jakékoliv jiné polohy proteasy.
S výhodou alespoň jeden ze zbytků se vyskytuje v oblasti vybrané z aminové koncové oblasti, oblasti prvního epitopu, oblasti druhého epitopu, oblasti třetího epitopu, oblasti místa prvního štěpení a oblasti místa druhého štěpení. Výhodněji se alespoň jeden ze zbytků vyskytuje v oblasti vybrané z aminové koncové oblasti, oblasti prvního epitopu, oblasti druhého epitopu a oblasti třetího epitopu. Ještě výhodněji alespoň jeden ze zbytků vyskytuje v oblasti vybrané z oblasti prvního epitopu, oblasti druhého epitopu a oblasti třetího epitopu. Nejvýhodněji alespoň jeden ze zbytků se vyskytuje v oblasti prvního epitopu.
V dalším výhodném provedení podle předloženého vynálezu jak první tak druhý zbytek proteasy se vyskytuje v oblasti vybrané z aminové koncové oblasti, oblasti prvního epitopu, oblasti druhého epitopu, oblasti třetího epitopu, oblasti místa prvního štěpení, oblasti místa druhého štěpení, oblasti prvního blízkého epitopu, oblasti druhého blízkého epitopu a oblasti třetího blízkého epitopu. Ještě výhodněji první zbytek odpovídá poloze 1 subtilisinu BPN' a druhý zbytek se vyskytuje v oblasti vybrané ze skupiny sestávající z oblasti prvního epitopu, oblasti druhého epitopu, oblasti třetího epitopu, oblasti místa prvního štěpení, oblasti místa druhého štěpení, oblasti prvního blízkého epitopu, oblasti druhého blízkého epitopu a oblasti třetího blízkého epitopu.
Jestliže alespoň jeden ze zbytků se vyskytuje v oblasti prvního epitopu, tato oblast s výhodou odpovídá polohám 75 až 83 subtilisinu BPN'. Výhodněji tato oblast odpovídá poloze 78 subtilisinu BPN'.
Jestliže alespoň jeden ze zbytků se vyskytuje v oblasti druhého epitopu, tato oblast s výhodou odpovídá polohám 109, 114 a 118 subtilisinu BPN', nejvýhodněji 118.
• · * · · • · · « • · « ··
Jestliže alespoň jeden ze zbytků se vyskytuje v oblasti třetího epitopu, tato oblast s výhodou odpovídá poloze 240 subtilisinu BPN'.
Jestliže alespoň jeden ze zbytků se vyskytuje v oblasti místa prvního štěpení, tato oblast s výhodou odpovídá polohám 158,159,160,161,162,163,164,165,170, 186, 191, 192, 193, 194, 196, 259, 260, 261 a 262 subtilisinu BPN'. Výhodněji tato oblast odpovídá polohám 158, 159, 160, 161,162,163, 164, 165, 170, 191, 192, 193, 194, 261 a 262 subtilisinu BPN'. Ještě výhodněji tato oblast odpovídá polohám 158, 159, 160, 161, 162,163, 164,192, 193,194, 261 a 262 subtilisinu BPN'. Nejvýhodněji tato oblast odpovídá polohám 160, 161,162,163 a 261 subtilisinu BPN'.
Jestliže alespoň jeden ze zbytků se vyskytuje v oblasti místa prvního štěpení, tato oblast s výhodou odpovídá polohám 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20 a 21 subtilisinu BPN'. Výhodněji tato oblast odpovídá polohám 14, 15, 16, 18, 19, 20 a 21 subtilisinu BPN'. Nejvýhodněji tato oblast odpovídá polohám 18, 19, 20 a 21 subtilisinu BPN'.
Jestliže alespoň jeden ze zbytků se vyskytuje v oblasti místa prvního blízkého epitopu, tato oblast s výhodou odpovídá polohám 2, 3, 4, 5, 6, 7, 12, 17, 40, 41, 43, 67, 86, 89, 206, 209, 214 a 215 subtilisinu BPN'. Nejýhodněji tato oblast odpovídá polohám 2, 3, 4, 5,17, 40, 41, 43, 67, 86, 87 a 214 subtilisinu BPN'.
Jestliže alespoň jeden ze zbytků se vyskytuje v oblasti místa druhého blízkého epitopu, tato oblast s výhodou odpovídá polohám 25, 26, 27, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 91, 99, 100, 101, 102, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 136, 137, 138,140,141,144 a 145 subtilisinu BPN'. Nejvýhodněji tato oblast odpovídá polohám 27, 47, 48, 50, 52, 102, 127,128, 130, 131, 132,133, 134, 138 a 141 subtilisinu BPN'.
Jestliže alespoň jeden ze zbytků se vyskytuje v oblasti místa třetího blízkého epitopu, tato oblast s výhodou odpovídá polohám 9, 10, 22, 23, 24, 62, 63, 143, 146, 154, 155, 156, 157, 172, 173, 187, 189, 195, 197, 203, 204, 253, 254, 256, 265, 267,
269, 271, 272 a 275 subtilisinu BPN'. Nejvýhodněji tato oblast odpovídá polohám 22, 23, 24, 143, 146, 155, 173, 189,197, 203, 204, 253, 254, 265 a 275 subtilisinu BPN'.
Níže uvedená tabulka 2 uvádí neomezující příklady výhodných intramolekulámě zesíťovaných subtilisinových proteas, v nichž v každém příkladu uvedený seznam poloh ukazuje první zbytek, respektive druhý zbytek, tj. kterými zbytky dojde k intramolekulámímu zesíťování. V souladu se zde uvedeným popisem číslování všech zbytků odpovídá číslování subltilisinu BPN'.
* 9
Tabulka 2 « ·
první zbytek druhý zbytek (v oblasti místa druhého štěpení)
141 (v oblasti druhého blízkého epitopu) 114 (v oblasti druhého blízkého epitopu) 25 (v oblasti druhého blízkého epitopu)
118 (v oblasti druhého epitopu) (v oblasti druhého blízkého epitopu) 275 (v oblasti třetího blízkého epitopu) 137 (v oblasti druhého blízkého epitopu) 55
133 (v oblasti druhého blízkého epitopu) 1 (oblast aminového konce) (oblast aminového konce) (v oblasti prvního blízkého epitopu) 43 (v oblasti prvního blízkého epitopu) (v oblasti místa druhého štěpení) (v oblasti místa druhého štěpení) (v oblasti místa druhého štěpení) (v oblasti prvního blízkého epitopu)
186 (v oblasti místa prvního štěpení)
186 (v oblasti místa prvního štěpení)
262 (v oblasti místa prvního štěpení)
262 (v oblasti místa prvního štěpení)
262 (v oblasti místa prvního štěpení)
130 (v oblasti druhého blízkého epitopu) 130 (v oblasti druhého blízkého epitopu) 78 (v oblasti prvního epitopu)
118 (v oblasti druhého epitopu)
118 (v oblasti druhého epitopu)
118 (v oblasti druhého epitopu)
118 (v oblasti druhého epitopu)
240 (v oblasti třetího epitopu)
240 (v oblasti třetího epitopu)
240 (v oblasti třetího epitopu)
109 (v oblasti druhého epitopu)
109 (v oblasti druhého epitopu)
109 (v oblasti druhého epitopu) (oblast prvního epitopu) (oblast prvního epitopu) (v oblasti prvního epitopu) (v oblasti prvního epitopu) (v oblasti prvního epitopu) (v oblasti prvního epitopu) (v oblasti prvního epitopu) (v oblasti prvního epitopu)
158 (v oblasti místa prvního štěpení) 160 (v oblasti místa prvního štěpení)
158 (v oblasti místa prvního štěpení)
160 (v oblasti místa prvního štěpení)
161 (v oblasti místa prvního štěpení)
159 (v oblasti místa prvního štěpení)
162 (v oblasti místa prvního štěpení) 212 (v oblasti prvního blízkého epitopu)
··· · · · · · · ···· ·· ·· ···· ·· ····
Případné částice: Intramolekulámě zesíťované proteasy podle předloženého vynálezu mohou dále obsahovat jednu nebo více jiných chemických struktur zahrnujících (například) jendu nebo více malých molekul, polypeptidů a/nebo polymerů kovalentně připojených k jakémukoliv zbytku proteasy (zde dále označované jako doplňkové částice), zvláště těch zbytků, které se neúčastní intramolekulámího zesíťování. Pojem malá molekula, jak je zde používán, znamená takovou molekulu, která má molekulovou hmotnost menší než 1600, s výhodou menší než 800, výhodněji menší než 400 a nejvýhodněji menší než 300. Pojem polypeptid, jak se zde používá, znamená takovou molekulu, která obsahuje dva nebo více aminokyselinových zbytků). Pojem polymer, jak se zde používá, znamená jakoukoliv molekulu, která obsahuje dvě nebo více identických (s výhodou pět nebo více identických) monomemích jednotek.
Mezi doplňkové částice mohou patřit polypeptidové částice, polymemí částice a vazebné částice, jak jsou popsány například ve spisu WO 96/17929, Olsen a spol., Novo Nordisk A/S, publikovaném 13. června 1996, WO 96/40791, Olsen a spol., Novo Nordisk A/S, publikovaném 19. prosince 1996, WO 96/40792, Olsen a spol., Novo Nordisk A/S, publikovaném 19. prosince 1996, WO 97/30148, Bisgard-Frantzen a spol., Novo Nordisk A/S, publikovaném 21. srpna 1997, WO 98/30682, Olsen a spol., Novo Nordisk A/S, publikovaném 16. července 1998, WO 98/35026, Von Der Osten a spol., Novo Nordisk A/S, publikovaném 13. srpna 1998, WO 99/00849, Olsen a spol., Novo Nordisk A/S, publikovaném 7. ledna 1999, USA patentu č. 5 856 451, Olsen a spol., Novo Nordisk A/S, vydaném 5. ledna 1999, WO 97/37007, Bott a spol., Genencor International lne., publikovaném 9. října 1997, USA patentové přihlášce č. 09/088 912, Weisgerber a spol., The Procter & Gamble Co., podané 2. června 1998, USA patentové přihlášce č. 08/903 298, Weisgerber a spol., The Procter & Gamble Co., podané 30. července 1997, USA provizorní patentové přihlášce č. 60/144 979, Rubingh a spol.: Protease Conjugates Having Sterically Protected Epitope Regions, podané 22. července 1999, a USA provizorní patentové přihlášce č. 60/144 981, Weisgerber a spol.: Protease Conjugates Having Sterically Protected Clip Sites, podané 22. července 1999.
« · * · · «·
Způsob přípravy: Proteasové částice, které mají substituci v jedné nebo více epitopových chráněných polohách (nebo jakémkoliv jiném místě částice) se připravují mutací nukleotidových sekvencí, které kódují rodičovskou aminokyselinovou sekvenci. Tyto způsoby jsou dobře známy v oblasti techniky; neomezující příklad jednoho takového způsobu je uveden níže:
Fagemid (pSS-5) obsahující přírodní subtilisinový BPN' gen se transformuje do Escheríchia coli dut- ung- kmene CJ236 a použitím pomocného fágu VCSM13 se produkuje jednovláknový uráčil obsahující DNA templát (Kunkel a spol.: Rapid and Efficient Site-Specific Mutagenesis Without Phenotypic Selection, Methods in Enzymology 1987, 154, 367 až 382, podle modifikace Yuckenberga a spol.: Site-directed in vitro Mutagenesis Using Uracil-Containing DNA and Phagemid Vectors, Directed Mutagenesis - A Practical Approach, McPherson M. J., red., str. 27 až 48 (1991). Primerem místně řízená mutagenese modifikovaná způsobem popsaným v Zoller M. J. a Smith M.: Oligonucleotide - Directed Mutagenesis Using M13 - Derived Vectors: An Efficient and General Proceduře for the Production of Point Mutations in any Fragment of DNA, Nucieic Acids Research 1982, 10, 6487 až 6500, se použije k produkci všech mutantů (v podstatě tak, jak uvádí Yuckenberg a spol., viz shora).
Oligonukleotidy se vyrobí použitím 380B DNA syntetizátoru (Applied Biosystems lne.). Reakční produkty mutagenese se transformují do Escherichia coli kmene MM294 (Americká sbírka typů kultur E. coli 33625). Všechny mutace jsou potvrzeny DNA sekvenováním. Isolovaná DNA se transformuje do Baciltus subtilís expresního kmene PG632 (Saunders a spoLOptimization of the Signal-Sequence Cleavage Site Secretion from Bacillus subtilis of a 34-Amino Acid Fragment of Human Parathyroid Hormone, Gene 1991, 102, 277 až 282, a Yang a spol.: Cloning of the Neutrál Protease Gene of Bacillus Subtilis and the Use of the Cloned Gene to Create an in vitro - Derived Deletion Mutation, Journal of Bacteriology 1984, 160,15 až 21.
• ·
Fermenatce je následující. Buňky Bacillus subtilis (PG632) obsahující proteasu, která nás zajímá, byly nechány růst do střední log-fáze v jednom litru LB živné kultury obsahující 10 g/l glukosy a naočkovány do fermentoru Biostat C (Braun Biotech., lne., Allentown, Pa.) v celkovém objemu 9 litrů. Fermentační medium obsahovalo kvasinkový extrakt, kaseinový hydrolyzát, rozpustný, částečně hydrolyzovaný škrob (Maltrin M-250), protipěnivé činidlo, pufry a stopové materiály (viz Biology Bacilli: Apllications to Industry, Doi R. H. a M. McGloughlin, red. (1992)). Živné medium se během průběhu fermentace udržuje na kontantním pH 7,5. Pro antibiotickou selekci mutagenizovaného plasmidu se přidá kanamycin (50 pg/ml). Buňky se nechají růst 18 hodin při 37 °C do Αβοο 60 a produkt se isoluje.
Fermentační živná půda se během následujících stupňů odebírá, aby se získala čistá proteasa. Půda se vyčistí od buněk Bacillus subtilis tangenciálním tokem proti 0,16μτη membráně. Živná půda bez buněk se pak zahustí ultrafiltrací membránou oddělující molekulovou hmotnost 8000. Koncentrovaným MES pufrem se upraví pH na 5,5 (2-(N-morfolino)ethansulfonová kyselina). Proteasa se dále vyčistí chromatografií na katexu se Sefarosou, eluce gradientem NaCI. Viz Scopes R. K.: Protein Purification Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1984).
Pro stanovení koncentrace aktivní proteasy ve frakcích sebraných během gradientově eluce se použije pNA test (DelMar a spol.: Analytical Biochemistry 1979, 99, 316 až 320. Tento test měří rychlost, kterou se uvolňuje 4-nitroanalin, jak proteasa hydrolyzuje vhodný syntetický substrát, sukcinyl-alanin-alanin-prolin-fenylaianin-4-nitroanilin (sAAPF-pNA). Rychlost produkce žluté barvy z hydrolyzační reakce se měří spektrofotometrem při 410 nm a je přímo úměrná koncentraci aktivní proteasové částice. Měření absorbance při 280 nm se dále používá pro stanovení koncentrací celkového proteinu. Poměr aktivní protesa/celkový protein udává čistotu proteasy a používá se pro identifikování frakcí, které se mají spojit pro zásobní roztok.
Aby se obešla autolýza během skladování proteasy, ke spojeným frakcím získaným z chromatografické kolony se přidá stejná hmotnost propylenglykolu. Po *· ··· » ukončeném postupu čištění se čistota zásobního roztoku proteasy zkontroluje SDS-PAGE (elektroforéza na polyakrylamidovém gelu s dodecylsulfátem sodným) a absolutní koncentrace enzymu se stanoví titrací aktivních míst způsobem používajícím trypsinový inhibitor typu ll-T; bílek krůtího vajíčka (Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri).
Při přípravě pro použití se proteasový zásobní roztok eluuje kolonou se Sephadexem G25 (Pharmacia, Piscataway, New Jersey), aby se odstranil propylenglykol a zaměnil pufr. MES pufr v enzymovém zásobním roztoku se zamění za 0,01 M roztok dihydrogenfosforečnanu sodného, pH 5,5.
Neomezující příklady způsobů přípravy intramolekulámě zesíťované proteasy podle předloženého vynálezu jsou uvedeny níže, pň čemž v každém příkladu znamená proteasu, jak zde byla shora popsána.
• ·
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Připraví se varianta subtilisinu BPN' se substitucí leucinu za tyrosin v poloze 217 a cysteinu za serin v poloze 78. Tato varianta se dialyzuje (100 ml při koncentraci 2 mg/ml) proti 5 litrům 5mM dithiothreitolu (DTT; komerčně dostupný od Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Mo.) v pufru o pH 5,5 po dobu 4 hodin. Tato varianta se přenese do čerstvého pufru bez DTT a dialyzuje se 16 hodin. Koncentrace varianty se změří absorbancí při 280 nm. Změří se koncentrace thiolu (viz Deaken a spol.: Biochemical Journal 1963, 89, 263), aby se zajistilo, že koncentrace volného thiolu je větší než koncentrace proteasy, a v 1,2-násobném nadbytku vzhledem ke koncentraci volného thiolu se přidá N-(gama-maleimidobutyryloxy)sukcinimidový ester (komerčně dostupný od Pierce Chemical, Rockford, II.). Po pěti minutách se přidá 20 ml 1M pufru, pH 6,8. Po dalších 30 minutách se přidá 100 ml 1M pufru o pH 5,5. Reakční směs se pak dialyzuje proti přibližně 5 litrům 0,01 M pufru o pH 5,5. Intramolekulámě zesíťovaná proteasa obsahující kovalentní vazbu mezi cysteienm v poloze 78 a aminovým koncem se vyčistí na koloně ionexu.
·· ··· · • <·
Připraví se varianta subtilisinu BPN' se substitucí leucinu za tyrosin v poloze 217, cysteinu za asparagin v poloze 240 a lysinu za asparagin v poloze 118. Všechny další lysinové zbytky proteasy jsou substituovány jinou aminokyselinou než je lysin nebo cystein. Tato varianta se dialyzuje (100 ml při koncentraci přibližně 2 mg/ml) proti 5 litrům 5mM dithiothreitolu (DTT; komerčně dostupný od Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Mo.) v pufru s pH 5,5 po dobu 4 hodin. Tato varianta se přenese do čerstvého pufru bez DTT a dialyzuje se 16 hodin. Koncentrace varianty se změří absorbancí při 280 nm. Měří se koncentrace thiolu, aby se zajistilo, že koncentrace volného thiolu bude větší než koncentrace proteasy. SukcinimidyM-(N-maleimidomethyl)-cyklohexan-1-karboxy(6-amidokaproát) (komerčně dostupný od Pierce Chemical, Rockford,
II.) se přidá v 1,2násobném nadbytku vzhledem ke koncentraci volného thiolu. Po pěti minutách se přidá 20 ml 1M pufru, pH 6,8. Po dalších 30 minutách se přidá 100 ml 1M • · • · pufru ο ρΗ 5,5. Reakčnř směs se pak dialyzuje proti 5 litrům 0,01 M pufru o pH 5,5. Intramolekulámě zesíťovaná proteasa obsahující kovalentní vazbu mezi cysteinem v poloze 240 a lysinem v poloze 116 se vyčistí na koloně ionexu.
Příklad 3
N-(gama-maleimidobutyryloxy)sukcinimidový ester použitý v příkladu 1 se nahradí jakýmkoliv jedním z následujících reakčních činidel za vzniku kovalentní vazby mezi cysteinem v poloze 78 a aminovým koncem: N(alfa-maleimidoacetoxy)sukcinimidovým esterem, N(beta-maleimidopropyloxy)sukcinimidovým esterem nebo 3-maleimidobenzoyl-N-hydroxysukcinimidovým esterem. Každé z těchto reakčních činidel je komerčně dostupné od Pierce Chemical Company, Rockford, II. Alternativně lze syntetizovat jakékoliv reakční činidlo obsahující maleimidovou část a část sukcinimidylového esteru podobné velikosti a substituovat ho za N-(gama-maleimidobutyryloxy)sukcinimidový ester (viz Kalgutar a spol.: Journal ofMedidnal Chemistry 1996, 39,1692 až 1703, a odkazy tam uvedené).
Příklad 4
Sukcinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)-cyklohexan-1-karboxy(6-amidokaproát) použitý v příkladu 2 se nahradí jakýmkoliv jedním z následujících reakčních činidel za vzniku kovalentní vazby mezi cysteinem v poloze 240 a lysinem v poloze 118: sukcinimidyl-4-(4-maleimidofenyl)-butyrátem, sulfosukcinimidy!-4-(4-maleimidofenyl)-butyrátem nebo N-[kapa-maleimidoundekanoyloxy]sulfosukcinimidovým esterem. Každé z těchto reakčních čindiel je komerčně dostupné od Pierce Chemical Company, Rockford, II. Alternativně lze synthetizovat jakékoliv reakční činidlo obsahující maleimidovou část a část sukcinimidylového esteru podobné velikosti a substituovat ho za N-(gama-maleimidobutyryloxy)sukcinimidový ester (viz Kalgutar a spol.: Journal of Medicinal Chemistry 1996, 39,1692 až 1703, a odkazy tam uvedené).
··
nh2
Připraví se varianta subtilisinu BPN' se substitucí leucinu za tyrosin v poloze 217 a cysteinu za serin v poloze 78. Všechny povrchové lysinové zbytky proteasy se substituují jinými aminokyselinami než je lysin nebo cystein. Tato varianta se dialyzuje (100 ml pň koncentraci 2 mg/ml) proti 5 litrům 5mM dithiothreitolu (DTT; komerčně dostupný od Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Mo.) v pufru o pH 7 až 8 po dobu 4 hodin. Tato varianta se přenese do čerstvého pufru bez DTT a dialyzuje se 4 hodiny. Koncentrace varianty se změří absorbancí při 280 nm. Změří se koncentrace thiolu, aby se zajistilo, že koncentrace volného thiolu bude větší než koncentrace proteasy, a v 1,2-násobném nadbytku vzhledem ke koncentraci volného thiolu se přidá N-sukcinimidyl-(4-jodacetyl)aminobenzoát (komerčně dostupný od Pierce Chemical, Rockford, II.). Po 30 minutách se přidá 100 ml 1M pufru o pH 5,5. Reakční směs se pak dialyzuje proti 5 litrům 0,01 M pufru o pH 5,5. Intramolekulámě zesíťovaná proteasa obsahující kovalentní vazbu mezi cysteiem v poloze 78 a aminovým koncem se vyčistí na koloně ionexu.
φ «
Připraví se varianta subtilisinu BPN' se substitucí leucinu za tyrosin v poloze 217 a cysteinu za serin v poloze 78. Tato varianta se dialyzuje (100 ml při koncentraci přibližně 2 mg/ml) proti 5 litrům 5mM dithiothreitolu (DTT; komerčně dostupný od Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Mo.) v pufru o pH 5,5 po dobu 4 hodin. Tato varianta se přenese do čerstvého pufru bez DTT a dialyzuje se 16 hodin. Koncentrace varianty se změří absorbancí při 280 nm. Měří se koncentrace thiolu, aby se zajistilo, že koncentrace volného thiolu bude větší než koncentrace proteasy. N-maleimido-[4'-azido-2'-nitrofenylamino]butyrát se přidá v 1,2násobném nadbytku vzhledem ke koncentraci volného thiolu. Po pěti minutách se reakce vystaví působení UF světla (320 až 350 nm) po dobu 10 minut. Alternativně se reakční směs vystaví 10 zábleskům standardní fotografické žárovky. Reakční směs se pak dialyzuje proti přibližně 2 litrům 0,01 M pufru o pH 5,5. Intramolekulámě zesíťovaná proteasa obsahující kovalentní vazbu mezi cysteinem v poloze 78 a aminovým koncem se vyčistí na koloně ionexu.
Příklad 7
GMAB použitý v příkladu 6 se nahradí jakýmkoliv jedním z následujících reakčních činidel za vzniku kovalentní vazby mezi lysinem v poloze 78 a aminovým • 9
4 «4 4444 koncem (při čemž další lysinové zbytky proteasy jsou substituovány jinou aminokyselinou): N-5-azido-2-nitrobenzoylsukcinimidem, N-sukcinimidyl-6-(4'-azido-2'-nitrofenylamino)hexanoátem, N-hydroxysulfosukcinimidyM-azidobenzoátem, sulfosukcinimidyl(4-azidosalicylamido)hexanoátem, sulfosukcinimidyl-7-azido-4-methylkumarin-3-acetátem, sulfosukcinimidyl-S-^-azido-Z-nitrofenyOhexanoátem a sulfosukcinimidyl-4-(4-azidofenyl)butyrátem. Všechna tato reakční činidla jsou komerčně dostupná od Pierce Chemical Company, Rockford, II.
Příklad 8
Připraví se varianta subtilisinu BPN' se substitucí leucinu za tyrosin v poloze 217, cysteinu za serin v poloze 78 a cysteinu za alanin v poloze 1. Tato varianta se dialyzuje (100 ml při koncentraci 2 mg/ml) proti 5 litrům 5mM dithiothreitolu (DTT; komerčně dostupný od Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Mo.) v pufru o pH 5,5 po dobu 4 hodin. Tato varianta se přenese do čerstvého pufru bez DTT a dialyzuje se 16 hodin. Koncentrace varianty se změří absorbancí při 280 nm. Změří se koncentrace thiolu, aby se zajistilo, že koncentrace volného thiolu je více než dvakrát větší než koncentrace proteasy. K proteasovému roztoku se přidá 10 ml 1M (N-(2-hydroxyethyl)piperazin-N'-(2-ethansulfonové kyseliny)) (HEPES)/NaOH pufr, pH 7,0. Na 1,2-násobný nadbytek vzhledem ke koncentraci proteasy se přidá bismaleimidohexan (komerčně dostupný od Pierce Chemical, Rockford, II.). Po jedné hodině se pak reakční směs dvakrát dialyzuje proti dvaceti objemům 0,01 M pufru o pH 5,5. Intramolekulámě
··
zesíťovaná proteasa obsahující kovalentní vazbu mezi cysteinem v poloze 78 a cysteinem na aminovém konci se vyčistí na koloně ionexu.
Analytické způsoby
Předložené intramolekulráně zesíťované proteasy mohou být testovány na enzymatickou aktivitu a imunogenní odpověď použitím následujících dvou způsobů, které jsou známy zručnému odborníkovi z oblasti techniky. Alternativně lze použít další způsoby dobře známé v oblasti techniky.
Proteasová aktivita
Proteasová aktivita intramolekulámě zesíťované proteasy podle předloženého vynálezu se může testovat způsoby, které jsou v oblasti techniky dobře známy. Dva takové způsoby jsou zde níže uvedeny.
Způsob stanovení aktivity vločky na kůži
Použitím pásky Scotch(R) #3750G se z kůže nohy člověka opakovaně odlupují vločky tak dlouho, dokud páska v podstatě nezmatní vločkami. Páska se pak nařeže na velikost 2,5 x 2,5 cm a nechá se ležet. Do Petriho misky (10 mm krát 35 mm) se přidají 2 ml 0,75 mg/ml kontrolního enzymu (například subtilisinu BPN') nebo proteasy, která se má testovat, v 0,01 M pufru dihydrogenfosforečnanu draselného, pH 5,5. K tomuto roztoku se přidá 1 ml 2,5% roztoku laurátu sodného, pH 8,6. Tento roztok se mírně míchá na vodorovné třepačce. Předem připravené čtverečky pásky se nechají nasáknout roztokem (strana s vločkami nahoru) po dobu 10 minut za pokračujícího mírného míchání. Čtvereček pásky se pak mírné oplachuje pitnou vodou po dobu 15 vteřin. Do čisté Petriho misky se odpipetuje Stevenelovo modré barvivo (3 ml, komerčně dostupné od Sigma Chemical Corp., St. Louis, Mo., jako Stevenel Blue Stain). Opláchnutý čtvereček pásky se umístí do barviva na tři minuty (vločkami nahoru) za mírného míchání. Čtvereček pásky se odstraní z barvy a • · *· » <
» « ·· • · ·
4·44 promyje se postupně ve dvou kádinkách 300 ml destilované vody po dobu 15 vteřin (jedno opláchnutí). Čtvereček pásky se nechá uschnout. Intenzita zabarvení mezi čtverečkem pásky získaným od kontrolního enzymu a čteverečkem pásky získaným z proteasy se porovná vizuálně nebo použitím chromometru. Při srovnání se čtverečkem pásky s kontrolním enzymem ten čtvereček pásky, který vykazuje nižší intenzitu barvy, ukazuje na vyšší aktivitu proteasy.
Způsob stanoevní aktivity zabarvováním kolagenu
Spojí se 50 ml 0,1 M tris pufru (tris-hydroxymethylaminomethan) obsahujícího 0,01 M CaCb, takže se získá pH 8,5, a 0,5 g azocollu (kolagen impregnovaný azobarvivem, komerčně dostupný od Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.). Tato směs se inkubuje při 25 °C za mírného míchání na vodorovné třepačce. Směs se zfiltruje 0,2pm jehlovým filtrem a absorbance této směsi při 520 nm se na spektrofotometru odečte jako nula. Ke zbývajícím 48 ml směsi tris/azocoll se přidá 1.10-4 % kontrolního enzymu (tj. 1 ppm; například subtilisinu BPN') nebo proteasy, která se má testovat. Každé dvě minuty až do celkem deseti minut se 0,2μιτι injekčním filtrem zfiltrují 2 ml roztoku obsahujícího kontrolu/proteasu. U každého zfiltrovaného vzorku se ihned při 520 nm odečte absorbance. Výsledky se vynesou proti času. Směrnice kontroly a testovaného konjugátu ukazují relativní aktivity těchto vzorků. Vyšší směrnice ukazuje na vyšší aktivitu. Test proteasové aktivity (směrnice) může být vyjádřen jako procento aktivity kontroly (směrnice).
Myší intranazální test imunogenicity
Imunogenní potenciál intramolekulámě zesíťovaných proteas podle předloženého vynálezu lze stanovit použitím způsobů známých v oblasti techniky nebo myším intranazálním testem imunogenicity, který je zde uveden. Tento test je podobný testům popsaným v Robinson a spol.: Specific Antibody Responses to Subtilisin Carlsberg (Alcalase) in Mice: Development of an Intranazal Exposure Model, Fundamental and Applied Toxicology 1996, 34,15 až 24, a Robinson a spol.: Use of • 44 · 4
44
4 4 • 4 · • 4 4 4 4
4444
4* 44
4 4 *
4 * ·4·
4 4
4444 the Mouše Intranasal Test (MINT) to Determine the Allergenic Potency of Detergent Enzymes: Comparison to the Guinea Pig Intratracheal (GPIT) Test, Toxicological Science 1998, 43, 39 až 46, které oba mohou být použity místo zde dále uvedeného testu.
V tomto testu se použijí myší samičky BDF1 (Charles River Laboratories, Portage, Mi.) o hmotnosti od 18 do 20 gramů. Tyto myši se jeden týden před dávkováním udržují v karanténě. Myši se umístí do klecí s podestýlkou dřevěnými hoblinami v místnostech s regulovanou vlhkostí (30 až 70 % hmotn.), teplotou (19,5-25 °C) a s dvanáctihodinovým cyklem světlo/tma. Myši jsou krmeny myším žrádlem Purina(R) (Purina Mills, Richmond, In.) s podáváním vody podle libosti.
Potenciální antigen, který má být testován (buď subtilisin BPN' jako positivní kontrola nebo intramolekulámě zesíťovaná proteasa podle předloženého vynálezu) se podá skupině pěti myší. Před podáním se každá myš anestetizuje intraperitoneální (i.p.) injekcí směsi Ketaset (88,8 mg/kg) a Rompun (6,67 mg/kg). Anestetizované zvíře se drží v dlani ruky, zády dolů, a intranazálně se podá 5 ml proteasy v pufru (0,01 M KH2PO4, pH 5,5). I když každá skupina obdrží stejné dávkování, mohou být testovány různé dávky. Podávané roztoky se opatrně umístí na vnější stranu každé nosní dírky a nechají se, aby je myš inhalovala. Podávání se opakuje 3., 10., 17. a 24. den.
Vzorky sera se odeberou 29. den. Způsobem ELISA se zachycením antigenu se změří enzymově specifická lgG1 protilátka v myším seru. Imunogenicity intramolekulámě zesíťované proteasy mohou být srovnány se subtilisinem BPN' použitím standardních hodnot ED50.
Prostředky podle předloženého vynálezu
Intramolekulámě zesíťované proteasy podle předloženého vynálezu se mohou používat v jakékoliv aplikaci, která je vhodná pro příslušnou rodičovskou proteasu. Mezi jeden takový příklad patří čistící prostředky. Kvůli žádaným vlastnostem snížené • · ·« ··»* ·· 0« « · · • · • · • * · ·· «··· imunogenicity předložených intramolekulámě zesíťovaných prtoeas mohou být proteasy dále použity v takových aplikacích, pro které použití proteas bylo historicky minimálně výhodné. Mezi příklady takových aplikací patří ty, při kterých intramolekulámě zesíťovaná proteasa nutně přichází do těsného kontaktu s kůží savce (zvláště kůží člověka), jako je použití prostředků pro osobní péči.
Čistící prostředky
Předložené prostředky se mohou používat v čistících prostředcích, mezi které patří, ale bez omezení na ně, prací prostředky, prostředky pro čištění tvrdých povrchů, nízkoúčinné čistící prostředky včetně prostředků pro mytí nádobí a detergentní prostředky pro mytí nádobí v automatických myčkách nádobí.
Čistící prostředky podle předloženého vynálezu obsahují účinné množství jedné nebo více proteas podle předloženého vynálezu a nosič čistícího prostředku.
Pojem účinné množství proteasy nebo podobný, jak je zde používán, znamená takové množství intramolekulámě zesíťované proteasy, které je nutné pro dosažení proteolytické aktivity nutné ve specifickém čistícím prostředku. Taková účinná množství lze snadno zjistit odborníkem z oblasti techniky a je dáno mnoha faktory, jako je příslušná používaná proteasa, čistící aplikace, specifické složení čistícího prostředku, skutečnost, jestli je vyžadován kapalný nebo suchý (např. granulovaný, kostka) prostředek a podobně. Čistící prostředky s výhodou obsahují od 0,0001 % do 10 %, výhodněji od 0,001 % do 1 % a nejvýhodněji od 0,01 % do 0,1 % jedné nebo více proteas podle předloženého vynálezu. Několik příkladů různých čistících prostředků, v nichž se mohou používat proteasy, je zde dále podrobně diskutováno.
Vedle předložených proteas předložené čistící prostředky dále obsahují nosič čistícího prostředku obsahující jeden nebo více materiálů čistícícího prostředku slučitelných s proteasou. Pojem materiál čistícího prostředku, jak je zde tento pojem používán, znamená jakýkoliv materiál vybraný pro příslušný typ požadovaného
čistícího prostředku a formu produktu (např. kapalina, granule, kostka, sprej, tyčka, pasta, gel), při čemž tento materiál je slučitelný také s proteasou použitou v prostředku. Specifický výběr materiálů čistícího prostředku se snadno provede na základě úvahy o tom, jaký povrch materiálu má být vyčištěn, na žádané formě prostředku pro podmínky čištění během používání (např. při použití jako detergent pro mytí). Pojem slučitelný, jak je zde používán, znamená takový materiál čistícího prostředku, který nesnižuje proteolytickou aktivitu proteasy v takovém rozsahu, aby proteasa nebyla tak účinná, jak je požadováno během normálních situací používání. Příklady specifických materiálů čistícího prostředku jsou zde níže podrobně uvedeny.
Proteasy podle předloženého vynálezu mohou být používány v rozmanitých detergentních prostředcích, v nichž je žádoucí vysoké pěnění a dobré čištění. Proteasy se tedy mohou používat s různými konvenčními přísadami, takže se získají plně připravené čistící prostředky pro tvrdé povrchy, prostředky pro mytí nádobí, prostředky pro praní látek a podobně. Tyto prostředky mohou být ve formě kapalin, granulí, kostek a podobně. Tyto prostředky mohou být sestaveny jako koncentrované detergenty, které obsahují od až 30 % do 60 % hmotn. povrchově aktivních činidel.
Čistící prostředky podle vynálezu mohou popřípadě, a s výhodou, obsahovat různá povrchově aktivní činidla (např. aniontová, neiontová nebo obojetná povrchově aktivní činidla). Tato povrchově aktivní činidla jsou typicky přítomna v množství od 5 % do 35 % hmotn. z hmotnosti prostředků.
Mezi neomezující příklady povrchově aktivních činidel užitečných podle vynálezu patří konvenční alkylbenzensulfonáty s 11 až 18 atomy uhlíku a primární a náhodné alkylsulfáty, sekundární (2,3) alkylsulfáty s 10 až 18 atomy uhlíku obecných vzorců CH3(CH2)X(CHOSO3)'M+)CH3 a CH3(CH2)y(CHOSO3)-M+)CH2CH3, v nichž x a (y+1) znamenají alespoň číslo 7, s výhodou alespoň číslo 9, a M znamená ve vodě solubilizující kation, zvláště sodný, alkylalkoxysulfáty s 10 až 18 atomy uhlíku (zvláště EO 1 až 5 ethoxysulfáty), alkylalkoxykarboxyláty s 10 až 18 atomy uhlíku (zvláště EO 1 až 5 ethoxykarboxyláty), alkylpolyglykosidy s 10 až 18 atomy uhlíku a jejich • · • · · · · · · · odpovídající sulfatované polyglykosidy, α-sulfonované estery mastných kyselin s 12 až 18 atomy uhlíku, alkyl s 12 až 18 atomy uhlíku a alkylfenolalkoxyláty (zvláště ethoxyláty a směsné ethoxy/propoxy), betainy s 12 až 18 atomy uhlíku a sulfobetainy (sultainy), aminoxidy s 10 až 18 atomy uhlíku a podobné. Výhodné podle vynálezu jsou alkylalkoxysulfáty (AES) a alkylalkoxykarboxyláty (AEC). Použití takových povrchově aktivních činidel v kombinaci s aminoxidovými a/nebo betainovými nebo sultainovými povrchově aktivními činidly je rovněž výhodné, podle přání toho, kdo prostředky sestavuje. Další konvenční užitečná povrchově aktivní činidla jsou uvedena v seznamech v konvenčních textech. Mezi zvláště užitečná povrchově aktivní činidla patří N-methylglukamidy s 10 až 18 atomy uhlíku popsané v USA patentu č. 5 194 639, Connor a spol., vydaném 16. března 1993.
V prostředcích podle vynálezu mohou být zahrnuty rozmanité další přísady užitečné v detergentních čistících prostředcích, mezi které patří, například další aktivní přísady, nosiče, hydrotropní činidla, činidla napomáhající zpracování, barviva nebo pigmenty a rozpouštědla pro kapalné přípravky. Jestliže je žádoucí další přídavek pěnění, mohou být do prostředků zahrnuta činidla podporující pěnění, jako jsou alkanolamidy s 10 až 16 atomy uhlíku, typicky v množství 1 % až 10 % hmotn. Monoethanol a diethanolamidy s 10 až 14 atomy uhlíku ilustrují typickou skupinu takových zesilovačů pěnění. Výhodné je také použití takových zesilovačů pěnění s vysoce pěnícími dodatkovými povrchově aktivními činidly, jako jsou shora uvedené aminoxidy, betainy a sultainy. Jestliže je tó žádoucí, mohou se přidat rozpustné hořečnaté soli, jako je chlorid hořečnatý, síran hořečnatý a podobné, v množstvích typicky od 0,1 % do 2 % hmotn., aby se dosáhlo dalšího pěnění.
Kapalné detergentní prostředky podle vynálezu mohou obsahovat vodu a další rozpouštědla jako nosiče. Vhodné jsou primární nebo sekundární alkoholy s nízkou molekulovou hmotností, jejichž příklady jsou methanol, ethanol, propanol a isopropanol. Pro solubilizování povrchově aktivních činidel jsou výhodné monohydroxyalkoholy, ale mohou se používat také polyoly, jako jsou ty, které obsahují od 2 do 6 atomů uhlíku a od 2 do 6 hydroxylových skupin (např. 1,3-propandiol, ethylenglykol, • ·
glycerin a 1,2-propandiol). Tyto prostředky mohou obsahovat od 5 % do 90 %, typicky od 10 % do 50 % hmotn. takových nosičů.
Detergentní prostředky podle vynálezu budou s výhodou sestavovány tak, aby během použití ve vodných čistících operacích měla prací voda pH mezi 6,8 a 11. Konečné výrobky jsou tedy sestavovány tak, aby typicky byly v tomoto rozmezí. Mezi způsoby regulování pH pro doporučené hodnoty používání patří použití například pufrů, alkalií a kyselin. Tyto způsoby jsou dobře známy odborníkům z oblasti techniky.
Jestliže se sestavují čistící prostředky pro tvrdé povrchy a prostředky pro čištění látek podle předloženého vynálezu, ten, kdo je sestavuje, si může přát používat rozmanité stavební složky v množství od 5 % do 50 % hmotn. Mezi typické stavební složky patří 1 až lOmikrometrové zeolity, polykarboxyláty, jako jsou citrát a oxydisukcináty, vrstvené křemičitany, fosforečnany a podobné. Seznam dalších konvenčních stavebních složek je uveden v obvyklých předpisech.
Obdobně si může ten, kdo prostředky sestavuje, přát použít v těchto prostředcích různé další enzymy, jako jsou celulasy, lipasy, amylasy a proteasy, typicky v množstvích od 0,001 % do 1 % hmotn. Rozmanité čistící enzymy a enzymy pro péči o látky jsou dobře známy v oblasti pracích detergentních činidel.
V takových prostředcích mohou být použity rozmanité bělící sloučeniny, jako jsou peruhličitany, perboritany a podobné, typicky v množstvích od 1 % do 15 % hmotn. Jestliže je to žádoucí, tyto prostředky mohou obsahovat také bělící aktivátory, jako je tetraacetyl-ethylendiamin, nonanoyloxybenzensulfonát a podobné, které jsou také známy v oblasti techniky. Množství, která se používají, jsou typicky v rozmezí od 1 % do 10 % hmotn.
V těchto prostředcích se mohou používat činidla uvolňující ušpinění, zvláště aniontového oligoesterového typu, chelatační činidla, zvláště aminofosfonáty a ethylendiamidisukcináty, činidla odstraňující ušpinění hlinkami, zvláště ethoxylovaný te·· ···« traethylenpentamin, dispergační činida, zvláště polyakryláty a polyaspartáty, zjasňující činidla, zvláště aniontová zjasňující činidla, potlačovatelé pěnění, zvláště silikony a sekundární alkoholy, avivážní činidla pro látky, zvláště smektitové hlinky a podobné, v množstvích v rozmezí od 1 % do 35 % hmotn. Standardní předpisy a publikované patenty obsahují mnoho podrobných popisů takových konvenčních materiálů.
V čistících prostředcích se mohou používat také stabilizátory enzymů. Mezi tyto stabilizátory enzymů patří propylenglykol (s výhodou od 1 % do 10 % hmotn.), mravenčan sodný (s výhodou do 0,1 % do 1 % hmotn.) a mravenčan vápenatý (s výhodou od 0,1 % do 1 %).
V prostředcích pro čištění tvrdých povrchů jsou užitečné různé varianty. Pojem prostředek pro čištění tvrdých povrchů, jak se zde používá, znamená kapalné a granulované detergentní prostředky pro čištění tvrdých povrchů, jako jsou podlahy, stěny, koupelnové obklady a podobné. Prostředky pro čištění tvrdých povrchů podle předloženého vynálezu obsahují účinné množství jedné nebo více proteas podle předloženého vynálezu, s výhodou od 0,001 % do 10 %, výhodněji od 0,01 % do 5 %, ještě výhodněji od 0,05 % do 1 % hmotn. proteasy z hmotnosti prostředku. Vedle toho, že obsahují jednu nebo více proteas, tyto prostředky pro čištění tvrdých povrchů typicky obsahují povrchově aktivní činidlo a ve vodě rozpustnou vychytávací stavební složku. V některých specializovaných výrobcích, jako jsou spreje pro čištění oken, však někdy povrchově aktivní činidla nejsou používána, protože mohou produkovat filmový a/nebo pruhovaný zbytek na povrchu skla.
Povrchově aktivní složka, jestliže je přítomna, může představovat až jenom 0,1 % hmotn. z prostředků podle předloženého vynálezu, ale typicky tyto prostředky budou obsahovat od 0,25 % do 10 %, výhodněji od 1 % do 5 % hmotn. povrchově aktivního činidla.
• · · · *
Prostředky budou typicky obsahovat od 0,5 % do 50 % detergentní stavební složky, s výhodou od 1 % do 10 % hmotn.
Hodnota pH by měla být v rozmezí od 7 do 12. Jestliže je nutná úprava pH, mohou se používat konvenční činidla pro úpravu pH, jako je hydroxid sodný, uhličitan sodný nebo kyselina chlorovodíková.
V prostředcích mohou být zahrnuta rozpouštědla. Mezi užitečná rozpouštědla patří, ale bez omezení na ně, glykolethery, jako je monohexylether diethylenglykolu, monobutylether diethylenglykolu, monobutylether ethylenglykolu, monohexylether ethylenglykolu, monobutylether propylenglykolu, monobutylether dipropylenglykolu, a dioly, jako je 2,2,4-trimethyl-1,3-pentandiol a 2-ethyl-1,3-hexandiol. Jestliže se používají, jsou taková rozpouštědla typicky přítomna v množstvích od 0,5 % do 15 %, výhodněji od 3 % do 11 % hmotn.
V předložených prostředcích se mohou používat dále vysoce těkavá rozpouštědla, jako je isopropanol nebo ethanol, aby se usnadnilo rychlejší odpařování prostředku z povrchů, když povrch není opláchnut po aplikaci prostředku v plné síle na povrch. Jestliže se používají, jsou těkavá rozpouštědla typicky přítomna v množstvích od 2 % do 12 % hmotn. z hmotnosti prostředků.
• ··
* ·
Příklady 7 až 12
Kapalné čistící prostředky pro tvrdý povrch (množství složek jsou uvedena v % hmotnostních)
| př.7 | př.8 | př.9 | př.1O | př.11 | př.12 | |
| proteasa z př. 3 | 0,05 | 0,50 | 0,02 | 0,03 | 0,30 | 0,05 |
| EDTA | - | - | 2,90 | 2,90 | - | - |
| citrát sodný | - | - | - | - | 2,90 | 2,90 |
| alkyl(s 12 atomy uhlíku)benzen- sulfonát sodný | 1,95 | 1,95 | 1,95 | |||
| alkylsulfát s 12 atomy uhlíku sodný | 2,20 | 2,20 | 2,20 | |||
| ethoxysulfát s 12 atomy uhlíku sodný | 2,20 | 2,20 | 2,20 | |||
| dimethylaminoxid s 12 atomy uhlíku | 0,50 | 0,50 | 0,50 | |||
| kumensulfonát sodný | 1,30 | - | 1,30 | - | 1,30 | - |
| hexylkarbitol | 6,30 | 6,30 | 6,30 | 6,30 | 6,30 | 6,30 |
| voda | 90,4 | 88,3 | 87,53 | 85,87 | 87,25 | 85,85 |
Všechny přípravky jsou upraveny tak, aby pH bylo 7.
V jiném provedení podle předloženého vynálezu prostředky pro mytí nádobí obsahují jednu nebo více variant předloženého vynálezu. Prostředek pro mytí nádo9·· « 9 · · 9 · * · · bí, jak je zde tento pojem používán, znamená všechny formy prostředků pro čištění nádobí včetně, ale bez omezení na ně, granulovaných a kapalných forem.
Příklady 13 až 16
Kapalný prostředek pro mytí nádobí (množství složek jsou uvedena v % hmotnostních)
| př.13 | př.14 | př. 15 | př. 16 | |
| proteasa z příkladu 1 | 0,05 | 0,50 | 0,02 | 0,40 |
| N-methylglukamid s 12 až 14 atomy uhlíku | 90 | 0,90 | 0,90 | 0,90 |
| ethoxy(1)sulfát s 12 atomy uhlíku | 12,0 | 12,0 | 12,0 | 12,0 |
| 2-methylundekanová kyselina | 4,50 | 4,50 | 4,50 | 4,50 |
| ethoxy(2)karboxylát s 12 atomy uhlíku | 4,50 | 4,50 | 4,50 | 4,50 |
| alkoholethoxylát(4) s 12 atomy uhlíku | 3,00 | 3,00 | 3,00 | 3,00 |
| aminoxid s 12 atomy uhlíku | 3,00 | 3,00 | 3,00 | 3,00 |
| kumensulfonát sodný | 2,00 | 2,0 | 2,00 | 2,00 |
| ethanol | 4,00 | 4,00 | 4,00 | 4,00 |
| Mg2+ (jako MgCI2) | 0,20 | 0,20 | 0,20 | 0,20 |
| Ca2+ (jako CaCI2) | 0,40 | 0,40 | 0,40 | 0,40 |
| voda | 65,45 | 65 | 65,48 | 65,1 |
Všechny přípravky jsou upraveny na pH 7.
Příklady 17 až 19
Kapalné prostředky pro čištění látek (množství složek jsou uvedena v % hmotnostních) př.17 př.18 př. 19
| proteasa z příkladu 4 | 0,05 | 0,03 | 0,30 |
| alkylsulfát sodný s 12 až 14 atomy uhlíku | 20,0 | 20,0 | 20,0 |
| 2-butyloktanová kyselina | 5,0 | 5,0 | 5,0 |
| citrát sodný | 1,0 | 1,0 | 1,0 |
| alkoholethoxylát(3) s 10 atomy uhlíku | 13,0 | 13,0 | 13,0 |
| monoethanolamin | 2,50 | 2,50 | 2,50 |
| voda/propylenglykol/ethanol (100:1:1) | 58,45 | 58,47 | 58,20 |
Prostředky osobní péče
Předložené proteasy jsou zvláště vhodné pro použití v prostředcích osobní péče, jako jsou například kondicionéry pro vlasy s ponecháním nebo opláchnutím, šampony, prostředky proti akné s ponecháním nebo opláchnutím, obličejová mléka a kondicionéry, sprchové gely, mýdla, pěnící a nepěnící obličejové čistící prostředky, kosmetické prostředky, omývadla rukou, obličeje a těla, zvlhčující činidla, náplastě a masky, obličejová zvlhčující činidla bez oplachování, kosmetické a čistící polštářky, prostředky pro orální péči, prostředky pro menses a prostředky pro péči o kontaktní čočky. Předložené prostředky osobní péče obsahují jednu nebo více proteas podle předloženého vynálezu a nosič pro osobní péči.
Pro ilustraci - předložené proteasy jsou vhodné pro zahrnutí do prostředků popsaných v následujících odkazech: USA patent č. 5 641 479, Linares a spol., vydaný 24. června 1997 (prostředky pro čištění kůže), USA patent č. 5 599 549, Wivell a spol., vydaný 4. února 1997 (prostředky pro čištění kůže), USA patent č. 5 585 104,
99
9 · • · · • · ·
9999
Ha a spol., vydaný 17. prosince 1996) (prostředky pro čištění kůže), USA patent č. 5 540 852, Kefauver a spol., vydaný 30. července 1996 (prostředky pro čištění kůže), USA patent č. 5 510 050, Dunbar a spol., vydaný 23. dubna 1996 (prostředky pro čištění kůže), USA patent č. 5 612 324, Guang Lín a spol., vydaný 18. března 1997 (přípravky proti akné), USA patent č. 5 587 176, Warren a spol., vydaný 24. prosince 1996 (přípravky proti akné), USA patent č. 5 549 888, Venkateswaran, vydaný 27. srpna 1996 (přípravky proti akné), USA patent č. 5 470 884, Corless a spol., vydaný 28. listopadu 1995 (přípravky proti akné), USA patent č. 5 650 384, Gordon a spol., vydaný 22. července 1997 (sprchové gely), USA patent č. 5 607 678, Moore a spol., vydaný 4. března 1997 (sprchové gely), USA patent č. 5 624 666, Coffindaffer a spol., vydaný 29. dubna 1997 (vlasové kondicionéry a/nebo šampony), USA patent č. 5 618 524, Bolich a spol., vydaný 8. dubna 1997 (vlasové kondicionéry a/nebo šampony), USA patent č. 5 612 301, Imman, vydaný 18. března 1997 (vlasové kondicionéry a/nebo šampony), USA patent č. 5 573 709, Wells, vydaný 12. listopadu 1996 (vlasové kondicionéry a/nebo šampony), USA patent č. 5 482 703, Pings, vydaný 9. ledna 1996 (vlasové kondicionéry a/nebo šampony), znovuvydaný USA patent č. 34 584, Grote a spol., znovuvydaný 12. dubna 1994 (vlasové kondicionéry a/nebo šampony), USA patent č. 5 641 493, Dáte a spol., vydaný 24. června 1997 (kosmetické přípravky), USA patent č. 5 605 894, Blank a spol., vydaný 25. února 1997 (kosmetické přípravky), USA patent č. 5 585 090, Yoshioka a spol., vydaný 17. prosince 1996 (kosmetické přípravky), USA patent č. 4 939 179, Cheney a spol., vydaný 3. července 1990 (omývadla pro ruce, obličej a/nebo tělo), USA patent č. 5 607 980, McAtee a spol., vydaný 4. března 1997 (omývadla pro ruce, obličej a/nebo tělo), USA patent č. 4 045 364, Richter a spol., vydaný 30. srpna 1997 (kosmetické a čistící polštářky), evropská patentová přihláška 0 619 074, Touchet a spol., publikovaná 12. října 1994 (kosmetické a čistící polštářky), USA patent č. 4 975 217, Brown-Skrobot a spol., vydaný 4. prosince 1990 (kosmetické a čistící polštářky), USA patent č. 5 096 700, Seibel, vydaný 17. března 1992 (orální čistící prostředky), USA patent č. 5 028 414, Sampathkumar, vydaný 2. července 1991 (orální čistící prostředky), USA patent č. 5 028 415, Benedict a spol., vydaný 2. července 1991 (orální čistící prostředky), USA patent č. 5 028 415, vydaný 2. července 1991 (orální čistící
prostředky), USA patent č. 4 863 627, Davies a spol., 5. září 1989 (čistící roztok pro kontaktní čočky), znovuvydaný USA patent č. 32 672, Huth a spol., znovuvydaný 24. května 1988 (čistící roztoky pro kontaktní čočky), a USA patent č. 4 609 493, Schafer, vydaný 2. září 1986 (čistící roztoky pro kontaktní čočky).
Pro další ilustraci orálních čistících prostředků podle předloženého vynálezu do prostředků užitečných pro odstraňování proteinových skvrn ze zubů a zubních protéz je zahrnuto farmaceuticky přijatelné množství jedné nebo více proteas podle předloženého vynálezu. Pojem orální čistící prostředky, jak se zde používá, znamená zubní čistící prostředky, zubní pasty, zubní gely, zubní prášky, ústní vody, ústní spreje, ústní gely, žvýkačky, pastilky, sáčky, tablety, biogely, profýlaktické pasty, zubní léčivé roztoky a podobné. Orální čistící prostředky s výhodou obsahují od 0,0001 % do 20 % jedné nebo více proteas podle předloženého vynálezu, výhodněji od 0,001 % do 10 %, ještě výhodněji od 0,01 % do 5 % hmotn. z hmotnosti prostředku, a farmaceuticky přijatelný nosič. Pojem 'farmaceuticky přijatelný, jak se zde používá, znamená, že léčiva, léčivé přípravky nebo inertní složky, které tento pojem popisuje, jsou vhodné pro použití v kontaktu s tkáněmi člověka a nižších živočichů bez nepatřičné toxicity, neslučitelnosti, nestability, dráždění, alergické odpovědi a podobně, souměřitelně s odůvodněným poměrem příznivý účinek/riziko.
Farmaceuticky přijatelné složky nosiče orálního čistícího prostředku budou typicky obecně představovat od 50 % do 99,99 %, s výhodou do 65 % do 99,99 %, výhodněji od 65 % do 99 % hmotn. z hmotnosti prostředku.
Farmaceuticky přijatelné složky nosiče a případné složky, které mohou být zahrnuty v orálních čistících prostředcích podle předloženého vynálezu, jsou dobře známy odborníkům z oblasti techniky. Rozmanité typy prostředků, nosné složky a případné složky užitečné v orálních čistících prostředcích jsou popsány ve zde shora citovaných odkazech.
«·
V jiném provedení předloženého vynálezu prostředky pro čištění zubních protéz mimo ústní dutinu obsahují jednu nebo více proteas podle předloženého vynálezu. Takové prostředky pro čištění zubních protéz obsahují efektivní množství jedné nebo více proteas, s výhodou v množství od 0,0001 % do 50 %, výhodněji od 0,001 % do 35 %, ještě výhodněji od 0,01 % do 20 % hmotn. z hmotnosti prostředku a nosič pro čištní zubních protéz. Různé typy prostředků pro čištění zubních protéz, jako jsou efervescentní tablety a podobné, jsou dobře známy v oblasti techniky (viz např. USA patent č. 5 055 305, Young) a jsou obecně vhodné pro zahrnutí jedné nebo více proteas pro odstraňování proteinových skvrn ze zubních protéz.
V jiném provedení podle předloženého vynálezu - prostředky pro čištění kontaktních čoček obsahují jednu nebo více proteas podle předloženého vynálezu. Tyto prostředky pro čištění kontaktních čoček obsahují efektivní množství jedné nebo více proteas, s výhodou od 0,01 % do 50 % jedné nebo více proteas, výhodněji od 0,01 % do 20 %, ještě výhodněji od 1 % do 5 % hmotn. z hmotnosti prostředku, a nosič pro čištění kontaktních čoček. Různé typy prostředků pro čištění kontaktních čoček, jako jsou tablety, kapaliny a podobné, jsou dobře známy v oblasti techniky a jsou obecně vhodné pro zahrnutí jedné nebo více proteas podle předloženého vynálezu pro odstraňování proteinových skvrn z kontaktních čoček.
Příklady 20 až 23
Prostředky pro čištění kontaktních čoček (množství složek jsou uvedena v % hmotnostních)
| př.20 | př.21 | př.22 | př.23 | |
| proteasa z příkladu 5 | 0,01 | 0,5 | 0,1 | 2,0 |
| glukosa | 50,0 | 50,0 | 50,0 | 50,0 |
| neiontové povrchově aktivní činidlo (kopolymer | ||||
| polyoxyethylen/polyoxypropylen) | 2,0 | 2,0 | 2,0 | 2,0 |
| aniontové povrchově aktivní činidlo (sodná sůl | ||||
| polyoxyethylen-alkylfenylether- | ||||
| -sulfricesteru) | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 |
| chlorid sodný | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 |
| borax | 0,30 | 0,30 | 0,30 | 0,30 |
| voda | 45,69 | 45,20 45,60 | 43,70 |
Příklady 24 až 27
Výrobky pro mytí těla (množství složek jsou uvedena v % hmotnostních)
| př.24 | př.25 | př.26 | př.27 | |
| voda | 62,62 | 65,72 | 57,72 | 60,72 |
| dvojsodná sůl EDTA | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 |
| glycerin | 3,0 | 3,0 | 3,0 | 3,0 |
| Polyquatemium 10 | 0,4 | 0,4 | 0,4 | 0,4 |
| laurethsulfát sodný | 12,0 | 12,0 | 12,0 | 12,0 |
| kokosový amid MEA | 2,8 | 2,8 | 2,8 | 2,8 |
| laurafoacetát sodný | 6,0 | 6,0 | 6,0 | 6,0 |
| kyselina myristová | 1,6 | 1,6 | 1,6 | 1,6 |
| heptahydrát MgSO4 | 0,3 | 0,3 | 0,3 | 0,3 |
| trihydroxystearin | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
| PEG-6 kaprylové/kaprinové triglyceridy | 3,0 | - | - | - |
| sacharosové polyestery bavlníkové mastné | ||||
| kyseliny | 3,0 | - | - | - |
| sacharosové polyestery behenové mastné | ||||
| kyseliny | 3,0 | - | 4,0 | - |
| vazelína | - | 4,0 | 8,0 | - |
| minerální olej | - | - | - | 6,0 |
| DMDM hydantoin | 0,08 | 0,08 | 0,08 | 0,08 |
| proteasa z příkladu 6 | 0,1 | 2,0 | 2,0 | 5,0 |
| kyselina citrónová | 1,40 | 1,40 | 1,40 | 1,40 |
Příklady 28 až 31
Výrobky pro mytí obličeje (množství složek jsou uvedena v % hmotnostních)
9 ř « «· ·· «
«
| př.28 | př.29 | př.30 | př.31 | |
| voda | 66,52 | 65,17 | 68,47 | 68,72 |
| dvojsodná sůl EDTA | 0,1 | 0,1 | 0,2 | 0,2 |
| kyselina citrónová | - | - | 1,4 | 1,4 |
| laureth-3-sulfát sodný | 3,0 | 3,5 | - | - |
| laureth-4-karboxylát sodný | 3,0 | 3,5 | - | - |
| laureth-12 | 1,0 | 1,2 | - | - |
| Polyquatemium 10 | - | - | 0,4 | 0,4 |
| Polyquatemium 25 | 0,3 | 0,3 | - | - |
| glycerin | 3,0 | 3,0 | 3,0 | 3,0 |
| lauroamfoacetát sodný | - | - | 6,0 | 6,0 |
| kyselina laurová | 6,0 | 6,0 | 3,0 | 3,0 |
| kyselina myristová | - | - | 3,0 | 3,0 |
| heptahydrát MgSO4 | 2,3 | 2,0 | 2,0 | 2,0 |
| triethanolamin | 4,0 | 4,0 | 4,0 | 4,0 |
| trihydroxystearin | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
| sacharosové polyestery behenové mastné | ||||
| kyseliny | 2,0 | 2,0 | - | - |
| sacharosové polyestery bavlníkové mastné | ||||
| kyseliny | 3,0 | 2,0 | - | - |
| PEG-6 kaprylové/kaprinové triglyceridy | - | - | - | 2,0 |
| vazelína | - | - | 4,0 | - |
| minerální olej | - | - | - | 2,0 |
| kokosový amidopropyl-betain | 2,0 | 3,0 | 1,8 | 1,8 |
| lauryl-dimethylaminoxid | 1,0 | 1,2 | 1,2 | 1,2 |
| Dex Panthenol | 1,0 | 0,25 | 0,25 | - |
| DMDM hydantoin | 0,08 | 0,08 | 0,08 | 0,08 |
| proteasa z příkladu 2 | 1,0 | 2,0 | 0,5 | 0,5 |
| vůně | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 |
Příklady 32 až 33
Prostředek pro zvlhčování kůže bez oplachování (množství složek jsou uvedena v % hmotnostních)
| př.32 | př.33 | |
| glycerin | 5,0 | - |
| kyselina stearová | 3,0 | - |
| isoparafin s 11 až 13 atomy uhlíku | 2,0 | - |
| stearát glykolu | 1,5 | - |
| propylenglykol | - | 3,0 |
| minerální olej | 1,0 | 10,0 |
| sezamový olej | - | 7,0 |
| vazelína | - | 1,8 |
| triethanolamin | 0,7 | - |
| cetylacetát | 0,65 | - |
| glyceryl-stearát | 0,48 | 2,0 |
| TEA stearát | - | 2,5 |
| cetylalkohol | 0,47 | - |
| lanolinový alkohol | - | 1,8 |
| DEA-cetylfosfát | 0,25 | - |
| methylparaben | 0,2 | 0,2 |
| propylparaben | 0,12 | 0,1 |
| Carbomer 934 | 0,11 | - |
| dvojsodná sůl EDTA | 0,1 | - |
| proteasa z příkladu 4 | 0,1 | 0,5 |
| voda | 84,32 | 71,1 |
• · · ·
Příklad 34
Prostředek ve formě čistícího polštářku (množství složek jsou uvedena v % hmotnostních)
| př.32 | |
| propylenglykol | 1,0 |
| laurylsulfát amonný | 0,6 |
| kyselina jantarová | 4,0 |
| jantaran sodný | 3,2 |
| Triclosan(R) | 0,15 |
| proteasa z příkladu 1 | 0,05 |
| voda | 91,0 |
Shora uvedený prostředek je impregnován na tkaný absorpční list sestávající z celulosy a/nebo polyesteru v množství 250 % hmotn. z hmotnosti absorpčního listu.
Claims (12)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Proteasa podobající se subtilisinu, která obsahuje intramolekulární zesíťování, při čemž intramolekulární zesíťování obsahuje vazebnou část mezi aminokyselinou prvního zbytku proteasy a aminokyselinou druhého zbytku proteasy.
- 2. Proteasa podle nároku 1, v němž alespoň jeden zbytek se vyskytuje v oblasti vybrané ze skupiny sestávající z:a) aminové koncové oblasti odpovídající poloze 1 subtilisinu BPN',b) oblasti prvního epitopu odpovídající polohám 70 až 84 subtilisinu BPN',c) oblasti druhého epitopu odpovídající polohám 103 až 126 subtilisinu BPN',d) oblasti třetího epitopu odpovídající polohám 220 až 246 subtilisinu BPN',e) oblasti místa prvního štěpení odpovídajícího polohám 156 až 165, 179, 186, 191 až 196 a 259 až 262 subtilisinu BPN',f) oblasti místa druhého štěpení odpovídajícího polohám 12 až 24, 27, 84 až 88, 271 a 274 subtilisinu BPN',g) oblasti místa prvního blízkého epitopu odpovídajícího polohám 2, 3, 4, 5, 6, 7, 12, 17, 36, 40, 41, 43, 44, 45, 67, 86, 87, 89, 206, 209, 210, 212, 213, 214, 215 a 216 subtilisinu BPN',h) oblasti místa druhého blízkého epitopu odpovídajícího polohám 25, 26, 27, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 91, 99, 100, 101, 102, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 136, 137, 138, 140, 141, 144 a 145 subtilisinu BPN', ai) oblasti místa třetího blízkého epitopu odpovídajícího polohám 9, 10, 22, 23, 24, 62, 63, 143, 146, 154, 155, 156, 157, 172, 173, 187, 189, 195, 197, 203, 204, 253, 254, 256, 265, 267, 269, 271, 272 a 275 subtilisinu BPN'.
- 3. Proteasa podle nároku 2, v němž oblast prvního blízkého epitopu odpovídá polohám 2, 3, 4, 5, 6, 7, 12, 17, 40, 41, 43, 67, 86, 87, 89, 209, 214 a 215 subtilisinu BPN', oblast druhého blízkého epitopu odpovídá polohám 27, 47, 48, 50, 52,102, 127, 128, 130, 131, 132,134, 138 a 141 subtilisinu BPN' a oblast třetího blízkého epitopu odpovídá polohám 22, 23, 24, 143, 146, 155, 173, 189, 197, 203, 204, 253, 254, 265 a 275 subtilisinu BPN'.
- 4. Proteasa podle nároku 3, v němž oblast místa druhého štěpení odpovídá polohám 13 až 24 subtilisinu BPN'.
- 5. Proteasa podle nároku 4, v němž oblast místa prvního štěpení odpovídá polohám 156 až 165, 170,191 až 195, 261 a 262 subtilisinu BPN'.
- 6. Proteasa podle nároku 1, v němž oblast prvního epitopu odpovídá polohám 75 až 83 subtilisinu BPN'.
- 7. Proteasa podle nároku 6, v němž aminokyselina prvního zbytku znamená lysin nebo v němž první zbytek odpovídá poloze 1 subtilisinu BPN' a v němž aminokyselina druhého zbytky znamená cystein.
- 8. Proteasa podle nároku 6, v němž se každý první i druhý zbytek vyskytuje v oblasti vybrané ze skupiny sestávající z oblasti aminového konce, oblasti prvního epitopu, oblasti druhého epitopu, oblasti třetího epitopu, oblasti místa prvního štěpení, oblasti místa druhého štěpení, oblasti prvního blízkého epitopu, oblasti druhého blízkého epitopu a oblasti třetího blízkého epitopu.
- 9. Proteasa podle nároku 8, v němž první zbytek odpovídá poloze 1 subtilisinu BPN' a druhý zbytek se vyskytuje v oblasti vybrané ze skupiny sestávající z oblasti prvního epitopu, oblasti druhého epitopu, oblasti třetího epitopu, oblasti místa prvního štěpení, oblasti místa druhého štěpení, oblasti prvního blízkého epitopu, oblasti druhého blízkého epitopu a oblasti třetího blízkého epitopu.·· «· «» • · · » · · » · • ·· · · · • · · · · · A • * * · * · • A A A » A »· ·»·*AA AA • A A · * · ·A · A • · ·AA ·»··
- 10. Proteasa podle nároku 9, v němž vazebná část obsahuje alkylsukcinimid, druhý zbytek se vyskytuje v oblasti prvního epitopu a druhý zbytek odpovídá poloze 78 subtilisinu BPN'.
- 11. Čistící prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje proteasu podle nároku 1 a nosič čistícího prostředku.
- 12. Prostředek pro osobní péči, vyznačující se t í m, že obsahuje proteasu podle nároku 1 a nosič pro osobní péči.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US14497799P | 1999-07-22 | 1999-07-22 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2002210A3 true CZ2002210A3 (cs) | 2002-05-15 |
Family
ID=22511035
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2002210A CZ2002210A3 (cs) | 1999-07-22 | 2000-07-11 | Proteasa podobající se subtilisinu obsahující intramolekulární zesí»ování a její pouľití |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1196546A2 (cs) |
| JP (1) | JP2003505068A (cs) |
| KR (1) | KR20020029371A (cs) |
| CN (1) | CN1369008A (cs) |
| AU (1) | AU5928200A (cs) |
| BR (1) | BR0012570A (cs) |
| CA (1) | CA2379718A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ2002210A3 (cs) |
| MX (1) | MXPA02000835A (cs) |
| WO (1) | WO2001007576A2 (cs) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102335101A (zh) * | 2011-02-18 | 2012-02-01 | 苏州润新生物科技有限公司 | 一种祛斑功能的化妆品 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BE795238A (fr) * | 1972-02-09 | 1973-08-09 | Schering Ag | Derives d'insuline reticules de maniere intramoleculaire, leur procede de preparation et leur utilisation |
| US4853871A (en) * | 1987-04-06 | 1989-08-01 | Genex Corporation | Computer-based method for designing stablized proteins |
| US5543302A (en) * | 1988-05-27 | 1996-08-06 | Solvay Enzymes, Inc. | Proteases of altered stability to autolytic degradation |
| FI932561A7 (fi) * | 1990-12-05 | 1993-06-04 | Novozymes As | Proteiinit, joilla on muuttuneet epitoopit ja menetelmiä niiden valmistamiseksi |
-
2000
- 2000-07-11 MX MXPA02000835A patent/MXPA02000835A/es unknown
- 2000-07-11 CN CN00810743A patent/CN1369008A/zh active Pending
- 2000-07-11 EP EP00945316A patent/EP1196546A2/en not_active Withdrawn
- 2000-07-11 CZ CZ2002210A patent/CZ2002210A3/cs unknown
- 2000-07-11 AU AU59282/00A patent/AU5928200A/en not_active Abandoned
- 2000-07-11 KR KR1020027000940A patent/KR20020029371A/ko not_active Ceased
- 2000-07-11 WO PCT/US2000/018853 patent/WO2001007576A2/en not_active Application Discontinuation
- 2000-07-11 JP JP2001512847A patent/JP2003505068A/ja not_active Withdrawn
- 2000-07-11 BR BR0012570-9A patent/BR0012570A/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-07-11 CA CA002379718A patent/CA2379718A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| MXPA02000835A (es) | 2002-07-30 |
| WO2001007576A2 (en) | 2001-02-01 |
| AU5928200A (en) | 2001-02-13 |
| KR20020029371A (ko) | 2002-04-18 |
| BR0012570A (pt) | 2002-06-04 |
| CN1369008A (zh) | 2002-09-11 |
| EP1196546A2 (en) | 2002-04-17 |
| WO2001007576A3 (en) | 2001-06-07 |
| JP2003505068A (ja) | 2003-02-12 |
| CA2379718A1 (en) | 2001-02-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3642735B2 (ja) | プロテアーゼ複合体 | |
| KR20010034697A (ko) | 아미노산 치환을 갖는 세린 프로테아제 변이체 | |
| US6586223B1 (en) | Subtilisin protease variants having amino acid substitutions in defined epitope regions | |
| US6586224B1 (en) | Subtilisin protease variants having amino acid deletions and substitutions in defined epitope regions | |
| US6566115B1 (en) | Protease conjugates having sterically protected clip sites | |
| KR20010052223A (ko) | 아미노산 결실 및 치환을 갖는 세린 프로테아제 변이체 | |
| US6946128B1 (en) | Protease conjugates having sterically protected epitope regions | |
| AU777550B2 (en) | Protease conjugates having sterically protected epitope regions | |
| CZ2002210A3 (cs) | Proteasa podobající se subtilisinu obsahující intramolekulární zesí»ování a její pouľití | |
| CZ20003396A3 (cs) | Proteázový konjugát a prostředek osobní hygieny | |
| MXPA00009385A (en) | Protease conjugates | |
| CZ20003397A3 (cs) | Varianta serinové proteázy; prostředek pro osobní hygienu, čistící prostředek, mutovaný gen | |
| CZ20003394A3 (cs) | Varianta serinové proteázy, mutovaný gen, prostředek pro osobní hygienu |