KR20020022508A - Method for Manufacturing PHA Using Fermentation Broth of Food Waste - Google Patents

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KR20020022508A
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fermentation
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장호남
최동원
이우기
이상엽
권선훈
임성진
이평천
신경섭
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이우기
이원바이오텍주식회사
윤덕용
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Abstract

PURPOSE: Provided is a preparation method of polyhydroxyalkanoate (PHA) using fermentation liquid of food waste as a fermentation medium, thereby producing PHA such as poly-3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate (PHB/V) cost effectively. CONSTITUTION: The preparation method of PHA comprises the steps of: culturing a microorganism such as recombinant E. coli, or Alcaligenes sp. at 25-45deg.C. and at pH 5.0-8.0 by fed-batch culture or batch culture, using a culture medium containing fermentation liquid of food waste; and obtaining PHA from the culture.

Description

음식물 쓰레기 발효액을 이용한 PHA의 생산방법 {Method for Manufacturing PHA Using Fermentation Broth of Food Waste}Method for Manufacturing PHA Using Fermentation Broth of Food Waste

미생물의 배양을 통한 PHA 생산에 있어서 전체 공정의 경제성에 크게 영향을 미치는 배지 성분 중 프로피온 산(propionic acid)을 폐기물인 음식물 쓰레기를 발효하여 얻은 발효액으로 대체하여 PHA 대량생산을 위한 생산비용 절감을 목적으로 한다.To reduce the production cost for mass production of PHA by replacing the propionic acid, which is a medium component that greatly affects the economics of the whole process in the production of PHA through cultivation of microorganisms, with fermentation broth obtained by fermenting food waste as waste. It is done.

본 발명은 음식물 쓰레기 발효액을 이용한 PHA 생산방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로 본 발명은 미생물을 이용하여 PHA를 생산하는 발효공정에 있어서 음식물 쓰레기 발효액을 PHA 발효 미생물 배양배지에 포함시켜 이용함으로써 특히 PHB/V 생산에서 프로피온 산과 같은 유기산을 대체하여 경제적으로 PHA를 생산할 수 있는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a PHA production method using a food waste fermentation broth. More specifically, in the fermentation process of producing PHA using microorganisms, the food waste fermentation broth is included in the PHA fermentation microorganism culture medium, and in particular, in the production of PHB / V, PHA is economically substituted for organic acids such as propionic acid. It is about how it can produce.

최근 범용성 고분자에 의한 토양오염문제가 심각해지면서 이를 대체할 수 있는 생분해성 고분자의 개발이 전세계적으로 급속히 진전되고 있다. 현재 알려진 생분해성 고분자는 전분과 기존의 석유화학고분자를 블렌딩한 전분계 고분자, polycaprolactam, 유산 고분자, PHB, PHO, PHB/V 등, 폴리아미드와 이들의 혼합물 등이다. 1993년 이후 지금까지 제품화된 생분해성 고분자는 전분계 고분자가 주를 이루어 왔으나 생분해도에 있어 문제점이 지적되면서 근본적인 개선이 요구되고 있다. 생분해성 고분자는 쇼핑백, 쓰레기 봉투, fast-food 포장재, 농업용 필름, 개인위생용품, 충격흡수용 충진제 등의 잠재 용도를 지니고 있으며 현재 국내에서는 쓰레기 봉투를 생분해성 고분자로의 대체가 시행 중이다. 보고에 의하면 유럽과 북미의 잠재적 시장규모는 2002년까지 50만톤/년 정도로 추정되고 있으며 유럽시장이 먼저 발달될 것으로 예상되고 있다. 추정 생산단가는 kg당 2- 6 불 정도이고 PHA와 같은 완전분해성 고분자가 2002년 생분해성 고분자 시장의 약 90 %를 차지할 것으로 예상되고 있다. 현재 생분해성 고분자의 가격은 kg당 2-6 불로 너무 고가이며 막대한 잠재 시장에 맞추어 큰 산업으로 성장하려면 kg당 2 불 이하로 인하되어야 한다. 폴리에틸렌의 경우 kg당 0.8 불, 폴리스티렌의 경우 kg당 1 불에 비하면 매우 높지만 제품가격에 최종 폐기물 처리비용을 포함시키는 가격산정방법을 도입하면 비슷한 가격대가 형성될 것으로 기대하고 있으며 앞으로 범용성 고분자에 비해 제품 물성이 부족하다는 인식과 생분해도에 대한 의심을 해결해야한다.Recently, as the problem of soil pollution caused by general purpose polymers becomes serious, development of biodegradable polymers that can replace them is rapidly progressing worldwide. Currently known biodegradable polymers are starch-based polymers blending starch and conventional petrochemical polymers, polycaprolactam, lactic acid polymers, PHB, PHO, PHB / V and the like, and polyamides and mixtures thereof. Since 1993, starch-based polymers have been mainly used for commercialized biodegradable polymers. However, as the problems in biodegradability are pointed out, fundamental improvement is required. Biodegradable polymers have potential uses such as shopping bags, garbage bags, fast-food packaging, agricultural films, personal hygiene products, and impact absorbing fillers. Currently, biodegradable polymers are being replaced by biodegradable polymers. According to the report, the potential market size of Europe and North America is estimated to be about 500,000 tons / year by 2002, and the European market is expected to develop first. Estimated production costs range from $ 2 to $ 6 / kg and fully degradable polymers such as PHA are expected to account for about 90% of the biodegradable polymer market in 2002. Currently, biodegradable polymers are priced at $ 2-6 per kg, which is too expensive and must be lowered to under $ 2 per kg to grow into a large industry for a huge potential market. Although it is much higher than $ 0.8 per kg for polyethylene and $ 1 per kg for polystyrene, it is expected that a similar price range will be formed by introducing a price estimation method that includes the final waste disposal cost in the product price. Recognition of the lack of physical properties and the suspicion of biodegradation should be resolved.

현재, ZENECA Bio Products (미국의 Monsanto사와 합병)에서는 이미 상업화에 성공하였고 포도당과 프로피온 산을 이용하여 알칼리게네스 유트로퍼스(Alcaligenes eutrophus)에 의해 PHB와 PHB/V를 'Biopol'이라는 상품명으로 시판하고 있다. 일본에서는 Doi 그룹을 필두로 'Biopol'과는 다른 새로운 구조의 PHB/V를 개발하였고 PHB/V의 공중합체 생산기술도 확보하고 있다. 미국에서도 생분해성 고분자 연구 콘소시움을 형성하여 PHB를 포함한 여러종류의 생분해성 고분자에 대한 연구를 활발히 진행하고 있으며 소머빌(Sommerville, Carnegie Institution) 그룹에서는 형질전환 식물에서 PHB합성을 통하여 식물체에서 생분해성 고분자를 생산하기 위한 연구를 활발히 수행하고 있다. 특히, 미국에서는 이 생분해성 고분자의 가격을 kg당 1.5-2.5 불로 가격(건조중량비 5 %)을 내리는 것이 가능하다고 보고하였으며, 이와 같이 생산가격을 내리는 것이 실용화의 열쇠로서 계속 연구되어지고 있는 실정이다.Currently, ZENECA Bio Products (merged with Monsanto, USA) has already commercialized and marketed PHB and PHB / V under the trade name 'Biopol' by Alcaligenes eutrophus using glucose and propionic acid. Doing. In Japan, the Doi Group has developed PHB / V with a new structure different from 'Biopol', and has also secured PHB / V copolymer production technology. Biodegradable Polymer Research Consortiums in the United States are actively conducting research on various biodegradable polymers, including PHB. In the Somerville (Carnegie Institution) group, biodegradable polymers in plants are transformed through PHB synthesis in transgenic plants. We are actively conducting research to produce. In particular, in the United States, it is possible to reduce the price of the biodegradable polymer at a price of $ 1.5-2.5 / kg (5% of dry weight), and the reduction of the production price is being studied as a key to practical use. .

이에 본 발명자들은 PHA 발효 미생물의 배양배지에 PHA 생산에 필요한 프로피온 산과 같은 고가의 유기산을 대체할 수 있는 새로운 배지를 개발하고 이를 이용하여 고농도 PHA를 경제적으로 생산할 수 있는 기술을 확립하고자 한다.Accordingly, the present inventors have developed a new medium that can replace expensive organic acids, such as propionic acid required for PHA production, in a culture medium of PHA fermented microorganisms, and use this to establish a technology that can economically produce high concentration PHA.

결국, 본 발명의 주된 목적은 음식물 쓰레기 발효액을 PHA 배양배지에 포함시켜 이용하여 고농도의 PHA를 낮은 배지비용으로 생산함으로써, 공정의 경제성을 크게 향상시킬 수 있는 PHA의 경제적인 생산 방법을 제공하는 것이다.After all, the main object of the present invention is to provide a method for producing an economical PHA that can significantly improve the economics of the process by producing a high concentration of PHA at low media cost by using a food waste fermentation broth in a PHA culture medium. .

도 1은 음식물 쓰레기 발효액을 배양배지로 이용한 PHA 발효에 있어서, 시간에 따른 세포의 농도, PHA의 농도 등를 나타낸 그래프이다.1 is a graph showing the concentration of cells, concentration of PHA and the like over time in PHA fermentation using a food waste fermentation broth as a culture medium.

본 발명의 음식물 쓰레기 발효액을 이용한 PHA의 생산방법은 음식물 쓰레기 발효액을 포함하는 배양배지를 이용하여 PHA 발효미생물을 배양하고, 전기 배양물로부터 PHA를 수득하는 공정을 포함한다. 이때, 음식물 쓰레기 발효액의 주성분인유기산의 반응조 내에서의 농도는 사용하는 미생물의 종류 및 포도당의 사용양에 따라 그 사용양이 달라질 수 있으나 10 g/L 이하게 되게 조절하는 것이 보통이다. 일반적으로 고농도 세포배양을 위해서 유가식 배양법을 사용할 때 음식물 쓰레기 발효액은 농축되어 포도당과 함께 공급용액으로 사용된다. 음식물 쓰레기 발효액은 음식물 쓰레기를 혐기성 발효하여 얻을 수 있는데, 참고로 국내특허 출원번호 제 98-39798호 에는 이의 제조방법에 대한 자세한 방법이 기술되어 있다. 배양배지는 PHA 발효미생물을 배양할 수 있는 포도당으로 대표될 수 있는 탄소원 및 미량의 금속이온과 무기염이 포함된 배양배지를 사용할 수 있으며, PHA 발효미생물 음 재조합 대장균 또는 알칼리게네스 속의 통상적인 PHA 발효미생물을 이용할 수 있다. 구체적으로 음식물 쓰레기 발효액을 포함하는 배양배지를 적용시킬 수 있는 PHA 발효미생물로는 재조합 대장균, 알칼리게네스 유트로퍼스, 알칼리게네스 레이터스(Alcaligenes latus) 등이 있다.The production method of PHA using the food waste fermentation broth of the present invention includes a step of culturing the PHA fermentation microorganisms using a culture medium containing the food waste fermentation broth and obtaining PHA from the electric culture. At this time, the concentration of the organic acid, the main component of the food waste fermentation broth, in the reaction tank may vary depending on the type of microorganism used and the amount of glucose, but is usually adjusted to be 10 g / L or less. In general, when using fed-batch culture for high concentration cell culture, food waste fermentation broth is concentrated and used as feed solution with glucose. Food waste fermentation broth can be obtained by anaerobic fermentation of food waste. For reference, Korean Patent Application No. 98-39798 describes a detailed method for the preparation thereof. The culture medium may be a culture medium containing a carbon source and trace metal ions and inorganic salts which may be represented by glucose capable of culturing PHA fermented microorganisms. Fermentation microorganisms can be used. Specifically, PHA fermentation microorganisms to which a culture medium containing a food waste fermentation broth may be applied include recombinant E. coli, Alkali genes Eutropus , Alkali genes latus ( Alcaligenes latus ).

아울러 PHA 발효미생물의 배양은 통상적인 유가식 배양을 이용할 수 있으며 각 PHA 발효미생물의 특성에 맞는 배양조건에 의하여 25내지 45℃의 온도 및 pH 6.0 내지 8.0 범위에서 배양을 수행한다. 전술한 방법에 의하여 PHA 발효미생물의 배양이 이루어진 후에는, 원심분리, 용해세제 처리 등의 일련의 공지된 회수공정을 통하여 PHA를 배양물로부터 용이하게 수득할 수 있다.In addition, the culture of PHA fermented microorganisms can be used a conventional fed-batch culture, and the culture is carried out at a temperature of 25 to 45 ℃ and pH 6.0 to 8.0 by the culture conditions suitable for the characteristics of each PHA fermented microorganism. After culturing the PHA fermentation microorganism by the above-described method, PHA can be easily obtained from the culture through a series of known recovery processes such as centrifugation, dissolution detergent treatment and the like.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, it will be apparent to those of ordinary skill in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples in accordance with the gist of the present invention. .

실시예 1: 음식물 쓰레기 발효액을 이용한 PHA 생산 Example 1 PHA Production Using Food Waste Fermentation Broth

음식물 쓰레기 발효액의 순수 유기산 대체 가능성을 관찰하기 위해서 500 mL 용량의 플라스크에 PHA 발효미생물의 2단계 플라스크 배양을 수행하였다. 배양액의 부피는 100 mL이고, 사용된 PHA 발효미생물은 알칼리게네스 유트로퍼스(Alcaligenes eutrophus, NCIMB 11599)이고 전기 균주를 글리세롤이 포함된 발효배지에서 1 mL을 분주한 다음 -75 ℃ 냉동고에 보관하고 발효의 배양종균으로 사용하였다. 1단계 배양을 위한 배지는 포도당 10 g/L, 효모추출물 10 g/L, 고기추출물 5 g/L, (NH4)2SO45 g/L 이고 2단계 배양을 위한 배지는 포도당 10 g/L, (NH4)2SO41 g/L, MgSO4·7H20 0.2 g/L, KH2PO41.5 g/L, Na2HPO4·12H2O 9g/L과 아세트산, 프로피온산, 뷰티릭산, 발레릭산 등 혼합유기산을 5.6 g/L 포함하는 음식물 쓰레기 발효액으로 제조되었다. 먼저 100 mL의 1단계 배양배지에 배양 종균을 접종하고 24시간동안 배양한 다음 원심분리하여 0.9% NaCl 용액으로 1회 세척하여 세포를 수득하였고 이를 100 mL 2단계 배양배지에 투입하여 48시간동안 배양하여 PHA를 포함하는 세포를 얻었다. 배양액 중의 세포농도는 채취한 배양액을 원심분리하여 상등액을 버리고 오븐에서 건조하여 세포건조질량을 측정하여 측정하였고, 배양액 중의 포도당의 농도는 글루코카드(KDK Co., 일본)를 이용하여 측정하였다. PHA의 분석은 불꽃이온화 검출기가 부착된 GC로 측정하였고 이때 사용된 컬럼은 SPB-5(Supelco, 미국)이었다. 그 결과 세포농도 1.4 g/L, PHB/V 0.04 g/L를 얻어 PHA생산 가능성을 확인하였다. 이때 세포중 PHA 분율은 2.8 % 였고 PHB/V에서 3HV의 분율은 12.6 % 였다.In order to observe the possibility of pure organic acid replacement of food waste fermentation broth, a two-step flask culture of PHA fermented microorganisms was performed in a 500 mL flask. The volume of the culture was 100 mL, the PHA fermentation microorganism used was Alcaligenes eutrophus (NCIMB 11599), and the strain was dispensed in a 1 mL aliquot of fermentation medium containing glycerol and stored in a freezer at -75 ° C. And used as a culture seed of the fermentation. The medium for one-step culture is 10 g / L glucose, 10 g / L yeast extract, 5 g / L meat extract, (NH 4 ) 2 SO 4 5 g / L and the medium for two-step culture is 10 g / L glucose L, (NH 4 ) 2 SO 4 1 g / L, MgSO 4 .7H 2 0 0.2 g / L, KH 2 PO 4 1.5 g / L, Na 2 HPO 4 · 12H 2 O 9 g / L and acetic acid, propionic acid, It was prepared as a food waste fermentation broth containing 5.6 g / L of mixed organic acids such as butyric acid and valeric acid. First, inoculate the culture seed in 100 mL of the first stage culture medium, incubate for 24 hours, centrifuge and wash once with 0.9% NaCl solution to obtain cells. To obtain cells containing PHA. The cell concentration in the culture was measured by centrifuging the collected culture solution, discarding the supernatant, drying in an oven, and measuring the dry mass of the cell. The concentration of glucose in the culture was measured using glucocard (KDK Co., Japan). The analysis of PHA was measured by GC with a flame ionization detector and the column used was SPB-5 (Supelco, USA). As a result, the cell concentration was 1.4 g / L, PHB / V 0.04 g / L to confirm the possibility of PHA production. The PHA fraction in the cells was 2.8% and the fraction of 3HV in PHB / V was 12.6%.

실시예 2: 음식물 쓰레기 발효액을 이용한 유가식 배양에 의한 PHA의 생산 Example 2 Production of PHA by Fed-Fed Culture Using Food Waste Fermentation Broth

실시예 1에서와 같은 방법으로 1단계 배양한 100 mL 배양액을 발효 부피 1L의 발효조에 접종하였다. 발효조는 포도당 농도를 30 g/L 이내로 유지하고 30시간까지는 암모니아수 원액을, 그 이후에는 5 N NaOH 용액을 이용하여 PH 6.8로 배양배지의 pH를 유지시켰으며 발효온도는 30℃를 유지하여 유가식 배양을 실시하였다. 이때 발효조안의 초기 배양배지는 포도당 20 g/L, (NH4)2SO44 g/L, MgSO4·7H20 1.2 g/L, KH2PO43.1 g/L, 시트릭산 1.7g/L, 미량금속원소 용액 1mL로 구성되었고, 유가식 배양에 사용되는 공급용액으로는 약 30시간까지는 700 g/L의 포도당 용액, 그 이후에는 500 g/L의 포도당 용액과 농축된 음식물 쓰레기 발효액 160 g/L의 혼합액이 사용되었다. 이 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 확인해 볼 때 37시간까지 발효하여 건조세포질량 57 g/L, PHB/V 농도 13g/L를 얻을 수 있었으며 이때 세포중 PHA의 분율은 22.7 %, PHB/V 중 3HV의 분율은 23 % 었다. 이상과 같이 음식물 쓰레기 발효액을 이용하여 유가식 배양을 함으로써 PHA를 효과적으로 생산할 수 있음을 확인함으로써 PHA 생산에 필수적인 프로피온산 등 유기산을 폐기물인 음식물 쓰레기로부터 얻은 값싼 발효액으로 대체할 수 있음을 확인하였다.A 100 mL culture medium cultured in one step was inoculated into a fermenter with a fermentation volume of 1 L in the same manner as in Example 1. The fermenter maintained the concentration of glucose within 30 g / L and maintained the pH of the culture medium at pH 6.8 using ammonia water solution for up to 30 hours, then using 5 N NaOH solution and fermentation temperature at 30 ° C. The culture was carried out. The initial culture medium in the fermentation tank was glucose 20 g / L, (NH 4 ) 2 SO 4 4 g / L, MgSO 4 · 7H 2 0 1.2 g / L, KH 2 PO 4 3.1 g / L, citric acid 1.7g / L, 1 mL of trace metal element solution, feed solution for fed-batch culture, 700 g / L glucose solution up to about 30 hours, then 500 g / L glucose solution and concentrated food waste fermentation 160 g / L of mixed liquor was used. This result is shown in FIG. As shown in FIG. 1, the fermentation was performed for 37 hours to obtain a dry cell mass of 57 g / L and a PHB / V concentration of 13 g / L. In this case, the fraction of PHA in cells was 22.7% and the fraction of 3HV in PHB / V was 23%. It was. As mentioned above, it was confirmed that the PHA can be effectively produced by the fed-batch culture using the food waste fermentation broth, so that organic acids such as propionic acid, which is essential for PHA production, can be replaced with cheap fermentation broth obtained from the waste food waste.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당 업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.As described above in detail a specific part of the content of the present invention, for those skilled in the art, such a specific description is only a preferred embodiment, which is not limited by the scope of the present invention Will be obvious. Thus, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 음식물 쓰레기 발효액을 PHA 발효미생물 배양배지에 혼합사용하여, PHA를 낮은 배지비용으로 경제적으로 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명에 의하면, PHA 발효미생물의 배양을 통한 PHA 생산에 있어서 프로피온산 등의 유기산을 이용할 때와 비교하여 낮은 배지비용으로 37시간에 13 g/L의 PHA를 생산할 수 있었다. 이러한 결과는 종래의 방법들과 비교해 볼 때, 전체 공정의 경제성을 크게 차지하는 배지성분인 프로피온 산 등 유기산을 폐기물인 음식물 쓰레기의 발효액을 이용하여 완전히 대체할 수 있다는 것에 중요한 의미가 있는바, PHA의 대량 생산을 위한 생산비용을 획기적으로 줄일 수 있다.As described and demonstrated in detail above, the present invention provides a method for economically producing PHA at low media cost by using food waste fermentation broth mixed in a PHA fermentation microorganism culture medium. According to the present invention, it was possible to produce 13 g / L of PHA in 37 hours at a lower medium cost than in the case of using organic acids such as propionic acid in producing PHA through culturing PHA fermentation microorganisms. This result has a significant meaning that organic acids such as propionic acid, which is a medium component of the overall process economy, can be completely replaced by using a fermentation broth of waste food waste compared to conventional methods. The production cost for mass production can be drastically reduced.

Claims (4)

음식물 쓰레기 발효액을 포함하는 배양배지를 이용하여 PHA 발효미생물을 배양하고, 전기 배양물로부터 PHA를 수득하는 공정을 포함하는 음식물 쓰레기 발효액을 이용한 PHA의 생산방법A method for producing PHA using a food waste fermentation broth comprising culturing the PHA fermentation microorganisms using a culture medium containing food waste fermentation broth and obtaining PHA from the electric culture. 제 1항에 있어서,The method of claim 1, 음식물 쓰레기 발효액을 혼합 배양배지로 이용할 때, 발효액 내에 아세트 산, 프로피온 산, 뷰티릭 산, 발레릭 산, 카프로익 산 등 각 종 유기산 중 하나 혹은 그 이상의 조합으로 이루어진 혼합 유기산을 이용하여 PHA 발효미생물을 배양하고, 전기 배양물로부터 PHB/V 등 각종 PHA를 수득하는 것을 특징으로하는When food waste fermentation broth is used as a mixed culture medium, PHA fermentation microorganisms are mixed with fermentation broth using mixed organic acids including one or more combinations of organic acids such as acetic acid, propionic acid, butyric acid, valeric acid, and caproic acid. To obtain various PHAs such as PHB / V from the electric culture 음식물 쓰레기 발효액을 이용한 PHA의 생산방법Production method of PHA using food waste fermentation broth 제 1항에 있어서,The method of claim 1, PHA 발효미생물은 재조합 대장균 또는 알칼리게네스 속인 것을 특징으로하는PHA fermentation microorganism is characterized in that the genus of recombinant E. coli or 음식물 쓰레기 발효액을 이용한 PHA의 생산방법Production method of PHA using food waste fermentation broth 제 1항에 있어서,The method of claim 1, 25 내지 45℃ 온도 및 pH 5.0 내지 8.0 범위에서, 회분식 및 유가식으로 배양하는 것을 특징으로하는Characterized in a batch and fed-batch culture at a temperature of 25 to 45 ℃ and pH 5.0 to 8.0 음식물 쓰레기 발효액을 이용한 PHA의 생산방법Production method of PHA using food waste fermentation broth
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