KR20020003706A - Ｅｒｋ를 특이성있게 저해하는 초파리의 새로운맵카이네이즈 탈인산효소 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 맵카이네이즈 신호 경로의 신호전달이상에 의해서 발생하는 종양을 특이적으로 저해하는 새로운 유전자에 대한 발명으로, 본 발명은 ERK맵카이네이즈효소를 특이성있게 저해하는Drosophila이중 특이적인 맵카이네이즈 탈인산효소를 밝혀냈고, 본 발명의 유전자는 ERK의 조절의 이상으로 인해 발생하는 대부분의 종양에 작용할 수 있는 새롭고 효과적인 항암제로 사용할 수 있다.

Description

ＥＲＫ를 특이성있게 저해하는 초파리의 새로운 맵카이네이즈 탈인산효소{A novel Drosophila MAP Kinase Phosphatase which specifically inhibit ERK}
본 발명은 맵카이네이즈 신호 경로의 비정상적인 활성화에 의해서 생기는 종양의 발생을 특이적으로 저해하는 새로운 유전자에 대한 발명으로, 더욱 상세하게는 ERK를 특이적으로 저해하는Drosophila의 새로운 맵카이네이즈 탈인산효소(이하 "DMKP"라 한다) 유전자에 대한 발명이다.
최근 여러 형태의 종양의 발생과 진행을 유도하는 세포의 신호전달경로에 대한 많은 연구들이 진행되고 있다. 특히 많은 연구들이 정상세포에 비하여 암세포에서 이상이 생기고, 돌연변이된 유전자나 단백질를 밝히는데 집중되고 있다. 유전학적 연구는 여러 형태의 종양을 발생시킬수 있는 돌연변이를 가진 유전자 훼밀리를 밝혀냈다.
맵 카이네이즈 경로는 세포가 성장 인자, 영양상태 및 스트레스와 같은 여러 세포 밖의 자극에 반응하여 세포의 성장, 분화 및 에팝토시스를 유도하는 중요한 세포 네트워크이며, 효모에서 인간에 이르는 진핵생물체간에 그 신호전달기작이 잘 보존되어 있다. 현재까지 ERK, SAPK 및 p38 등의 세가지 중요한 맵카이네이즈 신호 경로가 잘 알려져 있으며, 이들 맵카이네이즈 경로 사이의 균형있는 신호전달이 세포의 운명과 항상성을 결정하는 중요한 요소이고, 이러한 맵카이네이즈 신호 경로에 이상이 있는 발생할 경우, 많은 종류의 종양의 발생과 밀접하게 연관관계가 있다는 것이 밝혀졌다.
일반적으로 맵카이네이즈 경로에 관련된 종양의 치료에 사용되는 항암제는미국특허 제 5,420,245호에서와 같이 맵카이네이즈 신호 경로의 윗 단계에서 작용하는 파네실트랜스퍼레이즈의 억제제 및 리셉터타이로신카이네이스를 저해하는 항체 등과 같은 항암제들이 일반적이다. 그러나 이러한 맵카이네이즈 신호 경로를 윗단계에서 저해하는 항암제는 맵카이네이즈 신호 경로의 아랫단계에서 발생할 수 있는 "cross-talk"에 의해 생길 수 있는 부작용이나, 효과성 면에서 떨어지는 등의 문제점이 많았다.
본 발명은 상기한 문제점들을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 맵카이네이즈 신호 경로 중 아랫단계인 ERK를 특이적으로 저해하는 유전자를 분리하고, 이 유전자를 ERK 조절의 이상으로 생긴 종양을 특이적으로 저해하는 항암 유전자로 제공하는 것이다.
본 발명에서 새로이 찾아낸 초파리의 ERK에 특이성있게 작용하는 DMKP는 MAPK 신호전달계가 효모에서 사람에 이르는 다양한 고등생물에서 잘 보존되어 있으며, JNK 혹은 p38 MAPK들을 저해시키지 않기 때문에, 사람에는 적용시킬 수 있는 효과적인 항암제로 개발될 수 있다.
도 1은 RT-PCR을 사용하여 초파리의 발생 동안 Drosophila MAP kinase phosphatase(DMKP) mRNA 의 양을 측정한 그림.
도 2의 A는 His-DMKP를 대장균에서 발현, B는 DMKP를 효모에서 발현한 결과를 보여주는 그림이고, C는 그들의 활성을 확인한 그림.
도 3은 DMKP 유전자가 안정되게 삽입된 세포주에서 CuSO4를 이용하여 DMKP를 발현시킨 결과를 보여주는 그림.
도 4는 DMKP가 ERK, JNK, p38 MAP kinase 중에서 ERK에 특이성있게 작용하는 탈인산효소임을 보여주는 그림으로, A에서 C는 DMKP 유전자가 안정하게 삽입된 세포주에서 발현했을 경우, ERK(A), JNK(B), p38(C)MAPK 활성도가 각각 저해되는 지를 보여주는 그림.
도 5는 DMKP 유전자를S. cerevisiae에서 발현했을 시 ERK와 유사한 Fus3 MAPK를 저해하여 Fus3에 의존하는 유전자 발현을 저해시킴을 보여주는 그림.
도 6은 DMPK가 FUS3 맵카이네이즈의 활성을 저해하는 것을 보여주는 그림.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 ERK를 특이적으로 저해하는Drosophila의 새로운 맵카이네이즈 탈인산효소 유전자를 제공한다.
또 본 발명은 상기의 유전자를 발현하기 위한 발현 벡터를 제공한다.
상기의 발현벡터는 pBS-DMKP, pKC305, pPac-DMKP 및 pKC423으로 구성된 군으로부터 선택된 1 종 이상의 발현벡터인 것이 바람직하다.
또한 본 발명은 상기의 유전자에 의해 발현된 서열정보 2에 기재된 초파리의 새로운 맵카이네이즈 탈인산 효소를 제공한다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
맵카이네이즈의 활성은 보존된 Thr-X-Tyr 모티프의 트레오인과 타이로신 잔기의 인산화를 필요로 한다. 맵카이네이즈의 인산화는 대부분 양쪽 특이성을 갖는 맵카이네이즈 탈인산효소들(MKPs)또는 타이로신 특이적인 맵카이네이즈 탈인산효소들에 의해 중재되는 가역적인 반응이다. 맵카이네이즈신호전달에 관여하는 유전자는 척추동물에서 효모까지 잘 보존되어 있다. 또한 맵카이네이즈의 불활성화에 대한 기작 역시 맵카이네이즈 활성화 기작처럼 종에 걸쳐 보존되어 있다. 맵카이네이즈 탈인산효소에 의한 맵카이네이즈의 여러 조절은 다양한 맵카이네이즈 신호경로 사이의 교차 조절에 매우 중요하고, 맵카이네이즈의 특이적 저해도 역시 보고되었다. 맵카이네이즈 탈인산효소(MKP)-3는 ERK에 매우 특이적이고, JNK 나 p38 맵카이네이즈를 불활성화하지는 않는 것으로 최근 밝혀졌으며, 중요한 차세대 항암제로 개발 중이다.
포유류와 마찬가지로 초파리(Drosophila)에서도, 다른 세 계열의 맵카이네이즈가 밝혀졌다. rolled에 의해 코딩되는DrosophilaRolled/ERKA (DERK)는 Sevenless 신호전달 경고의 콤포넌트이고, 다양한 분화와 발생과정을 조절한다.Drosophila의 JNK 호모로그인 DJNK는 등 봉합의 형태적 과정, 면역 반응, 광수용체 결정 및 조직 극성의 형성에 중요하다.Drosophilap38 (Dp38) 역시 최근에 클로닝되었다. 그러나 맵카이네이즈의 조절에 관여하는Drosophila의 맵카이네이즈 탈인산효소 유전자는 JNK에 특이성있게 저해하는 Puckered를 제외하고는 아직 밝혀지지 않았다. 맵카이네이즈의 활성화는 조절되어져야만 하는 일시적인 것이고, 맵카이네이즈의 불활성의 실패는 고등 진핵세포에서 발암과정으로 전환을 이끌 수 있다.
따라서, 본 발명자들은Drosophila-expressed sequence tag 데이터(이하 "dbEST"라 한다)를 찾아서, 알려진 이중 특이성을 가진 맵카이네이즈 탈인산효소와 아미노산 서열의 유사성을 갖는 새로운Drosophila맵카이네이즈 탈인산효소(DMKP) cDNA를 얻어서, 이 효소가 ERK 맵카이네이즈에 특이적으로 작용하는 탈인산효소라는 것을 밝혔고, 이것을 발현 혹은 단백질 수준에서 주입함으로써 맵카이네이즈 경로의 이상 등에서 오는 종양의 치료에 이용하였다.
본 발명에 사용된 제한효소는 New England Biolabs Inc.에서 구입하였고, Schneider 배지, fetal bovine serum, 항생물질, 리포펙타민(lipofectamine)은 Life Technologies, Inc.에서 구입하였다. RNA 분리를 위한 Tri 시약은 Molecular Research Center Inc. 에서 구입하였고, 6x His tag 프라스미드, pQE31, 및 QIAexpress Ni-NTA 단백질 정제 시스템은 Qiagen Inc. 에서 구입하였다. 안정한 세포주를 제조하기 위한 pMT/V5와 pCoHygro 벡터는 Invitrogen Co.에서 구입하였다.Drosophila액틴 프로모퍼를 갖는 PacPLDMKP를 제조하기 위해서 사용되는 PacPL 벡터는 스웨덴의 Umea 대학의 D. Huntmark박사로부터 공급받았다. 효모 합성 완전배지를 위한 최소 SD 배지는 Clontech Laboratories, Inc.에서 구입하였고,ECL 시스템은 대한민국 서울의 Genepia Inc. 에서 구입하였으며, 고감도 X 레이 필름은 Amersham Inc.에서 구입하였다. p-ERK, -JNK 및 -p38 항체는 New England Bio Lab에서 구입하였다. 모노크로날 항-α튜블린 항체는 Upstate Biotechnology Inc. Research Product에서 구입하였다. 항-레빗 IgG 항체 및 단백질 분석 키트는 Bio-Rad Laboratories에서, 그리고 프로트란 나이트로셀루로스 막은 Schleicher and Schuell Co.에서 구입하였다. 파라-나이트로페닐 인산(이하 "pNPP"라 한다), 프로틴 A 세파로스, 아미노산 및 프로테이즈 저해제를 포함하는 모든 다른 화학 물질은 Sigma 에서 구입하였다.
이하 본 발명을 비한정적인 실시예를 통하여 더욱 상세하게 설명한다.
실시예 1
새로운DrosophilaMKP를 알기 위해서, 본 발명자들은 이중 특이적인 MKP, MSG5중의 하나에 대한 아미노산 서열 상동성에 대한DrosophiladbEST를 찾아서 그것을 DMKP라 명하였다. 이 cDNA 는 1.4-kb의 크기와 3'-폴리 A 구조 및 5'- 비번역 지역도 갖는다. DMKP ORF는 활성화부위에 잘 보존된 HCXXGXXRS/T서열을 갖는 203 아미노산의 폴리펩티드이다. 또 DMKP는 이중 특이성이 있는 포스파테이즈의 촉매 자리에 보존된 Asp-120, Cys-152 및 Ser-159 잔기를 갖고, 또 GYLM 모티프도 갖는다.
이러한 결과는 하기의 실험을 통하여 얻었다.
이중(dual) 특이적인 맵카이네이즈 탈인산효소(이하 "MKP"라 한다) 아미노산 서열를 갖는DrosophiladbEST의 조사에 의해, 본 발명의 발명자들은 MKP의 C-말단과 큰 상동성을 갖는 부분적인 cDNA(accession No. CK00185)를 확인하였다. 프라스미드 내의 cDNA 클론(CK00185), pBS-DMKP-CK185는 미국 캘리포니아 대학의Drosophila게놈 리소스에서 얻었다. 총 cDNA의 염기 서열은 Sanger 방법(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 74(1977) 5463-5467)에 의해 수행되었다. 아미노산 서열 결정을 위해 MacVectorTM6.0.1 프로그램를 사용하였다.
[프라스미드의 제조]
Drosophila맵카이네이즈 탈인산효소(이하 "DMKP"라 한다)의 3'말단에 위치한 pBS-dMKP-CK185의 벡터 서열은NdeⅠ과XbaⅠ으로 처리하여 제거하였다. 말단을 dNTP 및 Klenow 절편을 이용하여 채운 후에 프라스미드를 재 연결하여 pBS-DMKP, pKC305를 제조하였다. pPac-DMKP 는 PacPL의EcoRV 및SacⅠ자리 속으로 pBS-DMKP 의EcoRV 및SacⅠ절편을 삽입하여 제조하였다. pBS-DMKP, pKC379의 C-말단 도메인의E. coli발현벡터는 6x His tag 프라스미드, pQE31의BamHⅠ 및SacⅠ 자리 속으로 C-말단의 154 아미노산에 대한 cDNA를 갖는 pPac-DMKP 의BamHⅠ 및SacⅠ절편을 삽입하여 제조하였다. 효모 DMKP 발현벡터(pKC423)을 제조하기 위해,HindⅢ 자리를 갖는 두 프라이머 즉 5'-ACCGAGAAACGAAGCTTTAATACCGCTATGAT-3' 및 5'-TTCATAAAAGCTTATCATATGCAGTATC-3'를 갖는 pKC305(pBS-DMKP)의 PCR 에 의해서 총 DMKP cDNA를 갖는 674bp DNA 절편을 얻었다.
아가로스 젤 정제 후에 PCR 생성물을 pKC423을 생성하기 위해 Ycp88(URA3 CEN)의HindⅢ 자리로 서브클로닝하였다.
실시예 2: Drosophila 발생 중의 mRNA 의 발현 실험
본 발명자들은 RT-PCR을 사용하여D. melanogaster의 발생 동안 DMKP mRNA 의 수준을 측정하였다. 도 1에서 보는 바와 같이 초기 배(0-4시간)와 유충 1기까지는 DMKP mRNA가 탐지되지 않고, DMKP mRNA 의 감지는 유충 2기에서 시작하여 3기에서 최대가 되고, 성충때 까지 유지된다. DMKP mRNA 의 발현은 l(2)mbn 및 Schneider 세포에서도 탐지되었다. 그러나, β-액틴의 mRNA 수준은 발생 단계를 통하여 크게 변하지 않았다.
이러한 결과는 다음의 실험을 통하여 얻었다.
여러 다른 발생 단계에서,Drosophila melanogaster로부터 총 RNA를 매뉴얼에 따라 Tri 시약으로 추출하였다. cDNA의 첫번 가닥은 5 ㎍의 총 RNA, 각 dNTP 1mM, AMV 역전사 효소 20 unit, 랜덤 프라이머 1.6 ㎍을 갖는 반응 혼합물에서 합성하였다. 25 ㎕의 반응 혼합물은 100 ng의 총 RNA에서 온 cDNA, 1.25 unit의T. aquaticusDNA 중합효소, 200 μM의 각 dNTP, 200 nM의 각 프라이머 및 1.5 mM의 MgCl2를 갖는다.
DMKP의 센스 프라이머 서열은 5'-CCCGCGTCAATGGAGTTTATTG-3'이고, 안티 센스의 서열은 5'-GATCACCATTGGCAACGA-3'이다. RT-PCR은 94℃에서 30초 변성, 60℃에서 1분 어닐링하고, 72℃에서 1분 체인 연장의 조건하에서 Perkin Elmer Co.의 DNA 써말 사이클러로, β-액틴 증폭은 20 회, DMKP 증폭은 30회를 각각 실시하였다. 10 ㎕의 PCR 생성물을 0.5 ug/ml의 Et-Br를 갖는 1.5 % 아가로스 젤 전기영도에 의해분리하고 관찰하였다.
실시예 3: DMKP의 포스파테이즈 활성 실험
DMKP가 포스파테이즈 활성을 갖는지 여부를 결정하기 위해, His-DMKP로서 대장균의 활성자리를 갖는 DMKP의 C 말단 도메인을 발현시켰다(도 2A 참조). HIS-DMKP 단백질을 요소 용액으로 녹이고, 99%순도로 정제하였다. 정제된 DMKP를 항 DMKP 항체를 생산하는데 사용하였다. 대장균에서 만들어진 DMKP 단백질은 불용성이므로, 포스파테이즈 활성을 탐지하기 위해,S. cerevisiae에서 DMKP 단백질을 만들었다. 효모에서 생성된 단백질은 23 kDa이었다. 면역-정제된 DMKP 는 포스포-타이로신과 구조적으로 연관된 발색 기질인 pNPP를 농도 의존적으로 가수분해하였다(도 2C 참조). 그러나 벡터만으로 형질전환된 세포에서 얻은 추출액의 면역-침전체에서는 포스파테이즈 활성이 탐지되지 않았다.
이러한 결과는 다음의 실험을 통하여 얻었다.
[DMKP의 발현과 항체 생성]
6x His 서열로 태그된 DMKP(His-DMKP)의 C-말단 도메인은 His-DMKP 발현벡터, pKC379로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)를 사용하여 대량 발현하였다. 세포들을 50 ㎍/ml 앰피실린를 갖는 LB 배지에서 성장시켰다. 세포밀도가 중 로그기에 도달했을 때, 0.2 mM의 이소프로필-1-티오-베타-D-갈락토피라노사이드(IPTG)로 DMKP를 유도하였다. 유도 후 5시간 후에, 세포를 모아서 추출을 수행하였다. 대장균에서 과량발현된 대부분의 재조합 His-DMKP 단백질은 불용성이다. 불용성의 His-DMKP 단백질을 8 M의 요소에 녹여서 QIAexpress Ni-NTA 단백질 정제 시스템를사용하여 정제하였다. DMKP 항체는 정제된 His-DMK단백질을 뉴질렌드 흰토끼에 주입하여 얻었다. 500 ㎍의 정제된 단백질과 1 ml의 Freund 불완전 애쥬번트를 혼합하여서 첫 번 면역화를 하였고, 두 번과 세 번째는 각각 200과 300 ㎍의 DMKP단백질을 1 ml의 Freund 완전 애쥬번트를 혼합하여 2 주 간격으로 진행하였다. 세 번째 접종 후 1주 후에, 시럼을 얻었고, DMKP 항체는 Halow 등의 Antibodies(1988)에 의한 표준 방법에 의해 정제하였다.
[S. cerevisiae에서 DMKP 발현]
pKC423(DMKP URA CEN) 또는 벡터(URA CEN)를S. cerevisiaeEY957(MATα sst1ΔKSS1 ura 3-1 leu2-3, 112trp1-1 his3-11,15 ade2-1 can1-100+)속으로 형질전환하였고, 그 형질전환체는 우라실이 부족한 합성 완전 배지에서 선택되었다. 효모 형질전환체는 합성 완전 선택 배지에서 성장하였고, 추출액은 최 등의 방법(J.B.C.(1998) 273, 369-74)으로 만들었다.
[웨스턴 블럿 분석]
50 ㎍의 단백질를 갖는 세포추출액을 10% SDS-PAGE로 분리하여 나이트로셀루로스 막에 트랜스퍼하였다. 블럿들을 5% 탈지 카네이션 우유를 포함하는 20 mM의 Tris-Cl, 150 mM NaCl 및 0.05%의 Tween 20 (TBST)로 불럿킹한 후 TBST로 3회 세척 후 적당량의 1차 항체를 갖는 TBST 우유로 상온에서 2시간 또는 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 그 후 블럿을 15분 간격으로 3회 세척한 후 레빗 IgG를 갖는 TBST 우유로 1시간 인큐베이션하였다. 막을 TBST로 15분 간격으로 3회 세척 후, 블럿을 ECL로 현상하였다.
[포스파테이즈 분석]
DMKP 형질전환체에서 얻은 200, 400, 500 ㎍의 효모 추출액을 DMKP 항체를 사용하여 면역침전시키고, pNPP에 대해 효소활성을 측정하였다. 포스파테이즈 반응은 20 mM의 pNPP, 50 mM의 이미다졸 및 5 mM의 다이사이오스레이톨을 갖는 용액에서 37 ℃에서 1시간 수행하였다. 반응은 1 M의 NaOH를 첨가하여 중지했고, 포스파테이즈 활성은 405 nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였다.
실시예 4: Drosophila 세포에서 DMKP의 DERK의 특이적 저해성 실험본 발명자들은 Schneider 세포에서 DMKP가 DERK, DJNK 및 Dp38 맵카이네이즈 탈인산효소의 활성을 조절할 수 있는지를 실험하였다. CuSO4에 의해 발현유도되는 DMKP 유전자를 갖는 안정한 Schneider 세포주를 만들고, DMKP 단백질은 DMKP 항체에 의해 탐지하였고, CuSO4유도적인 염색체 DMKP 유전자를 갖는 세포에서 CuSO4농도가 증가됨에 따라 단백질 수준 양은 의존적으로 증가했다. 젤 상에서 관찰된 DMKP 단백질의 크기는 29 kDa이었다. CuSO4유도적인 밴드를 제외하곤, DMKP 항체는 또한 33 kDa과 50 kDa 단백질을 인식했다(도 3 참조).
안정된 세포주에서 DMKP를 성공적으로 유도한 후, 단백질의 발현이 DERK, DJNK 및 Dp38 맵카이네이즈 탈인산효소의 활성을 저해할 수 있는지 여부를 실험하였다. 포스포-DERK 레벨에 의해 측정된 DERK 활성의 수준은 비 촉발된 세포에서 매우 높아서, 자극 없이도 DERK 의 조절에서 DMKP 의 효과를 측정하였다. 도 4 A에서 보는 바와 같이, 포스포-DERK 수준은 다른 CuSO4이온 농도에 의해 유도된DMKP 수준에 반비례하는 관계가 있다. p-DJNK와 -Dp38의 수준은 세포를 각각 LPS 나 NaCl 로 처리하여 크게 증가시킬 수 있으나(4B 또는 C 참조), 촉진제에 의해 증가된 포스포-DJNK와 -Dp38의 수준은 DMKP 발현의 유도에 의해 크게 낮추어지지 않았다(4B 또는 C 참조). DMKP 에 의한 포스포-ERK의 특이한 농도 의존적인 저해는 일시적인 트랜스펙션 실험에서도 관찰되었다(도 5 참조). 비록 p-DERK 수준이 트랜스펙션된 pPac-DMKP 벡터의 수준이 증가함에 따라 단계적으로 감소했지만, 포스포-DJNK 및 포스포-Dp38의 수준은 DERK 발현벡터의 트랜스펙션에 의해서 변하지 않았다.
이러한 결과는 다음의 실험을 통하여 얻었다.
[세포 배양 및 안정한 DMKP 세포주의 제조]
schneider 세포는 열에 의해 불활성화된 10% FBS, 100 unit의 페니실린 및 100 ug/ml의 스트렙토마이신이 공급되는 23℃의 Schneider 배지에서 키웠다. 트렌지언트 형질전환은 리포펙타민을 사용하여 수행하였다. DMKP를 발현하는 안정한 세포주는Drosophila Copia프로모터의 조절하에서 대장균 하이그로마이신-B-포스포트랜스퍼레이즈를 갖는 pCoHygro와 같이 pMT/V5-DMKP로 트랜스펙션해서 제조하였다. 트랜스펙션은 Di Nocera, P.P. 등(P.N.A.S. U. S. A.(1983)80, 7095-98)의 표준 CaPO4프로토콜에 따라 수행하였고, 트랜스펙션된 세포는 6주 동안 300 ㎍/ml의 하이그로마이신으로 선택하였다. 사용하기 전에 DMKP 발현을 유도하기 위해서 안정한 세포는 1 mM의 CuSO4로 24시간 처리하였다. DMPK 단백질의 유도는 DMKP 항체를 사용한 웨스턴 블럿 분석에 의해 분석하였다.DrosophilaERK(이하 "DERK"라 한다)의 활성 상태를 조사하기 위해, 안정하게 DMKP를 발현하는 CuSO4유도된 세포에서의 총 세포 추출액을 제조하여, 항-휴먼 포스포-ERK 특정 항체를 사용한 웨스턴 블럿 분석을 하였다. 세포 DJNK 및 Dp38, 안정하게 DMKP를 발현하는 CuSO4유도된 세포 또는 비유도된 세포의 활성상태를 조사하기 위해, 각각 DJNK와 Dp38의 활성을 위해 10 ug/ml의 LPS 또는 300 uM의 NaCl로 10분 동안 처리하였다.
[Drosophila세포 추출액의 제조]
배양된 세포를 찬 PBS로 두 번 씻은 후 모았다. 세포는 300-500 ul의 pH 6.2- 8.2의 50-100mM 베타-글라이세로포스페이트, 각각0.1-1mM의 메타-와 오쏘- 바나데이트, 2mM의 염화 마그네슘, 1mM 이지티에이(EGTA), 1-3mM 다이싸이오쓰레이톨(DTT), 0.5% 트라이톤 엑스-100, 0.2-0.6mM 페닐메틸썰포닐 플로라이드(PMSF) 와 각각 5㎍/ml의 펩스타틴 에이(pepstatin A), 카이모스타틴(chymostatin), 루펩틴(leupeptin)과 펩틴(peptin)로 구성된 차가운 버퍼에 녹여서 라이시스시켰다. 시료를 얼음에서 15분 정치 후에 30초 초음파 분쇄하였다. 깨지지 않은 세포 부스러기는 12,000xg에서 10분 원심분리하여 제거하고 상등액을 두 번째 원심분리하여 더 깨끗하게 하였다. 시료는 즉시 액체화하여, 후에 사용하기 위해 -80℃에서 얼렸다.
실시예 5: DMKP의S.cerevisiae페르몬 경로의 다운 레귤레이션 실험.
생체 내에서 DMKP 의 기능을 알기 위해서, Elion 등의 방법(P.N.A.S. U. S.A. 88(1991) 9392-9396)을 이용하였다.
fus1-lacZ리포터는 페르몬 반응을 정량화하는데 사용되는fus1유전자에서 온 페르몬 유도적인 프로모터와 융합된 박테리아lacZ유전자를 갖는다.fus1-lacZ리포터의 발현은 FUS3 맵카이네이즈의 활성에 의존한다. 따라서 본 발명자들은sst1Δ균주인 EY957에서 FUS3 의존적인fus1-lacZ트랜스 표지 유전자 발현을 측정하여, DMKP 가 FUS3 맵카이네이즈의 활성을 저해하는지 여부를 실험하였다. SST1은 α인자를 분해하는 효소이기 때문에, EY957(sst1Δ)은 민감하게 페르몬 신호전달을 감지한다.fus1-lacZ유전자 발현은 페르몬 처리시 100배 증가하였다(도 6 참조). 페르몬에 의해 증가된 β-갈락토시데이즈 활성은 효모 벡터 만으로 형질전환시킨 것에 비해 DMKP 발현 프라스미드로 형질전환시킨 것에서 약 25% 정도 다운 레귤레이션되었다(도 6 참조).
상기의 결과는 다음과 같은 실험에 의해 얻어졌다.
[fus1-lacZ트렌스-표지 시스템]
pKC423(DMKP CEN URA)또는 빈 벡터(CEN URA)를 pJB207(fus1-lacZ 2μ LEU)와 함께 EY957속으로 형질전환하고, SC (selective complete)-Ura Leu 프레이트에서 선택하였다. SC-Ura Leu 배지속으로 접종하고, 37℃에서 오버나잇하였다. 세포는 1/10 부피의 오버나잇 배양액을 접종하여 성장했고, 30℃ 진탕배양에서 더욱 성장했다. 배양액의 OD600값이 1.0-1.2에 도달할 때, 세포를 50 nM의 α인자로 1시간 유도하고, 최 등의 방법 (Cell(1994)78, 499-512)으로 추출액을 만들었다.
[β-갈락토시데이즈 분석]
β-갈락토시데이즈 분석은 Dolan 등의 방법(Genes Dev.(1990) 4, 492-502)으로 수행하였고, 세 독자적인 형질전환체를 β-갈락토시데이즈 분석에 사용하여 그 값을 평균화하였다.
본 발명은 DJNK 및 Dp38의 활성에는 큰 영향이 없고, DERK의 특이적인 다운 레귤레이션에 관여하는 새로운Drosophila이중 특이적인 맵카이네이즈 탈인산효소를 밝혀냈고, 이를 맵카이네이즈 경로에 관여하는 효소의 조절의 이상을 가진 특히 ERK 의 조절의 저해로 인해 생긴 종양에 본 발명의 유전자를 트랜스펙션시켜서 종양의 치료에 이용할 수 있다.

Claims (4)

  1. ERK를 특이적으로 저해하는 서열정보 1에 기재된 초파리의 새로운 맵카이네이즈 탈인산효소 유전자.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기의 유전자를 발현하기 위한 발현 벡터.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기의 발현벡터는 pBS-DMKP, pKC305, pPac-DMKP 및 pKC423으로 구성된 군으로부터 선택된 1 종 이상의 발현벡터인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  4. 제 1 항의 유전자에 의해 발현된 서열정보 2에 기재된 초파리의 새로운 맵카이네이즈 탈인산 효소.
KR10-2000-0035764A 2000-06-27 2000-06-27 Ｅｒｋ를 특이성있게 저해하는 초파리의 새로운맵카이네이즈 탈인산효소 KR100372180B1 (ko)

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