KR20020001846A - 폐순환승압을 치료하기 위한 맥관형성 인자를 암호화 하는핵산을 포함하는 재조합 결손 아데노바이러스의 용도 - Google Patents
폐순환승압을 치료하기 위한 맥관형성 인자를 암호화 하는핵산을 포함하는 재조합 결손 아데노바이러스의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 폐순환승압을 예방, 개선 및/또는 치료하는 맥관형성 인자를 암호화 하는 핵산을 포함하는 벡터의 용도에 관한 것이다.
Description
폐순환승압은 심각한 경우 치명적이고 현재 이식 이외의 다른 치료법이 없는 흔한 이상질환이다.
이러한 질환은 우심실 분출을 방해하고 심장 혈액 박출량을 손상시키는 폐 동맥 저항의 증가를 특징으로 한다. 폐순환승압의 발생시 동맥중앙 및 동맥내막 비대와 함께 평활근 세포의 과형성, 세포외 매트릭스의 형성, 및 말초 혈관 밀도의 감소를 동반하는 혈관 희박화를 포함한 폐혈관벽의 다수의 기능 및 구조 이상이 수반된다.
본 발명은 폐순환승압을 예방, 호전 및/또는 치료하기 위해 맥관형성 인자를 암호화 하는 핵산을 포함하는 벡터의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 벡터를 국소적으로 효율적으로 투여할 수 있는 특정 약학 조성물에 관한 것이다.
도 1: Crouzet et al.(PNAS Vol. 94 p1414, 1997)에 의해 설명된 방법에 따라, 플라스미드 pXL3208 및 pXL3215로부터의 이중 재조합에 의해 생성된, 플라스미드 pXL3264 수득. 플라스미드 pXL3264는 E1 및 E3 영역이 결실된 타입 5 아데노바이러스의 게놈을 포함하고, CMV-spFGF1-SV40 발현 카세트를 포함한다.
도 2: 벡터 pXL3179의 도해. 플라스미드 pXL3179는 플라스미드 pXL2774로부터 유도된 벡터이고(WO97/10343), 여기에 인간 섬유아세포 인터페론의 시그널 펩티드와 FGF1(섬유아세포 생장 인자 1)에 대한 cDNA 간의 융합을 암호화 하는 유전자(sp-FGF1, Jouanneauet al., 1991 PNAS88: 2893-2897)가 인간 사이토메갈로바이러스 초기 영역(hCMV IE) 및 SV40 바이러스 후기 영역의 폴리아데닐화 시그널(Genbank SV4CG)로부터 유도된 프로모터의 통제하에 도입된다.
도 3: 벡터 pXL3636 및 pXL3637의 도해. 이들 벡터는 플라스미드 pXL3208에 상응하는 구조를 가지고 sp-FGF-1(pXL3208, 도 1) 대신 각각 VEGF-B167(pXL3636) 및 VEGF-B186(pXL3637)을 암호화 하는 서열을 포함한다.
재료 및 방법
일반적인 분자생물학 기술
플라스미드 DNA의 예비 추출, 세슘 클로라이드 구배에서의 플라스미드 DNA의 원심분리, 아가로스 또는 아크릴아미드 겔상에서의 전기영동, 전기용출에 의한 DNA 단편의 정제, 페놀 또는 페놀-클로로포름을 이용한 단백질의 추출, 에탄올 또는 이소프로판올을 이용한 식염수 매질중 DNA의 침강, 대장균으로의 형질전환 등과 같은 분자생물학에서 통상 이용되는 방법은 당업자에게 익히 알려져 있고 문헌[Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., 1982; Ausubel F. M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987]에 상세히 설명되어 있다.
연결을 위해, DNA 단편을 크기에 따라 아가로스 또는 아크릴아미드 겔에서의 전기영동에 의해 분리하고, 페놀 또는 페놀/클로로포름 혼합물을 이용하여 추출하며, 에탄올을 이용하여 침강시킨 다음, 공급자의 추천에 따라 파아지 T4 DNA 리가제(Biolabs)의 존재하에 배양할 수 있다.
돌출 5' 말단은 공급자의 지시에 따라 대장균 DNA 폴리머라제 Ⅰ의 Klenow 단편(Biolabs)을 사용하여 메워질 수 있다. 돌출 3' 말단은 제조업자의 권장에 따라 사용되는 파아지 T4 DNA 폴리머라제(Biolabs)의 존재하에 파괴된다. 돌출 5' 말단은 S1 뉴클레아제로의 신중한 처리에 의해 파괴된다.
합성 올리고데옥시뉴클레오티드를 사용하는 시험관내 특정부위의 돌연변이유발은 Taylor et al.[Nucleic Acids Res.13(1985) 8749-8764]에 의해 개발된 방법에 따라 Amersham에 의해 공급되는 키트를 사용하여 수행될 수 있다.
DNA 단편은 제조업자의 사양서에 따라 DNA 열 사이클러(Perkin Elmer Cetus)를 사용하는 PCR 기술[polymerase-catalyzedchainreaction, Saiki R. K. et al., Science230(1985) 1350-1354: Mullis K. B. and Faloona F. A., Meth. Enzym.155(1987) 335-350]에 의해 효소적으로 증폭될 수 있다.
뉴클레오티드 서열은 Amersham에 의해 공급되는 키트를 사용하여 Sanger et al.[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467]에 의해 개발된 방법으로 확인될 수 있다.
본 발명은 우선 폐순환승압을 치료하는 효과적인 방법을 제공한다. 본 방법은 맥관형성 인자를 암호화 하는 핵산을 포함하는 벡터를 이용하는 데 기초한다.
폐순환승압의 발생시 각종 맥관형성 인자, 예를 들어 섬유아세포 생장 인자(FGF)와 혈관 내피 생장 인자(VEGF)의 수반에 관한 연구를 수행하면서, 이들 인자들의 역할을 명확히 이해할 수 없었다.
내피 세포를 위해 선택된 첫번째 생장 인자, 즉 VEGF는 1989년에 확인되었다. 그 이후 수행된 연구들은 정상 및 병원성 맥관형성 과정에서 VEGF의 중요성을 입증해 보였다. 이러한 인자는 맥관형성의 두가지 전형적인 생체내 모델인 토끼 각막과 병아리 융모요막에서 강력한 맥관형성 효과를 가진다. VEGF는 또한 혈관 투과성 인자로도 알려져 있다. VEGF는 크기가 34-36 kDa인 간-결합, 호모다이머 글리코프로테인으로서, 이의 구조는 시그널 펩티드를 포함하고 있어, 이를 분비할 수 있다. VEGF 암호 유전자는 8개의 엑손으로 구성된다. 4개의 펩티드 형태는 택일식 슬라이싱에 의해 생성된다. 인간의 경우, 이는 각각 121, 165, 189 및 206개 아미노산을 포함한다.
성인의 경우, VEGF는 다수의 정상 조직, 특히 심장과 폐에서 발현된다. 이러한 발현이 반드시 중요한 맥관형성과 결부된 것은 아니다. 여러 형태의 VEGF가 티로신 키나제 활성을 보유하고 fms 부류에 속하는 두가지 수용체를 인식한다: Flt-1 수용체와 Flk-1 수용체. Flt-1 수용체, 즉 (VEGFR)-1은 높은 친화성 수용체(10 pM)이다. KDR 또는 flk-1 또는 (VEGFR)-2 수용체는 펩티드의 유사분열 작용을 담당하는 것으로 여겨지는 낮은 친화성 수용체(750 pM)이다. VEGF 발현 조절의 가장 유력한 측면 중 하나는 저산소 상태에 대한 민감도이다. 비교적 단기간의 저산소증은배양액중의 세포, 특히 심근세포와 평활근 세포에 의한 VEGF의 시험관내 발현을 자극하는 것으로 나타났다. 그러나, 폐순환승압의 발생 또는 예방에 있어 이러한 인자의 역할이 무엇인지는 알려져 있지 않다.
혈관 내피 생장 인자의 부류는 또한 본 발명에 사용될 수 있는 기타 분자, 예를 들어 PIGF(태반 생장 인자), VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D 및 VEGF-E를 포함한다. 혈관 내피 생장 인자 부류 중에서, VEGF와 VEGF-B가 본 발명에 특히 바람직한 형태이다.
VEGF-B는 다수의 성인 조직, 특히 심장, 골격근 및 췌장에서 생성된다. 두가지 형태의 펩티드가 택일식 슬라이싱에 의해 생성되고 각각 167 및 186개 아미노산을 포함한다. VEGF-B가 내피 세포의 증식을 자극하지만, VEGFR-2 수용체에 결합하지는 않는다.
섬유아세포 생장 인자(FGF) 부류는 다수의 전형을 포함하고, 적어도 14개 멤버가 현재 확인되었다(Birnbaum et al. Medecine et Science 13, p 392-396, 1997 참조). FGF-1과 FGF-2 형태가 폐 내피 세포 및 폐에서 혈관 세포내에서 발현되지만, 폐순환승압과 관련된 이들 인자의 발현 또는 폐에서 내피 세포와 평활근 세포의 증식을 유도하는 이들 인자의 능력, 또는 여러 환경 조건, 특히 저산소 조건과 관련된 기관 또는 액포 내피 세포내에서 이들 인자의 발현에 대해 아무런 정보도 입수되지 않았다.
뜻밖에도, 본 출원인은 폐안으로 맥관형성 인자를 암호화 하는 핵산의 전달이 이전과는 결코 대등하지 않는 효율로 폐동맥 압력을 감소시키고 폐순환승압과관련된 우심실 비대를 예방할 수 있음을 입증해 보였다.
저산소성 폐순환승압을 예방하고 치료하는 맥관형성 인자의 효과를 연구하기 위해, 본 출원인은 모델로서 만성 저산소증 상태인 래트를 이용했다. 기관내 주입에 의해 투여되는 아데노바이러스 타입의 재조합 벡터를 이용하여 맥관형성 인자를 암호화 하는 핵산을 전달시켰다. 얻어진 결과는 폐내에서 맥관형성 인자, 예를 들어 특히 VEGF-B 또는 FGF-1를 발현시켜 폐동맥 압력을 감소시키고 우심실 비대와 폐혈관계의 리모델링을 예방함을 보여준다. 본 발명은 무엇보다도 폐순환승압을 효과적으로 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 문맥상 사용될 수 있는 각종 맥관형성 인자 중에서, 특히 섬유아세포 생장 인자(FGF) 부류, 좀더 구체적으로 말하면 FGF-1, FGF-2, FGF-4 및 FGF-5, 혈관 내피 생장 인자, 좀더 구체적으로 말하면 VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-D 및 PIGF(태반 생장 인자), 및 안기오포이에틴 타입의 인자(안기오포이에틴 1과 안기오포이에틴 2)가 언급될 수 있다.
본 발명은 첫째 폐순환승압을 예방, 호전 및/또는 치료하는 약학 조성물을 제조하기 위해 맥관형성 인자를 암호화 하는 핵산을 포함하는 벡터의 용도에 관한 것이다.
바람직하게는, 맥관형성 인자는 FGF 또는 VEGF 또는 안기오포이에틴 부류중에서 선택된 내피 세포 생장 인자, 또는 이들 부류 중 적어도 하나 중에서 선택된 적어도 두가지 인자의 조합물이다. 특별히 언급될 수 있는 맥관형성 인자의 유리한 조합물의 예로는 적어도 FGF-1과 VEGF를 조합한 조합물, 적어도 FGF-1과 VEGF-B를조합한 조합물, 적어도 FGF-1과 안기오포이에틴 1을 조합한 조합물, 적어도 VEGF와 안기오포이에틴 1을 조합한 조합물 및 적어도 VEGF-B와 안기오포이에틴 1을 조합한 조합물이 있다.
일 특정 양태에 따르면, 내피 세포 생장 인자는 FGF-1, FGF-2, FGF-4 또는 FGF-5 또는 이들의 변이체 중에서 선택된다.
또다른 양태에 따르면, 내피 세포 생장 인자는 VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D 또는 VEGF-E, 또는 이들의 변이체 중에서 선택된다. 바람직하게는, 내피 세포 생장 인자는 VEGF 또는 VEGF-B 중에서 선택된다.
본 발명의 의미상, 폴리펩티드 또는 단백질의 "변이체"는 폴리펩티드 또는 단백질에서 유도되고 폴리펩티드 또는 단백질의 적어도 하나의 생물학적 기능을 보유한 임의의 동족체, 단편, 유도체 또는 돌연변이된 형태인 것으로 이해한다. 폴리펩티드 또는 단백질의 각종 변이체가 자연 상태에 존재할 수 있다. 이들 변이체는 단백질을 암호화 하는 구조 유전자의 뉴클레오티드 서열의 차이를 특징으로 하는 대립유전자 변이이거나, 차별적 슬라이싱 또는 해독후 변화에 기인할 수 있다. 이들 변이체는 1 이상의 아미노산 잔기를 치환, 결실, 첨가 및/또는 변화시켜 얻어질 수 있다. 당업자를에게 공지된 기술을 이용하여 이러한 변화를 행할 수 있다.
이들 변이체는 특히 결합 부위에 대한 보다 높은 친화성을 가진 분자, 생체내 개선된 발현을 허락하는 서열, 프로테아제에 대한 보다 강한 내성을 나타내는 분자, 또는 보다 우수한 치료 효능 또는 보다 약한 부작용 또는 가능하다면 새로운 생물학적 성질을 보유한 분자이다.
좀더 특별히 언급될 수 있는 FGF-1의 바람직한 변이체는 미국 특허 4,868,113에 기재되고 154개 아미노산, 140개 아미노산 또는 134개 아미노산을 포함하는 형태의 FGF-1의 자연 변이체이다. 언급될 수 있는 바람직한 VEGF 변이체는 VEGF121, VEGF165, VEGF189및 VEGF206형태이다. 언급될 수 있는 바람직한 VEGF-B 변이체는 VEGF186과 VEGF167형태이다. 형태 FGF-1(21-154)와 VEGF165, 및 형태 VEGF186과 VEGF167이 가장 특히 바람직한 변이체로서 언급될 수 있다.
본 발명에 사용될 수 있는 기타 변이체는 특히 1 이상의 잔기가 치환된 분자, 해당 결합 부위와 상호작용에 수반되지 않거나 상당한 정도로 수반되지 않거나 원치않는 활성을 발현시키는 영역을 결실시켜 얻어진 유도체, 및 본래 서열과 비교하여 부가적인 잔기, 예를 들어 분비 시그널 및/또는 연결 펩티드를 함유한 유도체이다.
FGF-1의 경우, 맥관형성 인자를 암호화 하는 뉴클레오티드 서열은 유리하게도 합성된 FGF-1이 세포외 구획으로 좀더 효과적으로 방출되어 이의 수용체를 활성화시킬 수 있도록 감염된 세포의 분비 경로안으로 합성된 FGF-1을 인도하는 분비 시그널을 함유한다. 이용된 분비 시그널은 이종 분비 시그널 또는 심지어 인공 분비 시그널일 수 있다. 언급될 수 있는 예는 FGF-1의 상당한 분비를 유도하는 인간 β인터페론의 분비 시그널이다.
본 발명의 문맥에 이용된 맥관형성 인자-암호 DNA 서열은 cDNA, 게놈 DNA(gDNA) 또는 예를 들어 1 이상의 인트론이 삽입된 cDNA로 구성된 하이브리드 작제물일 수 있다. DNA 서열은 또한 합성 또는 반합성 서열일 수 있다. cDNA 또는 gDNA가 특히 유리하게 이용된다. 특히, gDNA를 이용하여 인간 세포에서 개선된 발현을 일으킬 수 있다.
유리하게는, 맥관형성 인자를 암호화 하는 서열은 폐 내피 세포에서 발현되도록 할 수 있는 시그널의 통제하에 놓인다. 시그널은 바람직하게는 이종 발현 시그널, 즉 본래 맥관형성 인자의 발현을 담당하는 시그널과는 다른 시그널이다. 시그널은 특히 기타 단백질을 발현시키는 서열 또는 합성 서열일 수 있다. 특히, 이러한 서열은 진핵생물 또는 바이러스 유전자의 프로모터 서열일 수 있다. 예를 들어, 프로모터 서열은 감염에 바람직한 세포의 게놈에서 유도된 프로모터 서열일 수 있다. 마찬가지로, 프로모터 서열은 이용된 아데노바이러스를 포함한 바이러스의 게놈에서 유도된 프로모터 서열일 수 있다. 이러한 측면에서 예를 들어 E1A, MLP, CMV, LTR-RSV 등 프로모터가 언급될 수 있다. 또한, 이러한 발현 서열은 활성 서열, 조절 서열 또는 조직-특이성 발현을 허용하는 서열의 첨가에 의해 변화될 수 있다. 이에 따라, 이는 특히 또는 주로 폐 내피 세포에서 활성인 발현 시그널을 이용하는데 있어 특히 가치가 있는데, 이로인해 DNA 서열은 벡터가 실제로 이들 세포를 감염시킬 경우에만 발현되어 이러한 효과를 만들어낼 수 있는데; 이러한 측면에서 사이토케라틴 18 유전자의 프로모터가 언급될 수 있다.
1 이상의 맥관형성 인자를 암호화 하는 핵산이 벡터에 도입된다. 본 발명의 의미상, "벡터"는 핵산을 숙주 세포, 바람직하게는 폐, 좀더 구체적으로 말하면 폐 내피 세포안으로 전달할 수 있는 임의 수단인 것으로 이해한다. 용어 벡터는 핵산을 생체내 또는 생체외 세포안으로 전달하는 바이러스 및 비바이러스 벡터를 포함한다. 예를 들어, 본 발명을 수행하는 벡터 종류는 플라스미드, 코스미드 또는 바이러스, 파아지, 인공 염색체, 재조합 바이러스 등에 의해 캡시드화되지 않은 임의 DNA일 수 있다. 벡터는 바람직하게는 플라스미드 또는 재조합 바이러스이다.
플라스미드 타입의 벡터 중에서, 당업자에게 공지되어 있고 일반적으로 복제 기원을 함유한 모든 클로닝 및/또는 발현 플라스미드가 언급될 수 있다. 예를 들어 출원 WO96/26270과 WO97/10343에 기재된 복제 및/또는 선택 마커의 개선된 기원을 운반하는 플라스미드도 언급될 수 있다.
재조합 바이러스 타입의 벡터 중에서, 바람직하게는 재조합 아데노-수반 바이러스, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 허프스바이러스 및 렌티바이러스 또는 SV40 바이러스가 언급될 수 있다. 벡터의 감염성을 가지고 있으면서 복제 결손인 재조합 바이러스 타입의 작제가 문헌[참조: S. Baeck and K.L.March(1998), Circul. Research Vol. 82, pp 295-305; T. Shenk, B.N.Fields, D.M.Knipe, P.M. Howley et al. (1996), Adenoviridae: the viruses and their replication(in virology). pp 211-2148, EDS-Ravenspublishers/Philadelphia, P. Yeh and M. Perricaudet (1997), FASEB Vol. 11, pp 615-623]에 널리 기재되어 있다.
본 발명에 특히 바람직한 재조합 바이러스는 결손 재조합 아데노바이러스이다.
아데노바이러스는 대략 36 kb(킬로베이스)의 크기를 가진 선형, 이중 가닥 DNA 바이러스이다. 아데노바이러스는 구조와 성질이 다소 차이가 있는 여러 혈청타입이 존재하지만, 필적하는 유전적 구조를 나타낸다. 좀더 구체적으로 말하면, 재조합 아데노바이러스는 인간 또는 동물 기원일 수 있다. 인간 기원의 아데노바이러스를 고려할 경우, 바람직하게는 그룹 C로 분류된 아데노바이러스, 특히 2(Ad2), 5(Ad5), 7(Ad7) 또는 12(Ad12) 타입의 아데노바이러스가 언급될 수 있다. 동물 기원의 여러 아데노바이러스 중에서, 바람직하게는 개 기원의 아데노바이러스, 특히 CAV2 아데노바이러스의 모든 균주[예: Manhattan strain 또는 A26/61(ATCC VR-800)]가 언급될 수 있다. 본원에서 참고된 출원 WO94/26914의 동물 기원의 기타 아데노바이러스가 특별히 언급된다.
아데노바이러스 게놈은 특히 각 말단에 역반복 서열(ITR), 캡시드화 서열(Psi), 초기 유전자 및 후기 유전자를 포함한다. 주된 초기 유전자는 E1, E2, E3 및 E4 영역에 함유된다. 이들 중에서, E1 영역에 함유된 유전자가 특히 바이러스 증폭에 필요하다. 주된 후기 유전자는 L1에서 L5 영역에 함유된다. 아데노바이러스 Ad5의 게놈이 완전히 서열분석되었고 데이터베이스로 입수가능하다(특히 Genbank M73260 참조). 마찬가지로, 전부는 아니더라도 나머지 아데노바이러스 게놈(Ad2, Ad7, Ad12 등)의 일부도 서열 분석되었다.
여러 치료 유전자를 함유한 각종 아데노바이러스-유도된 작제물이 재조합 벡터로서 이용하기 위해 제조되었다. 이들 작제물 각각에서, 아데노바이러스는 감염된 세포에서 복제할 수 없도록 변화되었다. 이에 따라, 선행 기술에 기재된 작제물은 바이러스 복제에 필수적인 E1 영역이 결실된 아데노바이러스이며, 이종 DNA 서열이 E1 영역 대신에 삽입된다(Levrero et al., Gene 101(1991) 195; Gosh-Choudhury et al., Gene 50(1986) 161). 또한, 아데노바이러스 게놈에서 기타 결실 또는 변화가 벡터의 성질을 개선시키기 위해 제안되고 있다. 이에 따라, 온도-민감성 점 돌연변이가 돌연변이체 ts125에 도입되었고, 이러한 점 돌연변이는 72 kDa DNA-결합 단백질(DBP)를 불활성화시킨다(Van der Vliet et al., J. Virol., 1975, 15(2) 348-354). 복제 및/또는 바이러스 증폭에 필수적인 E4 영역은 기타 벡터에서 빠져있다. 이에 따라, E4 영역은 후기 유전자의 발현 조절, 후기 핵 RNA의 안정화, 숙주 세포의 단백질의 발현 소멸 및 바이러스 DNA의 복제 효율과 관련된다. E1과 E4 영역이 결여된 아데노바이러스 벡터는 바이러스 유전자의 전사와 발현의 매우 감소된 백그라운드 노이즈를 나타낸다. 이러한 벡터는 예를 들어 출원 WO94/28152, WO95/02697 및 WO96/22378에 기재되어 있다. 또한, IVa2 유전자내에서 변형을 운반하는 벡터도 기재되어 있다(WO96/10088).
본 발명의 바람직한 양태에서, 재조합 아데노바이러스는 인간 그룹 C 아데노바이러스이다. 좀더 바람직하게는, 아데노바이러스는 Ad2 또는 Ad5 아데노바이러스이다.
유리하게는, 본 발명의 문맥에 사용되는 재조합 아데노바이러스는 게놈의 E1 영역에 결실을 함유한다. 좀더 구체적으로 말하면, 이는 E1a와 E1b 영역의 결실을 함유한다. 예를 들어 (Ad5 게놈의 경우) 뉴클레오티드 454-3328, 386-3446 또는 357-4020에 영향을 미치는 결실이 언급될 수 있다.
또다른 변이체에 따르면, 본 발명의 문맥에 사용되는 재조합 아데노바이러스는 부가적으로 게놈의 E4 영역에 결실을 함유한다. 좀더 구체적으로 말하면, E4 영역에서 결실은 모든 개방 판독 프레임에 영향을 미친다. 특정 예로서 33466-35535 또는 33093-35535 결실이 언급될 수 있다. E4 영역에서 나머지 종류의 결실은 본원에서 참고된 출원 WO95/02697 및 WO96/22378에 기재되어 있다.
맥관형성 인자를 암호화 하는 핵산을 함유한 발현 카세트는 재조합 게놈의 다양한 위치에 삽입될 수 있다. 이는 결손된 서열을 대체하거나 기존 서열에 첨가시 E1, E3 또는 E4 영역내에 삽입될 수 있다. 발현 카세트는 또한 바이러스 생성을 위해 cis에서 필요한 서열과는 별도의 기타 부위에 삽입될 수 있다(ITR 서열과 캡시드화 서열).
본 발명의 의미상, 핵산을 "발현시키는 카세트"는 특정 제한 부위의 벡터에 삽입될 수 있는 DNA 단편으로 해석되며; 해당 RNA 또는 폴리펩티드를 암호화 하는 뉴클레오티드 서열 이외에, DNA 단편은 해당 서열을 발현시키는데 필요한 서열(인핸서(들), 프로모터(들), 폴리아데닐화 서열 등)을 포함한다. DNA 단편 및 제한 부위는 상기 단편이 전사 및/또는 해독에 적절한 판독 프레임안으로 삽입되도록 디자인된다.
재조합 아데노바이러스는 캡시드화 세포주, 즉 재조합 아데노바이러스 게놈에서 결여된 1 이상의 기능을 trans 상보할 수 있는 세포주에서 생성된다. 당업자에게 공지된 캡시드화 세포주의 예로는 세포주 293이 언급될 수 있고, 여기에 아데노바이러스 게놈의 일부가 통합된다. 좀더 구체적으로 말해서, 세포주 293은 좌측 ITR, 캡시드화 영역, (E1a와 E1b를 포함한) E1 영역, pIX 단백질을 암호화 하는 영역 및 pIVa2 단백질을 암호화 하는 영역의 일부를 포함한 아데노바이러스 혈청타입5(Ad5) 게놈의 좌측 말단(대략 11-12%)을 함유하고 있는 인간 신장 배 세포주이다. 이러한 세포주는 E1 영역이 결여된, 즉 E1 영역의 전부 또는 일부가 결여된 재조합 아데노바이러스를 트랜스상보하고, 높은 역가의 바이러스 스톡을 생성할 수 있다. 이러한 세포주는 또한 허용된 온도(32℃)에서 부가적으로 온도-민감성 E2 돌연변이를 함유한 바이러스 스톡을 생성할 수 있다. E1 영역을 상보할 수 있고 특히 인간 폐 육종 A549 세포(WO94/28152) 또는 인간 망막아세포(Hum. Gen. Ther. (1996) 215)에 기초한 기타 세포주가 공지되어 있다. 또한, 아데노바이러스의 다수 기능을 트랜스상보할 수 있는 세포주도 공지되어 있다. E1과 E4 영역을 상보하는 세포주(Yeh et al., J. Virol. Vol. 70(1996) pp 559-565; Cancer Gen. Ther. 2(1995) 322; Krougliak et al., Hum. Gen. Ther. 6(1995)1579) 및 E1과 E2 영역을 상보하는 세포주(WO94/28152, WO95/02697 및 W95/27071)가 특히 언급될 수 있다.
재조합 아데노바이러스는 일반적으로 캡시드화 세포주안으로 바이러스 DNA를 도입시켜 생성되고, 세포는 대략 2 또는 3일 후에 용해된다(아데노바이러스 사이클의 동역학이 24 내지 36시간이기 때문). 본 방법을 수행하기 위해, 도입되는 바이러스 DNA는 박테리아(WO96/25506) 또는 효모(WO95/03400)에서 작제될 수 있고 세포안으로 형질감염되는 완전 재조합 바이러스 게놈일 수 있다. 바이러스 DNA는 또한 캡시드화 세포주를 감염시키는데 이용된 재조합 바이러스의 DNA일 수 있다. 바이러스 DNA는 또한 단편 형태(각각은 재조합 바이러스 게놈의 일부와 캡시드화 세포안으로 도입에 이어 여러 단편 사이의 상동 재조합에 의해 재조합 바이러스 게놈을 재구성할 수 있는 상동성 영역을 운반함)로 도입될 수 있다.
세포가 용해된 후, 재조합 바이러스 입자를 세슘 클로라이드 구배에서 원심분리에 의해 분리한다. 다른 방법은 본원에서 참조된 출원 WO98/00528에 기재되어 있다.
본 발명을 수행하는데 적합하고 특별히 언급될 수 있는 벡터의 예는 본 발명에 기재된 인간 FGF-1 또는 인간 VEGF-B를 암호화 하는 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스, 또는 문헌[참조: Mulhauser J et al. (복제-결손 재조합 아데노바이러스 벡터에 의해 발현된 VEGF 165가 생체내에서 맥관형성을 유도함) Circ Res. 195; 77:1077-1086]에 기재된 인간 VEGF의 165 이소폼을 암호화 하는 유전자를 포함한 재조합 아데노바이러스이다.
본 발명은 또한 앞서 기재된 벡터, 및 생리학적으로 허용가능한 부형제를 포함한 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 약학 조성물은 경구, 비경구, 비내, 동맥내, 정맥내 등 경로에 의해 투여되도록 제형될 수 있다.
바람직하게는, 약학 조성물은 기관 경로, 특히 주입에 의하거나, 정맥내 경로에 의해 투여되도록 의도된 제형에 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함한다. 부형제는 특히 멸균, 등장성 식염(모노나트륨 또는 디나트륨 포스페이트, 나트륨, 칼륨, 칼슘 또는 마그네슘 클로라이드 등 또는 이러한 염의 혼합물)액, 또는 건조, 특히 경우에 따라 멸균수 또는 생리 식염의 첨가에 의해 용액을 기관내 주입되도록 작제할 수 있는 동결건조된 조성물일 수 있다.
주입 또는 주사에 이용되는 투여량은 각종 파라미터, 특히 이용된 투여 방식, 발현되는 유전자 또는 발현도중 요구에 따라 조절될 수 있다. 일반적으로, 본발명에 따른 재조합 바이러스는 104내지 1014pfu, 바람직하게는 106내지 1010pfu를 함유한 투여량 형태로 제형되어 투여된다. 용어 pfu(플라크 형성 단위)는 바이러스 용액의 감염 정도에 상응하고 적절한 세포 배양액을 감염시켜 감염된 세포의 플라크 수를 측정하여 결정된다. 바이러스 용액의 pfu 역가를 측정하는 기술도 문헌에 기재되어 있다.
부가적으로, 본 발명에 따른 조성물은 또한 화학 또는 생화학 전달제를 포함할 수 있다. 용어 "화학 또는 생화학 전달제"는 핵산을 세포중으로 침투를 촉진하는 임의 화합물(즉, 재조합 바이러스 제외)로 해석한다. 제제는 또한 양이온성 비-바이러스제, 예를 들어 양이온 지질, 펩티드, 중합체(폴리에틸렌 이민, 폴리라이신) 또는 나노입자; 또는 비-양이온성 비-바이러스제, 예를 들어 비-양이온성 리포솜, 중합체 또는 비-양이온 나노입자일 수 있다.
바람직한 양태에 따르면, 본 발명에 따른 조성물은 내피 세포 생장 인자를 암호화 하는 유전자를 포함한 결손 재조합 벡터를 포함하고, 기관내 투여를 위해 제형된다. 유리하게는, 본 발명의 조성물은 104내지 1014pfu, 바람직하게는 106내지 1010pfu를 포함한다.
본 발명은 또한 폐순환승압을 예방, 호전 및/또는 치료하는데 이용될 수 있는 약제를 제조하는 방법에 관한 것으로, 이는 생장 인자를 암호화 하는 핵산을 포함한 재조합 벡터를 1 이상의 상용성 및 약학적으로 허용가능한 보조제와 혼합함을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 폐순환승압을 앓고 있는 포유동물, 특히 인간을 치료하는 방법에 관한 것으로, 방법은 내피 세포 생장 인자를 암호화 하는 핵산을 포함하는 유효량의 재조합 벡터를 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 설명을 목적으로 하기의 비제한적인 실시예에 의해 좀더 구체적으로 기재될 것이다.
실시예 1: FGF-1 단백질을 발현하는 재조합 아데노바이러스의 작제
본 실시예는 CMV 프로모터에 작동가능하게 연결된 FGF-1 단백질을 암호화 하는 유전자를 운반하는 아데노바이러스 벡터의 작제를 설명하고 있다.
인간 FGF-1을 암호화 하는 인간 cDNA는 490 개의 염기쌍을 포함하고 또한 베타-내피세포 생장 인자를 의미하는, ECGFβ로 불리는 154 개의 아미노산 폴리펩티드를 암호화 한다. 해독 후 성숙 메카니즘에 의해 ECGFβ형태로부터 유도되는 두가지 천연 폴리펩티드가 존재하는데; 이들은 산성 FGF(aa 15 내지 154) 및 ECGFα(알파-내피세포 생장 인자; aa 21 내지 154) 또는 FGF-1이다.
하기에 설명된 아데노바이러스에 존재하는 FGF-1 형태(sp-FGF-1)는 실제로 FGF-1(aa 21-154)과 Jouanneau et al.(PNAS (1991) 88: 2893-2897)에 의해 설명된인간 베타 인터페론 시그널 펩티드의 융합에 의해 형성된 단백질이다.
sp-FGF-1은 사이토메갈로바이러스 인핸서/프로모터(CMV, 뉴클레오티드 -522 내지 +72)의 통제하에 발현된다(Boshart et al. 1985, Cell, 41:521-530). SV40 바이러스 폴리아데닐화 부위(SV40 게놈을 따라 뉴클레오티드 2538 내지 2759, Genbank locus SV4CG)가 후기 센스로, sp-FGF-1 cDNA의 3'에 삽입된다. (ⅰ) 사이토메갈로바이러스 인핸서/프로모터, (ⅱ) sp-FGF-1 cDNA 및 (ⅲ) SV40 바이러스 폴리아데닐화 부위에 의해 형성된 전체 단위는 하기에서 FGF-1 발현 카세트라고 언급된다.
아데노바이러스는 Crouzet et al.(PNAS Vol. 94 p1414, 1997)에 의해 설명된 방법에 따라, 플라스미드 pXL3208과 플라스미드 pXL3215 간의 상동 재조합에 의해 작제된다. 플라스미드 pXL3215는 이의 E1 영역에 삽입된 RSV-LacZ 카세트를 포함하는 아데노바이러스의 게놈을 포함한다. 작제 원리는 도 1에 나타나 있다. 이러한 이중 재조합에 의해 생성된, 플라스미드 pXL3264는 E1 및 E3 영역이 결실된 타입 5아데노바이러스의 게놈을 포함하고 CMV-spFGF-1-SV40 발현 카세트를 포함한다. 이 작제물은 FGF-1 발현 카세트의 서열분석에 의해 확인된다.
아데노바이러스 AV1.0 CMV-FGF1은 PacⅠ-절단된 pXL3264 DNA의 세포주 293(ATCC CRL-1573)으로의 형질감염에 의해 생성된다. 수득되는 바이러스 입자는 이어서 동일한 세포주에서 증폭되고 바이러스의 스톡이 이중 CsCl 구배에 의해 생성된다.
바이러스 입자는 C2C12 세포, 마우스 근모세포(ATCC CRL-1772) 또는 W162 세포(Weinberg D. H. and Ketner G. A. 1983, PNAS 80:5383-5386)에서 인간 spFGF1 유전자의 발현을 연구하기 위해 사용된다.
노던 블랏은 100 내지 3000 개의 바이러스 입자(vp)/세포를 증가식 MOI로 감염시키거나 대조구로서 리포펙타민(Gibco-BRL)의 존재하에 동일한 FGF-1 발현 카세트를 포함하는 플라스미드 pXL3179로 세포를 형질감염시킨 후에 W162 세포 상에서 수행된다. 플라스미드 pXL3179는 도 2에 나타나 있다.
웨스턴 블랏은 30 내지 3000의 MOI로 감염시키고 48시간 후에 상등액을 수거한 후에 C2C12 세포 상에서 수행된다. FGF1을 정제된 토끼 폴리클로날 항-FGF1 항체, 이어서 퍼옥시다제에 접합된 염소 항-토끼 항체를 사용하여 확인한다. 퍼옥시다제 활성을 화학발광(ECL, Amersham)에 의해 확인하고 Lumi-Imager(Roche diagnostics)상에서 검출한다.
C2C12 세포로부터의 배양 상등액은 FGF의 발현 형태가 생물학적으로 활성임을 확인하는 데 사용된다. 이어서 이 상등액의 연속 희석액(1/200 내지 1/50)을 NIH 3T3 세포의 배양액에 첨가했다. 이 배양액에 대한 트로픽 효과는 방사성 동위원소 표지된 티미딘을 도입하여 모니터링했다.
총괄해 볼때, 얻어진 결과는 아데노바이러스 AV1.0 CMV-FGF1이 FGF-1의 생물학적으로 활성인 형태를 발현함을 확인해준다.
실시예 2: VEGF-B 단백질을 발현하는 재조합 아데노바이러스의 작제
본 실시예는 CMV 프로모터에 작동가능하게 연결된 VEGF-B 단백질을 암호화 하는 유전자를 운반하는 아데노바이러스 벡터의 작제를 설명하고 있다.
인간 VEGF-B의 두 가지 형태: 즉 VEGF-B167및 VEGF-B186(이의 상응하는 뉴클레오티드 서열은 참조번호 HSU48801(VEGF-B167) 및 HSU43368(VEGF-B186)으로 Genbank에서 입수가능)이 존재한다.
아데노바이러스 AV1.0-CMV-VEGF-B167및 AV1.0-CMV-VEGF-B186이 벡터 pXL3636 및 pXL3637로부터, 벡터 AV1.0-CMV-spFGF-1과 유사한 방식으로 작제되었다(도 3). VEGF-B167또는 VEGF-B186의 발현은 사이토메갈로바이러스 인핸서/프로모터(CMV, 뉴클레오티드 -522 내지 +72)의 통제하에 놓인다(Boshart et al. 1985, Cell, 41: 521-530). SV40 바이러스 폴리아데닐화 부위(SV40 게놈에 따라 뉴클레오티드 2538 내지 2759, Genbank locus SV4CG)가 후기 센스로, VEGF-B167또는 VEGF-B186cDNA의 3'에 삽입된다.
아데노바이러스는 Crouzet al.(PNAS Vol. 94 p1414, 1997)에 의해 설명된 방법에 따라 플라스미드 pXL3636(VEGF-B167)과 플라스미드 pXL3215간 또는 플라스미드 pXL3637(VEGF-B186)와 플라스미드 pXL3215 간의 상동 재조합에 의해 작제되었다. 플라스미드 pXL3215는 E1 영역에 삽입된 RSV-LacZ 카세트를 포함하는 아데노바이러스의 게놈을 포함한다. 작제 원리는 도 1에 나타나 있다.
이러한 이중 재조합에 의해 생성된 플라스미드는 E1 및 E3 영역이 결실된 타입 5 아데노바이러스의 게놈을 포함하고 CMV-VEGF-B167-SV40 발현 카세트 또는 CMV-VEGF-B186-SV40 발현 카세트를 포함한다.
AV1.0-CMV-VEGF-B167및 AV1.0-CMV-VEGF-B186아데노바이러스는 이중 재조합에 의해 생성된, PacⅠ-절단된 플라스미드를 293 세포주(ATCC CRL-1573)로 형질감염시킴으로써 생성된다. 수득되는 바이러스 입자는 이어서 동일한 세포주에서 증폭되고, 바이러스 스톡은 이중 CsCl 구배를 사용하여 생성된다.
실시예 3: 래트에서 AV1.0-CMV-FGF1의 폐내 전달
본 실시예는 전술한 벡터 AV1.0 CMV-FGF1을 사용하여, 래트에서 인간 FGF-1을 암호화 하는 유전자의 전달을 설명하고 있다. 동일하지만 FGF-1 발현 카세트(AV1.0 CMV.Null)를 포함하지 않는 재조합 아데노바이러스가 대조구 동물에서 사용되었다.
생후 1 개월된 수컷 Wistar 래트(200-250 g)를 무작위로 두 그룹으로 분리한다. 케타민(100 mg/kg)과 자일라신(2 mg/kg) 혼합물의 복강내 주사로 마취시킨 후에, 108pfu(PBS로 희석되어 150 ㎕의 최종 용적을 제공)의 투여량을 기관내 주입함으로써 벡터 AV1.0 CMV-FGF1 또는 대조구 벡터 AV1.0 CMV.Null을 투여한다. 이 투여량은 동물의 기관지폐포 세척액 및 혈청에서 ELISA에 의한 FGF-1 단백질의 분석을 포함하는 투여량-반응 연구를 수행한 후에 선택되었다. 바이러스 투여 48시간 후에, 동물을 표준 압력 조건하에서(Flufrance cabinet, Cachan, France) 15일간 저산소 가스 혼합물(10% Fio2)에 노출시킨다.
실시예 4: 래트에서 AV1.0-CMV-VEGF-B
167
및 AV1.0-CMV-VEGF-B
186
의 폐내 전달
AV1.0-CMV-VEGF-B167및 AV1.0-CMV-VEGF-B186을 실시예 3에 설명된 것과 동일한 조건하에서 래트의 폐에 전달했다. VEGF-B 발현 카세트를 포함하지 않는 재조합 아데노바이러스(AV1.0 CMV.Null)를 대조구 동물에서 사용했다.
실시예 5: 래트에서, VEGF-B를 암호화 하는 유전자의 폐내 전달의 효능 평가
하기에 일람된 기준에 따라, 저산소증에 노출된 후 15 일째에, 평가를 수행한다.
a - 기관지폐포 세척액에서 FGF-1 단백질의 분석(ELISA)에 의한 형질도입의 효능 평가.
b - 마취하에 심장에 카테터를 삽입하여, 혈역학적 연구를 수행함으로써 폐순환승압의 평가(폐동맥압, 체동맥압 및 심박수 측정).
c - 풀톤 지수: 우심실의 중량/좌심실 + 격벽의 중량을 계산하여 우심실비대 평가.
d - 폐포 및 폐포관(직경 <200 ㎛) 수준에서 폐 소동맥의 근육화 정도를 평가하는, 폐의 조직학적 및 조직형태학적 연구 수행.
2a -형질도입의 효율
인간 VEGF-B 단백질은 저산소증에 노출된 후 15 일째에 동물의 혈청 및 기관지폐포 세척액(LBA)에서 ELISA에 의해 평가된다. VEGF-B 인자는 어떤 조건이 이용되든지(즉, 저산소증 또는 저산소증 없이) 대조구 동물의 혈청에서는 발견되지 않았다. 마찬가지로, VEGF-B의 농도는 VEGF-B(167형 또는 186형)를 암호화 하는 결손 재조합 아데노바이러스로 처리한 동물의 LBA에서 0이다.
2b -폐순환승압의 평가
폐순환승압은 마취하에 심장에 카테터를 삽입하여, 혈역학적 연구를 수행함으로써 평가되는데, 폐동맥압, 체동맥압 및 심박수가 측정된다.
체중은 저산소증에 노출되기 시작한 후 15 일째에 래트의 두 그룹이 동일하다. AV1.0-CMV-VEGF-B167또는 AV1.0-CMV-VEGF186으로 처리한 래트의 폐동맥압은 AdCMV.Null을 투여한 래트보다 상당히 작게 상승하고, 반면 체동맥압 및 심박수는 두 그룹(처리 및 대조) 간에 유의 차는 없다.
이러한 결과는 VEGF-B를 암호화 하는 유전자의 전달이 저산소증과 관련있는 동맥압의 상승을 매우 효율적으로 방지함을 나타낸다.
2c -우심실 비대 평가
우심실 비대는 우심실의 중량 대 좌심실 + 격벽의 중량 비를 측정함으로써 평가된다.
수집된 결과는 우심실 비대가 AV1.0 CMV-VEGF-B167또는 AV1.0 CMV-VEGF186으로 처리한 것보다 AV1.0 CMV/Null을 투여한 래트에서 상당히 큼을 보여준다.
2d -폐의 조직학적 연구
폐의 조직학적 연구는 염증성 병변이 108pfu의 투여량에서 매우 제한되고:부종과 출혈의 부재 및 기관지 또는 폐포 상피에서의 병변의 부재를 나타낸다. 어떤 처리가 도입되든지, 마크로파아지 우세로, 간질성 육아종이 종종 관찰된다.
폐는 두 가지 기준, 즉 (ⅰ) 동맥의 크기로 표준화되는, 동맥벽(직경 <200 ㎛의 소동맥)의 두께 연구 및 (ⅱ) 폐포 및 폐포관 수준에서 비-근육화, 부분적 근육화 또는 완전한 근육화 동맥의 % 연구에 따라 조직형태학적으로 연구된다.
동맥벽의 두께가 측정되고, 수집된 결과는 동맥벽의 두께가 동맥의 크기로 표준화될 때, AV1.0 CMV.Null로 처리된 것보다 벡터 AV1.0 CMV.VEGF-B가 투여된 래트에서 상당히 감소함을 보여준다.
폐포 및 폐포관 수준에서 비-근육화, 부분적 근육화 또는 완전한 근육화 동맥의 %가 측정되고, 수집된 결과는 비-근육화 동맥의 %가 폐포 수준 및 폐포관 수준 모두에서, VEGF-B를 암호화 하는 결손 재조합 아데노바이러스 벡터로 처리된 래트에서 상당히 증가함을 보여준다.
이러한 결과는 폐에서 VEGF-B와 같은 내피세포 생장 인자의 과발현이 저산소성 폐순환승압의 발달을 방지함을 명백하게 입증한다.
실시예 6: 래트에서 인간 FGF-1 유전자의 폐내 전달의 효능 평가
평가는 저산소증에 노출된 후 15 일째에, 하기에 일람된 기준에 따라 수행된다.
a - 기관지폐포 세척액내 FGF-1 단백질의 분석(ELISA)에 의한 형질도입의 효능 평가.
b - 마취하에 심장에 카테터를 삽입하여, 혈역학적 연구를 수행함으로써 폐순환승압의 평가(폐동맥압, 체동맥압 및 심박수 측정).
c - 풀톤 지수: 우심실의 중량/좌심실 + 격벽의 중량을 계산하여 우심실 비대 평가.
d - 폐포 및 폐포관(직경 <200 ㎛) 수준에서 폐 소동맥의 근육화 정도를 평가하는, 폐의 조직학적 및 조직형태학적 연구.
얻어진 결과는 폐에서 FGF-1과 같은 내피세포 생장 인자의 과발현이 저산소성 폐순환승압의 발생을 방지함을 보여준다.
Claims (11)
- 폐순환승압의 예방, 호전 및/또는 치료를 목적으로 하는 약학 조성물의 제조를 위한 맥관형성 인자를 암호화 하는 핵산을 포함하는 벡터의 용도.
- 제 1 항에 있어서, 맥관형성 인자가 FGF 부류 또는 VEGF 부류 중에서 선택되는 내피세포 생장 인자임을 특징으로 하는 용도.
- 제 2 항에 있어서, 내피세포 생장 인자가 FGF-1, FGF-2, FGF-4 또는 FGF-5 또는 이들의 변이체 중에서 선택됨을 특징으로 하는 용도.
- 제 2 항에 있어서, 내피세포 생장 인자가 VEGF, VEGF-B 또는 VEGF-C 또는 이들의 변이체 중에서 선택됨을 특징으로 하는 용도.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터가 플라스미드, 코스미드 또는 바이러스에 의해 캡시드화되지 않는 DNA임을 특징으로 하는 용도.
- 제 1 항 내지 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터가 바람직하게는 아데노바이러스, 레트로바이러스, 허프스바이러스 또는 아데노-수반 바이러스로부터 유도된 재조합 바이러스임을 특징으로 하는 용도.
- 제 6 항에 있어서, 재조합 바이러스가 결손 재조합 아데노바이러스임을 특징으로 하는 용도.
- 제 6 항에 있어서, 기관내 경로로 투여됨을 목적으로 하고 104내지 1014pfu, 바람직하게는 106내지 1010pfu를 포함하는 약학 조성물을 제조하기 위한 용도.
- 맥관형성 인자를 암호화 하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터가 일 이상의 상용성 및 약학적으로 허용가능한 보조제와 혼합됨을 특징으로 하는, 폐순환승압의 예방, 호전 및/또는 치료에 사용될 수 있는 약제의 제조방법.
- 조성물이 기관내 투여를 위해 제형됨을 특징으로 하는, 맥관형성 인자를 암호화 하는 핵산을 포함하는 결손 재조합 벡터를 포함하는 약학 조성물.
- 제 10 항에 있어서, 104내지 1014pfu, 바람직하게는 106내지 1010pfu를 포함함을 특징으로 하는 약학 조성물.
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