KR20010113036A - 사람의 퓨즈드 억제제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) 퓨즈드 단백질의 폴리펩티드 억제제 및 이 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자에 대해 상동성을 갖는 신규 폴리펩티드에 관한 것이다. 본원에서는 또한 이들의 핵산 서열을 포함하는 벡터 및 숙주 세포, 이종 폴리펩티드 서열에 융합된 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 키메라형 폴리펩티드 분자, 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 항체, 및 본 발명의 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공한다.

Description

사람의 퓨즈드 억제제{Human Suppressor of Fused}

다세포 유기체의 발생은 적어도 부분적으로는 패턴 세포, 조직 또는 기관의 위치 정보를 특정하거나, 지시하거나 또는 유지하는 메카니즘에 의존한다. 형질전환 성장 인자-베타(TGFβ), Wnt, 섬유모세포 성장 인자 및 헤지호그 과(科)의 구성원과 같은 다양한 분비 신호전달 분자는 드로소필라(Drosophila) 뿐만 아니라 척추 동물의 상이한 세포 및 구조의 패턴화 활성과 연관되어 있다. 페리몬의 문헌[Cell 80:517-520 (1995)].

드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)의 유전자 스크린에 의해 세그먼트-극성 유전자(segment-polarity gene)로 처음으로 확인된 {누슬라인-볼하드(Nusslein-Volhard) 등의 문헌[Roux. Arch. Dev. Biol. 193; 267-282 (1984)]} 헤지호그(Hh)는 광범위하고 다양한 발생학적 기능을 담당한다 (상기 페리몬의 문헌). 비록 하나의 드로소필라 Hh 유전자가 확인되었으나, 소닉(Sonic) Hh(SHh), 데절트(Desert) Hh(DHh) 및 인디안(Indian) Hh(IHh)의 세가지 포유류 Hh 상동체가 단리되었다 (에셀라드(Echelard) 등, Cell 75: 1417-30 (1993); 리들(Riddle) 등, Cell 75: 1401-16 (1993)). SHh는 발생 중인 척추동물 배아의 척삭(脊索) 및 바닥판(floor plate)에서 높은 수준으로 발현된다. 시험관내 체외이식 검정 뿐만 아니라 형질전환 동물에서의 SHh의 이소성(ectopic) 발현은 SHh가 신경관 패턴화에 중요 역할을 한다는 것을 보여준다 (에셀라드 등의 상기 문헌; 에릭손(Ericson) 등, Cell 81: 747-56 (1995); 마티(Marti) 등, Nature 375: 322-5 (1995); 크라우스(Krauss) 등, Cell 75, 1432-44 (1993); 리들(Riddle) 등, Cell 75: 1401-16 (1993); 로에린크(Roelink) 등, Cell 81:445-55 (1995); 하이네스(Hynes) 등, Neuron 19; 15-26 (1997)). Hh는 또한 사지 (크라우스(Krauss) 등, Cell 75:1431-44 (1993); 라우퍼(Laufer) 등, Cell 79, 993-1003 (1994)), 몸분절(somite) (판(Fan) 및 테셔-라비니(Tessier-Lavigne), Cell 79, 1175-86 (1994); 존슨(Johnson) 등, Cell 79; 1165-73 (1994)), 폐 (벨루치(Bellusci) 등, Develop. 124:53-63 (1997)) 및 피부 (오로(Oro) 등, Science 276:817-21 (1997))의 발생에 일정 역할을 한다. 또한, IHh 및 DHh는 뼈, 장 및 배아 세포 발생에 관여한다 (아펠퀴스트(Apelqvist) 등, Curr. Biol. 7: 801-4 (1997); 벨루치 등, Dev. Suppl. 124:53-63 (1997); 비트구드(Bitgood) 등, Curr. biol. 6:298-304 (1996); 로버츠(Roberts) 등, Development 121:3163-74 (1995)). SHh 녹아웃(knockout) 생쥐는 SHh가 여러 측면의 척추동물 발생에 결정적이라는 견해를 한층 강화시켜준다(치앙(Chiang) 등, Nature 383:407-13 (1996)). 이들 생쥐는 척삭 및 바닥판과 같은 중심선 구조의 결함, 신경관에서의 배쪽 세포 유형의 부재, 원위 사지 구조의 부재, 외눈증 및 척수 칼럼 및 대부분의 늑골의 부재를 나타낸다.

세포 표면에서, Hh 신호는 12 막통과 도메인 단백질 패치드(Patched) (Ptch) (후퍼(Hooper) 및 스코트(Scott), Cell 59:751-65 (1989); 나카노(Nakano) 등, Nature 341:508-13 (1989)) 및 G-단밸질 커플링 유사 수용체 스무든드(Smoothened) (Smo) (알세도(Alcedo) 등, Cell 86:221-232 (1996); 반 덴 호벨(van den Heuvel) 및 인그함(Ingham), Nature 382:547-551 (1996))에 의해 중계되는 것으로 생각된다. 유전적 및 생화학적 증거들은 Ptch 및 Smo이 다성분 수용체 복합체의 일부인 경우의 수용체 모델을 지지한다 (첸(Chen) 및 스트룰(Struhl), Cell 87:553-63 (1996); 마리고(Marigo) 등, Nature 384: 176-9 (1996); 스톤(Stone) 등, Nature 384:129-34 (1996)). Hh가 Ptch에 결합하면, Ptch의 Smo에 대한 보통의 억제 효과가 경감되어 Smo가 원형질 막을 통과하여 Hh 신호를 도입할 수 있게 하여준다. Ptch 유전자에서의 기능 상실 돌연변이가 기저 세포 모반 증후군(BCNS), 다발성 기저 세포 암종(BCCs)를 특징으로하는 유전적 질병을 갖는 환자에서 확인되었다. 비기능성 Ptch 유전자 돌연변이는 또한 산발성 기저 세포암종 종양과 상당 부분 연관이 있다 (키담바람(Chidambaram) 등, Cancer Research 56:4599-601 (1996); 가이라니(Gailani) 등, Nature Genet. 14:78-81 (1996); 한(Hahn) 등, Cell 85:841-51 (1996); 존슨(Johnson) 등, Science 272:1668-71 (1996); 운덴(Unden) 등, Cancer Res. 56:4562-5; 위킹(Wicking) 등, Am. J. Hum. Genet. 60:21-6 (1997)). Ptch기능의 상실은 기저 세포암종에서 통제되지 않은 Smo 신호전달을 야기하는 것으로 생각된다. 이와 유사하게, Smo 돌연변이가 활성화된 것이 산발성 BCC 종양에서 확인되었고 (지에(Xie) 등, Nature 391:90-2 (1998)), 이는 SHh 수용체 복합체에서 신호전달 서브유닛으로의 Smo의 역할을 강조해준다. 그러나, Ptch가 Smo 활성을 조절하는 정확한 메카니즘은 아직 명백히 밝혀지지 않았다.

중요한 것은, Hh 신호가 그 수용체로부터 하류의 표적까지 전달되는 신호전달 메카니즘 역시 밝혀지지 않은 채 남아있다는 것이다. 드로소필라에서의 유전적 상위성(epistatic) 분석으로 Hh 신호 도입 경로의 성분으로서 작용하는 것으로 나타난 다수의 세그먼트 극성 유전자를 확인하였다 (인그함(Ingham), Curr. Opin. Genet. Dev. 5:492-8 (1995); 상기 페리몬의 문헌). 이들은 키네신(kinesin) 형 분자 Costal-2 (Cos-2) (로빈슨(Robbins) 등, Cell 90:225-34 (1997); 시손(Sisson) 등, Cell 90: 235-45 (1997)), 퓨즈드로 지칭되는 단백질 (프레아트(Preat) 등, Genetics 135:1047-62 (1990); 테론드(Therond) 등, Proc. Natl Acad Sci. USA 93:4224-8 (1996)), 및 징크 핑거(zinc finger) 단백질 Ci. (알렉산더(Alexandre) 등, Genes Dev. 10:2003-13 (1996); 도민게즈(Dominguez) 등, Science 272:1621-5 (1996); 오레닉(Orenic) 등, Genes Dev. 4: 1053-67 (1990))을 포함한다. Hh 신호전달에 관련된 추가 요소는 전사 인자 CBP [아키마루(Akimaru) 등, Nature 386:735-738 (1997)], 음성 조절 인자 slimb [쟝(Jiang) 및 스트룰(Struhl), Nature 391:493-496 (1998)] 및 SHh 반응성 엘리먼트 COUP-TFII [크리스난(Krishnan) 등, Science 278:1947-1950 (1997)]을 포함한다. 또한, 드로소필라에서 발견되는 퓨즈드 억제제로 지칭되는 분자 (팜(Pham) 등, Genetics 140:587-98 (1995); 프레아트, Genetics 132:725-36 (1992))는 Hh 신호 도입(signal transduction) 경로의 화합물이라 여겨진다.

이들 Hh 경로 분자들의 기능적 역할 및 그들간의 상호작용은 유전적 및 구조적 분석에 일부 기초하여 제안되었다. Cos-2의 돌연변이체는 배아상태에서 사망하며, 각 세그먼트의 중심 성분의 복제 및 Hh 반응성 유전자의 도메인 팽창을 포함하는 Hh 과발현과 유사한 표현형을 나타낸다. 반대로, 퓨즈드 및 Ci의 돌연변이 배아는 각 세그먼트의 후방부의 결손 및 전방부 또는 각 세그먼트의 거울형 이미지 복제품으로 치환 및 전방부의 거울형 복제품으로 치환되는 것을 포함하는 Hh 기능 상실과 유사한 표현형을 나타낸다 (부손(Busson) 등), Roux. Arch. Dev. Biol. 197:221-230 (1988)). Ci의 분자 특성은 이것이 윙리스(Wingless) 및 Dpp와 같은 Hh 반응성 유전자를 직접 활성화시키는 전사 인자임을 암시한다 (알렉산더 등, (1996) 상기 문헌, 도민게즈 등, (1996) 상기 문헌). 마찬가지로, 퓨즈드의 분자 분석은 이것이 세린 트레오닌 키나제와 구조적으로 연관되어 있고, 완전한 N-말단 키나제 도메인 및 C-말단 조절 구역이 본연의 기능에 요구됨을 밝혔다 (프레아트 등, Nature 347:87-9 (1990); 로빈스 등, (1997) 상기 문헌; 테론드(Therond) 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:4224-8 (1996)). Cos-2 및 퓨즈드의 추정되는 반대 기능과 일관되게, 퓨즈드 돌연변이는 Cos-2 돌연변이체 및 또한 퓨즈드 억제제 돌연변이체에 의하여 억제된다 (프레아트 등, Genetics 135:1047-62 (1993)). 퓨즈드 널(null) 돌연변이체 및 N-말단 키나제 도메인 돌연변이체는 퓨즈드 억제제돌연변이체에 의해 충분히 억제될 수 있고, 퓨즈드의 C-말단 돌연변이체는 퓨즈드 억제제의 배경에서 강한 Cos-2 표현형을 나타낸다. 이는 퓨즈드 억제제가 존재하지 않을 때 퓨즈드 키나제 도메인은 SHh 신호전달의 구조 활성화제로 작용할 수 있음을 암시한다. 최근의 연구는 92 kDa 드로소필라 퓨즈드, Cos-2 및 Ci가 마이크로튜불 연관성 다중단백질 복합체에 존재하고, Hh 신호전달이 이 복합체가 마이크로튜불로부터 해리되도록 한다는 것을 보여준다 (로빈스 등, Cell 90:225-34 (1997); 시손(Sisson) 등, Cell 90:235-45 (1997)). 퓨즈드 및 Cos-2 모두 Hh 처리에 의하여 인산화되나 (로빈스 등, 상기 문헌; 테론드 등, Genetics 142:1181-98 (1996)), 활성(들)을 초래하는 키나제(들)은 특징적으로 잔존한다.

현재까지 이들 성분에 대해 공지된 척추동물 상동체는 단지 Gli 단백질 과의 단백질들 (예를 들면, Gli-1, Gli-2 및 Gli-3) 뿐이다. 이들은 Ci와 구조적으로 관련된 징크 핑거 추정 전사 인자이다. 이들 중에서, Gli-1은 SHh 신호의 후보 매개체임 밝혀졌고 [하이네스(Hynes) 등, Neuron 15:35-44 (1995), 리(Lee) 등, Development 124:2537-52 (1997); 알렉산더 등, Genes Dev. 10:2003-13 (1996)], 이는 Hh에 의한 유전자 활성화 메카니즘이 파리와 척추동물 간에 보존되어 있음을 암시한다. Hh 케스케이드 중의 다른 신호전달 성분이 진화적으로 보존되었는지를 확인하고, Hh 신호전달 케스케이드 중의 퓨즈드의 기능을 생화학적 수준에서 검사하기 위하여, 사람의 퓨즈드 cDNA를 단리하였고, 특징화하였다 (본원에 전문이 삽입된 1998년 2월 26일 출원된 미국 가출원 제06/076072호 참조). 생쥐에서, 퓨즈드는 SHh 반응성 조직에서 발현된다. 생화학적 연구는 퓨즈드가 기능적 키나제임을 입증하였다. 기능 연구는 퓨즈드가 Gli의 활성화 인자이고, 퓨즈드의 우성한 음성(negative)형은 제노푸스(Xenopus) 배아에서 SHh 신호전달을 봉쇄할 수 있다는 증거를 제공하였다. 또한, 이들 자료들은 Cos-2 및 퓨즈드 모두 Hh 신호전달에 직접 관여함을 입증하였다.

근래에, 드로소필라에서 퓨즈드 단백질의 억제제가 확인되었고, 이는 신규 PEST 함유 단백질인 것으로 나타났다 (모니에르(Monnier) 등, Curr. Biol. 8:583-586(1998), 팜 등, Genetics 140:587-598(1995), 프레아트 등, Genetics 135:1047-1062(1993) 및 프레아트, Genetics 132:725-736(1992)). PEST 도메인은 프롤린, 글루탐산 (또는 아스파르트산), 세린 및 트레오닌 (각각, 단일 문자 코드 P, E, S 및 T)가 풍부하고, 소수성 인덱스가 낮은 짧은 서열이다. 이들은 짧은 (<2 시간) 세포 반감기를 갖는 많은 단백질에서 발견된다 (40). 본 출원인은 억제제 폴리펩티드와 상동성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 확인하고 기술하였으며, 본원에서 사람 퓨즈드 억제제 ("hSu(fu)") 및 별도로 hSu(fu)로 지칭하였다. 패치드 유전자의 체성 획득 돌연변이가 기저 세포 암종, 일차 유방암종, 수질모세포종 및 수막종을 포함하는 산발성 암에서 확인되었다. 근래에는 패치드는 종양 억제제로 작용하고, 이들 돌연변이는 패치드 유전자 생성물에서 기능 상실을 유발하는 것으로 여겨진다. 따라서, 헤지호그/패치드 신호전달 경로는 종양발생에서의 한 가지 인자일 수 있다. 세포 성장 및 종양발생을 증가시키는 유전적 변화를 감지하는 것은 임상 의학에서 큰 관심 분야이다. 변경된 세포 성장을 유도하는 특이적 변화를 확인하는 것은 진단 개선 및 관련 종양에 대한 가능한 치료로의 관문일 수 있다.

본 발명은 일반적으로 세포 성장 및 분화에 관련된 헤지호그(Hedgehog; Hh) 신호 경로에 관여된 분자에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 사람의 퓨즈드 억제제 ("hSU(fu)")를 코팅하는 DNA와 상동성을 갖는 신규 DNA의 확인 및 단리, 및 본원에서 hSu(fu) 및 별도로 hSu(fu)로 지칭하는 신규 폴리펩티드의 재조합적 제조에 관한 것이다.

발명의 요약

"hSu(fu)" 또는 PRO1280로 지칭되는 신규 폴리펩티드를 코팅하는 cDNA 클론 (DNA33455)를 동정하였다. 한 실시태양에서, 본 발명은 hSu(fu) 폴리펩티드를 코팅하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다.

한 실시태양에서, 단리된 핵산은 도 1 (서열 확인 번호 2)의 hSu(fu)의 약 1 내지 약 433 아미노산 잔기의 서열을 갖는 hSu(fu) 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 (a), 또는 (a)의 핵산 분자의 상보물 (b)과 약 80% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 약 85% 이상의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 90% 이상의 서열 동일성, 더더욱 바람직하게는 약 95% 서열 동일성, 이보다 더더욱 바람직하게는 약 98% 이상의 서열 동일성, 및 가장 바람직하게는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 다른 실시태양에서는, 핵산은 ATCC 기탁 번호 제PTA-127호 (DNA33455-1548로 지칭됨)의 사람 단백질 cDNA에 의해 코딩되는 동일한 성숙 폴리펩티드를 코팅하는 DNA 분자 (a), 또는 이 DNA의 상보물 (b)과 상동성을 갖는다. 바람직한 실시태양에서, 핵산은 ATCC 기탁 번호 제PTA-127호 (DNA33455-1548)의 사람 단백질 cDNA에 의해 코딩되는 동일한 성숙 폴리펩티드를 코팅하는 DNA를 포함한다.

나아가, 본 발명은 도 6A-6B (서열 확인 번호 1)의 약 74 내지 약 1372 잔기의 핵산 상보물과 혼성화된 핵산 서열을 포함하는 hSu(fu) 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 분자에 관계된 것이다. 바람직하게는, 혼성화는 엄격한 혼성화 및 세척 조건하에서 일어난다.

본 발명은 또한 도 1 (서열 확인 번호 2)의 hSu(fu)의 약 1 내지 약 433 아미노산 잔기의 서열, 또는 상보적 핵산 서열과 약 80% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 약 85% 이상의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 90% 이상의 서열 동일성, 더더욱 바람직하게는 약 95% 이상의 서열 동일성, 이보다 더욱 바람직하게는 약 98% 이상의 서열 동일성, 및 가장 바람직하게는 100% 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자에 관계된 것이다.

더 나아가서, 본 발명은 100 개 이상의 뉴클레오티드를 가지며, 시험 DNA 분자를 엄격 조건하에서 도 1 (서열 확인 번호 2)의 hSu(fu)의 1 내지 약 433 아미노산 잔기의 서열을 갖는 hSu(fu) 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자 (a), 또는 (a)의 DNA 분자의 상보물 (b)과 혼성화하는 것, 및 DNA 분자가 (a) 또는 (b)와 약 80% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 약 85% 이상의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 90% 이상의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 95% 이상의 서열 동일성을 갖는다면 시험 DNA 분자를 단리하는 것에 의하여 제조한 단리된 핵산 분자에 관한 것이다.

구체적으로는, 본 발명은 개시 메티오닌을 갖거나 갖지 않는 hSu(fu) 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 단리된 핵산 분자, 또는 이러한 코딩 핵산 분자에 상보적인 것을 제공한다.

다른 관점에서는, 본 발명은 도 1 (서열 확인 번호 2)의 hSu(fu)의 1 내지 약 433 잔기의 아미노산 서열과 비교하였을 때 약 80% 이상 양성, 바람직하게는 약 85% 이상 양성, 더욱 바람직하게는 약 90% 이상 양성, 가장 바람직하게는 약 95%이상 양성을 기록하는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA (a), 또는 (a)의 DNA의 상보물 (b)을 포함하는 단리된 핵산 분자에 관계된 것이다.

다른 실시태양은 혼성화 탐침으로 용도를 가질 수 있는 서열을 코딩하는 hSu(fu) 폴리펩티드의 단편에 관한 것이다. 이러한 핵산 단편은 길이가 약 20 내지 약 80 뉴클레오티드, 바람직하게는 길이가 약 20 내지 약 60 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 길이가 약 20 내지 약 50 뉴클레오티드 및 가장 바람직하게는 길이가 약 20 내지 약 40 뉴클레오티드이고, 서열 확인 번호 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열로부터 유도될 수 있다.

다른 실시태양에서, 본 발명은 hSu(fu)을 코딩하는 핵산 또는 그 변형물을 포함하는 벡터를 제공한다. 이 벡터는 본원에서 확인된 임의의 단리된 핵산 분자를 포함할 수 있다.

이러한 벡터를 포함하는 숙주 세포를 또한 제공한다. 예를 들면, 숙주 세포는 CHO 세포, 이. 콜라이(E. coli), 또는 효모일 수 있다. 또한 hSu(fu) 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공하며 이는 hSu(fu)를 발현하기에 적합한 조건 하에서 숙주 세포를 배양하고 세포 배양으로부터 hSu(fu)를 회수하는 것을 포함한다.

다른 실시태양에서, 본 발명은 본원에서 상기 확인된 임의의 단리된 핵산 서열에 의해 코딩되는 단리된 hSu(fu) 폴리펩티드를 제공한다.

구체적으로는, 본 발명은 어떤 실시태양에서 도 1 (서열 확인 번호 2)의 hSu(fu)의 1 내지 약 433 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 자연 서열 hSu(fu) 폴리펩티드를 제공한다.

다른 면으로는, 본 발명은 도 1 (서열 확인 번호 2)의 hSu(fu)의 1 내지 약 433 아미노산 잔기의 서열과 약 80% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 약 85% 이상의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 90% 이상의 서열 동일성, 가장 바람직하게는 약 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 hSu(fu) 폴리펩티드에 관계된 것이다.

나아가서, 본 발명은 도 1 (서열 확인 번호 2)의 hSu(fu)의 1 내지 약 433 잔기의 아미노산 서열과 비교할 때 약 80% 이상 양성, 바람직하게는약 85% 이상 양성, 더욱 바람직하게는약 90% 이상 양성, 가장 바람직하게는 약 95% 이상 양성을 기록하는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 hSu(fu) 폴리펩티드에 관계된 것이다.

또 다른 면으로는, 본 발명은 도 1 (서열 확인 번호 2)의 hSu(fu)의 1 내지 약 433 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 단리된 hSu(fu) 폴리펩티드, 또는 항-hSu(fu) 항체에 결합 부위를 제공하기에 충분한 단편에 관계된 것이다. 바람직하게는, hSu(fu) 단편은 천연 hSu(fu) 폴리펩티드의 정성적인 생물학적 활성을 유지한다.

이에 더 나아가서, 본 발명은 (i) 시험 DNA 분자를 엄격 조건하에서 서열 확인 번호 2의 약 1 내지 약 433 아미노산 잔기의 서열을 갖는 hSu(fu) 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자 (a) 또는 (a)의 DNA 분자의 상보물 (b)과 혼성화시키고, 시험 DNA 분자가 (a) 또는 (b)에 약 80% 이상의 서열 동일성, 약 85% 이상의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 90% 이상의 서열 동일성, 가장 바람직하게는 약 95% 이상의 서열 동일성을 갖는다면, (ii) 시험 DNA 분자를 포함하는 숙주 세포를 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에서 배양하고, (iii) 세포 배양으로부터 폴리펩티드를 회수하는 것에 의해 제조된 폴리펩티드를 제공한다.

다른 실시태양에서는, 본 발명은 이종 폴리펩티드에 융합된 hSu(fu) 폴리펩티드 또는 아미노산 서열을 포함하는 키메라성 분자를 제공한다. 이러한 키메라성 분자의 예로는 에피토프 태그(tag) 서열 또는 면역글로불린의 Fc 부위에 융합된 hSu(fu) 폴리펩티드를 들 수 있다.

다른 실시태양에서는, 본 발명은 hSu(fu) 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 임의적으로, 항체는 모노클로날 항체이다.

또 다른 실시태양에서는, 본 발명은 천연 hSu(fu) 폴리펩티드의 효현제(agonist) 및 길항제에 관계된 것이다. 특정 실시태양에서, 효현제 또는 길항제는 항-hSu(fu) 항체이다.

더 나아간 실시태양에서는, 본 발명은 천연 hSu(fu) 폴리펩티드를 후보 분자와 접촉시키고, 상기 폴리펩티드에 의해 매개되는 생물학적 활성을 모니터링하는 것에 의하여 천연 hSu(fu)폴리펩티드의 효현제 또는 길항제를 확인하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 실시태양에서, 생물학적 활성은 헤지호그 신호전달 경로에서 퓨즈드 폴리펩티드의 활성을 억제한다.

또 더 나아간 실시태양에서는, 본 발명은 제약적으로 허용가능한 담체와의 조합으로 hSu(fu) 폴리펩티드 또는 본원에서 상기 규정한 효현제 또는 길항제를 포함하는 조성물에 관계된 것이다.

또 다른 실시태양에서는, 본 발명은 헤지호그 신호전달의 hSu(fu) 조절을 촉진하는 효현제 및 그 조절에 대한 길항제를 개발하는 방법 및 화합물을 제공한다. 구체적으로는, 작은 생유기 분자 및 안티센스 뉴클레오티드를 포함하는 SH 신호전달 경로에서 hSu(fu)의 정상 기능을 봉쇄, 방해, 억제 및(또는) 중화하는 척추동물 hSu(fu)의 길항제를 제공한다.

또 다른 실시태양에서는, 본 발명은 사람 hSu(fu)의 별도로 스플라이싱된(spliced) 변형체를 제공한다.

또 더 나아간 실시태양에서는, 본 발명은 헤지호그 신호전달의 hSu(fu) 조절을 변경시키는 분자를 스크리닝하는 방법 또는 그 분자를 확인하는 검사 방법을 제공한다. 바람직하게는, 이 분자는 hSu(fu)와 그의 결합성 단백질 (퓨즈드와 같은 것)과의 상호작용을 막거나, 또는 복합체의 해리를 막거나 억제한다. 이들 검정은 hSu(fu) 및 기질을 포함하는 혼합물을 후보 분자와 배양하고, 후보 분자가 hSu(fu) 헤지호그 신호전달을 조절하는 능력을 탐지하는 것을 포함한다. 스크린된 분자는 바람직하게는 소분자의 약 후보들이다.

또 다른 실시태양에서는, 본 방법은

(a) 시험 세포 또는 조직을 배양하고,

(b) hSu(fu) 조절성 헤지호그 신호전달을 억제할 수 있는 화합물을 투여하며,

(c) 헤지호그 신호전달이 조절되는지를 측정하는 것을 포함하는, 특정 질병이 헤지호그 신호전달에 의해 조절되는 것인지를 결정하는 진단 기술에 관한 것이다.

도면의 간단한 설명

도 1은 천연 hSu(fu)의 유도 아미노산 서열 (서열 확인 번호 2)를 나타낸다. 사람 Su(fu)의 예측 단백질 서열과 드로소필라 Su(fu) (서열 확인 번호 4)가 정렬되어 존재한다. 동일한 잔기들은 네모상자 안에 있으며, 짙은 회색 구역은 보존된 잠재성 단백질 키나제 C (Protein Kinase C) 인산화 부위를 나타내고, 별표는 보존된 잠재성 카제인 키나제 II (Kasein Kinase II) 인산화 부위를 나타내고, 얇은 검은색 막대는 hSu(fu) (서열의 위쪽 막대) 또는 dSu(fu) (서열의 아래쪽 막대)에서의 후보 PKA 인산화 부위를 나타내고, 검은 배경의 하얀색 글자는 PEST 도메인을 나타낸다. 니들만-웬치(Needleman-Wench) 알고리즘 (니들만 및 분쉬(Wunsch) (1970), J. Mol. Biol. 48:443)을 정렬에 사용하였고, 두 개의 단백질 간의 37.7% 동일성, 63% 양성을 밝혔다. 433 개의 아미노산 서열 사람 단백질은 47932의 분자량 및 5.66의 pI (비글리코실화된 것)을 가지리라 예상된다. 잠재적인 N-글리코실화 부위는 NLSG 서열 265 위치에 존재한다. 도면 및 본원에 걸쳐 사용된 약어는 다음을 포함한다: aa, 아미노산(들); bp, 염기쌍(들); cDNA, RNA에 상보적인 DNA; BLAST, 기본 국소 정렬 검색 도구; ORF, 오픈 리딩 프레임; UTR, 비해독 구역; HH, 헤지호그 단백질과; Hh, 드로소필라 헤지호그 단백질; Shh, 소닉(Sonic) 헤지호그 단백질; Dhh, 데절트(Desert) 헤지호그 단백질; Ihh, 인디안(Indian) 헤지호그 단백질; dSu(fu), 드로소필라 퓨즈드 단백질 억제제; hSu(fu), 사람 퓨즈드 단백질 억제제; Fu, 드로소필라 퓨즈드 단백질; hGli, 사람 Gli 단백질; mGli2, 생쥐Gli2 단백질; hGli3, 사람 Gli3 단백질; Ci, 드로소필라 팔굽이(Cubitus) 중절 단백질; Slimb, 드로소필라 Slimb 단백질, mSlimb, 생쥐 Slimb 단백질; PKA, cAMP 의존성 단백질 키나제; FISH, 형광 제자리 혼성화; PCR, 폴리머라제 체인 반응; EST, 발현 서열 태그; GST, 글루타치온-S-트랜스퍼라제 (Glutathione-S-transferase) 단백질; MEM, 최소 필수 배지; E, 배아기; 및 PAGE, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동.

도 2A 및 2B는 사람 Su(fu) 유전자의 염색체 위치 측정을 도시한 것이다. 도 2A는 비오틴화된 hSu(fu) 탐침의 FISH 위치 측정을 나타낸다. 동일한 유사 분열도의 DAPI-염색된 이미지를 겹쳐 놓는 것에 의하여 10번 염색체의 장암(long arm)으로의 할당이 행하여졌다 (도 2B). 도 2B는 FISH 맵핑 결과의 도해이다. 각 도트는 단일 염색체 폭 상의 이중 FISH 신호를 대표한다. 분석된 총 100 개의 세포 중에서, 72 개 세포가 특이적으로 표지되었다.

도 3A-3J는 배아 및 성체 설치류 조직에서 Su(fu) mRNA의 조직 분포를 도시한 것이다. 도 3A는 배측(背側)면도이며, 도 3B는 총 마운트(whole mount) 배아기 8.5 일 (E8.5) 생쥐에 대한 생쥐 Su(fu) 탐침을 사용한 제자리 혼성화의 측면도를 나타낸다. 도 3C-3J는 표시된 나이의 쥐 총 배 (도 3C 및 3D), 신경관 (도 3E 및 3F), 또는 뇌 (도 3G, 3H, 3I, 및 3J)의 Su(fu)의 제자리 혼성화의 세로 부분 (도 3C, 도 3D, 도 3I, 및 도 3J), 또는 관부 부분 (도 3E-3H)를 나타낸다. 도 3J는 도 3I의 소뇌의 확대도이다. 축척 막대(scale bar)=0.27 ㎜ (도 3A 및 3B), 0.5 ㎜ (도 3C); 1.67 ㎜ (도 3D), 0.16 ㎜ (도 3E); 0.59 ㎜ (도 3F); 1.14 ㎜ (도 3G); 5.33 ㎜ (도 3H); 10 ㎜ (도 3I); 및 1.03 ㎜ (도 3J). 사용된 약어는 다음과 같다: ps, 원시선조(primitive streak); np, 신경판; hb, 후뇌; mb, 중뇌; fb, 전뇌; mes, 중배엽; som, 몸분절(somite); all, 요막(allantois); man, 제1 동맥궁의 하악 성분; sc, 척수; ctx, 피질; di, 간뇌; cer, 소뇌; ton, 혀; eso, 식도; liv, 간; gt, 생식 결절; lu, 폐; dis, 추간원판; mg, 중간창자; nt, 신경관; epen, 뇌실막;nn, 신피질 신경상피(neocortical neuroepithelium); hip, 해마(hippocampus); ssz, 선조 심실하 구역(striatal subventricular zone); th, 시상; cau, 미상(caudate); hyp, 시상하부; olf, 후구(olfactory bulb); ic, 하구(inferior colliculus); suc, 상구(superior colliculus).

도 4A 내지 4E는 성체 생쥐 고환의 Su(fu)의 조직 분포를 도시한 것이다. 도 4A는 Su(fu) 탐침에 혼성화된 성체 고환의 단면이다. 확대도 (도 4C-4E)는 Su(fu) mRNA는 발달중의 정모세포 (도 4C 및 4D), 또는 몇몇 구역에서는 생식세포(germinal cell)의 후단계 분화가 일어나는 정세관(seminiferous tubules)의 중앙 (도 4E)에 국소화됨을 증명한다. 도 4B는 고환이 센스 가닥 조절 탐침과 혼성화된 것을 도시한 것이다. 축척 막대는 1.0 ㎜ (도 4A 및 4B) 및 0.065 ㎜ (도 4C-4E)를 나타낸다. 약자는 다음과 같다: st, 정세관; ta, 백색막(tunica albuginea); sg, 정조세포(spermatogonia); sc, 정모세포; lc, 라이디히(leydig) 세포; sm, 성숙 정자; lu, 관강.

도 5A-5D는 hSu(fu)의 면역세포화학, 생화학적 상호작용 및 생물학적 활성을 도시한 것이다. 도 5A는 트랜스펙션된 COS-7 세포에서 hSu(fu) 및 hGli의 공동 국소화를 나타낸다. 세포들은 도 5A에서 pRK.hSu(fu) (도 5A1), pRK.hGli (도 5A3)각각, 또는 2 개의 플라스미드를 함께 (도 5A2 및 5A4)로 표시한 바와 같이 트랙스펙션시켰고, 단백질은 24 시간 후 면역생화학적으로 염색하였고, 형광 현미경으로 시각화하였다. 트랙스펙션된 세포를 고정하였고, 침투가능화 하였으며, 각각 hSu(fu) (붉은색; 도 5A1 및 5A2) 및(또는) hGli (녹색; 도 5A3 및 5A4)을 항-hSu(fu) 및 항-c-myc 1차 항체에 이어서 cy3-접합된 항-토끼 IgG 또는 cy2-접합된 항-생쥐 IgG롤 각각 사용하여 표지하였다. 아래쪽 패널 (도 5A2 및 5A4)은 양 단백질들을 같이 트랜스펙션하고, 이중 표지한 세포를 나타낸다. 확대율: 400x. 도 5B는 일시적으로 트랙스펙션된 NIH-3T3 세포 중의 hGli 및 hSu(fu)의 공동 면역침전을 도시한 것이다. 세포들은 표시한 플라스미드 (총 10 ㎍)으로 트랜스펙션시켰고, 42 시간 후에 용균(lyse)하였으며, 용균물을 항-플래그(flag) M2 (플래그-태그된 hSu(fu)에 대한 것) 또는 항-c-myc (myc-태그된 hGli에 대한 것) 항체로 면역침전시켰다. 단백질 복합체는 8% 겔 상의 변성 SDS-PAGE시켰고, 니트로셀룰로오스로 이전하였으며, 표시한 바와 같이 항-myc 또는 항-플래그 항체로 탐침화하였다. 항체들은 ECL 검출로 시각화하였다. 도 5C는 GST-융합 단백질 결합 검정을 도시한 것이다. 단백질은 시험관내 전사-해독에 의해³⁵S로 표지하였으며, 각각 GST-hSu(fu) 또는 GST에 접합된 글루타치온 세파로즈 비드로 2 시간 동안 4℃에서 배양하였다. 세척 후, 결합 단백질을 SDS-로딩 완충액 중에서 끓여서 용출하였으며, 샘플들은 10% 또는 8% (오직 hSu(fu)만) 변성 SDS-PAGE시켰다. 겔을 고정하였고, 증폭, 건조하였으며, 필름에 노출하였다. 각 반응에 사용한 표지된 단백질의 양은유입 ("in") 레인에 나타낸 것의 4 배였다. "Lucif"는 루시페라제를 나타낸다. 도 5D는 Gli 활성화 리포터(reporter) 검정을 도시한 것이다. 6-웰(well) 플레이트 중의 C3H10T1/2 세포를 듀플리케이트로, hSu(fu), hGli, hSu(fu)+hGli, 또는 빈 벡터 (pRK5) (각 0.5 ㎍)에 대한 발현 구조 및 루시페라제 리포터 플라스미드 (1 ㎍)으로 일시적으로 트랜스펙션시켯다. 트랜스펙션된 DNA의 총량은 pRK.EGFP와 함께 2 ㎍ 이었다. 세포 용균물 중의 상대적 루시페라제 활성을 트랜스펙션 48 시간 후에 측정하였고, 레닐라(Renilla) 루시페라제 활성 (pRL-TK; 0.0025 ㎍/웰)에 대해 표준화하였다. 데이타는 3회 중에서 대표적인 실험으로부터 결정한 듀플리케이트의 평균 +/- SD를 나타낸다.

도 6A-6B는 천연 서열 hSu(fu)를 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 그 뉴클레오티드 서열 (서열 확인 번호 1)은 천연 hSu(fu) (서열 확인 번호 2)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (뉴클레오티드 74 내지 1372)를 함유하고, 여기서 뉴클레오티드 서열 (서열 확인 번호 1)은 본원에서 "UNQ650" 및(또는) "DNA33455-1548"로 지정된 클론이다. 출발 코돈은 뉴클레오티드 74 내지 76이고, "O"로 지정한 종결 코돈은 뉴클레오티드 1373 내지 1375이다.

도 7은 공통 서열(consensus sequence)로 설계된, 본원에서 DNA33454 (서열 확인 번호 3)으로 지정한 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 밑줄친 서열은 쥐과의 퓨즈드 억제제와 상동성인 프라이머 서열을 나타낸다.

도 8은 마라(Marra) 등에 의해 워싱턴 유니버시티-HHMI 생쥐 EST 프로젝트로 제공된 진뱅크(GenBank) 평가 번호 제AA061390호 (서열 확인 번호 5)에서 얻은 Mus근육성 퓨즈드 억제제 유전자의 EST 생쥐 고환 cDNA의 275 bp 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

도 9는 퓨즈드 억제제 유전자와 유사한 NT2 신경성 전구체 937230 cDNA (진뱅크 평가 번호 제AA223637호)로 확인된 EST 사람 뇌 cDNA 서열의 346 bp 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

도 10은 아미노산 서열 hSu(fu) 에피토프 플래그 단백질 (서열 확인 번호 10)이다.

도 11은 아미노산 서열 hSu(fu)-GST 단백질 (서열 확인 번호 11)이다.

바람직한 실시태양의 상세한 설명

I.정의:

본원에서 사용된 용어 "hSu(fu) 폴리펩티드", "hSu(fu) 단백질" 및 "hSu(fu)"는 천연 서열 hSu(fu) 및 hSu(fu) 변형체 (본원에서 추후 정의함)를 포함한다. hSu(fu)는 사람 조직형과 같은 다양한 출처 또는 다른 출처로부터 단리할 수 있거나, 또는 재조합 및(또는) 합성법으로 제조할 수 있다.

"천연 서열 hSu(fu)"는 천연으로부터 유도된 hSu(fu)와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 천연 서열 hSu(fu)는 천연으로부터 단리할 수 있거나, 또는 재조합 및(또는) 합성법에 의해 제조할 수 있다. "천연 서열 hSu(fu)"라는 용어는 구체적으로 hSu(fu)의 천연적으로 발생한절단된(truncated) 형 또는 분비된 형 (예를 들면, 세포외 도메인 서열), 천연적으로 발생한 변형형 (예를 들면, 별도로 스플라이싱된 형) 및 천연적으로 발생한 대립 유전자 변형체를 포함한다. 본 발명의 한 실시태양에서는, 천연 서열 hSu(fu)는 도 1 (서열 확인 번호 2)의 hSu(fu)의 1 내지 433 아미노산을 포함하는 성숙 또는 전장 천연 서열 hSu(fu)이다.

"hSu(fu) 변형체"는 도 1 (서열 확인 번호 2)에 나타낸 연역된(deduced) 아미노산 서열을 갖는 hSu(fu) 폴리펩티드의 1 내지 433 잔기의 아미노산 서열과 약 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 활성 hSu(fu) (활성도는 하기 정의함)를 의미한다. 이러한 hSu(fu) 변형체는 예를 들면, 도 1의 서열 (서열 확인 번호 2)의 N- 또는 C-말단 뿐만 아니라 1 이상의 내부 도메인 내의 1 이상의 아미노산 잔기가 첨가 또는 결손된 hSu(fu) 폴리펩티드를 포함한다. 통상적으로, hSu(fu) 변형체는 도 1 (서열 확인 번호 2)의 hSu(fu)의 1 내지 433 잔기의 아미노산 서열과 약 80% 이상의 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 85% 이상의 아미노산 서열 동일성, 더더욱 바람직하게는 약 90% 이상의 아미노산 서열 동일성, 좀 더 더욱 바람직하게는 약 95% 이상의 서열 동일성, 및 이보다 더욱 바람직하게는 약 98% 이상의 서열 동일성을 가질 것이다. 변형체는 도 1 (서열 확인 번호 4)에 나타낸 드로소필라의 서열과 같은 공지의 퓨즈드 억제제 서열 뿐만 아니라 천연 서열도 포함하지 않는다.

본원에서 확인된 hSu(fu) 서열에 관한 "퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성"은 서열을 정렬하고, 필요한 경우 갭을 도입하여 최대 퍼센트 서열 동일성을 획득하며, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존성 치환을 고려하지 않은 후, hSu(fu) 서열 중의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 중의 아미노산 잔기의 퍼센트로 정의된다. 본원에서 사용된 % 동일성 값은 본원에 참고문헌으로 삽입된 알트슐(Altschul) 등의 문헌[Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996); 또한 http:blast. wustl/edu/blast/README.hlml참고]으로부터 얻은 WU-BLAST-2에 의해 산출할 수 있다. WU-BLAST-2는 몇 가지의 검색 파라미터를 사용하고, 이들 대부분은 디폴트값으로 설정되어 있다. 조절가능한 파라미터들은 다음의 값 내에 설정된다: 중복 스팬(span)=1, 중복 분수(fraction)=0.125, 단어 역치(T)=11.

상기 기술한 바와 같이 실행한 서열 비교를 언급함에 있어서, "양성"이라는 용어는 동일하지 않으나 유사한 특성을 갖는 (예를 들면, 보존성 치환의 결과로서) 비교된 서열 중의 잔기들을 포함한다. 양성의 % 값은 BLOSUM 62 매트릭스 중의 양성 값을 기록한 잔기를 상기 정의된 더 긴 서열 중의 총 잔기의 수로 나눈 분수(fraction)에 의해 결정된다.

유사하게, 본원에서 확인된 hSu(fu) 폴리펩티드의 코딩 서열에 대하여 "퍼센트(%) 핵산 서열 동일성"은 hSu(fu) 코딩 서열 중의 뉴클레오티드 잔기와 동일한 후보 서열 중의 뉴클레오티드 잔기의 퍼센트로 정의된다. 본원에서 사용된 동일성 값은 중복 스팬 및 중복 분수로 각각 1 및 0.125를 설정한 디폴트 파라미터가 설정된 WU-BLAST-2의 BLSTN 모듈에 의해 산출할 수 있다.

본원에 개시된 다양한 폴리펩티드를 기술하는데 사용한 "단리된"은 그 천연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및(또는) 회수된 폴리펩티드를 의미한다. 그천연 환경의 오염 성분은 전형적으로 폴리펩티드의 진단 또는 치료 용도를 방해할 수 있는 물질이고, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 폴리펩티드는 (1)회전 컵 서열분석기 (spinning cup sequenator)를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15 개 이상의 잔기를 얻기 충분한 정도로, 또는 (2)쿠마지 블루(Coomassie blue) 또는 바람직하게는 은 착색제를 사용한 비환원 또는 환원 조건하에서 SDS-PAGE에 의해 상동성으로 정제할 수 있다. 단리된 폴리펩티드는 천연 환경 hSu(fu)의 1 이상의 성분이 존재할 수 없기 때문에 재조합 세포 내의 원위치 폴리펩티드를 포함한다. 그러나, 통상적으로 단리된 폴리펩티드는 1 이상의 정제 단계에 의해 제조될 수 있다.

hSu(fu) 폴리펩티드를 코딩하는 "단리된" 핵산 분자는 통상적으로 hSu(fu) 코딩 핵산과 연관된 1 이상의 천연 기원의 오염 핵산 분자로부터 확인 및 분리된 핵산 분자이다. 단리된 hSu(fu) 코딩 핵산 분자는 천연에서 발견되는 형태 또는 설정과는 다른 것이다. 다라서, 단리된 핵산 분자는 천연 세포에 존재하는 hSu(fu) 코딩 핵산 분자와는 구별된다. 그러나, hSu(fu) 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 분자는 통상적으로 hSu(fu)를 발현하는 세포 (여기서, 예를 들면 핵산 분자는 천연 세포와는 다른 염색체 위치에 있음) 중에 함유된 hSu(fu) 코딩 핵산 분자를 포함한다.

"조절 서열"은 특정 숙주 생체 중의 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 지칭한다. 원핵 세포에 적합한 조절 서열은 예를 들면, 프로모터, 임의로는 작동 서열, 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 이용한다고 공지되어 있다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 위치할 때 "작동가능하게 연결되어" 있다. 예를 들면, 전서열(presequence) 또는 분비성 리더(secretory leader)에 대한 DNA는 이것이 폴리펩티드의 분비에 관여하는 전단백질(preprotein)으로 발현된다면 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되어 있고, 프로모터 또는 인핸서는 이것이 서열의 전사에 영향을 준다면 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 있고, 또는 리보솜 결합 부위는 이것이 해독을 촉진하도록 위치한다면 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 것이다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 인접하고 있으며, 분비성 리더의 경우에는 인접하고 리딩기(reading phase)에 있다. 그러나, 인핸서는 인접할 필요가 없. 연결은 손쉬운 제한 부위에 리게이션(ligation)에 의해 이루어진다. 이러한 부위가 존재하지 않는다며, 합성 올리고뉴클레오티드 어뎁터 또는 링커가 통상의 방법에 의해 사용된다.

"항체"는 가장 넓은 관념으로 사용되었고, 구체적으로는 하나의 항-hSu(fu) 모노클로날 항체 (효현제, 길항제 및 중화 항체를 포함함)로부터 폴리에피토프 특이성을 갖는 항-hSu(fu) 항체 조성물을 포괄한다. 본원에서 사용된 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동질성 항체의 집단 (즉, 집단에 포함되는 개별 항체들은 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생성 돌연변이를 제외하고는 동일함)으로부터 얻은 항체를 지칭한다.

혼성화 반응의 "엄격성"은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 용이하게 결정될 수 있고, 일반적으로 탐침 길이, 세척 온도 및 염 농도에 의존하는 실험적 계산이다. 일반적으로, 탐침이 길수록 적당한 어닐링(annealing)에 더 높은 온도를 요하는 반면, 탐침이 짧을수록 더 낮은 온도가 필요하다. 혼성화는 일반적으로 상보성 가닥이 그 용융 온도 이하의 환경에 존재할 때 변성된 DNA가 재어닐링되는 능력에 의존한다. 탐침 및 혼성화가능한 서열 간의 목적 상동성 정도가 높을 수록 사용할 수 있는 상대 온도가 높다. 그 결과, 상대 온도가 높을수록 반응 조건은 더욱 엄격해지는 경향이 있을 수 있는 반면, 온도가 낮을 수록 덜 그러하다. 혼성화 반응의 엄격성에 대한 추가 설명 및 해설에 대해서는 아우수벨(Ausubel) 등의 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publisher, (1995)] 참조.

본원에서 정의된 "엄격 조건" 또는 "높은 엄격성 조건"은 (1) 세척에 낮은 이온 강도 및 높은 온도 (예를 들면, 50 ℃에서 0.015 M 소듐 클로라이드/0.0015 M 소듐 시트레이트/0.1% 소듐 도데실 술페이트)를 적용하는 것, (2) 혼성화 도중에 포름아미드와 같은 변성제 (예를 들면, 0.1% 소 혈청 알부민을 갖는 50% (v/v) 포름아미드/0.1% 피콜(Ficoll)/0.15 폴리비닐피롤리돈/50 mM 소듐 포스페이트 완충액 (pH 6.8)과 함께 42 ℃에서 750 mM 소듐 클로라이드, 75 mM 소듐 시트레이트)를 적용하는 것, 또는 (3) 42℃에서 50% 포름아미드, 5 ×SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 소듐 시트레이트), 50 mM 소듐 포스페이트 (pH 6.8), 0.1% 소듐 피로포스페이트, 5 ×덴하르트(Denhardt's) 용액, 초음파 처리한 연어 정자 DNA (50 ㎍/㎖), 0.1% SDS, 및 10% 덱스트란 술페이트와 함께 42℃에서 0.2 ×SSC (소듐 클로라이드/소듐 시트레이트) 및 0.1% SDS를 적용하는 것, 또는 (4) 55℃에서 10% 덱스트란 술페이트, 2 ×SSC 및 50% 포름아미드, 이어서 55℃에서 0.1 ×SSC 포함 EDTA로 구성된 높은 엄격성 세척을 적용하는 것으로 확인할 수있다.

"중간 엄격 조건"은 삼브루크(Sambrook) 등에 의해 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989]에 기술한 것에 의해 확인할 수 있으며, 상기 기술한 것보다 낮은 엄격도의 세척 용액 및 혼성화 조건 (예를 들면, 온도, 이온 강도 및 %SDS)를 사용하는 것을 포함한다. 중간 엄격 조건의 예는 37℃에서 20% 포름아미드, 5 ×SSC (150 mM NaCl, 15 mM 트리소듐 시트레이트), 50 mM 소듐 포스페이트 (pH 7.6), 5 ×덴하르트 용액, 10% 덱스트란 술페이트, 및 20 ㎎/㎖ 변성 전단(sheared) 연어 정자 DNA를 포함하는 용액 중에서 밤새 배양하고, 이어서 여과액을 약 37-50℃에서 1 ×SSC 중에서 세척하는 것이다. 당업계의 숙련자들은 탐침 길이 등과 같은 인자를 고려하여 필요한 온도, 이온 강도 등을 조정하는 방법을 알 수 있을 것이다.

본원에서 사용된 "에피토프 태그된"은 "태그 폴리펩티드"에 융합된 hSu(fu) 폴리펩티드를 포함하는 키메라형(chimeric) 폴리펩티드를 지칭한다. 태그 폴리펩티드는 항체가 만들 수 있는 것에 대한 에피토프를 제공하기에 충분한 잔기들을 가지나, 이것이 융합되는 폴리펩티드의 활성을 방해하지 않을 정도로 짧다. 태그 폴리펩티드는 바람직하게는 또한 상당히 독특하여 항체는 다른 에피토프와는 실질적으로 교차 반응하지 않는다. 적합한 태그 폴리펩티드는 일반적으로 6 이상의 아미노산 잔기를 가지며, 보통 약 8 내지 50 아미노산 잔기 (바람직하게는, 약 10 내지 20 아미노산 잔기)이다.

본원에서 사용된, "면역어드헤신(immunoadhesin)"이라는 용어는 이종 단백질의 결합 특이성 ("어드헤신(adhesin)")을 면역글로불린 불변 도메인의 효과기(effector) 기능과 결합한 항체형 분자를 지칭한다. 구조적으로, 면역어드헤신은 항체의 항원 인식 및 결합 부위와 다른 (즉, "이종") 원하는 결합 특이성을 갖는 아미노산 서열과 면역글로불린 불변 도메인 서열과의 유합을 포함한다. 면역어드헤신 분자의 어드헤신 부분은 전형적으로 적어도 수용체 또는 리간드의 결합 부위를 포함하는 연속 아미노산 서열이다. 면역어드헤신 중의 면역글로불린 불변 도메인 서열은 IgG-1, IgG-2, IgG-3 또는 IgG-4 아형, IgA (IgA-1 및 IgA-2를 포함함), IgE, IgD 또는 IgM과 같은 임의의 면역글로불린으로부터 얻을 수 있다.

"조절" 또는 "조절하기"라는 용어는 신호전달 경로의 상승조정 (upregulation) 또는 하강조정 (downregulation)을 의미한다. 신호 도입 조절하의 세포 과정은 특정 유전자의 전사, 정상 세포 기능 (예를 들면, 대사, 증식, 분화, 부착, 자연괴사 및 생존) 뿐만 아니라 비정상 과정 (예를 들면, 형질 변형, 분화 및 전이의 봉쇄)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본원에 사용된 "폴리머라제 체인 반응" 또는 "PCR" 기술은 일반적으로 미소량의 핵산, RNA 및(또는) DNA 특정 조각을 미국 특허 제4,683,195호 (1987년 7월 28일 공고)에 기술된 바와 같이 증폭하는 것을 지칭한다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제작할 수 있도록 관심 구역 말단 또는 그 이상의 서열 정보가 이용가능해야 한다. 이들 프라이머는 증폭되는 주형의 마주보는 가닥 서열과 동일 또는 유사할 수 있다. 두 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드는 증폭 물질의말단과 일치할 수 있다. PCR 서열은 총 유전체 DNA, 및 세포성 RNA, 박테리오파지 또는 플라스미드 서열 등으로부터 전사된 cDNA를 형성한다. 일반적으로, 물리스(Mullis) 등 [Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263 (1987)]; 에를리히, 에드(Erlich, Ed.), [PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989)] 참조. 본원에서 사용된 PCR은 공지된 핵산을 프라이머로 사용하고 핵산 폴리머라제를 사용하여 핵산의 특정 조각을 증폭 또는 생성하는 것을 포함하는, 핵산 시험 샘플의 일 예 (그러나, 유일한 것은 아님)로 간주된다.

본원에서 목적하는 "활성" 또는 "활성도"는 천연 또는 천연 발생의 hSu(fu)의 생물학적 및(또는) 면역학적 활성을 보유하는 hSu(fu) 형(들)을 지칭한다. 바람직한 활성은 예를 들면, 헤지호그 신호전달 경로를 조절하는 능력, 가장 바람직하게는 퓨즈드 활성을 조절, 활성화 또는 억제하는 것을 포함한다.

"길항제"는 가장 넓은 관념으로 사용되었고, 본원에 개시된 천연 hSu(fu) 폴리펩티드의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 봉쇄, 억제 또는 중화하는 임의의 분자를 포함한다. 유사하게, "효현제"는 가장 넓은 관념으로 사용되었고, 본원에 개시된 천연 hSu(fu) 폴리펩티드의 생물학적 활성을 모방하는 임의의 분자를 포함한다. 적합한 효현제 또는 길항제 분자는 구체적으로 효현제 또는 길항제 항체 또는 항체 단편, 천연 hSu(fu) 폴리펩티드의 단편 또는 아미노산 서열 변형체, 펩티드, 소형 유기 분자 등을 포함한다.

"치료"는 치유적인 치료 및 예방적 또는 방지적 수단 모두를 지칭한다 (여기서, 그 목적은 목표하는 병리학적 상태 또는 질병을 막거나 또는 늦추는 (경감시키는) 것이다). 치료를 요하는 경우는 이미 그 질병을 가진 경우 뿐만 아니라 그 질병을 갖기 쉬운 경향이 있는 경우 또는 그 질병을 예방해야 할 경우를 포함한다.

"만성" 투여는 급성 모드의 반대로서 지속적인 모드로 제제를 투여하여 초기 치료 효과 (활성)를 연장된 기간 동안 유지하는 투여를 지칭한다. "간헐적" 투여는 중단 없이 연속적으로 주는 것이 아니라 성질상 순환적으로 치료하는 것이다.

치료 목적으로 "포유류"는 사람, 가정용 및 농장용 동물, 및 동물원용, 운동용 또는 애완용 동물 (예를 들면, 개, 고양이, 소, 말, 양, 돼지 등)을 포함하는 포유류로 분류된 임의의 동물을 지칭한다. 바람직하게는, 포유류는 사람이다.

1 이상의 추가 치료제와 "병용하여" 투여한다는 것은 동시에(수반하여) 및 임의의 순서로 연속하여 투여하는 것을 포함한다.

II.본 발명의 조성물 및 방법

헤지호그(HH)과의 단백질인 분비성 신호전달 단백질은 척추동물 및 비척추동물 (1, 2)에서 초기 배아발생 동안 다중 조직 패턴화 현상에 중요한 역할을 수행한다. 드로소필라 헤지호그 (Hh) 신호전달은 유생의 적절한 체절구성(segmentation) 및 성체 파리의 날개 및 다른 돌기의 조직화 및 성장을 위해 요구된다. 포유류 HH 단백질 과는 소닉 헤지호그(Shh), 인디안 헤지호그(Ihh), 및 데절트 헤지호그(Dhh)의 세가지 단백질을 포함한다. 이들 세 단백질들은 조직 특이적으로 발현되며, 중추신경계의 배쪽 세포형의 전문화, 좌우 비대칭의 제어, 몸분절 및 사지의 성장 및 패턴화, 연골 분화, 기관발생 및 정자발생을 포함하는 다수의 발달 과정에서 중요역할을 한다. 다수의 척추동물 HH 경로 신호전달 성분에 대한 유전자 돌연변이는 사람 암 및 발생학적 질병 (3에서 검토)과 연관되어 있으며, 따라서 이 경로가 정상 세포 성장 제어에서 중요한 역할을 함이 확실하다.

Hh 신호 도입 경로의 메카니즘은 완전히 이해되지 않았다. 그러나, 드로소필라에서의 유전적 연구는 Hh 신호전달 경로에서 특이적 성분으로서 역할하는 다양한 막통과 및 세포내 단백질 배열을 확인하였다 (3, 4, 5에서 검토). 경로는 척추동물 Gli 단백질 (8)과 상동성이 징크 핑거 전사 인자인 팔굽이 중절 (Ci) (6, 7)의 활성화에서 끝난다. Hh 신호 전도 메카니즘의 보존성은 이소적으로 발현된 제노푸스 또는 사람 Gli (hGli)가 개구리 (9) 및 생쥐 (10)에서 바닥판 특이적 마커 및 배쪽 신경 세포형의 유도에 있어서 Shh를 모방하는 능력에 의해 제안된다. 또한, 다수의 다른 경로 성분들은 진화적으로 보존되어 있다. 시클릭 AMP-의존적 단백질 키나제 (PKA)는 파리 (11, 12) 및 설치류 (13-16) 모두에서의 HH 신호전달에 있어서 통상의 부정적 조절 효과를 보인다. 유전적 분석에 의하면 Hh 하류의 신호전달을 억제하는 기능을 하는 다회 막통과 단백질 (18, 19)인 드로소필라 패치드 (17) 및 Hh 신호 도입에 절대적으로 필요한 7회 막통과 단백질 (18, 21)인 드로소필라 스무든드(Smoothened) (20)에 대한 척추동물 상동체를 확인하였다. 척추동물계로부터 얻은 생화학 데이타 및 드로소필라에서의 유전적 분석을 조합하여 HH 단백질에 대한 다중 서브유닛 수용체 복합체에서 패치드는 리간드 결합 성분이고, 스무든드는 신호유발 성분이라고 예측하였다 (20, 22-24). 더불어서, 진화적 보존에 대한 이 증거는 드로소필라 신호전달 경로의 다른 확인된 구성원들도 척추동물 대응부를 가지리라는 것을 암시한다.

드로소필라 퓨즈드 억제제 (dSu(fu))는 신규 세포질 PEST 포함 단백질 (25)이고, 야생형 배경 중에서 돌연변이되었을 때는 구조적(항상적) Hh 신호전달을 암시하는 온화한 표현형(26)을 부여한다. 게다가, 동일한 돌연변이는 Hh 신호전달 에 요구되는 세린-트레오닌 키나제 (28)인 퓨즈드(Fu) (27) 중의 돌연변이의 배아 및 성체 표현형 모두를 충분히 억제할 수 있다. dSu(fu)는 Fu 및 Ci와 물리적으로 상호작용하고 (29), Ci와의 상호작용은 이를 원형질 중에 격리하는 것에 의해서 및(또는) 활성형으로의 진행을 억제함으로써 (26) Ci를 비활성 상태로 유지한다고 가정된다. Hh 신호전달이 없을 때, 전장 Ci는 단백질가수분해로 분해되어 아미노 말단 75-kDa의 전사 억제자(repressor) 형을 생성하고 (30), 이는 아마 PKA-인산화된 Ci (23)을 F-박스(box) 함유 단백질인 Slimb (31)에 의해 유비퀴틴 (ubiquitin)-프로테아솜 (proteasome) 경로로 표적화하는 것에 의한 것이다. Hh 신호의 수신은 Fu를 활성화하고, dSu(fu)를 불활성화하며, Ci가 Hh 표적 유전자의 전사 활성화제로 전환되는 것에 이르는 하류의 현상을 유발한다고 예측된다.

HH 신호전달에서 Su(fu)의 역할에 대한 생화학적 및 기능적 인식을 더 얻기 위하여, 이 단백질의 사람 상동체를 획득하였고, 그 발현 패턴을 발달 중 및 성체에서 시험하였다. 또한, 척추동물 Gli 단백질과의 구성원 및 척추동물 Slimb 상동체를 포함하는 HH 경로 중의 다른 신호전달 성분들 및 hSu(fu) 간의 물리적 상호작용을 분석하였고, 이들 상호작용의 기능적 관련성을 확인하였다.

드로소필라 퓨즈드 억제제 (Su(fu))는 유전적 분석에 의하면 헤지호그 세그멘트 극성 경로의 음성 조절제로 기능하는 신규 468 아미노산 세포질 단백질을 코딩한다. 본원에서는 1차 구조 및 조직 분포 뿐만 아니라 척추동물 Su(fu)-사람 Su(fu)의 생화학적 및 기능적 구조를 보고한다. 본원에서 논의한 바에 의하면, 사람 Su(fu)는 예측 분자량 48 kDa 및 드로소필라 단백질과 전체 37.7% 서열 동일성 (63% 유사성)을 갖는 433 아미노산의 PEST 함유 단백질이다. 쥐 Su(fu)에 대한 메신저 RNA는 신경판, 몸분절, 고환, 장 및 피부를 포함하는 배아 헤지호그 반응성 조직에서 광범위하게 발현되었다. 성체에서는, 발현은 분열 능력을 유지한다고 알려진 고환 및 뇌 부분에서 강하게 남아있다. 사람 Su(fu) 유전자좌(locus)는 염색체 10q244-q25에 맵핑되며, 이 부분은 교모세포종(glioblastoma), 전립선암, 악성 흑색종 및 자궁내막암에서는 결손되어 있다. 사람 Su(fu)는 척추동물에서 헤지호그 신호전달을 중개하는 징크 핑거 전사 인자 Gli에 의한 전사 활성화를 억제하며, Gli, Gli2 및 Gli3와 물리적으로 상호작용하는 것으로 발견되었다. 사람 Su(fu)는 또한 파리에서 부분적으로 파리 Gli 상동체의 분해를 촉진하는 것에 의해 헤지호그 반응을 억제하는 F-박스 함유 단백질인 Slimb와 복합체를 형성한다. 더불어서, 본원에 있는 데이타 (실시예 참조)는 Su(fu)는 척추동물 헤지호그 신호전달 경로에서 중요 음성 조절제라는 가설에 대한 증거를 제공한다. 나아가서, 데이타는 Su(fu)는 Gli에 결합하는 것 및 Gli- 매개성 전사 활성화를 억제하는 것에 의해서 뿐만 아니라 Gli를 Slimb 의존성 프로테오솜성 퇴화 경로에 연결하는 어댑터 단백질로 역활하는 것에 의해 작용할 수 있음을 지적한다.

본원에서 보고하는 것은 하기 실시예에서 증명한 바와 같이 dSu(fu)와 63%유사성 및 척추동물 HH 신호전달에서의 역할과 일치하는 발생적 발현 프로파일을 나타내는 사람 단백질이다. hSu(fu)는 dSu(fu)와 함께 다수의 보존된 잠재 인산화 부위 (이 중 3개는 후보 PKA 인산화 부위임) 및 그 카르복시 말단 절반에 낮은 스코어의 PEST 도메인을 포함한다. PEST 도메인은 아스파르트산, 프롤린, 글루탐산 세린 및 트레오닌이 풍부한, 낮은 소수성 인덱스를 갖는 짧은 서열이다. 이는 짧은 (<2 h) 세포 반감기 (40)을 갖는 많은 단백질에서 발견된다. 사람 및 드로소필라 Su(fu) 단백질에서 확인된 PEST 도메인은 한계 스코어 만을 받았고 (5인 스코어가 유의적인 것으로 여겨지고, 이들은 각각 2.56 및 1.48임), 따라서 이들은 이러한 견지에서 기능적으로 관련된 것일 수 없다. FISH 분석에 의해서, hSu(fu) 유전자는 유전체 10q24-25에 맵핑되었다 (하기 실시예 참조). 흥미롭게도, 다형성 교모세포증(gliblastoma multiforme), 전립선암, 악성 흑색종 및 자궁내막암 (44-47)을 포함하는 다수의 종양에서의 이형접합 (heterozygosity; LOH) 분석의 손실에 기초한 종양 억제 유전자에 대한 2개의 유전자위가 염색체 10q24-25에 위치하는 것으로 확인되었다 (하기 실시예 참조). 이러한 견지에서, 이들 부위에 또한 위치하는 것으로 근래 기술된 다수의 암에서 돌연변이된 것이 발견되었다: 10q23.3의 MMACl/PTEN (48, 49) 및 10q25.3-26.1의 DMBTl (50) (악성 뇌종양에서는 결손됨). hSu(fu)는 활성적 세포 증식 구역에서 높게 발현되고 (실시예 및 도 3F-3J 참조), HH 신호전달의 억제제라는 발견과 함께 hSu(fu)의 염색체 위치는 hSu(fu)가 패치드와 같이 종양 억제자일 가능성이 높다는 것을 나타낸다.

제자리 혼성화 분석 (하기 실시예 참조)은 설치류 Su(fu) mRNA가 쥐 스무든드 mRNA (20; 및 데이타는 보이지 않음)를 연상시키는 발생적 발현 프로파일을 가지고 배아 조직에서 거의 광범위하게 발현된다는 것을 밝혔다. 많은 HH 반응성 조직은 Shh 반응성 배아 신경 주름 및 신경관 (1, 2), 전몸분절의 중배엽 및 몸분절 (13), 및 배아 앞창자, 식도 및 폐 (51, 52), Ihh 반응성 연골 (53), 및 Dhh 반응성 고환 (41)을 포함하는 Su(fu) mRNA를 우월하게 발현한다 (도 3D 참조). 또한, Su(fu) mRNA는 시험한 대부분의 조직에서 발생시 하강조정된 반면에, 성체 고환 및 해마 피라밋 및 과립 세포, 소뇌 과립 및 푸르킨제(Purkinje) 세포, 및 후각구 과립 세포를 포함하는 성체 뇌 내의 세포 집합에서는 유지되었으며, 이는 유사분열 활성으로 남아있거나 이러한 활성 능력을 보유하는 구역들은 지속적인 Su(fu) 발현을 요구할 수 있음을 암시한다. 성체 쥐 뇌에서는, Su(fu)의 발현은 소뇌 푸르킨제 세포에서의 Shh, 스무든드 및 패치드 mRNA와 중복된다 (도 3J) (트레이포트(Traiffort) 등, 1998). 돌연변이 패치드 유전자에 대한 생쥐 이형접합체는 소뇌 연수세포종을 발생시킨다는 사실을 알았으며, 이러한 발견은 성체 소뇌에서 Shh 신호전달의 잠재적 역할을 나타낸다. 고환 내에서는, Dhh는 발생 중인 일차 및 이차 정모세포와 밀접히 접촉된 세르톨리(Sertoli) 세포 (41)에서 발현되었다. 발생 중인 배아 세포에서의 Su(fu) mRNA의 발현은 패치드2 mRNA, 패치드와 상동성을 갖는 이차 척추동물 HH-결합 단백질 (55), 및 척추동물 Fu 상동체에 대한 mRNA (55)와 중복된다. 또한, Gli 및 Gli3 모두는 발생 중인 정원세포 (56)에서 발현되고, 더불어서 데이타는 이들 세포가 기능적 HH 신호전달 시스템을 유지하며, Su(fu)는 이 시스템의 내부적 부분임을 나타낸다. 3가지 추정 세포내 HH 신호전달단백질과 함께 Dhh 수용체의 세포 공동 구역화는 세르톨리 세포 유도성 Dhh (1)이 패치드2 수용체를 통하여 발생 중인 배아 세포에 직접 영향을 준다는 가설을 뒷받침하여 준다. Su(fu)는 성체 고환 (41, 55)에서의 패치드 유전자 발현 부위인 간질 (interstitial) 레이디히 세포에서 발견되지 않았다. Shh, Ihh 및 Dhh에 반응성인 조직에서의 Su(fu) mRNA의 존재는 동일한 신호전달 성분 및 메카니즘이 모든 포유류 HH 과 구성원에 의해 사용될 수 있음을 나타낸다.

척추동물 HH 신호전달에서 hSu(fu) 역할과 일치하여, 배양 세포에서 공동 발현된 hSu(fu) 및 hGli의 면역세포화학적 국소화는 두 개의 단백질이 서로의 내부 및 마이크로튜불 내에 공동 국소화됨을 밝혀내었다 (도 5A 및 데이타는 보이지 않음). 이러한 결과는 드로소필라 Hh 신호전달 성분들인 Ci 및 Fu의 세포 국소화와 연과되어 있고, 이들 마이크로튜불 연합은 키네신 관련된 단백질 코스탈2(Costal2) (57, 58)에 의해 매개된다. Hh의 부재시에는, 코스탈2는 신호전달 기관 (dSu(fu) 및 Ci와 복합된 Fu)를 세포골격에 붙잡아두는 것에 의하여 신호 도입을 억제한다고 여겨진다. 코스탈2에 대한 척추동물 상동체는 아직 밝혀지지 않았다.

관련된 생화학 실험 (실시예 참조)에서, hGli는 2개의 상이한 검정 시스템에서 hSu(fu)와 물리적으로 상호작용하는 것이 밝혀졌다. 먼저, hSu(fu) 및 hGli는 에피토프 태그된 hSu(fu)에 대한 항체 또는 에피토프 태그된 hGli에 대한 항체를 사용하여 공동트랜스펙션된 NIH-3T3 세포로부터 공동 면역침전 시킬 수 있었다. 두번째,³⁵S-라벨된 시험관내 해독된 hGli는 시험관내 결합 검정에서 GST-hSu(fu)퓨즈드 단백질에 특이적으로 결합함을 나타내었다 (도 5C). 이들 데이타는 드로소필라 Ci 및 dSu(fu) 간의 유사한 상호작용을 입증한 모니에르(Monnier) 등의 결과를 보완하여 준다 (29). 효모 2-하이브리드 시스템을 사용하여, 세린-트레오닌 키나제 Fu의 카르복시 말단 추정 조절 도메인은 3분자 복합체에서 dSu(fu)와 직접적으로 및 Ci와 간접적으로 상호작용함을 밝혔다 (29). 후자의 상호작용은 링커 분자로서 dSu(fu)의 존재에 의존한다. 얻어진 모델에서 Fu의 활성화는 아마도 dSu(fu)에서의 PEST 서열의 인산화 및 그 결과 dSu(fu) 분해를 통하여 dSu(fu) 및 Ci의 해리를 유발한다고 제시되었다. 내생의 Shh 수용체를 발현하는 (마리고 (Marigo) 등, 1996) 트랜스펙션된 NIH-3T3 세포로부터의 공동면역침전에 의하여, 본원에서는 (실시예 참조) Shh의 존재시 hSu(fu)-hGli상호작용이 단지 소량만 감소함이 관찰되었다. 그러나, 본원의 면역세포화학 데이타는 hSu(fu)는 핵에서 hGli와 공동 국소화될 수 있음을 나타내므로 (도 5A 참조), Gli로부터의 Su(fu)의 해리는 Shh 유도성 Gli 활성화에는 그다지 필요하지 않다. 대신, 신호 케스케이드는 Su(fu) 및(또는) Gli의 후해독 변형 (인산화)에 의해 전파될 수 있다.

징크 핑거 전사 인자의 Gli과의 2가지 추가 구성원인 Gli2 및 Gli3의 hSu(fu)와 상호작용하는 능력을 본원에서 측정하였다 (실시예 참조). 3 가지 Gli 단백질은 그들의 구별적인 발현 패턴 (59)에 의해서, 및 Gli2 및 Gli3 돌연변이 생쥐의 관찰된 표현형 (60-63)에 의해서 증명되는 바와 같이 HH-매개성 발달 과정에서 특이적이고도 과다한 하위 기능을 하는 것으로 나타났다. mGli2 및 hGli3 모두는 본원 시험관내 결합 검정에서 GST-hSu(fu) 단백질에 특이적으로 결합하는 것이발견되었다 (도 5C). 따라서, 본원 데이타는 Gli 단백질 과의 모든 구성원의 활성 조절에 있어서의 hSu(fu)의 역할을 지지하여 준다.

이전의 유전적 연구는 dSu(fu)와 Ci와의 상호작용이 Ci의 전사 활성화 형태를 억제하는 기능을 할 수 있음을 암시하며, 이러한 억제는 Hh 신호 수용에 의해 경감되는 것으로 생각된다. 본원에서는 hSu(fu)가 Gli 전사 활성화 리포터 검정에서 hGli의 활성을 억제할 수 있는지를 확인하였다 (24). hGli는 리포터 발현을 거의 100 배 활성화시키며, 이러한 유도는 hSu(fu)에 의해 극단적으로 억제된다는 것을 발견하였다 (실시예 및 도 5D 참조). 역설적으로, 공동발현되는 hGli의 부존재시 hSu(fu)는 또한 리포터 발현의 증가를 유발함을 발견하였다. 이러한 결과는 과발현된 hSu(fu)가 Gli 활성화의 내생적 음성 조절제 (예를 들면, Slimb, 코스탈2 또는 PKA)를 적정해내는 능력 (즉, 제거하는)을 나타낸다. 이러한 설명은 세포 반응을 측정하는데 Hh 신호 도입 캐스메이드에서 Ci 및 dSu(fu) 간의 화학량론적 비율의 중요성을 증명하는 드로소필라 유전학 (26)으로부터 도출된 증거에 의해 뒷받침된다.

hSu(fu)는 Gli 과 구성원 외에 그 자신과도 결합하고, Slimb의 척추동물 상동체도 결합하는 것으로 발견되었다 (도 5C). 자기자신과의 상호작용은 효모 2-하이브리드 스크린에서 독립적으로 확인되었고, 여기서 사람 고환 라이브러리에서 얻은 hSu(fu)는 미끼(bait)로 사용된 전장 hSu(fu) 단백질과의 상호작용 파트너로 단리되엇다 (데이타 도시 안함). 관련된 공동면역침전 실험에서, mSlimb는 또한 hGli와의 물리적 복합체로 발견되었다. 이러한 상호작용은 내생 hSu(fu)를 링커단백질로 사용하는 간접적인 것일 수 있다. HIV-1 단백질 Vpu는 사람 Slimb의 명백히 별도로 스플라이싱된 형태인 βTrCP (33) 및 CD4 (34)를 유사한 방식으로 연결하는 것으로 나타났다. hSu(fu)의 이량체화는 Su(fu)가 다른 효과기(effector) 단백질과 함께 묶여서 Gli 활성을 조절하도록 해주는 반면에, Slimb와의 상호작용은 Su(fu)가 Gli 분해를 제어할 수 있게 한다.

Slimb는 각각 E2 유비퀴틴 접합 단백질 분해 복합체 (34, 65)의 성분에 대한 결합 부위로서 및 단백질-단백질 상호작용 부위 (64)로서 작용하는, F-박스 및 수 개의 WD-40 반복 도메인 (64-66)을 포함한다. 드로소필라에서, Slimb 기능의 상실은 활성 Hh 신호전달의 효과를 나타내는 완전한 Ci (26, 31)의 세포 자동 축적을 일으킨다. 또한, 2개의 Hh 반응성 유전자인 드로소필라 TGFβ 상동체 디세펜타플레직 (decepentaplegic; dpp) 및 Wnt 과 구성원 윙리스 (wingless; wg) 모두는 이러한 돌연변이체의 전-후 축(anterial-posterial axis)에서 이소적으로 발현된다. 이들 데이타는 함께 Slimb는 정상적으로 Ci/Gli의 분해(degradation)를 촉진함으로 리간드 부존재시 Hh 신호전달을 억제하는 기능을 할 수 있음을 암시한다. 본원의 발견은 hSu(fu) 및(또는) hGli 세포내 활성의 조절에서 척추동물 Slimb의 잠재적 관여와 일치한다. 그러나, 이러한 견지에서의 Slimb의 정확한 역할은 추후 규정되도록 남아있다. Ci와 달리 Gli 활성화제/억제제 기능의 조절에서 단백질가수분해의 역할은 보고된 바 없다. 윤(Yoon) 및 동료들 (67)은 Gli가 전사 억제제로 전환될 수 있는 조건을 찾을 수 없었다. 본 발명자들은 배양된 세포에서 과발현된 hGli의 상이한 카르복시 말단 절단된 분할 생성물을 관찰하였으나 (데이타 도시 안함), 이러한 분할 생성물이 Shh에 의해 조절되는지는 증명하지 못하였다. 비록 매우 그러할 것 같지는 않으나, 부분적으로 Slimb/Gli/Su(fu) 상호작용이 Gli 및 Su(fu)의 정상 상태 수준을 유지하는 기능을 하고 HH 신호전달에는 직접 관여하지 않을 수 있다.

요컨대, 본원에서 Gli 활성화 검정 결과와 관련하여 hSu(fu) 및 Gli 과 구성원 간에 증명된 생화학적 상호작용은 드로소필라에서의 유전적 연구를 보충하고, Su(fu)가 Gli의 직접적 음성 조절제임을 나타낸다. 이들 연구는 HH 과 구성원에 대한 세포 반응을 결정하는데 있어서, 상이한 신호전달 성분들의 상대적인 세포내 농도의 중요성을 더욱 강조해준다. 이들 결과 및 공지된 종양 억제제 유전자위에 대한 hSu(fu)의 염색체 좌위에 비추어 볼 때, hSu(fu)에서의 돌연변이는 종양발생에서 일정 역할을 할 것 같다. 본원의 발견은 드로소필라에서 사람까지 Hh 신호전달 성분 및 메카니즘의 (일부 주목할만한 차이점을 가진) 보존성으로 확대된다.

A.전장 hSu(fu) 폴리펩티드

본 발명은 본원 명세서에서 hSu(fu) (UNQ650)으로 지칭하는 폴리펩티드를 코딩하는 신규 확인 및 단리된 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 특히, hSu(fu) 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 하기 실시예에 부연하여 개시한 바와 같이 확인하고 단리하였다. 별개의 발현 주기에서 생성된 단백질은 다른 PRO 번호를 줄 수 있으나, UNQ 번호는 임의의 주어진 DNA 및 그 코딩 단백질에 대하여 유일하여, 변하지 않는다는 것에 주목한다. 그러나, 간단하게 본원 명세서에서는 hSu((fu)의 상기 정의에 포함되는 모든 추가의 천연 상동체 및 변형체 뿐만 아니라 DNA33455-1548에 의해 코딩되는 단백질은 그 출처 및 제조 방식을 고려함이 없이 "hSu(fu)"라고 지칭한다.

WU-BLAST2 서열 정렬 컴퓨터 프로그램을 사용하여, 전장 천연 서열 hSu(fu)의 일부가 (도 2 및 서열 확인 번호 2에 나타냄) 드로소필라 멜라노가스터 (S55695)로부터 얻은 퓨즈드 단백질의 억제제의 사람 상동체의 일부와 약 39% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 따라서, 본원에서 개시된 hSu(fu)는 헤지호그 신호전달 경로 단백질 과의 신규 동정 구성원이고, 드로소필라 퓨즈드 단백질의 전형적인 폴리펩티드 억제제 활성을 가질 수 있다.

B.hSu(fu) 변형체

본원에 기술한 전장 천연 서열 hSu(fu) 폴리펩티드 외에도, hSu(fu) 변형체를 제조할 수 있다. hSu(fu) 변형체는 hSu(fu) DNA에 적합한 뉴클레오티드 변화를 도입하는 것에 의해서 및(또는) 목적 hSu(fu) 폴리펩티드의 합성에 의해 제조할 수 있다. 당업계의 숙련자들은 아미노산 변화가 글리코실화 부위의 수 또는 위치의 변화 또는 막부착 특성들을 바꾸는 것과 같은 hSu(fu)의 해독후 프로세스를 바꿀 수 있음을 이해할 것이다.

천연 전장 서열 hSu(fu)에서 또는 본원에 기술한 hSu(fu)의 다양한 도메인에서의 다양화는 예를 들면, 보존적 및 비보존적 돌연 변이 (예를 들면, 미국 특허 제5,364,934호에 설명된 것)에 대한 임의의 기술 또는 지침을 사용하여 만들 수 있다. 다양화는 천연 서열 hSu(fu)와 비교하여 hSu(fu)의 아미노산 서열을 변화시키는 결과가 되는 hSu(fu)를 코딩하는 1 이상의 코돈의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다. 임의로, 다양화는 hSu(fu)의 1 이상의 도메인에서의 임의의 다른 아미노산으로 1 이상의 아미노산의 치환에 의한 것이다. 목적 활성에 불리한 영향 없이 어떠한 아미노산 잔기가 삽입, 치환 또는 결실될 수 있는지를 결정하는 지침은 hSu(fu) 서열을 상동적인 공지의 단백질 분자의 것과 비교하는 것 및 높은 상동성 구역에 변화시킨 아미노산 서열 수를 최소화하는 것에 의해 발견할 수 있다. 아미노산 치환은 류신을 세린으로 대체하는 것과 같이 (즉, 보존적 아미노산 대체) 유사한 구조 및(또는) 화학적 성질을 갖는 다른 아미노산으로 1 아미노산을 대체하는 결과일 수 있다. 삽입 또는 결실은 임의로 1 내지 5 아미노산 범위 내일 수 있다. 허용된 다양화는 서열 중의 아미노산을 계통적으로 삽입, 결실 또는 치환을 일으키고 얻어진 변형체를 전장 또는 성숙 천연 서열에 의해 나타나는 활성에 대하여 시험하는 것에 의해 결정할 수 있다.

변형체는 올리고뉴클레오티드-매개성 (위치-특정성(site-directed)) 돌연변이발생, 알라닌 스캐닝 및 PCR 돌연변이발생과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 만들 수 있다. 위치 특정성 돌연변이발생 [카터(Carter) 등, Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); 졸러(Zoller) 등, Nucl. Acids Res., 10:6487(1987)], 카세트 돌연변이발생 [웰스(Wells) 등, Gene, 34:315(1985)], 제한 선택 돌연변이발생 [웰스(Wells) 등, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415(1986)] 또는 다른 공지의 기술을 클로닝된 DNA에 사용하여 hSu(fu) 변형체 DNA를 제조할 수 있다.

스캐닝 아미노산 분석은 또한 인접 서열을 따라서 1 이상의 아미노산을 확인하는데 응용할 수 있다. 이 중에서 바람직한 스캐닝 아미노산은 상대적으로 작은 중성 아미노산이다. 이러한 아미노산은 알라닌, 글리신, 세린 및 시스틴이다. 알라닌은 베타 탄소 이외는 측쇄를 제거되었으며, 변형체의 주요쇄(main-chain) 형태를 덜 변화시는 것이므로 이들 군 중에서 전형적으로 바람직한 스캐닝 아미노산이다 [커닝햄(Cunnigham) 및 웰스(Wells), Science, 244:1081-1085 (1989)]. 알라닌 또한 가장 흔한 아미노산이므로 전형적으로 바람직하다. 게다가, 이는 숨겨진(buried) 위치 및 노출된 위치 모두에서 종종 발견된다 [크레이톤(Creighton), The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); 코티아 (Chothia), J.Mol.Biol., 150:1 (1976)]. 알라닌 치환이 적당한 양의 변형체를 야기하지 못한다면, 동등효과(isoteric) 아미노산을 사용할 수 있다.

C.hSu(fu)의 개질

hSu(fu)의 공유적 개질(covalent modification)은 본 발명의 범위에 포함된다. 한 가지 유형의 공유적 개질은 hSu(fu)의 선별 측쇄 또는 N- 또는 C- 말단 잔기와 반응 할 수 있는 유기성 유도 제제와 hSu(fu) 폴리펩티드의 목표 아미노산 잔기를 반응시키는 것을 포함한다. 이기능성(bifunctional) 제제와의 유도화는 예를 들면, 항-hSu(fu) 항체를 정제하는 방법에서 사용하기 위하여 수불용성 지지 매트릭스 또는 표면에 hSu(fu)를 교차결합시키는 것 및 그 역의 경우 유용하다. 통상적으로 사용되는 교차결합제는 예를 들면, 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드 에스테르 (예를 들면, 4-아지도살리실산과의 에스테르), 호모이기능성 이미도에스테르 (3,3'-디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)와 같은 디숙신이미딜 에스테르를 포함함), 이기능성 말레이미드 (예를 들면, 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄) 및 메틸-3-[(p-아지도페닐)디티오]프로피오이미데이트와 같은 제제를 들 수 있다.

다른 개질은 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기를 각각 상응하는 글루타밀 및 아스파틸 잔기로 탈이미드화, 프롤린 및 리신의 히드록시화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록시기의 인산화, 리신, 아르기닌 및 히스티딘 잔기의 α-아미노기의 메틸화 [티.디.크레이톤(T.E. Creighton), Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)], N-말단 아민의 아세틸화 및 임의의 C-말단 카르복실기의 아미드화를 포함한다.

hSu(fu) 폴리펩티드의 다른 유형의 공유 개질은 본 발명의 범위 내에 있으며, 폴리펩티드의 천연 글리코실화 패턴을 바꾸는 것을 포함한다. "천연 글리코실화 패턴을 바꾸는 것"은 본원에서 천연 서열 hSu(fu)에서 발견되는 1 이상의 탄수화물 부분을 결실시키는 것 (잠재적 글리코실화 부위를 제거하는 것에 의해서 또는 화학적 및 (또는) 효소적 방법에 의해 글리코실화를 제거하는 것에 의해서) 및(또는) 천연 서열 hSu(fu)에 존재하지 않는 1 이상의 글리코실화 부위를 첨가하는 것을 의미할 목적을 의도한다. 게다가, 위 문구는 성질상 및 존재하는 다양한 탄수화물 부분의 비율의 변화를 포함하는 천연 단백질의 글리코실화에서의 정성적 변화를 포함한다.

hSu(fu) 폴리펩티드에 글리코실화 부위를 첨가하는 것은 아미노산 서열을 바꾸는 것에 의해 달성할 수 있다. 변경은 예를들면, 천연 서열 hSu(fu)에 (O-결합된 글리코실화 부위에 대하여) 1 이상의 세린 또는 트레오닌의 첨가 또는 치환에 의해 일으킬 수 있다. hSu(fu) 아미노산 서열은 DNA 수준에서의 변화를 통하여, 구체적으로는 목적 아미노산으로 해독될 수 있는 코돈을 생성하는 것과 같이 미리 선택된 염기에서 hSu(fu) 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 돌연변이시키는 것에 의해 임의로 변경될 수 있다.

hSu(fu) 폴리펩티드 상의 탄수화물 부분의 수를 증가시키는 다른 방법은 글리코시드를 화학적 또는 효소적 커플링하는 것에 의해서이다. 이러한 방법은 당업계, 예를 들면 국제특허공개 WO 제87/05330호 (1987년 11월 11일 공개) 및 아플린(Aplin) 및 리스턴(Wriston)의 문헌[CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)]에 기술되어 있다.

hSu(fu) 폴리펩티드 상에 존재하는 탄수화물 부분을 제거하는 것은 화학적으로 또는 효소적으로, 또는 글리코실화의 표적으로 작용하는 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈의 돌연변이적 치환에 의해 수행할 수 있다. 화학적 탈글리코실화 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면 하키무딘(Hakimuddin) 등의 문헌[Arch. Biochem. Biophys., 259:52(1987)] 및 에지(Edge) 등의 문헌[Anal. Biochem., 118:131(1981)]에 기술되어 있다. 폴리펩티드 상의 탄수화물 부분의 효소적 분절은 토타쿠라(Thotakura) 등이 문헌[Meth. Enzymol., 138:350(1987)]에 기술한 바와 같이 다양한 엔도- 및 엑소-글리코시다제를 사용하는 것에 의해 달성할 수 있다.

hSu(fu)의 다른 유형의 공유 개질은 hSu(fu) 폴리펩티드를 다양한 비단백질성 폴리머 중 하나 (예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌)를 미국 특허 제4,640,835호, 제4,496,689호, 제4,301,144호, 제4,670,417호 제4,791,192호 또는 제4,179,337호에 나와 있는 방법으로 결합시키는 것을 포함한다.

본 발명의 hSu(fu)는 다른 것에 융합된 hSu(fu), 이종성 폴리펩티드 또는 아미노산 서열을 포함하는 키메라 분자를 형성하는 방법으로 또한 개질할 수 있다.

한 실시태양에서, 이러한 키메라 분자는 hSu(fu)를 항-태그 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 에피토프를 제공하는 태그 폴리펩티드와 융합하는 것을 포함한다. 에피토프 태그는 일반적으로 hSu(fu)의 아미노- 또는 카르복시-말단에 위치한다. 이러한 에피토프-태그된 형태의 hSu(fu)의 존재는 태그 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 검출할 수 있다. 또한, 에피토프 태그를 제공하는 것은 hSu(fu)가 항-태그 항체를 사용하는 치환성 정제 또는 에피토프태그에 결합하는 다른 유형의 친화성 매트릭스에 의해 쉽게 정제하는 것을 가능하게 한다. 다양한 태그 폴리펩티드 및 그들 각각의 항체는 당업계에 공지되어 있다. 이들의 예로는 폴리-히스티딘(poly-his) 또는 폴리-히스티딘-글리신(poly-his-gly) 태그; 플루(flu) HA 태그 폴리펩티드 및 그 항체 12CA5 [필드(Field) 등, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1998)]; c-myc 태그 및 이에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체[에반(Evan) 등, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616(1985)] 및 헤르페스 심플렉스 바이러스 당단백질 D (gD) 태그 및 그 항체[파보르스키(Paborsky) 등, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]을 들 수 있다. 다른 태그 폴리펩티드로는 플래그(Flag)-펩티드 [홉(Hopp) 등, BioTechnology, 6:1204-1210 (1998)]; KT3 에피토프 펩티드 [마틴(Martin) 등, Science, 255:192-194 (1992)]; α-튜불린 에피토프 펩티드 [스키너(Skinner) 등, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)] 및 T7 유전자 10 단백질 펩티드 태그 [Lutz-Freyermuth 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)]을 들 수 있다.

별도 실시태양에서, 키메라 분자는 hSu(fu)는 면역글로불린 또는 면역글로불린의 특정 구역과의 융합을 포함할 수 있다. 키메라 분자 (또한 "면역어드헤신"으로 지칭됨)의 2가 형태에 대해서는, 이러한 융합은 IgG 분자의 Fc 구역에 대한 것일 수 있다. Ig 융합은 바람직하게는 Ig 분자 내의 1 이상의 가변 구역 대신에 수용성 (막통과 도메인이 결실 또는 불활성화된) 형태의 hSu(fu) 폴리펩티드의 치환을 포함한다. 특히 바람직한 실시태양에서, 면역글로불린 융합은 IgG1 분자의 힌지(hinge), CH2 및 CH3, 또는 힌지, CH1, CH2 및 CH3 구역을 포함한다. 면역글로불린 융합의 제조에 대해서는 또한 미국 특허 제5,428,130호 (1995년 6월 27일 공고)를 참조.

D. hSu(fu)의 제조

하기 기술은 일차적으로 핵산을 포함하는 벡터로 트랜스펙션 또는 형질전환된 세포를 배양하는 것에 의해 hSu(fu)를 제조하는 것에 관한 것이다. 물론 당업계에 공지된 별법을 적용하여 hSu(fu)를 제조할 수 있음이 의도된다. 예를 들면, hSu(fu) 서열 또는 그 일부는 고체상 기술을 사용하는 직접 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다 [예를 들면, 스튜어트(Stewart) 등, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); 메티필드(Merrifield), J.Am.Chem.Soc., 85:2149-2154 (1963) 참조]. 시험관내 단백질 합성은 수동적 기술을 사용하여 또는 자동화법에 의하여 행할 수 있다. 자동화된 합성은 예를 들면 제조자의 지시문을 사용하는 어플라이드 바이오시스템 펩티드 합성기 (Foster City, CA)를 사용하여 이룰 수 있다. hSu(fu)의 다양한 부분은 전장 hSu(fu)를 제조하는 화학적 또는 효소적 방법을 사용하여 개별적으로 또는 연합하여 화학적으로 합성할 수 있다.

1.hSu(fu)를 코딩하는 DNA의 단리

hSu(fu)를 코딩하는 DNA는 hSu(fu) mRNA를 지니고, 이를 검출가능한 수준에서 발현한다고 여겨지는 조직으로부터 제조한 cDNA 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 따라서, 사람 hSu(fu) DNA는 실시예에 기술한 바와 같이 사람 조직으로부터 제조한 cDNA 라이브러리로부터 용이하게 얻을 수 있다. hSu(fu) 코딩 유전자는 또한 유전체 라이브러리로부터 또는 올리고뉴클레오티드 합성에 의하여 얻을 수 있다.

라이브러리는 관심있는 유전자 또는 이에 의해 코딩되는 단백질을 확인하기 위해 고안된 탐침( hSu(fu)에 대한 항체 또는 적어도 약 20-80개의 염기의 올리고뉴클레오티드)으로 스크리닝할 수 있다. 선택한 탐침으로 cDNA 또는 유전체 라이브로러리를 스크리닝하는 것은 삼브룩(Sambrook) 등의 문헌[Molecular Cloning:A Laboratory Manual (New York:Cold Spring harbor Laboratory press, 1989)]에 기술된 바와 같이 표준 방법을 사용하여 행할 수 있다. hSu(fu)를 코딩하는 유전자를 단리하는 별도 방법은 PCR 방법론을 사용하는 것이다 [삼브룩 등의 상기 문헌; 디펜바흐(Dieffenbach) 등, PCR Primer:A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].

하기 실시예는 cDNA 하이브러리를 스크리닝하는 기술을 설명한다. 탐침으로 선택한 올리고뉴클레오티드 서열은 충분한 길이 및 허위 양성을 최소화하는 충분한 명백성을 가져야만 한다. 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 스크리닝하는 라이브러리에서 DNA에 대한 혼성화에 따라 검출할 수 있도록 라벨링된다. 라벨링 방법은 당업계에 공지되어 있으며,³²P-라벨된 ATP과 같은 방사선 라벨을 사용하는 것, 비오틴화 또는 효소 라벨링을 포함한다. 보통 엄격도 및 높은 엄격도를 포함하는 혼성화 조건은 삼브룩 등의 상기 문헌에 제공되어 있다.

이러한 라이브러리 스크리닝 방법에서 확인된 서열은 기탁된 것 및 진뱅크와 같은 공중 데이타베이스 또는 다른 사설 서열 데이타베이스에서 입수가능한 다른 공지 서열과 비교 및 정렬할 수 있다. 분자의 한정된 부분 내 또는 전장 서열에 걸친 서열 동일성 (아미노산 또는 뉴클레오티드 수준에서)은 상동성을 측정하기 위해 다양한 알고리즘을 적용하는 ALIGN, DNAstar, BLAST, BLAST2 및 INHERIT와 같은 컴퓨터 소프트웨어 프로그램을 사용한 서열 정렬을 통하여 측정할 수 있다.

단백질 코딩 서열을 갖는 핵산은 첫번째로 본원에 개시된 추측 아미노산 서열을 사용하여 선택한 cDNA 또는 유전체 라이브러리를 스크리닝하는 것에 의해서 및, 필요한 경우 cDNA로 역전사될 수 없는 mRNA의 처리 중간체 및 전구체를 탐지하는 삼브룩 등의 상기 문헌에 기술된 통상의 프라이머 확장 과정을 사용하여 얻을 수 있다.

2.숙주 세포의 선택 및 형질전환

숙주 세포는 hSu(fu) 제조용의 본원에 기술한 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환 또는 트랜스펙션하며, 프로모터 유도, 형질전환체 선택 또는 원하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭하는데 적합하도록 개질된 통상의 영양 배지에서 배양한다. 배지, 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 과도한 실험을 행하지 않고도 당업계의 숙련자들에 의해 선택될 수 있다. 일반적으로, 세포 배양의 생산성을 극대화하기 위한 이론, 프로토콜 및 실제 기술은 문헌[Mammalian Cell Biotechnology:a Practical Approach, M.Butler, ed. (IRL Press, 1991)] 및 삼브룩 등의 상기 문헌에서 발견할 수 있다.

트랜스펙션 방법은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자들에게 공지되어 있다 (예를 들면, CaPO₄및 일렉트로포레이션(electroporation)). 사용하는 숙주 세포에 따라서 형질전환은 이 세포에 적합한 표준 기술을 사용하여 수행한다. 삼브룩 등의 상기 문헌에 기술된 바와 같은 칼슘 클로라이드를 사용하는 칼슘 처리법 또는 일렉트로포레이션은 일반적으로 실질적인 세포벽 장막을 함유하는 다른 세포 또는원핵세포에 대해 사용된다. 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)로 감염시키는 것은 쇼(Shaw) 등의 문헌[Gene, 23:315 (1983)] 및 국제특허공개 WO 제89/05859호 (1989년 6월 29일 공개)에 기술된 바와 같이 특정 식물 세포의 형질전환에 사용된다. 세포벽이 없는 포유류 세포에 대해서는, 그라함(Graham) 및 반 데어 에브(van der Eb)의 [Virology, 42:456-457 (1978)]의 칼슘 포스페이트 침전법을 사용할 수 있다. 포유류 세포 숙주 시스템 형질전환의 일반적인 사항은 미국 특허 제4,399,216호에 기술되어 있다. 효모로의 형질전환은 반 소린겐(Van Solinge) 등 [J.Bact., 130:946 (1997)] 및 히시아오(Hsiao) 등 [Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979)]의 방법에 따라서 전형적으로 수행할 수 있다. 그러나, 핵 마이크로주사, 일렉트로포레이션, 비손상 세포와의 세균 원형질체 융합 또는 폴리양이온 (예를 들면, 폴리브렌, 폴리오르니틴)에 의한 것과 같은 DNA를 세포에 도입하는 다른 방법 또한 사용할 수 있다. 포유류 세포를 형질전환하는 다양한 기술에 대해서는 권(Keown) 등의 문헌[Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)] 및 만소우(Mansour) 등의 문헌[Narure, 336:348-352 (1988)]을 참조.

본원에서 벡터 중의 DNA를 클로닝 또는 발현하기 적합한 숙주 세포는 원핵세포, 효모 또는 고등 진핵 세포를 포함한다. 적합한 원핵세포는 그람 음성 또는 그람 양성 유기체 (예를 들면, 이. 콜라이(E. coli)와 같은 장내세균 (Enterobacteriaceae))와 같은 진정세균(eubacteria)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다양한 이. 콜라이 균주는 이. 콜라이 K12 균주 MM294 (ATCC 31,446),이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537), 이. 콜라이 균주 W3110 (ATCC 27,325) 및 K5 772 (ATCC 53,635)와 같이 공개적으로 입수가능하다.

원핵세포 외에도, 필라멘트성 곰팡이 또는 효모와 같은 진핵 미생물이 hSu(fu)를 코딩하는 벡터를 적당하게 클로닝 또는 발현한다. 사카로마이세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae)가 통상적으로 사용되는 하급 진핵 숙주 미생물이다.

글리코실화된 hSu(fu)에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래한다. 비척추동물 세포의 예로는 식물 세포 뿐만 아니라 드로소필라 S2 및 스포도프테라(Spodoptera) Sf9와 같은 곤충 세포를 포함한다. 유용한 포유류 숙주 세포계 (cell line)의 예로는 중국 햄스터 난소 (Chinese haster ovary: CHO) 및 COS 세포를 들 수 있다. 보다 구체적인 예로는 SV40에 의해 형절전환된 원숭이 신장 CV1 계 (COS-7, ATCC CRL 1651), 사람 배아 신장계 (현탁 배양에서의 성장용으로 서브클로닝된 293 또는 293 세포, 그라함(Graham) 등, J. Gen Virol., 36:59 (1977)), 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)), 생쥐 세르톨리 세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23;243-251 (1980)), 사람 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75), 사람 간 세포 (Hep G2, HB 8065), 및 사람 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51)를 들 수 있다. 적합한 숙주 세포를 선택하는 것은 당업계의 기술 범위 내에 있는 것으로 생각된다.

3.복제가능한 벡터의 선택 및 사용

hSu(fu)를 코딩하는 핵산 (예를 들면, cDNA 또는 유전체 DNA)는 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현용 복제가능한 벡터 내에 삽입할 수 있다. 다양한 벡터를 공개적으로 입수가능하다. 벡터는 예를 들면, 플라스미드, 코스미드(cosmid), 바이러스성 입자(viral particle) 또는 파지(phage) 형태로 있을 수 있다. 적합한 핵산 서열은 다양한 방법에 의해 벡터 내로 삽입할 수 있다. 일반적으로, DNA는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 적합한 제한 엔도뉴클레아제 부위(들)에 삽입한다. 벡터 성분은 일반적으로 1 이상의 신호 서열, 1 개의 복제 기원(origin of replication), 1 이상의 마커(marker) 유전자, 1 개의 인핸서 요소, 1 개의 프로모터, 및 1 개의 전자 종결 서열을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 1 이상의 이들 성분을 포함하는 적합한 벡터 구성은 당업계의 숙련자들에게 공지된 표준 리게이션(ligation) 기술을 이용한다.

hSu(fu)는 직접적으로 뿐만 아니라 완전한 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 분절 부위를 갖는 다른 폴리펩티드 또는 신호 서열일 수 있는 이종성 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 재조합적으로 제조할 수 있다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 성분일 수 있거나, 벡터에 삽입되는 hSu(fu)를 코딩하는 DNA의 부분일 수 있다. 신호 서열은 예를 들면, 알칼리성 포스파타제, 페니실린아제, lpp 또는 열 안정성 장내독소 II 리더의 군으로부터 선택되는 원핵세포 신호 서열일 수 있다. 효모 분비물에 대해서, 신호 서열은 예를 들면, 효모 인버타제(invertase) 리더, 알파 인자 리더 (사카로마이세스 및 클루이베로마이세스(Kluyveromyces)-인자 리더를 포함하며, 후자의 것은 미국 특허 제5,010,182호에기술되어 있음) 또는 산 포스파타제 리더, 씨. 알비칸스(C. albicans) 글루코아밀라제 리더 (EP 362,179, 1990년 4월 4일 공고) 또는 국제특허공개 WO 제90/13646호 (1990년 11월 15일 공개)에 기술된 신호일 수 있다. 포유류 세포 발현에서는, 포유류 신호 서열은 동일 또는 관련 종의 분비 폴리펩티드로부터 얻은 신호 서열 뿐만 아니라 바이러스 분비성 리더와 같은 단백질의 직접 분비에 사용될 수 있다.

발현 및 클로닝 벡터 모두는 벡터가 1 이상의 선택된 숙주 세포에서 복제되는 것을 가능하게 해주는 핵산 서열을 포함한다. 이러한 서열은 다양한 세균, 효모 및 바이러스에 대해 공지되어 있다. 플라스미 pBR332에서 유래한 복제 기원은 대부분의 그람 음성 세균에 적당하고, 2 μ플라스미드 기원은 효모에 적당하며, 다양한 바이러스 기원 (SV40, 폴리오마(polyoma), 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)는 포유류 세포에서의 클로닝 벡터에 적합하다.

발현 및 클로닝 벡터는 전형적으로 선택 마커로도 불리는 선택 유전자를 포함할 수 있다. 전형적 선택 유전자는 (a) 항생물질 또는 다른 독소 (예를 들면, 암피실린, 네오마이신, 메톡트렉세이트 또는 테트라사이클린)에 대한 저항성을 부여하는 것, (b) 보충 영양요구성 결손, 또는 (c) 복합 배지로부터 얻을 수 없는 임계 영양분을 공급하는 것 (예를 들면, 바실라이(Bacilli)에 대한 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자)인 단백질을 코딩한다.

포유류 세포에 대한 적합한 선택가능한 마커의 예는 DHFR 또는 티미딘 키나제와 같이 세포 성분을 확인하여 hSu(fu)를 코딩하는 핵산을 집어내는 것을 가능하게 하는 것들이다. 야생형 DHFR을 적용할 때 적합한 숙주 세포는 우라브(Urlaub)등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)]에 기술된 바와 같이 제조 및 전파된 DHFR 활성이 결손된 CHO 세포계이다. 효모에 사용하기 적당한 선택 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]. trp1 유전자는 트립토판에서 성장하는 능력을 결한 효모의 돌연변이 균주 (예를 들면, ATCC No. 44076 또는 PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)])에 대한 선택 마커를 제공한다.

발현 및 클로닝 벡터는 보통 직접 mRNA를 합성하는 hSu(fu)를 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 다양한 잠재적 숙주 세포에 의해 인식되는 프로모터는 공지되어 있다. 원핵 숙주와 사용하기 적당한 프로모터로는 락타마제 및 락토스 프로모터 시스템 [장(Chang) 등, Nature 275:615 (1978); 고에델(Goeddel) 등, Nature, 281:544 (1979)], 알칼리성 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 [고에델, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776], 및 tac 프로모터와 같은 하이브리드 프로모터 [드보어(deBoer) 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)]을 들 수 있다. 세균 시스템에서 사용되는 프로모터는 또한 hSu(fu)를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노(Shine-Dalgarno: S.D.) 서열을 포함할 수 있다.

효모 숙주와 사용하기 적당한 프로모터 서열의 예로는 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로지나제, 헥소키나제, 피루베이트 디카르복실라제,포스포프룩토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오세포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글로코키나제와 같은 3-포스포글리세레이트 키나제 [히체만(Hitzeman) 등, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] 또는 다른 해당 효소 [헤스(Hess) 등, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); 홀란드(Holland), Biochemistry, 17:4900 (1978)]을 들 수 있다.

성장 조건에 의해 제어되는 추가 전사 잇점을 갖는 유도가능한 프로모터인 다른 효모 프로모터는 알콜 탈수소효소 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 연관된 분해가능한 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소, 및 말토스 및 갈락토스가 활용되게 하는 프로모터 구역이다. 효모 발현에 사용하기 적당한 벡터 및 프로모터는 유럽 특허 EP 제73,657호에 더 기술되어 있다.

포유류 숙주 세포에서의 벡터로부터의 hSu(fu) 전사는 예를 들면, 폴리오마(polyoma) 바이러스, 파울폭스(fowlpox) 박스 (1989년 7월 5일 공고된 UK 제2,211,504호), 아데노바이러스 (예를 들면, 아데노바이러스 2), 소 파필로마 바이러스, 조류 종양 바이러스(avian sarcoma virus), 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 시미안(Simian) 바이러스 40 (SV40)로부터 얻은 프로모터에 의해서, 이종성 포유류 프로모터 (에를 들면, 악틴(actin) 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터)으로부터, 및 열쇼크(heat-shock) 프로모터 (이들 프로모터는 숙주 세포 시스템과 양립하도록 제공됨)로부터 제어된다.

고등 진핵세포에 의한 hSu(fu)를 코딩하는 DNA의 전사는 인핸서 서열을 벡터에 삽입함으로 증가시킬 수 있다. 인핸서는 프로모터 상에 작용하여 그 전사를 증가시키는 보통 약 10 내지 300 bp의 DNA의 시스-작용성 요소이다. 많은 인핸서 서열은 현재 포유류 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, 페토단백질, 및 인슐린)에서 공지되어 있다. 그러나, 전형적으로 진핵세포 바이러스에서의 인핸서를 사용할 수 있다. 예로는 복제 기원의 말단 부위 (bp 100-270) 상의 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 프로모터 인핸서, 복제 기원의 말단 부위 상의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를 들 수 있다. 인핸서는 hSu(fu) 코딩 서열에 대해 5' 또는 3' 위치에서 벡터내로 스플라이싱될 수 있으나, 프로모터로부터 5' 부위에 바람직하게 위치한다.

진핵 숙주 세포 (효모, 곰팡이, 곤충, 식물, 동물, 사람 또는 다른 다세포 유기체 유래의 핵이 있는 세포)에 사용되는 발현 벡터는 또한 전사를 종결하기 위하고, mRNA를 안정화하기 위해 필요한 서열을 포함할 수 있다. 이러한 서열은 진핵세포 또는 바이러스 DNAs 또는 cDNAs의 비해독 구역의 5', 및 때로는 3'에서 통상 얻을 수 있다. 이들 구역은 hSu(fu)를 코딩하는 mRNA의 비해독 부분 중의 폴리아데닐화된 단편으로 전사된 뉴클레오티드 조각을 포함한다.

재조합 척추동물 세포 배양에서의 hSu(fu) 합성에 적용하기 적당한 또 다른 방법, 벡터, 및 숙주 세포는 게팅(Gething) 등의 문헌[Nature, 293:620-625 (1981)], 만테이(Mantei) 등의 문헌[Nature, 281:40-46 (1979)], EP 제117,060호 및 EP 제117,058호에 기술되어 있다.

4.유전자 증폭/발현 탐지

유전자 증폭 및(또는) 발현은 샘플 중에서 예를 들면, mRNA의 전사를 정량화하는 통상의 서던 블롯(Southern blotting), 노던 블롯(Northern blotting) [토마스(Thomas), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], 도트 블롯 (DNA 분석), 또는 본원에서 제공하는 서열에 기초하여 적합한 라벨된 탐침을 사용하는 제자리 혼성화법에 의해 직접 측정할 수 있다. 별법으로, DNA 듀플렉스(duplexe), RNA 듀플렉스, 및 DNA-RNA 하이브리드 듀플레스 또는 DNA-단백질 듀플렉스를 포함하는 특정 듀플렉스를 인식할 수 있는 항체를 이용할 수 있다. 항체를 차례로 라벨링할 수 있으며, 듀플렉스가 표면에 결합되도록 검정을 행할 수 있으며, 듀플렉스가 표면 상에 형성됨에 따라서 듀플렉스에 결합된 항체의 존재를 탐지할 수 있다.

별법으로, 면역학적 방법 (예를 들면, 세포 또는 조직 구역의 면역세포화학적 염색, 및 세포 배양물 또는 인체액의 검정)에 의하여 유전자 발현을 측정하여 유전자 생성물의 발현을 직접 정량화할 수 있다. 면역세포화학적 염색 및(또는) 시료 체액의 검정에 유용한 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있으며, 임의의 포유류에서 제조할 수 있다. 편리하게는, 항체는 천연 서열 hSu(fu) 폴리펩티드에 대하여 또는 본원에서 제공하는 DNA 서열에 기초한 합성 펩티드에 대하여, 또는 hSu(fu) DNA에 융합되고 특정 항체 에피토프를 코딩하는 외인성 서열에 대하여 제조할 수 있다.

5.폴리펩티드의 정제

hSu(fu) 형태는 배양 배지로부터 또는 숙주 세포 용균물로부터 회수할 수 있다. 막에 결합되어 있다면, 이는 적당한 세정 용액 (예를 들면, 트리톤-X 100)을 사용하거나 또는 효소적 분절에 의하여 막으로부터 떼어놓을 수 있다. hSu(fu)를 발현하는데 이용한 세포는 동결-해빙의 순환, 초음파분해, 기계적 파열 또는 세포 용균제와 같은 다양한 물리적 또는 화학적 방법에 의하여 파열시킬 수 있다.

재조합 세포 단백질 또는 폴리펩티드로부터 hSu(fu)를 정제하는 것이 바람직할 것이다. 하기 방법들은 적당한 정제 방법의 예이다: 이온 교환 칼럼에서 분류법, 에탄올 침전법, 역상 HPLC, 실라카 상에서 또는 양이온 교환 수지 (예를 들면, DEAE) 상에서 크로마토그래피, 크로마토포커싱(chromatofocusing), SDS-PAGE, 암모늄 술페이트 침전법, 예를 들면 세파덱스(Sephadex) G-75를 사용하는 겔 여과법, IgG와 같은 오염물을 제거하기 위한 단백질 A 세파로즈 칼럼, 및 hSu(fu)의 에피토프 태그된 형태를 결합하는 금속 킬레이팅 칼럼. 단백질 정제의 다양한 방법을 이용할 수 있으며, 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며 예를 들면, 문헌[Deutsher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)]에 기술되어 있다. 선택하는 정제 단계(들)은 예를 들면, 사용하는 제조 방법 및 제조된 특정 hSu(fu)의 성질에 의존할 것이다.

E.hSu(fu)의 용도

hSu(fu)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (또는 그 상보체)는 분자 생물학 분야 (혼성화 탐침으로의 용도를 포함함), 염색체 및 유전자 지도작성 및 항-센스RNA 및 DNA의 생성에서 다양한 응용을 갖는다. hSu(fu) 핵산은 또한 본원에 기술한 재조합 기술에 의한 hSu(fu) 폴리펩티드의 제조에 유용할 것이다.

전장 천연 서열 hSu(fu) 유전자 (서열 확인 번호 1) 또는 그 일부는 cDNA 라이브러리에 대한 혼성화 탐침으로 사용되어 전장 hSu(fu) 유전자를 단리하거나, 또는 도 1 (서열 확인 번호 1)에 기술된 hSu(fu) 서열과 원하는 서열 동일성을 갖는 또 다른 유전자 (예를 들면, hSu(fu)의 천연 발생 변형체 또는 다른 종에서 유래한 hSu(fu)를 코딩하는 것)을 단리할 수 있다. 임의로, 탐침의 길이는 약 20 내지 약 50 염기일 수 있다. 혼성화 탐침은 서열 확인 번호 1의 뉴클레오티드 서열로부터 또는 천연 서열 hSu(fu)의 프로모터, 인핸서 요소 및 인트론을 포함하는 유전체 서열로부터 얻을 수 있다. 예를 들면, 스크리닝 방법은 약 40 염기의 선택하는 탐침을 합성하는 공지된 DNA 서열을 사용하여 hSu(fu) 유전자의 코딩 구역을 단리하는 것을 포함할 수 있다. 혼성화 탐침은 방사성뉴클레오티드 (예를 들면,³²P 또는³⁵S)를 포함하는 다양한 라벨, 또는 아비딘(avidin)/비오틴 결합 시스템에 의해 탐침에 커플링되는 알칼리성 포스파타제와 같은 효소성 라벨에 의해 라벨링 할 수 있다. 본 발명의 hSu(fu) 유전자에 대해 상보적인 서열을 갖는 라벨링된 탐침을 사람 cDNA, 유전체 DNA 또는 mRNA의 라이브러리를 스크리닝하는데 사용하여 탐침이 이러한 라이브러리의 어떤 구성원에 혼성화되는지를 확인할 수 있다. 혼성화 기술은 하기 실시예에 더 상세히 설명되어 있다.

또한 PCR 기술에 탐침을 이용하여 밀접히 관련된 hSu(fu) 코딩 서열을 확인하기 위한 서열 풀(pool)을 생성할 수 있다.

hSu(fu)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 또한 hSu(fu)를 코딩하는 유전자 지도 작성용 및 유전적 질병을 갖는 개체의 유전적 분석용 혼성화 탐침을 작성하는데 사용할 수 있다. 본원에서 제공하는 뉴클레오티드 서열은 제자리 혼성화, 공지 염색체 마커에 대한 결합 분석 및 라이브러리를 쓴 혼성화 스크리닝과 같은 공지 기술을 사용하여 염색체의 특정 구역 및 염색체에 대하여 지도를 작성할 수 있다.

본 발명은 Hh 연관성 종양, 바람직하게는 hSu(fu) 발현 또는 돌연변이와 연관된 것을 탐지하는데 사용될 수 있다. 이상 HH 신호전달과 연관성이라 추정되는 종양을 갖는 환자로부터 얻은 DNA를 hSu(fu) 유전자 중의 종양발생성 돌연변이의 존재 여부를 분석한다. 산발성 종양의 유전적 특성은 일반적으로 편리하게는 생검(biopsy) 시료로의 종양 세포 DNA 또는 RNA의 분석을 요한다. 핵산은 이에 존재하는 정상 서열과 비교하여 종양발생성 돌연변이의 존재 여부를 스크리닝한다. 변경된 Hh 신호전달과 연관된 산발성 종양은 기저 세포암종, 흑색종, 편평 세포암종, 유방암종, 이행성(transitional) 방광 세포암종, 수막종, 골수종(medullomas), 심장 및 난소의 섬유종, 폐, 결장, 난소, 신장 및 식도의 암종, 및 소화관의 다른 암종을 포함한다.

다양한 방법이 유전체 DNA 서열 분석에 이용가능하다 (본원에 고려된 것을 포함함). 다량의 DNA를 입수가능한 경우, 유전체 DNA를 직접 사용한다. 별법으로, 목적하는 구역을 적당한 벡터로 클로닝하고 분석에 충분한 양으로 증가시키거나, 또는 통상의 기술 (예를 들면, 폴리머라제 체인 반응(PCR))에 의해 증폭할 수있다. 이상 hSu(fu) 단백질의 존재에 대한 종양 세포의 분석은 하기 논의되는 면역검정을 통하여 행할 수 있다.

hSu(fu)에 대한 코딩 서열이 다른 단백질에 결합하는 단백질을 코딩할 때 (예를 들면, hSu(fu)가 수용체인 경우), hSu(fu)는 결합 상호작용에 포함되는 다른 단백질 또는 분자를 확인하기 위한 검정에 사용할 수 있다. 이러한 방법에 의해, 수용체/리간드 결합 상호작용의 억제를 확인할 수 있다. 이러한 결합 상호작용에 포함되는 단백질은 또한 결합 상호작용의 단백질 또는 소분자 억제자에 대한 스크리닝에 사용할 수 있다. 또한, 수용체 hSu(fu)는 상관적인 리간드(들)을 단리하는데 사용할 수 있다. 스크리닝 검정은 천연 hSu(fu) 또는 hSu(fu)에 대한 수용체의 생물학적 활성을 모방하는 선도 화합물을 발견하기 위해 고안할 수 있다. 이러한 스크리닝 검정은 특히 소분자 약물 후보물을 학인하는데 적합하게 하는 화합물 라이브러리를 고처리율 스크리닝할 수 있는 검정을 포함할 것이다. 예상되는 소분자는 합성 유기 또는 무기 화합물을 포함한다. 검정은 당업계에 잘 특징지워진 단백질-단백질 결합 검정, 생화학적 스크리닝 검정, 면역검정 및 세포에 기초한 검정을 포함하는 다양한 포맷으로 수행할 수 있다.

hSu(fu)를 코딩하는 핵산 또는 그 개질된 형태는 또한 차례로 치료적으로 유용한 제제의 개발 및 스크리닝에 유용한 트랜스제닉(transgenic) 동물 또는 "녹-아웃(knock-out)" 동물을 생성하는데 사용할 수 있다. 트랜스제닉 동물 (예를 들면, 생쥐 또는 쥐)은 출생전 (예를 들면, 배아) 단계에서 동물 또는 동물 선조에 도입한 트란스유전자(transgene)을 포함하는 세포를 갖는 동물이다. 트란스유전자는이로부터 트랜스제닉 동물이 발생하는 세포체 내로 통합된 DNA이다. 한 실시태양에서, hSu(fu)를 코딩하는 cDNA는 확립된 기술에 따라서 hSu(fu)를 코딩하는 유전체 DNA를 클로닝하기 위해 사용할 수 있으며, 유전체 서열은 hSu(fu)를 코딩하는 DNA를 발현하는 세포를 포함하는 트랜스제닉 동물을 생성하는데 사용할 수 있다. 트랜스제닉 동물, 특히 생쥐 또는 쥐와 같은 동물을 생성하는 방법은 당업게에서 통상적인 것이며, 예를 들면 미국 특허 제4,736,866호 및 제4,870,009호에 기술되어 있다. 전형적으로, 특별한 세포는 조직 특이성 인핸서와 혼입된 hSu(fu) 트란스유전자에 대해 표적화될 것이다. 배아 단계에서 동물의 배선(germ line)에 도입된 hSu(fu)를 코딩하는 트란스유전자 카피를 포함하는 트란스제닉 동물은 hSu(fu)를 코딩하는 DNA의 발현 증가 효과를 검사하는데 사용할 수 있다. 이러한 동물은 예를 들면, 그 과발현과 연관된 병태적 조건으부터 보호하는 제제에 대한 시험 동물로 사용할 수 있다. 본 발명의 이러한 관점에서, 동물은 제제로 처리하며, 트란스유전자를 갖는 비처리 동물과 비교하여 병태적 조건의 발병 감소는 병태적조건에 대한 가능한 치료적 간섭을 나타낼 것이다.

별법으로, hSu(fu)의 비사람 상동체는 hSu(fu)를 코딩하는 내생 유전자와 동물의 배아 세포 내로 도입된 hSu(fu)를 코딩하는 변경된 유전체 DNA간의 동종성 재조합의 결과로서 hSu(fu)를 코딩하는 이상 또는 변경된 유전자를 갖는 hSu(fu) "녹-아웃" 동물을 작성하는데 사용할 수 있다. 예를 들면, hSu(fu)를 코딩하는 cDNA는 확립된 기술에 따라서 hSu(fu)를 코딩하는 유전체 DNA를 클로닝하는데 사용할 수 있다. hSu(fu)를 코딩하는 유전제 DNA의 일부는 모니터 통합(integration)에 사용할 수 있는 선택가능한 마커를 코딩하는 유전자와 같은 다른 유전자로 대체 또는 결실시킬 수 있다. 전형적으로, 수 킬로베이스의 변경되지 않은 플랭킹(flanking) DNA (5' 및 3' 말단에서 모두)는 벡터에 포함된다 [예를 들면, 상동성 재조합 벡터를 설명하는 토마스(Thomas) 및 카페치(Capecchi), Cell, 51:503 (1987) 참조]. 벡터는 배아 줄기 세포계 내로 도입ehl고 (예를 들면, 일렉트로포레이션에 의해서), 도입된 DNA가 내생 DNA와 균일하게 재조합된 세포를 선택한다 [예를 들면, 리(Li) 등, Cell, 69:915 (1992) 참조]. 이어서, 선택한 세포는 동물 (예를 들면, 생쥐 또는 쥐)의 포배(blstocyst) 내로 주입하여 집합 키메라를 형성한다 [예를 들면, Bradley, in Tetratocarcinomas and Embryonic Stem Cells:a Practical Approach, E.J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152 참조]. 이어서, 키메라형 배아를 적적한 가임신 암컷 양육(foster) 동물에게 이식하며, 배아는 "녹-아웃" 동물을 생성을 초래한다. 그 생식 세포에 상동적으로 재조합된 DNA가 잠복된 자손은 표준 기술로 확인할 수 있으며, 이는 동물의 모든 세포가 상동적으로 재조합된 DNA를 포함하는 동물을 낳는데 사용한다. 녹아웃 동물은 예를 들면, 어떠한 병리적 조건에 대한 대항 능력 및 hSu(fu) 폴리펩티드의 부존재로 인한 병리 상태의 발생에 대하여 특징적일 수 있다.

hSu(fu) 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 또한 유전자 치료에 사용할 수 있다. 유전자 치료 응용분야에서는, 유전자는 예를 들면 결손 유전자를 대체하기 위해 치료적으로 효과적인 유전적 산물을 생체내 합성하기 위하여 세포에 도입된다. "유전자 치료"는 지속적인 효과가 1회 요법에 의해 획득되는 통상의 유전자 치료, 및치료적으로 유효한 DNA 또는 mRNA의 1회 또는 반복 투여를 포함하는 유전자 치료제의 투여 모두를 포함한다. 안티센스 RNAs 및 DNAs는 생체내 특정 유전자의 발현을 봉쇄하는 치료제로 사용할 수 있다. 세포막에 의한 제한 유입에 의해 야기되는 낮은 세포내 농도에도 불구하고, 짧은 안티센스 올리고뉴클레오티드는 세포 내로 유입되어 세포 내에서 억제제로 기능할 수 있다. (Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. US 83, 4143-4146 [1986]). 올리고뉴클레오티드는 예를 들면, 음전하 포스포디에스테르기를 비하전기로 치환하는 것에 의하여 개질하여 그 유입을 높일 수 있다.

한 실시태양에서, 본 발명은 유전자치료를 위한 종양 억제제 활성을 갖는 hSu(fu)의 비돌연변이화 형을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 종양 또는 다른 질병은 종종 세포가 종양 억제제 유전자의 기능적 카피를 상실하거나, 또는 결손 형으로 돌연변이된 1 이상의 카피를 가질 때 발생된다. 이러한 경우, hSu(fu)의 기능적 카피를 도입하는 것은 상황을 개선시키는 것을 도와줄 수 있다.

핵산을 생존가능한 세포에 도입하는데에는 다양한 기술이 있다. 그 기술은 핵산이 배양 세포로 목적 숙주 세포에서 시험관내 또는 생체내에서 전달되는 지에 따라서 달라진다. 핵산을 시험관내에서 포유류 세포로 전달하기에 적당한 기술로는 리포솜, 일렉트로포레이션, 마이크로주사, 세포 융합, DEAE-덱스트란, 칼슘 포스페이트 침전법 등을 들 수 있다. 근래 바람직한 생체내 유전자 전달 기술은 바이러스성 (전형적으로, 레트로바이러스성) 벡터로 트랜스펙션 및 바이러스 코팅 단백질-리포솜 매개 트랜스펙션을 포함한다 (Dzau et al., Trends in Biotechnology 11, 205-210 [1993]). 일부의 경우, 세포 표면 막 단백질 또는 표적 세포에 특이적인 항체, 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드와 같은, 표적 세포에 표적화시키는 제제와 함께 핵산원을 제공하는 것이 바람직하다. 리포솜을 이용하는 경우, 엔도시토시스(endocytosis)와 연관된 세포 표면 막 단백질에 결합하는 단백질을 표적화 및(또는) 유입 촉진을 위하여 사용할 수 있다 (예를 들면, 특정 세포형 지향성 캡시드 단백질 또는 그 단편, 사이클링에서 내부화를 수행하는 단백질에 대한 항체, 세포내국소화 지향 및 세포내 반감기를 높이는 단백질). 수용체 매개 엔도시토시스 기술은 예를 들면 문헌[Wu et al., J.Biol.Chem. 262, 4429-4432 (1987); 및 Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990)]에 기술되어 있다. 유전자 마킹(marking) 및 유전자 치료 프로토콜에 대한 검토는 앤더슨(Anderson) 등의 문헌[Science 256, 808-813 (1992)] 참조.

본 발명의 hSu(fu) 폴리펩티드는 공지의 방법에 의해 제제화되어 제약적으로 유용한 조성물을 제조할 수 있으며, 이에 의한 hSu(fu) 생성물은 제약적으로 허용가능한 담체 비히클과 혼합된다. 치료 제제는 임의로 생리적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제를 지닌 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A.Ed.(1980)) 원하는 순도를 갖는 활성 성분과 혼합함에 의해 동결건조 제제 또는 수용액 형태로 저장용으로 제조한다. 허용가능한 담체, 부형제또는 안정화제는 적용 용량 및 농도에서 투여받는 자에게 비독성이며, 포스페이트,시트레이트 및 다른 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산을 포함하는 항산화제; 저분자량(약 10 개의 잔기 미만) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 폴리머; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 단당, 이당 및 다른 탄수화물 (글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함함); EDTA와 같은 킬레이트화제; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 설탕 알콜; 나트륨과 같은 염 형성 반대이온; 및(또는) 트윈(Tween), 플루로닉(Pluronics) 또는 PEG와 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다. 생체내 투여용으로 사용되는 제제는 무균성이어야만 한다. 이는 동결건조 및 재생 이전 또는 이후에 무균 여과막을 통하여 여과함으로 용이하게 달성할 수 있다.

본원의 치료 조성물은 일반적으로 무균 접근 포트(port) (예를 들면, 정맥주사 용액 백(bag) 또는 피하 주사 바늘에 의해 천공가능한 마개를 갖는 바이알)를 갖는 컨테이너 내에 위치한다.

투여 경로는 공지의 경로에 따르며, 예를 들면 정맥내, 복강내, 뇌실내, 근육내, 안내, 동맥내 또는 병변내 경로에 의한 주사 또는 주입, 국소 적용, 또는 지속 방출 시스템에 의한다.

본 발명의 제약 조성물의 용량 및 요구되는 약물 농도는 특정 계획한 용도에 따라 변할 수 있다. 적합한 용량 또는 투여 경로를 결정하는 것은 통상의 의사들의 기술 범위내에 있다. 동물 실험은 사람 치료에 효과적인 용량의 결정에 신뢰할만한 지침을 제공한다. 유효 용량의 종간 칭량은 모덴티 (Mordenti, J.) 및 샤펠 (Chappel, W.)의 문헌["The use of interspecies scaling in toxicokinetics" In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds., Pergamon Press,New York 1989, pp. 42-96]에 공개된 원리에 의해 수행할 수 있다.

F.항-hSu(fu) 항체

본 발명은 항-hSu(fu)항체를 더 제공한다. 항체의 예로는 폴리클로날, 모노클로날, 인간화(humanized), 이특이성(bispecific) 및 헤테로접합된 항체를 들 수 있다.

1.폴리클로날 항체

항-hSu(fu) 항체는 폴리클로날 항체를 포함할 수 있다. 폴리클로날 항체를 제조하는 방법은 당업자들에게 공지되어 있다. 폴리클로날 항체는 포유류에서, 예를 들면 면역화제(immunizing agent) 및 필요한 경우 아주반트를 1회 이상 주사하는 것에 의해 증가시킬 수 있다. 전형적으로, 면역화제 및 아주반트는 포유류에 다회 피하 또는 복강내 주사에 의해 주사될 것이다. 면역화제는 hSu(fu) 폴리펩티드 또는 그 융합 단백질을 포함한다. 면역화제를 면역화되는 동물에 면역원성이라 알려진 단백질에 접합시키는 것이 유용할 수 있다. 이러한 면역원성 단백질의 예는 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 혈청 알부민, 소 티로글로불린, 및 대두 트립신 억제제를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 적용할 수 있는 아주반트의 예로는 프로인트 완전 아주반트(Freund's complete adjuvant) 및 MPL-TDM 아주반트(모노포스포릴 리피드 A, 합성 트레할로스 디코리노마이콜레이트)를 포함한다. 면역화 프로토콜은 과도한 실험 없이 당업자들이 선택할 수 있다.

2.모노클로날 항체

별법으로, 항-hSu(fu) 항체는 모노클로날 항체일 수 있다. 모노클로날 항체는 코흘러(Kohler) 및 밀스타인(Milstein)의 문헌[Nature, 256:495 (1975)]에 기술된 방법과 같은 하이브리도마 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 하이브리도마 방법에서는, 생쥐, 햄스터 또는 다른 적합한 숙주 동물은 전형적으로 면역화제에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 생성 또는 생성할 수 있는 림프구를 유발하는 면역화제로 면역화된다. 별법으로, 림프구는 시험관내에서 면역화될 수 있다.

면역화제는 전형적으로 hSu(fu) 폴리펩티드 또는 그 융합 단백질을 포함할 수 있다. 일반적으로, 사람 기원의 세포가 요구된다면 말초 혈액 림프구("PBLs")를 사용하거나, 사람이 아닌 포유류 기원이 요구된다면 비장 세포 또는 림프절 세포를 사용한다. 이어서, 림프구는 적합한 융합제 (예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜)을 사용하여 영속적 세포계와 융합하여 하이브리도마 세포를 형성한다 [고딩(Goding), Monoclonal Antibodies:Principles and practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103]. 영속적 세포계는 통상적으로 전환된 포유류 세포이고, 특히 설취류, 소 및 사람 기원의 골수종 세포이다. 통상적으로, 쥐 또는 생쥐 골수종 세포계를 이용한다 하이브리도마 세포는 비융합된 영속적 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 1 이상의 기질을 바람직하게 포함하는 적당한 배양 배지에서 배양할 수 있다. 예를 들면, 모세포가 효소 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 전환효소 (HGPRT 또는 HPRT)를 결하였다면, 하이브리도마에 대한 배양 배지는 전형적으로 HGPRT-결실 세포의 성장을 막는 기질인 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘 ("HAT 배지")를 포함할 것이다.

바람직한 영속적 세포계는 효과적으로 융합하고, 선택된 항체 생산 세포에 의해 안정한 고수준의 항체 발현을 지속시키며, HAT 배지와 같은 배지에 감수성인 것이다. 더욱 바람직한 영속적 세포계는 예를 들면, 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute Cell Distribution Center, 미국 캘리포니아주 산 디에고 소재) 및 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection, 미국 메릴랜드주 록크빌 소재)로부터 얻을 수 있는 쥐과의 골수종계이다. 사람 골수종 및 생쥐-사람 헤테로골수종 세포계 또한 사람 모노클로날 항체를 생성함이 설명되어 있다 [Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Technique and Aplications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63].

하이브리도마 세포를 배양하는 배양 배지는 이어서 hSu(fu)에 대한 모노클로날 항체가 존재하는 지를 검정할 수 있다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생성된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전법 또는 시험관내 결합 검정 (예를 들면, 방사성면역검정 (RIA) 또는 효소 연결 면역흡착 검정 (ELISA))에 의해 확인한다. 이러한 기술 및 검정법은 당업계에 공지되어 있다. 모노클로날 항체의 결합 친화도는 예를 들면, 문손(Munson) 및 폴라드(Pollar)의 문헌[Anal. Biochem., 107:220 (1980)]의 스캐차드(Scatchard) 분석에 의해 확인할 수 있다.

원하는 하이브리도마 세포를 확인한 후, 클론은 희석 과정을 제한함으로 서브클로닝하고, 표준 방법에 의해 성장시킬 수 있다 [고딩의 상기 문헌]. 이러한 목적에 적당한 배양 배지는 예를 들면, 둘베코의 개질 이글스 (Dulbecco'sModified Eagle's) 배지 및 RPMI-1640 배지를 포함한다. 별법으로, 하이브리도마 세포는 포유류의 복수(ascites)와 같은 생체내에서 성장시킬 수 있다.

서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 배양 배지 또는 복수로부터 통상적인 면역글로불린 정제 방법 (예를 들면, 단백질 A-세파로스, 히드록실아파티트 크로마토그래피, 겔 일렉트로포레시스, 투석 또는 친화 크로마토그래피)에 의해 정제 또는 단리할 수 있다.

모노클로날 항체는 또한 미국 특허 제4,816,567호에 기술된 것과 같은 재조합 DNA 방법에 의해 제조할 수 있다. 본 발명의 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상의 방법 (예를 들면, 쥐과의 항체의 H쇄 및 L쇄를 코딩하는 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 탐침을 사용하는 것에 의해서)을 사용하여 용이하게 서열분석 및 단리할 수 있다. 본 발명의 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 출처로 작용한다. 일단 단리되면, DNA는 발현 벡테 내에 위치하고, 이 발현 벡터는 이어서 달리 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포 내로 트랜스펙션되어, 재조합된 숙주 세포에서 모노클로날 항체를 합성하게 된다. DNA는 또한 예를 들면, 상동적 쥐과의 서열 대신에 사람 H 및 L쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 치환하는 것에 의해서 [미국 특허 제4,816,567호; 모리슨 등의 상기 문헌] 또는 면역글로불린 코딩 서열 전부 또는 일부의 코딩 서열을 비면역글로불린 폴리펩티드에 대해 공유 결합시키는 것에 의해 개질할 수 있다. 이러한 비면역글로불린 폴리펩티드는 본 발명의 항체의 불변 도메인으로 치환될 수있거나, 본 발명의 항체의 하나의 항체 결합 부위의 가변 부위로 치환되어 키메라형 이가(bivalent) 항체를 생성할 수 있다.

항체는 또한 일가(monovalent) 항체일 수 있다. 일가 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 한 가지 방법은 면역글로불린 L쇄 및 개질된 H쇄의 재조합 발현을 포함한다. H쇄는 일반적으로 Fc 구역의 임의의 지점에서 절단되어 H쇄 교차결합을 방지한다. 별법으로, 관련된 시스틴 잔기는 다른 아미노산 잔기로 치환 또는 결실되어 교차결합을 방지한다.

시험관내 방법 또한 일가 항체를 제조하는데 적당하다. 항체를 분해(digestion)하여 이의 단편, 특히 Fab 단편을 생성하는 것은 당업계의 통상적인 기술을 사용하여 수행할 수 있다.

3.사람 및 인간화 항체

본 발명의 항-hSu(fu) 항체는 인간화 항체 또는 사람 항체를 더 포함할 수 있다. 비사람 (예를 들면, 쥐과 동물) 항체의 인간화 형태는 비사람 면역글로불린으로부터 유래한 최소 서열을 포함하는 키메라형 면역글로불린, 이의 면역글로불린쇄 또는 단편 (Fv, Fab, Fab', F(ab')₂또는 항체의 항원 결합 서브서열과 같은 것)이다. 인간화 항체는 수여체의 상보성 결정 부위 (CDR)의 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 생쥐, 쥐 또는 토끼와 같은 비사람 종 (공여체 항체)의 CDR의 잔기로 대체된 사람 면역글로불린 (수여체 항체)를 포함한다. 일부 경우, 사람 면역글로불린의 Fv 골격 잔기는 상응하는 비사람 잔기로 대체된다. 인간화 항체는또한 수여체 항체 뿐만 아니라 수입된(imported) CDR 또는 골격(framework) 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 구역이 비사람 면역글로불린에 상응하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 구역은 사람 면역글로불린 컨센서스 서열인, 1 이상의, 전형적으로는 2 개의 가변 도메인을 포함할 수 있다. 인간화 항체는 적합하게는 또한 1 이상의 면역글로불린 불변 구역 (Fc), 전형적으로는 사람 면역글로불린의 Fc 일부 이상을 포함할 수 있다 [존스(Jones) 등, Nature, 321:522-525 (1986); 리쉬만(Riechmann) 등, Nature, 332;323-329 (1988); 및 프레스타(Presta), Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)].

인간화된 비사람 항체에 대한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비사람 기원으로부터 그 내로 도입된 1 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비사람 아미노산 잔기는 종종 "수입(import)" 잔기로 지칭되고, 이는 전형적으로 "수입" 가변 도메인으로부터 얻게 된다. 인간화는 필수적으로 윈터(Winter) 및 동료들의 방법 [존스(Jones) 등, Nature, 321:522-525 91986); 리쉬만 등, Nature, 332:323-327 (19870; 버호연(Verhoeyen) 등, Science, 239:1534-1536 (1988)]에 따라서 설치류 CDRs 또는 CDR 서열을 상응하는 사람 항체 서열로 치환함으로 수행될 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 실질적으로 전체가 아닌 사람 가변 도메인이 비사람종으로부터 상응하는 서열로 치환된 키메라형 항체이다 (미국 특허 제4,816,567호). 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기 및 가능한 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 부위에서 유래한 잔기로 치환된사람 항체이다.

사람 항체는 또한 파지 디스플레이 라이브러리를 포함하는 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 제조할 수 있다 [후겐붐(Hoogenboom)및 윈터(Winter), J.Mol. Biol., 227:381 (1991); 마르크스(Marks) 등, J.Mol.Biol., 222:581 (1991)]. 콜(Cole) 등 및 보너(Boerner) 등의 방법 또한 사람 모노클로날 항체를 제조하는데 이용가능하다 [콜 등, Monoclonal Antibodies and Caner Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985) 및 보너 등, J.Immunol., 147(1):86-95 (1991)]. 유사하게, 사람 항체는 사람 면역글로불린 유전자위를 내생의 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 트랜스제닉 동물 (예를 들면, 생쥐)에 도입함으로 만들 수 있다. 시도 결과, 사람 항체 생성을 관찰하였고, 이는 유전자 재배열, 조립 및 항체 레퍼토리를 포함하여 모든 면에서 사람에서 보이는 것과 밀접히 닮아있다. 이러한 접근은 예를 들면 미국 특허 제5,545,807호, 제5,545,806호, 제5,569,825호 제5,625,126호 제5,633,425호 제5,661,016호 및 이하의 학술지에 기술되어 있다: 마르크스(Marks) 등, Bio/Technology 10, 779-783 (1992); 론베르그(Lonberg) 등, Nature 368:856-859 (1994); 모리슨 (Morrison), Nature, 368, 812-13 (1994); 피시윌드(Fishwild) 등, Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); 누베르거(Neuberger), Nature Biotechnology, 14, 826 (1996); 론베르그 및 후스자(Huszar), Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995).

4.이특이성 항체

이특이성 항체는 2 이상의 상이한 항원에 결합 특이성을 갖는 모노클로날,바람직하게는 사람 또는 인간화 항체이다. 본원의 경우, 결합 특이성 하나는 hSu(fu)에 대한 것이고, 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 것, 및 바람직하게는 세포 표면 단백질 또는 수용체 또는 수용체 서브유닛에 대한 것이다.

이특이성 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전통적으로, 이특이성 항체의 재조합 생산은 2 개의 H쇄가 상이한 특이성을 갖게되는 2 개의 면역글로불린 H-쇄/L-쇄 쌍의 공동 발현에 기초한다 [밀스타인(Milstein) 및 쿠엘로(Cuello), Nature, 305:537-539(1983)]. 면역글로불린 H 및 L쇄가 무작위적으로 분류되기 때문에, 이들 하이브리도마 (콰드로마(quadromas))는 10 개의 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생성하고 이 중 1 개가 정확한 이특이성 구조를 갖는다. 정확한 분자의 정제는 보통 친화도 크로마토그래피 단계로 달성된다. 유사한 방법은 국제특허공개 WO 제93/08829호(1993년 5월 13일 공개) 및 트라운엑커(Traunecker) 등의 문헌[EMBO J.,10:3655-3659(1991)]에 개시되어 있다.

원하는 결합 특이성을 갖는 항체 가변 영역 (항체-항원 연합 부위)는 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합될 수 있다. 융합은 바람직하게는 적어도 힌지, CH2 및 CH3 구역 부분을 포함하는 면역글로불린 H쇄 불변 도메인과 된다. 1 이상의 융합에서 존재하는 L쇄 결합에 필요한 부위를 포함하는 제1 H쇄 불변 구역 (CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 면역글로불린 H쇄 융합, 및 원하는 경우 면역글로불린 L쇄를 코딩하는 DNAs를 별개의 발현 벡터에 삽입하며, 적당한 숙주 유기체 내로 공동 트랜스펙션한다. 이특이성 항체를 생성하는 추가 설명은 예를들면, 수레쉬(Suresh) 등의 문헌[Methods in ENzymology, 121:210 (1986)] 참조.

5.헤테로접합 항체

헤테로접합 항체 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 헤테로접합 항체는 2 개의 공유 결합된 항체로 구성된다. 이러한 항체는 예를 들면, 원치않는 세포에 면역 시스템을 표적화하기 위해서 [미국 특허 제4,676,980호] 및 HIV 감염의 치료를위해서 [국제특허공개 WO 제91/00360호, 제92/200373호, 유럽특허 EP 제03089호]에서 제안되었다. 항체는 시험관내에서 교차결합제를 포함하는 합성 단백질 화학에서 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있으리라 예상된다. 예를 들면, 면역독소는 디술피드 교환 반응을 사용하여 또는 티오에테르 결합의 형성에 의하여 작성될 수 있다. 이러한 목적에 적당한 제제의 예로는 이미노티올레이트 및 메틸-4-머르캅토부틸이미데이트 및 예를 들면, 미국 특허 제4,676,980호에 개시된 것을 들 수 있다.

G.항-hSu(fu) 항체의 용도

본 발명의 항-hSu(fu) 항체는 다양한 유용성을 갖는다. 예를 들면, 항-hSu(fu) 항체는 hSu(fu) 에 대한 진단 검정 (예를 들면, 특정 세포, 조직 또는 혈청에서 그 발현을 탐지하는 것)`에 사용할 수 있다. 경쟁적 결합 검정, 직접 또는 간접 샌드위치 검정 및 비균일 또는 균일상에서 행해지는 면역침전 검정과 같은 당업계에 공지된 다양한 진단 검정 기술을 사용할 수 있다 [졸라(Zola), Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. ((87) pp. 147-158]. 진단 검정에 사용되는 항체는 검출가능한 부분으로 라벨링될 수 있다. 검출가능한 부분은 검출가능한 신호를 직접 또는 간접적으로 생성할 수 있어야만 한다. 예를 들면, 탐지가능한 부분은 방사성동위원소 (예를 들면,³H,¹⁴C,³²P,³⁵S 또는¹²⁵I), 형광 또는 화학발광 화합물 (에를 들면, 플루레신 이소티오시아네이트, 로다민 또는 루시페린), 효소 (예를 들면, 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 호스라디쉬 퍼옥시다제)일 수 있다. 문헌[훈터(Hunter) 등, Nature 144:945 (1962); 데이비드(David) 등, Biochemistry, 13:1014 (1974); 페인(Pain) 등, J.Immunol.Meth., 40:219 (1981); 및 니그렌(Nygren), J.Histochem. and Cytochem., 30:407 (1982)]에 기술된 방법을 포함하여 항체를 검출가능한 부분에 접합시키는 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

더욱 바람직하게는, 이상 hSu(fu) 단백질의 존재에 대한 종양 세포의 분석은 면역검정에 의해 행할 수 있다. 시료는 Hh-연관성 종양을 가지리라 추정되는 환자로부터 취한다. 본원에서 사용되는 시료는 혈액, 뇌척수액, 눈물, 타액, 림프, 투석액 등과 같은 생물학적 유체; 기관 또는 조직 배양 유래 유체; 및 생리적 조직으로부터 추출한 유체를 포함한다. 상기 용어에 또한 포함되는 것은 이러한 유체의 유도체 및 분획이다. 생검 시료가 특히 관심이 있다 (예를 들면, 피부 병변, 기관 조직 단편 등). 전이가 의심되는 경우에는, 혈액 시료가 바람직할 수 있다. 시료 중의 세포의 숫자는 일반적으로 약 10³이상, 통상적으로 10⁴이상, 더욱 통상적으로 약 10⁵이상이다. 고형 조직의 경우 세포를 분리할 수 있거나, 조직 절편을 부석할 것이다. 별법으로, 세포의 용균물을 제조할 수 있다.

진단은 다수의 방법에 의해 행할 수 있다. 상이한 방법은 모두 종양발생성 돌연변이를 갖는다고 추정되는 환자 세포에서 비정상적 hSu(fu)의 존재를 확인한다. 본원에서 논의하는 본 발명의 조성물 및 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 검출은 통상적인 방법에 따라서 행해지는 비손상 세포의 염색 또는 조직 단편을 활용할 수 있다. 관심있는 항체를 세포 시료에 첨가하고, 에피토프에 결합하도록 하기 충분한 시간 (보통 약 10 분 이상) 배양한다. 항체는 방사성동위원소, 효소, 형광체, 화학발광체 또는 직접 탐지용 다른 라벨로 라벨링 할 수 있다. 별법으로, 2차 단계 항체 또는 제제는 신호를 증폭하기 위해 사용된다. 이러한 제제는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 1차 항체는 2 단계 제제로 첨가된 호스라디쉬 퍼옥시다제 접합된 아비딘과 비오틴에 접합될 수있다. 최종 검출은 퍼옥시다제의 존재 중에서 기질이 색깔 변화를 일으키게 할 수 있다. 항체 결합의 부재 또는 존재는 분리되는 세포의 유동 세포계수, 현미경검사, 라디오그라피, 신틸레이션 카운팅 등을 포함하는 다양한 방법으로 확인할 수 있다.

진단을 위한 또 다른 별법은 종양 세포가 활성 hSu(fu) 단백질을 분비 (또는 세포 사망에 따라 방출)할 수 있는 세포 용균물, 상층액 또는 다른 유체 중에서 항체 및 hSu(fu) 간의 결합을 시험관내 검출하는 것에 달려있다. 시료 및 그 분획에서 hSu(fu)의 농도를 측정하는 것은 본원에서 논의한 바와 같은 다양한 특정 검정에 의해 달성할 수 있다. 통상의 샌드위치형 검정을 사용할 수 있다. 예를 들면, 샌드위치 검정은 먼저 hSu(fu) 특이성 항체를 불용성 표면 또는 지지체에 부착시킬 수 있다. 결합의 특정 수단은 이것이 본 발명의 전반적 방법 및 제제와 양립할만큼 결정적이지 않다. 이들은 플레이트에 공유적으로 또는 비공유적으로 (바람직하게는 비공유적으로) 결합될 수 있다. 불용성 지지체는 폴리펩티드가 결합할 수 있고, 수용성 물질로부터 용이하게 분리되며, 전반적 방법과 달리 양립할 수 있는 임의의 조성물일 수 있다. 이러한 지지체의 표면은 고형 또는 다공성 및 임의의 통상적인 형상일 수 있다. 수용체가 결합되는 적당한 불용성 지지체의 예로는 비드 (예를 들면, 마그네틱 비드), 막 및 마이크로타이터 플레이트를 들 수 있다. 이들은 전형적으로 유리, 플라스틱 (예를 들면, 폴리스티렌), 폴리사카라이드, 나일론 또는 니트로셀룰로오스로 만들어진다. 마이크로타이터 플레이트는 다수의 검정이 소량의 제제 및 시료를 사용하여 동시에 수행될 수 있기 때문에 특히 통상적인 것이다.

항-hSu(fu) 항체는 또한 재조합 세포 배양 또는 천연 출처로부터의 hSu(fu) 의 친화도 정제에 유용하다. 이 과정에서, hSu(fu)에 대한 항체는 적당한 지지체 (예를 들면, 세파덱스 수지 또는 필터지)에 당업계에 공지된 방법을 사용하여 고정화된다. 이어서, 고정화된 항체는 정제된 hSu(fu)를 포함하는 시료와 접촉시키고, 이어서 지지체는 고정화된 항체에 결합된 hSu(fu)를 제외한 시료 중의 실질적으로 모든 물질을 제거할 수있는 적당한 용매로 세척한다. 마지막으로, 지지체는 항체로부터 hSu(fu)를 방출할 수 있는 다른 적당한 용매로 세척한다.

H.hSu(fu) 길항제 및 효현제

근래에, 사람 헤지호그 신호전달 경로에의 관심이 발생 장애 및 빈번한 피부종양을 특징으로 하는 희귀한 상염색체 우성 질병인 기저세포 모반 증후군을 갖는 환자에서 유전되는 패치드 유전자 돌연변이를 발견함으로 고조되었다. 패치드 유전자의 체세포성 획득 돌연변이가 기저 세포 암종, 1차 유방암종, 수모세포종 및 수막종을 포함하는 산발성 암에서 확인되었다. 패치드는 종양 억제제로 작용하며, 이들 돌연변이는 패치드 유전자 생성물에서 기능 상실을 야기한다고 일반적으로 믿어진다. 헤지호그/패치드 신호전달 경로는 따라서 종양발생에서의 한 인자일 수 있다. 세포 성장 및 종양발생성을 증가시키는 유전적 변경을 탐지하는 것은 임상 의학에 크게 중요하다. 세포 성장의 변경으로 이끄는 특정 변화의 탐지는 연관된 종양의 진단 및 가능한 치료로의 관문일 수 있다.

몇 가지 접근법이 본 발명의 hSu(fu) 길항제 및 효현제 화합물을 생성하는데 적당하게 이용될 수 있다. 길항제 분자를 세포의 내부로 표적화할 수 있고 그 내부에서 돌연변이 hSu(fu) (예를 들면, 종양 억제제 기능을 상실한 돌연변이; 종양발생성 구성물)의 작용을 방해 또는 예방하는 임의의 접근법이 적당하다. 예를 들면, 우성 돌연변이와 같은 돌연변이 hSu(fu)를 포함하는 경쟁적 억제제는 결핍 또는 항상적(constitutive) hSu(fu)를 보완하여 Gli 음성 조절의 정상적 hSu(fu) 기능을 회복하고, 이에 의해 Hh 신호전달을 봉쇄한다. 이러한 길항제 또는 효현제 분자의 크기, 전하 및 막통과 수송에 적합한 소수성과 같은 추가 특성은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자들에 의해 용이하게 측정될 수 있다.

hSu(fu)의 유사물 또는 다른 포유류 상동체를 확인하거나 평가하는 경우, 세포를 시험 화합물에 노출시키고, 사람 hSu(fu)를 사용하는 양성 대조 및 화합물 또는 천연 리간드에 노출되지 않은 음성 대조와 비교한다. hSu(fu) 신호 조절 길항제 또는 효현제를 확인 또는 평가하기 위한 경우, 세포를 천연 리간드의 존재하에 본 발명의 화합물에 노출시키고, 시험 화합물에 노출시키지 않은 대조군과 비교한다.

본 발명의 스크리닝 검정법은 화학 라이브러리의 고처리량 스크리닝을 받을 수 있으며, 소분자 약물 후보물을 확인하는데 특히 적당하다.

1.길항제 및 효현제 분자

정상 hSu(fu) 단백질의 길항제는 부적절한 Hh 신호전달 경로 활성이 특징인 상태 또는 증가된 Hh 신호전달이 바람직한 경우 치료 목적으로 투여될 수 있다. 헤지호그 생물학적 활성은 머리, 폐, 중추신경계 또는 배의 중배엽 패턴화를 포함하는 다양한 조직의 형성 및 분화를 달리 조정 또는 유도하는 능력을 포함한다. 이러한 조절은 시험관내, 생체외 또는 생체내 상황에서 획득할 수 있다. 예를 들면, 상처 치료, 골 형성, 저증식성 또는 과다증식성 피부 질환의 치료, 분화 유도는 필요 길항제의 투여에 의해 영향받는다.

Hh는 운동 신경 유도 활성, 신경 분화 유도 활성 또는 신경 생존 촉진 활성을 포함하는 신경발생성을 조절하는 것이 가능하다. Hh는 또한 연골세포 유도 능력 또는 정자발생 중에 포함되는 것을 포함하여 줄기세포 또는 생식 세포 분화 유도 및 기관발생성을 제어한다. 관절염 (예를 들면, 골관절염, 류마티스성 관절염 등)의 치료는 hSu(fu) 길항제의 투여 및 연이은 연골세포 및 연골 형성의 유도로 이득을 얻을 수 있다. Hh는 모근초(hair sheath)에서의 세포 성장을 조절하여 모근의 성장을 제어할 수 있으며, hSu(fu) 길항제는 이러한 목적으로 치료적으로 사용될 수 있다.

HH의 투여는 2차 신호전달 분자 (예를 들면, TGF 베타 과의 구성원, 골 형태발생 단백질, 및 섬유모세포 성장 인자 과의 구성원)의 발현을 유도하기 때문에, hSu(fu)의 길항제도 동일한 작용을 할 수 있다.

많은 신경학적 질환은 신경 요소의 불연속 집단의 퇴화와 연관되어 있으며, 이는 길항제로 치료될 수 있다. 특정 질환은 외상성 상해, 뇌졸중에 따른 허혈로 인한 상해, 신경계의 면역 및(또는) 감염으로 인한 손상, 알츠하이머병, 파킨슨씨병, 헌팅톤 무도병, 근위측성 측삭 경화증, 척수소뇌변성 및 중추신경계의 만성 면역성 질병 (예를 들면, 다발성 경화증)을 포함한다. 길항제는 또한 빈맥 또는 심장의 가로무늬근을 자극하는 신경의 변성 조건으로부터 일어나는 동맥성 심장 부정맥가 같은 말초 신경계의 자율성 질환을 치료하는데 유용하다.

또한 흥미있는 것은 시험관내 및 생체외 용도로서, 특정 세포 배양물 (예를 들면, 신경 전구 세포)에 첨가되는 Hh는 그 세포를 뉴런 또는 글리아(glia)로 최종 분화시킬 수 있는 것이 공지되어 있거나 또는 예상된다. Hh는 당업계에 공지된 바와 같은 적합한 배양 배지와 함께 배양시 이러한 세포의 재생을 지속한다. hSu(fu)의 길항제는 유사하게 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물을 투여하기 위한 다양한 방법은 본원에서 논의된 바대로 사용될 수 있다.

약물 스크리닝은 비정상 세포에서 hSu(fu) 기능을 대체하는 제제를 확인한다. 종양 억제자로서의 hSu(fu)의 역할은 그 기능을 내는 (또는 종양 억제제 활성을 상실한 돌연변이 hSu(fu) 형의 기능을 길항하는) 제제는 종양발생 과정을 억제할 수 있다는 것을 의미한다. 역으로, 정상 hSu(fu) 기능을 길항하는 제제는 제어된 성장 및 치유를 촉진할 수 있다. 특히 흥미있는 것은 사람 세포에 낮은 독성을 갖는 제제에 대한 스크리닝 검정이다. 라벨링된 시험관내 단백질-단백질 결합 검정, 일렉트로포레이션 이동 쉬프트 검정(electrophoretic mobility shift assay), 단백질 결합에 대한 면역검정, 효모 하이브리드 시스템 등을 포함하는 다양한 검정을 이 목적에 사용할 수 있다. 본원에서 사용된 "제제"라는 용어는 원하는 생리적 기능을 변경 또는 모방하는 능력을 갖는 임의의 분자 (예를 들면, 단백질 또는 약제)를 설명한다. 일반적으로, 다수의 검정 혼합물은 상이한 제제 농도로 병행 런닝(run)하여 다양한 농도에 대한 상이한 반응성을 얻는다. 전형적으로, 이들 농도 중 하나는 음성 대조, 즉 농도 0 또는 탐지 수준 아래로 작용한다.

후보 제제는 다양한 화학물 군을 포함할 수 있을지라도, 전형적으로는 이들은 유기 분자, 바람직하게는 50 보다 크고 약 2,500 달톤보다 작은 분자량을 갖는 작은 유기 화합물이다. 후보 제제는 단백질과 구조적 상호작용, 구체적으로는 수소 결합에 필요한 관능기를 포함하며, 전형적으로는 적어도 아민, 카르보닐, 히드록시 또는 카르복시기, 바람직하게는 적어도 2 개의 화학 관능기를 포함한다. 후보 제제는 때로는 고리식 탄소 또는 헤테로고리 구조 및(또는) 1 이상의 상기 관능기로 치환된 방향족 또는 폴리방향족 구조를 포함한다. 후보 제제는 또한 펩티드, 사카라이드, 지방산, 스테로이드, 퓨린, 피리미딘, 이들의 유도체, 구조적 유사체또는 조합을 포함하는 생물분자 중에서 발견된다.

후보 제제는 합성 또는 천연 화합물을 포함하는 다양한 출처로부터 얻는다. 예를 들면, 무작위적 올리고뉴클레오티드의 발현 및 올리고펩티드를 포함하여 다양한 유기 화합물 및 생분자의 무작위 합성 및 지시된 합성을 위한 다양한 방법이 이용 가능하다. 별법으로, 세균, 곰팡이, 식물 및 동물 추출물 형태의 천연 화합물의 라이브러리를 이용하거나 쉽게 제조할 수 있다. 또한, 천연 또는 합성적으로 제조된 라이브러리 및 화합물은 통상적인 화학적, 물리적 및 생화학적 방법을 통해 용이하게 개질되며, 조합 라이브러리를 제조하는데 이용될 수 있다. 공지된 약리 제제는 직접 또는 무작위 화학 개질 (예를 들면, 아실화, 알킬화, 에스테르화, 아미드화 등)을 받아서 구조 유사체를 생성할 수 있다.

스크리닝 검정이 결합 검정인 경우, 1 이상의 분자가 라벨에 연결될 수 있고, 여기서 라벨은 검출가능한 신호를 직접 또는 간접적으로 제공할 수있다. 다양한 라벨은 방사성동위원소, 형광체, 화학발광체,효소, 특정 결합 분자, 입자 (예를 들면, 자성 입자) 등을 포함한다. 특이적 결합 분자는 비오틴 및 스트렙타비딘, 디곡신 및 항디곡신 등과 같은 쌍들(pairs)을 포함한다. 특이적 결합 구성원에 대해서는, 상보적 일원은 공지된 방법에 따라서 탐지용으로 제공되는 분자와 정상적으로 라벨링된다.

다양한 다른 시약이 스크리닝 검정에 포함될 수 있다. 이들은 최적 단백질-단백질 결합을 촉진하고 및(또는) 비특이성 또는 배경 상호작용을 감소시키는데 사용되는 염, 중성 단백질 (예를 들면, 알부민), 세제 등과 같은 시약을 포함한다.검정의 효율을 높일 수 있는 시약 (예를 들면, 프로테아제 억제제, 뉴클레아제 억제제, 항미생물제제 등)을 사용할 수 있다. 성분 혼합물은 필요 결합을 제공하는 임의의 순서로 첨가된다. 임의의 적당한 온도, 전형적으로 4℃ 내지 40℃에서 인큐베이션한다. 인큐베이션 기간은 최적 활성에 대해 선택되나, 빠른 고처리량 스크리닝을 촉진하기 위해 최적화될 수 있으며, 전형적으로 0.1 내지 1 시간이 충분할 것이다.

원하는 약리 활성을 갖는 화합물은 생리적으로 허용가능한 담체 중에서 hSu(fu) 또는 Hh 경로 기능에서의 결손 때문이라 여겨지는 비정상적 발생 또는 암의 치료를 위해 숙주에 투여될 수 있다.

hSu(fu)는 전사 인자 Gli를 음성적으로 조절하는데 관여하는 Hh의 먼 하류의 조절제이기 때문에, 본 발명의 후보 분자는 다양한 경우에 유용하게 사용되는 잇점을 갖는다 (예를 들면, Hh 경로의 상류 분자가 결손되어 종양발생성이 되거나, 또는 부적절한 성장 및 치류가 될 때). 본 발명의 화합물은 Hh 경로의 중요 전사 단계에 영향을 미치는 것에 의해 이러한 봉쇄 및 결손을 회피할 수 있다. 따라서, 본 발명의 화합물은 상처 치유, 노화, 종양발생 등에서 헤지호그 경로 기능을 증가 (또는 Hh 경로 상류 결손을 극복)하는데 사용될 수 있다. 제제는 본원에서 논의한 바와 같이 다양한 방법, 경구, 국소, 비경구 (예를 들면, 피하, 복강내), 바이러스 감염에 의해, 혈관내 투여할 수 있다.

hSu(fu) 신호전달의 길항제 및(또는) 효현제를 스크리닝하기 위해 검정 혼합물은 후보 약리 제제의 존재를 별도로 하고, 대조 활성을 갖는 헤지호그 신호전달을 유도하는 조건하에서 인큐베이션한다. 혼합물 성분은 필수 헤지호그 활성을 제공하는 임의의 순서로 첨가될 수 있다. 최적 결합을 촉진하는 임의의 온도, 전형적으로 약 4℃ 내지 40℃, 보다 일반적으로 약 15℃ 내지 40℃에서 인큐베이션할 수 있다. 인큐베이션 기간은 마찬가지로 최적 결합에 대해 선택되나, 또한 빠른 고처리량 스크리닝을 촉진하는 것을 최소화하기 위해 선택되며, 전형적으로 약 0.1 내지 10 시간, 바람직하게는 5 시간 미만, 더욱 바람직하게는 2 시간 미만이다. 인큐베이션 후에는, 후보 약리 제제의 hSu(fu) 신호전달에 대한 효과를 임의의 편리한 방법으로 측정한다. 무세포 결합형 검정(cell-free binding-type assay)에서는, 결합 및 비결합 성분을 분리하기 위해 보통 분리 단계를 사용한다. 분리는 예를 들면, 침강 (예를 들면, TCA 침강, 면역침강 등), 고정화 (예를 들면, 고형 기체 상에 고정화), 이어서 세척하는 것에 의해 초래될 수 있다. 결합 단백질은 이에 부착된 검출가능한 라벨의 잇점을 취하는 것에 의해 (예를 들면, 방사성 방출, 광학 또는 전자 밀도의 측정에 의해서, 또는 예를 들면, 항체 접합을 사용한 간접 탐지에 의해서) 용이하게 탐지된다.

예를 들면, 적합한 길항제 및(또는) 효현제에 대한 스크리닝 방법은 hSu(fu) 발현 조직에서 후보 길항제 및(또는) 효현제의 존재 및 부존재시의 제자리 혼성화를 비교하고 hSu(fu) 조절된 세포 발생의 확인 또는 부존재시를 확인하는 것으로 이루어진다. 이러한 hSu(fu)결합 리간드를 확인하기 위해서는, hSu(fu)를 세포 표면상에서 발현시킬 수 있으며, 이는 합성 후보 화합물 또는 천연 발생의 화합물 (예를 들면, 혈청 또는 세포와 같은 내생 출처로부터의 것)의 라이브러리의 스크리닝을 위해 사용할 수 있다.

hSu(fu) 및 그 결합 단백질의 단백질-단백질 상호작용에 영향을 미치는 적당한 분자는 상호작용 및 적합한 복합체 형성을 막을 수 있는 후자의 단편 또는 소분자 (예를 들면, 펩티드모방체(peptidomimetics))를 포함한다. 보통 10K 분자량 미만인 이러한 소분자는 이들이 세포를 더 잘 투과할 듯 하고, 다양한 세포내 메카니즘에 의한 분해에 덜 감수성이며, 단백질로서 면역 반응을 유발하기 쉽지 않으므로 치료제로 바람직하다. 많은 제약 회사는 본 발명의 검정법을 사용하여 용이하게 스크리닝될 수 있는 이러한 분자의 광범위한 라이브러리를 소유한다. 비제한적 예로는 단백질, 펩티드, 당단백질, 당지질, 다당, 올리고당, 핵산, 생유기 분자, 펩티도모방체, 제약 제제 및 그들의 대사체, 전사 및 해독 조절 서열 등을 들 수 있다.

hSu(fu)에 결합하는 분자를 확인하기 위한 바람직한 기술은 고체상 (예를 들면, 검정 플레이트의 웰)에 부착된 키메라형 기질 (예를 들면, 에피토프 태그된 퓨즈드 또는 퓨즈드 면역어드헤신)을 이용한다. 임의로 라벨된 (예를 들면, 방사성라벨) 후보 화합물의 고정화 수용체에의 결합을 측정할 수 있다. 별법으로, Gli 활성화에 대한 경쟁을 측정할 수 있다. 길항제 및(또는) 효현제를 스크리닝하는데는, hSu(fu)는 hSu(fu) 기질에 이어서 잠재적인 길항제 및(또는) 효현제에 노출할 수 있거나, 또는 hSu(fu) 결합 단백질 및 길항제 및(또는) 효현제는 동시에 첨가될 수 있으며, hSu(fu) 활성화를 봉쇄하는 길항제 및(또는) 효현제의 능력을 평가할 수 있다.

2.검출 검정

hSu(fu) 폴리펩티드는 hSu(fu) 헤지호그 신호전달을 조절하는 치료적 활성제제에 대한 선도 화합물을 확인하기 위한 검정에서 유용하다. 구체적으로는, 결손 hSu(fu)가 유발한 종양 성장의 경우에는, 예를 들면 hSu(fu) 신호전달 복합체의 형성을 막거나 또는 hSu(fu)가 조절하는 헤지호그 신호전달을 막거나 약하게 하는 (예를 들면, hSu(fu) 그 자체 또는 기질에 결합) -이에 따라 Gli 활성을 하강조절하는- 선도 화합물을 용이하게 확인할 수 있다. 구체적으로, 후보 화합물은 Gli에 대한 결합 및 Gli 하강조절 활성으로 스크리닝될 수 있다. 이러한 후보 분자는 Gli 결합에 대해 정상 hSu(fu)와 경쟁해야하며, 이는 hSu(fu)의 Gli 결합 파괴를 측정하는 검정으로 쉽게 확인될 수 있다.

당업계에 공지된 다양한 방법을 본 발명의 hSu(fu) 단백질의 활성의 확인, 평가 또는 억제 검정에 사용할 수 있다.

(a)생화학적 검출 기술

생화학적 검출 기술은 다수의 기술에 의해 평가할 수 있다. 본 발명과 사용될 수 있는 한가지 전형적 검정 혼합물은 보통 hSu(fu)가 결합하고 있고 (예를 들면, Gli), 보통 단리된 부분적으로 순수하거나 또는 순수한 형태를 갖는 단백질 및 hSu(fu)를 포함한다. 이들 성분 하나 또는 모두는 예를 들면, 단백질-단백질 결합을 제공 또는 증가, 검정 조건 하에서 안정도를 증가시키는 등을 할 수 있는 다른 펩티드 또는 폴리펩티드에 대한 hSu(fu)이다. 게다가, 성분 중 하나는 보통 검출가능한 라벨을 포함 또는 이에 커플링되어 있다. 라벨은 방사성활성, 발광, 광학또는 전자 밀도 등을 측정하는 것에 의해 직접 탐지에 또는 에피토프 태그, 효소 등과 같은 간접 탐지에 제공될 수 있다. 검정 혼합물은 추가로 후보 약지 제제 및 임의로 결합을 촉진하고, 안정도를 증가시키고, 비특이성 또는 배경 상호작용을 감소시키거나 검정의 효율 또는 감도를 달리 증가시키는 염, 완충액, 담체 단백질 (예를 들면, 알부민), 세제, 프로테아제 억제제, 뉴클레아제 억제제, 항미생물제제 등과 같은 다수의 다른 성분을 포함할 수 있다.

하기 검출 방법 또한 무세포 시스템에 사용할 수 있으며, 여기서 신호 도입 기질 분자 및 hSu(fu)를 포함하는 세포 용균물은 본 발명의 화합물과 혼합된다. 결과는 화합물이 첨가되지 않은 반응 혼합물과 얻은 것과 비교한다. 무세포 시스템은 천연 리간드 또는 그 동일성 확인을 요하지 않는다. 무세포 시스템은 화합물이 첨가되지 않은 혼합물을 요하지 않는다. 무세포 시스템은 천연 리간드 또는 그 동일성 확인을 요하지 않는다.

(b)생물학적 검출 기술

본 발명의 길항제/효현제 화합물의 그 자체로 헤지호그 신호전달을 조절하는 hSu(fu) 활성을 조절하는 능력은 또한 리간드 결합과 연관된 형태적 또는 기능적 변화를 기록함으로 측정할 수 있다. 당업계에 공지된 임의의 정성적 또는 정량적 기술을 hSu(fu)의 제어 하에 있는 세포 과정을 측정 및 관찰하는데 적용할 수 있다. 본 발명의 화합물의 활성은 또한 기능장애의 헤지호그 신호전달에 의해 야기되거나 이와 연관된 실험 질병 모델을 사용한 동물에서 평가할 수 있다. 예를 들면, 생쥐에서의 효과없는 DHh 헤지호그 신호전달은 생존가능하나 무균인 생쥐로 만든다. 돌연변이 h퓨즈드-DN의 효과 또한 IHh 발현에 의해 제어되는 장관 발생에 영향을 준다. 또한, 적당한 SHh 신호전달은 쥐과의 배아 발생에 척삭 및 바닥판, 신경관, 원위 사지 구조, 척수 칼럼 및 늑골에서 결정적이다. 부적당한 SHh 신호전달은 또한 외눈증(cyclopia)과 상관되어 있다. 임의의 이들 표현형 특성은 hSu(fu) 길항제 및(또는) 효현제에 대한 스크리닝 검정에서 평가 및 정량화될 수 있을 것이다. 헤지호그의 과발현과 연관된 질병 상태는 기저 세포 암종과 연관되어 있는 반면, 비활성 소닉 헤지호그 신호전달은 부적절한 신경 발생으로 이끈다.

본 발명은 hSu(fu) 단백질이 생리적 조건하에서 Gli 및(또는) Slimb 단백질과 복합체를 형성한다는 놀라운 발견에 기초한다. 이러한 발견은 hSu(fu) 단백질이 Gli 및(또는) Slimb 기능을 조절하여 Hh 신호 경로를 조절하도록 작용한다는 것을 나타낸다. 따라서, hSu(fu) 또는 Gli 및(또는) Slimb의 결합을 억제 또는 증대시키는 제제의 능력을 검출하는 검정을 조사 뱅크 (예를 들면, 화합물 라이브러리, 펩티드 라이브러리 등)의 용이한 고처리량 스크리닝에 대해 하여 hSu(fu) 또는 Gli 및(또는) Slimb 길항제 또는 효현제를 확인하였다. 이러한 hSu(fu) 또는 Gli 및(또는) Slimb 길항제 및 효현제는 hSu(fu) 및(또는) Gli 및(또는) Slimb 활성을 조절하고, 이에 따라 세포자멸(apoptosis)를 조절할 수 있다.

hSu(fu)/Gli 및(또는) Slimb 복합체 형성 또는 hSu(fu)/Gli 및(또는) Slimb 복합체 형성을 특이적으로 억제할 수 있는 제제 유효량을 환자에게 투여하는 것은 hSu(fu) 및(또는) Gli 및(또는) Slimb 활성을 조절하는 것에 의해 효과적으로 치료되는 병리 조건 (예를 들면, 암, 염증, 림프세포증식성 질환, 자가면역 질환, 신경퇴행성 질환 등)을 치료하기 위한 치료 또는 예방적 방법으로 사용할 수 있다.

결합 검정은 일반적으로 둘 중의 한 가지 형태를 취한다: 고정화된 hSu(fu) 폴리펩티드(들)는 라벨된 Gli 및(또는) Slimb 폴리펩티드(들)에 결합하도록 사용될 수 있거나, 역으로 고정화된 Gli 및(또는) Slimb 폴리펩티드(들)는 라벨된 hSu(fu) 폴리펩티드들에 결합하도록 사용될 수 있다. 별법으로, 결합 검정은 hSu(fu) 폴리펩티드와 호모다이머를 형성하는 hSu(fu) 폴리펩티드의 결합을 검출하기 위해 수행할 수 있으며, 전형적으로 라벨된 hSu(fu) 폴리펩티드는 수성 결합 조건 하에서 고정화된 hSu(fu) 폴리펩티드와 접촉하며, 결합 정도는 고정화된 라벨된 hSu(fu)의 양을 측정함으로 확인할 수 있다. 각 경우에, 라벨된 폴리펩티드는 폴리펩티드(들)의 특이적 결합을 가능케하는 수성 조건하에서 고정화 폴리펩티드와 접촉하여 첨가제 없이 hSu(fu)의 Gli 및(또는) Slimb와의 복합체를 형성한다. 특정한 수성 조건은 통상의 방법에 따라 숙련가에 의해 선택될 수 있다. 일반적 지침으로는, 2가 양이온(들) 및(또는) 금속 킬레이트화제 및(또는) 비이온성 세제 및(또는) 막 단편들이 임의로 첨가된 10-250 mM NaCl, 5-50 mM 트리스 HCl, pH 5-8의 완충된 수성 조건을 사용할 수 있다. 이들 기본적 조건에 첨가, 삭제, 개질 (예를 들면, pH) 및 치환 (예를 들면 KCl을 NaCl 대신 치환 또는 완충액 치환)을 일으킬 수 있음을 당업자들은 이해한다. hSu(fu) 폴리펩티드(들)의 Gli 및(또는) Slimb 폴리펩티드에 대한 결합이 제어 반응(들)에서 일어나도록 기본 결합 반응 조건을 개질할 수 있다. 일부 실시태양에서, 검정이 hSu(fu)/hSu(fu) 호모다이머의 형성을 탐지하는 경우, hSu(fu) 폴리펩티드의 hSu(fu) 폴리펩티드에 대한 특이적 결합이 제어반응(들)에서 일어나도록 기본 결합 반응 조건을 개질할 수 있다. 제어 반응 (제제를 포함하지 않음)에서 특이적 결합을 허용하지 않는 조건은 결합 검정에 사용하기 적당하지 않다. 미리 측정된 폴리펩티드 서열에 결합하는 폴리펩티드 서열을 확인하는 한 접근법은 미리 측정된 폴리펩티드 서열이 융합 단백질에 존재하는 이른바 "2-하이브리드" 시스템을 사용하였다 (치엔(Chein) 등, (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88:9578). 이러한 접근법은 생체내 단백질-단백질 상호작용은 전사 활성화제 (Fields S and Song O (1989) Nature 340:245), 효모 Gal4 전사 단백질의 재구성을 통하여 확인한다. 전형적으로, 이 방법은 DNA-결합 및 전사 활성화를 초래하는 분리가능한 도메인을 구성하는 효모 Gal4 단백질의 특성에 기초한다. 2 개의 하이브리드 시스템 (하나는 공지된 단백질의 폴리펩티드 서열에 융합된 효모 Gal4 DNA-결합 도메인을 구성하며, 다른 하나는 두번째 단백질의 폴리펩티드 서열에 융합된 Gal4 활성화 도메인을 구성하는 것)을 작성하고, 효모 숙주 세포에 도입하였다. 2개의 융합 단백질 간의 분자간 결합은 Gal4 DNA-결합 도메인을 Gal4 활성화 도메인과 재구성하고, 이는 Gal4 결합 부위에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자 (예를 들면, lacZ, HIS3)의 전사 활성화로 이끈다. 전형적으로, 2-하이브리드 방법은 공지 단백질과 상호작용하는 신규 폴리펩티드 서열을 확인하기 위해 사용된다 (Silver S C and Hunt S W (1993) Mol. Biol. Rep. 17:155; Durfee et al.(1993) Genes Devel. 7:555; Yang et al.(1992) Science 257:680; Luban et al.(1993) Mol. Biol. Rep. 17:155; Hardy et al.(1992) Genes Devel. 6:801; Barterl et al.(1993) Mol. Cell. Biol. 13:2899; and Madura et al.(1993) J.Biol. Chem. 268:12046). 2-하이브리드 시스템은 또한 2 개의 공지된 단백질의 상호작용 구조 도메인 (Bardwell et al.(1993) med. Microbiol. 8:1177; Chakraborty et al.(1992) J. Biol. Chem. 267:17498; Staudinger et al.(1993) J. Biol. Chem. 268:4608; and Milne GT and Weaver DT (1993) Genes Devel. 7:1755) 또는 단일 단백질의 올리고머화를 초래하는 도메인 (Iwabuchi et al.(1993) Oncogene 8:1693; Bogerd et al.(1993) J. Virol. 67:5030)을 확인하는데 사용된다. 생체내 단백분해 효소의 활성을 연구하기 위해 변형된 2-하이브리드 시스템을 사용하였다 (Dasmahapatr et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89:4159). 별법으로, 이. 콜라이(E. coli)/BCCP 상호작용성 스크리닝 시스템을 (Germino et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:933; Guarente L(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:1639) 상호작용성 단백질 서열 (즉, 헤테로다이머인 것 또는 고차 헤테로다이머를 형성하는 단백질서열)을 확인하기 위해 사용할 수 있다.

이들 2-하이브리드 방법 각각은 이에 따라 Gal4 결합 부위에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자의 전사를 유도하는 기능성 Gal4 전사 활성화제를 재구성하는 2 개의 Gal4 융합 단백질 간의 양성 연관성에 달려있다. 리포터 유전자의 전사는 (1) 열량 효소 검정에 의해 확인할 수 있는 효소 활성 (예를 들면, 베타-갈락토시다제)으로서, 또는 (2) 규정된 배지 (예를 들면, HIS3) 상에서의 증가된 세포 성장으로서 전형적으로 나타내어지는 양성 해독을 생기게 한다. 양성(positive) 해독 조건은 일반적으로 1 이상의 다음의 검출가능한 조건으로 확인된다: (1) 미리 측정된 리포터 유전자의 증가된 전사율, (2) 미리 측정된 리포터 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드 생성물의 증가된 농도 또는 풍부함 (전형적으로, 예를 들면 생체내에서 용이하게 검정될 수 있는 효소) 및(또는) (3) 반대의 2-하이브리드 시스템을 갖는 유기체 (예를 들면, 효모)에서의 선택가능한 또는 달리 확인가능한 표현형 변화. 일반적으로, 양성 해독을 특징하는 선택가능하거나 또는 달리 확인가능한 표현형 변화는 유기체에 제한 배지 상에서 선택적 성장 잇점, 교배 표현형, 특징적 형태 또는 발생 단계, 약물 내성 또는 탐지가능한 효소 활성 (예를 들면, 베타-갈락토시다제, 루시페라제, 알칼리성 포스파타제 등) 각각을 부여한다. 전사 활성화제는 특정 유전자의 발현을 양성 조절하는 단백질이다 이들은 특징 DNA 서열에 결합하며, 이에 의해 특이성을 부여하는 한 구역, 및 기본 유전자 발현 기관의 단백질 성분에 결합하는 활성화 도메인을 종결하는 다른 구역의 2 개의 구조 도메인으로 기능적으로 나뉠 수 있다 (Ma and Ptashne (1988) Cell 55:443). 이들 2 개의 도메인은 전사 활성화제로 작용하기 위해 물리적으로 연결되는 것이 필요하다. 2-하이브리드 시스템은 단리된 DNA 결합 도메인을 1 단백질 (단백질 X)과 짜맞추는 반면, 단리된 활성화 도메인을 다른 단백질 (단백질 Y)와 짜맞춤으로써 이러한 발견을 촉진한다. X 및 Y가 상당한 정도로 상호작용할 때, DNA 결합 및 활성화 도메인은 연결되며, 전사 활성화 기능을 재구성할 것이다 (Fields 및 Song(1989) Nature 340:245). 효모 숙주 계통은 단백질-단백질 상호작용에 대한 해독을 제공하는 특정 리포터 유전자 (예를 들면, HIS 3 또는 lacZ)를 재구성된 전사 활성화제가 발현되게 하도록 설계되었다 (Field 및 Song(1989) 상기 문헌, chien et al.(1991) 상기 문헌). 단백질-단백질 상호작용을 모니터링하는데 대한 2-하이브리드 시스템의 한가지 잇점은 물리적으로는 약하지만, 생리적으로는 중요한 단백질-단백질 상호작용을 탐지하는 감수성이다. 이와 같이 이는 단백질-단백질 상호작용을 탐지하는 다른 방법들(예를 들면, ELISA 검정)을 능가하는 중대한 잇점을 제공한다.

본 발명은 hSu(fu) 연관된 단백질 2-하이브리드 시스템 (전형적으로, 제1 하이브리드 단백질, 제2 하이브리드 단백질 및 리포터 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 형태이며, 상기 폴리뉴클레오티드(들)은 안정하게 복제되거나 일시적 발현을 위해 도입됨)을 갖는 숙주 유기체 (전형적으로, 단세포 유기체)를 제공한다. 한 실시태양에서, 숙주 유기체는 효모 세포 (예를 들면, 사카로마이세스 세레비지아에)이며, 여기서 리포터 유전자 전사 조절 서열은 Gal4-반응성 프로모터를 포함한다. (1) hSu(fu) 폴리펩티드에 결합할 수 있는 Gli 및(또는) Slimb의 결합 단편에 융합된 GAL4 DNA 결합 도메인 (또는GAL4 활성화 도메인)을 코딩하는 발현 카세트, (2) Gli 및(또는) Slimb 폴리펩티드에 결합할 수 있는 hSu(fu)의 결합 단편에 융합된 GAL4 DNA 활성화 도메인 (또는 각각 GAL4 결합 도메인)을 코딩하는 발현 카세트, 및 (3) 시스-연결된 GAL4 전사 반응 요소를 포함하는 리포터 유전자 (예를 들면, 베타-갈락토시다제)를 포함하는 효모는 약물 스크리닝에 사용할 수 있다. 이러한 효모는 시험 약물과 배양하며, 리포터 유전자 (예를 들면, 베타-갈락토시다제)의 발현을 확인한다; 제어 배양과 비교하여 리포터 유전자의 발현을 억제하는 약물의 능력은 약물의 후보 Gli 조절 약물 또는 hSu(fu) 조절 약물로 확인한다. 효모 2-하이브리드 시스템은 포유류 (전형적으로, 사람) cDNA 발현 라이브러리를스크리닝하는데 사용할 수 있고, 여기서 각각 cDNA는 GAL4 DNA 결합 도메인에 융합되어 있으며, 각 hSu(fu) 또는 Gli 및(또는) Slimb 폴리펩티드 서열은 GAL 활성화 도메인 또는 DNA 결합 도메인에 융합된다. 이러한 효모 2-하이브리드 시스템은 hSu(fu) 또는 Gli 및(또는) Slimb 서열에 결합하는 단백질을 코딩하는 cDNAs에 대해 스크리닝할 수 있다. 예를 들면, cDNA 라이브러리는 사람 성숙 B 세포 (Namalwa)계 (Ambrus et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.)) 또는 다른 적당한 세포형에서 온 mRNA로부터 제조할 수 있다. 효모 2-하이브리드 발현 시스템에 클로닝된 이러한 cDNA 라이브러리 (Chien et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:9578)는 hSu(fu) 또는 Gli 및(또는) Slimb와 상호작용하고, 이에 의해 GAL4 의존성 리포터 유전자 발현을 야기하는 단백질을 코딩하는 cDNA를 확인할 수 있다. hSu(fu) 또는 Gli 및(또는) Slimb와 상호작용하는 폴리펩티드는 또한 hSu(fu) 또는 Gli 및(또는) Slimb와 항체와의 면역침강 및 공동침전 종류에 의해 확인할 수 있다. 게다가, hSu(fu) 또는 Gli 및(또는) Slimb를 결합하는 폴리펩티드는 펩티드 라이브러리 (예를 들면, 박테리오파지 펩티드 디스플레이 라이브러리, 공간적으로 제한된 VLSIPS 라이브러리 어레이 등)를 hSu(fu) 또는 Gli 및(또는) Slimb 폴리펩티드와 스크리닝함으로 확인할 수 있다.

본 발명은 또한 (1) 제1 hSu(fu) 관련된 폴리펩티드 및 전사 활성화제 활성화 도메인을 포함하는 제1 하이브리드 단백질, (2) 제2 hSu(fu) 관련된 폴리펩티드 및 전사 활성화제 DNA-결합 도메인을 포함하는 제2 하이브리드 단백질, 숙주 세포 및 지시 매뉴얼을 갖는 2-하이브리드 시스템을 포함하는 키트를 제공한다. 이러한키트는 임의로 제1 및 제2 하이브리드 단백질 간의 분자간 결합을 변경하는 용량의 시험 약물 패널을 포함할 수 있다. 이러한 세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 얻은 데이타는 사람에서 사용량의 범위를 공식화하는데 사용할 수 있다. 본 발명의 화합물의 용량은 독성이 거의 또는 전혀 없이 순환하는 농도 범위내에 있어야만 한다. 용량은 이용되는 투약 형태 및 투여 경로에 따라서 이 범위내에서 변할 수 있다.

3.안티센스 뉴클레오티드

다른 바람직한 길항제류는 안티센스 뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하는 유전자 치료 기술 용도를 포함한다. 적용가능한 유전자 기술은 치료적으로 유효한 DNA 또는 mRNA의 단일 또는 다회 투여를 포함한다. 안티센스 RNAs 및 DNAs는 생체내 특정 유전자의 발현을 봉쇄하는 치료 약물로 사용할 수 있다. 짧은 안티센스 올리고뉴클레오티드는 이들이 세포막에 의해 제한적으로 유입되어 야기되는 낮은 세포내 농도에도 불구하고 억제제로 작용하는 세포내로 수입될 수 있다 [Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4143-4146 (1986)]. 올리고뉴클레오티드는 예를 들면, 음전하 포스포디에스테르기를 비전하기로 치환하는 것에 의해 개질시켜 유입을 증가시킬 수 있다.

핵산을 생존 세포내로 도입하는 다양한 기술이 공지되어 있다. 기술은 목적 숙주의 세포에서 핵산이 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 배양된 세포로 전달되는지에 따라서 달라진다. 핵산을 시험관내에서 포유류 세포로 전달하기 적당한 기술은 리포솜, 일렉트로포레이션, 마이크로주사, 세포 융합, DEAE-덱스트란, 칼슘포스페이트 침전법 등을 포함한다. 근래의 바람직한 생체내 유전자 치료 기술은 바이러스성 (전형적으로, 레트로바이러스성) 벡터로 트랜스펙션 및 바이러스 코팅 단백질-리포솜 매개 트랜스펙션을 포함한다 [Dzau et al., Trends Biotech. 11:205-210 (1993)]. 일부 경우, 표적화에 사용할 수 있는 엔도시토시스와 연관된 세포 표면 막 단백질에 특이적인 항체와 같은 표적 세포를 표적화하는 것 및(또는) 유입을 촉진하는 것 (예를 들면, 특정 세포 유형에 희귀한 캡시드 단백질 또는 그 단편), 사이클링에서 내부화를 겪는 단백질에 대한 항체, 및 세포내 국소화를 표적하며 세포내 반감기를 증가시키는 단백질인 약물과 핵산 출처를 제공하는 것이 바람직하다. 수용체 매개 엔도시토시스 기술은 예를 들면 문헌[Wu et al, J.Biol.Chem. 262:4429-4432 (1987); Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3410-3414 (1990)]에 기술되어 있다. 공지된 유전자 표지 및 유전자 치료 프로토콜 검토에 대해서는 문헌[Anderson et al., Science 256:808-813 (1992)]참조.

한 실시태양에서, hSu(fu) 길항제 및(또는) 효현제 분자는 세포에서 내생 리간드를 결합하고, 이에 의해 특히 세포에서의 hSu(fu) 수준이 정상 생리적 수준을 넘을 때 hSu(fu) 야생형에 비반응성인 세포를 유발하는데 사용할 수 있다. 또한, 이는 원치않는 세포 반응 (에를 들면, 종양 세포의 증식)을 활성화하는 내생 hSu(fu) 기질 또는 복합제를 결합하는데 유리할 수 있다.

본 발명의 추가 실시태양에서는, hSu(fu) 발현은 hSu(fu) 단백질의 발현을 감소시키는데 유효한 양의 hSu(fu) 안티센스 RNA 또는 DNA와 hSu(fu)-발현 세포를 제공하는 것에 감소시킬 수 있다.

본 발명의 유전자 서열을 포함하는 쉽게 확인 및 단리되는 종양 억제제 활성이 결손된 돌연변이 유전자와 같은 종양발생성 hSu(fu) 유전자에 특이적 안티센스 분자는 hSu(fu) 연관된 종양을 갖는다고 나타나거나 추정되는 세포에서의 발현을 하강조절하는데 사용된다. 안티센스 분자의 투여는 종양발생성 hSu(fu) 활성을 감소시키는 효과를 갖는다. 안티센스 서열은 표적 결손된 hSu(fu) 유전자의 mRNA에 상보적이며, 표적 유전자 생성물의 발현을 억제한다.

안티센스 분자는 합성 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 이러한 안티센스 올리고 뉴클레오티드는 일반적으로 약 7 이상, 통상적으로 약 12 이상, 더욱 통상적으로 약 20 뉴클레오티드 길이 이상이며, 약 500 이하, 통상적으로 약 50 이하, 더욱 통상적으로 약 35 뉴클레오티드 길이 이하이며, 여기서 길이는 교차 반응성의 존재 등을 포함하는 특이성, 억제 효율에 의해 지배된다. 7 내지 8 염기 길이의 짧은 올리고뉴클레오티드가 유전자 발현의 강하고 선택적인 억제제일 수 있다는 것을 발견되었다 (Wagner et al. Nature biotechnology 14:840-844 (1996) 참조). 특이적 구역 또는 내생 센스 가닥 mRNA 서열 구역을 선택하여 바람직하게는 hSu(fu) 돌연변이를 포함하는 안티센스 서열에 의해 보완한다. 후보 서열은 시험관내 또는 동물 모델에서의 표적 유전자의 발현 억제에 대해 검정하였다. mRNA 서열의 몇 군데 구역이 안티센스 상보성에 대해 선택된 경우 서열 조합 또한 사용할 수 있다. 안티센스 분자 및(또는) 다른 억제 약물 유입을 가능케하는 조건 하에서 종양 세포와 접촉하는 것에 의해 투여한다. 분자는 용액 또는 임의의 다른 제약적으로 적당한 투여 형태 (예를 들면, 리포솜 현탁액)로 제공될 수 있다. 세포에 의한 핵산 섭취를 증대시키기 위한 당업계에 공지된 많은 송달 방법이 있다. 유용한 송달 시스템으로는 센다이(Sendai) 바이러스-리포솜 송달 시스템 (Rapaport and Shai, J.Biol.Chem. 269:15124-15131 (1994) 참조), 양이온 리포솜, 폴리머성 송달 겔 또는 매트릭스, 다공성 풍선 카테터 (Shi et al., Circulation 90:955-951 (1994); 및 Shi et al. Gene Therapy 1:408-414 (1994)에 논의된 것), 레트로바이러스 발현 벡터 등을 들 수 있다. 송달 비히클로 리포솜을 사용하는 것은 흥미있는 한 방법이다. 리포솜은 표적 부위의 세포와 융합하며, 관강 내용물을 세포내적으로 송달한다. 리포솜은 접촉을 유지하는 다양한 방법 (예를 들면, 단리, 결합제 등)을 사용하여 융합하기 충분한 시간 동안 세포와 접촉되어 유지된다. 리포솜은 막 융합을 매개하는 정제 단백질 또는 펩티드 (예를 들면, 센다이 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스 등)를 사용하여 제조할 수 있다. 지질은 양이온 지질 (예를 들면, 포스파티딜콜린)을 포함하는 지질을 형성하는 공지된 리포솜의 임의의 유용한 조합일 수 있다. 잔존 지질은 정상적으로, 콜레스테롤, 포스파티딜 세린, 포스파티딜 글리세론 등과 같은 중성 지질일 것이다.

I.진단 용도

본원에 기재된 본 발명의 화합물 (예를 들면, 사람 및 척추동물 hSu(fu), 척추동물 hSu(fu) 변형체 및 항-척추동물 hSu(fu) 항체)의 다른 용도는 질환이 일정 정도로 hSu(fu) 또는 헤지호그 신호전달로 구동되는지 진단하는 것을 돕는 것이다. 예를 들면, 기저 세포암종 세포는 활성 헤지호그 신호전달과 연관되어 있다.

특정 질환이 헤지호그 신호전달에 의해 구동되는지를 측정하는 진단 검정은 다음의 단계를 사용하여 수행할 수 있다: (1) 시험 세포 또는 조직 배양; (2) hSu(fu) 매개 헤지호그 신호전달을 억제할 수 있는 화합물 투여, 및 (3) 대조군에 비하여 헤지호그 신호전달이 조절된 정도를 측정. 단계들은 본원에 개시된 바에 비추어 표준 기술을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들면, 표준 기술을 사용하여 세포 또는 조직을 단리 및 생체내에서 배양할 수 있다.

하기 실시예들은 예시적 목적으로만 제공되며, 어떠한 경우로도 본 발명의 범위를 한정할 의도는 아니다.

본원 명세서에 인용된 모든 특허 및 참고 문헌들은 전체로서 참고문헌으로 삽입되었다.

실시예에서 거론된 상업적으로 입수가능한 시약들은 달리 지시하지 않는 한 제조자의 지시문에 따라서 사용하였다. ATCC 기탁 번호에 의한 하기 실시예 및 명세서를 통하여 확인된 이들 세포 출처는 미국 버지니아주 마나사스 소재 아메리칸 타입 컬처 컬렉션 (American Type Culture Collection)이다.

실시예 1. 사람 hSu(fu)를 코딩하는 cDNA 클론의 단리

공중 서열 데이타베이스 (진뱅크)를 검색하였으며, 드로소필라 멜라노가스터의 퓨즈드 단백질의 억제자에 상동성을 나타내는 생쥐 EST를 확인하였다 (AA223637). 생쥐 EST의 추정 연역된(deduced) 아미노산 서열은 dSu(fu) 단백질의84개 중 64개 아미노산과 매치되었다. 이어서, EST 서열을 공중 EST 데이타베이스 (예를 들면, 진뱅크), 및 독점적 EST 데이타베이스 (라이프시크(LIFESEQ)(등록상표), 미국 캘리포니아노 팔로 알토 인사이트 제약 (Incyte Pharmaceuticals))를 포함하는 다양한 EST 데이타베이스와 비교하여 상동적 EST 서열을 확인하였다. 컴퓨터 프로그램 BLAST 또는 BLAST2를 사용하여 비교를 행하였다 [Altschul et al., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996)]. 공지 단백질을 코딩하지 않는 BLAST 스코어 70 (또는 일부 경우, 90) 이상을 얻은 비교물을 프로그램 "phrap" (미국 워싱턴주 시애틀, 유니버티시 오브 워싱턴, 필 그린)을 갖고 컨센서스(consensus) DNA로 모아서 조립하였다. 컨센서스 서열은 도 7 (서열 확인 번호 3)에 나타내었으며, 본원에서 DNA33454로 지정하였다.

도 7 (서열 확인 번호 3)에 나타낸 DNA33454 컨센서스 서열에 기초하여, 올리고뉴클레오티드를 1) 관심있는 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리를 PCR로 확인하기 위해서, 및 2) hSu(fu)에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리하기 위한 탐침으로 사용하기 위해 합성하였다. 전방(forward) 및 역(reverse) PCR 프라이머는 일반적으로 20 내지 30 뉴클레오티드 범위이며, 종종 약 100-1000 bp 길이 PCR 생성물을이 되도록 고안된다. 탐침 서열은 전형적으로 40-55 bp 길이이다. 일부 경우, 컨센서스 서열이 약 1-1.5 Kbp보다 클 때는 추가 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 전장 클론에 대한 몇 개의 라이브러리를 스크리닝하기 위해서, 라이브러리에서의 DNA를 PCR 프라이머 쌍을 갖고 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, 상기 문헌]에 따라서 PCR 증폭으로 스크리닝하였다. 이어서,포지티브 라이브러리를 사용하여 탐침 올리고뉴클레오티드 및 프라이머 쌍 중 하나를 사용하여 관심있는 유전자를 코딩하는 클론을 단리하였다.

PCR 프라이머 (전방 및 역)를 합성하였다:

전방 PCR 프라이머5'-CAGCCGAACCCGCTCCAGGTTAC-3' (서열 확인 번호 7)

역 PCR 프라이머5'-CATGGACTCTGTTGTCACCATAGAG-3' (서열 확인 번호 8)

또한, 사람 태아 폐 pRK5 포유류 발현 라이브러리를 다음의 뉴클레오티드 서열을 갖는 컨센서스 DNA33454 서열로부터 구성한 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 탐침으로 스크리닝하였다:혼성화 탐침

5'-GAGCACTGGCACTACATCAGCTTTGGCCTGAGTGATCTCT-3' (서열 학인 번호 9)

cDNA 라이브러리를 구성하기 위한 RNA를 사람 태아 폐 조직으로부터 단리하였다. cDNA 클론을 단리하기 위해 사용된 cDNA 라이브러리는 상업적으로 입수가능한 시약 (예를 들면, 미국 캘리포니아주 산 디에고 인비트로젠(Invitrogen)으로부터 입수가능한 것)을 사용하여 표준 방법으로 구성하였다. cDNA는 NotI 부위를 포함하는 올리고 dT로 프라이밍하였고, SalI 헤미키나제된 어댑터에 블런트로 연결하였고, NotI로 분절하였고, 겔 전기영동에 의해 적합한 크기로 하였으며, 독특한 XhoI 및 NotI 부위에서 정해진 배향에서 적당한 클로닝 벡터 (예를 들면, pRKB 또는 pRKD; pRK5B는 SfiI 부위를 포함하지 않는 pRK5D의 전구체임; Holmes et al., Science, 253:1278-1280 (1991) 참조)로 클로닝하였다.

상기 기술한 바에 의해 단리된 클론의 DNA 서열 분석은 hSu(fu)에 대한 전장 DNA 서열(본원에서 DNA33455-1548로 지정함 [도 6A-6B, 서열 확인 번호 1]; (또한UNQ650으로 지정함)) 및 hSu(fu) (서열 확인 번호 2; 도 1)에 대한 유도 단백질 서열을 제공하였다. 클론 UNQ650 (DNA33455-1548로 지정하여 기탁)은 ATCC에 1999년 3월 5일자로 기탁하였으며, ATCC 기탁 번호 PTA-127이 할당되었다.

UNQ650 (DNA33455-1548)의 총 뉴클레오티드 서열은 도 6A-6B (서열 확인 번호 1)에 나타내었다. 클론 UNQ650 (DNA33455-1548)은 뉴클레오티드 74-74에 분명한 해독 개시 부위를 갖고, 뉴클레오티드 위치 1373-1375에서의 종결 코돈에서 끝나는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 6A-6B). 예측되는 폴리펩티드 전구체는 433 아미노산 길이이다 (도 1). 도 1에 나타낸 전장 hSu(fu) 단백질은 약 47,932 달톤의 추정 분자량 및 약 5.66의 pI를 갖는다. 도 1 (서열 확인 번호 2)에 나타낸 전장 hSu(fu) 서열의 분석은 약 아미노산 265 내지 약 아미노산 268의 잠재적 N-글리코실화 부위의 존재를 입증한다. hSu(fu)를 dSu(fu)와 정렬하여 아미노산 수준에서 37.7% 동일성을 밝혔고 (도 1), 이는 보전성 아미노산 치환을 고려할 때 63%까지 증가한다. 프로사이트(Prosite) 데이타베이스에 대한 hSu(fu)의 검색은 15 개의 잠재적인 인산화 부위를 밝혀냈으며, 이들 중 몇몇은 종 간에 보존되어 있다 (도 1에 나타냄). 프로사이트 검색은 hSu(fu)에서 3 개의 후보 PKA 인산화 부위를 확인하였으나, dSu(fu)에서는 없었다. 그러나, 검색 전략에 몇 가지의 활성이 덜한 잠재적 PKA 인산화 부위 모티프를 포함시킴에 의해, 2 개의 추가 부위를 hSu(fu)에서 확인하였으며, 5 개의 이러한 부위를 dSu(fu)에서 확인하였다 (도 1). PEST 알고리즘 (40)은 344-358 아미노산에 걸친 한계 PEST 서열을 확인하였다. hSu(fu) 유전자는 FISH 분석에 의하여 염색체 10, 구역 q24-q25에 유전자지도를 작성하였다.

도 1 (서열 확인 번호 2)에 나타낸 전장 서열의 WU-BLAST2 서열 정렬 분석을 사용한 데이호프(Dayhoff) 데이타베이스 (버전 35.45 SwissProt 35) 분석은 hSu(fu) 아미노산 서열과 다음 데이호프 서열 간에 유의성있는 상동성을 입증하였다: S55695, A45983, PAC4_RAT, P_R93246, S49624, CA39_CHICK, S30127, MTCI28_32, MTV043_60 및 LEG3_CRILO.

실시예 2. 혼성화 탐침으로의 hSu(fu)의 용도

다음 방법은 혼성화 탐침으로의 hSu(fu)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 용도를 설명한다.

전장 또는 성숙 hSu(fu) (도 6A-6B, 서열 확인 번호 1에 나타냄)의 코딩 서열을 포함하는 DNA는 사람 조직 cDNA 라이브러리 또는 사람 조직 유전체 라이브러리에서 상동적 DNAs (예를 들면, 천연 발생 hSu(fu) 변형체와 같은 것)에 대한 스크리닝 탐침으로 이용된다.

혼성화 및 어느 라이브러리 DNAs를 포함하는 필터의 세척은 다음의 고 엄격도 조건하에서 수행하였다. 필터에 대한 방사성 라벨된 hSu(fu) 유도된 탐침의 혼성화는 50% 포름아미드, 5×SSC, 0.1% 소듐 피로포스페이트, 50 mM 소듐 포스페이트, pH 6.8, 2×덴하르트 용액, 및 10% 덱스트란 술페이트의 용액에서 42℃에서 20 시간 동안 수행하였다. 필터의 세척은 42℃에서 0.1×SSC 및 0.1% SDS의 수용액에서 수행하였다.

이어서, 전장 천연 서열 hSu(fu)를 코딩하는 DNA와 원하는 서열 동일 성을 갖는 DNAs는 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 확인할 수 있다.

실시예 3. 제자리 혼성화에 대한 혼성화 탐침으로서의 hSu(fu)의 용도

설치류 Su(fu) mRNA에 대해 제자리 혼성화를 수행하였다. 배아기 8.5일 (E8.5) 생쥐 배아에 대한 총 마운트(whole-mount) 제자리 혼성화를 기술한대로 수행하였다 (37). 탐침은 사람 서열 뉴클레오티드 116-390 (뉴클레오티드 1=개시유전자 ATG에서의 A)에 상응하는 T7 RNA 중합효소 및 생쥐 Su(fu) cDNA PCR 주형으로 합성되는 디곡시제닌(digoxigenin)-라벨된 RNA였다. 조직 절편에 대한 제자리 혼성화를 위해서, 쥐 E11.5 및 E15.5 전체 배아, 및 후산기(postnatal) 1일 (P1) 쥐뇌를 4% 파라포름알데히드에서 밤새 4℃에서 침지(immersion)-고정하였고, 15% 수크로스에서 밤새 동해방지 하였으며(cryoprotected), O.T.C. (VWR 사이언티픽)에서 끼워넣었으며, 액체 질소 상에서 동결하였다. 성체 쥐 뇌를 분말화된 드라이 아이스로 신선 동결하였다. 성체 쥐 척수 및 생쥐 고환은 O.T.C에 끼워넣었으며, 액체 질소 상에서 동결하였다. 절편은 16 ㎛로 절단하였으며, 상기 기술한 바와 같이 제자리 혼성화 과정을 진행하였다 (38).³³P-UTP 라벨된 RNA 탐침을 기술한 바와 같이 생성하였다 (39). 센스 및 안티센스 탐침은 사람 서열의 뉴클레오티드 97-424를 포함하는 hSu(fu) cDNA PCR 단편으로부터 T7 RNA 폴리머라제로 합성하였다.

총 마운트 제자리 혼성화는 Su(fu) mRNA가 E8.5 생쥐에서 널리 발현된다는것을 밝혔으며 (도 3A-3B), 초기 발생 시기를 검사하였다. 라벨링은 발생중인 신경판을 통하여 균일하게 강하게 나타났다. 단지 심장의 원기(anlage)만이 이단계에서 특이적으로 라벨링되지 않았다 (도 3B). 생쥐에서 E11.5에서, Su(fu) 메시지는 중추신경계, 척수 및 몸분절을 통하여 널리 잔존하였다 (도 3C). E11.5 및 E15.5 쥐 척수의 횡단면은 활발한 세포 증식 구역인 심실 구역의 발생중인 신경상피 내의 현저한 신호를 밝혔다 (도 3E 및 3F). 뇌, 척수, 장관, 폐 및 고환을 포함하는 E15.5 배아에 걸치 조직을 Su(fu)에 대해 라벨링하였고, 간만이 매우 낮은 신호를 표시하였다 (도 3D). P1 쥐 뇌에서, Su(fu) mRNA는 신경상피, 심실하 구역 및 해마상 신경 세포 필드에 놓인 현저한 신호로 널리 발현되었다 (도 3G). 메시지는 여전히 약하게 검출가능하게 성체 뇌에서 급격히 하강 조절되었으나, 상대적으로 높은 발현이 해마, 소뇌 과립체 및 푸르킨제 세포층, 및 후구(olfactory bulb)에서 관찰되었다 (도 3H-3J).

Dhh는 시험에서 특이적으로 발현되고, 정자발생에 결정적이므로, 성체 생쥐 고환을 Su(fu) mRNA에 대해 검사하였다 (41). 고환의 횡단면에서, Su(fu) mRNA는 정세관(seminiferous tubule)의 아집단에서 집중적으로 발현되었고, 이는 그 전사가 생식 세포 분화 단게에 따라 조절될 수 있음을 암시한다 (도 4A). Su(fu) 메시지는 발생중인 정모세포의 구역에 걸쳐 은색 과립의 고리로 관찰되었다 (도 4C 및 4D). 관 내의 많은 부위에서, 가장 높은 발현은 생식 세포 분화의 최후 단계가 일어나는 중앙부에 집중되었다 (도 4E). 센스 가닥 대조 탐침의 인접 조직 절편에 혼성화한 것은 배경 이상의 신호를 보여주지 않았다 (도 4B).

실시예 4. hSu(fu) 유전자의 염색체 위치 맵핑하는 혼성화 탐침으로의 hSu(fu)의 용도

hSu(fu) 유전자의 염색체 국소화를 측정하였다. 사람 혈액으로부터 단리한 림프구는 37℃에서 68-72 시간 동안 10% 태아 송아지 혈청 및 파이토케마글루티닌으로 보충한 알파MEM에서 배양하였다. 배양물을 BrdU (0.18 mg.ml; Sigma)로 처리하여 세포 군락을 동조화시키고, 이어서 무혈청 배지로 3회 세척하였으며, 37℃에서 6 시간 동안 티미딘 (2.5 mg/ml; Sigma)가 있는 알파MEM에서 재배양하였다. 세포를 수확하였으며, 표준 방법에 의해 슬라이드를 준비하였고, 저장(hypotonic) 처리, 고정 및 자연 건조하였다. 전장 hSu(fu) cDNA를 바이오닉(BioNick) 라벨링 키트 (Gibco BRL)을 사용하여 15℃에서 2 시간 동안 dATP의 존재 중에서 비오틴화하였다. 형과 정위치 혼성화 (FISH)를 기술한대로 행하였다 (35, 36). 간단하게, 슬라이드를 55℃에서 구웠으며, RNAase로 처리하였고, 2×SSC 중의 70% 포름아미드에서 2 시간 동안 (70℃) 변성하였으며, 에탄올 중에서 탈수하였다. 탐침은 50% 포름아미드 및 10% 덱스트란 술페이트로 구성된 혼성화 혼합물 중에서 75℃에서 5 시간 동안 변성하였다. 변성된 염색체 준비물을 밤새 탐침으로 혼성화하고, 세척하였으며, 형광 항-비오틴 항체로 라벨링 및 DAPI 염색하였다. 각 염색체 퍼짐의 FISH 신호 및 DAPI 밴딩 패턴을 각각 기록하였고, 이어서 포개어서 hSu(fu) 매핑 위치에 할당하였다.

상기 FISH 분석에 의해서, hSu(fu) 유전자는 염색체 10q24-25에 지도를 작성하였다. 흥미롭게도, 다형성 교모세포증, 전립선 암, 악성 흑색종 및 자궁내막암 (44-47)을 포함하여 다수의 종양에서의 이형접합성의 상식 (LOH) 분석에 기초하여 종양 억제 유전자에 대한 2 개의 유전자위는 간격 10q23-qter 내에 제안되었다. 이러한 견지에서, 다수의 암에서 돌연변이된 것으로 발견된 2 개의 후보 종양 억제 유전자는 또한 이 구역에 맵핑되는 것이 근래 설명되었다: 10q23.3에서의 MMAC1/PTEN (48, 49) 및 10q25.3-26.1에서의 DMBT1 (악성 뇌 종양에서는 결실) (50). hSu(fu)가 세포 증식 활성하 구역에서 높게 발현된다는 것 (도 3F-J 참조), 및 HH 신호전달의 억제제라는 발견과 연합하여, hSu(fu)의 염색체 국소화는, hSu(fu)가 패치드와 같이 종양 억제자일 가능성이 높음을 나타낸다.

실시예 5. 이. 콜라이에서의 hSu(fu)의 발현

본 실시예는 이. 콜라이에서의 재조합 발현에 의한 hSu(fu)의 비글리코실화 형태의 제조를 설명한다.

hSu(fu) (서열 확인 번호 1)을 코딩하는 DNA 서열은 선택한 PCR 프라이머를 사용하여 초기 증폭하였다. 프라이머는 선택한 발현 벡터 상의 제한 효소에 상응하는 제한 효소 부위를 포함하여야 한다. 다양한 발현 벡터를 사용할 수 있다. 적당한 벡터의 예는 암피실린 및 테트라사이클린 내성 유전자를 포함하는 pBR322 (이. 콜라이로부터 유래; Bolivar et al., Gene, 2:95 (1997) 참조) 이다. 벡터는 제한 효소로 소화하고, 탈인산화하였다. 이어서, PCR 증폭된 서열은 벡터와 리게이션하였다. 벡터는 바람직하게는 항생물질 내성 유전자, trp 프로모터, 폴리-히스티딘 리더 (제1 6개의 STII 코돈, 폴리-히스티딘 서열 및 엔테로키나제 분절 부위를 포함함), hSu(fu) 코딩 구역, 람다 전사 종결자 및 argU 유전자를 코딩하는 서열을 포함할 것이다.

이어서, 리게이션 혼합물을 사용하여 상기 삼브룩 등의 문헌에 기술된 방법을 사용하여 선택한 이. 콜라이 균주를 형질전환하였다. 형질전환체는 LB 플레이트 상에서 성장하는 능력으로 확인하였으며, 항생물질 내성 콜로니를 선택하였다. 플라스미드 DNA를 단리하고, 제한 분석 및 DNA 서열분석에 의해 확인하였다.

선택한 클론은 밤새 항생물질을 보충한 LB 브로쓰와 같은 액체 배양 배지에서 키울 수 있었다. 그 결과, 밤샘 배양은 더 큰 척도의 배양을 접종하는데 사용할 수 있었다. 이어서, 세포는 발현 프로모터가 작동되는 동안 원하는 광학 밀도로 키울 수 있었다.

수 시간 더 세포를 배양한 후, 세포를 원심분리로 수확할 수 있었다. 원심분리에 의해 얻은 세포 펠렛은 당업계에 공지된 다양한 약물을 사용하여 가용화할 수 있으며, 가용화된 hSu(fu) 단백질은 이어서 단백질의 강한 결합을 허용하는 조건하에서 금속 킬레이트 칼럼을 사용하여 정제할 수 있었다.

실시예 6. 포유류 세포에서의 hSu(fu)의 발현

본 실시예는 포유류 세포에서의 재조합 발현에 의한 잠재적으로 글리코실화된 형태의 hSu(fu)의 제조를 설명한다.

벡터 pRK5 (1989년 3월 15일 공개된 EP 307,247호 참조)를 발현 벡터로 이용하였다. 임의로, hSu(fu) DNA는 상기 삼브룩 등의 문헌에 기술된 것과 같은 리게이션 방법을 사용하여 hSu(fu) DNA의 삽입을 가능케하는 선택된 제한 효소와 pRK5 내로 리게이션하였다. 얻어진 벡터는 pRK5-hSu(fu)로 지칭한다.

한 실시태양에서, 선택하는 숙주 세포는 293 세포일 수 있다. 사람 293 세포 (ATCC CCL 1573)는 태아 송아지 혈청 및 임의로 영양 성분 및(또는) 항생물질을 보충한 DMEM과 같은 배지 중에서 조직 배양 플레이트에서 합류하도록 키웠다. 약 10 ㎍ pRK5-hSu(fu) DNA를 VA RNA 유전자를 코딩하는 DNA 약 1 ㎍와 혼합하였고 [Thimmappaya et al., Cell, 31;543 (1982)], 1 mM 트리스-HCl, 0.1 mM EDTA, 0.227 M CaCl₂500 ㎕ 중에 용해하였다. 이 혼합물에 50 mM HEPES (pH 7.35), 280 mM NaCl, 1.5 mM NaPO₄500 ㎕를 적가하였고, 25℃에서 10 분 동안 침전이 형성되도록 하였다. 침전물을 현탁하였고, 293 세포에 가하였으며, 37℃에서 약 4 시간 동안 안정되도록 하였다. 배양 배지를 빨아내었으며, PBS 중의 20% 글리세롤 2 ml을 30 초 동안 가하였다. 이어서, 293 세포는 무혈청 배지로 세척하였고, 신선한 배지를 가하였으며, 세포는 약 5 일 동안 배양하였다.

트랜스펙션 약 24 시간 후에, 배양 배지를 제거하고, 배양 배지 (단독) 또는 200 μCi/ml³⁵S-시스틴 및 200 μCi/ml³⁵S-메티오닌을 포함하는 배양 배지로 대체하였다. 12 시간 인큐베이션 후, 조절된 배지를 수집하고, 회전 여과기 상에서 농축하였고, 15% SDS 겔에 로딩하였다. 처리된 겔은 건조하고 선택한 기간 동안 필름에 농출하여 hSu(fu) 폴리펩티드의 존재를 밝혀낼 수 있었다. 트랜스펙션된 세포를 포함하는 배양물은 더 인큐베이션하고 (무혈청 배지에서), 배지는 선택한 생물검정에서 시험하였다.

별법으로, hSu(fu)는 문헌[Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981)]에 기술된 덱스트란 술페이트 방법을 사용하여 일시적으로 293 세포 내로 도입할 수 있다. 293 세포는 스피너 플라스크에서 최대 밀도 까지 키웠으며, 700 ㎍ pRK5-hSu(fu) DNA를 가하였다. 세포는 첫번째로 원심분리에 의해 스피너 플라스크로부터 농축하였으며, PBS로 세척하였다. DNA-덱스트란 침전물은 세포 펠렛에서 4 시간 동안 인큐베이션하였다. 세포는 20% 글리세롤로 90초간 처리하였으며, 조직 배양 배지로 세척하였으며, 조직 배양 배지, 5 ㎍/ml 소 인슐린 및 0.1 ㎍/ml 소 트란스페린을 포함하는 스피너 플라스크로 재도입하였다. 약 4일 후, 조절된 배지를 원심분리하였으며, 투석 및(또는) 칼럼 크로마토그래피와 같은 임의의 선택된 방법으로 정제하였다.

다른 실시태양에셔, hSu(fu)는 CHO 세포에서 발현될 수 있다. pRK5-hSu(fu)는 CaPO₄또는 DEAE-덱스트란과 같은 공지된 시약을 사용하여 CHO 세포 내로 형질전환할 수 있다. 상기 논의한 바와 같이, 세포 배양물을 인큐베이션할 수 있으며, 배지는 배양 배지 (단독) 또는³⁵S-메티오닌과 같은 방사성라벨을 포함하는 배지로 대체하였다. hSu(fu) 폴리펩티드의 존재를 측정한 후, 배양 배지는 무혈정 배지로 대체할 수 있다. 바람직하게는, 배양물은 약 6일 동안 인큐베이션하였고, 이어서 조절된 배지를 수확하였다. 발현된 hSu(fu)를 포함하는 배지는 이어서 농축하고임의의 선택된 방법으로 정제할 수 있다.

에피토프-태그된 hSu(fu)는 또한 숙주 CHO 세포에서 발현될 수 있다. hSu(fu)는 pRK5 벡터 외로 서브클로닝할 수 있다. 서브클론 삽입물은 PCR하여 폴리-his와 같은 선택된 에피토프 태그와의 프레임에서 바쿨로바이러스(Baculovirus) 발현 벡터 내로 융합될 수 있다. 이어서, 폴리-히스티딘 태그된 hSu(fu) 삽입물은 안정한 클론을 선택하기 이해 DHFR과 같은 선택 마커를 포함하는 SV40 구동 벡터로 서브클로닝할 수 있다. 최종적으로, CHO 세포는 SV40 구동 벡터와 (상기 기술한 바와 같이) 형질전환할 수 있다. 상기 기술한 바와 같이 라벨링하여 발현을 확증할 수 있다. 발현된 폴리-히스티딘 태그된 hSu(fu)를 포함하는 배양 배지는 이어서 농축하고, Ni²⁺-킬레이트 친화도 크로마토그래피에 의한 것과 같이 임의의 공지된 방법에 의해 정제할 수 있다.

단백질-단백질 상호작용을 연구하기 위하여, 다양한 서브클론 및 cDNA 구성물을 hSu(fu) 및 다른 단백질 제조를 이해 창조하였다. hSu(fu) cDNA는 CMV-기재 발현 벡터 (pRK)로 서브클로닝하였으며, 그 카르복시 말단에 플래그 펩티드로 에피토프 태그하여 도 10에 존재하는 hSu(fu)-플래그-에피토프 단백질 (서열 확인 번호 10)을 코딩하는 삽입체를 포함하는 pRK.hSu(fu)를 제조하였다. 사람 Gli cDNA (킨즐러 박사(Dr. Ken Kinzler)에 의해 제공됨)는 동일한 발현 벡터 내로 클로닝하였으며, 9E10 c-myc 에피토프를 아미노 말단 (첫번째 ATG 바로 뒤)에 도입하여 pRK.hGli를 제조하였다. 사람 Gli3 (루퍼트 박사(Dr. Mike Ruppert)에 의해 제공됨) 또한 pRK로 클로닝하였다. 3' 말단부터 삽입체를 서열 분석하여 단백질의 미성숙된 절단체를 야기하는, 공개된 서열 (32)와 비교하여 4700 위치에서 없어진 "T" 뉴클레오티드를 밝혀내었다. 위치 지정 돌연변이발생 (Site-directed mutagenesis) (Muta-Gene Phagemid 시험관내 돌연변이발생 시스템, Bio-Rad)는 pRK.hGli3를 생성하는, 이 위치에서의 "T"를 첨가하는데 사용하였다. 생쥐 Gli2의 코딩 구역은 주형으로 마라톤 레디 생쥐 E11 (Marathon Ready mouse E11) cDnA (클론테크)를 사용하여 타카라(Takara) LA 폴리머라제 (Takara Shuzo Co., Ltd.)와의 pCR에 의하여 얻었으며, pRK 내로 클로닝하여, pRK.mGli2를 수득하였다. 사람 Slimb 서열 (33)과 비교하여 첫번째 22 아미노산이 없어진 생쥐 Slimb cDNA를 게놈 시스템 (클론 번호 제1068742호)로부터 얻었으며, 5' RACE에 의해 연장하였다. 몇가지 다른 5' RACE 생성물을 회수하였고, 이는 유전자가 5' 말단에서 별개로 스플라이싱되게 된다 (또한 (33), (34) 참조). 공개된 사람 Slimb의 아미노 말단과가장 근접하게 매칭된 서열을 단리하였고, pRK로 클로닝하여 pRK.mSlimb를 제조하였다. mSlimb cDNA로부터 예견되는 단백질은 사람의 대응부 (33)과 572 아미노산 중 단지 9 개만이 상이하다. 글루타치온-S-트랜스퍼라제 (GST)-hSu(fu) 발현 구성물 (pGEX.hSu(fu))는 파마시아 pGEX 벡터 시스템을 사용하여 만들었다. (GST)-hSu(fu) (서열 확인 번호 11)의 발현된 아미노산 서열은 도 11에 나타나 있다.

실시예 7. 효모에서 hSu(fu)의 발현

다음의 방법은 효모에서의 hSu(fu)의 재조합 발현을 설명한다.

첫째로, 효모 발현 벡터는 ADH2/GAPDH 프로모터로부터 hSu(fu)의 분비 또는 세포내 생성을 위해 작성하였다. hSu(fu)를 코딩하는 DNA 및 프로모터는 선택한 플라스키드 중의 적당한 제한 효소 부위로 삽입하여 hSu(fu)의 세포내 발현으로 향하게 하였다. 분비를 위하여, hSu(fu)를 코딩하는 DNA는 hSu(fu)의 발현을 이하여 ADH2/GAPDG 프로모터를 코딩하는 DNA, 천연 hSu(fu) 신호 펩티드 또는 다른 포유류 신호 펩티드, 또는 예를 들면 효모 알파-인자 또는 인버타제 분비성 신호/리더 서열 및 링커 서열 (필요한 경우)와 함께 선택된 플라스미드 내로 클로닝할 수 있다.

효모 균주 AB110과 같은 효모 세포는 이어서 상기 기술한 발현 플라스미드로 형질전환 및 선택한 발효 배지에서 배양하였다. 형질전환된 효모 상층액은 10% 트리클로로아세트산으로 침전 및 SDS-PAGE에 의한 분리, 이어서 쿠마지 블루 염색으로 겔을 염색한 것에 의해 분석할 수 있다.

재조합 hSu(fu)는 이어서 단리하고, 효모 세포를 원심분리에 의해 발효 배지로부터 제거하며, 이어서 선택한 카트리지 필터를사용하여 배지를 농축할 수 있다. hSu(fu)를 포함하는 농축물은 선택된 칼럼 크로마토그래피 수지를 사용하여 더 정제할 수 있다.

실시예 8. 바쿨로바이러스 감염된 곤충 세포에서 hSu(fu)의 발현

다음의 방법은 바쿨로바이러스에 감염된 곤충 세포에서의 hSu(fu)의 재조합 발현을 기술한다.

hSu(fu)를 코딩하는 서열은 바쿨로바이러스 발현 벡터 내에 포함된 에피토프태그의 상류 퓨즈드이다. 이러한 에피토프 태그는 폴리-his 태그 및 면역글로불린 태그 (IgG의 Fc 구역과 같은 것)를 포함한다. pVL 1393 (노바겐)과 같이 상업적으로 입수가능한 플라스미드로부터 유래한 플라스미드를 포함하여 다양한 플라스미드를 이용할 수 있다. 간단하게는, hSu(fu)를 코딩하는 서열 또는 hSu(fu)의 코딩 서열의 원하는 부분 (예를 들면, 성숙 단백질을 코딩하는 서열)은 5' 및 3' 구역에 상보적인 프라이머로 PCR에 의해 증폭된다. 5' 프라이머는 플랭킹(flanking) (선택된) 제한 효소 부위를 혼입할 수 있다. 이어서, 생성물은 선택된 제한 효소로 소화시키고, 발현 벡터 내로 서브클로닝하였다.

재조합 바쿨로바이러스는 상기 플라스미드 및 바쿨로골드(BaculoGold) 바이러스 DNA (파민젠(Pharmingen))을 리포펙틴 (GIBCO-BRL로부터 상업적으로 입수가능함)을 사용하여 스포도프테라 프루지페르다(Spodoptera frugiperda) ("Sf9") 세포 (ATCC CRL 1711) 내로 공동 트랜스펙션에 의해 생성하였다. 28℃에서 4-5일 인큐베이션 후, 방출된 바이러스를 수확하였고, 더 증폭하기 위해 사용하였다. 바이러스 감염 및 단백질 발현은 오'레일리(O'Reilley) 등의 문헌[Baculovirus expression vectors:A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)]에 기술된 바대로 수행하였다.

이어서, 발현된 폴리-히스티딘 태그된 hSu(fu)를 예를 들면, 다음과 같은 Ni²⁺-킬레이트 친화도 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다. 추출물은 루퍼트(Rupert) 등의 문헌[Nature, 362;175-179 (1993)]에 기술된 바와 같이 재조합 바이러스 감염된 Sf9 세포로부터 제조하였다. 간단하게는, Sf9 세포를 세척하고, 초음파처리 완충액 (25 mL Hepes, pH 7.9; 12.5 mM MgCl₂; 0.1 mM EDTA; 10% 글리세롤; 0.1% NP-40; 0.4 M KCl)에 재현탁하였으며, 얼음 상에서 20초간 2회 초음파처리하였다. 초음파처리물은 원심분리로 깨끗하게 하였으며, 상층액을 로딩 완충액 (50 mM 포스페이트, 300 mM NaCl, 10% 글리세롤, pH 7.8) 중에 50배 희석하였으며 0.45 m 필터로 여과하였다. Ni²⁺-NTA 아가로스 칼럼 (퀴아겐(Qiagen)으로부터 상업적으로 입수)을 5 mL의 베드 부피로 제조하였고, 25 mL의 물로 세척하였으며, 25 mL의 로딩 완충액으로 평형을 맞추었다. 여과된 세포 추출물을 0.5 mL/분으로 칼럼에 로딩하였다. 칼럼은 지점 부획 수집이 시작되는 곳에 로딩 완충액으로 기준선 A₂₈₀으로 세척하였다. 다음에, 칼럼을 비특이적으로 결합한 단백질을 용출하는 2차 세척 완충액 (50 mM 포스페이트; 300 mM NaCl, 10% 글리세롤, pH 6.0)으로 세척하였다. A₂₈₀기준선에 다시 도달한 후, 칼럼을 2차 세척 완충액 중에서 0 내지 500 mM 이미다졸 구배로 전개하였다. 1 mL 분획을 수집하였으며, SDS-PAGE 및 은 염색 또는 알칼리성 포스페이트에 접합된 Ni²⁺-NTA (퀴아젠)으로 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 용출된 His₁₀-태그된 hSu(fu)를 포함하는 분획을 풀링하고, 다시 로딩 완충액으로 투석하였다.

별법으로, IgG 태그된 (또는 Fc 태그된) hSu(fu)의 정제는 공지된 크로마토그래피 기술 (예를 들면, 단백질 A 또는 단백질 G 칼럼 크로마토그래피를 포함함)을 사용하여 수행할 수 있다.

실시예 9. hSu(fu) 결합 항체의 제조

본 실시예는 hSu(fu)를 특이적으로 결합할 수 있는 모노클로날 항체의 제조를 설명한다.

모노클로날 항체를 제조하는 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면 상기 고딩(Goding)의 문헌에 기술되어 있다. 이용할 수 있는 면역원은 정제된 hSu(fu), hSu(fu)를 포함하는 융합 단백질 및 세포 표면 상에 재조합 hSu(fu)를 발현하는 세포를 포함한다. 당업자들은 과도한 실험없이 면역원을 선택할 수 있다.

생쥐 (예를 들면, Balb/c)는 완전 프로인트 아주반트 중에 유화된 hSu(fu) 면역원으로 면역화시키며, 1-100 마이크로그람의 양으로 피하 또는 복강내 주사하였다. 별법으로, 면역원은 MPL-TDA 아주반트 (미국 몬타나주 해밀톤 소재 리비 이뮤노케미칼 리서치(Ribi Immunochemical Research)) 중에 유화시키고, 동물의 뒷발 패드에 주사한다. 이어서, 면역화된 생쥐는 선택된 아주반트 중에 유화된 추가 면역원으로 10 내지 12 일 후에 부양시켰다. 이후, 수 주 후에 생쥐는 또한 추가 며역화 주사로 부양시킬 수 있다. 혈청 시료를 생쥐로부터 안와후방 출혈로 주기적으로 얻어서, ELISA 검정으로 시험하여 항-hSu(fu) 항체를 검출할 수 있었다.

적당한 항체 역가를 검출한 후, 항체에 "양성"인 동물을 hSu(fu) 최종 정맥내 주사를 주사할 수 있다. 3 내지 4일 후, 생쥐를 희생하여, 비장 세포를 수확하였다. 이어서, 비장 세포를 선택한 쥐과의 골수종 세포계 (예를 들면, ATCC로부터제 CRL 1597호로 입수가능한 P3X63AgU)에 (35% 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여) 융합시켰다. 퓨즈드는 하이브리도마 세포를 생성하고, 이는 이어서 비융합 세포, 골수종 하이브리드 및 비장 세포 하이브리드를 억제하는 HAT (하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘) 배지를 포함하는 96 웰 조직 배양 플레이트에 플래이팅 할 수 있다.

하이브리도마 세포는 ELISA에서 hSu(fu)에 대한 반응성을 스크리닝 할 수 있다. hSu(fu)에 대한 원하는 모노클로날 항체를 분비하는 "양성" 하이브리도마 세포를 측정하는 것은 당업계의 기술 범위 내에있다.

양성 하이브리도마 세포는 동계의(syngeneric) Balb/c 생쥐에 복강내 주사하여 항-hSu(fu) 모노클로날 항체를 포함하는 복수(ascite)를 제조할 수 있다. 별법으로, 하이브리도마 세포는 조직 배양 플라스크 또는 롤러 병에서 키울 수 있다. 복수로부터 생성된 모노클로날 항체의 정제는 암모늄 술페이트 침강에 이어서 겔 배제 크로마토그래피를 사용하여 달성할 수 있다. 별법으로, 단백질 A 또는 단백질 G에 결합하는 항체에 기초한 친화성 크로마토그래피를 이용할 수 있다.

실시예 10. hSu(fu) 결합 항체의 용도

항-hSu(fu) 항체와의 면역세포화학.hSu(fu) 폴리클로날 항체를 정제된 GST-hSu(fu) 융합 단백질로써 토끼를 면역화하여 제조하였다. 얻어진 항체는 단백질 A 칼럼 상에서 친화성 크로마토그래피로 정제하였다.

프로넥틴(ProNectin) F (스트라타진)-코딩된 유리 챔버 슬라이드 중의 서브컨플루언트(subconfluent) COS-7세포를 pRK.hSu(fu) 또는 pRK.hGli 중 하나 또는 양 플라스미드 모두에 DEAD-덱스트란에 이어 DMSO-쇼크를 사용하여 일시적으로 트랜스펙션하였다. 24시간 후에 세포를 4% 파라포름알데이드중에 10 분간 고정하였고, 0.1% 트리톤-X 100 중에서 5 분간 침투시켰으며, 봉쇄(block) 완충액 (PBS 중의 5% 염소 혈청) 중에서 30 분간 봉쇄시켰으며, 항-hSu(fu) 폴리클로날 (하기 참조) 및(또는) 항-c-myc 모노클로날 (제넨테크; 봉쇄 완충액 중의 3 ㎍/ml, 1 시간 동안)로 구성되는 1차 항체로 반응시켰다. 세포를 세척하고, 각각 cy3-항-토끼 IgG (1:350) 및(또는) cy2-항-생쥐 IgG (1:100; 잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch))로 1시간 동안 봉쇄 완충액 중에서 라벨링하였다. 슬라이드를 세척하고, 플루오로마운트(Fluoromount)-G (서던 바이오테크놀로지 어소시에이션,인크.(Southern Biotechnology Assoc., Inc.))으로 표면을 입혔다.

실시예 11. hSu(fu)를 포함하는 단백질-단백질 상호작용

시험관내 공동-면역침강 검정을 단백질-단백질 상호작용 연구에 대해 수행하였다. NH-3T3 세포를 10 cm 조직 배양 디쉬에서 30% 합류하는 10% 소 태아 혈청 및 100 유닛/ml 펜스트렙(penstrep) (성장 배지)를 포함하는 DMEM 중에서 키웠다. 세포를 10 ㎍의 DNA/디쉬, 36 ㎕ 리포펙타민 및 5 ml optiMEM (Gibco BRL)을 사용하여 제조자의 프로토콜 (Gibco BRL)에 따라서 리포펙타민으로 일시적으로 트랜스펙션하였다. 2 개의 플라스미드를 동시에 트랜스펙션할 때, 각 5 ㎍을 사용하였다. 42 시간 후, 세포를 PBS로 2회 세척하였으며 (4℃), 1 ml의 얼음럼 차가운 용균 완충액 (20 mM Hepes, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 각 5 ㎍/ml의 루펩틴 및 아프로티닌, 1 mM PMSF, 및 250 μM 오르토바나데이트(orthovanadate)를 포함함)에서 직접 용균하였다. 용균물을 4℃에서 20분간 회전시켰고, 이어서 14000 rpm에서 20 분간 원심분리하였으며, 상층액을 각 2 ㎕ 항-플래그 M2 모노클로날 항체 (코닥 IBI) 또는 2 ㎕ 항-myc 모노클로날 항체 (9E10; 제넨테크)로 밤새도록 4℃) 면역침강시켰다. 단백질 A 세파로즈 (파마시아)를 1 시간 동안 4℃에서 가하였다 (25 ㎕의 용균 완충액 중의 50:50 슬러리). 비드를 용균 완충액으로 3회, 0.5 M NaCl로 1회 세척하였으며, 2×SDS 로딩 완충액을 가하였으며, 시료를 끓였으며 (5분), 8% 변성 SDS 폴리아크릴아미드 겔 (노벡스) 상에서 전기영동하였다. 단백질을 ECL 검출 시스템 (아머샴)을 사용하여 니트로셀룰로오스에 블롯하고, 플래그 또는 myc 에피토그에 대한 항체로 탐침 검사하여 검출하였다.

GST-융합 단백질 시험관내 결합 검정을 하였다. pGEX.hSu(fu)를 DH125 세균 세포로 형질전환하였으며, 500 ml의 밤새 배양한 배양물을 제조자의 지시문 (파마시아)에 따라서 GST-hSu(fu) 융합 단백질 정제 과정을 진행하였다. 융합 단백질은 비드로부터 과량의 감소된 글루타치온으로 용출하였으며, 용출된 단백질은 OD₂₈₀측정법 및 변성 SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서의 시각화에 의해 정량화하였다 (데이타는 보이지 않음). 글루타치온 세파로즈 비드는 4 ㎍ 융합 단백질 또는 GST (시그마)로 2 시간 동안 4℃에서 로딩하였으며, 이어서 결합 완충액으로 3회 세척하였다. 25 ㎕ 비드 (50:50 슬러리)를 50 ㎕ 결합 완충액 중에서 2 시간 동안 4℃에서 2-8 ㎕의³⁵S-라벨된 시험관내 해독된 hGli, mGli2, hGli3, mSlimb 또는 hSu(fu)와 인큐베이션하였다. 비드를 용균 완충액으로 3회 세척하였으며, SDS-PAGE로 가공하였다. 겔은 이어서 고정시키고, EN³HANCE (듀폰 NEN)에서 증폭하고, 건조하였으며, 코닥 X-AR 필름에 노출하였다. 결합 완충액은 50 mM TrisHCl, pH 8.0, 150 mM NaCl 및 프로테아제 억제제 (상기)였다. pRK.hGli, pRK.mGli2, pRK.hGli3, pRK.mSlimb, pRK.hSu(fu) 및 SP6-루시페라제제어 플라스미드를 50 ㎕ 반응 부피 중의 20 μCi[³⁵S]-메티오닌 (아머샴) 및 SP6 RNA 폴리머라제와 TNT 연결된 세망세포(reticulocyte) 용균물 시스템 (프로메가(Promega))를 사용하여 시험관내 전사 및 해독하였다. 각 반응물 1 ㎕를 대략적인 단백질 정량을 위해 변성 SDS-PAGE시켰다. 동량의 각 단백질을 결합 검정에 사용하였다.

루시페라제 리포터 검정을 듀얼(Dual)-루시페라제 리포터 검정 시스템(프로메가, 인크,)를 사용하여 기술한 바대로 (24) C3H10T1/2 세포에서 수행하였다. 트랜스펙션 효율의 차이는 개똥벌레 루시페라제 리포터의 할성을 공동 트랜스펙션한 레닐라(Renilla) 루시페라제 내부 대조의 활성에 대해 표준화하여 보정하였다.

hSu(fu)의 생화학적 상호작용 및 생물학적 활성을 측정하였다. 이전의 연구가 dSu(fu)의 드로소필라 Gli 상동체인 Ci (29)에 대한 결합을 측정하였으므로, 유사한 상호작용이 그 사람 단백질 대응부에 존재하는지를 시험하였다. 면역세포화학을 사용하여 트랜스펙션된 COS-7 세포에서의 순작적으로 과 발현된 hSu(fu) 및 hGli의 세포하 국소화를 시각화하였다. 개별적으로 발현될 때, hSu(fu) 및 hGli는세포질에 걸쳐 광범위하게 분포하며, 때로는 핵에서 검출된다 (도 5A, 상부 패널). 또한, 이들은 β-튜불린과 유사한 염색 패턴을 나타내며 (데이타는 보이지 않음), 이는 이들이 마이크로튜불 내에 공동 국소화됨을 암시한다. 세포를 hSu(fu) 및 hGli와 공동 트랜스펙션시킬 때, 이중 라벨링은 그 염색 패턴에서 광범위한 중첩을 밝혔다. 게다가, hGli는 세포질에 걸쳐 더 이상 발견되지 않았으며, 또한 hSu(fu)로 강하게 라벨링되는 밀도있게 염색된 구역에 점상으로 대신 농축되었다 (도 5A, 하부 패널). hSu(fu)만 과발현하는 세포에서는 보이지 않으며, 항상 단백질 모두에 대해 염색되는 이러한 밀도있게 염색되는 구역은 hSu(fu)에 의한 hGli의 세포질 격리를 나타낼 수 있다.

hSu(fu)에 의한 hGli의 세포하부 격리 여부를 검사하는 것은 2 단백질 간의 생화학적 상호작용에 기인하며, hSu(fu)의 hGli와의 공동 면역침전을 관찰하였다. NIH-3T3 세포는 플래그 에피토프-태그된 hSu(fu) (pRK.hSu(fu)) 및 c-myc 에피토프-태그된 hGli (pRK.hGli)에 대한 발현 플라스미드로 일시적으로 트랜스펙션하였으며, 세포는 42 시간 후에 용균하였으며, 가용화 단백질 복합체는 항-플래그 또는 항-myc 항체로 면역침전시켰고, 이어서 별도 항체를 사용하여 웨스턴 블롯하였다. hSu(fu) 또는 hGli만 발현하는 세포로부터는 공동 면역침전 단백질은 검출되지 않았다 (도 5B). 대조적으로, 양 단백질을 공동 발현하는 세포로부터는 hSu(fu)는 hGli와 쉽게 공동 면역침전하였으며, hGli는 hSu(fu)와 쉽게 면역침전하였다 (도 5B). hSu(fu)-hGli 상호작용은 시험관내 결합 검정을 사용하여 확인하였다. 이러한 목적으로는, 세균적으로 생산한 GST-hSu(fu) 단백질을 글루타치온 세파로즈 비드에 로딩하였으며, 시험관내 해독된³⁵S-라벨된-hGli를 유지하는 능력을 검사하였다. hGli는 GST-hSu(fu) 글루타치온 세파로즈 비드 상에서 특이적으로 유지되었으나, GST만 로딩된 비드 상에서는 그러하지 아니하였다 (도 5C).

추가 실험에서, Gli 상동체 Gli2 및 Gli3가 hSu(fu)와 상호작용하는 능력을 검사하였다³⁵S-라벨된 mGli2 및 hGli3 모두 (루시페라제, 음성 대조는 제외)는 GST-hSu(fu)-접합된 비드에 의해 특이적으로 유지되었다 (도 5C). 9E10 c-myc 에피토프가 단백질의 카르복시 최종 말단에 융합한 hGli3 버젼은 본 검정에서 hSu(fu)에 결합하지 않았으며 (데이타는 보이지 않음), 이는 Gli3의 카르복시 말단 구역이 이 반응에 중요함을 지적한다.

본원에 있는 결합 데이타는 척추동물 Gli의 활성은 Su(fu)와의 상호작용에 의해 음성적으로 조절됨을 나타낸다. 따라서, hSu(fu)가 hGli의 활성을 기능적 Gli 리포터 검정에서 억제할 수 있는지를 검사하였다. 이 결과, Gli 결합 부위 (42) 카피 9 개가 리포터 개똥벌레 루시페라제 유전자의 전사를 지향하는 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제 최소 프로모터에 연결되었다. 이 구조의 루시페라제 유전자의 발현은 Gli에 의해서 및 Shh 리포터 (24)의 성분에 의해 특이적으로 조절됨이 알려졌다. 상기 입증한 바와 같이 (24), 루시페라제 리포터 구조를 갖는 C3H10T1/2 세포 및 무관계한 단백질 (pRK.EGFP)을 코딩하는 발현 플라스미드를 공동 트랜스펙션한 결과 매우 낮은 수준의 루시페라제 활성을 보였다 (도 5D). 대조적으로, hGli 발현 플라스미드를 갖는 리포터 유전자의 공동 트랜스펙션은 루시페라제 활성 수준에서 약 100 배 증가를 보였다 (도 5D). 흥미롭게도, dSu(fu)가 Ci의 음성 조절자라는 개념과 일치하여, hGli-활성화 리포터 발현은 공동발현된 hSu(fu)의 존재시 유의성있게 억제되었으나, 무관계한 단백질의 경우는 그러하지 않았다 (도 5D). 흥미롭게도, 배경 효과 이상의 루시페라제 활성의 증가는 hSu(fu)가 외생의 hGli의 부재시 리포터 유전자와 함께 공동 발현될 때 탐지된다 (도 5D). 이와 함께, 본 발명자들의 발견은 hSu(fu)의 hGli와의 물리적 상호작용은 그 전사 활성의 불활성화를 일으킨다는 것을 나타낸다.

hSu(fu)의 가능한 메카니즘을 검사 시작하기 위해서, 본 발명자들은 hSu(fu)와 Slimb/βTrCP의 척추동물 상동체, Ci 및 유비퀴틴-프로테아조말 분해 경로 (31, 34, 43)에서의 다른 단백질에 포함된 F-박스 포함 단백질의 상호작용을 검사하였다. 본 발명자들은 시험관내 해독된³⁵S-라벨된 mSlimb는 진정으로 GST-hSu(fu)-접합된 글루타치온 세파로즈 비드에 특이적으로 결합하나, GST-접합된 비드 단독의 경우는 그러하지 않다는 것을 발견하였다 (도 5C). 임의의 특정 작용 메카니즘에 한정함을 원치않으며, hSu(fu)는 hGli 및 Slimb 모두와의 물리적 상호작용을 통하여 hGli를 Slimb/βTrCP-의존성 프로테아조말 분해 경로에 표적화함으로 부분적으로 hGli를 불활성화하리라는 것을 제안한다. 별법으로, hSu(fu)는 그 자체로는 Slimb-매개 분해의 표적이며, 그 분해는 hGli가 기능을 하도록 할 수 있다. 각 경우, hSu(fu)는 징크 핑거 전사 인자 Gli를 통하여 헤지호그 신호전달의 음성 조절자이다. 흥미롭게도,³⁵S-라벨된 Su(fu) 또한 GST-hSu(fu)에 결합하며 (도 5C),hSu(fu)는 2-하이브리드 검정에서 그 자체에 결합함을 발견하였으며 (데이타는 보이지 않음), 이는 hSu(fu)는 아마도 다이머로 기능할 것임을 나타낸다.

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물질의 기탁

다음의 물질을 미국 20110-2209 버몬트주 마나사스 유니버시티 블러바드 10801 소재 아메리칸 타입 컬처 컬렉션 (ATCC)에 기탁하였다.

물질 ATCC 기탁 번호 기탁일

DNA33455-1548 PTA-127 1999년 3월 5일

본 기탁은 특허 절차상 미생물 기탁의 국제척 승인에 관한 부다페스트 조약의 규정 및 부다페스트 조약 규칙에 의하여 행하여졌다. 이는 기탁일로부터 30년 동안 기탁한 생존 배양물을 유지하는 것을 보장한다. 기탁물은 ATCC에 의해 부다페스트 조약의 조건 및 제넨테크 인크 및 ATCC의 승인을 조건으로 하여 입수가능할 것이며, 이는 관련 미국 특허의 공고 또는 임의의 미국 또는 외국 특허 출원의 공개 중 먼저되는 것에 의하여 기탁 배양물 자손을 공중에게 영속적이고 제한없이 제공하는 것을 보증하며, 35 USC §122 및 이에 따른 특허청장의 규약 (특히 886 OG 638과 관련된 37 CFR §1.14를 포함함)에 따라 권리를 부여하는 미국 특허 및 상표청장에 의해 결정된 자에게 그 후손을 제공하는 것을 보증한다.

본 출원의 양수인은 기탁된 배양물이 적당한 조건하에서 배양하였을 때 죽거나 멸실 또는 파괴된다면, 그 물질을 동종의 다른 것으로 통보에 의해 대체할 것이다. 기탁물을 제공하는 것은 그 특허법에 따라 어느 나라의 정부의 권위에 의해 수요된 권리에 위배하여 본 발명을 실시할 권한을 구성하는 것은 아니다.

전기한 명세서는 당업계에서 통상의 지식을 가진자가 본 발명을 실시하기에 충분하도록 기재되어 있다고 여겨진다. 기탁된 실시태양은 본 발명의 특정 측면의 하나의 예시로서만 의도되므로 본 발명은 기탁된 구조물에 의해 제한되는 것이 아니며, 기능적으로 동등한 임의의 구성물은 본 발명으 범위 내에 있다. 본원에서의 물질 기탁은 본원에 포함된 본원의 서면상의 설명이 본 발명의 어떠한 측면 (그 최상의 모드를포함함)의 실시를 가능케하는 것에 부적당하다는 것을 인정하지 않으며, 또한 청구 범위를 본원에 나타난 특정 예시로 한정하는 것도 아니다. 실제로, 본원에 나타내고 설명한 것 외에도 본 발명의 다양한 변형은 상기 설명으로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자들에게 명백한 것이며, 본원 청구범위에 포함된다.

Claims (37)

1. 도 1 (서열 확인 번호 2)의 1 내지 433 아미노산 잔기의 서열을 갖는 hSu(fu) 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자 (a), 또는 (a)의 DNA 분자의 상보물 (b)과 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 DNA를 포함하는 단리된 핵산 분자.
2. 제1항에 있어서, 도 6A-6B (서열 확인 번호 1)의 약 74 내지 약 1372 위치 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
3. 제1항에 있어서, 도 6A-6B (서열 확인 번호 1)의 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
4. 도 6A-6B (서열 확인 번호 1)의 약 74 내지 약 1372 위치의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산의 상보물과 혼성화된 DNA를 포함하는 hSu(fu) 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 분자.
5. ATCC 기탁 번호 제PTA-127호 (DNA33455-1548) 사람 단백질 cDNA에 의해 코딩되는 동일한 성숙 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자 (a), 또는 (a)의 DNA 분자의 상보물 (b)과 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 DNA를 포함하는 단리된 핵산 분자.
6. 제5항에 있어서, ATCC 기탁 번호 제PTA-127호 (DNA33455-1548) 사람 단백질 cDNA에 의해 코딩되는 동일한 성숙 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 단리된 핵산 분자.
7. 도 1 (서열 확인 번호 2)의 약 1 내지 약 433 아미노산 잔기의 서열과 80% 이상 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA (a), 또는 (a)의 DNA의 상보물 (b)을 포함하는 단리된 핵산 분자.
8. 제7항에 있어서, 도 1 (서열 확인 번호 2)의 1 내지 약 433 아미노산 잔기의 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA (a), 또는 (a)의 DNA의 상보물 (b)을 포함하는 단리된 핵산 분자.
9. 도 1 (서열 확인 번호 2)의 1 내지 약 433 아미노산 잔기의 서열과 비교하였을 때 80% 이상의 양성(positive)을 기록하는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA (a), 또는 (a)의 DNA의 상보물 (b)을 포함하는 단리된 핵산 분자.
10. 시험 DNA 분자를 엄격 조건하에서 도 1 (서열 확인 번호 2)의 1 내지 약 433 아미노산 잔기의 서열을 갖는 hSu(fu) 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자 (a), 또는 (a)의 DNA 분자의 상보물 (b)과 혼성화시키고, 만일 시험 DNA 분자가 (a) 또는 (b)에 약 80% 이상의 서열 동일성을 갖는다면 시험 DNA 분자를 단리하는 것에 의해 제조한 100 개 이상의 뉴클레오티드를 가지며, 단리된 핵산 분자.
11. 제1항의 핵산을 함유하는 벡터.
12. 제11항에 있어서, 벡터로 형질전환한 숙주 세포에 의해 인식되는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 벡터.
13. 제12항의 벡터를 함유하는 숙주 세포.
14. 제13항에 있어서, 상기 세포가 CHO 세포인 숙주 세포.
15. 제13항에 있어서, 상기 세포가 이. 콜라이(E. coli)인 숙주 세포.
16. 제13항에 있어서, 상기 세포가 효모 세포인 숙주 세포.
17. 제12항의 숙주 세포를 hSu(fu) 폴리펩티드를 발현하기 적당한 조건하에서 배양하고, 상기 hSu(fu) 폴리펩티드를 세포 배양물로부터 회수하는 것을 포함하는 hSu(fu) 폴리펩티드의 제조 방법.
18. 제1항의 DNA에 의해 코딩되는 단리된 hSu(fu) 폴리펩티드.
19. 도 2 (서열 확인 번호 2)의 1 내지 약 433 아미노산 잔기의 서열과 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 단리된 hSu(fu) 폴리펩티드.
20. 제19항에 있어서, 도 2 (서열 확인 번호 2)의 1 내지 약 433 아미노산 잔기를 포함하는 단리된 폴리펩티드.
21. 도 1 (서열 확인 번호 2)의 1 내지 약 433 아미노산 잔기의 서열과 비교하였을 때 80% 이상의 양성을 기록하는 단리된 hSu(fu) 폴리펩티드.
22. 도 1 (서열 확인 번호 2)의 1 내지 약 433 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 단리된 hSu(fu) 폴리펩티드, 또는 항-hSu(fu) 항체에 대한 결합 부위를 제공하기 충분한 그 단편.
23. ATCC 기탁 번호 제PTA-127호 (DNA33455-1548)로 기탁된 벡터의 cDNA 삽입물에 의해 코딩되는 단리된 hSu(fu) 폴리펩티드.
24. (i) 시험 DNA 분자를 엄격 조건하에서 도 1 (서열 확인 번호 2)의 1 내지 약 433 아미노산 잔기의 서열을 갖는 hSu(fu) 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자 (a), 또는 (a)의 DNA 분자의 상보물 (b)과 혼성화시키고, 만일 상기 시험 DNA 분자가(a) 또는 (b)와 약 80% 이상의 서열 동일성을 갖는다면, (ii) 상기 시험 DNA 분자를 포함하는 숙주 세포를 상기 폴리펩티드의 발현에 적당한 조건 하에서 배양시키고, (iii) 상기 폴리펩티드를 세포 배양물로부터 회수하는 것에 의해 생산된 단리된 폴리펩티드.
25. 이종 아미노산 서열에 융합된 hSu(fu) 폴리펩티드를 포함하는 키메라형 분자.
26. 제25항에 있어서, 상기 이종 아미노산 서열이 에피토프 태그 서열인 키메라형 분자.
27. 제25항에 있어서, 상기 이종 아미노산 서열이 면역글로불린의 Fc 구역인 키메라형 분자.
28. hSu(fu) 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체.
29. 제28항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날 항체인 항체.
30. 제28항에 있어서, 상기 항체가 인간화(humanized) 항체인 항체.
31. hSu(fu) 폴리펩티드의 길항제.
32. 제31항에 있어서, 작은 생유기 분자인 길항제.
33. 제31항에 있어서, 안티센스 뉴클레오티드인 길항제.
34. Hh 신호전달 경로에서 hSu(fu)의 정상적 기능을 촉진 또는 증가시키는 척추동물 hSu(fu)의 효현제(agonist).
35. 제34항에 있어서, 작은 생유기분자인 효현제.
36. (a) 배양물 중의 hSu(fu) 발현 표적 세포를 후보 화합물에 노출시키고,

    (b) 처리한 세포에서의 표현형 또는 기능 변화를 기록하고,

    결과를 후보 화합물에 노출시키지 않은 대조 세포와 비교하는 것을 포함하는 hSu(fu) 생물학적 활성의 길항제 또는 효현제의 스크리닝 방법.
37. (a) 시험 세포 또는 조직을 배양하고,

    (b) hSu(fu)에 의해 조절되는 헤지호그(Hedgehog) 신호전달을 억제할 수 있는 화합물을 투여하고,

    (c) 상기 투여가 시험 세포에서 헤지호그 매개 표현형 효과를 일으키는지를측정하는 것을 포함하는, 특정 질환이 헤지호그 신호전달에 의해 조절되는지를 측정하는 진단 방법.