KR20020016707A

KR20020016707A - 람노리피드와 메칠 람노리피드를 동시에 생산하는해양세균 슈도모나스 아에루기노사 비와이케이-2

Info

Publication number: KR20020016707A
Application number: KR1020000049891A
Authority: KR
Inventors: 김봉조; 김학주; 하순득
Original assignee: 공재열
Priority date: 2000-08-26
Filing date: 2000-08-26
Publication date: 2002-03-06
Also published as: KR100458136B1

Abstract

본 발명은 육상과 해양의 유출유 정화에 동시에 사용할 수 있고 산업적으로 다양하게 사용되어질 수 있는 생물유화제 생산 균주인 해양 세균 슈도모나스 아에루기노사 비와이케이-2를 해양에서 분리하는 기술과 이들이 생산하는 생물유화제의 효율적인 분리 정제 기술에 있으며, 상기 균주는 토양유래 슈도모나스 아에루기노사 균주와는 다른 당지질 생물유화제인 람노리피드와 메칠람노리피드를 동시에 생산하는 독특한 생육 특성을 지니고 있다

Description

람노리피드와 메칠 람노리피드를 동시에 생산하는 해양세균 슈도모나스 아에루기노사 비와이케이-2{THE MARINE BACTERIUM PSEUDOMONAS AERUGINOSA BYK-2 PRODUCING RHAMNOLIPID AND METHYL RHAMNOLIPID SIMULTANEOUSLY}

본 발명은 육상과 해상에서 유류 분해능이 우수하고 산업적으로 다양하게 사용되어질 수 있는 생물유화제를 개발하기 위한, 해양세균의 분리기술과 생육특성 그리고생물유화제 분리ㆍ정제 등에 관한 기술로서 해양에서 분리한 해양세균 슈도모나스 아에루기노사 비와이케이-2(Pseudomonas aeruginosa BYK-2)(생명공학연구소 기탁일자 2000년 4월 27일)(미생물 수탁번호: KCTC 18012P)에 관한 것이다.

통상적으로, 슈도모나스 아에루기노사 균주에 관한 연구는 토양으로부터 균을 분리하여, 항균활성에 관한 연구가 최초로 보고되었으며, 1949년 F. J. Jarvis등에 의하여 당지질을 생산함이 확인된 이래로 많은 연구자들에 의해, 슈도모나스 아에로기노사와 그 변종 그리고 이들이 생산하는 당지질 생물유화제(람노리피드)의 종류에 대한 많은 연구가 이루어졌다. 또한 슈도모나스 아에로기노사는 녹농균으로 알려져 있고, 주로 폐수처리와 토양 유류오염지역의 생물학적정화에 주로 이용되고 있다.

슈도모나스 아에로기노사가 생산하는 생물유화제는 많은 연구자들에 의해 주성분이 당지질이며, 당은 람노즈(rhamnose)로 지질은 베타-하이드록시데카노익에시드(β-hydroxydecanoic acid)로 구성되어 있음이 밝혀졌으며, 환경 등의 조건에 따라 일부 변이종이 나타나 생물유화제의 형태도 달라지는 것으로 보고되고 있다. 이러한 당지질 생물유화제인 람노리피드는 도 35에 도시한 바와 같이 람노리피드-1(RL-1), 람노리피드-2(RL-2), 람노리피드-3(RL-3), 람노리피드-4(RL-4)의 4종류의 주요형태가 알려졌다.

람노리피드의 4가지 주요형태 가운데에서 가장 많이 발견되는 형태는 RL 1과 RL 3으로서 Hisatsuka 등(1971)과 Itoh 등(1972)에 의하여 각각 발견되었으며, RL 2와 RL 4는 오직 휴지기 세포에서만 합성되는 것으로 보고되는 것으로Syldatk(1985) 등이 보고하고 있다. 그리고 도 36에 도시한 바와 같이 메칠 람노리피드는 Hirayama와 Kato(1982) 등이 슈도모나스 아에로기노사 158(Pseudomonas aeruginosa158) 균주가 생산하며, RL 1과 RL 3의 구조부위에 베타-하이드록시데카노익에시드의 1번 탄소위치에 메칠기가 결합되어 있다. 또한 도 37에 도시한 바와 같이 Yamaguchi 등(1976)은 RL 1과 RL 3의 람노즈 구조부위인 2번 탄소 위치에 각각 알파-데카노익에시드(α-decanoic acid)가 결합된 변형된 람노리피드를 보고하고 있다.

그러나, 종래 보고된 세균들의 경우 유류 유출사고시 토양에는 세균을 살포하여 직접 유류를 분해시킬 수 있는 장점이 있으나, 해양의 경우 호염성 세균이 아니기 때문에 직접 적용이 어려운 실정이다.

또한, 종래 기술의 경우 슈도모나스 아에루기노사가 주로 토양에서 분리되어 연구되었을 뿐 해양에서 분리된 예가 없으며, 토양세균의 경우 대부분이 염분 등에 대해 생육이 저해되는 단점으로 해양 유류오염시 적용이 어렵기 때문에 토양 유출유 처리 및 폐수처리 등에만 주로 이용되어왔다.

따라서, 본 발명은 한국 남해안 유류오염지역으로 부터 유류분해능이 우수하고 기존의 보고와는 다른 람노리피드와 메칠 람노리피드를 동시에 생산하는 비와이케이-2를 분리하는 것과 이들이 생산하는 생물유화제를 효율적으로 분리 정제할 수 있는 기술개발을 그 목적으로 한다.

본 발명의 다른 목적은 토양과 해양의 유류오염지역에 유출유의 효율적인 제거와 각 산업분야에 다양하게 사용되고있는 화학합성 계면활성제를 대신할 환경친화적인 대체 물질의 개발을 목적으로 한다.

상기한 바와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 슈도모나스 아에루기노사 비와이케이-2는 유류 오염지역 해수시료를 균주 분리용 유류배지에 넣고 7일간 진탕 배양하여 분해시킨 다음, 이를 멸균된 유류배지에 2% 접종하여 3일간 진탕 배양하는 과정과; 가장 분해능이 좋은 배지를 선별하여 변형된 해수배지에 도말하여 단일 균주들을 분리한 다음, 이를 분리용 유류배지에 접종하여 7일간 진탕 배양하는 과정과; 원유분해능이 우수한 배지를 재차 선별하여 변형된 해수배지에 도말하여 최종적으로 단일 균주를 분리하는 과정으로 이루어짐을 특징으로 한다.

도 1은 본 발명에 따른 해양유류오염지역으로부터 유류분해세균의 분리 방법을 나타낸 블록도.

도 2는 본 발명의 균주의 동정 결과를 나타낸 도표.

도 3은 염분 농도의 변화에 따른 슈도모나스 아에루기노사 비와이케이-2의 생육 특성을 나타낸 본 발명의 그래프.

도 4는 슈도모나스 아에루기노사 비와이케이-2를 이용한 난분해성 아라비안 라이트 원유의 생분해능을 나타낸 본 발명의 그래프.

도 5는 슈도모나스 아에루기노사 비와이케이-2 이용한 난분해성 벙커씨유의 생분해능을 나타낸 본 발명의 그래프.

도 6은 본 발명에 따른 균주가 생산하는 생물유화제의 분리ㆍ정제 방법을 나타낸 블록도.

도 7은 탄소원의 종류에 따른 생산된 생물유화제의 박층크로마토그래피 결과를 나타낸 본 발명의 그래프.

도 8은 정제된 두 종류(BS-1, BS-2)의 생물유화제의 박층크로마토그래피의결과를 도시한 본 발명의 그래프.

도 9는 당지질 생물유화제 BS-1의 변환적외선 분광장치를 이용한 분석 결과를 나타낸 본 발명의 그래프.

도 10은 당지질 생물유화제 BS-1의 고속원자충격 질량분석장치를 이용한 분석결과를 나타낸 본 발명의 그래프.

도 11은 당지질 생물유화제 BS-1의 수소핵자기공명장치를 이용한 분석 결과를 나타낸 본 발명의 그래프.

도 12는 당지질 생물유화제 BS-1의 탄소핵자기공명장치를 이용한 분석결과를 나타낸 본 발명의 그래프.

도 13은 당지질 생물유화제 BS-1의 뎁트(DEPT) 분광 분석결과를 나타낸 본 발명의 그래프.

도 14는 당지질 생물유화제 BS-1의 노이지(NOESY) 분광 분석결과를 나타낸 본 발명의 그래프.

도 15는 당지질 생물유화제 BS-1의 토코지(TOCSY) 분광 분석결과를 나타낸 본 발명의 그래프.

도 16은 당지질 생물유화제 BS-1의 릴레이(RELAY) 분광 분석결과를 나타낸 본 발명의 그래프.

도 17은 당지질 생물유화제 BS-1의 에치에스큐씨(HSQC) 분광 분석결과를 나타낸 본 발명의 그래프.

도 18은 당지질 생물유화제 BS-1의 에치엠비씨(HMBC) 분광 분석결과를 나타낸 본 발명의 그래프.

도 19는 당지질 생물유화제 BS-1의 구조 분석결과를 나타낸 본 발명의 구조식.

도 20은 당지질 생물유화제 BS-2의 변환적외선 분광장치를 이용한 분석 결과를 나타낸 본 발명의 그래프.

도 21은 당지질 생물유화제 BS-2의 수소핵자기공명장치를 이용한 분석 결과를 나타낸 본 발명의 그래프.

도 22는 당지질 생물유화제 BS-2의 탄소핵자지공명장치를 이용한 분석결과를 나타낸 본 발명의 그래프.

도 23은 당지질 생물유화제 BS-2의 뎁트(DEPT) 분광 분석결과를 나타낸 본 발명의 그래프.

도 24는 당지질 생물유화제 BS-2의 릴레이(RELAY) 분광 분석결과를 나타낸 본 발명의 그래프.

도 25는 당지질 생물유화제 BS-2의 에치에스큐씨(HSQC) 분광 분석결과를 나타낸 본 발명의 그래프.

도 26은 당지질 생물유화제 BS-2의 에치엠비씨(HMBC) 분광 분석결과를 나타낸 본 발명의 그래프.

도 27은 당지질 생물유화제 BS-2의 구조 분석결과를 나타낸 본 발명의 구조식.

도 28은 슈도모나스 아에루기노사 BYK-2 균주로부터 분리한 생물유화제의 임계마이셀농도 결과를 나타낸 본 발명의 그래프.

도 29는 슈도모나스 아에루기노사 BYK-2 균주로부터 분리한 생물유화제의 친수-친유 균형(HLB)을 측정한 결과를 나타낸 본 발명의 그래프.

도 30은 슈도모나스 아에루기노사 BYK-2 균주로부터 분리한 생물유화제와 시판용 계면활성제의 담수에서의 유화안정성 분석 결과를 나타낸 본 발명의 그래프.

도 31은 슈도모나스 아에루기노사 BYK-2 균주로부터 분리한 생물유화제와 시판용 계면활성제의 해수에서의 유화안정성 분석 결과를 나타낸 본 발명의 그래프.

도 32는 슈도모나스 아에루기노사 BYK-2 균주로부터 분리한 생물유화제의 온도안정성 분석 결과를 나타낸 본 발명의 그래프.

도 33은 슈도모나스 아에루기노사 BYK-2 균주로부터 분리한 생물유화제의 121도씨에서 10분간 열처리한 후의 유화안정성 분석 결과를 나타낸 본 발명의 그래프.

도 34는 현재까지 보고되고있는 람노리피드의 종류를 나타낸 구조식.

도 35는 현재까지 보고되고있는 메칠람노리피드의 종류를 나타낸 구조식.

도 36은 현재까지 보고되고있는 변형된 람노리피드의 종류를 나타낸 구조식.

이하 본 발명에 따른 바람직한 실시예에 의거 상세히 설명하겠는 바, 상기 본 발명의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다. 그리고, 하기의 설명에서는 본 발명을 이해하는데 필요한 부분만이 설명되며 그 이외 부분의 설명은 본 발명의 요지를 흐트리지 않도록 생략될 것이라는 것을 유의하여야 한다.

우선 본 발명에서는 육상과 해양의 유출유 정화에 동시에 사용할 수 있고 산업적으로 다양하게 사용되어질 수 있는 생물유화제 생산 균주인 해양 세균 슈도모나스 아에루기노사 비와이케이-2를 해양에서 분리하는데 있으며, 상기 균주는 토양유래 슈도모나스 아에루기노사 균주와는 다른 당지질 생물유화제인 람노리피드와 메칠람노리피드를 동시에 생산하는 독특한 생육 특성을 지니고 있다.

전술한 균주의 특성은 9%의 염분에서도 생육이 가능한 호염성 균주이며, 난분해성 유류인 원유와 벙커씨유를 1% 첨가한 후 7일간 해수와 담수가 각각 첨가된 변형된 엘비 배지에서 배양하여, 원유의 경우 각각 92.1%(해수)와 96%(담수)가 벙커씨유의 경우 각각 76.0%(해수)와 80%(담수)가 생분해되었다. 각 탄소원들(탄화수소화합물, 탄수화물, 당류)을 기질로 배양하여 추출한 생물유화제를 박층 크로마토그래피로 각 성분을 분석한 결과 모두 당지질이었으며, 각 탄소원별로 각 이동률을 종합해보면, 이동률(Rf)이 0.48, 0.52, 0.65, 0.70, 0.82, 0.91로 총 7종류의 당지질 생물유화제를 생산하는 것을 확인하였다.

7종류의 당지질 생물유화제중 그 생산량이 가장 많은 이동률 0.48, 0.65의 두 물질(BS-1, BS-2)을 분리하여 핵자기공명법 등과 같은 각종 분석 장비로서 구조를 분석한 결과 분자량이 650과 664인 람노리피드(2-O-α-L-rhamnopyranosyl-α-L-rhamnopyranosyl-β-hydroxyldecanoyl-β-hydroxydecanoic acid)와 메칠 람노리피드(2-O-α-L-rhamnopyranosyl-α-L-rhamnopyranosyl-β-hydroxyldecanoyl-β-hydroxydecanoic acid methyl ester)임을 밝혀냈으며, 람노리피드와 메칠 람노리피드를 동시에 생산하는 슈도모나스 아에루기노사는 현재까지 없었다.

또한 본 발명의 균주가 생산하는 당지질 생물유화제의 물성을 살펴보면, 임계마이셀농도는 10mg/L로, 기존에 보고되고있는 슈도모나스 아에루기노사 유래 당지질 생물유화제의 임계마이셀농도(15mg/L, 50mg/L)보다 훨씬 적은 량으로 임계마이셀 농도가 형성되어, 유화ㆍ분산능이 우수하고 그 사용량이 적기 때문에 생태계에 안정한 환경 친화적인 물질이다. 그리고 표면장력은 29.5mN/m, 계면장력은 0.98mN/m로 확인되었다.

한편, 본 발명은 생물유화제의 물성 중 유화안정성을 담수와 해수에서 시판용 계면활성제와 비교한 시판용 계면활성제 보다 담수나 해수에서 모두 우수한 유화안정성을 유지하여 담수나 해수의 유출유 처리에 매우 효율적인 것으로 밝혀졌으며, 온도안정성과 121℃에서 10분간 고온 가압멸균 처리한 열 안정성도 매우 우수하여, 열처리 공정을 가지는 식품산업 등과 같은 산업 전반에 안정적으로 활용할 수 있을 것으로 보여진다.

도 1은 본 발명에서 사용할 균주를 해수에서 분리하는 과정에 대한 개략도이다.

상기 도 1에 도시된 바와 같은 방법으로 균주를 분리할 경우 유류분해와 관련된 균주들을 쉽게 분리할 수 있으며, 본 발명자의 경우에도 본 방법으로 80여 균주의 유류분해세균을 확보할 수 있었다. 따라서 그 중 유류 분해능과 생물유화제 생산 능이 가장 우수한 균주인 비와이케이-2(BYK-2)를 본 발명에 이용하였고 여기에 관련된 배지와 방법은 실시예 1과 같다.

{실시예 1}

남해안 유류오염지역 등 남해안 30여 곳의 지역 해수를 채취하여 현장에서 분리용 유류배지(비멸균 아라비안 라이트 원유, 0.5 g; yeast extract, 5.0 mg; K₂HPO_4,0.5 mg; (NH₄)₂SO_4,50 mg)가 첨가된 삼각플라스크에 유류오염지역해수 50㎖를 직접 처리하여, 실험실로 옮긴 후, 진탕배양기를 이용, 25℃에서 180rpm으로 7일간 배양하였다.

7일간의 배양 기간 중 아라비안 라이트 원유가 완전히 분해된 지역의 해수를선별하여 다시 살균된 해수가 들어있는 분리용 유류배지에 선별된 유류 분해 배지를 각각 2%씩 넣고 다시 3일간 배양한 후 아라비안 라이트 원유의 분해능이 가장 좋은 배지를 선별하여 변형된 해수배지(peptone, 5.0 g; yeast extract, 1.0 g; ferric citrate, 0.1 g; NH₄NO_3,1.6 mg; Na₂HPO_4,8.0 mg; agar, 0.13 g; sea water, 1.0 L; pH 7.0)에 도말하여 단일 균주들을 분리한 후, 분리용 유류배지에 접종하여 7일간 같은 조건에서 배양한 후 원유분해능이 우수한 배지를 재차 선별하여 변형된 해수배지에 도말하여 최종적으로 단일 균주를 분리하였다. 이러한 방법에 의해 만들어진 균주를 비와이케이-2(BYK-2) 균주라 명명하였다.

본 발명에 따라 분리된 비와이케이-2 균주에 관한 동정은 도 2에 도시한 바와 같이 먼저 그램 염색을 통한 현미경 상에서의 형태학적 관찰과 각종 생리, 생화학적 특성을 조사하여 그램 음성의 운동성을 가진 슈도모나스 아에루기노사로 동정되었고 슈도모나스 아에루기노사 비와이케이-2로 명명하였다.

한편 도 3은 본 발명에 따라 슈도모나스 아에루기노사 비와이케이-2의 염분농도에 따른 생육특성을 조사하였다. 즉, 일반적으로 토양에서 분리한 슈도모나스 아에루기노사 균주는 6.5% 이상의 염분농도에서는 전혀 균이 성장하지 않는 것으로 보고되고 있으나, 해양에서 분리한 본 발명의 균주의 경우 0∼9% 범위 내에서도 균 생육이 가능한 것으로 확인되었다. 특히 해수의 염분 농도는 3%로 본 발명의 균주의 경우 4% 염분 농도까지는 전혀 생육에 영향을 받지 않는 것으로 보아 토양이나 해양에서 모두 이용이 가능한 것으로 밝혀졌다. 이와 관련된 상세한 내용은 실시예 2와 같다.

{실시예 2}

염분 농도가 슈도모나스 아에루기노사 비와이케-2의 생육에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 변형된 엘비배지에 염분농도를 0∼9%까지 넣고 48시간 배양한 후 분광 광도계를 이용하여 배양액의 농도를 660nm에서 측정하였다.

도 4와 도 5는 본 발명의 균주가 해수와 담수 등에서 유류분해능이 우수한지의 여부와 난분해성 유류인 아라비안 라이트 원유와 벙커씨유에 대하여 어느 정도의 유류 분해능을 가지는지를 7일간 담수와 해수가 첨가된 변형된 엘비 배지에서 배양하여 확인한 결과 아라비안 라이트 원유의 경우 해수와 담수에서 각각 92.1%와 96%가 생분해되었으며, 벙커씨유의 경우에도 각각 76.2%와 80%가 생분해되어 유류 분해능이 아주 우수한 균주로 확인되었으며, 여기에 사용된 배지와 방법은 실시예 3과 같다.

{실시예 3}

난 분해성 유류의 생분해능을 조사하기 위하여 중량법(Mulkins-Phillips 등, 1974)을 사용하였다. 중량법은 250㎖ 삼각플라스크에 1% 아라비안 라이트 원유와 벙커씨유가 첨가된 멸균된 변형된 엘비 배지(tryptone, 10.0 g; yeast extract, 5.0 g; 해수 또는 담수 , 1 리터) 50㎖를 넣은 후, 14시간 전 배양된 배양액을 1% 접종하고 25℃에서 180rpm으로 진탕 배양하였다. 유류의 생분해능을 조사하기 위하여 배양시간별(24, 48, 72시간)로 50㎖ 배양액이 든 삼각플라스크를 회수한 다음, 회수된 삼각플라스크에 50㎖ 벤젠을 가한 후 잔존 유류를 추출하고, 무수 황산나트륨으로 수분을 제거하여 정량분석에 이용하였다. 측정에 사용된 용기는 먼저 100℃건조기에서 1시간 건조한 후, 0.1㎎까지 정량이 가능한 저울로서 무게를 측정하고, 수분이 제거된 벤젠 추출물을 용기에 넣고 80℃ 건조기에서 6시간 동안 건조하고 식힌 후 저울에서 정량하여 생분해능을 측정하였다.

도 6은 본 발명에 따른 당지질 생물유화제를 추출ㆍ농축한 후 분리ㆍ정제하는 방법으로 이러한 방법으로 회수할 경우 추출한 생물유화제 원액 속에 잔류해 있는 탄화수소화합물이나 지방산 등의 제거가 용이하고 고속액체 크로마토그래피 등을 이용하지 않고도 빠른 시간 내에 95% 이상의 순도를 가진 당 지질을 회수할 수 있는 장점을 지니고 있다. 이와 관련된 구체적인 사항은 실시예 4와 같다.

{실시예 4}

각종 탄소원을 기질로 하여 균주를 배양한 후 그 배양액을 8,000g로 4℃에서 10분간 원심분리 한 다음 배양 상층액을 회수하였다. 회수한 배양 상층액은 5노르말 염산으로 수소이온농도를 2.0으로 맞춘 후 동량의 클로로포름 메탄올 혼합용매(CM, chloroform : methanol = 1:1, 부피/부피)로 10분간 교반 추출하고 회전진공증발기로 농축하였다. 다음 농축된 시료를 실리카겔과 클로로포름이 충진된 분리관(2.5 × 100cm)에 넣고 클로로포름으로 먼저 잔존하는 기질을 제거한 후, 클로로포름 메탄올 혼합용매로서 당지질 생물유화제를 1차로 분리한 후 농축하였다. 이렇게 얻어진 생물유화제는 박층크로마토그래피로서 순도를 확인하고, 재차 실리카겔이충진된 카트리지(Waters Co., USA)를 이용하여 분리하여 농축 후 순도를 확인하였다.

한편 실리카 카트리지를 이용한 생물유화제 분리방법으로는 먼저 실리카 카트리지를 클로로포름 20㎖로 세척한 후, 클로로포름으로 녹인 시료를 실리카 카트리지에 넣고 시료를 흡착시킨다. 흡착시킨 시료는 클로로포름과 메탄올을 농도 비로 용출시켜 정제하고, 순도 확인은 박층크로마토 그래피와 고속 액체 크로마토그래피 법으로 한다.

도 8은 탄소원의 종류에 따른 당 지질 생물유화제의 종류를 확인한 것으로서, 배지의 성분 중 기질로 사용되는 탄소원을 변화시켜 배양한 후 유기용매로 추출, 농축하여 박층 크로마토그래피로 몇 종류의 당 지질 형태의 생물유화제를 생산하는지를 확인하였다.

탄소원의 종류별로 생산된 당지질체의 종류를 살펴보면, 탄화수소화합물을 기질로 사용했을 경우 쿠웨이트 원유, 벙커씨유, 헥사데칸 그리고 테트라데칸에서는 4종류(이동률 0.48, 0.52, 0.65, 0.82)의 당지질이 생산되었고, 유동 파라핀에서는 5종류 (이동률 0.48, 0.52, 0.65, 0.70, 0.82)가 생산되었다.

그리고 지방산을 기질로 한 올레익산과 올리브 유, 그리고 레시틴에서는 3종류 (이동률 0.48, 0.65, 0.82)가 생산되었다. 당을 기질로 한 아라비노즈, 락토즈 및 프락토즈는 4종류(이동률 0.48, 0.65, 0.75, 0.82), 트리할로즈, 덱스트로즈, 말토즈의 경우는 5종류 (이동률 0.48, 0.52, 0.65, 0.75, 0.82), 갈락토즈에서는 5종류(이동률 0.48, 0.65, 0.70, 0.75, 0.82), 슈크로즈에서 5종류 (이동률 0.48, 0.65, 0.75, 0.82, 0.91)가 각각 생산되었다. 이러한 결과를 바탕으로 본 발명의 균주가 생산하는 생물유화제는 탄소원의 종류에 따라 다양한 종류의 당 지질체를 생산하는 것을 확인하였으며, 아울러 기질의 종류에 상관없이 3종류(이동률 0.48,0.65, 0.82)의 당지질체는 공통적으로 생산하는 것으로 확인하였다.

따라서 본 발명의 균주의 경우 기질의 종류에 따라 생산할 수 있는 당지질체는 총 7종류 (이동률 0.48, 0.52, 0.65, 0.70, 0.75, 0.82, 0.91)로 현재까지 보고된 슈도모나스 아에루기노사 균주들 중 한 균주가 생산할 수 있는 최대 당 지질의 종류는 4가지(RL 1, RL 2, RL 3, RL 4)에 비하여 7종류의 당 지질체 생산 능력은 해양에서 분리한 본 발명의 균주가 슈도모나스 아에루기노사 변종으로 해석되어진다. 이와 관련된 구체적인 사항은 실시예 5와 같다.

{실시예 5}

생물유화제 구성성분은 박층크로마토그래피(Thin layer chromatography)로 분석하였다. 박층크로마토그래피 분석에는 실리카겔 60이 도포된 유리판(silica gel 60 F₂₅₄glass plate)을 사용하고, 전개용매는 클로로포름: 메탄올: 물이 60 : 25 : 4(부피/부피)로 혼합된 것을 사용하였다. 검출시약으로는 에탄올에 20% 황산이 들어 있는 시약과 알파-나프토레소시놀(α-naphtoresorcinol) 시약을 사용하였다.

도 8은 배양액 중 생물유화제의 생산량이 가장 많은 종류인 이동률이 0.48(BS-1), 0.65(BS-2)인 두 종류에 대하여 분리ㆍ정제한 것으로서 순도는 95%와 96.1% 이었으며, 양은 각각 500㎖과 420㎖을 얻었다. 이 시료를 이용하여 당지질 생물유화제 BS-1과 BS-2의 구조를 분석하였다.

도 9는 당지질 생물유화제 BS-1 시료의 관능기를 확인하기 위하여 변환적외선 분광장치를 이용 분석 결과 흡수파장이 3450cm^-1, 2920cm^-1, 1750cm^-1, 1450cm^-1, 1050- 1120cm^-1를 가지며, 파장별로 각각 수산화기(hydroxyl group, -OH), 긴 사슬의 탄화수소(long chain hydrocarbon, -CH₂-), 에스테르(esters, -CH2-CO-O-R), 메칠기(- methyl, -CH₃), -진동부위(vibration,-CH₂-)를 가진다.

도 10은 당지질 생물유화제 BS-1의 고속원자충격 질량분석장치를 이용한 분석결과로서 분자량은 650.37로 화학식은 C₃₂H₅₈O₁₃으로 밝혀졌다.

도 11 내지 도 17은 당지질 생물유화제 BS-1의 구조분석을 위하여 실시한 핵자기 공명분석법으로서 1차원 분석과 2차원 분석을 동시에 수행하였다. 도 11은 수소핵자기공명 분석, 도 12는 탄소핵자기공명 분석, 도 13은 뎁트(DEPT) 분광 분석, 도 14는 노이지(NOESY) 분광 분석, 도 15는 토코지(TOCSY) 분광 분석, 도 16은 릴레이(RELAY) 분광 분석, 도17은 에치에스큐씨(HSQC) 분광 분석을 나타내고 있다.

또한 도 18은 에치엠비씨(HMBC) 분광 분석 결과로서 이들의 자료를 종합하여 구조를 해석하면, 도 19의 구조가 완성된다. 당지질 생물유화제 BS-1의 구조는 2개의 알파 엘 람노즈(α-L-rhamnose)와 2개의 베타하이드록시데카노익에시드(β-hydroxydecanoic acid)가 결합되어 있는 2-오-알파-엘-람노피라노실-알파-엘-람노피라노실-베타-하이드록시데카노일-베타하이드록시데카노익에시드(2-O-α-L-rhamnopyranosyl-α-L-rhamnopyranosyl-β-hydroxydecanoyl-β-hydroxydecanoic acid)로 밝혀졌다. 이 구조는 토양유래 슈도모나스 아에루기노사 디에스엠2659(Pedomonas aeruginosaDSM 2659)가 생산하는 4종류의 람노리피드(RL1, RL2, RL3, RL4) (Gruber 등, 1993)중 람노리피드 RL3와 구조가 일치한다.

도 20은 당지질 생물유화제 BS-2 시료의 관능기를 확인하기 위하여 변환적외선 분광장치를 이용 분석 결과 BS-1과 같은 위치의 흡수파장 3450cm^-1, 2920cm^-1, 1750cm^-1, 1450cm^-1, 1050- 1120cm^-1을 가지는 것으로 확인되었다. 당지질 생물유화제 BS-2의 고속원자충격 질량분석장치를 이용한 분석결과 분자량은 664로 화학식은 C₃₃H₆₀O₁₃으로 밝혀졌다.

도 21 내지 도 27은 당지질 생물유화제 BS-2의 구조분석을 위하여 실시한 핵자기 공명분석법으로서 1차원 분석과 2차원 분석을 동시에 수행하였다 도 21은 수소핵자기공명 분석, 도 22 탄소핵자기공명 분석, 도 23은 뎁트(DEPT) 분광 분석, 도 24는 릴레이(RELAY) 분광 분석, 도 25는 에치에스큐씨(HSQC) 분광 분석, 도 26은 에치엠비씨(HMBC) 분광 분석 결과로서 이들의 자료를 종합하여 구조를 해석하면, 도 27의 구조가 완성된다.

당지질 생물유화제 BS-2의 구조는 2개의 알파 엘 람노즈(α-L-rhamnose)와 1개의 베타-하이드록시데카노익에시드(β-hydroxydecanoic acid), 1개의 베타-하이드록시데카노익에시드 메칠 에스테르(β-hydroxydecanoic acid methyl ester)가 결합된 2-오-알파-엘-람노피라노실-알파-엘-람노피라노실-베타-하이드록시데카노일-베타하이드록시데카노익에시드 메칠에스테르(2-O-α-L-rhamnopyranosyl-α-L-rhamnopyranosyl-β-hydroxy- decanoyl-β-hydroxydecanoic acid methyl ester로밝혀졌다. 이 구조는 일본의 히라야마 등 (Hirayama et al, 1982)이 토양유래 슈도모나스 아에루기노사 158 (Peudomonas aeruginosa158)로부터 최초로 분리하여 보고한 메칠 람노리피드(GL1, GL2), 2개의 구조 중 GL2와 일치하는 것으로 나타났다. 그러나 그루버 등(Gruber et al, 1993)이 보고한 람노리피드 RL3과 히라야마 등(Hirayama et al, 1982)이 보고한 GL2는 각각 한 균주에서 람노리피드나 메칠 람노리피드를 생산하였지만, 본 발명의 균주의 경우는 한 균주에서 람노리피드와 메칠람노리피드를 동시에 생산한다는 점이 슈도모나스 아에루기노사(Peudomonas aeruginosa)연구에 있어서 현재까지 보고된 적이 없는 새로운 균 학적 특성을 지닌 변이 종으로 사료된다.

도 28은 슈도모나스 아에루기노사 비와이케이-2가 생물유화제에 대한 임계마이셀 농도를 측정하였다. 일반적으로 계면활성제들은 낮은 농도에서는 흡착의 형태로 표면장력과 계면장력의 저하에 관여하다가 농도가 진해지면 계면활성제의 흡착이 포화상태에 도달하여 집합체를 형성하는데 이것이 임계 마이셀 농도(CMC)라고 한다. 이러한 아이셀의 중요한 성질은 입자콜로이드와는 달리 수중에서 매우 안정된 형태를 취하고 있어 유화제의 본래 목적인 유화안정성을 유지시키는데 중요한 역할을 하게 된다.

임계 마이셀 농도는 표면장력계를 사용하여, 배양 상층액으로부터 분리된 생물유화제를 각기 다른 농도별로 희석하여 측정하였으며, 본 균주가 생산하는 당지질 생물유화제의 임계 마이셀 농도는 10㎎/ℓ였으며, 표면장력은 29.5mN/m였다. 이 농도는 토양에서 분리된 슈도모나스 아에루기노사가 생산하는 람노리피드의 임계마이셀 농도 15㎎/ℓ(Mulligan et al., 1993)와 슈도모나스 아에루기노사 에이티씨씨 9024(Peudomanas aeruginosaATCC9027)가 생산하는 람노리피드의 임계 마이셀 농도 50㎎/ℓ(Zhang et al., 1992) 보다도 적은 량으로도 임계 마이셀이 형성되며, 유화안정성 또한 아주 우수하였다. 이것은 본 균주가 람노리피드와 메칠람노리피드를 동시에 생산하는 특성에 따른 결과이다. 이와 관련된 상세한 내용은 실시예 6과 같다.

{실시예 6}

배양 상층액으로 부터 분리 추출한 농축 시료를 농도별(0, 1, 2, 3, 4, 5, 7.5, 10, 25, 50, 100㎎/ℓ)로 10㎖씩 희석하여 제조한 후 표면장력계(TD-1, Lauda, German)로 표면장력을 측정하여 임계 마이셀 농도(critical micelle concentration)값을 결정하였다.

도 29에서 나타낸 친수친유균형값(HLB, hydrophilic lipophilic balanced biosurfactant)은 본 발명의 균주가 생산하는 당지질 생물유화제가 친수성이 강한지, 소수성이 강한지를 확인하는 수치로 유화형태나 특성을 나타내는 지표가 된다. 친수친유 균형값이 1∼7인 것은 물/기름(W/O, water in oil)형이고, 10-13은 기름/물(O/W, oil in water) 형으로 보고되고 있다(Poter et al., 1994). 그 특징으로는 친수친유 균형값이 1∼4는 불용성이며, 4-7은 안정성과 분산능이 떨어지며, 7∼9는 안정적이지만 불투명하며, 10∼13은 약간 흐리며, 13 이상은 투명한 용액으로 존재하는 것으로 알려져 있다.

따라서, 본 발명의 균주가 생산하는 당지질 생물유화제(C. BS, crudebiosurfactant)와 정제된 BS-1 생물유화제의 친수친유 균형값을 측정하였으며, 시판용 각종 계면활성제 (emulsan, Triton X-100, SDS, Tween 80, Tween 40, Tween 20)와 비교 측정하였다. 당지질 생물유화제의 친수친유 균형값은 11.1, 정제된 BS-1은 10.6, 에멀산(emulsan)은 11.4, 트리톤 엑스-100(Triton X-100)은 10.0, 에스디에스(SDS)는 10.6, 트윈 80(Tween 80)은 15.0, 트윈 40(Tween 40)은 13.4, 트윈 20(Tween 20)은 12.1로 측정되어 실험에 사용된 각종 계면활성제는 모두 기름/물(O/W) 형으로 확인되었다. 이와 관련된 상세한 내용은 실시예 7과 같다.

{실시예 7}

친수친유 균형값의 측정은 본 발명의 균주가 생산하는 당지질 생물유화제(C. BS)와 BS-1 그리고 시판용 계면활성제(Triton X-100, SDS, Tween 80, Tween 40, Tween 20, Emulsan)를 사용하여 Porter(1994)등에 의한 적정법으로 측정하였다. 측정은 0.01g의 각종 계면활성제를 10㎖의 증류수에 녹인 후 4% 벤젠과 96% 1,4-다이옥산(1,4-dioxane)이 혼합된 유기용제로 적정하였다. 각종 계면활성제가 녹아있는 10㎖의 용액은 교반기로 혼합하여 적정하였으며, 친수친유 균형값 값은 맑은 종말점이 나올 때까지 계속 유기 용제를 적하시켜 적하량으로 구하였다.

도 30과 도 31은 본 발명의 균주가 생산하는 생물유화제의 물성 중 담수와 해수에 대한 유화안정성을 분석한 것으로 유화활성 측정법에 의해 유화시킨 후 시간의 변화에 따른 기울기의 변화량으로 시판중인 계면활성제와 비교하였다. 그 결과 담수에서는 본 발명의 균주가 생산하는 생물유화제가 붕괴상수(Kd) = -26으로, 해수에서는 에멀산과 트윈 40, 그리고 본 발명의 균주가 생산하는 생물유화제가 붕괴상수(Kd) = -36.6, -40.3, -43.8로 다소 에멀산이 높기는 하지만 거의 유사한 안정성을 나타냈다. 이러한 결과는 본 발명의 균주가 생산하는 생물유화제가 해수나 담수에 대한 유류유 처리에 모두 사용이 가능한 것으로 밝혀졌다. 이와 관련된 상세한 내용은 실시예 8과 같다.

{실시예 8}

본 발명의 균주가 생산하는 생물유화제와 각종 시판용 계면활성제(Triton X-100, SDS, Tween 80, Tween 40, Tween 20, Emulsan)를 각각 0.01%씩 넣고 로젠버그 등(Rosenberg E. et al 1979)의 방법으로 유화활성도를 측정하였다. 유화안정성은 유화활성도 측정법과 동일한 방법으로 실험을 행한 후 10분 간격으로 620nm에서 흡광도를 측정하여 변화된 값의 기울기로부터 붕괴상수(Kd 값)을 산출하였다.

붕괴상수(Kd) = ( logX₂- logX₁) / 10

(X₁: 진탕 후 10분 정치시킨 후의 흡광도 값, X₂: 매 10분 간격마다 측정한 흡광도 값)

도 32와 도 33은 본 발명의 균주가 생산하는 생물유화제의 온도 안정성과 열안정성을 검토하였다. 온도 안정성은 20℃∼100℃까지 각 온도별로(20℃, 40℃, 50℃, 60℃, 70℃, 80℃, 100℃)범위에서 60분간 10분 간격으로 유화안정성을 측정하였다. 온도 안정성은 30℃에서 붕괴상수(Kd)가 -6.07로 가장 안정하였으며, 그 외 각 온도별(20℃, 40℃, 50℃, 60℃, 70℃, 80℃, 100℃), 붕괴상수( Kd)값이 -6.82, -6.79, -8.73, -9.04, -9.45, -10.7로 20℃∼100℃ 전체 온도 범위에서 고른유화안정성을 나타내었다. 열 안정성을 측정하기 위하여 121℃에서 10분간 고온 가압 멸균하여, 유화안정성을 멸균처리를 하지 않은 것과 비교하였다. 그 결과 열처리하지 않은 것은 60분 후, 붕괴 상수(Kd)값은 -6.13이었고, 열처리 한 것의 경우 -6.53으로 열 안정성이 아주 우수한 것으로 확인되었다. 이와 관련된 상세한 내용은 실시예 9와 같다.

{실시예 9}

본 발명의 균주가 생산하는 생물유화제의 온도 및 열 안정성은 유화안정성 측정법과 동일한 방법으로 행하였으며, 온도별(20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 100℃) 유화안정성을 측정하였다. 또한 열 안정성 실험을 위하여 생물유화제를 고온 가압 멸균기를 이용하여 121℃에서 10분간 열처리 한 후 열처리하지 않은 시료와 열 안정성을 비교하였다. 실험은 20mM 트리스-염산 완충용액(Tris-HCl buffer, pH 7.0)에 0.01%(중량/부피)의 생물유화제를 첨가하여 사용하였다.

이상으로 살펴본 바와 같이, 본 발명은 분리용 유류 배지의 성분이 함유된 삼각플라스크에 유류 오염지역내의 해수시료채취 현장에서 직접 첨가하여 영양을 공급함으로써, 시료채취 후 실험실까지 이동 중에 발생하는 유류분해 세균들의 감소수 줄일 수 있고, 많은 다양한 종류의 유류 분해세균을 보존하여, 실험실에 옮겨 진탕 배양함으로써, 빠른 시간 내에 많은 종류의 유류분해 세균을 분리할 수 있는 장점이 있으며, 육상과 해양의 유출유 처리에 모두 이용할 수 있고, 국내 우점종인 토착세균을 개발하여 유출유에 처리함으로써 외국에서 수입하는 유출유처리 균주보다 훨씬 효율적인 처리가 가능한 장점을 가지고 있다.

또한, 본 발명은 육상과 해양의 유출유 처리에 동시에 이용함으로써, 유출유 처리뿐만 아니라 폐수나 오수속에 포함된 난용성, 난분해성 탄화수소들의 제거에도 효율적으로 이용할 수 있다.

그리고, 고 순도의 시료를 얻기 위해서는 주로 고가의 고속능 액체크로마토 그래피법 등에 의하여 기존에는 분리함으로써 많은 비용과 시료 량의 분리능의 한계로 많은 량의 시료를 회수하는데는 많은 시간이 소비되었으나 본 발명자가 고안한 분리 방법을 사용할 경우 당 지질에 대해서는 많은 양의 고순도(95% 이상)의 시료를 빠른 시간 내에 저 비용으로 손쉽게 분리할 수 있는 장점이 있다.

또한, 본 발명의 균주의 경우는 해수에서 분리한 점과 한 균주에서 람노리피드와 메칠람노리피드를 동시에 생산하는 점이 슈도모나스 아에루기노사 연구에 있어서 현재까지 보고된 적이 없는 새로운 균 학적 특성을 지니고 있다. 즉, 현재까지 보고된 슈도모나스 아에루기노사가 생산하는 각각의 람노리피드나 메칠 람노리피드 비해, 두 가지 형태의 물질이 혼합된 본 발명의 균주가 생산 생물유화제의 임계마이셀 농도가 이들보다 낮은 농도에서 형성됨으로써 적은 량으로도 훨씬 유화안정성을 유지할 수 있고, 사용량을 줄일 수 있어 훨씬 환경 친화적인 효과가 있다.

또한, 본 발명은 생물유화제의 유화 안정성도 시판용 계면활성제에 비해 담수나 해수에서 모두 안정하였으며, 온도나 열 안정성이 있기 때문에 화학합성계면활성제를 대신하여 산업적으로 다양하게 사용할 수 있다.

Claims

유류오염 지역의 해수에서 람노리피드와 메칠 람노리피드를 동시에 생산하는 슈도모나스 아에루기노사 비와이케이-2를 분리하는 방법.
제1항에 있어서,

유류 오염지역 해수시료를 균주 분리용 유류배지에 넣고 7일간 진탕 배양하여 분해시킨 다음, 이를 멸균된 유류배지에 2% 접종하여 3일간 진탕 배양하는 제1 과정과;

상기 제1 과정에서 가장 분해능이 좋은 배지를 선별하여 변형된 해수배지에 도말하여 단일 균주들을 분리한 다음, 이를 분리용 유류배지에 접종하여 7일간 진탕 배양하는 제2 과정과;

상기 제2 과정에서 원유분해능이 우수한 배지를 재차 선별하여 변형된 해수배지에 도말하여 최종적으로 단일 균주를 분리하는 제3 과정으로 이루어짐을 특징으로 하는 슈도모나스 아에루기노사 비와이케이-2.
제2항에 있어서, 상기 진탕 배양 25℃에서 180rpm으로 이루어짐을 특징으로 하는 슈도모나스 아에루기노사 비와이케이-2.
당지질 생물유화제를 추출ㆍ농축한 후 분리ㆍ정제하는 방법에 있어서,

각종 탄소원을 기질로 하여 균주를 배양한 후 그 배양액을 원심분리하여 배양 상층액을 회수하는 과정과,

상기 회수한 배양 상층액을 5노르말 염산으로 수소이온농도를 2.0으로 맞춘 후 동량의 클로로포름 메탄올 혼합용매로 교반 추출하고 회전진공증발기로 농축하는 과정과,

상기 농축된 시료를 실리카겔과 클로로포름이 충진된 분리관에 넣고 클로로포름으로 먼저 잔존하는 기질을 제거한 후, 클로로포름 메탄올 혼합용매로서 당지질 생물유화제를 1차로 분리한 후 농축하는 과정으로 이루어짐을 특징으로 하는 당지질 생물유화제를 분리 정제하는 방법.