KR20020003384A

KR20020003384A - 표현형 및 생물학적 마커 동정 시스템

Info

Publication number: KR20020003384A
Application number: KR1020017013650A
Authority: KR
Inventors: 골든 린골드; 루이스 제이. 다이에츠; 아론 비. 캔토르; 마이클 제이. 나탄; 카렌 제이. 브런크; 안토니 앨리슨
Original assignee: 써로메드, 인크.
Priority date: 1999-04-26
Filing date: 2000-04-26
Publication date: 2002-01-12
Also published as: AU4494200A; MXPA01010970A; CA2371385A1; JP2002543394A; EP1224564A1; BR0010068A; WO2000065472A1; AU773832B2

Abstract

본 발명은 유기체를 완전히 특성화하기 위하여 다중 변수를 얻기 위한 표현형화 시스템이다. 상기 표현형은 세포 집단 및/또는 세포 관련 분자에 관한 적어도 20 어세이의 결과, 용해성 인자에 관련하는 적어도 20 어세이의 결과 및 임상 변수를 포함한다.

Description

표현형 및 생물학적 마커 동정 시스템{PHENOTYPE AND BIOLOGICAL MARKER IDENTIFICATION SYSTEM}

게노믹스(genomics), 조합 화학 및 고처리량 스크리닝을 포함한 약 개발에서 최근의 혁명의 결과로서, 임상 실험을 위한 유용한 다수의 약 후보들은 제약 산업의 발전과 경제적 용량을 초과한다. 1998년, 세계의 최대 제약 및 생명공학 회사들은 연구 개발에 약 500억 달러 이상을 소비했고, 그중 삼분에 일이상이 임상 개발에 직접 소비되었다. 증가된 경쟁 및 관리 보호 기관과 기타 책임있는 사람들의 압력을 포함한 다수의 요인의 결과로서, 제약 산업은 시장으로 판매되는 신약의 안전성과 효능을 포함한 품질을 개선시키고 및 임상 개발의 효과를 개선시키려 한다.

따라서, 최근 약 개발 혁명은 임상 시험 병목현상에 기여하고 있다. 확인되는 치료 대상 및 발생되는 선도 화합물(lead compound)의 수는 이들이 현시점에서 수행하고 있는 임상 시험을 실시할 수 있는 제약 회사의 용량을 훨씬 초과하고 있다. 게다가, 현재 산업상 신약 개발의 평균 비용이 대략 5억만달러로 평가되고 있으며, 이것은 모든 잠재 약 후보를 개발하기에는 엄청난 고가이다.

제약 산업은 약 개발에서 대등한 기술 개발을 구하고자 한다. 임상 시험은 매우 비싸며, 매우 위험하고, 주로 의사결정이 대상 분석에 크게 기초한다. 결과적으로, 약이 가장 효과적이 되는 환자 집단, 주어진 약에 대한 적절한 투여량 및 이것의 사용과 연관된 부작용에 대한 잠재성을 결정하는 것은 어렵다. 이것은 임상 개발에서의 실패를 유도할 뿐만 아니라, 부적절하게 투여되거나, 처방되거나 또는 위험한 부작용을 일으키는 생성물이 승인되게 할 수 있다. 이들 개발중인 증가된 약물의 수에 의해 제약 회사들은 약물 개발 공정보다 먼저 후보 약물의 안전성 및 효능 프로파일의 객관적인 측정을 확인하는 기술을 요구한다.

대량의 정보와 기술을 처리하는 하나의 접근은 약물 동정 및 개발의 전통적인 방법을 버리는 것이다. 상이한 분석, 임상 및 정보 처리 기술의 다양성이 계속적으로 발전함에 따라서, 개별 또는 집단의 전례가 없는 계통적 평가를 허용하는 개별 또는 집단의 표현형을 개발하는 것이 가능해지고 있다. 주어진 개체에 대한 표현형은 이론적으로 현재 측정가능한 개체의 모든 특성을 포함한다. 이런 표현형 정보의 용도는 생물학적 마커의 동정이다.

생물학적 마커는 측정되거나 또는 평가되는 경우 그중에서 정상적인 생물학적 과정, 발병 과정 또는 치료 개입에 대한 약리학적 반응의 표시기(indicatior)로서 불연속 관계 또는 상관관계를 갖는 특성이다. 치료 개입에 대한 약리학적 반응은 이것으로 국한되는 것은 아니지만 일반적인 개입에 대한 반응(예를 들면, 효능), 개입에 대한 투여량 반응, 개입의 부작용 프로파일 및 약물동력학적 특성을 포함한다. 반응은 유효한 또는 불리한(예를 들면, 독성) 변화와 연관될 수 있다. 생물학적 마커는 발병 과정과 관련하여 변화하는 세포 또는 분자의 패턴을 포함하고, 진단 및/또는 예후 유용성(value)를 갖는다. 생물학적 마커는 세포 집단과 그들의 관련 분자의 레벨, 용해성 인자의 레벨, 기타 분자의 레벨, 유전자형 정보, 유전자 발현 레벨, 유전적 돌연변이, 및 질병의 존재 및/또는 진행과 연관될 수 있는 임상 변수를 포함할 수도 있다.

임상 종점(clinical endpoint)으로서 질병 진행 또는 재발 또는 삶의 질의 평가(이것은 전형적으로 평가하기에 오랜기간이 소요된다)와 같은 것에 대조적으로, 생물학적 마커는 약물의 임상 프로파일에 대한 보다 빠르고 정량적인 측정을 제공할 수 있다. 임상 실시 및 약물 개발 모두에서 현재 사용되는 단일 생물학적 마커는 콜레스테롤, 전립선 특이 항원("PSA"), CD4 T 세포 및 바이러스성 RNA를 포함한다. 고 콜레스테롤과 심장 질환, PSA와 전립선암 및 AIDS에서 감소된 CD4 양성 T 세포와 바이러스성 RNA 사이의 공지된 상관성과 달리, 대부분의 다른 질병과 연관된 생물학적 마커는 아직 동정되지 않았다. 결과적으로, 정부기관 및 제약 회사는 임상 시험에 사용하기 위한 생물학적 마커를 개발하려고 하고 있지만, 약물 개발에서 생물학적 마커의 사용은 지금까지 제한적이였다.

비록 많은 잠재적인 생물학적 마커가 있지만, 생물학적 마커를 정상 생물학적 과정, 질병, 질병 진행 및 치료에 대한 반응과의 상관성을 구축하기 위해 필요한 막대한 양의 정보를 통해 분류할 수 있는 기술은 제한적이다. 표현형화는 수백 내지 수만개의 변수를 측정하기 위해 요구되는 기구(instrumentation) 및 어세이(assay), 이 데이터를 용이하게 접근할 수 있게 하는 정보 시스템, 정보 패턴과 임상 데이터를 연관시키는 소프트웨어 및 얻어진 정보를 약물 개발과정에 이용하는 능력을 요구한다. 본 발명은 이런 기술을 제공한다.

본 발명은 표현형 및 생물학적 마커 동정 시스템 및 질병, 질병 진행, 치료에 대한 반응 및 정상 생물학적 기능과 관련된 생물학적 마커의 신규한 패턴을 동정하고 사용하는 방법에 관한 것이다. 생물학적 마커의 신규한 패턴의 발견 및 사용은 임상 시험에서 환자 선별의 개선 및 크게 향상된 안전성 및 효능을 갖는 치료제의 동정화를 포함하여 비용면에서 보다 효율적으로 약을 개발할 수 있다. 표현형 정보 및 생물학적 마커는 진단 응용분야에서도 사용될 수 있다.

도 1은 제 1구현예의 생물학적 마커 동정 시스템을 얻기 위해 흡수된 정보 유형을 나타낸 개략도이다.

도 2는 본 발명의 개선된 MLSC 기구("서로스캔(SurroScan)"으로 명명)를 개략적으로 도시한 것이다.

도 3은 본 발명에서 얻은 데이터를 분석하기 위한 통합된 정보 기반시설을 도시한 것이다.

도 4A 내지 C는 CD27⁺및 CD27^-CD8 T세포가 샘플중에서 변화하는 것을 보여주는 실시예 1에서 얻은 결과를 나타낸 것이다. 세개의 다른 공여체(도 4A, B 및 C)로부터 얻은 혈액 샘플은 Cy5 항-CD27 및 Cy5.5 항-CD8로 착색되었다.

도 5A 및 B는 2-색 MLSC로 강력한 세포 측정을 나타낸 것이다. 도 5A는 6개의 다른 모세관으로부터 나온 CD8 T세포 수의 일관성을 보여준다. Cy5.5 항-CD8은 모세관 각각에 대해 상이한 Cy5 접합된 항체와 결합되었다(항-CD3, CD25, CD7, CD45RA, CD62L, CD69). 50개의 다른 혈액 샘플이 분석되었다. 박스-및-침상결정 플롯은 세포 수의 분포가 모세관 각각에 대해서와 매우 유사하다는 것을 나타낸다. 짝 선형 회귀(Pair-wise linear regression)은 또한 이들 어세이의 일관성의 높은 정도를 나타낸다(데이터 도시되지 않음). 도 5는 B세포의 두개의 측정에 대한 일관성 나타내며, 하나는 Cy5.5 항-CD20으로, 또 다른 하나는 Cy5.5 항-CD19로 측정된다. 선형 회귀의 95% 신뢰구간은 1의 기울기를 포함하고, 적합도는 0.97의 상관계수를 갖는다.

도 6은 RA 환자 샘플 및 혈액 은행 샘플에서 CD8 T세포 및 CD4 T세포를 비교하는 분류 매트릭스를 나타낸다.

도 7A 및 B는 서로스캔 기구상에서 3색 세포 어세이의 결과를 나타낸다.

도 8A 내지 C는 MLSC 기술로 측정된 바와 같은 세포내 분자를 착색한 결과를 나타낸다.

도 9A 내지 C는 MLSC 기술을 사용하여 3 검출 채널 분석의 결과를 나타낸다.

본 발명은 유기체 또는 유기체의 강 또는 아강을 표현형화하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 또한 정상적인 생물학적 과정, 발병 과정 또는 치료개입에 대한 약리학적 반응의 표시기로서 측정 및 평가되는 생물학적 마커의 동정을 포함한다. 본 발명은 유기체의 표현형 또는 환자의 질병상태 및 치료에 대한 반응을 정확하게 프로파일할 수 있는 다중 및 다양한 생물학적 마커를 정량적이면서, 민감하고, 재현가능하고 빠르게 측정할 수 있는 기술을 포함한다. 또한, 혈액이 가장 정보가 풍부한 단일조직이면서 시험을 위해 용이하게 접근할 수 있기 때문에, 본 발명은 소량의 혈액 샘플로부터 생물학적 변수를 동정하는데 초점을 맞춘다. 본 발명은 세개의 기본적인 요소 : 수단, 어세이 개발 및 임상 정보를 포함하는 다영역의 포맷(format)을 포함한다.

본 발명은 유기체 또는 유기체의 강 또는 아강의 표현형화에 관한 것이다. 이론적으로, 유기체의 표현형화는 상기 개체의 과거 및 현재의 측정가능한 모든 특성을 얻는 것을 포함한다. 임의의 유기체의 완전한 표현형화는 실제적이지 않거가 가능하지조차 않은 반면, 본 명세서에서 밝히고 설명된 표현형화는 정상의 생물학적 기능, 질병, 질병 진행 및 유기체에 대한 실질적인 임의의 섭동(perturbation)과 관련된 변화의 분석을 위해 사용하는 정보원을 제공하기 위해 예상할 수 없는 수의 변수 또는 특성 유형의 예상할 수 없는 수량을 제공한다.

본 발명에 의해 교시된 표현형화 시스템은 정상적인 생물학적 과정, 질병 또는 의학적 증상(medical condition)에 대한 생물학적 마커의 동정에 사용한다. 본 발명의 이 태양을 수행하기 위해, ⅰ)개별 집단으로부터의 생물학적 정보, ⅱ) 개별적으로 얻은, 바람직하게는 시간에 따른 다중 샘플링에 의해 얻은 적절한 양의 데이터, ⅲ) a) 광범위한 유형의 정보를 통합적으로 병합할 수 있고 b) 데이터의 본질적으로 다른 유형의 의미있는 상관관계 분석을 수행할 수 있는 정보 저장 및 검색 시스템을 가질 필요가 있다. 도 1은 생물학적 마커 동정 시스템을 창줄하는데 유용한 정보를 도시하고 있다.

질병 및 질병 진행은 유전적 및 환경적 요인 모두의 복합적인 상호작용을 포함한다. 본 발명은 소량의 혈액 샘플로부터 유전적 및 환경적 요인 모두를 반영하는 생물학적 마커의 패턴에서 변화를 동정하고 추적하는 것에 대한 잠재성을 갖는다. 게다가, 본 발명은 질병 감도, 질병 진행 및 치료에 대한 반응의 유전적 요소를 판독하는 것을 돕는다.

본 발명은 세포, 단백질, 유기 분자, 유전자형, 용해성 인자, 임상 및 환경 요인를 모니터링할 수 있고, 이들 모두는 약 개발에서 생물학적 마커로서 및 질병 마커로서 사용되어진다. 공지된 생물학적 마커의 실예는 AIDS에서 CD4 양성 T 세포 및 바이러스성 RNA 레벨의 감소, 심장질환에 대한 받아들여진 생물학적 마커로서 증가된 콜레스테롤 레벨 및 전립선암 환자의 혈액에서 발견된 단백질 마커로서 PSA의 변화 레벨을 모니터링하는 것을 포함한다.

생물학적 마커 또는 마커"그룹핑"의 일부가 될 수 있다고 밝혀진 생물학적 특성 또는 변수가 흔하게 예견될 수 없기 때문에, 적절한 데이터베이스가 가능한 많은 변수에 관한 정보를 포함하는 것이 필수적이다.

본 발명은 주어진 유기체의 표현형, 이런 표현형을 어셈블링하는 방법 및 이런 표현형을 이용하기 위한 방법으로 확대된다. 유기체 또는 유기체의 강 또는 아강의 표현형은 유기체 또는 유기체의 강 또는 아강에 관한 데이터의 대량 컴파일을 포함한다. 본 발명의 신규한 태양은 테이터의 이종의 특성과 유기체에서 유용한 데이터의 다양한 카테고리의 각각으로부터 얻은 데이터의 수량에 있다. 표현형은 오로지 표현형을 정의하는 데이터가 광범위한 경우 그의 충분한 유용성에 이를 것이다. 예를 들어, 표준 혈액 프로파일과 물리적 실험으로부터 얻은 일상적인 임상 인자를 포함한 사람 환자에 대한 표현형은 이런 표현형을 완전히 이용하기에 충분한 정보를 제공할 수 없다. 비록 관련된 어세이와 얻어진 데이터가 이 분야의 과학적이고 임상적인 가능성 내에 있을지라도, 단일 유기체로부터 정보의 모든 것을 얻는 것은 새로운 작업이다. 비록 표현형의 취급 및 유지는 컴퓨터화에 적합하지만, 주어진 표현형은 전통적인 포맷으로 유지될 것이다. 생물학적 마커를 동정하거나 또는 유기체에서 섭동(perturbation)의 효과를 관찰하도록 표현형을 조작하는 것은 물론 컴퓨터를 통한 계산법을 사용하여 매우 단순해진다. 상기 설명된 바와같이, 유기체의 완벽한 표현형화는 실제로 수천 또는 가능한 수백만의 데이터 포인트를 포함한다. 본 발명의 바람직한 태양에서, 표현형은 40 이상의 생물학적 변수, 보다 바람직하게 100 이상의 변수, 가장 바람직하게는 200 이상의 다른 변수 및 일부의 경우에는 300 이상의 다른 변수를 포함한다. 상기 표현형은 세포 어세이, 용해성 인자 어세이 및 임상 정보로부터 얻은 정보를 포함한 생물학적 변수를 포함해야 한다. 바람직한 구현예에서, 20 이상의 세포 집단 및/또는 세포 관련 분자의 측정을 병합하는 20 이상의 세포 어세이의 결과 및 20 이상의 용해성 인자 어세이의 결과는 임상 정보와 함께 표현형에 포함된다. 보다 바람직한 구현예에서, 40 이상의 세포 집단 및/또는 세포 관련 분자의 측정을 병합하는 40 이상의 세포 어세이 결과 및 40 이상의 용해성 인자 어세이의 결과는 바람직하게 임상적 및 환경적 변수의 광범위한 집단과 함께 포함된다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 20 이상의 임상 변수, 바람직하게 40 이상의 임상 변수 및 일부의 경우 60 이상의 임상 변수가 포함된다.

환자에 대한 생물학적 정보를 풍부하면서 쉽게 얻은 소스는 혈액이다. 현재까지, 200 이상의 동정된 별개의 백혈구 세포 표면 항원과 동정된 항체가 있다. 게다가, 혈액중에서 동정될 수 있는 실제로 수천개의 단백질과 다른 용해성 인자 및 소분자가 있다. 따라서, 문제는 혈액중에서 충분한 양의 정보를 발견하는 것이 아니라, 제한된 양의 혈액으로부터 유용한 정보 모두를 효과적으로 추출하는 것이다.

생물학적 마커의 다수 레벨은 개체로부터 개체로 광범위하게 다양해질 수 있다. 많은 경우에서, 이런 변화는 무질서적일 수 있지만, 항상 그런 것은 아니다. 예를 들면, 일부의 상황에서 기준선 레벨은 개별적으로 특이해질 수 있고, 개개로부터 다중 리딩(multiple reading)을 이용하는 것으로 생물학적 마커를 동정하는 것이 가능하게 될 것이다. 비록 기준선이 건강한 개인에 대해 구축되지 않을지라도, 질병 또는 의학적 증상을 갖는 제공된 개체의 시간의 경과에 따른 변화로부터 얻은 정보는 가치가 있다. 예를 들면, 류마티스성 관절염 환자는 약물의 유무에 따라 또는 심한 증상이 나타나는 경우 흥미로운 변화를 보여준다. 이와 같은 종적인 상관관계가 존재하는 경우, 다른 유사한 상황의 환자의 종적 데이터의 검토가 질병과 관련된 생물학적 마커가 가치있다는 것은 확신시킬 수 있다. 시간이 연장된 기간의 경과 후 종적 데이터가 존재하는 경우, 통계적으로 중요할 수 있는 분석을 위해 필요한 개체의 수는 비교적 적게 될 것이다.

본 발명의 또 다른 적용은 약물 반응 모니터링 연구에 있다. 이 구현예에서, 개별 집단은 약물의 투여 전 및 후에 약물의 투여량을 증가시킨 후에 평가된다. 이 구현예에서, 선별된 집단은 건강한 개체일 수 있고, 예상된 생물학적 투여량 반응 종점은 독성 또는 부작용 프로파일이다. 개체가 특정 질병 또는 의학적 증상을 갖는 구현예에서, 마커는 약물의 음성 효과와 함께 효능에 대해서도 동정될 수도 있다. 약물의 투여 전 및 후 개체로부터 얻은 정보를 평가하는 것으로, 약물에 대한 투여와 반응과 관련된 마커 또는 마커 그룹핑을 동정하는 것이 가능해 질 것이다. 일부의 상황에서, 이와 같은 마커는 임상 연구에 대한 종점으로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 질병 진행 또는 재발 또는 삶의 질 평가(이것은 전형적으로 평가를 위해서는 장기간이 소요된다)와 같은 임상 종점과 대조적으로, 생물학적 마커는 약물의 임상적인 프로파일의 보다 빠르고 정량적인 측정을 제공할 것이다.

본 발명의 다른 구현예에서, 질병 또는 의학적 증상의 예방 또는 치료를 위한 약물 또는 치료를 제공받은 개체의 종적 연구는 평가되어지는 개체의 집단을 구성할 수 있다. 이들이 연속적인 임상 관찰로 치료를 받기 전에 개개인의 생물학적 표시기를 연관시키는 것에 의해, 처리 치료법으로부터 가장 이익을 얻을 다수의 잠재적인 환자 집단과 관련된 생물학적 마커를 동정하는 것이 가능해질 것이다. 이런 방식에서, 고가의 치료는 치료로부터 가장 이익을 얻는 환자의 하위집단으로 제한될 것이다.

본 발명의 또 다른 적용은 질병의 매우 이른 임상적인 징조를 갖는 환자를 동정하기 위한 생물학적 마커의 용도이다. 이것은 환자가 병원에 갈 정도로 충분히 심하지 않은 "준임상" 징조 및 증상을 갖는 다수의 질병 상태에서 매우 가치있다. 그러나, 환자가 그들의 혈액내에서 발견되는 마커를 가지고 있고 이들에게 의학적인 응급치료를 받을 것이 충고된다면, 그들의 "준임상" 징조는 질병의 초기 표현형의 제시로서 동정될 수 있다. 많은 질병의 경우에서, 약물 치료가 시작되고 개개인에 대해 질병의 실체의 병적 특성 및 사망율을 감소시킬 수 있도록 가능한 빠른 시일내에 질병을 진단하는 것은 매루 이롭다. 가능한 시나리오는 환자가 이들이 류마티스성 관절염에 대한 생물학적 마커를 가지고 있는지를 보기 위해 혈액 테스트를 받을 수 있는 경우일 것이다. 마커가 존재하는 경우, 이들은 관절통증, 부기 및 변형을 가질 때까지 기다리는 대신에 그들의 관절에서 온기의 감각만을 가지는 "준임상" 단계 동안 치료하려 할 것이다. 그 개개인은 치료를 하기 전에 질병의 말기까지 기다리는 사람과 비교해서 류마티스성 관절염에 대한 보다 좋게 오랫동안 회복될 것이다.

본 발명은 유기체 또는 유기체의 강 또는 아강의 표현형화에 관한 것이다. 상기 표현형은 다수의 데이터 카테고리로부터 데이터로 구성된다. 본 발명의 범위내에 포함된 데이터의 기본 카테고리는 ⅰ)생물학적 유체중의 세포 관련 분자들을 포함하는 세포 집단의 레벨, ⅱ)생물학적 유체중의 용해성 인자의 레벨, ⅲ) 투여 약물 및 약물 동력학(신체 내에서 약물 및 그의 대사 산물의 측정), 및 ⅳ) 임상 변수가 있다. 데이터의 추가적인 카테고리는 이것으로 제한되는 것은 아니지만 ⅰ) 생물학적 유체중에서의 소분자 화합물의 레벨, ⅱ) 개체의 유전자 배열 및 유전자 발현(mRNA 또는 전사물) 레벨을 포함하는 개체에 관한 유전자형 정보 레벨, 및 ⅲ) 소변 성분의 어세이로부터 얻은 데이터를 포함한다. 특정 구현예에서, 데이터 카테고리는 x-레이, 뇌 또는 신체의 CAT 스캔 또는 MRI와 같은 이미지, 또는 생검, EKG, 스트레스 시험, 내시경검사, 초음파 시험, 라파라스코픽 공정(laparascopic procedure), 오르토스코픽 수술(orthroscopic surgeries), PET 스캔, 또는 기타 개체의 증상 측정법으로 얻은 정보를 포함할 수 있다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 데이터베이스에 포함된 임상 변수는 이것으로 제한되는 것은 아니지만 개체의 나이, 성별, 제중, 키, 체형, 병력(코모비디티(comorbidities), 약물치료 등 포함), 질병 또는 의학적 증상(있다면)의 증상발현(manifestation) 및 카테고리화가 포함되고, 기타 표준 임상 관찰은 의사에 의해서 만들어진다. 임상 변수중에서 또한 포함되는 것은 환경 요인 및 가족력 요인일 수 있다.

임상 변수는 또한 정보가 얻어지는 소스에 의해 특징지워질 수 있다. 환자로부터 얻은 임상 변수에는 환자가 병원에서 기록할 수 있는 골관절염에 대한 WOMAC 및 류마티스성 관절염에 대한 건강 평가 질문서와 같은 질문서를 통해 제공하는 정보가 포함될 수 있다. 유사하게, 환자의 현재 임상 증상의 모든 것을 말하는 전자 또는 웹에 기초한 질문서가 병원 방문전에 환자에 의해서 작성될 수 있다. 간호사에 의해 얻은 정보는 바이탈 사인, 알러지 시험, 폐기능 시험, 스트레스-탈륨 시험 또는 ECG 시험으로부터 얻은 정보를 포함한다. 의사에 의해 수집된 임상 변수는 상세한 이전 병력, 수술, 입원, 약물, 약물 반응, 가족력, 사회력, 알코올/약물/흡연 이력 및 HIV 또는 간염에 걸릴 높은 위험성이 있는 환자에게 있는 기타 습관의 상세한 히스토리를 포함한다. 충분한 신체적 시험은 의사에 의해 또한 수행되어지며, 환자의 임상 변수의 결정적인 요소이다.

바람직한 구현예에서, 세포 집단 및 이들과 관련된 분자의 레벨은 마이크로볼륨 레이져 스캐닝 세포계측법(mcrovolume laser scanning cytometry)에 의해 동정된다. 이와 같은 데이타는 또는 흘림 세포계측법에 의해 얻어질 수 있지만, 흘림 세포계측 어세이를 수행하는데 필요한 혈액의 부피는 한번에 개개인으로부터 얻은 혈액으로 수행될 수 있는 어세이의 개수에 심한 제한을 가져온다. 게다가, 흘림 세포계측 어세이를 수행하기 위해 요구되는 샘플 제조법은 많은 시간이 소요되며 비용이 비싸고, 측정결과에 개입될 수 있다.

용해성 인자의 레벨은 임의의 적합한 기술에 의해 측정될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 용해성 인자의 레벨은 표준 면역어세이 기술, 예를 들면 ELISA 등과 같은 것에 의해 측정된다. 또 다른 구현예에서, 마이크로볼륨 레이져 스캐닝 세포계측법은 용해성 인자의 레벨을 얻는데 사용된다. 용해성 인자는 MLSC, ELISA 등과 같은 면역어세이, 질량 분광 분석법, 2D 겔 전기영동, 질량 분광 분석법과 면역흡착법의 조합 및 화학적 어세이에 의해 검출될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 세포집단은 MLSC 분석법에 의해 검출되고, 용해성 인자는 면역어세이 또는 질량 분광 분석법에 의해 검출된다.

본 발명은 소량의 혈액으로부터 생물학적 변수를 신속하고, 재현성 있으면서, 정량적으로 평가하기 위한 개선된 방법; 혈액중의 수백 내지 수천개의 생물학적 마커의 검출을 위한 개선된 방법과 조화되는 소형화된 고감도의 어세이; 시간의 경과에 따라 환자로부터 광범위한 의학적 정보 내용을 수집하기 위한 광범위한 임상 전략; 정상적인 생물학적 기능, 특이 질병, 질병 진행 및 치료에 대한 반응을 갖는 변수의 패턴을 연관시키는 소프트웨어, 데이터베이스 및 데이터 마이닝 툴; 약물 개발에 사용하기 위해 아카데미 센터 및 임상 연구기관과의 협력으로 얻은 임상 데이터 및 생물학적 마커의 데이터베이스; 마커의 소유 패턴 및 주어진 치료법으로부터 더 이익이 되도록 선도 화합물을 선택하고 환자를 동정하여 더 특징적으로 결정하는 것에 의해 약물 개발의 효능을 향상시키는 능력을 사용하는 진단 시험의 개발을 포함한다.

유기체를 표현형화하고 다수의 생물학적 변수를 재현성있고 신속하게 측정할 수 있는 독특한 능력은 소량의 혈액 샘플로부터 생물학적 마커의 신규한 패턴을 동정하는 본 발명에 필수적인 것이다. 지금까지 데이터에 대한 통계적인 분석은 다수의 상이한 세포 서브셋(subset) 또는 세포 집단에 대한 어세이가 정량적이며 매우 재현성이 있다는 것을 보여주고 있다. 적은 양의 혈액을 사용하고, 환자 샘플의 제한된 취급을 요구하는 본 기술은 다른 시판되는 측정 기술과 확연히 구별되는 이점을 갖는다.

본 발명은 또한 특정 질병에 관한 환자 집단의 연구를 포함한다. 이들 연구는 질병 패턴의 통계적 분석에 기초하고, 영향을 받은 개개인으로부터 얻은 다수의 혈액 샘플의 수집을 요구한다. 또한, 본 발명은 식물 및 동물에서 생물학적 마커를 표현형화하고 동정하기 위해 및 예비임상 연구에서 보조적으로 이용된다.

정의

본 명세서에 사용된 용어 "표현형" 또는 "표현형화"는 유기체의 모든 측정가능한 특징의 실질적인 서브셋을 포함하는 컴파일(compilation)을 말한다. 이런 특징 또는 변수는 이것으로 제한되는 것은 아니지만 세포 집단 및 이들의 관련 분자의 레벨, 용해성 인자의 레벨, 기타 분자의 레벨, 유전자형 정보, 유전자 발현 레벨, 유전자 돌연변이 및 임상 변수를 포함한다. 이런 특징 또는 변수는 모든 히스토리컬 데이터 및 현재 데이터를 포함한다. 예를 들면, 유기체의 완성된 표현형은 과거의 모든 시점에서 이런 특징 모두 뿐만 아니라 현시점에서 모든 측정가능한 특징을 포함한다. 기술적인 측정가능한 특징에 덧붙여, 표현형은 유기체의 느낌 또는 감정(유기체가 사람인 경우, 표현형은 개개인의 정신적 상태, 예를 들면 우울, 고통, 흥분, 정신병, 화학적 의존도를 포함한다); 식생활 및 식생활의 변화, 상처, 관계 히스토리(relational history), 성적 활동, 사회-경제적 상태를 포함한다.

본 명세서에 사용된 용어 "유기체"는 모든 식물, 동물, 바이러스 및 외계 물질을 말한다. 이 정의내에 포함된 것은 이것으로 제한되지 않지만 사람, 마우스, 랫트, 래빗, 가축, 천연 및 유전공학적 식물 및 천연 및 유전공학적 동물이 있다.

제공된 표현형은 단일 유기체 또는 유기체의 강 또는 아강의 특징들의 컴파일을 포함한다. 예를 들면, 표현형 데이터는 치료 개입 전 후 암으로 진단된 단일 수컷 개체, 15 내지 55세의 수컷 그룹 또는 암으로 진단된 15 내지 55세의 수컷 그룹으로 얻을 수 있다. 이런 방식에서, 표현형은 제공된 개체에 특이적이 될 수 있거나 또는 개체의 조합된 그룹의 평균적인 또는 전형적인 증상을 나타낼 수 있다.

개개의 유기체 또는 유기체 집단의 표현형은 많은 목적을 위해 사용될 수도 있다. 본 발명의 가장 넓은 안에서, 표현형은 유기체에 대한 일부의 섭동 후에 종적으로 관찰되고 평가된다. 예를 들면, 천식의 증상을 보이기 전 및 후에 개체의 표현형을 비교한 결과는 천식과 관련된 생물학적 마커를 동정하는데 사용될 수 있다. 또 다른 실예에서, 천식에 걸린 개개인의 표현형은 정상 성인 집단의 표현형과 비교되어질 수 있다. 또 다른 실예에서, 자연적으로 발생하는 식물의 표현형은 측정가능한 특징이 유전자 변형의 도입으로 변경될 수 있는지를 결정하기 위해 유전적으로 번형된 식물의 표현형과 비교되어질 수 있다. 표현형화 정보의 사용의 또 다른 실예는 개체의 좋은-환자 상태를 주기적으로 모니터하는 것과 생물학적 노화 과정의 척도를 추적하는 것이다. 유기체에 대한 표현형 데이터의 광범위한 잠재적인 용도들은 거의 무한하다.

본 발명은 유기체 또는 유기체의 강 또는 아강에 대한 표현형, 이런 표현형을 얻기 위한 방법 및 생물학적 마커를 동정하는 것을 포함하여 이런 표현형을 이용하기 위한 방법을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "생물학적 마커" 또는 "마커" 또는 "바이오마커"는 정상적인 및 비정상적인 생물학적 과정, 발병 과정 또는 치료적 개입에 대한 약물 반응의 표시기로서 측정되고 평가되는 특징 또는 변수를 의미한다. 치료적 개입에 대한 약물 반응은 이것으로 제한되는 것은 아니지만 일반적인 개입(예를 들면, 효능), 개입에 대한 약물투여 반응, 개입의 부작용 프로파일 및 약물 동력학적 특성을 포함한다. 반응은 효과적인 또는 나쁜(예를 들면, 독성) 변화와 연관될 수 있다. 생물학적 마커는 발병 과정과 연결되어 변하는 세포 또는 분자의 패턴 또는 전체적 효과를 포함하며 진단 및/또는 예후 유용성을 갖는다.

생물학적 마커는 이것으로 제한되지는 않지만 세포 집단 및 이들과 관련된 분자의 레벨, 용해성 인자의 레벨, 다른 분자의 레벨, 유전자 발현 레벨(mRNA 또는 전사물), 유전자 돌연변이 및 질병의 존재 및 진행, 정상적인 생물학적 과정, 치료에 대한 반응과 연관될 수 있는 임상 변수를 포함한다. 임상 실습 및 약물 개발 모두에 현재 사용되는 단일 생물학적 마커는 콜레스테롤, PSA, CD4 T세포, 및 바이러스성 RNA가 포함된다. 고 콜레스테롤과 심장 질환, PSA와 전립암, 및 CD4 양성 T 세포와 바이러스성 RNA 및 AIDS 사이의 공지된 연관성과 달리, 대부분의 다른 질병과 관련된 생물학적 마커는 아직 동정되지 않았다. 결과적으로, 비록 정부 기관 및 제약 회사들이 임상적인 실험에 사용하기 위한 생물학적 마커의 개발에 총력을 기울이지만, 약 개발에서 생물학적 마커의 용도는 아직까지 제한되어 있다.

비제한 실시예로서, 생물학적 마커는 정상적인 생물학적 상태, 질병 또는 의학적 증상과, 예를 들면 심장질환의 증가된 위험성과 연관있는 고 콜레스테롤, 전립선암의 증가된 위험성과 연관있는 증가하는 PSA 레벨, AIDS의 존재 /진행과 연관있는 감소된 CD4 T 세포 및 증가된 바이러스성 RNA와 같이, 구별된 관계를 갖는 것으로 주로 생각되어진다. 그러나, 다양한 질병 또는 의학적 증상에 대한 유용한 마커는 현저하게 복잡한 패턴으로 구성될 수도 있다. 예를 들면, 특이 세포 유형상의 하나 이상의 특이 세포 표면 항원의 감소된 레벨은 이것이 하나 이상의 용해성 인자, 예를 들면 아마도 사이토카인의 증가된 레벨과 관련되어 밝혀지는 경우, 특별히 자가면역 질환의 전조가 된다. 따라서, 본 발명의 목적을 위해, 생물학적 마커는 다수의 표시기의 패턴으로 언급될 수도 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "생물학적 마커 동정 시스템"은 환자 집단으로부터 정보를 획득하고, 데이터를 연관시킬 수 있고 생물학적 마커를 동정할 수 있는 방식으로 상기 정보가 비교되어지는 시스템을 의미한다. 생물학적 마커 동정 시스템은 다수의 데이터 카테고리, 상기 데이터 카테고리 각각에 대응하는 다수 개체로부터 얻은 데이터, 및 데이터 카테고리 내에 데이터를 연관시키기 위한 가공 수단을 포함하는 통합된 데이터베이스를 포함하고, 여기서 데이터 카테고리의 연관 분석은 질병 또는 의학적 증상을 갖는 개체가 상기 질병 또는 의학적 증상을 갖지 않는 개체와 구별되어질 수 있는 데이터 카테고리 또는 카테고리들을 동정하기 위해 만들어질 수 있고, 여기서 상기 동정된 카테고리 또는 카테고리들은 상기 질병 또는 의학적 증상에 대한 마커이다. 추가로, 마커는 다른 시점에서, 예를 들면 약물의 투여 전 및 후에 단일 개체에 대한 다양한 데이터 카테고리에서 데이터를 비교하는 것으로 동정될 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "데이터 카테고리"는 유기체에 대해 인식될 수 있는 모든 유형의 측정을 의미한다. 본 발명에서 유용한 데이타 카테고리의 실예는 이것으로 제한되지 않지만 유기체의 생물학적 유체중의 세포 집단 또는 이들과 관련된 분자의 수와 유형, 유기체의 생물학적 유체중의 용해성 인자의 수와 유형, 유기체의 임상 변수와 연관된 정보, 유기체의 생물학적 유체의 ㎖당 세포 체적측정의 수(counts), 개체의 생물학적 유체중에 소분자의 수와 유형, 유기체의 DNA와 관련된 유전자 정보 및 유전자 발현 레벨 등이 포함된다. 예를 들면, 단일 데이터 카테고리는 유기체의 혈액중에서 IL-1의 농도를 나타낸다. 추가로, 데이터 카테고리는 혈액 및 소변중에서 약물 또는 그의 대사산물의 레벨이 될 수 있다. 추가로, 데이터 카테고리의 실예는 절대적인 CD4 T 세포수일 수 있다. 임의의 시점에서 유기체 또는 유기체의 강 또는 아강에 지정된 다수의 정보는 유기체의 표현형을 포함한다.

본 명세서에 사용된 용어 "생물학적 유체"는 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 혈액(전체 혈액, 붉은 혈액 세포 용해에 의한 제조된 백혈구, 주변 혈액 단일층 세포, 혈장 및 혈청), 침, 소변, 정액, 뇌척수액, 기관지 대기음, 땀, 배설물, 활액 및 전체 또는 처리된 조직을 포함한 임의의 생물학적 물질을 의미한다. 생물학적 유체는 전형적으로 세포 및 그들의 관련된 분자, 용해성 인자, 소분자 및 기타 물질을 포함한다. 혈액은 많은 이유로 본 발명에서 바람직한 생물학적 유체이다. 첫째, 이것은 용이하게 이용할 수 있고 여러번 뽑아낼 수 있다. 혈액은 시간이 경과하면 골수의 전구체로부터 어느 정도 보충한다. 혈액은 항원공격에 대해 반응성이고 항원공격의 메모리를 갖는다. 혈액은 중심적으로 위치되고 순환하며, 신체 전반의 변화에 대해 잠재적으로 기록한다. 혈액은 표면 분자, 내부 분자 및 개별 세포와 관련된 분비된 분자를 포함하여 다수의 세포 집단을 포함한다. 혈액은 또한 사이토카인, 항체, 급성기 단백질 등과 같은 자기유래 및 화학약품 및 감염성 질병의 산물과 같은 외래의 용해성 인자를 모두 포함한다.

본 명세서에 사용된 용어 "세포 집단"은 공통의 특징을 갖는 세포의 무리를 의미한다. 상기 특징은 한개, 두개, 세개 또는 그 이상의 세포 관련 분자의 존재 및 레벨, 크기 등을 포함할 수 있다. 한개, 두개 또는 그 이상의 세포 관련 분자는 세포 집단을 정의할 수 있다. 일반적으로 일부의 추가 세포 관련 분자는 세포 집단을 추가로 서브셋 하는데 사용될 수 있다. 세포 집단은 세포 레벨에서 동정되고 단백질 레벨에서는 동정되지 않는다. 세포 집단은 한개, 두개 또는 그 이상의 분자에 의해 정의될 수 있다. 임의의 세포 집단은 잠재적인 마커이다.

본 명세서에 사용된 용어 "세포 관련 분자"는 세포와 관련된 임의의 분자를 의미한다. 이것은 이것으로 제한되는 것은 아니지만: 1) 단백질, 당단백질, 지질 및 당지질과 같은 내재성 세포 표면 분자; 2) 그들의 수용체에 결합된 사이토카인, Fc 수용체에 결합된 면역글로블린, B 세포 또는 T 세포 수용체에 결합된 외래 항원 및 자기유래 항원에 결합된 자가-항체와 같은 외래성 세포 표면 분자; 3) 사이토플라스믹(cytoplasmic) 단백질, 탄수화물, 지질과 mRNA, 및 핵 단백질과 DNA(유전자 및 체세포 핵산 포함)와 같은 내재성 내부 분자; 및 4) 바이러스성 단백질 및 핵산과 같은 외래성 내부 분자를 포함한다. 바람직한 세포 관련 분자는 전형적으로 세포 표면 단백질이다. 실예로서, 수백개의 백혈구 세포 표면 단백질 또는 항원이 있고, 이들은 백혈구 분화 항원(CD 166을 통한 CD 항원 포함, Leucocyte Typing VI, Kishimoto, T.et al., ED, 1997 참조), 항원 수용체(예를 들면, B 세포 수용체, T 세포 수용체), 및 주조직적합복합체를 포함한다. 이들의 종류의 각각은 방대한 수의 단백질을 포함한다. 세포 표면 단백질의 일예의 리스트는 표 1에 제공되고, 이것은 방대한 수의 세포 표면 단백질을 나타내는 것일뿐, 포괄적인 리스트가 될 필요는 없다.

본 명세서에 사용된 "용해성 인자"는 세포 집단 또는 세포 관련 분자가 아닌생물학적 유체 또는 조직의 임의의 측정가능한 구성분을 의미한다. 용해성 인자는, 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 용해성 단백질, 탄수화물, 지질, 당단백질, 스테로이드, 금속성, 무기성, 이온성, 유기금속성 종을 포함한 기타 소분자, 및 사이토카인 및 용해성 수용체와 같은 상기 성분의 임의의 착물; 항체와 항원; 및 임의의 것과 착화된 약물이 포함된다. 용해성 인자는 사이토카인, 항체, 급성기 단백질 등과 같은 자기유래의 것 및 화학약품, 감염성 질환의 생성물, 장내 세균과 동물군과 같은 외래의 것일 수 있다. 용해성 인자는 유기체 의해 생성된 내재성일 수 있고 또는 바이러스, 약물 또는 환경적인 독소와 같은 외인성일 수 있다. 용해성 인자는 프로스타글라딘, 비타민, 대사산물(예를 들면, 철, 설탕, 아미노산 등)과 같은 소분자 화합물일 수 있다. 용해성 단백질의 실예는 표 6에 제공되고, 이것은 방대한 수의 용해성 단백질을 나타내며 결코 포괄적인 리스트는 아니다.

본 발명의 목적을 위해, 용해성 인자는 공지된 또는 미공지된 실체이다. 다양한 기술이 제공된 종이 동정되는데 유용하지만, 종의 화학적 본질은 공지되지 않는다. 본 발명에서, 용해성 인자의 화학적 본질은 현재 공지될 필요가 없거나 또는 어세이가 그의 존재 또는 부재를 결정하기 위해 행해지는 경우에 공지될 필요는 없다.

본 명세서에서 사용된 용어 "소분자" 또는 "유기분자" 또는 "소 유기분자"은 분자량이 18 내지 10,000인 용해성 인자 또는 세포 관련된 인자를 의미한다. 소분자는 이것으로 제한되는 것은 아니지만 프로스타글라딘, 비타민, 대사산물(예를 들면, 철, 설탕, 아미노산 등), 약물 및 약 대사산물을 포함한다.

본 명세서에 사용된 용어 "질병 또는 의학적 증상"은 신체 기능, 시스템 또는 기관의 방해, 중지, 장해 또는 변화를 의미한다. 질병 또는 의학적 증상의 실예는 이것으로 제한되는 것은 아니지만 면역성 및 염증성 증상, 암, 심장혈관 질환, 감염성 질환, 정신과적 증상, 비만 및 기타 다른 질병을 포함한다. 설명을 통해, 면역성 및 염증성 증상은 자가면역 질환을 포함하고, 이것에는 또한 류마티스성 관절염(RA), 다발성 경화증(MS), 당뇨병 등이 더 포함된다.

본 명세서에 사용된 용어 "섭동"은 유기체에 일어날 수 있는 외부 또는 내부 측정가능한 사건을 의미한다. 단순한 실예는 개체에 또는 건강했지만 이후에 천식이 생긴 개체에 치료적 제제의 투여일 수 있다. 이 적용에서, 섭동은 비교될 수 있는 개체 또는 유기체 집단 사이에서의 차이를 포함할 수도 있다. 예를 들면, 동물의 집단은 정상적인 것으로 여겨질 수 있고, 그들의 표현형은 유사하지만 유전적으로 변형된 동물의 표현형과 비교될 수 있다. 유전적으로 변형된 개개의 동물은 그의 유전적 변형이 정상적인 것으로부터 섭동되는 점에서 섭동된다. 많은 경우에서, 섭동은 때를 맞춘 불연속 지점에서 발생하는 단일 사건이 아니다. 섭동은 연장된 시간 동안 일어날 수도 있고 및/또는 순환되거나 간헐적일 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "임상 변수"는 질병 또는 의학적 증상과 관련되어 얻어질 수 있는 정보를 의미한다. 이런 정보는 환자에 의해 제공되거나 또는 의학 또는 과학적 관찰자에 의해 제공될 수 있다. 사람에 대한 임상 변수의 실예는 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 나이, 성, 체중, 키, 체형, 병력, 민족색, 가족력, 유전적 요인, 환경적 요인, 질병 또는 의학적 증상의 증상발현 또는 카테고리화, 및 혈압, MRI, x-레이, 등과 같은 임상 실험의 임의의 결과를 포함한다.

임상 변수는 또한 얻어지는 정보의 소스에 의해 특징지워질 수 있다. 환자로부터 얻은 임상 변수는 병원에서 종이에 기록하는 골관절염에 대한 WOMAC과 같은 질문서 및 류마티스성 관절염에 대한 건강 평가 질문서를 통해 환자가 제공한 정보를 포함할 수도 있다. 유사하게, 환자의 현재 임상적 증후의 모든 것을 기록하는 전자적 또는 웹에 기초한 질문서는 병원 방문 전에 환자에 의해 완성될 수 있다. 간호사에 의해 얻어진 정보는 바이탈 사인, 알러지 시험, 페기능 시험, 스트레스-탈륨 시험 또는 ECG 시험을 포함한 다양한 시험으로부터 얻은 정보을 포함한다. 의사로부터 수집된 임상 변수는 상세한 이전 병력, 수술, 입원, 약물, 약물 반응, 가족력, 사회력, 알코올/약물/흡연 이력 및 HIV 또는 간염에 걸릴 높은 위험성이 있는 환자에게 있는 기타 습관의 상세한 히스토리를 포함한다. 충분한 물리적 시험은 의사에 의해 또한 수행되어지며, 이것은 환자의 임상 변수의 결정적인 요소이다.

본 명세서에 사용된 용어 "유전자형 정보"는 유기체 유전자 구조, 유전자 돌연변이, 유전자 발현, 예를 들면 mRNA 또는 전사물 레벨, 및 유기체의 유전자 물질과 관련된 임의의 다른 측정 또는 변수와 관련한 임의의 데이터를 의미한다.

본 명세서에 사용된 용어 "임상 종점"은 환자가 어떻게 느끼고 기능하고 또는 살아남는지를 측정하는 특징 또는 변수를 의미한다. 특이 질병에 걸린 환자가 어떻게 느끼고 또는 기능하는지를 측정하는데 공통적으로 사용되는 여러가지 메카니즘이 있고, 이들은 유효한 임상 질문서를 주로 포함한다. 이들은 베크의 우울증질문서(Beck's depression questionnaires) 또는 소변에서의 변화가 전립선 비대증 또는 방광 배출 장애에 기인했는지를 결정하는 국제적인 전립선 질문서(International Prostate Questionnaire)와 같이 스스로 관리되어질 수도 있다. 이들 툴(tool)은 환자가 조병인지 아닌지를 판단하기 위한 캐롤 질문서(Carrol Questionnaire)를 완성하는 동안, 안면 표정, 10분이상 동안 앉고 일어설 수 없는 무력, 흥분의 레벨 등과 같은 특징을 판단하는 보건 공급자에 의해 제공될 수 있다. 그리고 최종적으로, 정신병인 경우, 전형적으로 그들 병의 급성적인 악화로 입원을 위해 허가받는 환자는 그룹 상호작용 또는 점심 만들기를 포함한 다양한 상황에서 기능할 수 있는 그들의 능력을 메모하기 위해 임상의사가 이것을 사실로 알 필요없이 처리되어질 수 있다. 이들 "임상 종점"은 질병의 실체 마다 매우 다를 수 있고 이어서 이들 종점을 특징화하는데 사용될 수 있는 툴은 또한 매우 광범위하다.

본 명세서에 사용된 용어 "마이크로볼륨 레이져 스캐닝 세포계측법" 또는 "MLSC"는 형광적으로 라벨화된 검출 분자를 사용하고, 샘플을 형광 방출이 기록되는 광학적 스캐닝 처리하여 소량의 샘플에서 구성요소의 존재를 검출하는 방법을 의미한다. 상기 MLSC 시스템은 다른 기술과 구별되는 여러가지 중요한 특징을 가지고 있다: 즉, 1) 혈액의 소량(5 내지 50㎕)만이 많은 어세이를 위해 요구되어진다; 2) 절대적인 세포수(세포/㎕)를 얻는다; 및 3) 어세이는 전혈에서 또는 정제된 백색 혈액 세포에서 직접적으로 실행될 수 있다. 이들 기술의 이행은 혈액의 단일 회수로부터 수백개의 다른 세포 집단의 측정을 용이하게 할 것이다. 상기 MLSC 기술은 미국 특허 제5,547,849호 및 제5,556,764호 및 다이츠 등에 의한 문헌[Cytometry 23 : 177-189(1996)], 1999년 7월 21일자로 "레이져-스캐너 공초점 시간-분해된 형광 분광학 시스템"의 명칭으로 미국 가출원된 제60/144,798호 및 "마이크로볼륨 레이져 스캐닝 세포계측법을 위한 시스템"의 명칭으로 본 출원과 동시에 출원된 공동 소유의 실용신안 출원에 기술되어 있고, 이들 각각은 전체로서 본 명세서에 포함된다. 마이크로볼륨 모세관을 이용하는 레이져 스캐닝 세포계측법은 전혈, 가공된 혈액 및 다른 유체중에서 형광색으로 라벨화된 세포를 모니터링하는 강력한 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 소량의 혈액으로부터 다중 생물학적 마커를 동시적으로 측정하는 MLSC 도구의 용량을 개선시키는 것으로 MLSC 기술을 개선하는 것이다. 개선된 서로스캔 광학 시스템의 개략적인 것은 도 2에 나타낸다.

본 명세서에서 사용된 용어 "태그"는 이것으로 제한되는 것은 아니지만 원자, 분자, 분자의 단편 또는 관능기; 입자 또는 입자의 조합; 단일 또는 연속적인 전자기적 펄스; 또는 구성요소를 동정하고, 정량하고, 연관시키고, 인식하고, 추적하고, 얼룩지게하고, 이해하고, 보고, 명명하고, 찾아내고 또는 기타 구별(이하 I/Q라 함)하기 위해 사용되는 생물학적 시스템의 구성요소(세포, 양이온, 음이온, 원자, 또는 이것으로 제한되는 것은 아니지만 생물학적 분자들 사이의 비공유적 착물을 포함한 임의의 초분자 어셈블리와 같은 분자 또는 분자의 집단)에 관련된, 부착된(공유적으로 또는 비공유적으로) 또는 기타 결합된 소정의 다른 형태 물질을 포함하는 실재물 또는 종을 의미한다.

태그는 주로 외인성이고, 예를 들면 조사하에서 구성요소의 일부가 아니다. 예를 들면, 형광 염료 분자는 주로 태그로서 추적, 정량 또는 양쪽 모두를 위해 사용된다. 마찬가지로, 태그로서 ELISA를 위한 효소와 같은 이차 종에 결합된 바이오틴 또는 스테렙타비딘의 사용은 널리퍼져있다. 태그의 기타 형태는 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 질량 분광 분석법에 의한 단백질 I/Q용 동위원소 질량 태그, 라만 산란(Raman scattering)에 의한 I/Q용 라만-활성 태그, 광선 산란, 형광, 응집, 에너지 전이 및 기타 다양한 검출 메카니즘(표면 플라즈몬 공명 포함)에 의한 I/Q 미립자 태그를 포함한다.

이에 관해서, 거의 무한한 수의 미립자 태그가 있지만, 이전부터 사용되고 있는 것은 소수이다. 나노입자 과학이 아직 초기상태(마치 2세기 전의 유기화학과 같다)이므로, 미립자 태그의 복잡성은 분자 복잡성에 접근시킬 것으로 예상되어진다. 즉, 본 발명자들은 미립자 태그가 조합 화학에서 비드 태그, 즉 수백 내지 수천 또는 수백만의 특출한 동정가능한 태그로서 현재 사용되는 유기 분자와 경쟁될 것이라고 기대하고 있다. 본 발명자들은 또한 이런 태그가 모든 세포내 측정이 가능할 수 있게 충분히 작게 될 것이라고 기대하고 있다. 예를 들면, 현재 다른 파장에서 각각 형광을 발하는 6개의 다른 발광성 반도체성 양자 도트 나노 입자가 있다. 이론적으로, 검출 메카니즘이 형광(또는 기타 광학 방법)을 포함할 수도 또는 포함하지 않을 수 있지만, 이런 직교 나노입자 광학 태그를 수천 또는 수백만 생산할 수 있다고 기대할 수 있다.

상기와 같은 것을 초분자 과학 및 초분자 태그로 말해질 수 있다. 본 발명자들은 비공유적인 힘에 의해 함께 수용된 분자 어셈블리가 궁극적으로 태그로서의 용도를 발견할 수 있다고 기대하고 있다. 게다가 태그는 생물학적 구성요소와 공유적으로 또는 비공유적으로 연결된 개개의 분자를 포함할 수 있다. 예를 들면, 구성요소를 독특하게 동정하는 전기화학적으로 활성인 산화환원 태그를 사용하는 것을 상상할 수 있다. 만일 태그가 각각의 다른 산화환원 전위를 갖고 특별한 생물학적 구성요소와 반응하기 위해 각각 미리 관능화된 10개의 다른 분자를 가지고 있다면, 이것은 특징을 동정하는 것으로 산화환원 전위를 검출하는 것을 사용하여 다중화된 태그 I/Q를 수행할 수 있다. 이것은 형광을 이용하고, "파장" 스페이스 대신 사용된 산화환원 "스페이스"를 이용하는 현재 사용되는 전략과 동일하다.

태그가 카르복실산염, 아민, 설탕 등과 같은 관능기 또는 분자와 결합된 수평한 스핀일 수 있다는 것을 또한 주의해야 한다. 예를 들면, 본 발명자들은 두개의 샘플이 서로 혼합될 수 있는 가능성을 예상하고, 여기서 각각의 샘플은 특별히 연속적인 전자기적 펄스(하이 필드 NMR에서 전형적으로 사용되는 종류의 것)로 부여된 하나 이상의 핵을 갖는다. 본 발명자들은 또한 두개 샘플에 대한 펄스가 검출 방법을 사용하는 이들을 비교하기에 충분히 수명이 길다고 예상한다. 특히, 본 발명자들은 두개 샘플에 대한 사인(signature)이 농도가 동일한 모든 종에 대해서 취소되고, 두개 샘플의 농도가 동일하지 않은 종만 시그널을 남겨둘 수 있다는 가능성을 예상한다.

상기에서 정의된 바와 같은 태그 및 화학 및 생물학적 문헌에서 전형적으로 사용된 바와 같은 "수용체" 또는 "수용체 분자" 사이에 관능적인 차이가 없다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 마찬가지로, 이하에 정의되는 "검출 분자"는 그 자제가 태그가 될 수 있다(예를 들면 I/Q가 질량에 기초하는 경우, 수정 결정 미량천칭 또는 압전 관성 바이오센서).

본 명세서에 사용된 용어 "검출 분자"는 이것으로 제한되는 것은 아니지만 세포 관련 분자, 용해성 인자 또는 소분자 또는 유기 분자를 포함하는 분자 또는 기타 해당 종에 결합할 수 있는 임의의 분자 또는 분자 어셈블리를 의미한다. 바람직한 검출 분자는 항체이다. 상기 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있다. 그러나, 새로운 유형의 검출 분자가 발견되고 빈번해지면서 이들이 확실히 이용될 수 있다는 것에 주의해야 한다. 예를 들면, 압타머(aptamer)는 분자 인식을 위해 증가적으로 사용되고 있고, 유기 화학자들은 다수의 분자 수용체를 합성하고 있다. 궁극적으로, 이들은 검출 분자로서 자체적으로 또는 태그와 연관되어 사용될 수 있다.

본 명세서에 사용되는 용어 "염료", "형광단(fluorophore)", "형광 염료"는 레이져에 의해 여기되는 형광을 발할 수 있는 분자를 의미하는 것으로 상호적으로 사용된다. 상기 염료는 전형적으로 본 발명에서 검출 분자에 직접적으로 연결되는 것이지만, 간접 결합이 또한 여기에 포괄된다. 많은 염료가 이 분야에 공지되었지만, 표 2에 기재된 것을 포함하며, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 특별히 바람직한 구현예에서, 스펙트럼의 붉은 영역(＞600nm)에서 여기될 수 있는 형광단이 사용된다. 두개의 붉은 염료는 Cy5 및 Cy5.5가 전형적으로 사용된다. 이들은 방출 피크 665 및 696 나노미터를 각각 갖고, 항체에 용이하게 결합될 수 있다. 이들모두는 헬륨-네온 레이져로 633nm에서 여기될 수 있다. 사용될 수 있는 세개의 붉은 염료 세트는 Cy5, Cy5.5 및 Cy7 또는 Cy5, Cy5.5 및 Cy7 APC를 포함한다. 문헌[Mujumdaret al., BioconjugateChemistry,7:356(1996); 미국 특허 제5,268,486호; Beaviset al., Cytometry,24:390(1996); Roderser et al., Cytometry, 24:191(1996); 및 미국 특허 제5,714,386호]참조. 본 발명 내의 태깅(tagging) 또는 검출 목적을 위해 유용한 추가적인 신규한 염료는 1999년 7월 6일에 "결합된 형광 염료, 이들의 제조방법 및 이들의 어세이에서의 용도"의 명칭으로 출원된 공동 소유의 미국 가출원 제60/142,477호에 설명되어 있고, 이것은 전체로서 참조를 위해 본 명세서에 포함된다.

본 명세서에 사용된 용어 "동물 모델"은 사람의 질병 또는 의학적 증상에 대해 유사한 병소 및 진행을 갖는 질병 또는 증상이 발전될 수 있는 임의의 실험적인 동물 시스템을 말한다. 적합한 동물 시스템으로는 이것으로 제한되는 것은 아니지만 랫트, 마우스, 래빗 및 영장류를 포함한다. 일부의 경우에서, 질병은 동물 모델에서 동시적으로 일어난다. 다른 경우에서, 동물 모델에서 질병의 유도는 동일한 조건 노출시키는 것, 예를 들면 사람에게 질병을 일으키는 병원균으로 감염, 독성에 노출 또는 특별한 식이요법으로 초래할 수 있다. 선택적으로, 질병 또는 증상은 사람 질병 또는 의학적 증상의 실제적인 개시제가 알려지지 않은 경우일지라도 사람 질병 또는 의학적 증상을 모방하는 제제를 이용하여 동물 모델에 유도시킬 수 있다. 이 질병 또는 의학적 증상은 외과적 시술의 사용을 통해 유도될 수도 있다. 실험적 동물 모델 시스템의 유전적 조작은 단독으로 또는 질병 유도의 다른방법과 조합하여 동물 모델의 개발을 위한 또 다른 툴을 제공한다.

표현형화의 임상전 적용

현재 사람의 생물학적 마커를 동정하고 분석하려고 많은 노력을 하고 있다. 그러나, 실험적 동물 모델 시스템에서 생물학적 마커를 동정하고 분석하기 위한 방법을 갖는 것이 요구되어진다. 예를 들면, 특정의 사람 질병 진행의 생물학적 마커는 그 질병의 실험적으로-유도된 동물 모델, 예를 들면, 관절염의 랫트 보조 모델에서 동정될 수 있다. 문헌[Philippe, et al, American Journal of Physiology 273:R1550-56(1997)]에서 검토. 동정된 마커를 이용하여, 실험적 치료의 효능이 동물 모델에서 결정될 수 있다. 동물에서 생물학적 마커(여기서 마커는 사람의 동일한 질병을 예측 또는 진단한다)의 발현에 대한 고특이성 효과를 갖는 치료는 따라서 초기 실시 없이 및 사람의 임상 실험에 대한 위험성 없이 동정될 수 있다. 선택적으로, 신규한 생물학적 마커는 사람 질병의 실험적 동물 모델에서 동정될 수 있고, 이어서 실험은 동일한 마커 또는 그들의 사람 상동물이 사람의 동일한 질병 또는 의학적 증상의 예측 또는 진단을 하는지를 결정하기 위해 행해질 수 있다. 일부의 경우에서, 사람에서 동정된 생물학적 마커는 동물 모델이 대응하는 생물학적 마커에 의해 평가될 수 있는 임상전 시도를 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 이런 분석을 수행하기 위한 방법 및 수단을 제공한다.

본 발명의 일련의 구현예에서, 생물학적 마커의 발현은 사람 질병을 갖는 동물 모델에서 연구된다. 특이 질병을 유도하기 위한 다양한 다른 기술을 사용하여 발전시키는 이와 같은 모델들이 현재 더욱 더 많아지고 있다. 각각의 경우에서,해당 생물학적 마커는 MLSC를 사용하는 바람직한 구현예에서 초기에 동정될 수 있다. 동정된 마커는 이어서 후보 치료법에 대한 동물의 반응을 결정하기 위해 MLSC를 사용하여 연구되어질 수 있다. MLSC에 기초한 어세이는 전형적으로 적은 부피의 생물학적 유체만을 요구하고, MLSC는 동물을 희생시키기 않으면서 오직 한정된 양의 유체를 동물로부터 얻을 수 있는 동물 모델 시스템(특히 랫트 및 마우스)에 사용하는데 유일하게 적합하다. 특히, MLSC의 사용은 후보 치료법의 약물동력학을 결정하기 위해 실험적 동물의 다중 시간 포인트 분석(multiple time point analysis)을 허용한다.

본 발명의 일부의 구현예에서, 특별한 질병의 공지된 또는 새로이 동정된 사람 생물학적 마커의 동물 상동물은 그 질병이 실험적으로 유도된 동물 모델에서 연구되어진다. 많은 경우에서, 사람 분자의 동물 상동물은 미리 공지되고 특정화될 것이다. 예를 들면, 광범위한 연구를 통해, 많은 부분이 마우스 및 사람에서 유사하게 행동하는 단백질에 대해 알려진 것이다. 사람 생물학적 마커의 이전에 공지되지 않은 동물 상동물의 동정화 및 이들에 결합할 수 있는 시약의 제조는 이 분야에서 표준 분자 생물학 기술을 사용하는 것으로 성취될 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에서, 신규한 생물학적 마커, 예를 들면 공지된 혈액 세포-관련 단백질의 이전에 미공지된 패턴은 사람 질병의 동물 모델에서 초기에 관측되어질 수 있다. 이 구현예에서, 사람 질병의 진행 또는 발전에 대한 동정된 마커의 관련성은 생물학적 마커의 사람 상동물을 동정하고, 이어서 관련되는 질병으로 고통받는 사람에서 그들의 발현을 연구하는 것으로 결정될 수 있다. 동정된 동물 생물학적 마커가 사람 질병과 관련되어 나타난다면, 이어서 이들은 1) 사람 질병에 대한 새로운 진단 및 예측 어세이의 기반으로서; 및 2)질병의 동물 모델에서 후보 치료법의 특이성 및 효능을 평가하기 위한 수단으로 제공된다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 신규하고 개선된 동물 모델은 사람에서 동정된 생물학적 마커에 기초해서 발전될 수도 있다. 예를 들면, 본 발명의 생물학적 마커 동정 시스템을 사용하는 것으로, 특정 세포 집단이 감소하는 동안, 혈청중에 제공된 용해성 인자의 레벨을 크게 증가시키는 주어진 질병 또는 의학적 증상에 대해 밝혀질 수 있다. 이런 정보에 기초하여, 동물 모델은 예를 들면 상동물 인자의 유전적 넉아웃을 사용하는 것으로 동물 혈청에서 질병을 보다 더 잘 시뮬레이션하기 위해 조정될 수 있다.

본 발명의 표현형화 시스템은 또한 신규하거나 또는 개선된 동물 모델의 동정에 유용할 수도 있다. 예를 들면, 다수의 유전적으로 변형된 동물을 표현형화함으로써, 유전적 변형의 증상발현의 더욱 완전한 그림이 인식될 수 있다. 이런 지식의 활용은 신규하거나 또는 개선된 동물 모델을 동정하는데 유용할 수 있다. 예를 들면, 선택된 사람 질병 상태를 시뮬레이션하도록 모든 것이 나타나는 다수의 유전자 넉아웃 마우스들을 만드는 것이 가능하다. 그러나, 질병으로 고통받는 사람 뿐만 아니라 다양한 넉아웃 각각을 표현형화하는 것으로, 사람 질병을 거의 근접하게 모방하는 동물 모델을 동정하는 것이 가능해 질 것이다.

본 발명은 사람 질병을 갖는 임의의 동물 모델에서 사용될 수 있다. 실예만으로, 본 발명은 고혈압, 아테로마성 동맥경화증, 심장 비대증, 동맥경화증, 및 혈전증을 포함한 심장혈관 질환의 다수 태양의 동물 모델에서 생물학적 마커를 동정하고 분석하는데 사용될 수 있다. 선척전인 심장 질환 및 비대증을 갖는 다수의 동물 모델은 현재 개발되어 있으며, 다수가 하기의 문헌에서 검토되었다. 문헌[Carmeliet, Artherosclerosis, 144:163-93(1999); Young et al., Molecular Basis of Cardiovascular Disease, 37-85(K.R. Chien, Editor)(1999); Hasenfuss, Cardiovasc. Res. 39:60-76(1998); Krege et al, Fundam. Clin. Cardiol. 26:271-92(1996); Lioa et al., Am.J.Therap. 4:149-58(1997); 및 Becker et al., Hypertension 27: 495-901(1996)]. 하기는 심장혈관 질환의 일부 동물 모델의 부분적인 리스트이다.

·사람 혈관 질환의 JCR:LA-cp 랫트 모델은 인슐린 내성, 혈관병증, 및 심장혈관 질환과 연관되는 생물학적 마커를 동정하고 연구하는데 사용될 수 있다. 문헌[O'Brien et al. Can. J. Physiol. Pharmacol. 76: 72-76(1998)].

·인슐린 의존 당뇨병의 동물 모델은 당뇨병 집단중의 허혈성 심장 질환의 진행을 연구하는데 사용되어진다. 문헌[Pierce et al., Can. J. Physiol. 75:343-50(1997)]에서 검토됨.

·클라미디아 폐렴(Chlamydia pneumonia)으로 마우스, 래빗 및 몽키를 감염시킨 것은 사람에서 천식 및 심장혈관 질환의 진행에서 병원균의 역할을 조사하는데 사용될 수 있다. 문헌[Saikku et al, Artherosclerosis, 140(Suppl. 1), S17-S19(1998)]에서 검토됨.

·자발적인 고혈압 랫트(SHR) 품종, 및 정상혈압의 랫트(SHR.BN-Ren)로부터크로모좀 13(레닌 유전자 포함)의 일부를 갖는 SHR 종류는 고혈압과 심장질환중의 디스리피데미아(dyslipidemia) 사이의 상호작용을 조사하기 위해 사용되어질 수 있다. 문헌[St. Lezin et al, Hypertension, 31:373-377(1998)].

·란드레이스 피그(Landrace pigs)에서 자발적으로 발병하는 비대성 심근증은 사람의 심장혈관 질병의 유용한 모델이 될 수 있다. 문헌[Chiu et al., Cardiovasc. Pathol. 8:169-75(1999).

·카디오미오페틱 햄스터(cardiomyopathic hamster) 품종은 사람 심장혈관 질환에서 뇌 및 심방 나트리우레틱(natriuretic) 펩티드(BNP 및 ANP)의 역할을 조사하기 위해 사용되어질 수 있다. 문헌[Tamura et al., J. Clin. Invest. 94:1059-68(1994)].

·고혈압 및 동맥경화증 랫트 품종은 사람 심장혈관 질병의 병리학에서 염, 단백질 및 지질의 섭취의 효과를 연구하기 위한 모델로서 사용되고 있다. 문헌[Yamori et al., Nutritional Prevention of Cardiovascular Disease(Symposium Proceedings)(1984), Published by : Academic Press, Orlando, Fla.]에서 검토됨.

·자간전증(preeclampsia)의 랫트, 기니아 피그, 래빗, 개, 양 및 개코원숭이는 임산부의 고혈압 장애에 대한 이상 생리학을 연구하기 위해 사용되고 있다. 문헌[Hypertension in Pregnancy 12:413-37(1993)]에서 검토됨.

기타 구현예에서, 본 발명은 관절염 및 다발성 경화증과 같은 염증성 질병의 동물 물델에서 생물학적 마커를 동정하고 분석하는데 사용된다.

후보 치료법을 스크리닝하기 위해 사용되는 경우, 본 발명은 보다 전통적인 스크리닝 방법보다 다수의 현저한 이점을 갖는다. 우선적으로, 임상 시험은 치료 진행의 비교적 후반쯤에서, 즉 치료법이 상동의 동물의 생물학적 마커의 발현에 고 특이성 효과를 가진다고 알려진 시점에서 행해지고, 이것이 임상 참여자에게 있는 위험을 최소로 한다. 두번째, 생물학적 마커 발현의 패턴을 분석하기 위한 실험적 동물 모델을 사용하는 것은 잠재적 치료제의 소량만이 초기에 합성될 필요가 있기 때문에, 치료의 개발 비용이 감소한다.

다른 구현예에서, 본 발명의 방법 및 시스템은 수의학 목적을 위한 동물에서 질병 또는 의학적 증상의 마커를 동정하기 위해 사용된다. 동정된 마커는 이어서 그 질병 또는 증상에 대한 직접적인 후보 치료법에 대한 스크리닝을 위해 사용될 수 있다. 이 구현예는 순화된 동물, 가축 및 식물에 적용될 수 있다.

수단

데이터 카테고리의 요구조건에 부합하는 데이터를 얻기 위한 임의의 적합한 수단은 본 발명의 범위내에 있다. 바람직한 구현예에서, 마이크로볼륨 레이져 스캐닝 세포계측법("MLSC")은 세포 관련 분자 및 세포 유형 갯수에 대한 데이터를 얻기 위해 사용된다. 일부의 구현예에서, MLSC 기술은 비드계 포착 시스템 또는 다양한 유형의 효소 결합된 면역흡착 어세이(예를 들면, ELISA)를 가지고 용해성 단백질을 위한 데이터를 얻기 위해 사용되어진다. 화합물, 특히 소분자에 대한 데이터를 얻기 위한 바람직한 또 다른 수단은 질량 분광 분석법의 사용을 포함한다. 상기 본 발명에서 사용된 MLSC 기술은 혈액중의 형광색으로 라벨화된 세포 및 용해성 단백질을 모니티링하기 위한 가장 강력한 방법이다. 이 기술은 현재 진단에 이용하기 위한 하나 이상의 세포 마커의 동정을 위해 임상 실험실에서 사용되고 있다. 본 발명은 생물학적 변수의 동정을 용이하게 하기 위해 MLSC를 사용한다. 하나의 구현예에서, 본 발명은 소량의 혈액으로부터 다수의 생물학적 특징 또는 변수를 동시적으로 측정할 수 있는 MLSC 수단의 용량을 개선시키는 것으로 MLSC 기술을 개선한다.

본 발명의 수단("서로스캔 수단"로 명명)으로 성취된 특별한 보강은 다음과 같다: 1) 두개의 추가적인 형광색 채널은 최대 네개의 형광색의 동시적인 검출 및 측정을 허용한다; 2) 고 레이져 여기 동력(higher laser excitation power)은 감도와 생산성을 향상시킨다; 3) 일회용 모세관 배열은 어세이마다 더 적은 혈액을 사용하여 환자 혈액당 더 많은 어세이를 하게 한다; 4) 개선된 소프트웨어 및 시스템 통합은 샘플 측정 및 데이터 분석을 자동화한다; 5) 서로스캔 수단의 용량은 데이터 창출과 생물학적 마커의 발견을 위해 환자 샘플을 다량 취급하도록 확장된다.

마이크로볼륨 레이져 스캐닝 세포계측(MLSC) 시스템 고안

MLSC 기술은 미국 특허 제5,547,849호 및 제 5,556,764호 및 다이에츠 등의 문헌[Cytometry 23:177-186(1996)]에 기재되어 있고, 이들 각각은 전체로서 본 명세서에 포함된다. 바이오메트릭 이메징 인크(Biometric Imaging Inc.)에서 시판하는 Imagn 2000 시스템은 MLSC 시스템의 실예이다. 마이크로볼륨 모세관을 이용하는 레이져 스캐닝 세포계측은 전혈, 가공된 혈액 및 기타 유체중에서 형광색으로 라벨화된 세포를 모니터링하기 위한 가장 강력한 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 소량의 혈액으로부터 다수의 생물학적 마커를 동시적으로 측정하는 MLSC 수단의 용량을 개선시키는 것으로 MLSC 기술을 개선한다. 개선된 서로스캔 광학 시스템의 개략적인 것은 도 2에 나타냈다. 본 발명에 사용하기 위한 바람직한 MLSC 수단은 1999년 7월 21일자로 "마이크로볼륨 레이져 스캐닝 세포계측"의 명칭으로 미국에 가출원된 공동 소유의 제60/144,798호 및 "마이크로볼륨 레이져 스캐닝 계측법을 위한 시스템"의 명칭으로 본 출원과 동시에 출원된 공동 소유의 실용신안 출원에 기술되어 있다. 이들 출원 각각은 전체로서 본 명세서에 포함된다.

개선된 광학 구성(configuration)의 하나의 구현예는 도 2에 도시되어 있다. 모세관 배열(10)은 분석용 샘플을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 시준 여기광은 하나 이상의 레이져에 의해 제공된다. 특히 바람직한 구현예에서, 633nm의 여기광은 He-Ne 레이져(11)에 의해 제공된다. 이 파장은 자가형광성을 갖는 생물학적 물질과 연관된 문제를 피한다. 레이져원은 3에서 17mW로 증가된다. 고레이져원은 두개의 잠재적 이익, 즉 증가된 감도 및 증가된 스캐닝 속도를 갖는다. 시준 레이져광은 여기 다이크로익 필터(12)에 의해 반사된다. 반사에 의해, 광선은 검류계-변속된 스캔 미러(13)에 투사된다. 스캔 미러는 검류계에 의한 고정된 각도, 예를 들면 +/-2.5도을 넘어서 신속하게 진동될 수 있다. 스캐닝 미러는 투사광을 현미경 물체(16)의 입사동공에 스캔미러를 영사하는 두개의 릴레이 렌즈(14와 15)로 반사한다. 이 광학 구성는 미러에서 특정 스캔된 각을 현미경 물체의 촛점에서 특정 필드 위치로 전환한다. 상기 +/-각도 소사(sweep)는 물체의 촛점에서 1㎜ 스캔 폭을 발생시킨다. 상기 스캔 각도와 필드 위치 사이의 관계는 이 구성에서 및각도의 이 범위를 넘어 필수적으로 선형이 된다. 게다가, 현미경 물체는 물체의 촛점면에서 스폿에 들어오는 시준빔을 맞춘다. 상기 광학 분할(optical resolution)을 고정하는 스폿 직경은 시준빔과 물체의 촛점길이에 의해 결정된다.

소사된 여기빔의 통로에 위치된 형광 샘플은 스토크스-전환된 빛을 방출한다. 이 빛은 물체에 의해 수집되고 시준된다. 이 시준광은 여전히 시준된 두개의 릴레이 렌즈(14 및 15)로부터 나타나고 이것을 반사하고 탈스캔하는 스캔 미러에 영향을 미친다. 스토크스-전환된 빛은 이어서 다이크로익 여기 필터(이것은 단파장 빛을 반사하고 장파장 빛을 통과시킨다)을 통과하고 이어서 임의의 반사된 여기광을 여과해내기 위해 추가로 제공하는 제 1 롱 패스 필터(17)을 통과한다.

본 발명의 개선된 수단은 이어서 스토크스-전환된 빛을 네개의 다른 방출 밴드로 분리하기 위해 또 다른 일련의 다이크로익 필터를 사용한다. 제 1 형광 다이크로익(18)은 두개의 가장 푸른 형광 색을 두개의 가장 붉은 색으로부터 나눈다. 두개의 가장 푸른 색깔은 이어서 촛점에서 벗어난 형광 신호를 크게 감소하기 위해 제 1 촛점 렌즈(20)을 통해 제 1 구멍(19)상에 촛점을 맞춘다. 구멍을 통해 통과한 후에, 제 2 형광 다이크로익(21)은 추가로 개개의 푸른 색을 서로서로 분리한다. 개개의 푸른 색은 이어서 두개의 분리 광전자증배관(22 및 23)으로 파스된다. 두개의 가장 붉은 색깔은 제 1 형광 다이크로익(28)에 의해서 두개의 가장 푸른 색깔로 나누어진 후에 제 2 롱 패스 필터(25), 미러(26) 및 제 2 촛점 렌즈(27)을 경유해서 제 2 구멍(24)에 촛점을 맞춘다. 구멍(24)을 통과한 후에, 가장 붉은 색깔은 제 3 형광 다이크로익(28)에 의해서 서로서로 분리된다. 이어서 개개의 붉은색깔은 광전자증배관(29 및 30)으로 파스된다. 이런 방식으로, 네개의 분리 형광 신호는 모세관에 고정된 샘플로부터 개개의 광전자증배관으로 동시적으로 전달될 수 있다. 이 개선점은 우선 동시적으로 네개의 분리 분석물을 모니터될 수 있게 한다. 각각의 광전자증배관은 들어오는 형광 양자 플럭스에 반응하여 전류를 발생한다. 이들 개개의 전류는 검출 전자공학에서 하나 이상의 예비증폭기에 의해 분리 전압으로 전환된다. 상기 전압은 스캔된 이미지에 대한 픽셀 강도값을 결정하기 위해 디지탈 변환기와 유사한 장치에 의해 정규적인 간격에서 샘플화된다. 본 발명의 네개의 채널은 채널 0, 1, 2, 및 3으로 명명한다.

신규한 광학 레이아웃은 최대 네개의 형광색으로 라벨화된 분자를 동시에 측정할 수 있도록 네개의 검출 채널을 갖는다. 바람직한 구현예에서, 다중색 어세이가 사용된다. 전형적으로 3이상의 형광 색깔은 각각의 어세이에서 사용된다. 적절한 염료 조합이 유용한 상황에서, 수단은 4-색 어세이를 지지할 수 있다.

XY 전이 단계는 광학 시스템에 비례해서 모세관의 배열(array)을 이동하는데 사용된다. 서로스캔 시스템 번역 단계는 두개의 배열을 보유하고 있고, 이들 각각은 96-웰 플레이트의 풋프린트(footprint)를 갖는다. 모세관 배열은 32개의 고정된 모세관 각각을 가지며 다중 채널 피펫과 겸용할 수 있도록 떨어져 있도록 고안된다. 작동자는 두개의 플레이트의 32 모세관을 동시에 채울 수 있다. 플레이트가 스캔되고 이미지가 가공되는 동안 작동자의 개입은 필요치 않다. 선택적으로, Imagn 2000(VC120)용으로 고안된 16 개개의 모세관은 다른 홀더로 채워질 수 있다.

이미지 가공 소프트웨어는 2, 3, 또는 4 색의 형광 염료로 이미지를 수용한다. 상기 소프트웨어는 임의의 개개의 색깔에서 검출된 입자들을 자동적으로 동정하고 변수화한다. 이들 입자를 설명하는 측정된 변수는 리스트-모드 포맷에 저장되고, 이것은 통상적인 세포계측 분석 소프트웨어(예를 들면, 플로우조(FlowJo))와 호환되게 만들어진다.

모세관 배열을 포함하는 신규한 일회용 카트리지 디자인은 미국 가출원(1999년 4월 23일에 "일회용 광학 큐벳 카트리지"의 명칭으로 출원된 미국 가출원 제60/130,876호; 1999년 4월 23일에 "일회용 광학 큐벳 카트리지를 사용하는 분광 분석 시스템"의 명칭으로 출원된 미국 가출원 제60/130,918호; 및 1999년 4월 23일에 "박막 광학 큐벳 카트리지를 위한 진공 척"의 명칭으로 출원된 미국 가출원 제60/130,875호), 및 2000년 4월 20일자로 "일회용 광학 큐벳 카트리지"의 명칭으로 출원된 공동 소유의 실용신안 출원에 설명되어 있고, 이들은 참조로서 본 명세서에 포함된다. 이 모세관 카트리지는 실시예 5, 7 및 8에서 사용되었다. 현재 사용하는 Flex-32로 명명되는 디자인은 32 모세관을 포함한다. FLEX32-플레이트의 필 홀(fill hole)은 96-웰 플레이트로서 동일한 9㎜ 간격 및 다중채널 피펫팅 장치를 갖는다. 모세관 내부 크기를 한정하기 위해 다이-컷팅되는 이중-점착 접착제와 함께 샌드위치된 마일라(mylar) 2층으로부터 구성된다. 얻어지는 카트리지는 낮은 비용으로 대량 생산될 수 있다. 카트리지는 유연하며, 이것은 진공압에 의해 광학적으로 평평한 베이스플레이트 상에 고정되게 하기 때문에, 제조공정상에 평탄성에 대한 요구조건이 필요없다. 상기 모세관의 간격은 다중-채널 미세역가 피펫과 로보트와의 호환성이 유지되도록 고안된다.

세포 어세이

본 발명은 수단, 바람직하게 MLSC 수단과 호환되고 수백 내지 수천의 세포 집단 및 이들의 세포 관련 분자를 10㎖ 단일 튜브의 혈액으로부터 측정할 수 있는 세포 어세이를 포함하고, 이들중 대부분은 항체에 기초된다. 바람직한 구현예에서, MLSC와 호환할 수 있는 소정의 검출 분자 유형 및 어세이 포멧은 본 발명에 포함되고, 이것으로 제한되는 것은 아니지만 활성화 및 접착성의 마커를 포함한 세포 표면 단백질, 세포내 분자 세포의 활성 상태에 변화를 구별하는 어세이, 희귀한 백색 세포를 농축하고 동정하는 어세이, 전혈이 사용되는 어세이 및 혈액중에 단백질과 같은 용해성 인자의 검출을 위한 어세이를 포함한다.

흘림 세포계측법으로, 세포 표면 항원에 대한 특이적인 형광단-라벨화된 항체 특이성은 특이 집단을 동정하고, 특징화하고, 열거하는데 사용된다. 상기 반응은 전혈에서 행해질 수 있다. 일반적으로, 시약은 세척해 낼 필요가 없고; 혈액-항체 혼합물의 정량 희석은 충분히 유용한 샘플 제조법이다. 세포-항체 혼합물은 공지된 용적의 광학적-양질의 모세관에 채워지고, 레이져-기초된 형광 영상 수단으로 분석된다. 전혈을 가지고 작동하기 위해서, 스펙트럼의 적색 영역(＞600㎚)에서 여기될 수 있는 형광단이 사용된다. 정제된 백색의 혈액 세포는 상기 수단으로 또한 분석되어질 수 있다. 흘림 세포계측과 달리, 레이져는 레이져를 지나는 유동하는 세포보다는 고정된 세포위를 스캔한다. 작은 실리더형 레이져 스폿은 제 1 방향으로 모세관을 가로질러 스캔되면서 상기 모세관은 제 2 방향으로 광학 시스템에 대해서 번역되어진다. 광전자증배관 튜브는 형광 신호를 검출하기 위해 사용된다. 이미지-가공 소프트웨어는 이미지를 분석하기 위해, 해당 세포를 동정하고 열거하기 위해 사용된다.

이 MLSC 접근은 혈액의 단일 튜브로부터 수백개의 다른 세포집단에서 절대적인 세포수를 얻을 수 있게 한다. 100개의 다른 항원에 대한 한 세트의 항체를 위해, 2색 조합이 가능한 것은 약 5000가지이고, 3-색 조합(n 조합 r, nCr=n!/r!(n-r)!)은 약 162,000가지이다. 따라서, 가장 적합한 100 세트를 개발하거나 또는 어세이할 필요가 있다고 고려된다. 다색 모세관은 원래의 2-색 시스템보다 제공된 혈액의 양으로 더 많은 세포 집단이 동정될 수 있게 한다. 실예로서, 시약을 다중화하는 것으로, 두개의 2-색 어세이에서 동정된 모든 집단은 하나의 3-색 어세이에서 동정될 수 있다. 예를 들면, 하나의 모세관에서 CD3 및 CD4 및 다른 모세관에서 CD3 및 CD8 대신 하나의 모세관에서 CD3, CD4 및 CD8을 어세이하는 것이 가능해진다. 더욱 중요하게, 독특한 세포 집단은 세개 이상의 항원의 동시적인 발현으로 한정될 수 있다. 예를 들면, CD8 T 세포는 CD45RA 및 CD62L의 차별된 발현에 기초된 4개의 다른 집단으로 서브셋될 수 있다.

면역어세이 절차

면역어세이는 다양한 포맷으로 운영될 수 있고, 소정의 적합한 포맷은 본 발명에서 계획된다. 두개의 실시예는 하기와 같다. 상기 MLSC 시스템은 마이크로스피어계 면역어세이로 사용될 수 있다. 이런 샌드위치 어세이에서, 마이크로스피어는 분석물-특이 포획 항체를 위한 고형 지지체로서 사용된다. 생물학적 유체로부터 분석물은 항체-코팅된 마이크로스피어에 결합되고 제 2항체로 검출되며, 이것은Cy5와 같은 형광 분자로 직접 라벨화되고 분석물상의 별개의 에피토프에 결합한다. 힌지 영역(hinge region)을 경유에 항체에 공유적으로 부착하는 아미노 비드와 헤테로이관능 가교제를 사용하는 프로토콜은 다중 어세이에서 잘 작동한다. 다른 크기(3 내지 20 마이크론 범위)의 비드를 MLSC 수단과 현재의 소프트웨어를 사용하여 구별하는 것이 가능하다. 다른 크기의 마이크로스피어에 다른 포획 항체를 연결하는 것으로, 단일 모세관에서 다중 면역어세이가 가능해진다. 내부 표시기 염료는 마이크로스피어를 구별하기 위해 및 다중화를 용이하게 하기 위해 또한 사용될 수 있다.

실시예 5에서 논의된 용해성 인자에 대한 면역어세이는 모두 화학적 발광 기초된 샌드위치 ELISA이다. 미세역가 플레이트는 해당 분석물에 대해 특이적인 포획 항체로 코팅되고 블록화된다. 분석물을 포함하는 생물학적 유체가 첨가되고, 배양되고 이어서 세척된다. 동일한 분석물상의 제 2 에피토프에 대해 특이적인 바이오틴화된 항체가 더해지고, 배양되고 및 세척되고, 이어서 아비딘-알카리성 포스파타제 접합물이 첨가된다. 분석물의 레벨은 화학적 발광의 알칼리성 포스파타제 기질로 밝혀진다. 플레이트는 Wallac Victor2 luminometer 또는 유사한 도구에서 읽혀진다.

질병 또는 의학적 증상에 대한 생물학적 마커의 발견을 보조하기 위해 세포 어세이의 로보스트 패널에 대한 고안 및 이행

MLSC 시스템은 최소의 혈액양을 사용하여 세포를 신속하게 착색하기 위해 고안된다. 다른 세포 표면 항원의 진상(score)에 대한 직접적인 시약은 개발되고 있고, 이것은 조합되는 경우, 수백의 다른 세포 집단을 동정할 수 있다. 시약에 대한 전략 및 조합 개발은 이하에 논의된다.

100개 이상의 세포 어세이를 개발하기에 적합한 한 세트의 모노클로날 항체 시약이 사용된다. 지금까지, 다수(약 80)의 다른 세포 표면 항원에 대한 직접적인 다수(약 120)의 다른 모노클로날 항체는 2-색 MLSC 수단을 사용하여 성공적으로 동정되고 시험되어지고 있다. Cy5 및 Cy5.5와 같은 작은 유기 염료는 단일-단계 NHS 화학과 잘 구축된 절차를 사용하여 항체의 아미노기에 용이하게 결합된다. 바람직한 염료 대 항체의 비율은 Cy5, Cy5.5 및 Cy7 시약에 대해 결정되어지고, 일반적으로 1 내지 4의 범위내이다. APC와 같은 단백질 프루오로크롬은 헤테로이관능 가교 시약 SMCC를 사용하는 3-단계 절차에서 비교적 감소된 항체의 설피드릴기(sufhydryl group)에 결합된다. 기타 형광단을 포함하는 시약의 제조가 또한 가능하다. 흘림 세포계측 적용을 위한 Cy7-APC 및 (Cy7-APC)-항체 접합물(conjugate)의 제조는 이미 설명되었다. 항체-형광단 결합 화학은 APC에 대한 것과 동일하다. 모든 단백질-단백질 접합물은 전통적인 수단, 예를 들면 Akta FPLC에서의 겔 여과에 의해 정제된다. 형광의 마이크로스피어는 또한 조사될 수 있다. 항체는 2-단계 카르보디아미드 화학으로 카르복실화된 마이크로스피어에 결합된다.

신규한 모노클로날 항체 시약은 전혈 및 붉은 용혈 세포 모두에서 적정된다. 시약 특이성 및 비특이 결합의 부족은 적절한 반대 염색으로 확인된다. 분석은 임의의 적합한 소프트웨어 프로그램(플로우조 세포계측 소프트웨어(Treestar, Inc의인터넷 주소 http://www.treestar.com/flowjo/에서 다운로드)를 포함)로 된다. 적정으로부터, 어세이(전형적으로, 0.01 내지 2㎍/㎖) 및 예비분석기준마다 각각의 시약의 최적의 양이 결정된다. 바람직한 구현예에서, 모든 어세이는 균질한(세척 없음) 방식으로 시행된다. 이것은 일반적으로 각각의 항체 시약이 형광 배경이 너무 높지않도록 1㎍/㎖ 이하의 역가 포인트를 갖는 것이 요구된다. 잠재적인 어려움은 특정 시약이 접합하도록 번경될 수 없거나 또는 역가 포인트가 너무 높을 수 있다는 것이다. 일반적으로 동일한 항원에 대한 제 2 모노클로날 항체를 치환하는 것이 가능하게 된다. 또한 일부 개개의 시약은 연구동안 측정되지 않을 수 있는 위험이 있다. 각각의 항원 카테고리로부터 다중 항체는 전형적으로 평가된다.

전형적으로, 약 50 내지 100(또는 그 이상) 세포 어세이의 패널은 질병 또는 의학적 증상을 모니터하기 위해 개발되어진다. 이런 어세이는 하나가 수백의 다른 세포집단을 열거할 수 있게 한다. 실예로서, 류마티스성 관절염(RA)에 대해 잠재적으로 중요한 면역성 및 염증성 세포 변수를 모니터하는 것이 가능하다. RA 집단에서, 사용을 위해 평가되는 세포 표면 항원은 인식된 세포 항원의 유형에 기초한 다른 서브셋으로 세분화될 수도 있다. 실예로서, 관련 수용체 뿐만 아니라 T 세포, B 세포, 항원-존재 세포, NK 세포 및 과립구를 포함한 주된 백혈구 아형상에 발견된 항원 및 이들 세포상에서 발견된 구조물이 포함된다. 이들은 활성 분자, 조-자극성 분자, 접착성 분자, 항원 수용체, 사이토카인 수용체 등이 포함된다. 이것으로 제한되지 않지만 RA에 대해 평가될 수 있는 대표적인 항원의 리스트는 표 1에서 제공된다.

세포 어세이 포맷

상기 세포 어세이는 두개의 포맷, 즉 전혈 또는 RBC-용혈의 어느 것으로도 고안된다. 바람직한 구현예에서, 어세이는 전혈 또는 RBC-용혈 포맷에서 행해진다. 최소의 조작은 가장 정확하게 절대적인 세포수(세포/혈액 ㎕)를 얻는 것이다. 게다가, 혈액의 오직 적은 양만이 어세이마다 요구되기 때문에 많은 어세이가 혈액의 단일튜브로부터 행해질 수 있다. 그러나, 일부의 세포 집단에서, 선택적인 어세이 포맷, RBC-용혈이 바람직할 것이다. 이들은 혈청중에 포함된 용해성 인자(자유 Ig, 용해성 사이토카인 수용체, 등)가 세포 라벨링과 매우 적은 낮은 빈도로 존재하는 세포 집단을 방해하는 특별한 항원-항체 쌍을 포함한다. 이 절차는 정상의 개체로부터 얻은 전혈에서 필연적으로 검출될 수 없지만 용해된 포맷에서 10배 증가되고 여러가지 자가면역 상태에서 증가되는 것이 나타나는 CD25 또는 CD69를 발현하는 활성화된 세포를 위해 유용하다. 다른 소수의 세포 집단, 예를 들면 NK 세포의 개선된 검출이 또한 보여질 수 있고, 분석에서 특히 유용하다고 입증되어야한다. 실예로서, 96 어세이의 패널용으로, 64가 전혈에 대해서 행해질 수 있고, 용혈에 대해서 32가 행해질 수 있다. 또 다른 샘플 가공은 피콜 그레디언트(Ficoll gradient)에 의한 PBMC 제조, 폴리클로날 또는 항원 특이 활성제와의 외부 생체내 자극을 포함한다.

항체 시약을 조합하는 것은 병리학에 기여할 수 있는, 또는 자가면역 질환과 같은 질병 또는 의학적 증상에 대한 마커가 될 수 있는 신규한 세포 집단의 동정화를 위해 중요하게 된다. 예를 들면, 접착 분자는 자가면역 과정에 포함될 것으로생각되는 T 세포상에 다르게 발현될 수 있다고 알려져 있다. 게다가, 여러 연구는 자가면역 질환을 갖는 환자에서 메모리 CD4 세포의 수가 증가함을 밝혔다. 본 발명의 어세이로, HLA 클래스 Π-제한된 혈통(예를 들면, CD4⁺)의 메모리(예를 들면, CD45RO⁺) T 세포의 서브셋상의 특이적인 접착성 분자(예를 들면, CD11a⁺)의 다른 레벨를 동시에 볼 수 있는 것이 가능해진다. 이것은 관련 질병-관련된 세포 집단을 동정하는 능력을 증가시켜야 한다. 다중색 모세관은 또한 제공된 세포 유형에서 전형적으로 함께 발견될 수 없는 항원 또는 다른 단계의 개체발생에서 동일한 세포 유형상에서 발견된 마커의 조합을 선택하는 것으로 신규한 세포 집단에 대해서 한번에 볼 수 있게 한다.

적절한 형광 염료의 결정

상기 지적한 바와 같이, 소정의 적절한 형광 염료는 본 발명의 범위내에 있다. 염료로서 공통적으로 사용되는 두개는 시아닌 염료 Cy5(em 667) 및 Cy5.5(em 703)이다. 전형적으로, 685㎚에서 방출 신호를 분리하는 단일 다이크로익 필터가 사용된다. 두가지 이상의 염료가 사용되는 경우 더 많은 필터가 요구될 것이다. 염료는 MLSC 시스템에서 그들의 호환성을 결정하기 위해 평가된다. 실예로서, 다양한 염료가 적절한 전면 3-색 세트를 결정하기 위해 평가되었다(표 2 참조). 염료를 평가하는데 고려되는 변수는 1) 3 염료의 스펙트럼 분리, 2) 레이져원의 기능으로서 신호-대-노이즈 비율, 3) 유용한 필터의 적합성, 4) 접합의 용이성, 및 5) 얻어지는 항체-형광단 접합물의 특이성을 포함한다. Cy5 및 APC는 제 1 색에 대해적절하고, Cy5.5는 제 2 색에 대해 적절하다. 여러가지 잠재적인 염료는 제 3 색에 대해 적절하다. Cy7-APC는 MLSC 시스템에 대해 적합할 것이라고 기대된다. Imagn 2000 시스템으로 예비 결과는 이 염료가 장파장 채널(＞685nm)에서 검출될 수 있고 Cy5 및 APC 모두와 구별된다. 방출 스펙트럼은 Cy5.5와 겹쳐진 부분이 새로운 수단용으로 제공된 적합한 필터에 문제가 되지 않음을 나타내고 있다. 형광 마이크로스피어는 광범위한 다른 색깔을 제공하고, 일부의 세포계측 적용에 성공적으로 사용되어진다. 마이크로스피어 시약으로 자주 발생하는 비특이 결합을 최소화하는 접합 방법이 사용될 것이다. 전형적으로, 형광단의 각각은 몇몇의 선택 항체, 예를 들면, 항-CD3, 항-CD4 및 항-CD20을 사용하여 형광단-항체 접합물이라는 상황에서 평가된다.

용해성 인자 접근

형광 이외의 수단에 의해 행해진 다수의 생체분석이 있다. 이들중 두드러진 것은 질량 분광 분석법이고, 이것은 폴리펩티드 및 단백질의 상세한 동정화 및 분석용으로 신속하게 선택되는 툴이다. 질량 분광 분석법에서 생분자 샘플 도입을 위한 광범위하게 사용되는 두가지 방법은 전기분무 이온화(ESI)와 매트릭스-보조 레이져 탈착/이온화(MALDI)이다. MALDI-TOF는 단백질, 폴리펩티드 및 기타 거대분자의 분석을 위해 최근에 성공적으로 이용되고 있다. 에너지를 전달하기 위해 유기 매트릭스를 분석물에 도입하는 것이 탈착 질량 분석의 분야에서 굉장히 진전되더라도, MALDI-TOF는 여전히 약간의 한계를 갖는다. 예를 들면, 소분자의 검출은 매트릭스로부터 바탕 이온의 존재 때문에 실제적이지 않다. 이런 경우, ESI 또는가스 크로마토그래피(GC) 질량 분석은 검출 또는 프로파일을 위해 사용될 수 있다.

분자 구조의 복잡성 및 단백질의 이종 특성은 다차원 분리 기술에 대한 필요성을 요구한다. 이에 대한 주된 분야의 하나는 실시예용으로 겔 매트릭스로서 폴리아크릴아미드를 사용하는 2차원 겔 전기영동의 개발이다. 겔은 가교, 세제의 첨가, 효소 또는 항체(친화성 전기영동)의 고정화 또는 기질(지모크라피 (zymography)) 및 pH 구배의 견지에서 변형된다. 이 기술은 구조적 변형, 활성, pI값 및 분자량의 측면에서 단백질의 특성화를 위해 사용된다.

또 다른 분야는 하이픈으로 연결된 분리 기술로서 언급되는 다차원 크로마토그래피 접근의 개발이다. 이점은 분석물을 더욱 정확하게 정량하는 능력 및 레이져 유도 형광법 또는 질량 분석과 같은 온라인 검출 방법과 보다 나은 상용성을 포함한다. 지금까지 두개의 분리 시스템은 이들이 직교되고 우수한 피크 캐패시티(해상도)를 유도하도록 선택된다. 주된 기술의 장애는 2차원으로 전달함에 따른 해상도를 유지한다는 측면에서 검출 시스템과 다양한 분리 기술의 통합 및 검출 시스템과 이동상과의 상용성이고, 예를 들면 용리액중의 염 및 세제는 전기분무 질량 분석과 비상용성이다. 문헌[Naylor J. Chromatogr. A 1996, 744 237-78; Jorgenson Anal. Chem 1997, 69, 1518-1524].

화학적 유도는 ESI 질량 분석을 얻기에 충분히 이온화되지 않은 화합물중에서 구성성분을 활성화하기 위해 선택적으로 사용될 수 있다. 예를 들면, 전기분무 조건하에서 이온화하지 않는 산성 또는 염기성 잔기가 전형적으로 부족한 스테롤은 페로센 카르복실산과 결합되어지고, 전기화학적 특성은 이온화를 촉진한다.문헌[Anal. Chem. 1994, 66, 209-212]참조. 유도화는 또한 부모의 딸 및 손녀딸 이온에서 다른 분열(fragmentation) 패턴을 사용하여 입체이성질체(동중체 종) 사이에서 구별하도록 취급하는 것으로 제공할 수 있다. 사극자 이온 트랩 질량 분석기에서 MSn 능력은 헥소사민 모노사카라이드, 글루코사민, 갈락토사민 및 CoC12(DAP)2Cl로 유도된 만노사민을 구별하기 위해 사용되어지고, 여기서 DAP는 디아미노프로판이다. 문헌[Anal. Chem 1999, 71, 4142-4147]참조.

친화성에 기초된 분리에 이은 질량 분석 검출은 혈액 및 소변과 같은 생물학적 유체중에 복잡한 분자를 샘플 제조를 거의 할 필요없이 분석하게 하여 임상적으로 중요하게 된다. 시페르겐(Ciphergen)의 기술(표면 풍부한 레이져 탈착 이온화(SELDI), MALDI의 변형)은 이런 원리에 기초된다. 시페르겐은 단백질 및/또는 소분자가 적용되고 이어서 증가하는 긴축성(stringency)으로 세척되는 5-6개의 다른 표면을 제공한다. 각각의 표면/긴축성(stringency) 조합은 다른 흡착 프로파일을 유도하고, 상기 기술은 복잡한 혼합물의 분석을 위한 수단을 제공한다.

임상 데이터 및 정보학

생물학적 마커와 임상 측정법의 동정화 및 상관관계는 광대한 양의 생물학적 및 의학적 데이터 및 이런 데이터에 접근하고 사용할 수 있게 만드는 검색 엔진의 통합을 요구한다. 본 발명에서 개발된 수단 및 어세이는 소량의 혈액으로부터 얻은 수백 내지 수천개의 독립적인 마커를 동정하는 능력을 갖는다. 본 발명은 시간에 따른 질병의 진행 및 치료에 대한 반응과 같은 환자로부터 얻은 광범위한 의학적 정보를 수집하기 위한 넓은 임상적인 전략을 개발하는 것을 포함한다. 게다가,본 발명은 마커와 특이 질병, 질병의 진행 및 치료에 대한 반응의 패턴을 연관시키는 소프트웨어, 데이터베이스 및 데이터 마이닝 툴을 포함하고, 이것은 이것으로 제한되지 않지만 어세이 및 임상 정보의 데이터베이스, 데이터 전환 및 통계 분석 툴 및 의학적 질문서 원형을 포함한다. 본 발명의 정보 시스템은 불연속 유형의 데이터의 포함을 위해 공통 언어 및 공통 포맷을 사용하도록 고안되고 데이터-마이닝 목적을 위해 구조화된다.

다음 수년동안 폭넓게 사용될 수 있는 보편적인 의학 언어는 SnoMed-RT이다. 이 언어는 본 발명의 현재 정보 시스템에 용이하게 채택될 수 있다. 유사하게, 본 발명은 다른 언어 또는 기술이 유용해짐에 따라, 이들을 또한 데이터베이스로 포함시켜 적응될 수 있다. 실예는 복부의 C.T. 스캔을 통해 얻어진 디지털 x-레이, 유방 X선 촬영 또는 실질적인 결장 내시경을 통합하는 궁극적인 툴의 개발이 될 것이다.

광대한 양의 생물 및 임상 정보를 취급할 수 있는 정보학 시스템을 개발하는데 있어서 기술적인 도전은 다수의 다양하고 복잡하며 주로 비호환성인 정보원을 모델링하고 통합하고, 과학적 및 의학적 지식 및 방법에서 급속한 진보에 적응시키고 및 사용자에 친숙한 인터페이스, 적절한 포맷 및 강력한 검색 툴을 개발하는 것을 포함한다. 본 발명에 의해 제공되는 정보학 시스템은 이들 기술적인 도전에 부합한다.

데이터 분석

세포 분석으로부터 나온 데이터는 동정된 각각의 집단에 대한 전혈 ㎕당 세포의 갯수, 주어진 집단에 대한 항원 밀도의 평가를 제공하는 각각의 세포 관련 분자에 대한 착색의 평균 세기, 세포의 평균 크기 및 특정 분자의 발현 레벨 모두를 포함한다. 상기와 같이 실제 세포 갯수 및 특정 분자의 발현 레벨 모두가 주어진 질병 상태에서 다양할 수도 있기 때문에 각각이 분석될 것이다. 카테고리화 임상 변수들(예를 들면, 질병의 진단)과 관련된 마커(세포 수 또는 착색 강도, 용해성 인자의 레벨)을 동정하기 위하여, 다양한 판별 기술이 사용된다. 연속-값의 임상 변수(예를 들면, 용해성 인자의 레벨)와 관련된 마커를 동정하기 위해, 다양한 회귀(regression) 기술이 사용된다. 판별 및 회귀 분석 모두를 위해, 단계적으로 변화하는 선별 및 교차-확인이 해당 임상 변수와 가장 밀접하게 관련된 이들 마커를 동정하기 위해 사용된다. 경우에 따라, 인구통계학적 및 임상 변수들(예를 들면, 나이, 성, 부수적인 약물 등) 및 유전적 변수들이 모델에서 공변량으로서 포함된다. 이들 기술은 데이터의 분석, 전형적으로 SAS 및 스태티스트카(Statistica) 통계 분석 소프트웨어 패키지를 사용하여 적용된다.

본 발명의 통합된 정보학 인프라스트럭쳐(도 3 참조)의 건축구성은 다중-층 구조를 포함한다. 가장 낮은 레벨은 일련의 데이터 소스로 이루어진다. 제 1 소스는 이것으로 제한되지 않지만 세포 어세이 데이터 및 용해성 인자 어세이 데이터를 포함하는 과학적 데이터를 포함한다. 제 2 소스는 어세이 개발을 위한 프로토콜 및 임상 연구의 실시를 위한 프로토콜을 설명하는 본문 및 표 데이터의 조합된 형태인 반구조화된 데이터일 수 있다. 상기 구조는 웹 브라우저상에 선택적인 정보 디스플레이 뿐만 아니라 정보 색인 및 질문 모두를 위해 모두 제공하는 태그를정의하는 데이터 유형 정의(DTD)로서 코드될 수 있다. 상기 DTD 태그는 또한 정보를 다른 부분으로 높은 레벨로 전기적으로 공유할 수 있는 정보 교환 모델을 또한 정의한다. 제 3 데이터 소스는 임상 연구를 위한 요구조건에 부합하도록 수집되고 재구조된 임상 데이터이다. 시간상의 제약하에서 환자로부터 얻은 유용하고 풍부한 정보의 수집을 최대화하기 위해 최적화된 임상 질문서는 정보를 수집하고 필요량을 제어하도록 사용된다. 필요한 경우, 질문서는 여러가지 언어로 쓰여질 수 있고, 응답자가 직면하고 있는 신체적인 요구에 적응될 수 있다(예를 들면, 컴퓨터 키보드를 사용할 수 없음). 이 테이터 소스에 대한 선택 기술은 XML이다. 게다가, 임상정보를 모으는 시스템은 입력의 비-본문 수단(non-textual means)을 또한 포함한다. 응답자는 이것을 교합하지 않고 문제점을 지적하도록 비쥬얼 또는 그래픽 디스플레이를 통해 사람의 해부 이미지에서 지적하는 것으로 건강 관련 정보의 제공을 위해 상호교환할 수 있다. 다른 수단, 예를 들면, 천식 또는 기종성 환자에서 바이탈 용량 및 FeV1sec.의 간단한 측정 또는 심장 부정맥을 검출하고 및/또는 정정하는 모니터링 장치등이 입력을 위해 사용될 수 있다. 데이터의 제 4 소스는 다른 수단, 예를 들면, Imagn, 서로스캔(SurroScan) 및 ELISA 플레이트 리더와의 조합으로 과학적 어세이의 실시를 위해 요구된 관련 변수 세팅의 모든 것을 포함하는 수단 데이터이다.

추가적으로, 데이터는 리스트에 수집되고 기록될 수 있다. 리스트 형식에서, 각각의 개별 세포에 대한 측정 값이 기록된다. 이것은 다른 분자의 복합 세트를 발현하는 개개의 세포 집단의 동정 및 분석을 용이하게 한다. 선택적으로, 분석 스키마(schema)은 쉽게 살펴지고 최적의 데이터 분석을 용이하게 한다. 마찬가지로, 환자 데이터(세포 집단, 용해성 인자, 병력, 임상 변수 등)의 완벽한 세트가 각각의 환자 샘플에 대한 리스트에 저장될 것이다.

도 3에 나타난 바와 같이, 이들 데이터 소스는 공통의 스키마를 사용하여 통합되고 웨어하우스된다(warehoused). 이 스키마는 구성요소 데이터 소스로부터 정보의 해석을 조화시킨다. 이 해석은 각각의 구성요소 데이터 소스의 논리적 또는 물리적 저장 항목을 독립적으로 하는 방식이다. 공통의 스키마는 궁극적으로 컴파일 데이터를 사용하는 툴(tool) 세트 또는 사용자 인터페이스에 현저하게 영향을 미치지 않으면서 시간의 경과(변화의 조절)에 따라 첨가되거다 또는 변형될 수 있도록 제공한다. 공통의 스키마는 언제나 변화 데이터 소스 및 컴파일된 데이터를 사용하는 응용 프로그램 사이에 버퍼를 제공하고, 데이터로부터 지식(knowledge)을 유도한다. 유사하게, 미래의 또 다른 수단, 예를 들면, NMR이 추가적인 데이터를 발생시키기 위해 포함된다면, 이것은 미리 존재하는 웨어하우스의 구조화를 다시 세팅함 없이 추가될 수 있다.

상기 스키마는 면역학과 관련된 임상 분야에서 공통 컨셉 및 그들 관계의 온토로지(ontology)를 증가시킨다. 상기 온토로지는 매장된 데이터 소스로부터의 정보 및 데이터 마이닝 작업의 내역에 대한 사용자 특이적인 의뢰의 해석을 보조하기 위해 데이터 마이닝 툴 및 사용자 인터페이스에 의해 사용되어질 것이다. 또한 온토로지는 수집된 임상 정보의 확인에 사용될 수 있다.

프로그램의 툴킷트(toolkit)는 통계적인 분석, 데이터 마이닝 및 결과의 시각화를 위한 프로그램을 포함한다. 툴킷트 프로그램에 의한 결과의 분석은 일련의 결과에 대한 일련의 조건에 관한 일련의 규칙을 제공한다. 이들 규칙은 매장 데이터의 통계적으로 상당한 부분 위에 적용되고, 형태는 다음과 같다:

if cond1 and cond2 and ... and condN then consequence1, consequence2,..

예를 들면, 세포 데이터 소스 및 임상 데이터 소스에 적용되는 경우, 툴킷트는 이전에 알려지지 않은 세포 어세이와 용해성 인자 측정 사이에 관계를 유도할 수 있다. 툴킷트에 의한 분석 결과는 사용자에게 및 미래의 데이터베이스 재사용을 위해 재생된다. 건축구조는 축적된 발견 경험을 저장하는 것으로 및 이 경험을 계속적으로 개선시키기 위해 통합하는 것으로 지식 발견 과정(knowledge discovery process)을 개선시키고자 한다.

데이터 마이닝을 위한 다른 툴은 고차원적인 데이터에서 클러스팅(clustering)하기 위한 방법을 포함한다. 이들 툴은 현재 사용되는 존재하는 수동 게이팅 방법을 확대하고 교체할 수 있다. 한번에 한명의 한자로부터 한번의 어세이만을 할 수 있는 현재 세포계측 소프트웨어와 달리, 본 발명의 세포계측 툴은 주변 집단(게이트)의 최적의 세트를 결정하기 위해 다중 환자 샘플로부터 어세이를 교차하여 리스트 모드 데이터를 조사할 수도 있다. 이 시스템은 2차원 및 3차원 시계의 선택된 서브셋상에 컴퓨터 조작된 클러스터를 동시에 구체화하는 다차원 시각화 시스템과 결합된다.

최종 층은 사용자 인터페이스이다. 이 시스템의 이 부분은 사용자 상호작용을 제공하고 임상 연구와 관련된 작업을 계획하고 실행하는데 사용된다. 사용자인터페이스 레벨에 의해 지지된 작업은 연구 데이터로부터 지식 발견, 임상 연구 계획, 프로토콜 계획과 평가 및 어세이 개발을 포함한다.

사용자 인터페이스는 단일방식으로 정보에 대한 요청을 받아들일 것이다. 이것은 그래피컬 인터페이스와 합쳐질 수도 있고 저장된 상세한 정보에 대한 요약 컨셉 레벨로부터 정보의 "드릴링 다운"을 위해 허용될 수도 있다. 이것은 데이터 및 문맥(예를 들면 어세이 프로토콜 계획에 속한 서류) 모두를 포함하는 정보 요청을 위해 허용될 수도 있고 네트워크상에 상호작용을 위해 허용될 수 있다.

실시예 1

류마티스성 관절염에 대한 생물학적 마커를 동정하기 위한 본 발명의 사용

본 발명은 류마티스성 관절염(RA)에 대한 생물학적 마커를 동정하기 위해서 사용될 수 있다. RA에 대한 생물학적 마커를 동정하기 위한 데이터를 생성하는 것을 돕기 위해서 마이크로볼륨 레이져 스캐닝 세포계측법(MLSC: microvolume laser scanning cytometry)를 사용하였다. 마커 발견 노력은 용이하게 접근할 수 있는 생물학적 유체, 가장 뚜렷하게는 혈액에 촛점을 맞추고 있다. 2-색 수단 및 항체 기재 분석은 소량의 전혈 만으로 상이한 세포집단의 진상(score)을 동정하고 열거하기 위한 이러한 기술의 잠재성을 입증했다. 용해성 인자, 소 분자 및 광범위 임상 데이터베이스를 위한 다중 어세이와 조합된 다수의 변수 세포 분석이 장래의 생물학적 마커 발견을 위한 강력한 툴이다. 이러한 마커는 질병 활성 및 치료에 대한 반응을 예측하고 모니터하는 신규하고 더욱 효과적인 방법을 이끌어내는 잠재성을 갖는다.

류마티스성 관절염은 소 관절의 만성 염증 장애이고, 또한 체계적 결과를 선고한다. 질병의 병인이 알려져 있지 않지만, 이의 병상은 시간에 걸쳐 공통적인 특성과 함께 전개된다. 초기 사건은 미지의 매개체에 의해 개시된 염증 반응을 포함하는 것으로 보인다. 활성화된 CD4⁺T 세포가 염증을 증폭시키고 영속시키는 것으로 보인다. 활성화된 T 세포의 존재는 폴리클로날 B-세포 활성화와 류마티스 인자(RF)의 생성을 유도할 수 있다. 자가항원을 방출시키면서 조직 손상이 발생하고, T 세포의 반응 정도가 확대된다. 결국, 일정한 염증 환경이 활막 섬유아세포의 형질전환을 유발시켜, T 세포 및 대식세포와 독립적인 파괴 잠재성을 수득할 수 있다. 주로 관절에서 대식세포에 의해 생성된 전-염증 사이토카인 및 이들이 유도한 IL-6와 같은 사이토카인이 체계적으로 활성화되고, 혈청에 존재하며, 급성기 단백질의 간장 합성을 증대시킨다. 질병의 여러 상태 전반에 걸쳐서, 질병의 마커가 될 잠재성이 있는 활막 및 혈액 중의 분자 및 세포에 변화가 있다. 신체 전반에 걸친 용이한 접근성 및 순환으로 인하여, 혈액은 질병 활성을 모니터하기 위한 매력적인 창을 제공하고 이에 따라 본 발명의 주된 표적이다.

본 발명은 류마티스성 관절염을 위한 진단 및 예측 유용성의 생물학적 마커를 동정하는 데에 유용하다. 이러한 마커는 상이한 형태의 질병을 분류하기 위해, 예를 들어 관절 침식이 다른 사람들 보다 더욱 신속하게 일어나는 환자의 서브셋을 동정하기 위해 요구된다. 또한, 마커는 간섭의 효능을 평가하고 초기 비독성의 성공적인 치료법을 개발하기 위해 중요하다. 혈액, 활막 및 소변중의 세포 및 용해성 인자에 대한 수많은 연구가 이루어졌다. 일반적으로, 동시에 하나 내지 여러 개의 마커가 연구되었다. 류마티스 인자 및 C-반응성 단백질과 같은 일부 인자들이 RA와 관련되어 있지만, RA 특이적 마커에 일치하는 패널은 존재하지 않는다. 복수 후보 마커를 동시에 평가해야 할 강한 필요가 있다. 이것은 다중 어세이를 사용하여 및 단일 어세이으로 측정될 수 있는 변수(색채)의 수를 증가시킴으로써 달성된다.

본 발명은 질병의 마커를 동정하고 이를 RA에 적용시키기 위한 플랫폼을 개발할 수 있다. 일반적으로, 각각의 어세이 조합은 주요 세포 서브셋을 동정하기 위해서 하나 이상의 시약(표 1의 좌측 컬럼)으로 이루어진다. 이들 항원 중 일부, 예를 들어 CD4는 다중 어세이에서 표적화되었다. 주요 마커는 샘플에 대한 정보를 최대화하기 위해서 상이한 서브셋팅 항체(표 1의 우측 컬럼)와 합쳐졌다. 각각의 어세이 조합을 개발함에 있어 표적 항원과 플루오로크롬의 성질이 고려되었다. 예를 들어, 더 밝은 색의 플루오로크롬이 덜 풍부한 항원과 함께 사용되었다. 다른 어세이에 대해서, 특정 표적에 대해 최상의 스펙트럼 차이를 갖는 시약을 사용하는 것이 중요하다. 일반적으로 각각의 항체에 대해서 1 내지 3 가지의 상이한 3-색 조합(예를 들어, Cy5 CD3, Cy5.5 CD4, Cy7APC-CD45RA 대 Cy5 CD45RA, Cy5.5 CD4, Cy7APC-CD3)을 분석하기 위해서 삼중 플로우조(FlowJo) 소프트웨어를 사용하여 상이한 세포집단을 구별하기 위한 최상의 조합을 결정하였다.

분석의 성공적인 패널을 고안하는 것은 약간의 경험적 지식을 요한다. 공정은 전형적으로 반복적인 것이고, 각각의 실험은 선행 실험 위에서 이루어졌다. 예로서, RA에 대한 잠재적인 가치를 지닌 후보 조합의 검토가 하기에 기재되어 있다.

T 세포 . T 세포 패널에서 평가되는 주요 항원에는 CD2, CD3, CD4, CD5, CD7 및 CD8이 포함되었다. 이들 T 세포 하위집단 위의 여러 종류의 분자가 조사될 수 있었다. 이것들에는 원(naive) 세포(CD45RA) 대 메모리 세포(CD45RO, CD26)를 구별하는 것을 돕는 표면 항원과 활성화(CD25, CD69, CD71, HLA 클래스 II) 또는 조-자극(CD27, CD28)에서 역할을 하는 항원이 포함되었다. 또한, 염증 부위에 접착하는 역할을 할 수 있는 마커가 어세이되었다(CD62L, CD11a/CD18, CD44, CD54 및 CD58). αβTCR, γδTCR, 및 VβTCR 유전자의 패널의 발현을 기초로 하는 T 세포의 하위집단이 평가되었다.

B 세포 . B 세포 패널에서 평가되는 주요 항원에는 CD19, CD20, CD21, CD22, CD23 및 CD72가 포함되었다. 또한, 더욱 활성화된 표현형을 표시할 수 있는 마커들(CD40, CD80, CD86, HLA 클래스 II, CD5)과 림프구 호밍(homing) 및 접착에 관련된 것들(CD62L, CD44, CD11a/CD18)을 포함하는 이들 B 세포 서브셋 위의 다양한 마커가 분석되었다. 특정 항원에 대한 IgM, IgG 및 IgA 수용체가 또한 평가되었다.

항원-존재 세포 . 항원-존재 세포가 주요 항원 CD13, CD14, CD15 및 CD33에 대한 마커를 사용하여 평가되었다. 또한, 이들 세포들 위의 다양한 접착 분자(CD11a, CD18, CD29, CD44, CD54, CD58, CD62L) 및 조-자극 분자(CD80, CD86)가 분석되었다. CD16(FcγRIII), CD32(FcγRII) 및 CD64(FcγRI)를 포함하는 기타 관련 수용체가 어세이되었다.

기타 세포 유형 및 항원 . RA에서 NK 마커 및 과립구 마커의 발현에 대해 매우 소수의 연구가 수행되었고 일반적으로 이들은 일관성이 없는 결과를 내었다. 마커 CD16, CD56, CD57 및 NKB1을 사용하는 NK 하위집단이 분석되었다. 호중구 및 호산구를 포함하는 과립구가 CD13, CD15 및 CD16을 사용하여 표현형화될 수 있었다. 상기의 것과 유사한 접착 분자 및 수용체의 패널이 이들 집단을 추가로 서브셋팅하기 위해서 사용되었다.

발현이 더욱 활성화된 표현형 또는 메모리 표현형과 연관되거나, 접착 또는 조-자극에 관련되거나, 중요한 리간드를 위한 수용체로 보여지는 다수의 항원이 존재한다. 실예가 표 1에 요약되어 있다. 이들중 여러 마커는 여러 자가면역 조건에서 검사되었고 이들 발현은 가변적인 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, RA 환자의 T 세포는 더 높은 레벨의 접착 수용체 LFA-1(CD11a/CD18)를 나타내지만 활성화된 세포에서 정상적으로 증가되는 IL2 수용체(CD25), 또는 활성화 및 조-자극을 위한 마커(CD80)의 발현에 어떠한 변화도 없었다.

표시기의 종류 및 검사될 수 있는 세포집단를 설명하는 일부 실예가 하기에 기재되어 있다.

T 세포 . RA에 T 세포를 관련시키는 여러 증거가 있다[참고문헌: Fox, D.A.(1997) Arthritis Rheum 40, 598-609]. 이러한 증거에는 제 3 과가변성 영역의 공통 서열을 공유하는 MHC 클래스 II 대립유전자와 RA의 연관이 포함된다[참고문헌: Weyand, C.M. and Goronzy, J.J. (1997) Ann N Y Acad Sci 815, 353-6 andWeyand, C.M. and Goronzy, J.J. (1997) Med Clin North Am 81, 29-55]. CD4⁺T 세포가 MHC 클래스 II 항원에 결합된 항원을 인식하기 때문에, RA의 특정 클래스 II 분자의 발현에의 관계는 RA에서 CD4 T 세포에 대한 역할을 암시한다. 또한, 콜라겐 유도 관절염 또는 보조 관절염과 같은 RA의 동물 모델에 관한 연구는 영향받은 동물로부터 전달된 T 세포가 감수성 숙주의 활막염을 유도할 수 있음을 보여 주었다. 또한, RA 환자에 관한 연구는 T 세포를 제거하거나 T 세포 기능을 방해하는 것을 목적으로 하는 전략이 류마티스성 염증을 개선할 수 있음을 보여 주었다.

아마도 본 발명과 더욱 관련하여, RA 환자의 활액 유체, 활액 조직 및/또는 주변 혈액에서 T 세포 표현형의 검사는 약간의 흥미로운 결과를 도출하였다[참고문헌: Cush, J.J. and Lipsky, P.E. (1991) Clin Orthop, 9-22]. 증가된 수의 활성화된 T 세포가 RA 환자의 주변 혈액 및 활액 유체에서 검출되었다. 이들 T 세포는 시험관내 유사분열 활성화 T 세포에서 보여지는 레벨과 유사하게, 대조군에 비하여 더 낮은 항원 밀도에서 CD3 및 CD4 세포 표면 마커를 발현한다[참고문헌: Luyten, F., Suykens, S., Veys, E.M., Van Lerbeirghe, J., Ackerman, C., Mielants, H. and Verbruggen, G. (1986) J Rheumatol 13, 864-9]. 또한 CD4/CD8 비의 증가를 유발시키는 대부분의 활성 RA에서 약간 감소된 수의 CD8⁺세포가 존재한다. 또한, RA 환자로부터의 T 세포는 증가된 양의 초기 활성화 마커 CD69[참고문헌: Pizalis, C., Kingsley, G., Lanchbury, J.S., Murphy, J. and Panayi, G.S. (1987) J Rheumatol 14, 662-6], 증가된 수의 CD4⁺CD29⁺및 CD4⁺CD45RO⁺메모리 세포 및 증가된 발현의 MHC 클래스 II 산물을 발현한다[참고문헌: Pitzalis, C., Kingsley, G., Murphy, J. and Panayi, G. (1987) Clin Immunol Immunopathol 45, 252-8]. CD44-의존성 일차 접착의 발현은 아동 RA 및 전신 홍반성 낭창의 동시 증상 질병과 강하게 상호 연관되어 있고[참고문헌: Estess, P., DeGrendele, H.C., Pascual, V. and Siegelman, M.H. (1998) J Clin Invest 102, 1173-82], 성인 RA에서 중요할 수 있다. 증가된 수의 γδ TCR T 세포 및 이들 세포에서의 증가된 HLA 발현에 관한 약간의 연구가 보여졌다[참고문헌: Reme, T., Portier, M., Frayssinoux, F., Combe, B., Miossec, P., Favier, F. and Sany, J. (1990) Arthritis Rheum 33, 485-92]. 종종 제한된 TCR에 연관된, RA에서의 CD8⁺57⁺세포의 증가가 또한 보고되어 있다[참고문헌: Morley, J.K., Batliwalla, F.M., Hingorani, R. and Gregersen, P.K. (1995) J Immunol 154, 6182-90 and Serrano, D., Monteiro, J., Allen, S.L., Kolitz, J., Schulman, P., Lichtman, S.M., Buchbinder, A., Vinciguerra, V.P., Chiorazzi, N. and Gregersen, P.K. (1997) J Immunol 158 1482-9]. 3-색 어세이는 이러한 특정 T 세포 서브셋에서의 제한된 Vβ발현을 모니터할 수 있다.

B 세포 . B 세포의 표현형 분석이 RA 환자에서 수행되었다. 팬 T 세포 마커 CD5를 발현하는 B 세포 하위집단이 상승되는 것으로 보였다[참고문헌: Sowden, J.A., Roberts-Thomson, P.J. and Zola, H. (1987) Rheumatol Int 7, 255-9, Hardy, R.R., Hayakawa, K., Shimizu, M., Yamasaki, K. and Kishimoto, T. (1987) Science 236, 81-3 and Casali, P., Burastero, S.E., Nakamura, M., Inghirami,G. and Notkins, A.L. (1987) Science 236, 77-81]. 이러한 서브셋은 또한 IgM 자가항체가 구조적으로 발현되는 것으로 보인 자가면역 마우스에서 상승되었다[참고문헌: Hayakawa, K. and Hardy, R.R. (1988) Annu Rev Immunol 6, 197-218]. 그러나, 사람에서 CD5⁺B 세포는 우선적으로 자가항체를 생성하지 않고[참고문헌: Suzuki, N., Sakane, T. and Engleman, E.G. (1990) J Clin Invest 85, 238-47], 사람의 자가면역성의 병인론에 있어서의 CD5⁺B 세포의 역할은 여전히 불명료하고, 아마도 활성화된 B 세포의 존재를 반영한다[참고문헌: Werner-Favre, C., Vischer, T.L., Wohlwend, D. and Zubler, R.H. (1989) Eur J Immunol 19, 1209-13]. RA 환자로부터의 순환하는 B 세포는 다시 활성화된 B 세포 표현형을 나타내는 HLA DR 분자의 증가된 발현을 설명한다[참고문헌: Eliaou, J. F., Andary, M., Favier, F., Carayon, P., Poncelet, P., Sany, J., Brochier, J. and Clot, J. (1988) Autoimmunity 1, 217-22]. 3-색 어세이는 특이적으로 CD5⁺C19⁺B 세포에 대해 증가된 HLA 클래스 II 발현을 모니터할 수 있다.

항원-존재 세포 . 단핵세포, 대식세포, 수상돌기 세포, B 세포 및 클래스 II 항원을 발현하기 위해서 유도된 기타 세포를 포함하는 여러 세포 유형이 항원-존재 세포로서 제공될 수 있다. 일반적으로, 이들 세포는 자가 면역 질병을 앓는 환자에 있어서 HLA 클래스 II 항원의 증가된 발현 레벨에 의해서 입증되는 활성화된 표현형을 보여준다[참고문헌: Lipsky, P.E., Davis, L.S., Cush, J.J. and Oppenheimer-Marks, N. (1989) Springer Semin Immunopathol 11, 123-62]. 항원-존재 세포는 활액 구획에서 풍부하고[참고문헌: Viner, N.J. (1995) Br Med Bull 51, 359-67], 혈액-유도 대식세포는 여러 연구에서 사람 연골 당단백질 39 발현과 연관되어 있었다[참고문헌: Kirkpatrick, R.B., Emery, J.G., Connor, J.R., Dodds, R., Lysko, P.G. and Rosenberg, M. (1997) Exp Cell Res 237, 46-54].

용해성 인자 어세이 . 용해성 인자 어세이는 잠재적인 생물학적 마커의 추가 배터리를 제공한다. RA 환자에게서 동정된 다수의 중요한 용해성 인자가 존재한다. 이들은 TNFα및 IL-6와 같은 순환하는 사이토카인, 사이토카인 수용체, 케모카인, 상이한 아이소타입의 류마티스 인자, 상이한 형태; 글리코실화되는 면역글로불린, 호르몬, C-반응성 단백질 및 혈청 아밀로이드 A와 같은 급성기 단백질 및 용해성 접착 분자, 및 매트릭스 메탈로프로테이나아제 및 이들의 억제제의 레벨을 포함한다. 다수의 이들 용해성 인자가 RA 환자에게서 질병의 상이한 단계에서 다양한 레벨로 존재하는 것으로 알려졌다[참고문헌: Choy, E.H. and Scott, D.L. (1995) Drugs 50, 15-25, Feldmann, M., Brennan, F.M. and Maini, R.N. (1996) Annu Rev Immunol 14, 397-440, and Wollheim, F.A. (1996) Apmis 104, 81-93]. 그러므로, 어세이는 이들 용해성 인자를 측정하고 동정된 세포집단과의 통계적 상관성을 찾기 위해서 수행될 수 있다.

병력 . 용해성 인자 외에도, 환자 병력의 정보가 데이터베이스에 포함된다. 임상 변수는 나이, 성, 질병 단계, ESR과 같은 실험실외 시험, 이전 치료법 및 수반하는 약물 또는 치료법에 대한 정보를 포함할 것이다. 이러한 정보는 평가와 관련되어 있다. 예를 들어, 종종 RA 환자에 의해서 취해지는 것과 같은 면역 억제약물이 세포 표면 항원의 발현에 대해 심각한 효과를 지닐 수 있음이 알려져 있다. 메토트렉세이트(methotrexate)로 치료한 환자에게는 CD19⁺및 CD5⁺19⁺B 세포의 감소가 나타났다. 시클로포스파미드(cyclophosphamide)로 치료한 환자에게는 CD25 또는 HLA DR을 발현하는 활성화된 T 세포의 감소가 나타났다. 프레드니손(prednisone)으로 치료한 환자에게는 활성화된 CD3⁺25⁺T 세포의 감소, CD5⁺19⁺B 세포의 감소 및 CD16⁺와 CD56⁺NK 세포의 감소를 포함하는 세포 표면 표현형에서의 여러 변화가 나타났다[참고문헌: Lacki, J.K. and Mackiewicz, S.H. (1997) Pol Arch Med Wewn 97, 134-43]. 질병 기간과 같은 기타 임상 변수가 또한 유용할 수 있다.

환자집단의 구별 . 자가면역 질병과 관련되어 있는 세포 분석 문헌의 검토는 명백히 충돌하는 보고가 있음을 발견하였다. 예를 들어, 일부 보고는 CD5 B 세포의 레벨의 증가를 나타내는 한편[참고문헌: Markeljevic, J., Batinic, D., Uzarevic, B., Bozikov, J., Cikes, N., Babic-Naglic, D., Horvat, Z. and Marusic, M. (1994) J Rheumatol 21, 2225-30], 다른 연구는 그렇지 않다[참고문헌: Liu, S.T., Wang, C.R., Liu, M.F., Li, J.S., Lei, H.Y. and Chuang, C.Y. (1996) Clin Rheumatol 15, 250-3]. 이들 출판물은 RA 환자에서 세포 표현형, 및 아마도 세포 기능을 위한 중요한 관련성을 갖는 기타 혼동스러운(confounding) 인자가 존재할 수 있음을 제안한다. 혈청에서 순환하는 용해성 인자, 질병의 단계, 및 치료법의 레벨을 기초로 하여, 연구를 위해 선택된 환자집단을 분리하는 것은상기의 RA 환자에서의 CD5⁺19⁺B 세포 레벨에 관한 명백한 불일치를 부분적으로 설명할 수 있다. 예를 들어, IgM 류마티스성 인자의 레벨과 CD5 B 세포의 퍼센트 사이에 상당한 상관성이 있음이 공지되어 있다[참고문헌: Youinou, P., Mackenzie, L., Katsikis, P., Merdrignac, G., Isenberg, D.A., Tuaillon, N., Lamour, A., Le Goff, P., Jouquan, J., Drogou, A. and et al., (1990) Arthritis Rheum 33, 339-48]. 또한 IgA 류마티스성 인자의 레벨은 CD5 B 세포 및 CD4⁺CD45RO⁺T 세포의 레벨과 관련이 있다[참고문헌: Arinbjarnarson, S., Jonsson, T., Steinsson, K., Sigfusson, A., Jonsson, H., Geirsson, A., Thorsteinsson, J. and Valdimarsson, H. (1997) J Rheumatol 24, 269-74]. 다수 변수의 동시 측정은 환자집단을 분리하기 위한 키(key) 변수를 동정할 확률을 증가시킨다.

이러한 일반적인 예는 본 발명이 질병을 특징화하기 위해 총체적인 생물학적 마커를 동정하는 데에 매우 적합함을 설명한다. 매우 적은 샘플 용적을 요하는 MLSC 기술은 다수 어세이가 단일 혈액 샘플에 대해 완료될 수 있음을 제공하고 최대량의 생물학적 정보가 획득될 수 있음을 보증한다. 생물학적 마커 동정 시스템은 다른 것들 중에서 전혈 및 RBC-용혈을 포함하여 혼합물의 어세이 유형을 수용시킬 수 있다. 수행된 어세이는 임상 표시에 관련되는 것으로 생각되고 광범위한 조사를 허용한다. 관련 생물학적 마커가 본 발명의 기술을 사용하여 동정될 수 있다.

실시예 2

다발성 경화증에 대한 생물학적 마커를 동정하기 위한 본 발명의 사용

본 발명은 다발성 경화증(MS)에 대한 생물학적 마커를 동정하기 위해서 사용될 수 있다. 생물학적 마커 동정 시스템이 다발성 경화증을 위한 마커를 동정하기 위해서 사용된다. MS는 중추 신경계의 자가면역 염증성 질병이다. MS는 임상적으로 신경 기능장애의 에피소드를 재발시키고 완화(remit)시키는 것을 특징으로 한다. 질병의 병인이 알려지지 않은 상태이지만, 뇌, 척수 및 뇌척수액 내의 염증 세포의 존재는 CNS 미엘린에 대한 면역 공격이 MS의 발병에 중심적임을 암시한다. MS 병소의 증거는 뇌 및 척수 전반에 걸쳐서 발견될 수 있는 플라크라 불리는 탈수초의 영역이다. 염증 세포가 플라크의 가장자리에서 관찰되고 백색 물질 전반에 걸쳐 분산되어 있다. 주요 염증 세포에는 활성화된 림프구 및 단핵세포 유도 대식세포가 포함된다. CD4 T 세포는 플라크의 가장자리에 축적되고; CD8 T 세포는 활성 질병에서 종종 발견되지 않지만, 오래된 병소에 존재한다. 미엘린 기재 단백질 및 기타 비-미엘린 자가-항원을 인식하는 자가반응 T 세포는 혈액에서 순환하고 활성화시 혈액-뇌 장벽을 통과할 수 있다. 접착 분자의 업(up)-조절, 조직적합성 항원 및 림프구 및 단핵세포 활성화의 기타 마커(IL2R, FcR)가 모두 활성화 및 호밍 과정에 연관된다. 또한, 면역 반응을 증폭시키기 위해서 제공되는 전-염증 사이토카인이 증가한다. 자가면역 반응은 또한 뚜렷한 B 세포 자극을 포함한다. 생성된 자가항체는 보충 시스템을 활성화하고 탈수초를 촉진할 수 있다. 질병의 다양한 단계 전반에 걸쳐서, CNS 중의 분자 및 세포와 질병의 마커가 존재할 잠재성이 있는 혈액에 변화가 있다.

본 발명은 다발성 경화증에 대해 진단 및 예측 유용성의 질병 마커를 동정할 수 있다. 이러한 마커들은 상이한 형태의 질병을 분류하는 데에, 예를 들어 그러한 2차 진행 질병으로 전개할 것 같은 재발-완화 질병을 앓는 환자의 서브셋을 동정하는 데에 가치가 있다. 또한, 마커들은 개입의 효능을 평가하고 초기 비독성의 성공적인 치료법을 개발하는 데에 가치가 있다. 다수의 조사가 질병에 대한 후보 마커인 혈액, 뇌척수액(CSF) 및 소변중의 세포 및 용해성 인자에서 이루어졌다. 일반적으로, 하나 내지 여러 마커가 동시에 조사되었다. CSF 중의 올리고클로날 면역글로불린과 같은 여러 인자들이 MS와 연관되어 있지만, MS-특정 마커에 일치하는 패널은 존재하지 않는다. 다수의 후보 마커를 동시에 측정할 필요를 강하게 요구한다.

T 세포 . MS에 T 세포를 관련시키는 여러 증거가 있다. 이러한 증거에는 MS의 MHC 클래스 II(특히 HLA DR) 대립유전자와의 관계가 포함된다[참고문헌: Hauser, S.L., Fleischnick, E., Weiner, H.L., Marcus, D., Awdeh, Z., Yunis, E.J. and Alper, C.A. (1989) Neurology 39, 275-7]. CD4⁺T 세포가 MHC 클래스 II 항원에 결합된 항원을 인식하기 때문에, MS와 특정 클래스 II 분자의 발현과의 관계는 MS에서의 CD4 T 세포에 대한 역할을 암시한다. 또한, 마우스 또는 랫트 실험의 알러지성 뇌척수염과 같은 MS의 동물 모델에 대한 연구는 미엘린 항원 특이적 CD4 T 세포가 원 동물로 선택적으로 전달될 경우 질병을 유도할 수 있음을 보여 주었다[참고문헌: Cross, A.H. and Raine, C.S. (1990) J Neuroimmunol 28, 27-37and Cross, A.H., Cannella, B., Brosnan, C.F. and Raine, C.S. (1990) Lab Invest 63, 162-70]. 또한, MS 환자에서의 연구는 T 세포를 제거하거나 T 세포 기능을 방해하는 것을 목적으로 하는 전략이 MS의 진행을 늦출 수 있음을 보여 주었다.

아마도 본 발명에 좀더 관련하여, MS 환자의 뇌척수액 및/또는 주변 혈액 중의 T 세포 표현형을 조사하는 연구는 약간의 흥미로운 발견을 끌어내었다. MS 환자의 혈액에서 CD8⁺T 세포가 감소하였다. 가장 현저한 감소를 나타내는 서브셋은 CD8⁺CD11b⁺서브셋이다[참고문헌: Ilonen, J., Surcel, H.M., Jagerroos, H., Nurmi, T. and Reunanen, M. (1990) Acta Neurol Scand 81, 128-30 and Oksaranta, O., Tarvonen, S., Ilonen, J., Poikonen, K., Reunanen, M., Panelius, M. and Salonen, R. (1996) Neurology 47, 1542-5]. 특히 활성 MS에서 CD71 및 CD25 마커를 지니는 활성화된 T 세포가 또한 증가하였다[참고문헌: Genc, K., Dona, D.L. and Reder, A.T. (1997) J Clin Invest 99, 2664-71 and Strauss, K., Hulstaert, F., Deneys, V., Mazzon, A. M., Hannet, I., De Bruyere, M., Reichert, T. and Sindic, C.J. (1995) J Neuroimmunol 63, 133-42)]. 또한, 뇌척수액 및 주변 혈액 중의 T 세포 대부분은 CD4 및 CD8 T 세포집단 모두에서 높은 레벨의 CD45RO 및 CD29를 갖는 메모리 표현형을 나타냈다[참고문헌: Vrethem, M., Dahle, C., Ekerfelt, C., Forsberg, P., Danielsson, O. and Ernerudh, J. (1998) Acta Neurol Scand 97, 215-20]. 이것은 주변 순환시 CD4⁺CD45RA⁺[참고문헌: Strauss,K., Hulstaert, F., Deneys, V., Mazzon, A.M., Hannet, I., De Bruyere, M., Reichert, T. and Sindic, C.J. (1995) J Neuroimmunol 63, 133-42] 및 CD8⁺CD27-CD45RA⁺[참고문헌: Hintzen, R.Q., Fiszer, U., Fredrinkson, S., Rep, M., Polman, C.H., van Lier, R.A. and Link, H. (1995) J Neuroimmunol 56, 99-105] 원 T 세포의 감소를 초래한다. 최근의 연구는 CD4⁺, CD4⁺SLAM⁺및 CD4⁺CD7⁺세포(우선적으로 T 헬퍼 1 사이토카인 생성 세포)가 대조군에 대해서 MS 환자에서 증가된다는 결론을 얻었다[참고문헌: Ferrante, P., Fusi, M.L., Saresella, M., Caputo, D., Biasin, M., Trabattoni, D., Salvaggio, A., Clerici, E., de Vries, J.E., Aversa, G., Cazzullo, C.L. and Clerici, M. (1998) J Immunol 160, 1514-21]. 또한, 일부의 연구는 제한된 TCR 레파토리를 나타내는 MS 환자의 주변 혈액에서 비대칭 TCR 가변성 베타 사용에 대해 나타내었다[참고문헌: Gran, B., Gestri, D., Sottini, A., Quiros Roldan, E., Bettinardi, A., Signorini, S., Primi, D., Ballerini, C., Taiuti, R., Amaducci, L. and Massacesi, L. (1998) J Neuroimmunol 85, 22-32]. 제한된 패턴의 유전자 재배열이 또한 γδ T 세포 서브셋에 설명되어 있다[참고문헌: Michalowska-Wender, G., Nowak, J. and Wender, M. (1998) Folia Neuropathol 36, 1-5].

B 세포. B 세포의 표현형 분석이 또한 MS 환자에서 수행되었다. 팬 T 세포 마커 CD5를 발현하는 B 세포 하위집단이 증가되는 것으로 나타났다[참고문헌: Mix, E., Olsson, T., Correale, J., Baig, S., Kostulas, V., Olsson, O. and Link, H.(1990) Clin Exp Immunol 79, 21-7]. 이러한 서브셋은 또한 IgM 자가항체를 구조적으로 발현하는 것으로 보이는 자가면역 마우스에서 증가된다[참고문헌: Hardy, R.R., Hayakawa, K., Shimizu, M., Yamasaki, K. and Kishimoto, T. (1987) Science 236, 81-3]. 그러나, 사람에 있어서 CD5⁺B 세포는 우선적으로 항체를 생성하지 않으며[참고문헌: Suzuki, N., Sakane, T. and Engleman, E.G. (1990) J Clin Invest 85, 238-47], 사람의 자가면역 발병에 있어서의 CD5⁺B 세포의 역할은 여전히 불명확하고 아마도 활성화된 B 세포의 존재를 반영한다[참고문헌: Werner-Favre, C., Vischer, T. L., Wohlwend, D. and Zubler, R.H. (1989) Eur J Immunol 19, 1209-13]. 이러한 결론과 일치되게, 높은 레벨의 메모리 마커 CD45RO가 MS를 앓는 환자로부터의 순환하는 CD20⁺B 세포에서 발견되었다[참고문헌: Yacyshyn, B., Meddings, J., Sadowski, D. and Bowen-Yacyshyn, M.B. (1996) Dig Dis Sci 41, 2493-8]. 순환 CD80⁺B 세포의 수는 또한 활성 질병을 앓는 MS 환자에서 현저히 증가되지만, 안정한 MS에서는 정상이 된다[참고문헌: Genc, K., Dona, D.L. and Reder, A.T. (1997) J Clin Invest 99, 2664-71].

항원-존재 세포 . 단핵세포, 대식세포, 수상돌기 세포, B 세포 및 클래스 II 항원을 발현하기 위해서 유도된 기타 세포를 포함하는 여러 세포 유형이 항원-존재 세포로서 제공될 수 있다. 일반적으로 이들 세포는 활성 MS를 앓는 환자에서 증가된 발현 레벨의 HLA 클래스 II 항원에 의해 설명되는 활성화된 표현형을 나타낸다[참고문헌: Genc, K., Dona, D.L. and Reder, A.T. (1997) J Clin Invest 99, 2664-71]. 최근의 연구는 또한 CD86 및 CD95 (fas) 발현 단핵세포가 건강한 대조군에 비하여 MS에서 증가됨을 보여 주었다[참고문헌: Genc, K., Dona, D.L. and Reder, A.T. (1997) J Clin Invest 99, 2664-71].

기타 세포 유형 . 매우 소수의 연구가 MS에서의 NK 마커 및 과립구 마커의 발현에 주지하였다. 한 연구는 만성 진행성 MS에서 CD16⁺NK 세포의 감소를 보여주었다[참고문헌: Kastrukoff, L.F., Morgan, N.G., Aziz, T.M., Zecchini, D., Berkowitz, J. and Paty, D.W. (1988) J Neuroimmunol 20, 15-23].

용해성 인자 어세이 . 용해성 인자 어세이는 잠재적인 생물학적 마커의 추가 배터리를 제공한다. MS 환자에게서 동정된 다수의 중요한 용해성 인자가 존재한다. 예를 들면, 용해성 Apo A-1/Fas의 레벨[참고문헌: Ferrante, P., Fusi, M.L., Saresella, M., Caputo, D., Biasin, M., Trabattoni, D., Salvaggio, A., Clerici, E., de Vries, J.E., Aversa, G., Cazzullo, C.L. and Clerici, M. (1998) J Immunol 160, 1514-21]이 안정한 질병을 앓는 환자 또는 건강한 대조군에서 보여지는 레벨에 비하여 급성 MS에서 증대된다. 또한, 용해성 세포내 접착 분자 1 (ICAM-1)과 같은 용해성 접착 분자[참고문헌: Giovannoni, G., Lai, M., Thorpe, J., KIdd, D., Chamoun, V., Thompson, A.J., Miller, D.H., Feldmann, M. and Thompson, E.J. (1997) Neurology 48, 1557-65] 및 용해성 E-셀렉틴[참고문헌: Giovannoni, G., Thorpe, J.W., Kidd, D., Kendall, B.E., Moseley, I.F.,Thompson, A.J., Keir, G., Miller, D.H., Feldmann, M. and Thompson, E.J. (1996) J Neurol Neurosurg Psychiatry 60, 20-6]의 레벨은 질병의 상이한 단계에 있는 MS 환자에서 증가되는 것으로 보였다. TNFα 및 IFNγ와 같은 전염증 사이토카인이 질병의 상이한 단계에 있는 MS 환자에서 다양한 레벨로 존재하는 것으로 알려졌다[참고문헌: Navikas, V. and Link, H. (1996) J Neurosci Res 45, 322-33]. 사이토카인 및 사이토카인 수용체, 케모카인, 매트릭스 메탈로프로테이나아제 및 이들의 수용체, 네옵테린, 및 미엘린 기재 단백질과 같은 기타 관련 단백질이 또한 질병의 상이한 단계에 있는 MS 환자 및 건강한 대조군에 다양한 레벨로 존재하는 것으로 나타났다. 그러므로, 어세이는 이러한 용해성 인자를 측정하고 동정된 세포집단과의 통계적 상관성을 찾기 위해서 수행될 수 있다.

병력 및 환자집단의 구별 . 용해성 인자 외에도 환자의 병력에 대한 정보가 데이터베이스에 포함될 것이다. 임상 히스토리는 나이, 성, 질병 단계, 실험실외 증거(자기공명 영상, 올리고클로날 면역글로불린에 대한 뇌척수액 분석, 및 유발 전위 기록), 이전 치료법 및 수반하는 약물 또는 치료법에 대한 정보를 포함할 것이다. 이러한 정보는 환자집단을 분리하는 것과 관련되어 있다.

처리 효과가 세포의 표현형에 역할을 한다는 증거가 있다. 미치료 MS 환자가 건강한 공여체에 비하여 더욱 거대한 세포집단의 CD3⁺CD4⁺CD8⁺순환 T 세포들을 나타내지만, 이러한 세포집단은 부신피질호르몬 처리[30] 후 감소된다. 또한, CD71+ 및 HLA DR+ 림프구 및 단핵세포의 수는 활성 MS에서 증가된다. 그러나, IFNβ-1b로의 치료는 활성화된 HLADR+, CD71+ 및 CD25+ 세포의 수를 감소시킨다. 또한, 순환 CD80+ B 세포의 수가 감소되더라도, CD86+ 단핵세포의 수는 치료[14] 후에 증가된다. 질병 기간과 같은 기타 임상 변수가 또한 유용할 수 있다. 예를 들어, 제한된 TCR Vβ레파토리를 갖는 MS 환자에서 중심 질병 기간은 제한된 레파토리를 갖지 않는 환자에서 보다 짧은 것으로 나타났다[참고문헌: Gran, B., Gestri, D., Sottini, A., Quiros Roldan, E., Bettinardi, A., Signorini, S., Primi, D., Ballerini, C., Taiuti, R., Amaducci, L. and Massacesi, L. (1998) J Neuroimmunol 85, 22-32].

실시예 3

환자 혈액을 조절하기 위해서 류마티스성 관절염 환자를 비교하는 연구

선도적인 연구에서, 40개의 2-색 세포 어세이의 패널을 Imagen 2000에 대해 제조하고 약 50명의 공여체로부터의 혈액 샘플을 측정하였다. 샘플의 절반은 스탠포드 혈액 은행(Stanford Blood Bank)로부터 온 것이고 절반은 스탠포드 대학의 류마티즘 클리닉으로부터 온 것이다. 이 연구는 본 발명의 바이오마커 검색 엔진의 키 성분; 수단, 분석 및 분석 툴을 평가하고 개발하기 위해서 고안되었다. 이것은 반드시 바이오마커를 밝히기 위해서 고안된 것은 아니다. 모든 어세이가 전혈에서 수행되었고, 비결합 시약을 제거하기 위해 세척하지 않았다. 38개의 어세이가 23가지의 상이한 세포 표면 항원으로의 27가지의 상이한 항체 시약을 포함하였다. 18개가 Cy5에 접합되고 9개가 Cy5.5에 접합되었다. 각각의 이들 세포 어세이는 2-색 조합을 이루기 위해서 각각의 염료에 접합된 하나의 항원을 포함하였다. 2개의어세이는 DNA 개재 염료를 사용하여 세포 생존력을 모니터하였다. 세포 어세이는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵세포 및 과립구의 세트를 포함하여 약 100개의 상이한 세포집단을 동정하도록 해 준다.

방법

세포 분석

분석의 패널이 표 3에 예시되어 있다. 각각의 시약은 분석 성능을 최적화하기 위해서 시약 조합물을 제조하기 전에 시험되고 적정되었다.

샘플 제조

이러한 연구를 위해서 모든 세포 어세이가 동일한 방식으로 전혈에 적용되었다(착색 후 세척 없음). DNA 염료의 형광색으로 라벨화된 항체 시약 조합물의 분취량(20uL)을 제조된 선반으로부터 미세역가 플레이트의 개별 웰로 멀티-채널 피펫을 사용하여 분배하였다. 전혈 또는 희석된 전혈(30uL)을 멀티-채널 피펫을 사용하여 첨가하고 샘플을 혼합하였다. 세포를 20분 동안 배양한 다음, 100uL의 희석제를 첨가하고 혼합하였다. 각각의 착색된 샘플의 부분(50uL, 혈액 10uL에 해당함)을 용적 측정 모세관(VC120)에 첨가하고 변형된 Imagn 2000 수단에 로딩하였다. 스캔을 개시하고 작동자 개입없이 실행하였다. 데이터 파일을 컴퓨터 네트워크로 옮기고 흘림 세포계측 표준 포맷 (Flow Cytometry Standard format)으로 전환하였다. 플로우조 세포계측 소프트웨어를 세포집단을 동정하고 세포 수(uL 당 세포), 상대 세포 크기 및 각 게이트내(박스내) 세포집단에 대한 항원 밀도로 측정되는 상대 형광 강도에 대한 수치값을 획득하기 위해서 사용하였다.

용해성 인자

C-반응성 단백질의 혈청 레벨은 비드계 면역어세이로 Imagn 2000에서 측정되었다. 항-CRP 항체로 코팅된 비드를 분석물을 포획하기 위해서 사용하였다. Cy5 접합 항-CRP 항체를 포획된 분석물을 밝혀내기 위해서 사용하였다.

환자 의료 정보

나이, 성, 질병 심각성의 변수, 동시-질병율 및 투약을 포함하는 요약된 병력을 각 환자로부터 수득하였다. 혈액 은행 샘플에 대한 데이터는 나이와 성으로 제한되었다.

데이터베이스 및 통계학

세포 어세이로부터의 데이터 출력, 용해성 인자 분석 및 병력을 단일 데이터베이스로 합하였다. 카테고리에 속한 임상 변수(예를 들어, 질병의 진단)와 연관된 잠재적 생물학적 마커(세포수 또는 염색 강도, 혈청 농도)를 동정하기 위해서 피셔(Fisher) 1차 및 2차 판별 분석, 논리적 회귀 및 분류목(classification tree)을 포함하는 다양한 판별 기술을 사용하였다. 연속 평가된 임상 변수(예를 들어, 적혈구 침강율)과 연관된 마커를 동정하기 위해서 다변량 선형 회귀 및 회귀목을 포함하여 다양한 회귀 기술을 사용하였다. 판별 및 회귀 분석 모두에 대해서, 단계별 변수 선별 및 교차 확인을 해당 임상 변수와 가장 밀접하게 연관되어 있는 마커들을 동정하기 위해서 사용하였다. 경우에 따라, 인구 및 임상 변수(예를 들어, 나이, 성 및 부수적인 약물)가 모델내 공변량으로서 포함되었다. 이들 기술은 SAS 및 스태티스티카(Statistica) 통계 분석 소프트웨어 패키지를 사용하여 수행되고적용되었다.

결과

공통 분석 전략이 대부분의 환자 샘플에 대해 사용될 수 있다.

세포집단 연구의 약점 중 하나가 종종 공여체 샘플 중에서의 가변성이지만, 동일한 분석 창(게이트)을 분석된 세포집단 95%에 대해서 모든 공여체에 걸쳐서 사용하였다. 이것은 이들 어세이 및 세포 어세이 시스템의 견고성 및 일관성을 나타낸다. 잔존하는 5%의 게이트를 특정 공여체에서 나타나는 새로운 집단 또는 약간의 공여체에 대해 신뢰할 수 없는 것으로 보이는 시약을 설명하도록 조절하였다. 후자의 경우에 있어서, 문제 시약은 장래 연구에서 개선된 버전으로 대체될 수 있다.

공여체들 중에 변동이 있는 2-색 조합의 실예가 도 4에 도시되어 있다. 세포를 Cy5.5에 접합된 CD8과 조합하여 Cy5에 접합된 CD27로 착색했다. 이러한 조합은 CD8⁺T 세포(제한된 MHC 클래스 I)가 모니터될 수 있게 하고, 이것은 CD27⁺(활성화됨) 및 CD27^-이다. CD8^-, CD27⁺세포(실제로 활성화된 CD4, 제한된 MHC 클래스 II, T 세포)가 또한 검출되었다. 공여체들 중에 변동이 있더라도, 단일 게이팅 전략이 수행될 수 있다. 공여체들 중에서 상이한 3가지 세포집단이 동정되었다. 도 4A에서 대부분의 CD8⁺T 세포는 CD27 음성이다. 도 4B에서 대부분의 CD8⁺T 세포는 CD27 양성이다. 마침내, 도 4C에서, CD8 집단은 CD27 양성인 것들과 CD27 음성인 것들 중에 흩어져 있다. 세포계측 소프트웨어인 플로우조는 각각의 게이트된 세포집단의 세포 수를 계산하였다. 또한, 각 항원에 대한 평균 형광 강도를 얻었다. 이것은 세포 표면에 대한 항원 강도를 나타낸다. 각 세포집단에 대한 상대 세포 크기가 또한 얻어졌다. 그 수는 비교되고 모든 공여체에 걸쳐 통계를 산정하였다. CD8⁺세포에 대한 CD27 발현에 관해 여기에 나타난 차이는 본원 임상 연구에서 환자와 대조군을 비교하는 경우 관찰되는 전형적인 종류의 변화이다.

관련된 측정 사이의 우수한 상관성

이러한 초기 연구의 또 다른 목표는 2-색 Imagn 시스템의 견고성을 산정하고 통계 툴을 개발하는 것이다. 연구는 여러 모세관이 동등하거나 다른 염료에 접합된 동일한 항체 시약을 함유하도록 고안되었다. 이것은 동일한 측정이 CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD19, CD20 및 CD27 항원에 대한 동일한 공여체로부터 어디에서든 2 내지 6 회 수득되게 한다. 동일한 세포집단을 또한 이들에서 발견된 상이한 항원에 대한 항체를 사용하여 측정하였다. 예를 들어, 총 T 세포는 CD3 및 CD5를 사용하여 세었다. B세포는 CD19 및 CD20 등을 사용하여 세었다. 이러한 예비 연구에서, 동일한 시약을 사용하는 모세관과 유사한 세포집단을 착색하는 상이한 항체를 함유하는 모세관 사이에 우수한 일치성이 보여졌다. 상이한 모세관에 걸친 동일한 항원에 대한 상관계수는 평균 0.94였다. 상관계수는 CD3 대 CD5 및 CD19 대 CD20에 대해 0.97이였다. 이들 상관성의 예가 도 5 및 도 6에 기재되어 있다.

차이가 RA와 혈액 은행 샘플에서 관찰되었다.

여러 측정된 변수가 표 4에 예시된 바와 같이 일반 혈액 은행 샘플 및 RA 환자 샘플을 분리하기 위해서 사용되었다. 최상의 단일 마커는 80 내지 86 %의 샘플을 정확히 분리하였다(7 내지 10 부정확 지정). 일부, 두 세포집단 쌍은 90%의 샘플을 분리하고, 세포집단 세트가 환자군을 분리하기 위해서 단일 세포집단 보다 더 유용할 수 있음을 제안하였다.

실시예 4

확대된 RA 연구

본 실시예는 RA 연구에서의 측정 가능성을 확대하였다. 류마티스성 관절염(RA) 환자로부터의 세포집단 및 용해성 인자를 모니터했다. RA 환자는 임상 연구의 일부이고, 메토트렉세이트와 ARAVA 또는 위약을 받았다. 환자를 약 2달에 걸쳐 종적으로 모니터했다. 각 시점에서, 세포집단 데이터, 용해성 인자 데이터 및 임상 정보를 수집하였다.

세포 어세이

대부분의 세포 어세이는 실시예 3에 기재된 바와 같은 전혈 포맷에서 수행되었다. 최소 조작으로 가장 정확한 절대 세포 수(세포/혈액 ㎕)가 얻어짐을 보장하였다. 또한 단일 튜브의 혈액으로부터 다수 어세이가 실행될 수 있도록 소량의 혈액만이 어세이(40 ul) 당 요구되었다. 그러나, 예를 들어, 일부의 세포집단에 대해서, 선택적인 어세이 포맷인 RBC-용혈이 바람직하다. 이들은 혈청에 함유된 용해성 인자(자유 Ig, 용해성 사이토카인 수용체 등)가 세포 라벨링을 방해하는 특정 항원-항체 쌍 및 매우 낮은 빈도로 존재하는 세포집단을 포함한다. 예를 들어, RBC-용혈 샘플 제조는 정상 개체로부터의 전혈에서 본질적으로 검출될 수 없지만용해된 포맷에서 10배 증가되는 경향이 있는 다양한 자가면역 상태에서 증가되기 쉬운 CD25 또는 CD69를 발현하는 활성화된 세포에 대해 유용하다. NK 세포와 같은 다른 소수 세포집단의 개선된 검출이 또한 입증되었다.

이러한 프로토콜을 위해서, 세포 어세이는 46개의 전혈 어세이와 14개의 RBC-용해된 전혈을 포함하는 60개의 2-색 조합의 패널을 포함한다. 35개의 개별 세포 표면 항원을 표적으로 하는 총 39개의 상이한 항체 시약(Cy5에 접합된 것 30개, Cy5.5에 접합된 9개)가 사용되었다. 모든 어세이는 동일 방식으로 수행되었다 (착색 후 세척하지 않음). 이러한 어세이 패널은 150개 이상의 상이한 세포집단의 동정을 가능하게 한다. 동정될 수 있는 시약 조합 및 세포집단이 표 5에 제공되어 있다.

용해성 인자 분석

다수 용해성 인자의 후속 측정을 위해서 각 혈액 샘플에 대해 혈청을 취하여 냉동시켰다. 이들은 TNFα및 IL-6와 같은 순환하는 사이토카인, 사이토카인 수용체, 케모카인, 상이한 아이소타입의 류마티스 인자(RF), 면역글로불린, C-반응성 단백질 및 혈청 아밀로이드 A와 같은 급성기 단백질, 용해성 부착 분자, 및 매트릭스 메탈로프로테이나아제 및 이들의 억제제의 레벨을 포함한다. 분석된 22개의 용해성 인자의 초기 패널이 표 6에 예시되어 있다. 또한 추가의 표적이 표 6에 제공되어 있다. 모든 분석은 요구된 감도 및 특이성을 보장하기 위해서 매치된 항체 쌍을 사용하는 샌드위치 ELISA 포맷에서 수행되었다.

환자 의료 정보

보다 상세한 질병-특이적 정보를 지닌 병력이 연구시 각 샘플과 함께 포함되었다.

실시예 5

4-채널 MLSC 수단에서의 세포 분석

어세이당 더 많은 정보 함량을 얻는 더 많은 어세이가 4-채널 서로스캔(SurroScan) 수단에서 수행될 수 있다. 어세이는 3-색 시약 조합을 사용하여 전개되었다. 효과적인 염료 조합에는 Cy5, Cy5.5 및 Cy7이 포함되었고 Cy5, Cy5.5 및 Cy7-APC가 3가지 표적 항원의 동시 및 독립 측정을 허용하였다. 3색 조합은 1) 여분을 제거하고(예를 들어, 두 모세관에서 CD3 + CD4 및 CD3 + CD8을 측정하는 대신에 한 모세관에서 CD3, CD4 및 CD8을 측정) 2) 3가지 항원(예를 들어, CD45RA와 CD62L을 모두 발현하는 원 CD4⁺T 세포)의 동시 발현에 의해 한정되는 새로운 집단을 동정함으로써 2색 조합 보다 모세관 당 더 많은 정보의 획득을 촉진하였다. 개별 발산 스펙트럼을 갖는 적합한 형광 염료가 주어지면, 제 4 채널에서 또는 일부의 경우에 존재하는 채널에서 추가의 표적 항원을 동시에 모니터링할 수 있었다. 도 7은 서로스캔 수단에서의 3-색 어세이의 결과를 제공한다.

서로스캔 수단에서의 분석은 VC120 모세관 보다 약 1/3 더 적은 샘플을 사용하는 모세관 배열로 실행될 수 있었다. 전혈 어세이에 대해서 3색 어세이 당 10 uL 이하를 처리할 수 있었고, 혈액 10 mL 튜브당 1000 어세이 이하에 대한 잠재성을 부여하였다. 백혈구 농도가 10배 증가된 RBC-용혈 샘플에 대해서, 약 100 어세이이 혈액 튜브당 수행될 수 있다. 50가지 이상의 표적 항원을 갖는 64개 3색 어세이의 패널이 전혈 및 용해된 포맷 모두를 사용하여 전개되었다. 이것은 200개 이상의 세포집단의 동정을 허용해야 한다.

실시예 6

세포내 착색

세포내 분자를 MLSC 기술로 측정할 수 있다. PBMC를 PHA 및 이오노마이신의 존재시에 5시간 동안 배양하였다. 세포를 독성 T 세포를 동정하기 위해서 Cy5.5 항-CD8로 착색하고, 고정하고 침투되게 한 다음 세포내 사이토카인을 검출하기 위해서 Cy5 항-인터페론(IFN-γ)으로 착색하였다. 도 8에서의 데이터는 IFN-γ가 자극된 세포에서만 검출된다는 것을 나타낸다. 대조군 시약(MOPC)은 세포를 라벨하지 않는다. CD8 T 세포 중에서, 20%가 세포내 IFN-γ를 발현하였다.

실시예 7

알러지 및 천식의 치료를 위한 생물학적 마커의 동정

본 발명은 알러지성 천식의 생물학적 마커를 동정하게 위해서 사용될 수 있다. 천식은 불확실한 병인의 일반적인 만성 폐 질병이다. 이것은 기침, 씨근거림, 흉부 긴장 및 숨 가쁨의 징후를 초래하는 기도의 염증을 특징으로 한다. 이들 임상 증후군은 기도의 과민감성 및 공기유동의 장애를 초래하는 장기 염증 과정으로 인한 것으로 생각된다. 질병은 극한 불편을 초래하고 동시에 적당한 치료가 없을시에 치명적일 수 있다. 천식의 임상적 증상발현은 천식이 전개될 가능성을 증가시키는 유전적 소인에 대한 다양한 환경 요인의 중첩으로부터 발생되는 것으로생각된다. 아토피, 환경적 알러지원에 대한 과민감성이 천식에서 보편적이지만, 모든 아토피성 개체가 천식으로 발전되지는 않는다. 알러지 메커니즘의 상대적 중요성은 완전히 이해되지 않았다. 부신피질 호르몬(흡입 및 전신)이 천식에 효능이 있지만 이의 유용성을 제한하는, 감지되는 실제 부작용과 연관되어 있다. 부신피질 호르몬에 대한 좀더 완전한 이해는 폐에서 국부적 효과만을 갖는 약물 또는 부작용 없이 이로운 효과를 갖는 약물의 개발을 허용할 수 있다.

연구는 아토피, 천식 및 부신피질 호르몬 치료법에 대한 반응의 생물학적 마커를 동정하기 위해서 고안되었다. 대상을 20명의 네 연구 그룹에 대해 스크리닝 했다: 1) 피부 시험 알러지원에 양성으로 시험된 가벼운 천식환자, 2) 피부 시험 알러지원에 음성으로 시험된 가벼운 천식환자, 3) 피부 시험 알러지원에 양성으로 시험된 비-천식환자, 및 4) 피부 시험 알러지원에 음성으로 시험된 비-천식환자(건강한 대상). 모든 적격한 대상을 3일 비드(bid) 처리 후, 생물학적 마커에 대한 약물 프레드니손의 효과를 조사하기 위해서 단일-블라인디드(blinded), 위약 조절, 무작위화 평행 연구에 진입시켰다. 혈액 샘플을 첫째날 아침 치료전 및 네째날 아침의 마지막 투약 12시간 후에 취하였다.

대상은 폐 기능 및 알러지에 대한 상세한 병력 및 임상실험을 포함하여 엄격한 스크리닝을 수행한다. 가벼운 천식 환자는 1) FEV₁≥80% 예상치, 2) 입증된 천식의 진단 또는 특히 밤에, 반복되는 씨근거림, 반복되는 호흡 곤란, 반복되는 흉부 긴장 중 일부 히스토리, 및 3) 양성 메타콜린 챌린지 시험 결과가 있다[참고문헌: Cockcroft DW, et al Clin Allergy 1977; 7: 235 and Juniper EF, et al Thorax 1984; 39: 556]. 비 천식환자는 1) FEV₁≥80% 예상치, 2) 천식 병력 없음, 및 3) 음성 메타콜린 챌린지 시험 결과가 있다. 알러지성 대상은 알러지원의 패널 적어도 하나에 대해 양성 피부 시험 결과를 갖는다.

임상 데이터의 실예에는 혈액학: 백혈구 수 (WBC), 적혈구 수 (RBC), 헤모글로빈(Hb), 헤마토크리트(HCT), 평균 세포 용적(MCV), 평균 세포 헤모글로빈(MCH), 평균 세포 헤모글로빈 농도 (MCHC), 혈소판 수, 호중구 수, 림프구 수, 단핵세포 수, 호산구 수, 호염기구 수, 및 ESR-적혈구 침강율; 혈액 생화학: 알칼린 포스파타아제, 알라닌 트린스아미나아제, 아스파테이트 트랜스아미나아제, 감마-글루타밀 트랜스펩티다아제, 알부민, 총 단백질, 총 빌리루빈, 요소, 크레아티닌, 나트륨, 칼륨, 글루코스; 검뇨: 단백질, 글루코스, 케톤, 빌리루빈, 혈액, 백혈구; 간염 및 HIV 시험: HIV I 및 II, 간염 B 표면 항원, 감염 C 항체가 포함된다. 모든 임상 히스토리 및 시험 변수가 통계 분석을 위한 주요 데이터베이스, 공변량으로서 평가 및 데이터 마이닝에 포함될 것이다.

아토피성 천식은 IgE 항체에 의해 매개되는 면역성 질병이다. 알러지원으로의 노출은 B 세포가 IgE를 합성하게 하고, 이는 기도의 점막에 존재하는 고 친화성 수용체 매스트(mast) 세포에 결합한다. 알러지원으로의 재-노출시, 매스트 세포의 표면에서의 항원-항체 상호작용은 히스타민, 트립타아제, PGD₂, 류코트리엔 C₄및 D₄및 혈소판 활성 인자를 포함하는 매스트 세포 과립에 저장된 아나필락시스의 매개체의 방출을 일으킨다. 이들 용해성 인자는 공기 평활근의 수축을 유도하고 FEV₁의 즉각적 하강을 초래한다. 알러지원으로의 재-노출은 또한 T 세포 및 매스트 세포로부터의 다양한 사이토카인: IL-4, IL-5, GM-CSF, TNF-α, TGF-β의 합성 및 방출을 유도한다. 이들 사이토카인은 B세포를 끌어들이고 활성화하여 더 많은 IgE, 및 호산구 및 호중구의 생성을 유발시키고, 호산구 양이온성 단백질 (ECP), 주요 염기성 단백질(MBP) 및 PAF를 생성한다. 이들 인자는 부종, 점액 분비과다, 평활근 수축을 유발시키고 노출 약 4 내지 6 시간 후 FEV₁의 하강에 의해 표시되는, 후기 천식 반응과 전형적으로 연관되어 있는 기관지 반응성을 증가시킨다.

바이오마커를 발견할 목적으로 광범위한 패널의 세포 및 용해성 인자 측정을 대상 혈액 샘플에 적용시켰다. 연구 고안은 마커 발현에 있어서의 그룹내 개체간 변동 및 그룹간 차이의 정보를 제공하였다. 그룹간 차이(예를 들어, 알레르기성 비-천식 대 비-알레르기성 비-천식)가 그룹내 개체간 변동 보다 클 것이라고 여겨졌다. 또한 프레드니손 치료법이 마커 발현에 상당한 개체간 변화를 초래할 것이라고 여겨졌다.

세포 어세이

혈액내 면역 및 염증 변수에 촛점을 둔 64개 3색 세포 어세이의 패널을 제조하여 초기 아토피성 천식에 대해 시험했다. 패널이 표 7에 기재되어 있다.

용해성 인자

연구는 또한 광범위한 패널의 용해성 인자를 주지할 것이다. 샌드위치-기재화학발광 ELISA 포맷에서의 면역어세이를 하기 표적에 대해 사용하였다:

사이토카인, 케모카인 및 이들의 용해성 수용체: IL-1 알파, IL-1 베타, IL-1 RA, IL-1 sRI, IL-1 sRII, IL-2, IL-2sR, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-6 sR, IL-8, IL-10, IL-12 p40, IL-12 p70, IL-13, IL-16, IL-17, MIF, MIP-1 알파, MIP-1 베타, RANTES, sTNF알파 RI^*, sTNF알파 RII^*, TGF 베타, TNF 알파, 알파, TGF 베타2, TGF 베타3, 온코스타틴 M, M-CSF, GM-CSF, IGF-1, PDGF-BB, FGF-4, FGF-6, FGF-7, Fas, VEGF, MCP-1, PF-4, EOTAXIN, IFN 감마, 면역글루불린: IgA1 캅파, IgA1 람다, IgA1, 2 캅파, IgA1, 2 람다, IgA2 캅파, IgA2 람다, IgE 토탈, IgG1 캅파, IgG1 람다, IgG1 토탈, IgG2 캅파, IgG2 람다, IgG2 토탈, IgG3 캅파, IgG3 람다, IgG3 토탈, IgG4 캅파, IgG4 람다, IgG4 토탈, IgG 토탈, IgG 토탈 캅파, IgG 토탈 람다, IgM 캅파, IgM 람다, IgM 토탈, RFIgA, RFIgG, RFIgM, RF 토탈, 급성기 단백질: CRP, SAA; 매트릭스 메탈로프로테이나아제 및 이들의 억제제: MMP-3, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2; 용해성 접착 분자: sCD54(ICAM-1), sCD62E, sCD62P.

면역 어세이 또는 질량 분광 분석법에 의해 측정된 추가의 용해성 인자에는 사이토카인, 케모카인 및 이들의 용해성 수용체: IL-9, IL-11, IL-14, IL-15, IL-18, sCD23, 호산구 단백질: ECP, MBP, 면역글로불린: 알러지원 특이성 IgE, 탄수화물 변형된 Ig: 다양한 프로스타글란딘; 다양한 류코트리엔, 히스타민이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.

세포 어세이, 용해성 인자 분석, 병력 및 스크리닝 라벨로부터의 데이터 출력을 단일 데이터베이스로 합쳤다. 카테고리에 속한 임상 변수(치료 전후의 질병 상태, 프레드니손 또는 위약)와 연계된 잠재적 생물학적 마커(세포 수, 특정 세포 유형에서의 항원 강도, 용해성 인자 농도 등)를 동정하기 위해서, 다양한 ANOVA 및 판별 기술이 사용될 수 있다. 경우에 따라, 인구 및 임상 변수(예를 들어, 나이, 성, 특정 히스토리 결과)가 모델내 공변량으로서 포함될 수 있다. 이들 기술은 SAS 및 스태티스티카, 스태트뷰(Statview) 또는 유사 통계 분석 소프트웨어 패키지를 사용하여 수행될 수 있다.

실시예 8

아스피린 투여 후 생물학적 마커를 동정하기 위한 본 발명의 사용

본 발명은 소량의 주변 혈액 샘플에서 수행될 세포 및 용해성 인자에 대한 약물 투여의 효과를 평가하기 위한 생물학적 마커를 동정하기 위해서 사용될 수 있다. 이들 어세이가 사람 주변 혈액에서 세포 및 용해성 마커에 대한 상이한 투여량의 약물의 효과의 분석을 가능하게 할 것으로 예상되었다. 본 실시예에서, 광범위하게 사용된 창구판매 약물인 아스피린(아세틸살리실산)이 사람 지원자에게 투여되었다. 상이한 투여량의 약물이 구강 투여될 것이다; 혈액은 투여 전 및 투여 후 다양한 시점에서 체혈되고 세포 및 용해성 인자 어세이의 패널이 착수되었다. 아스피린이 혈액의 세포 및 용해성 성분의 변화를 초래할 것으로 예상되었다.

아스피린은 1) 관상동맥 및 뇌 혈전증의 위험을 감소시키고 2) 진통/항-염증제로서의 두가지 주요 지시를 위해 일상적으로 사용되었다. 제 1 지시의 근간이 되는 메커니즘은 혈소판에서의 PGH-합성효소의 비가역적 억제라고 여겨진다. 혈소판에서의 이 효소의 프로스타글란딘 산물이 트롬복산 A2로 전환되고, 이것은 혈소판 응집 및 혈전증을 촉진한다. 프로스타글란딘 합성의 부작용은 산소 유리 라디칼을 생성하는 것이고, 이는 산화환원 반응의-산화 금속의 존재시에 불포화 지방산을 알데히드로 전환시킨다. 지질 산화의 상대적으로 안정한 산물은 말론디알데히드(MDA)이다. 이 화합물은 티오바르비트루산(TBA)과의 상호작용 후 비색계 또는 형광계를 사용하여 일상적으로 어세이된다. 아스피린은 프로스타글란딘 합성을 억제함으로써 주변 혈소판의 MDA 레벨을 감소시키는 것으로 예상된다. 이것은 아스피린 투여 후 변화가 예상되는 하나의 변수이다. CD62P 및 CD63의 발현에서의 변화와 같은 혈소판 활성화의 다른 마커에서의 변화가 또한 발생할 수 있다.

E-형 프로스타글란딘은 림프구 활성화 및 단핵세포-대식세포 혈통 세포들에 의한 종양 괴사 인자-α(TNF-α)의 생성을 억제한다. 정상 건강인에서 일부 레벨의 림프구 활성화 및 TNF-α생성이 존재하는 경우, 이것은 아스피린 처리 후 증가되거나 주변 혈액에서 검출가능될 수 있다. 이들은 하기 아스피린 투여 후 예상되는 변화의 예이다; 다수 마커가 어세이되는 경우, 예상치 못한 결과가 또한 발견될 것이고 예상된 것보다 좀더 흥미로운 것으로 입증될 수 있다.

연구는 혈액 변수에 대한 아스피린의 효과를 동정하기 위해서 고안되었다. 적격 대상은 3가지 투여 계획-그룹 1, 조식 후 1 투여(325mg 정제), 그룹 2, 조식 후 2 투여(650mg) 및 그룹 3, 조식 후 2 투여 및 석식 후 2 투여 (총 1300mg) 중 하나에 따라 아스피린을 경구 투여하도록 무작위적으로 지정되었다. 그룹 당 10 내지 12 명의 대상이 있다. 혈액 샘플을 아스피린 투여 전, 중, 후에 취하였다.스케줄이 표 8에 기재되어 있다. 대상은 다른 아스피린이나 다른 비-스테로이드성 항-염증성 약물을 취하지 않고, 항-염증(스테로이드성 또는 비스테로이드성) 약물의 사용을 요하는 치료 하에 있지 않은 18세 내지 65세의 건강한 개인이다.

세포 어세이

42개 3-색 세포 어세이의 패널을 초기 연구에 사용하였다. 표 9 참조. 패널은 면역 및 염증 변수를 포함하고 실시예 7에 기록된 어세이의 일부를 포함한다. 이것은 또한 혈소판 기능에 대한 일련의 어세이(1-17)를 포함한다. 이들 어세이는 희석된 전혈(WB, 1-9)에서의 직접 측정 및 트롬빈 자극 어세이(TRT, 10-13) 및 자극 대조군(NTRT, 14-17)을 포함한다.

용해성 인자

실시예 7에 기재된 용해성 인자의 광범위한 패널은 연구의 일부일 것이다. 추가의 측정에는 본 윌러브랜드(Von Willebrand) 인자, b-트롬보글로불린, 트롬복산 B2, 6-케토 PGF 및 말론디알데히드가 포함된다. 용해성 인자는 혈장으로부터 측정될 것이다. 또한, 일부 용해성 인자(예를 들어, MDA, 프로스타글란딘 류코트리엔)가 자극된 샘플 및 대조군에 대해 측정될 것이다.

주된 마커	서브셋 항원
T 세포 :CD2, CD3, CD4, CD5, CD7,CD8	메모리/활성화/조-자극(co-stimulation) :CD6,CD25, CD26, CD27 CD28, CD38, CD43,CD45RA/RO, CD49a-f, CD69, CD70, CD71,CD80, CD86, CD152(CTLA4)CD154(CD40L)
B 세포 :CD19, CD20, CD21, CD22,CD23, CD72	접착 :CD11a/b/c(인터그린), CD18, CD29,CD31,CD44, CD54(ICAM-1), CD58(LFA3),CD62E/L/P(셀렉틴), CD102(ICAM-2),CD104, CD138
항원-존재 세포 :CD13, CD14, CD15, CD33	항원 수용체 :TCR: αβTcR, γδTcR, 특이 TcR Vβ패널SIg: IgM, IgG, IgA
NK 세포 :CD16, CD56, CD57, NKB1	FcR :CD16(FcγRⅢ), CD32(FcγRⅡ),CD64(FcγRI)
과립구 :CD13, CD15, CD16, CD33	사이토킨 수용체 :CD25/CD122(IL2R),CD95(Fas), CD116(GMCSFR),CDw119(IFNγR), CD120(TNFR),CD121a/b(IL1R), CD123(IL3R),CD124(IL4R), CDw125(IL5R), CD126(IL6R),CD127(IL7R), CDw128(IL8R)
	비혈통 :CD9, CD35, CD40, CD45, HLA 클래스 Ⅱ DR,DP, DQ, PAN, CDw150(SLAM)

* 일부의 세포 표면 항원은 하나 이상의 카테고리내에 있다.

	염료(여기/최대 방출)
염료 유형	제 1 색	제 2 색	제 3 색
시아닌 염료¹	Cy5(650/667)	Cy5.5(678/703)	Cy7(743/770)
바디피(bodipy)²	바디피 630/650-X	바디피 650/665-X
피코빌리프로테인	APC(652/660)
탠덤(Tandem) 염료⁴			Cy7-APC(652/780)
안정화된 PEG⁵		라 졸라 블루(650/705)
마이크로스피어²	스카렛(645/680)	암적색(660/680)	Far Red(690/720)Infrared(715/755)Transfluor(633/720)

¹아메르샴,²분자 프로브,³다중 벤더,⁴파민겐 REF,⁵다이아트론

어세이 패널
콤보 #	Cy5	Cy5.5	검출된 잠재집단	코멘트
주된 T 세포 서브셋(CD4에 기초된 2차 단핵세포, CD7에 기초된 NK)
1	CD3/SR054	CD4/SR051	토탈 CD4토탈 CD3CD3+4+(CD4 T)CD3+4-(CD8 T)CD3-4+(모노)	In Pro-5001(5 신규 집단)
2	CD3/SR054	CD8/SR123	토탈 CD3토탈 CD8CD3+8+(CD8 T)CD3+8-(CD4 T)CD3-8+	In Pro-5001(4 신규 집단)
3	CD27/SR162	CD4/SR051	토탈 CD27토탈 CD4CD27+4+(CD4 T)CD27+4-(CD8 T)CD27-4+(모노)	신규 CD27(4 신규 집단)
4	CD27/SR162	CD8/SR123	토탈 CD27토탈 CD8CD27+8+(CD8 T)CD27+8-(CD4 T)CD27-8+	신규 CD27(3 신규 집단)
5	CD7/SR129	CD4/SR051	토탈 CD7토탈 CD4CD7+4+(CD4 T)CD7+4-(NK + 8)CD7-4+(모노)	신규 CD7(4 신규 집단)
6	CD7/SR129	CD8/SR123	토탈 CD7토탈 CD8CD7+8+(CD8 T)CD7+8-(NK + 4)CD7-8+	신규 CD7(3 신규 집단)
7	CD5/SR052	CD7/SR136	토탈 CD7토탈 CD5CD7+5+(T)CD7+5-(NK)CD7-5+	신규 CD7(4 신규 집단)
8	αβTCR/SR089	CD7/SR136	토탈 CD7토탈 αβTCR+(T)CD7+αβTCR-(NK)CD7-+αβTCR	신규 αβTCR(4 신규 집단)

소수의 T 세포 서브셋(포함되는 것은 CD45RA, CD62L, CD69, CD25)
9	CD45RA/SR181	CD4/SR051	CD4+45RA-CD4+45RA+	In Pro-5001(2 신규 집단)
10	CD45RA/SR181	CD8/SR123	CD8+45RA-CD8+45RA+	In Pro-5001(2 신규 집단)
11	CD62L/SR098	CD4/SR041	CD4+62L-CD4+62L+	In Pro-5001(2 신규 집단)
12	CD62L/SR098	CD8/SR123	CD8+62L-CD8+62L+	In Pro-5001(2 신규 집단)
13	CD69/SR099	CD4/SR051	CD4+69-CD4+69+	In Pro-5001(2 신규 집단)
14	CD69/SR099	CD8/SR123	CD8+69-CD8+69+	In Pro-5001(2 신규 집단)
15	CD25/SR095	CD3/SR055	CD3+25-CD3+25-	신규 CD25(2 신규 집단)
B 세포 및 B 세포 집단
콤보 #	Cy5	Cy5.5	이런 착색 조합에 의해 검출된 잠재집단	코멘트
16	CD5/SR052	CD19/SR050	토탈 CD5+토탈 CD19+CD5+19+(CD5+B 세포)	In Pro-5001(2 신규 집단)
17	CD25/SR095	CD19/SR050	CD19+25-CD19+25+	신규 CD25(2 신규 집단)
18	CD69/SR099	CD19/SR050	CD19+69-CD19+69+	In Pro-5001(2 신규 집단)
19	CD80/SR101	CD19/SR050	CD19+80-CD19+80+	신규 CD80(2 신규 집단)
20	CD86/SR143	CD19/SR050	CD19+86-CD19+86+	신규 CD86(2 신규 집단)
21	CD62L/SR098	CD20/SR160	토탈 CD20+CD20+62L-CD20+62L+	교체 CD 19(3 신규 집단)
22	CD45RA/SR181	CD20/SR160	CD20+45RA-CD20+45RA+	교체 CD19(2 신규 집단)
단핵세포 서브셋(또한 B, CD4 T)
	Cy5	Cy5.5	이런 착색 조합에 의해 검출된 잠재집단	코멘트
23	HLAPAN/SR151	CD20/SR160	토탈 PAN Ⅱ+토탈 CD20+PAN Ⅱ+20+(B)PAN Ⅱ+20-(모노)	신규 PANⅡ(3 신규 집단)
24	HLA2DR/SR147	CD20/SR160	토탈 DR+토탈 CD20+DR+20+(B)DR+20-(모노)	신규 DR(3 신규 집단)
25	HLAPAN/SR151	CD4/SR051	토탈 PANⅡ+토탈 CD4+PAN Ⅱ+4+(모노)PAN Ⅱ+4-(B)PAN Ⅱ-4+(T)	신규 PAN Ⅱ(3 신규 집단)

26	HLA 2DR/SR147	CD4/SR051	토탈 DR+토탈 CD4+DR+4+(모노)DR+4-(B)DR-4+(T)	신규 DR(3 신규 집단)
27	CD33/SR094	CD4/SR051	토탈 CD4+토탈 CD33+CD33+4+(모노)CD33-4+(CD4 T)	모노 검출을 위한 신규한 방법(3 신규 집단)
28	CD14/SR179	CD4/SR051	토탈 CD4+토탈 CD14+CD4+14+(모노)	신규 CD14(2 신규 집단)
29	CD14/SR179	CD3/SR055	토탈 CD14+토탈 CD3+	CD3 및 CD14 부분집단의 확인(신규하지 않음)
30	CD80/SR101	CD33/SR106	토탈 CD33+CD33+80-CD33+80+	(2 신규 집단)
31	CD86/SR143	CD33/SR106	토탈 CD33+CD33+86-CD33+86+	(2 신규 집단)
32	CD45RA/SR181	CD33/SR106	토탈 CD33+CD33+45RA-CD33+45RA+	(2 신규 집단)
33	CD62L/SR098	CD33/SR106	토탈 CD33+CD33+62L-CD33+62L+	(2 신규 집단)
과립구 서브셋
콤보 #	Cy5	Cy5.5	이런 착색 조합에 의해 검출된 잠재집단	코멘트
34	CD16/SR065	CD45/SR139	토탈 CD45+(토탈 wbc)토탈 CD16+대, 소 CD45+16+대, 소 CD45+16-	In Pro-5001(6 신규 집단)
35	CD16/SR065	CD11b/SR070	토탈 CD11b+토탈 CD16+대, 소 CD16+11b+대, 소 CD16-11b+	In Pro-5001(4 신규 집단)
36	CD62L/SR098	CD45/SR139	토탈 CD45대, 소 CD45+62L+대, 소 CD45+62L-	신규 그랜 콤보(4 신규 집단)
37	CD11b/SR102	CD45/SR139	토탈 CD45대, 소 CD45+11b+대, 소 CD45+11b-	신규 그랜 콤보(4 신규 집단)
38	CD45RB/SR144	CD4/SR051	토탈 CD4+토탈 CD45RB+CD4+45RB-CD4-45RB+	신규 CD45RB(3 신규 집단)

기타
39	없음	없음	TCC	1 신규 집단-토탈 세포
40	없음	없음	DCC	1 신규 집단-죽은 세포

* 이것은 모니터가능한 세포 집단의 실예이다. 선택적으로 및/또는 추가적인 집단이 모니터될 수 있다.

파이롯 스터디-선형 분별 분석 데이터 세트에서 RA 및 혈액 은행 샘플을 구별하기 위한 최상의 변수 샘플, n=51, 혈액 은행 = 26, RA = 25
잘못된 샘플 배열	단일 마커
단일 마커
7	백혈구 a%로서 TCR-αβT 세포
9	백혈구 a%로서 CD7 세포
	백혈구 a%로서 CD3 세포
10	백혈구 a%로서 CD5 세포
	백혈구 a%로서 CD4 T 세포
11	백혈구 a%로서 CD8 T 세포
12	백혈구 a%로서 CD27 T 세포
13	백혈구 a%로서 CD16 세포
	CD45 세포(모든 백혈구)
	백혈구 a%로서 CD8 T 세포
14	B 세포상에서 CD20 강도
마커 쌍
5	백혈구 a%로서 CD4 T 세포백혈구 a%로서 CD8 T 세포
	B 세포상의 CD20 강도백혈구 a%로서 CD7 세포
6	CD45 세포(모든 백혈구)백혈구 a%로서 CD8 T 세포
	백혈구 a%로서 CD20 T 세포백혈구 a%로서 CD7 T 세포

대부분의 측정은 2 내지 6 어세이의 평균이다.

Pro-5003용 패널에서 시약 조합에 대한 정보
번호	Cy5	Cy5.5	집단	코멘트
001	CD2/SR306	CD4/SR051	3 집단CD2+4+CD2-4+CD2+4-
002	CD2/SR306	CD8/SR212	4 집단CD2+8+밝음CD2+8+둔함CD2+8+토탈CD2+8-
003	CD3/SR054	CD4/SR051	3 집단CD3+4+CD3+4-CD3-4+	Pro-5002
004	CD3/SR054	CD8/SR212	3 집단CD3+8+CD3+8-CD3-8+	Pro-5002
005	CD7/SR208	CD4/SR051	3 집단CD7+4+CD7+4-CD7-4+	Pro-5002
006	CD7/SR208	CD8/SR212	3 집단CD7+8+CD7+8-CD7-8+	Pro-5002
007	αβTCR/SR089	CD7/SR211	5 집단αβ+7+αβ-7+밝음αβ-7+둔함αβ-7+토탈αβ+7-	Pro-5002
008	CD27/SR162	CD4/SR051	3 집단CD27+4+CD27+4-CD27-4+	Pro-5002
009	CD27/SR162	CD8/SR212	7 집단CD27+8+밝음CD27+8+둔함CD27+8+토탈CD27+8-CD27-8+밝음CD27-8+둔함CD27-8+토탈	Pro-5002

010	CD6/SR364	CD4/SR051	3 집단CD6+4-CD6+4+CD6-4+
011	CD6/SR364	CD8/SR212	7 집단CD6+8+밝음CD6+8+둔함CD6+8+토탈CD6+8-CD6-8+밝음CD6-8+둔함CD6-8+토탈
012	CD26/SR363	CD4/SR051	3 집단CD26+4-CD26+4+CD26-4+
013	CD26/SR363	CD8/SR212	5 집단CD26+8-CD26+8+CD26-8+밝음CD26-8+둔함CD26-8+토탈
014	CD57/SR197	CD4/SR051	2 집단CD57+4+CD57-4+
015	CD57/SR197	CD8/SR212	6 집단CD57+8+밝음CD57+8+둔함CD57+8+토탈CD57-8+밝음CD57-8+둔함CD57+8+토탈
016	NKB1/SR375	CD6/SR362	2 집단NKB1+6+NKB1-6+
017	CD45RA/SR346	CD4/SR051	3 집단CD45RA-4+CD45RA+4+CD45RA+4-	Pro-5002
018	CD45RA/SR346	CD8/SR212	3 집단CD45RA-8+CD45RA+8+CD45RA+8-	Pro-5002
019	CD62L/SR227	CD4/SR051	3 집단CD62L+4+밝음CD62L-4+밝음CD62L+4+둔함	Pro-5002

020	CD62L/SR227	CD8/SR212	6 집단CD62L+8+밝음CD62L+8+둔함CD62L+8+토탈CD62L-8+밝음CD62L-8+둔함CD62L-8+토탈	Pro-5002
021	CD69/SR099	CD4/SR051	2 집단CD69+4+CD69-4+	Use lysed(5x)
022	CD69/SR099	CD8/SR212	2 집단CD69+8+CD69-8+	Use lysed(10x)
023	CD25/SR231	CD4/SR051	2 집단CD25+4+CD25-4+	Use lysed(5x)
024	CD25/SR231	CD8/SR212	2 집단CD25+8+CD25-8+	Use lysed(10x)
025	TCR-VB3/SR215	CD8/SR212	3 집단TCRVB3+8+TCRVB3-8+TCRVB3+8-	Use lysed(10x)
026	TCR-VB5/SR216	CD8/SR212	3 집단TCRVB5+8+TCRVB5-8+TCRVB5+8-	Use lysed(10x)
027	TCR-VB8/SR217	CD8/SR212	3 집단TCRVB8+8+TCRVB8-8+TCRVB8+8-	Use lysed(10x)
028	NKB1/SR375	CD4/SR051	3 집단NKB1+4+NKB1+4-NKB1-4+	Use lysed(5x)
029	NKB1/SR375	CD8/SR212	3 집단NKB1+8+NKB1+8-NKB1-8+	Use lysed(10x)
030	CD5/SR297	CD19/SR050	3 집단CD5-19+CD5+19+CD5+19-	Pro-5002
031	CD6/SR364	CD19/SR050	3 집단CD6+19-CD6+19+CD6-19+

032	CD27/SR162	CD19/SR050	3 집단CD27-19+CD27+19+CD27+19-
033	CD2/SR306	CD19/SR050	3 집단CD2+19-CD2-19+CD2+19+	스탠포드 연구
034	CD80/SR228	CD19/SR050	2 집단CD80+19+CD80-CD19+	Use lysed(10x)
035	CD86/SR236	CD19/SR050	2 집단CD86+19+CD86-19+	Use lysed(10x)
036	CD25/SR231	CD19/SR050	2 집단CD25+19+CD25-19+	Use lysed(10x)
037	CD69/SR099	CD19/SR050	2 집단CD69+19+CD69-19+	Use lysed(10x)
038	CD62L/SR227	CD20/SR224	1 집단CD62L+20+	Pro-5002
039	CD45RA/SR346	CD20/SR224	2 집단CD45RA+20+CD45RA+20-	Pro-5002
040	HLAPAN/SR229	CD20/SR224	2 집단HLAPANⅡ+20+HLAPANⅡ+20-	Pro-5002
041	HLA2DR/SR230	CD20/SR224	2 집단HLADR+20+HLADR+20-	Pro-5002
042	HLADP/SR370	CD20/SR224	2 집단HLADP+20+HLADP+20-
043	HLAPAN/SR229	CD4/SR051	3 집단HLAPAN+4+HLAPAN+4-HLAPAN-4+	Pro-5002
044	HLA2DR/SR230	CD4/SR051	3 집단HLADR+4+HLADR+4-HLADR-4+	Pro-5002
045	HLADP/SR370	CD4/SR051	3 집단HLADP+4+HLADP+4-HLADP-4+

046	CD33/SR232	CD14/SR366	4 집단CD33+14+CD33+14+totalCD33dull14+CD33+14-	CD 33상의 우수한교차체크use doped downCD14
047	CD33/SR232	CD4/SR051	3 집단CD33+4+CD33-4+CD33+4-	Pro-5002CD33상의 두번째 체크
048	CD16/SR065	CD14/SR366	5 집단CD16+14+brightCD16+14+dullCD16+14+totalCD16-14+CD16+14-
049	CD64/SR182	CD4/SR051	2 집단CD64+4+CD64-4+
050	CD64/SR182	CD16/SR072	3 집단CD64+16+CD64+16-CD64-16+	스탠포드 연구
051	CD45RA/SR346	CD14/SR366	2 집단CD45RA+14+CD45RA+14-	Doped down CD14
052	CD62L/SR227	CD14/SR366	1 집단CD62L+14+	Doped down CD14
053	CD86/SR236	CD14/SR366	1 집단CD86+14+	Doped down CD14
054	CD45/SR132	CD14/SR366	4 집단CD45+14-totalCD45bright14-CD45dull14-CD45+14+	림프, 과립, 모노의 우수한 분열스탠포드 연구용해 1:4 희석 (0.5x)
055	CD45/SR132	CD16/SR072	3 집단+total CD45+CD45+16+hi_slCD45+16+lo_slCD45+16-	Pro-50021:4 희석 혈액
056	CD15/SR195	CD16/SR072	2 집단CD15+46+CD15-16+	1:4 희석 혈액
057	CD18/SR374	CD15/SR372	2 집단CD18+15+CD18+15-	1:4 희석 혈액

058	CD45/SR132	CD14/SR366	4 집단CD45+14-토탈CD45밝음14-CD45둔함14-CD45+14+	림프, 과립, 모노의 우수한 분열스탠포드 연구1:4 희석 혈액
059	CD11b/SR063	CD15/SR372	2 집단CD11b+15+CD11b+15-	1:4 희석 혈액
060	CD32/SR180	CD15/SR372	2 집단CD32+15+CD32+15-	1:4 희석 혈액

용해성 인자 면역어세이
번호	어세이	번호	어세이

1	IL-1 알파	23	IL-2
2	IL-1 베타	24	IL-3
3	IL-1ra	25	IL-4
4	IL-1sRI	26	IL-5
5	IL-1s	27	MMP-1
6	IL-6	28	MMP-2
7	IL-8	29	MMP13
8	IL-10	30	TIMP-2
9	RF(모든 동형)	31	TIMP-3
10	RF IgM	32	sCD44
11	RF IgG	33	ScD54 ICAM-1
12	RF IgA	34	sCD62L
13	CRP	35	RANTES
14	SAA	36-51	면역글로불린 H 및 L 동형(16 어세이)
15	MMP-3
16	MMP-9
17	TIMP-1
18	TNF 알파
19	INF 감마
20	TGF 베타
21	sCD62E
22	sCD62P

S = 용해성

어세이 번호	염료	항원	SR###	염료	항원	SR###	염료	항원	SR###	포맷
일반
ASY3-149	Cy5	CD45	SR712	Cy5.5	CD14	SR503	Cy7-APC	CD16	SR433	WB 0.25x
ASY3-132	Cy5	CD45	SR712	Cy5.5	CD14	SR503	Cy7-APC	CD16	SR433	용해된 0.25x
T 세포 (모두 또는 4와 8)
ASY3-001	Cy5	CD4	SR349	Cy5.5	CD8	SR212	Cy7-APC	CD3	SR435	WB
ASY3-150	Cy5	CD2	SR306	Cy5.5	CD4	SR506	Cy7-APC	CD8	SR529	WB
ASY3-066	Cy5	TCRαβ	SR660	Cy5.5	TCRγδ	SR663	Cy7-APC	CD3	SR435	WB
ASY3-151	Cy5	TCRαβ	SR660	Cy5.5	CD4	SR506	Cy7-APC	CD8	SR529	WB
CD8 세포
ASY3-055	Cy5	CD62L	SR227	Cy5.5	CD45RA	SR453	Cy7-APC	CD8	SR529	WB
ASY3-008	Cy5	CD57	SR342	Cy5.5	CD6	SR362	Cy7-APC	CD8	SR529	WB
ASY3-152	Cy5	CD27	SR225	Cy5.5	CD45RA	SR453	Cy7-APC	CD8	SR529	WB
ASY3-178	Cy5	CD28	SR675	Cy5.5	CD62L	SR454	Cy7-APC	CD8	SR529	WB
ASY3-179	Cy5	CD28	SR675	Cy5.5	CD45RA	SR453	Cy7-APC	CD8	SR529	WB
ASY3-079	Cy5	CD69	SR235	Cy5.5	CD25	SR616	Cy7-APC	CD8	SR529	용해된 5x
ASY3-080	Cy5	CD71	SR654	Cy5.5	CD57	SR619	Cy7-APC	CD8	SR529	용해된 5x
ASY3-089	Cy5	CD38	SR671	Cy5.5	CD72	SR592	Cy7-APC	CD8	SR529	WB
ASY3-090	Cy5	CD28	SR675	Cy5.5	CD26	SR343	Cy7-APC	CD8	SR529	WB
ASY3-091	Cy5	CCR5	SR502	Cy5.5	CD8	SR212	Cy7-APC	CD3	SR435	WB
ASY3-142	Cy5	CD4	SR349	Cy5.5	CD7	SR211	Cy7-APC	CD8	SR529	WB
ASY3-145	Cy5	CD44	SR558	Cy5.5	CD7	SR211	Cy7-APC	CD8	SR529	WB-0.25x

어세이 번호	염료	항원	SR###	염료	항원	SR###	염료	항원	SR###	포맷
CD4 T 세포
ASY3-056	Cy5	CD62L	SR227	Cy5.5	CD45RA	SR453	Cy7-APC	CD4	SR530	WB
ASY3-004	Cy5	CD4	SR349	Cy5.5	CD27	SR161	Cy7-APC	CD3	SR435	WB
ASY3-153	Cy5	CD26	SR363	Cy5.5	CD4	SR506	Cy7-APC	CD3	SR435	WB
ASY3-154	Cy5	CD57	SR342	Cy5.5	CD4	SR506	Cy7-APC	CD3	SR435	WB
ASY3-155	Cy5	CD62L	SR227	Cy5.5	CD4	SR506	Cy7-APC	CD3	SR435	WB
ASY3-188	Cy5	CD27	SR225	Cy5.5	CD45RA	SR453	Cy7-APC	CD4	SR530	WB
ASY3-180	Cy5	CD28	SR675	Cy5.5	CD45RA	SR453	Cy7-APC	CD4	SR530	WB
ASY3-063	Cy5	CD7	SR208	Cy5.5	CD6	SR362	Cy7-APC	CD4	SR530	WB
ASY3-156	Cy5	CD44	SR558	Cy5.5	CD4	SR506	Cy7-APC	CD3	SR435	WB-0.25x
ASY3-157	Cy5	CD89	SR447	Cy5.5	CD4	SR506	Cy7-APC	CD3	SR435	WB-0.25x
CD4 T 및 모노
ASY3-137	Cy5	CD69	SR235	Cy5.5	CD14	SR503	Cy7-APC	CD4	SR530	용해된-2x
ASY3-138	Cy5	CD25	SR231	Cy5.5	CD14	SR503	Cy7-APC	CD4	SR530	용해된-2x
ASY3-158	Cy5	CCR5	SR502	Cy5.5	CD4	SR506	Cy7-APC	CD14	SR719	WB
ASY3-159	Cy5	CD38	SR671	Cy5.5	CD14	SR503	Cy7-APC	CD4	SR530	WB
ASY3-160	Cy5	CD86	SR236	Cy5.5	CD14	SR503	Cy7-APC	CD4	SR530	WB
ASY3-139	Cy5	CD71	SR654	Cy5.5	CD14	SR503	Cy7-APC	CD4	SR530	용해된-2x

어세이 번호	염료	항원	SR###	염료	항원	SR###	염료	항원	SR###	포맷
B 세포
ASY3-143	Cy5	CD5	SR297	Cy5.5	CD19	SR050	Cy7-APC	CD20	SR718	WB
ASY3-161	Cy5	CD72	SR100	Cy5.5	CD19	SR050	Cy7-APC	CD20	SR718	WB
ASY3-162	Cy5	CD80	SR228	Cy5.5	CD86	SR706	Cy7-APC	CD20	SR718	WB
ASY3-163	Cy5	CD69	SR235	Cy5.5	CD71	SR655	Cy7-APC	CD20	SR729	용해된-5x
B 세포 및 모노
ASY3-164	Cy5	HLADP	SR370	Cy5.5	CD14	SR503	Cy7-APC	CD20	SR718	WB
ASY3-165	Cy5	HLADQ	SR500	Cy5.5	CD14	SR503	Cy7-APC	CD20	SR718	WB
ASY3-166	Cy5	HLADR	SR230	Cy5.5	CD14	SR503	Cy7-APC	CD20	SR718	WB
ASY3-167	Cy5	HLAPAN	SR229	Cy5.5	CD14	SR503	Cy7-APC	CD20	SR718	WB
ASY3-168	Cy5	CD14	SR179	Cy5.5	CD45RA	SR453	Cy7-APC	CD20	SR729	WB
ASY3-169	Cy5	CD40	SR634	Cy5.5	CD14	SR503	Cy7-APC	CD20	SR718	WB
ASY3-170	Cy5	CD62L	SR227	Cy5.5	CD14	SR503	Cy7-APC	CD20	SR729	WB
단핵세포
ASY3-171	Cy5	CD33	SR232	Cy5.5	CD14	SR503	Cy7-APC	CD4	SR530	WB
ASY3-172	Cy5	CD4	SR349	Cy5.5	CD11b	SR371	Cy7-APC	CD14	SR719	WB-0.25x
ASY3-045	Cy5	CD16b	SR359	Cy5.5	CD66b	SR536	Cy7-APC	CD16	SR433	WB-0.25x
ASY3-173	Cy5	CD64	SR365	Cy5.5	CD14	SR503	Cy7-APC	CD16	SR433	WB-0.25x
ASY3-049	Cy5	CD32	SR379	Cy5.5	CD15	SR372	Cy7-APC	CD16	SR433	WB-0.25x
ASY3-047	Cy5	CD18	SR374	Cy5.5	CD11b	SR371	Cy7-APC	CD16	SR433	WB-0.25x
ASY3-174	Cy5	CD44	SR558	Cy5.5	CD15	SR372	Cy7-APC	CD14	SR719	WB-0.25x
ASY3-175	Cy5	CD89	SR658	Cy5.5	CD15	SR372	Cy7-APC	CD14	SR719	WB-0.25x

어세이 번호	염료	항원	SR###	염료	항원	SR###	염료	항원	SR###	포맷

ASY3-128	Cy5	CD9	SR310	Cy5.5	CD15	SR372	Cy7-APC	CD16	SR433	용해된 0.25x
ASY3-148	Cy5	CD123	SR289	Cy5.5	CD32	SR704	Cy7-APC	CD16	SR433	WB 0.25x
ASY3-147	Cy5	CD123	SR289	Cy5.5	CD15	SR372	Cy7-APC	CD16	SR433	WB 0.25x
NK
ASY3-038	Cy5	NKB1	SR375	Cy5.5	CD5	SR298	Cy7-APC	CD7	SR490	WB
ASY3-071	Cy5	CD57	SR342	Cy5.5	CD5	SR298	Cy7-APC	CD7	SR490	WB
ASY3-085	Cy5	CD56	SR676	Cy5.5	CD2	SR352	Cy7-APC	CD3	SR435	WB
ASY3-086	Cy5	CD56	SR676	Cy5.5	CD5	SR298	Cy7-APC	CD7	SR490	WB
대조군
ASY3-050	Cy5	MOPC	SR344	Cy5.5	MOPC	SR350	Cy7-APC	MOPC	SR624	WB
ASY3-176	Cy5	CD5	SR297	Cy5.5	CD14	SR503	Cy7-APC	CD20	SR729	WB
ASY3-177	Cy5	CD5	SR297	Cy5.5	CD14	SR503	Cy7-APC	CD20	SR729	용해된-1x
ASY3-082	Cy5	CD4	SR349	Cy5.5	CD8	SR212	Cy7-APC	CD3	SR435	용해된-1x

혈액 샘플/투여량 스케줄
날	날	날	날	날	날	날
금요일	월요일	화요일	수요일	목요일	금요일	목요일
-3	0	1	2	3	4	10
스크리닝
-	아스피린	아스피린	아스피린	아스피린	-	-
혈액	혈액		혈액	혈액	혈액	혈액

혈액은 매일 오전 8시 및 9시 사이에서 뽑는다.

		Ch0	Ch1	Ch2
	어세이#	염료	항원	SR###	염료	항원	SR###	염료	항원	SR###	포맷
1	ASY3-102	Cy5	CD36	SR679	Cy5.5	CD9	SR678	Cy7 APC	CD61	SR641	WB
2	ASY3-103	Cy5	CD42a	SR684	Cy5.5	CD41a	SR683	Cy7APC	CD61	SR641	WB
3	ASY3-104	Cy5	CD42a	SR684	Cy5.5	CD62p	SR590	Cy7APC	CD61	SR641	WB
4	ASY3-105	Cy5	CD42b	SR685	Cy5.5	CD41a	SR683	Cy7APC	CD61	SR641	WB
5	ASY3-106	Cy5	CD42b	SR685	Cy5.5	CD62p	SR590	Cy7APC	CD61	SR641	WB
6	ASY3-107	Cy5	CD62p	SR686	Cy5.5	CD61	SR681	Cy7APC	CD41a	SR640	WB
7	ASY3-108	Cy5	CD63	SR687	Cy5.5	CD61	SR681	Cy7APC	CD41a	SR640	WB
8	ASY3-109	Cy5	PAC-1	SR673	Cy5.5	CD9	SR678	Cy7APC	CD61	SR641	WB
9	ASY3-110	Cy5	CD29	SR150	Cy5.5	CD9	SR678	Cy7APC	CD41a	SR640	WB
10	ASY3-111	Cy5	CD62p	SR686	Cy5.5	CD61	SR681	Cy7APC	CD41a	SR640	TRT
11	ASY3-112	Cy5	CD63	SR687	Cy5.5	CD61	SR681	Cy7APC	CD41a	SR640	TRT
12	ASY3-113	Cy5	PAC-1	SR673	Cy5.5	CD9	SR678	Cy7APC	CD61	SR641	TRT
13	ASY3-114	Cy5	CD42b	SR685	Cy5.5	CD62p	SR590	Cy7APC	CD61	SR641	TRT
14	ASY3-115	Cy5	CD62p	SR686	Cy5.5	CD61	SR681	Cy7APC	CD41a	SR640	NTRT
15	ASY3-116	Cy5	CD63	SR687	Cy5.5	CD61	SR681	Cy7APC	CD41a	SR640	NTRT
16	ASY3-117	Cy5	PAC-1	SR673	Cy5.5	CD9	SR678	Cy7APC	CD61	SR641	NTRT
17	ASY3-118	Cy5	CD42b	SR685	Cy5.5	CD62p	SR590	Cy7APC	CD61	SR641	NTRT
18	ASY3-066	Cy5	TCRab	SR660	Cy5.5	TCRgd	SR663	Cy7APC	CD3	SR435	WB

19	ASY3-151	Cy5	TCRab	SR660	Cy5.5	CD4	SR506	Cy7 APC	CD8	SR529	WB
20	ASY3-055	Cy5	CD62L	SR227	Cy5.5	CD45RA	SR453	Cy7APC	CD8	SR529	WB
21	ASY3-178	Cy5	CD28	SR675	Cy5.5	CD62L	SR454	Cy7APC	CD8	SR529	WB
22	ASY3-091	Cy5	CCR5	SR502	Cy5.5	CD8	SR212	Cy7APC	CD3	SR435	WB
23	ASY3-142	Cy5	CD4	SR349	Cy5.5	CD72	SR211	Cy7APC	CD8	SR529	WB
24	ASY3-056	Cy5	CD62L	SR227	Cy5.5	CD45RA	SR453	Cy7APC	CD4	SR530	WB
25	ASY3-180	Cy5	CD28	SR675	Cy5.5	CD45RA	SR453	Cy7APC	CD4	SR530	WB
26	ASY3-158	Cy5	CCR5	SR502	Cy5.5	CD4	SR506	Cy7APC	CD14	SR719	WB
27	ASY3-160	Cy5	CD86	SR236	Cy5.5	CD14	SR503	Cy7APC	CD4	SR530	WB
28	ASY3-186	Cy5	CD5	SR297	Cy5.5	CD19	SR050	Cy7APC	CD20	SR729	WB
29	ASY3-181	Cy5	CD80	SR228	Cy5.5	CD86	SR706	Cy7APC	CD20	SR729	WB
30	ASY3-182	Cy5	HLADP	SR370	Cy5.5	CD14	SR503	Cy7APC	CD20	SR729	WB
31	ASY3-183	Cy5	HLADQ	SR500	Cy5.5	CD14	SR503	Cy7APC	CD20	SR729	WB
32	ASY3-184	Cy5	HLADR	SR230	Cy5.5	CD14	SR503	Cy7APC	CD20	SR729	WB
33	ASY3-185	Cy5	CD40	SR634	Cy5.5	CD14	SR503	Cy7APC	CD20	SR729	WB
34	ASY3-171	Cy5	CD33	SR232	Cy5.5	CD14	SR503	Cy7APC	CD4	SR530	WB
35	ASY3-038	Cy5	NKB1	SR375	Cy5.5	CD5	SR298	Cy7APC	CD7	SR490	WB
36	ASY3-085	Cy5	CD56	SR676	Cy5.5	CD2	SR352	Cy7APC	CD3	SR435	WB
37	ASY3-050	Cy5	MOPC	SR344	Cy5.5	MOPC	SR350	Cy7APC	MOPC	SR624	WB
38	ASY3-156	Cy5	CD44	SR558	Cy5.5	CD4	SR506	Cy7APC	CD3	SR435	WB-0.25x
39	ASY3-045	Cy5	CD16b	SR369	Cy5.5	CD66b	SR536	Cy7APC	CD16	SR433	WB-0.25x
40	ASY3-173	Cy5	CD64	SR365	Cy5.5	CD14	SR503	Cy7APC	CD16	SR433	WB-0.25x
41	ASY3-148	Cy5	CD123	SR289	Cy5.5	CD32	SR704	Cy7-APC	CD16	SR433	WB0.25x
42	ASY3-147	Cy5	CD123	SR289	Cy5.5	CD15	SR372	Cy7-APC	CD16	SR433	WB0.25x

Claims

a) 하기 ⅰ) 내지 ⅱ)를 포함하는 다수의 데이터 카테고리를 포함하는 통합된 데이터베이스,

ⅰ) 유기체의 생물학적 유체중에서의 다수의 세포 집단 및/또는 세포 관련 분자의 레벨, 및/또는 유기체의 생물학적 유체중에서의 다수의 용해성 인자의 레벨, 및

ⅱ) 유기체의 다수의 임상 변수와 관련된 정보;

b) 상기 데이터 카테고리와 대응하는 다수 유기체로부터 얻은 데이터; 및

ⅰ) 상기 데이터 카테고리내의 데이터를 연관시키기 위한 가공 수단을 포함하고, 여기서 데이터 카테고리의 연관 분석은 정상 생물학적 과정, 발병 과정 또는 치료적 개입에 대한 약리학적 반응을 나타내는 데이터 카테고리 또는 카테고리들을 동정하도록 만들어질 수 있고, 여기서 상기 동정된 카테고리 또는 카테고리들은 생물학적 마커인 생물학적 마커 동정 시스템.
제 1항에 있어서, 상기 세포 집단 및/또는 세포 관련 분자의 레벨에 대한 상기 데이터는 마이크로볼륨 레이져 스캐닝 세포계측법에 의해 얻어지는 것인 생물학적 마커 동정 시스템.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 적어도 20 세포 집단 및/또는 세포 관련 분자레벨 데이터 카테고리를 포함하는 것인 생물학적 마커 동정 시스템.
제 3항에 있어서, 적어도 30 세포 집단 및/또는 세포 관련 분자 레벨 데이터 카테고리를 포함하는 것인 생물학적 마커 동정 시스템.
제 3항에 있어서, 적어도 40 세포 집단 및/또는 세포 관련 분자 레벨 데이터 카테고리를 포함하는 것인 생물학적 마커 동정 시스템.
제 1항 내지 제 3항중 어느 하나의 항에 있어서, 용해성 인자는 용해성 단백질인 생물학적 마커 동정 시스템.
제 1항에 있어서, 용해성 인자는 소분자인 생물학적 마커 동정 시스템.
제 1항에 있어서, 용해성 인자의 레벨에 대한 상기 테이터는 마이크로볼륨 레이져 스캐닝 세포계측법에 의해 얻어지는 것인 생물학적 마커 동정 시스템.
제 1항에 있어서, 용해성 인자의 레벨에 대한 상기 데이터는 면역어세이에 의해 얻어지는 것인 생물학적 마커 동정 시스템.
제 1항에 있어서, 적어도 20 용해성 인자 레벨 데이터 카테고리를 포함하는것인 생물학적 마커 동정 시스템.
제 10항에 있어서, 적어도 30 용해성 인자 레벨 데이터 카테고리를 포함하는 것인 생물학적 마커 동정 시스템.
제 10항에 있어서, 적어도 40 용해성 인자 레벨 데이터 카테고리를 포함하는 것인 생물학적 마커 동정 시스템.
제 1항에 있어서, 상기 유기체의 적어도 일부로부터의 데이터는 여러번을 포함시킨 것인 생물학적 마커 동정 시스템.
제 1항에 있어서, 상기 데이터 카테고리는,

ⅲ) 유기체와 관련된 유전자형 정보를 더 포함하는 것인 생물학적 마커 동정 시스템.
제 1항에 있어서, 용해성 인자의 레벨에 대한 상기 데이터는 질량 분광 분석법으로 얻어지는 것인 생물학적 마커 동정 시스템.
제 1항에 있어서, 상기 임상 변수와 관련된 정보는 나이, 성, 체중, 키, 체형, 병력, 가족력, 환경 인자 및 질병 또는 의학적 증상의 증상발현 및 카테고리화로 이루어진 군에서 선택되는 것인 생물학적 마커 동정 시스템.
제 1항에 있어서, 상기 데이터는 치료를 위한 투여 전 및 후에 유기체로부터 얻는 것인 생물학적 마커 동정 시스템.
제 1항에 있어서, 상기 테이터의 적어도 일부는 예정된 질병 또는 의학적 증상을 갖는 것으로 미리 진단된 유기체로부터 얻는 것인 생물학적 마커 동정 시스템.
제 1항에 있어서, 상기 데이터의 적어도 일부는 예정된 질병 또는 의학적 증상을 갖는 것으로 미리 진단되는 유기체로부터 여러번 얻어지는 것인 생물학적 마커 동정 시스템.
제 18항 또는 제 19항에 있어서, 상기 예정된 질병 또는 의학적 증상은 류마티스성 관절염인 생물학적 마커 동정 시스템.
제 18항 또는 제 19항에 있어서, 상기 예정된 질병 또는 의학적 증상은 류마티스성 관절염, 천식, 알러지 및 다발성 경화증으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 생물학적 마커 동정 시스템.
제 1항에 있어서, 상기 데이터 카테고리는 유기체의 생물학적 유체중에서 다수의 세포 집단 및/또는 세포 관련 분자의 레벨 및 유기체의 생물학적 유체중에서 다수의 용해성 인자의 레벨을 포함하는 것인 생물학적 마커 동정 시스템.
다수의 유기체로부터 얻은 정보를 연관시키는 단계, 여기서 상기 유기체의 적어도 일부는 질병 또는 의학적 증상을 갖고, 여기서 정보는 다수의 데이터 카테고리와 관련되고, 및 여기서 상기 데이터 카테고리는 하기의 것을 포함하며,

ⅰ) 유기체의 생물학적 유체중에 다수의 세포 집단 및/또는 세포 관련 분자의 레벨 및/또는 유기체의 생물학적 유체중에서의 다수의 용해성 인자의 레벨, 및

ⅱ) 유기체의 다수의 임상 변수와 관련된 정보;

상기 질병 또는 의학적 증상을 갖는 유기체가 상기 질병 또는 의학적 증상을 갖지 않는 이들 유기체와 구별될 수 있도록 데이터 카테고리를 동정하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 동정된 카테고리는 상기 질병에 대한 생물학적 마커인 상기 질병 또는 의학적 증상에 대한 생물학적 마커의 동정 방법.
제 23항에 있어서, 세포 집단 및/또는 세포 관련 분자의 레벨에 대한 상기 데이터는 마이크로볼륨 레이져 스캐닝 세포계측법에 의해 얻는 것인 생물학적 마커의 동정 방법.
제 23항에 있어서, 적어도 20 세포 집단 및/또는 세포 관련 분자 레벨 데이터 카테고리를 포함하는 생물학적 마커의 동정 방법.
제 25항에 있어서, 적어도 30 세포 집단 및/또는 세포 관련 분자 레벨 데이터 카테고리를 포함하는 생물학적 마커의 동정 방법.
제 25항에 있어서, 적어도 40 세포 집단 및/또는 세포 관련 분자 레벨 데이터 카테고리를 포함하는 생물학적 마커의 동정 방법.
제 23항에 있어서, 용해성 인자의 레벨에 대한 상기 데이터는 마이크로볼륨 레이져 스캐닝 세포계측법에 의해 얻어지는 것인 생물학적 마커의 동정 방법.
제 23항에 있어서, 적어도 20 용해성 인자 레벨 데이터 카테고리를 포함하는 생물학적 마커의 동정 방법.
제 29항에 있어서, 적어도 30 용해성 인자 레벨 데이터 카테고리를 포함하는 생물학적 마커의 동정 방법.
제 29항에 있어서, 적어도 40 용해성 인자 레벨 데이터 카테고리를 포함하는 생물학적 마커의 동정 방법.
제 23항에 잇어서, 상기 데이터 카테고리는,

ⅲ) 임의의 유기체와 관련된 유전자형 정보를 더 포함하는 것인 생물학적 마커의 동정 방법.
제 23항에 있어서, 상기 용해성 인자의 레벨에 대한 데이터는 질량 분광 분석법에 의해 얻어지는 것인 생물학적 마커의 동정 방법.
제 23항에 있어서, 상기 용해성 인자의 레벨에 대한 데이터는 면역어세이에 의해 얻어지는 것인 생물학적 마커의 동정 방법.
제 23항에 있어서, 상기 임상 변수와 관련된 정보는 나이, 성, 체중, 키, 체형, 병력, 가족력, 환경적 인자 및 질병 또는 의학적 증상의 증상발현 및 카테고리화로 이루어진 군에서 선택되는 것인 생물학적 마커의 동정 방법.
제 23항에 있어서, 상기 질병은 류마티스성 관절염인 생물학적 마커의 동정 방법.
제 23항에 있어서, 상기 질병은 류마티스성 관절염, 천식, 알러지 및 다발성 경화증으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 생물학적 마커의 동정 방법.
ⅰ) 세포 집단 및/또는 세포 관련 분자에 관한 적어도 20 어세이의 결과;

ⅱ) 용해성 인자에 관한 적어도 20 어세이의 결과; 및

ⅲ) 임상 변수를 포함하는 다수의 생물학적 변수를 포함하는 유기체의 표현형.
제 38항에 있어서, 세포 집단 및/또는 세포 관련 분자에 관한 적어도 40 어세이의 결과를 포함하는 표현형.
제 38항에 있어서, 용해성 인자에 관한 적어도 40 어세이의 결과를 포함하는 표현형.
제 38항에 있어서, 상기 유기체의 유전자형 정보를 더 포함하는 것인 표현형.
강 또는 아강의 다수의 구성원으로부터 다수의 생물학적 변수를 포함하고; 여기서 상기 각각의 구성원으로부터 얻는 상기 생물학적 변수는 하기의 것을 포함하는 것인 유기체의 강 또는 아강의 표현형.

ⅰ) 세포 집단 및/또는 세포 관련 분자에 관한 적어도 20 어세이의 결과;

ⅱ) 용해성 인자에 관한 적어도 20 어세이의 결과;

ⅲ) 임상 변수.
제 42항에 있어서, 세포 집단 및/또는 세포 관련 분자에 관한 적어도 40 어세이의 결과를 포함하는 표현형.
제 42항에 있어서, 용해성 분자에 관한 적어도 40 어세이의 결과를 포함하는 표현형.
제 42항에 있어서, 상기 각각의 구성원의 유전자형 정보를 더 포함하는 것인 표현형.
ⅰ) 하기와 같은 것을 포함하는 상기 유기체로부터 생물학적 변수를 얻는 단계:

a) 세포 집단 및/또는 세포 관련 분자에 관한 적어도 20 어세이의 결과;

b) 용해성 인자에 관한 적어도 20 어세이의 결과; 및

c) 임상 변수; 및

ⅱ) 상기 생물학적 변수를 통합된 데이터베이스로 인가하는 단계를 포함하는 유기체의 표현형을 생성하는 시스템.
제 46항에 있어서, 세포 집단 및/또는 세포 관련 분자에 관한 적어도 40 어세이의 결과를 포함하는 것인 시스템.
제 46항에 있어서, 용해성 인자에 관한 적어도 40 어세이의 결과를 포함하는 것인 시스템.
제 46항에 있어서, 상기 생물학적 변수는 유전자형 정보를 더 포함하는 것인 시스템.
ⅰ) 섭동 전후에 유기체의 표현형을 얻는 단계; 및

ⅱ) 변화된 변수를 동정하기 위해 상기 전후에 표현형에 대한 정보를 비교하는 단계;를 포함하고, 여기서 상기 표현형은,

a) 세포 집단 및/또는 세포 관련 분자에 관한 적어도 20 어세이의 결과;

b) 용해성 인자에 관한 적어도 20 어세이의 결과;

c) 임상 변수로 이루어지는 것인 유기체상에 섭동 효과의 평가 방법.
제 50항에 있어서, 상기 표현형은 세포 집단 및/또는 세포 관련 분자에 관한 적어도 40 어세이를 포함하는 것인 평가 방법.
제 50항에 있어서, 상기 표현형은 용해성 인자에 관한 적어도 40 어세이를포함하는 것인 평가 방법.
제 50항에 있어서, 상기 표현형은 상기 유기체에 대한 유전자형 정보를 더 포함하는 것인 평가 방법.
ⅰ) 섭동 전후에 유기체의 강 또는 아강의 다수의 구성원의 표현형을 얻는 단계; 및

ⅱ) 변화된 변수를 동정하기 위해 상기 전후에 표현형에 대한 정보를 비교하는 단계;를 포함하고, 여기서 상기 표현형은,

a) 세포 집단 및/또는 세포 관련 분자에 관한 적어도 20 어세이의 결과;

b) 용해성 인자에 관한 적어도 20 어세이의 결과;

c) 임상 변수로 이루어지는 것인 유기체의 강 또는 아강상에 섭동 효과의 평가 방법.
ⅰ) 섭동에 영향을 받지 않는 다수의 유기체의 표현형 및 섭동에 영향을 받는 하나 이상의 유기체의 표현형을 얻는 단계; 및

ⅱ) 섭동에 영향을 받지 않는 다수의 유기체에서의 정보를 섭동에 의해 영향을 받는 하나 이상의 유기체의 표현형과 비교하는 단계;를 포함하고, 여기서 상기 표현형은,

a) 세포 집단 및/또는 세포 관련 분자에 관한 적어도 20 어세이의 결과;

b) 용해성 인자에 관한 적어도 20 어세이의 결과;

c) 임상 변수로 이루지는 것인 유기체 또는 유기체의 강 또는 아강에서의 섭동 효과의 평가 방법.
a) 하기 ⅰ) 내지 ⅱ)를 포함하는 다수의 데이터 카테고리를 포함하는 통합된 데이터베이스,

ⅰ) 동물의 생물학적 유체중에서 다수의 세포 집단 및/또는 세포 관련 분자의 레벨, 및 /또는 동물의 생물학적 유체중에서의 다수의 용해성 인자의 레벨, 및

ⅱ) 동물의 다수의 물리적 변수와 관련된 정보;

b) 상기 데이터 카테고리와 대응하는 다수 동물로부터 얻은 데이터; 및

ⅰ) 상기 데이터 카테고리내의 데이터를 연관시키기 위한 가공 수단을 포함하고, 여기서 데이터 카테고리의 연관 분석은 정상 생물학적 과정, 발병 과정 또는 치료적 개입에 대한 약리학적 반응을 나타내는 데이터 카테고리 또는 카테고리들을 동정하도록 만들어질 수 있고, 여기서 상기 동정된 카테고리 또는 카테고리들은 생물학적 마커인 질병 또는 의학적 증상을 갖는 동물 모델에서 질병 또는 의학적 증상의 생물학적 마커 동정 시스템.
제 56항에 있어서, 상기 세포 집단 및/또는 세포 관련 분자의 레벨에 대한상기 데이터는 마이크로볼륨 레이져 스캐닝 세포계측법에 의해 얻어지는 것인 생물학적 마커 동정 시스템.
제 56항 또는 제 57항에 있어서, 적어도 20 세포 집단 및/또는 세포 관련 분자 레벨 데이터 카테고리를 포함하는 것인 생물학적 마커 동정 시스템.
제 58항에 있어서, 적어도 40 세포 집단 및/또는 세포 관련 분자 레벨 데이터 카테고리를 포함하는 것인 생물학적 마커 동정 시스템.
제 56항에 있어서, 적어도 20 용해성 인자 레벨 데이터 카테고리를 포함하는 것인 생물학적 마커 동정 시스템.
제 56항에 있어서, 적어도 40 용해성 인자 레벨 데이터 카테고리를 포함하는 것인 생물학적 마커 동정 시스템.
제 56항에 있어서, 상기 데이터 카테고리는 동물과 관련된 유전자형 정보를 더 포함하는 것인 생물학적 마커 동정 시스템.
질병 또는 의학적 증상의 동물 모델을 제공하는 단계;

다수의 개개의 동물로부터 얻은 정보를 연관시키는 단계, 상기 개개의 동물중 적어도 일부는 질병 또는 의학적 증상을 가지며, 여기서 정보는 다수의 데이터 카테고리와 관련되고 및 상기 데이터 카테고리는 하기의 것을 포함하고,

ⅰ) 개개의 생물학적 유체중에서 다수의 세포 집단 및/또는 세포 관련 분자의 레벨; 및

ⅱ) 개개의 동물의 다수의 물리적 변수와 관련된 정보;

상기 질병 또는 의학적 증상을 갖는 개개의 동물이 상기 질병 또는 의학적 증상을 갖지 않는 개개의 동물과 구별될 수 있도록 데이터 카테고리를 동정하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 동정된 카테고리는 상기 동물 모델의 질병에 대한 생물학적 마커인 질병 또는 의학적 증상을 갖는 동물 모델에서 제공된 질병 또는 의학적 증상에 대한 생물학적 마커를 동정하는 방법.
질병 또는 의학적 증상의 동물 모델을 제공하는 단계;

제 63항에 따른 질병 또는 의학적 증상의 동물 모델에서 질병 또는 의학적 증상에 대한 생물학적 마커를 동정하는 단계; 및

상기 생물학적 마커가 사람에서의 질병 또는 의학적 증상을 진단 또는 예측하는지 결정하는 단계를 포함하는 사람에서의 제공된 질병 또는 의학적 증상에 대한 생물학적 마커의 동정 방법.
질병 또는 의학적 증상의 동물 모델을 제공하는 단계;

제 63항에 따른 방법에 의해 상기 동물 모델에서 질병 또는 의학적 증상의적어도 하나의 생물학적 마커를 동정하는 단계;

후보 치료제로 동물 모델을 치료하는 단계; 및

상기 동물 모델에서 생물학적 마커의 반응을 모니터링하는 단계를 포함하는 사람 질병 또는 의학적 증상에 대해 직접적인 후보 치료제를 어세이하는 방법.
의학적 질병 또는 증상을 갖는 동물 모델에서 동정된 생물학적 마커와 동등한 사람에서의 생물학적 마커를 평가하는 단계를 포함하는 의학적 질병 또는 증상을 갖는 사람에서의 임상 연구 결과를 모니터링하는 방법.
질병 또는 의학적 증상에 관련한 사람 생물학적 마커를 동정하는 단계;

사람 생물학적 마커의 동물 상동물의 레벨을 증가시키거나 또는 감소시키는 것으로 질병 또는 의학적 증상을 보다 정확하게 시뮬레이션하기 위해 동물 모델을 조정하는 단계를 포함하는 사람 질병 또는 의학적 증상에 대한 개선된 동물 모델을 고안하는 방법.
ⅰ) 질병 또는 의학적 증상을 갖는 다수의 잠재적인 동물 모델의 표현형을 얻는 단계;

ⅱ) 상기 질병 또는 의학적 증상을 갖는 유기체의 표현형을 얻는 단계;

ⅲ) 잠재적인 동물 모델 표현형을 상기 질병 또는 의학적 증상을 갖는 유기체의 표현형과 비교하여 상기 질병 또는 의학적 증상을 갖는 유기체의 표현형을 가장 밀접하게 시뮬레이션하는 동물 모델 표현형을 동정하는 단계;를 포함하고, 여기서 상기 표현형은,

a) 세포 집단 및/또는 세포 관련 분자에 관한 적어도 20 어세이의 결과;

b) 용해성 인자에 관한 적어도 20 어세이의 결과; 및

c) 임상 변수로 이루어지는 질병 또는 의학적 증상의 동물 모델을 동정하는 방법.
제 38항에 있어서, 상기 유기체는 사람, 동물, 식물 및 바이러스로 이루어진 군에서 선택되는 것인 표현형.
제 42항에 있어서, 상기 유기체의 강 또는 아강은 사람, 동물, 식물 및 바이러스로 이루어진 군에서 선택되는 것인 표현형.
ⅰ) 유전적으로 변형된 식물 또는 동물의 표현형 및 비유전적으로 변형된 식물 또는 동물의 표현형을 얻는 단계;

ⅱ) 유전적으로 변형된 및 비유전적으로 변형된 표현형의 정보를 비교하여 변화된 변수를 동정하는 단계;를 포함하고, 여기서 상기 표현형은,

a) 세포 집단 및/또는 세포 관련 분자에 관한 적어도 20 어세이의 결과;

b) 용해성 인자에 관한 적어도 20 어세이의 결과; 및

c) 임상 변수로 이루어지는 식물 또는 동물에서 유전적 변형의 효과를 평가하는 방법.