JP2002537812A - Ｆｕｓｅｄのヒトサプレッサー - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、キイロショウジョウバエ融合タンパク質のポリペプチドサプレッサーと相同性を有する新規なポリペプチドと、そのポリペプチドをコードする核酸分子を対象とする。ここにまた提供されるものは、その核酸配列を含んでなるベクターと宿主細胞、異種性ポリペプチド配列に融合した本発明のポリペプチドを含んでなるキメラポリペプチド分子、本発明のポリペプチドに結合する抗体及び本発明のポリペプチドを製造する方法である。
Description
【０００１】 （技術分野） 本発明は、一般的に、細胞増殖及び分化に関連するヘッジホッグ（Ｈｈ）シグ
ナル経路に関与する分子に関する。さらに、本発明は、ｆｕｓｅｄのヒトサプレ
ッサー（「ｈＳＵ（ｆｕ）」）をコードするＤＮＡと相同性を有する新規ＤＮＡ
の同定及び単離、またここでｈＳｕ（ｆｕ）あるいはｈＳｕ（ｆｕ）と命名した
新規ポリペプチドの組換え生産に関する。
ナル経路に関与する分子に関する。さらに、本発明は、ｆｕｓｅｄのヒトサプレ
ッサー（「ｈＳＵ（ｆｕ）」）をコードするＤＮＡと相同性を有する新規ＤＮＡ
の同定及び単離、またここでｈＳｕ（ｆｕ）あるいはｈＳｕ（ｆｕ）と命名した
新規ポリペプチドの組換え生産に関する。
【０００２】 多細胞生物の発育は少なくとも部分的に、細胞、組織、又は器官のパターンの
位置的情報を特定、指揮又は維持するメカニズムに依存している。種々の分泌さ
れたシグナル伝達分子、例えばトランスフォーミング成長因子-ベータ（ＴＧＦ-
β）、Ｗｎｔ、繊維芽成長因子及びヘッジホッグファミリーのメンバー等は、シ
ョウジョウバエ及び脊椎動物における様々な細胞及び構造のパターン形成に関連
している。Perrimon, Cell: 80: 517-520 (1995)。 ヘッジホッグ（Ｈｈ）は、キイロショウジョウバエにおける遺伝子スクリーニ
ングによりセグメントポラリティ遺伝子として最初に同定され、Nusslein-Volha
rd等, Roux. Arch. Dev. Biol. 193: 267-282 (1984)、広範な発達機能を果たす
（Perrimon, 上掲）。１つのショウジョウバエＨｈ遺伝子しか同定されていないが、３つのヒ
トＨｈ相同体：ソニックＨｈ（ＳＨｈ）、デザートＨｈ（ＤＨｈ）及びインディ
アンＨｈ（ＩＨｈ）が単離されている（Echelard等, Cell 75, 1417-30 (1993)
；Riddle等, Cell 75: 1401-16 (1993)）。ＳＨｈは発育中の脊椎動物胚の脊索
及び底板で高レベルで発現される。インビトロ外植片アッセイ並びにトランスジ
ェニック動物におけるＳＨｈの異所性発現は、ＳＨｈが神経管パターン形成にお
いて鍵となる役割を果たすことを示している、Echelard等, 上掲, Ericson等, Cell 81: 747-56 (1995); Marti等, Nature 375: 322-5 (199
5); Krauss等, Cell 75, 1432-44 (1993); Riddle等, Cell 75: 1401-16 (1993); Ro
elink等 Cell 81:445-44 (1995), 上掲; Hynes等, Neuron 19: 15-26 (1997)。また、Ｈ
ｈは、肢（Krauss等, Cel 75: 1431-44 (1993); Laufer等, Cell 79, 993-1003
(1994)）、体節（Fan 及びTessier-Lavigne, Cell 79, 1175-86 (1994); Johnso
n等, Cell 79: 1165-73 (1994)）、肺（Bellusci等, Develop. 124: 53-63 (199
7)）及び皮膚（Oro等, Science 276: 817-21 (1997)）の発達においても役割を
果たす。同様に、ＩＨｈ及びＤＨｈは骨、腸及び胚細胞発育に関連する、Apeqvi
st等, Curr. Biol. 7: 801-4 (1997); Bellusci等, Dev. Suppl. 124: 53-63 (1997); Bitgood等, Curr. Biol. 6: 298-304 (1996);
Roberts等, Development 121: 3163-74 (1995)。ＳＨｈノックアウトマウスは
、ＳＨｈが脊椎動物発生の多くの面に重要であるという考えを更に強めた、Chia
ng等, Nature 383: 407-13 (1996)。 これらのマウスは、脊索及び底板といった
正中線における異常、神経管の腹側細胞型の不存在、末端肢構造の不存在、単眼
症、及び脊柱及び殆どの肋骨における不存在を示す。
位置的情報を特定、指揮又は維持するメカニズムに依存している。種々の分泌さ
れたシグナル伝達分子、例えばトランスフォーミング成長因子-ベータ（ＴＧＦ-
β）、Ｗｎｔ、繊維芽成長因子及びヘッジホッグファミリーのメンバー等は、シ
ョウジョウバエ及び脊椎動物における様々な細胞及び構造のパターン形成に関連
している。Perrimon, Cell: 80: 517-520 (1995)。 ヘッジホッグ（Ｈｈ）は、キイロショウジョウバエにおける遺伝子スクリーニ
ングによりセグメントポラリティ遺伝子として最初に同定され、Nusslein-Volha
rd等, Roux. Arch. Dev. Biol. 193: 267-282 (1984)、広範な発達機能を果たす
（Perrimon, 上掲）。１つのショウジョウバエＨｈ遺伝子しか同定されていないが、３つのヒ
トＨｈ相同体：ソニックＨｈ（ＳＨｈ）、デザートＨｈ（ＤＨｈ）及びインディ
アンＨｈ（ＩＨｈ）が単離されている（Echelard等, Cell 75, 1417-30 (1993)
；Riddle等, Cell 75: 1401-16 (1993)）。ＳＨｈは発育中の脊椎動物胚の脊索
及び底板で高レベルで発現される。インビトロ外植片アッセイ並びにトランスジ
ェニック動物におけるＳＨｈの異所性発現は、ＳＨｈが神経管パターン形成にお
いて鍵となる役割を果たすことを示している、Echelard等, 上掲, Ericson等, Cell 81: 747-56 (1995); Marti等, Nature 375: 322-5 (199
5); Krauss等, Cell 75, 1432-44 (1993); Riddle等, Cell 75: 1401-16 (1993); Ro
elink等 Cell 81:445-44 (1995), 上掲; Hynes等, Neuron 19: 15-26 (1997)。また、Ｈ
ｈは、肢（Krauss等, Cel 75: 1431-44 (1993); Laufer等, Cell 79, 993-1003
(1994)）、体節（Fan 及びTessier-Lavigne, Cell 79, 1175-86 (1994); Johnso
n等, Cell 79: 1165-73 (1994)）、肺（Bellusci等, Develop. 124: 53-63 (199
7)）及び皮膚（Oro等, Science 276: 817-21 (1997)）の発達においても役割を
果たす。同様に、ＩＨｈ及びＤＨｈは骨、腸及び胚細胞発育に関連する、Apeqvi
st等, Curr. Biol. 7: 801-4 (1997); Bellusci等, Dev. Suppl. 124: 53-63 (1997); Bitgood等, Curr. Biol. 6: 298-304 (1996);
Roberts等, Development 121: 3163-74 (1995)。ＳＨｈノックアウトマウスは
、ＳＨｈが脊椎動物発生の多くの面に重要であるという考えを更に強めた、Chia
ng等, Nature 383: 407-13 (1996)。 これらのマウスは、脊索及び底板といった
正中線における異常、神経管の腹側細胞型の不存在、末端肢構造の不存在、単眼
症、及び脊柱及び殆どの肋骨における不存在を示す。
【０００３】 細胞表面において、Ｈｈシグナルは、１２膜貫通ドメインタンパク質Ｐａｔｃ
ｈｅｄ（Ｐｔｃｈ）(Hooper及びScott, Cell 59: 751-65 (1989); Nakano等, Na
ture 341: 508-13 (1989))及びＧ-タンパク質結合様レセプターＳｍｏｏｔｈｅ
ｎｅｄ（Ｓｍｏ）(Alcedo等, Cell 86: 221-232 (1996); van den Heuval及びIn
gham, Nature 382: 547-551 (1996))にリレーされると考えられている。遺伝子
的及び生化学的証拠が、Ｐｔｃｈ及びＳｍｏが多成分レセプター複合体の一部で
あるレセプターモデルを支持している、Chen及びStruhl, Cell 87: 553-63 (199
6); Marigo等, Nature 384: 176-9 (1996); Stone等, Nature 384: 129-34 (199
6)。ＨｈのＰｔｃｈへの結合に際し、ＰｔｃｈのＳｍｏに対する平常の阻害効果
が解除され、Ｓｍｏが細胞質膜を通したＨｈシグナルの伝達を可能にする。Ｐｔ
ｃｈ遺伝子における機能変異の喪失が、多発性基底細胞癌（ＢＣＣ）を特徴とす
る遺伝病である基底細胞母斑症候群（ＢＣＮＳ）の患者で同定された。また、機
能障害Ｐｔｃｈ遺伝子変異は、多くの割合で散在性基底細胞癌腫を伴っていた（
Chidambaram等, Cancer Research 56: 4599-601 (1996); Gailani等, Nature Genet. 14: 78-81 (1996); Hahn等, Cell
85: 841-51 (1996); Johnson等, Science 272: 1668-71 (1996); Unden等, Can
cer Res. 56: 4562-5; Wicking等, Am. J. Hum. Genet. 60: 21-6 (1997)）。Ｐｔｃｈ機能の
喪失は、基底細胞癌における制御不能なＳｍｏシグナル伝達を起こすと考えられ
る。同様に、Ｓｍｏ変異の活性化が散在性ＢＣＣ腫瘍で同定され（Xie等, Natur
e 391: 90-2 (1998)）、ＳＨｈのレセプター複合体におけるシグナル伝達サブユ
ニットとしてのＳｍｏの役割を強調している。しかしながら、ＰｔｃｈがＳｍｏ
を制御することによる正確な機構は未だ明らかになっていない。 重要なことに、シグナル伝達機構が、レセプターから下流の標的に伝達される
ことによるシグナル伝達機構も明確にされねばならない。ショウジョウバエにお
ける遺伝子上位分析は、幾つかのセグメントポラリティ遺伝子を同定し、それら
はＨｈシグナル伝達経路の成分として機能することがわかった（Ingham, Curr.
Opin. Genet. Dev. 5: 492-8 (1995); Perrimon, 上掲）。これらは、キネシン様分子、Ｃｏｓｔａｌ-２（Ｃｏｓ-２）（Robbins
等, Cell 90: 225-34 (1997); Sisson等, Cell 90: 235-45 (1997)）、ｆｕｓｅ
ｄと命名されたタンパク質（Preat等, Genetics 135: 1047-62 (1990); Therond等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 4224-8 (1996)）、及び
Ｚｎフィンガータンパク質Ｃｉ．（Alexandre等, Genes Dev. 10: 2003-13 (1996); Dominguez等, Science 272: 1621-5 (1996); Orenic
等, Genes Dev. 4: 1053-67 (1990)）を含む。Ｈｈシグナル伝達に関係する更な
る成分は、転写因子ＣＢＰ［Akimaru等, Nature 386: 735-738 (1997)］、ネガ
ティブレギュレータｓｌｉｍｂ［Jiang及びStruhl, Nature 391: 493-496 (1998
)］及びＳＨｈ応答成分ＣＯＵＰ-ＴＦＩＩ［Krishnan等, Science 278: 1947-19
50 (1997)］を含む。さらに、ｆｕｓｅｄのサプレッサとして示された分子［Pha
m等, Genetics 140: 587-98 (1995); Preat, Genetics 132: 725-36 (1992)］は
、ショウジョウバエで見出されたもので、Ｈｈシグナル伝達経路の構成要素であ
ると考えられている。
ｈｅｄ（Ｐｔｃｈ）(Hooper及びScott, Cell 59: 751-65 (1989); Nakano等, Na
ture 341: 508-13 (1989))及びＧ-タンパク質結合様レセプターＳｍｏｏｔｈｅ
ｎｅｄ（Ｓｍｏ）(Alcedo等, Cell 86: 221-232 (1996); van den Heuval及びIn
gham, Nature 382: 547-551 (1996))にリレーされると考えられている。遺伝子
的及び生化学的証拠が、Ｐｔｃｈ及びＳｍｏが多成分レセプター複合体の一部で
あるレセプターモデルを支持している、Chen及びStruhl, Cell 87: 553-63 (199
6); Marigo等, Nature 384: 176-9 (1996); Stone等, Nature 384: 129-34 (199
6)。ＨｈのＰｔｃｈへの結合に際し、ＰｔｃｈのＳｍｏに対する平常の阻害効果
が解除され、Ｓｍｏが細胞質膜を通したＨｈシグナルの伝達を可能にする。Ｐｔ
ｃｈ遺伝子における機能変異の喪失が、多発性基底細胞癌（ＢＣＣ）を特徴とす
る遺伝病である基底細胞母斑症候群（ＢＣＮＳ）の患者で同定された。また、機
能障害Ｐｔｃｈ遺伝子変異は、多くの割合で散在性基底細胞癌腫を伴っていた（
Chidambaram等, Cancer Research 56: 4599-601 (1996); Gailani等, Nature Genet. 14: 78-81 (1996); Hahn等, Cell
85: 841-51 (1996); Johnson等, Science 272: 1668-71 (1996); Unden等, Can
cer Res. 56: 4562-5; Wicking等, Am. J. Hum. Genet. 60: 21-6 (1997)）。Ｐｔｃｈ機能の
喪失は、基底細胞癌における制御不能なＳｍｏシグナル伝達を起こすと考えられ
る。同様に、Ｓｍｏ変異の活性化が散在性ＢＣＣ腫瘍で同定され（Xie等, Natur
e 391: 90-2 (1998)）、ＳＨｈのレセプター複合体におけるシグナル伝達サブユ
ニットとしてのＳｍｏの役割を強調している。しかしながら、ＰｔｃｈがＳｍｏ
を制御することによる正確な機構は未だ明らかになっていない。 重要なことに、シグナル伝達機構が、レセプターから下流の標的に伝達される
ことによるシグナル伝達機構も明確にされねばならない。ショウジョウバエにお
ける遺伝子上位分析は、幾つかのセグメントポラリティ遺伝子を同定し、それら
はＨｈシグナル伝達経路の成分として機能することがわかった（Ingham, Curr.
Opin. Genet. Dev. 5: 492-8 (1995); Perrimon, 上掲）。これらは、キネシン様分子、Ｃｏｓｔａｌ-２（Ｃｏｓ-２）（Robbins
等, Cell 90: 225-34 (1997); Sisson等, Cell 90: 235-45 (1997)）、ｆｕｓｅ
ｄと命名されたタンパク質（Preat等, Genetics 135: 1047-62 (1990); Therond等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 4224-8 (1996)）、及び
Ｚｎフィンガータンパク質Ｃｉ．（Alexandre等, Genes Dev. 10: 2003-13 (1996); Dominguez等, Science 272: 1621-5 (1996); Orenic
等, Genes Dev. 4: 1053-67 (1990)）を含む。Ｈｈシグナル伝達に関係する更な
る成分は、転写因子ＣＢＰ［Akimaru等, Nature 386: 735-738 (1997)］、ネガ
ティブレギュレータｓｌｉｍｂ［Jiang及びStruhl, Nature 391: 493-496 (1998
)］及びＳＨｈ応答成分ＣＯＵＰ-ＴＦＩＩ［Krishnan等, Science 278: 1947-19
50 (1997)］を含む。さらに、ｆｕｓｅｄのサプレッサとして示された分子［Pha
m等, Genetics 140: 587-98 (1995); Preat, Genetics 132: 725-36 (1992)］は
、ショウジョウバエで見出されたもので、Ｈｈシグナル伝達経路の構成要素であ
ると考えられている。
【０００４】 これらＨｈ経路の分子の機能的役割及び相互作用は、ある部分においては、遺
伝学的、構造学的分析に基づいて示唆されてきた。Ｃｏｓ-２における変異は胚
致死性であり、各セグメントの中心成分及びＨｈ応答性遺伝子の拡張ドメインの
複製を含むＨｈ過剰発現に類似のフェノタイプを提示する。これに対して、ｈＳ
ｕ（ｆｕ）及びＣｉについての変異胚は、各セグメント後部の欠失及び前部の鏡
像様複製の置換を含むＨｈ機能の喪失に類似のフェノタイプを示す、Busson等,
Roux. Arch. Dev. Biol. 197: 221-230 (1988)。Ｃｉの分子キャラクタリゼーシ
ョンは、それがＷｉｎｇｌｅｓｓ及びＤｐｐなどのＨｈ応答性遺伝子を直接活性
化する転写因子であることを示唆した、Alexandre等, (1996), 上掲;Dominguez
等, (1996), 上掲）。同様に、ｆｕｓｅｄの分子解析により、セリン、トレオニンキ
ナーゼと関連性があり、インタクトなＮ末端キナーゼドメイン及びＣ末端制御領
域がその適切は機能に必要であることが明らかになった（Preat等, Nature 347:87-9 (1990); Robbins等, (1997) 上掲；Therond等, Proc. Natl. A
cad. Sci. USA 93: 4224-8 (1996)）。Ｃｏｓ-２及びｆｕｓｅｄの推定反対機能に一
致して、ｆｕｓｅｄ変異はＣｏｓ-２変異体によって、及びｆｕｓｅｄ変異体の
サプレッサによって抑制される、Preat等, Genetics 135: 1047-62 (1993)。し
かしながら、ｆｕｓｅｄ無しの変異及びＮ-末端キナーゼドメイン変異は、ｆｕ
ｓｅｄ変異のサプレッサによって完全に抑制されるが、ｆｕｓｅｄのＣ-末端変
異はｆｕｓｅｄのサプレッサのバックグラウンドにおいて強いＣｏｓ-２フェノ
タイプを示す。このことは、ｆｕｓｅｄキナーゼドメインが、ｆｕｓｅｄのサプ
レッサが存在しない場合にＳＨｈシグナル伝達の構成アクチベータとして作用す
ることを示唆している。最近の研究は、９２ｋＤａショウジョウバエｆｕｓｅｄ
、Ｃｏｓ-２及びＣｉが微小管結合性多タンパク質複合体として存在し、Ｈｈシ
グナル伝達が微小管からのこの複合体の解離を導くことを示した、Robbins等, C
ell 90: 225-34 (1997); Sisson等, Cell 90: 235-45 (1997)。ｆｕｓｅｄ及び
Ｃｏｓ-２の両方ともがＨｈ処理に応答してリン酸化されるが、Robbins等, 上掲
; Therond等, Genetics 142: 1181-98 (1996)、この活性の原因となるキナーゼ
の性質決定は未だ行われていない。
伝学的、構造学的分析に基づいて示唆されてきた。Ｃｏｓ-２における変異は胚
致死性であり、各セグメントの中心成分及びＨｈ応答性遺伝子の拡張ドメインの
複製を含むＨｈ過剰発現に類似のフェノタイプを提示する。これに対して、ｈＳ
ｕ（ｆｕ）及びＣｉについての変異胚は、各セグメント後部の欠失及び前部の鏡
像様複製の置換を含むＨｈ機能の喪失に類似のフェノタイプを示す、Busson等,
Roux. Arch. Dev. Biol. 197: 221-230 (1988)。Ｃｉの分子キャラクタリゼーシ
ョンは、それがＷｉｎｇｌｅｓｓ及びＤｐｐなどのＨｈ応答性遺伝子を直接活性
化する転写因子であることを示唆した、Alexandre等, (1996), 上掲;Dominguez
等, (1996), 上掲）。同様に、ｆｕｓｅｄの分子解析により、セリン、トレオニンキ
ナーゼと関連性があり、インタクトなＮ末端キナーゼドメイン及びＣ末端制御領
域がその適切は機能に必要であることが明らかになった（Preat等, Nature 347:87-9 (1990); Robbins等, (1997) 上掲；Therond等, Proc. Natl. A
cad. Sci. USA 93: 4224-8 (1996)）。Ｃｏｓ-２及びｆｕｓｅｄの推定反対機能に一
致して、ｆｕｓｅｄ変異はＣｏｓ-２変異体によって、及びｆｕｓｅｄ変異体の
サプレッサによって抑制される、Preat等, Genetics 135: 1047-62 (1993)。し
かしながら、ｆｕｓｅｄ無しの変異及びＮ-末端キナーゼドメイン変異は、ｆｕ
ｓｅｄ変異のサプレッサによって完全に抑制されるが、ｆｕｓｅｄのＣ-末端変
異はｆｕｓｅｄのサプレッサのバックグラウンドにおいて強いＣｏｓ-２フェノ
タイプを示す。このことは、ｆｕｓｅｄキナーゼドメインが、ｆｕｓｅｄのサプ
レッサが存在しない場合にＳＨｈシグナル伝達の構成アクチベータとして作用す
ることを示唆している。最近の研究は、９２ｋＤａショウジョウバエｆｕｓｅｄ
、Ｃｏｓ-２及びＣｉが微小管結合性多タンパク質複合体として存在し、Ｈｈシ
グナル伝達が微小管からのこの複合体の解離を導くことを示した、Robbins等, C
ell 90: 225-34 (1997); Sisson等, Cell 90: 235-45 (1997)。ｆｕｓｅｄ及び
Ｃｏｓ-２の両方ともがＨｈ処理に応答してリン酸化されるが、Robbins等, 上掲
; Therond等, Genetics 142: 1181-98 (1996)、この活性の原因となるキナーゼ
の性質決定は未だ行われていない。
【０００５】 今日までに、これらの成分について知られている脊椎動物相同体は、Ｇｌｉタ
ンパク質ファミリー（例えば、Ｇｌｉ-１、Ｇｌｉ-２及びＧｌｉ-３）のみであ
る。これらは、Ｃｉに構造的に関連するＺｎフィンガー推定転写因子である。こ
れらの中で、Ｇｌｉ-１はＳＨｈシグナルのメディエータ候補であることが示さ
れ［Hynes等, Neuron 15: 35-44 (1995), Lee等, Development 124: 2537-52 (1
997); Alexandre等, Genes Dev. 10: 2003-13 (1996)］、Ｈｈに応答する遺伝子
活性化の機構がハエと脊椎動物の間で保存されることを示唆している。Ｈｈカス
ケードにおける他のシグナル伝達因子が進化的に保存されるか否かを決定し、生
化学レベルでのＨｈシグナル伝達におけるｆｕｓｅｄの機能を調べるために、ヒ
トｆｕｓｅｄ ｃＤＮＡが単離され特性決定された（米国仮出願06/076072、1998年２月２６日
出願、ここにその全体を取り込む）。マウスにおいて、ｆｕｓｅｄはＳＨｈ応答
性組織で発現される。生化学的研究は、ｆｕｓｅｄが機能性キナーゼであること
を示した。機能的研究は、ｆｕｓｅｄがＧｌｉのアクチベータであり、ｆｕｓｅ
ｄのドミナントネガティブ形態がアフリカツメガエル胚におけるＳＨｈシグナル
伝達を阻止できるという証拠を提供する。これらのデータをまとめて、Ｃｏｓ−
２とｆｕｓｅｄの両方がＨｈシグナル伝達に直接的に関連していることが示され
た。
ンパク質ファミリー（例えば、Ｇｌｉ-１、Ｇｌｉ-２及びＧｌｉ-３）のみであ
る。これらは、Ｃｉに構造的に関連するＺｎフィンガー推定転写因子である。こ
れらの中で、Ｇｌｉ-１はＳＨｈシグナルのメディエータ候補であることが示さ
れ［Hynes等, Neuron 15: 35-44 (1995), Lee等, Development 124: 2537-52 (1
997); Alexandre等, Genes Dev. 10: 2003-13 (1996)］、Ｈｈに応答する遺伝子
活性化の機構がハエと脊椎動物の間で保存されることを示唆している。Ｈｈカス
ケードにおける他のシグナル伝達因子が進化的に保存されるか否かを決定し、生
化学レベルでのＨｈシグナル伝達におけるｆｕｓｅｄの機能を調べるために、ヒ
トｆｕｓｅｄ ｃＤＮＡが単離され特性決定された（米国仮出願06/076072、1998年２月２６日
出願、ここにその全体を取り込む）。マウスにおいて、ｆｕｓｅｄはＳＨｈ応答
性組織で発現される。生化学的研究は、ｆｕｓｅｄが機能性キナーゼであること
を示した。機能的研究は、ｆｕｓｅｄがＧｌｉのアクチベータであり、ｆｕｓｅ
ｄのドミナントネガティブ形態がアフリカツメガエル胚におけるＳＨｈシグナル
伝達を阻止できるという証拠を提供する。これらのデータをまとめて、Ｃｏｓ−
２とｆｕｓｅｄの両方がＨｈシグナル伝達に直接的に関連していることが示され
た。
【０００６】 最近、ショウジョウバエにおいてｆｕｓｅｄタンパク質のサプレッサーが同定
され、新規ＰＥＳＴ-包含タンパク質であることが示された（Monnier等, Curr.
Biol. 8: 583-586 (1998), Pham等, Genetics 140: 587-598 (1995), Preat等,
Genetics 135: 1047-1062 (1993)及びPreat, Genetics 132: 725-736(1992)）。
ＰＥＳＴドメインはプロリン、グルタミン酸、（又はアスパラギン酸）、セリン
及びトレオニン（一文字コードでそれぞれ、Ｐ、Ｅ、Ｓ、及びＴ）に富む短い配
列で、低疎水性指数のもので組み合わされている。それらは、短い（２時間以内
）細胞内半減期をもつ多くのタンパク質に見出される（40）。出願人は、ここに
おいて、サプレッサーポリペプチドと相同性のあるポリペプチドをコードするＤ
ＮＡを同定し、記述し、ここにおいてｆｕｓｅｄヒトサプレッサー（「ｈＳｕ（
ｆｕ）」）と、あるいはｈＳｕ（ｆｕ）と命名した。体細胞において必要である
ｐａtｃｈｅｄ遺伝子の変異は、基底細胞癌腫、原発性乳癌腫、髄芽腫、髄膜腫
を含む散発性腫瘍において同定された。目下のところ、ｐａtｃｈｅｄはガン抑
制因子として作用し、これらの変異はｐａtｃｈｅｄ遺伝子産物における機能欠
損を引き起こすことが信じられている。従って、ｈｅｄｇｅｈｏｇ/ｐａｔｃｈ
ｅｄシグナル伝達経路は、腫瘍形成における要因であるかもしれない。細胞増殖
の増強及び腫瘍形成に至る遺伝的変化を検出することは、臨床医学にとって非常
に興味深いことである。細胞増殖変調に至る特異的な変化を同定することは診断
の改善及び関連腫瘍に対する治療可能性へのチャンスになるかもしれない。
され、新規ＰＥＳＴ-包含タンパク質であることが示された（Monnier等, Curr.
Biol. 8: 583-586 (1998), Pham等, Genetics 140: 587-598 (1995), Preat等,
Genetics 135: 1047-1062 (1993)及びPreat, Genetics 132: 725-736(1992)）。
ＰＥＳＴドメインはプロリン、グルタミン酸、（又はアスパラギン酸）、セリン
及びトレオニン（一文字コードでそれぞれ、Ｐ、Ｅ、Ｓ、及びＴ）に富む短い配
列で、低疎水性指数のもので組み合わされている。それらは、短い（２時間以内
）細胞内半減期をもつ多くのタンパク質に見出される（40）。出願人は、ここに
おいて、サプレッサーポリペプチドと相同性のあるポリペプチドをコードするＤ
ＮＡを同定し、記述し、ここにおいてｆｕｓｅｄヒトサプレッサー（「ｈＳｕ（
ｆｕ）」）と、あるいはｈＳｕ（ｆｕ）と命名した。体細胞において必要である
ｐａtｃｈｅｄ遺伝子の変異は、基底細胞癌腫、原発性乳癌腫、髄芽腫、髄膜腫
を含む散発性腫瘍において同定された。目下のところ、ｐａtｃｈｅｄはガン抑
制因子として作用し、これらの変異はｐａtｃｈｅｄ遺伝子産物における機能欠
損を引き起こすことが信じられている。従って、ｈｅｄｇｅｈｏｇ/ｐａｔｃｈ
ｅｄシグナル伝達経路は、腫瘍形成における要因であるかもしれない。細胞増殖
の増強及び腫瘍形成に至る遺伝的変化を検出することは、臨床医学にとって非常
に興味深いことである。細胞増殖変調に至る特異的な変化を同定することは診断
の改善及び関連腫瘍に対する治療可能性へのチャンスになるかもしれない。
【０００７】 （発明の概要） 「ｈＳｕ（ｆｕ）」又はＰＲＯ１２８０と命名された新規ポリペプチドをコー
ドするｃＤＮＡクローン（ＤＮＡ３３４５５）が同定された。一実施態様では、
本発明はｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる単離さ
れた核酸分子を提供する。 一実施態様では、単離された核酸は、（ａ）Ｆｉｇ１のｈＳｕ（ｆｕ）のアミ
ノ酸１〜４３３の配列（配列番号：２）のアミノ酸配列を持つｈＳｕ（ｆｕ）ポ
リペプチドをコードする核酸分子、又は（ｂ）（ａ）の核酸分子の相補鎖に対し
て少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なく
とも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％、さらにより好ましくは少な
くとも９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する配列により構成さ
れる。他の実施態様では、核酸はＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ-１２７のヒトタンパ
ク質ｃＤＮＡ（ＤＮＡ３３４５５-１５４８と命名）にコードされるのと同じ成
熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子又はその相補鎖と相同性を有する。好適
な実施態様では、核酸はＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ-１２７のヒトタンパク質ｃＤ
ＮＡ（ＤＮＡ３３４５５-１５４８）にコードされるのと同じ成熟ポリペプチド
をコードするＤＮＡ分子又はその相補鎖を含む。 本発明は、さらに、Ｆｉｇ６Ａ-６Ｂの約７４から約１３７２残基間の核酸（
配列番号：1）の相補鎖にハイブリダイズ化する核酸配列を含み、ｈＳｕ（ｆｕ
）ポリペプチドをコードする単離された核酸分子に関する。好ましくは、ハイブ
リダイゼーションは緊縮性のハイブリダイゼーション及び洗浄の条件下で行われ
る。 さらに、本発明はＦｉｇ１のｈＳｕ（ｆｕ）のアミノ酸１〜４３３の配列（配
列番号：２）のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８
５％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％
、さらにより好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは１００％の配列同一
性を有するポリペプチドをコードする核酸配列又はその相補鎖を含む単離された
核酸分子に関する。 更なる場合には、本発明は少なくとも１００ヌクレオチドを有し、（ａ）Ｆｉ
ｇ１のｈＳｕ（ｆｕ）のアミノ酸１〜４３３の配列（配列番号：２）のアミノ酸
配列を有するｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）
（ａ）の相補鎖と緊縮性の条件下で試験ＤＮＡ分子とハイブリダイズ化すること
により生産される単離された核酸に関し、そのＤＮＡ分子が少なくとも約８０％
、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好
ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する場合には、その試験ＤＮＡ分
子を単離することに関する。 特定の場合には、本発明は開始メチオニンを有する、もしくは有さないｈＳｕ
（ｆｕ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ又はそのコード化ＤＮＡの相補鎖によ
り構成される核酸分子を提供する。 他の面においては、本発明は、（ａ）Ｆｉｇ１のｈＳｕ（ｆｕ）のアミノ酸１
〜４３３の配列（配列番号：２）のアミノ酸配列と比較した時、少なくとも約８
０％のポジティブ、好ましくは少なくとも約８５％のポジティブ、より好ましく
は少なくとも約９０％のポジティブ、最も好ましくは少なくとも約９５％のポジ
ティブのスコアを示すポリペプチドをコードする核酸又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ
の相補鎖により構成される単離された核酸分子に関する。 他の実施態様は、ハイブリダイゼーションプローブとしての利用を見出すこと
ができるｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドをコードする配列断片を対象としている。
そのような核酸断片は約２０から約８０ヌクレオチド長で、好ましくは約２０か
ら約６０ヌクレオチド長、さらに好ましくは約２０から約５０ヌクレオチド長、
もっとも好ましくは約２０から約４０ヌクレオチド長であり、配列番号：1に示
されるヌクレオチド配列から誘導し得る。
ドするｃＤＮＡクローン（ＤＮＡ３３４５５）が同定された。一実施態様では、
本発明はｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる単離さ
れた核酸分子を提供する。 一実施態様では、単離された核酸は、（ａ）Ｆｉｇ１のｈＳｕ（ｆｕ）のアミ
ノ酸１〜４３３の配列（配列番号：２）のアミノ酸配列を持つｈＳｕ（ｆｕ）ポ
リペプチドをコードする核酸分子、又は（ｂ）（ａ）の核酸分子の相補鎖に対し
て少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なく
とも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％、さらにより好ましくは少な
くとも９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する配列により構成さ
れる。他の実施態様では、核酸はＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ-１２７のヒトタンパ
ク質ｃＤＮＡ（ＤＮＡ３３４５５-１５４８と命名）にコードされるのと同じ成
熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子又はその相補鎖と相同性を有する。好適
な実施態様では、核酸はＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ-１２７のヒトタンパク質ｃＤ
ＮＡ（ＤＮＡ３３４５５-１５４８）にコードされるのと同じ成熟ポリペプチド
をコードするＤＮＡ分子又はその相補鎖を含む。 本発明は、さらに、Ｆｉｇ６Ａ-６Ｂの約７４から約１３７２残基間の核酸（
配列番号：1）の相補鎖にハイブリダイズ化する核酸配列を含み、ｈＳｕ（ｆｕ
）ポリペプチドをコードする単離された核酸分子に関する。好ましくは、ハイブ
リダイゼーションは緊縮性のハイブリダイゼーション及び洗浄の条件下で行われ
る。 さらに、本発明はＦｉｇ１のｈＳｕ（ｆｕ）のアミノ酸１〜４３３の配列（配
列番号：２）のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８
５％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％
、さらにより好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは１００％の配列同一
性を有するポリペプチドをコードする核酸配列又はその相補鎖を含む単離された
核酸分子に関する。 更なる場合には、本発明は少なくとも１００ヌクレオチドを有し、（ａ）Ｆｉ
ｇ１のｈＳｕ（ｆｕ）のアミノ酸１〜４３３の配列（配列番号：２）のアミノ酸
配列を有するｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）
（ａ）の相補鎖と緊縮性の条件下で試験ＤＮＡ分子とハイブリダイズ化すること
により生産される単離された核酸に関し、そのＤＮＡ分子が少なくとも約８０％
、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好
ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する場合には、その試験ＤＮＡ分
子を単離することに関する。 特定の場合には、本発明は開始メチオニンを有する、もしくは有さないｈＳｕ
（ｆｕ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ又はそのコード化ＤＮＡの相補鎖によ
り構成される核酸分子を提供する。 他の面においては、本発明は、（ａ）Ｆｉｇ１のｈＳｕ（ｆｕ）のアミノ酸１
〜４３３の配列（配列番号：２）のアミノ酸配列と比較した時、少なくとも約８
０％のポジティブ、好ましくは少なくとも約８５％のポジティブ、より好ましく
は少なくとも約９０％のポジティブ、最も好ましくは少なくとも約９５％のポジ
ティブのスコアを示すポリペプチドをコードする核酸又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ
の相補鎖により構成される単離された核酸分子に関する。 他の実施態様は、ハイブリダイゼーションプローブとしての利用を見出すこと
ができるｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドをコードする配列断片を対象としている。
そのような核酸断片は約２０から約８０ヌクレオチド長で、好ましくは約２０か
ら約６０ヌクレオチド長、さらに好ましくは約２０から約５０ヌクレオチド長、
もっとも好ましくは約２０から約４０ヌクレオチド長であり、配列番号：1に示
されるヌクレオチド配列から誘導し得る。
【０００８】 他の実施態様では、本発明はｈＳｕ（ｆｕ）又はその変異体をコードする核酸
を含むベクターを提供する。そのベクターはここで同定された単離された核酸分
子のいくつかを含む。 そのようなベクターを含む宿主細胞も提供される。例えば、宿主細胞はＣＨＯ
細胞、大腸菌又は酵母でよい。さらに、宿主細胞を、ｈＳｕ（ｆｕ）の発現に適
した条件下で培養し、細胞培養物からそれを回収することを含んでなるｈＳｕ（
ｆｕ）の製造方法も提供される。
を含むベクターを提供する。そのベクターはここで同定された単離された核酸分
子のいくつかを含む。 そのようなベクターを含む宿主細胞も提供される。例えば、宿主細胞はＣＨＯ
細胞、大腸菌又は酵母でよい。さらに、宿主細胞を、ｈＳｕ（ｆｕ）の発現に適
した条件下で培養し、細胞培養物からそれを回収することを含んでなるｈＳｕ（
ｆｕ）の製造方法も提供される。
【０００９】 さらに他の実施態様では、本発明は上述の如く同定された単離核酸のいずれか
によってコードされた単離ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドを提供する。 特に、本発明は単離された天然配列ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドを提供し、そ
れは一実施態様においてＦｉｇ１の残基１〜４３３（配列番号：２）を含んでな
るアミノ酸配列を含むｈＳｕ（ｆｕ）である。 他の場合には、本発明は単離されたｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドで、Ｆｉｇ１
の残基１〜４３３（配列番号：２）のアミノ酸配列と少なくとも約８０％の配列
同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、さらに好ましくは約９０
％の配列同一性、最も好ましくは約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列に
よって構成されるものに関する。 さらなる場合には、本発明は単離されたｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドで、Ｆｉ
ｇ１の残基１〜４３３（配列番号：２）のアミノ酸配列と少なくとも約８０％の
配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、さらに好ましくは約
９０％の配列同一性、最も好ましくは約９５％のポジティブスコアを示すアミノ
酸配列によって構成されるものに関する。 さらに他の場合において、本発明は単離されたｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドで
、Ｆｉｇ１の残基１〜４３３（配列番号：２）のアミノ酸配列又は抗ｈＳｕ（ｆ
ｕ）抗体に対する結合部位を提供するのに充分な前述配列の断片により構成され
るものに関する。好ましくは、ｈＳｕ（ｆｕ）断片は天然ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペ
プチドの定性的生物活性を保持する。 更なる場合には、本発明は（i）緊縮性の条件下で試験ＤＮＡ分子と（ａ）配
列番号：２の約１から約４３３番のアミノ酸配列を有するｈＳｕ（ｆｕ）をコー
ド化する試験ＤＮＡ、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖をハイブリダイズ
化することにより生産されるポリペプチド、及びその試験ＤＮＡ分子が（ａ）又
は（ｂ）と少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の
配列同一性、さらに好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましく
は少なくとも約９５％の配列同一性を有する場合、（ii）ポリペプチドの発現に
とって適切な条件下で試験ＤＮＡ分子を含む宿主細胞を培養し、（iii）細胞培
養物からポリペプチドを回収することにより生産されるポリペプチドを提供する
。 他の実施態様では、本発明は異質性ポリペプチド又はアミノ酸配列と融合した
ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドを含むキメラ分子を提供する。そのようなキメラ分
子の例には、エピトープタグ配列又はイムノグロブリンのＦｃ領域と融合したｈ
Ｓｕ（ｆｕ）ポリペプチドを含む。 他の実施態様では、本発明はｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドと特異的に結合する
抗体を提供する。場合によっては、その抗体はモノクローナル抗体である。 さらに他の実施態様では、本発明は天然ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドのアゴニ
スト及びアンタゴニストに関する。特別な実施態様では、そのアゴニスト又はア
ンタゴニストは抗ｈＳｕ（ｆｕ）抗体である。 更なる実施態様では、本発明は天然ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドを候補分子に
接触させ、当該ポリペプチドによって仲介される生物学的な活性を検出すること
により天然ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定
する方法に関する。好ましい実施態様において、生物学的活性はヘッジホッグシ
グナル経路において融合ポリペプチドの活性を抑制するものである。 さらなる実施態様では、本発明は製薬的に受容可能な担体と組み合わせて、ｈ
Ｓｕ（ｆｕ）ポリペプチドもしくは上述に定義したようなアゴニスト又はアンタ
ゴニストを含んでなる組成物に関する。 他の実施態様では、本発明はｈＳｕ（ｆｕ）によるヘッジホッグシグナル伝達
調節の促進に対するアンタゴニストもしくはアゴニストを開発するための化合物
及び方法を提供する。特に、生物有機化学的小分子及びアンチセンスヌクレオチ
ドを含む、ＳＨシグナル伝達経路においてｈＳｕ（ｆｕ）の正常な機能発現を阻
止、防止、阻害、及び／又は、中和するｈＳｕ（ｆｕ）のアンタゴニストである
。
によってコードされた単離ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドを提供する。 特に、本発明は単離された天然配列ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドを提供し、そ
れは一実施態様においてＦｉｇ１の残基１〜４３３（配列番号：２）を含んでな
るアミノ酸配列を含むｈＳｕ（ｆｕ）である。 他の場合には、本発明は単離されたｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドで、Ｆｉｇ１
の残基１〜４３３（配列番号：２）のアミノ酸配列と少なくとも約８０％の配列
同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、さらに好ましくは約９０
％の配列同一性、最も好ましくは約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列に
よって構成されるものに関する。 さらなる場合には、本発明は単離されたｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドで、Ｆｉ
ｇ１の残基１〜４３３（配列番号：２）のアミノ酸配列と少なくとも約８０％の
配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、さらに好ましくは約
９０％の配列同一性、最も好ましくは約９５％のポジティブスコアを示すアミノ
酸配列によって構成されるものに関する。 さらに他の場合において、本発明は単離されたｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドで
、Ｆｉｇ１の残基１〜４３３（配列番号：２）のアミノ酸配列又は抗ｈＳｕ（ｆ
ｕ）抗体に対する結合部位を提供するのに充分な前述配列の断片により構成され
るものに関する。好ましくは、ｈＳｕ（ｆｕ）断片は天然ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペ
プチドの定性的生物活性を保持する。 更なる場合には、本発明は（i）緊縮性の条件下で試験ＤＮＡ分子と（ａ）配
列番号：２の約１から約４３３番のアミノ酸配列を有するｈＳｕ（ｆｕ）をコー
ド化する試験ＤＮＡ、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖をハイブリダイズ
化することにより生産されるポリペプチド、及びその試験ＤＮＡ分子が（ａ）又
は（ｂ）と少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の
配列同一性、さらに好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましく
は少なくとも約９５％の配列同一性を有する場合、（ii）ポリペプチドの発現に
とって適切な条件下で試験ＤＮＡ分子を含む宿主細胞を培養し、（iii）細胞培
養物からポリペプチドを回収することにより生産されるポリペプチドを提供する
。 他の実施態様では、本発明は異質性ポリペプチド又はアミノ酸配列と融合した
ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドを含むキメラ分子を提供する。そのようなキメラ分
子の例には、エピトープタグ配列又はイムノグロブリンのＦｃ領域と融合したｈ
Ｓｕ（ｆｕ）ポリペプチドを含む。 他の実施態様では、本発明はｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドと特異的に結合する
抗体を提供する。場合によっては、その抗体はモノクローナル抗体である。 さらに他の実施態様では、本発明は天然ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドのアゴニ
スト及びアンタゴニストに関する。特別な実施態様では、そのアゴニスト又はア
ンタゴニストは抗ｈＳｕ（ｆｕ）抗体である。 更なる実施態様では、本発明は天然ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドを候補分子に
接触させ、当該ポリペプチドによって仲介される生物学的な活性を検出すること
により天然ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定
する方法に関する。好ましい実施態様において、生物学的活性はヘッジホッグシ
グナル経路において融合ポリペプチドの活性を抑制するものである。 さらなる実施態様では、本発明は製薬的に受容可能な担体と組み合わせて、ｈ
Ｓｕ（ｆｕ）ポリペプチドもしくは上述に定義したようなアゴニスト又はアンタ
ゴニストを含んでなる組成物に関する。 他の実施態様では、本発明はｈＳｕ（ｆｕ）によるヘッジホッグシグナル伝達
調節の促進に対するアンタゴニストもしくはアゴニストを開発するための化合物
及び方法を提供する。特に、生物有機化学的小分子及びアンチセンスヌクレオチ
ドを含む、ＳＨシグナル伝達経路においてｈＳｕ（ｆｕ）の正常な機能発現を阻
止、防止、阻害、及び／又は、中和するｈＳｕ（ｆｕ）のアンタゴニストである
。
【００１０】 さらに他の実施態様において、本発明は、ヒトｈＳｕ（ｆｕ）の選択的スプラ
イシングされた変異体を提供する。 またさらに他の実施態様では、本発明は、ヘッジホッグシグナル伝達のｈＳｕ
（ｆｕ）による調節を転調させる分子を同定するためのスクリーニング又はアッ
セイ方法を提供する。好ましくは、その分子は、ｈＳｕ（ｆｕ）のその結合性複
合体（ｆｕｓｅｄのような）形成タンパク質との相互作用を阻止するか、複合体
の分解を阻止又は阻害するかのいずれかである。このアッセイは、ｈＳｕ（ｆｕ
）及び基質を含む混合物の候補分子とのインキュベーション、及びｈＳｕ（ｆｕ
）によるヘッジホッグシグナル伝達を調節する候補分子の能力の検出を含む。ス
クリーニングされた分子は、好ましくは小分子薬候補である。 他の実施態様では、この方法は、特定の疾患がヘッジホッグシグナル伝達によ
って調節されるか否かを決定する診断方法に関係し、 （ａ）試験細胞又は組織を培養し； （ｂ）ｈＳｕ（ｆｕ）によるヘッジホッグシグナル伝達調節を阻害できる化合
物を投与し；そして （ｃ）ヘッジホッグシグナル伝達が変調されるかどうか決定する： ことを含む。
イシングされた変異体を提供する。 またさらに他の実施態様では、本発明は、ヘッジホッグシグナル伝達のｈＳｕ
（ｆｕ）による調節を転調させる分子を同定するためのスクリーニング又はアッ
セイ方法を提供する。好ましくは、その分子は、ｈＳｕ（ｆｕ）のその結合性複
合体（ｆｕｓｅｄのような）形成タンパク質との相互作用を阻止するか、複合体
の分解を阻止又は阻害するかのいずれかである。このアッセイは、ｈＳｕ（ｆｕ
）及び基質を含む混合物の候補分子とのインキュベーション、及びｈＳｕ（ｆｕ
）によるヘッジホッグシグナル伝達を調節する候補分子の能力の検出を含む。ス
クリーニングされた分子は、好ましくは小分子薬候補である。 他の実施態様では、この方法は、特定の疾患がヘッジホッグシグナル伝達によ
って調節されるか否かを決定する診断方法に関係し、 （ａ）試験細胞又は組織を培養し； （ｂ）ｈＳｕ（ｆｕ）によるヘッジホッグシグナル伝達調節を阻害できる化合
物を投与し；そして （ｃ）ヘッジホッグシグナル伝達が変調されるかどうか決定する： ことを含む。
【００１１】 （好適な実施態様の詳細な説明） Ｉ．定義 ここで使用される際の「ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチド」、「ｈＳｕ（ｆｕ）タ
ンパク質」及び「ｈＳｕ（ｆｕ）」という用語は、天然配列ｈＳｕ（ｆｕ）及び
ｈＳｕ（ｆｕ）の生物学的活性を有するｈＳｕ（ｆｕ）変異体（ここで更に詳細
に定義する）を含む。ｈＳｕ（ｆｕ）は、ヒト組織型又は他の供給源といった種
々の供給源から単離してもよく、あるいは組換え及び/又は合成方法によって調
製してもよい。 「天然配列ｈＳｕ（ｆｕ）」は、天然由来のｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドと同
一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでいる。このような天然配列ｈＳ
ｕ（ｆｕ）は、自然から単離することもできるし、組換え及び/又は合成手段に
より生産することもできる。「天然配列ｈＳｕ（ｆｕ）」という用語には、特に
、ｈＳｕ（ｆｕ）の自然に生じる切断形態、分泌形態（例えば、細胞外ドメイン
配列）、自然に生じる変異形態(例えば、選択的にスプライシングされた形態)及
びｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。本
発明の一実施態様において、天然配列ヒトｈＳｕ（ｆｕ）は、Ｆｉｇ１に示す配
列番号：２のアミノ酸１〜４３３を含有する成熟又は全長天然ｈＳｕ（ｆｕ）で
ある。
ンパク質」及び「ｈＳｕ（ｆｕ）」という用語は、天然配列ｈＳｕ（ｆｕ）及び
ｈＳｕ（ｆｕ）の生物学的活性を有するｈＳｕ（ｆｕ）変異体（ここで更に詳細
に定義する）を含む。ｈＳｕ（ｆｕ）は、ヒト組織型又は他の供給源といった種
々の供給源から単離してもよく、あるいは組換え及び/又は合成方法によって調
製してもよい。 「天然配列ｈＳｕ（ｆｕ）」は、天然由来のｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドと同
一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでいる。このような天然配列ｈＳ
ｕ（ｆｕ）は、自然から単離することもできるし、組換え及び/又は合成手段に
より生産することもできる。「天然配列ｈＳｕ（ｆｕ）」という用語には、特に
、ｈＳｕ（ｆｕ）の自然に生じる切断形態、分泌形態（例えば、細胞外ドメイン
配列）、自然に生じる変異形態(例えば、選択的にスプライシングされた形態)及
びｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。本
発明の一実施態様において、天然配列ヒトｈＳｕ（ｆｕ）は、Ｆｉｇ１に示す配
列番号：２のアミノ酸１〜４３３を含有する成熟又は全長天然ｈＳｕ（ｆｕ）で
ある。
【００１２】 「ｈＳｕ（ｆｕ）変異体」とは、ｈＳｕ（ｆｕ）についてＦｉｇ１に示した推
定アミノ酸配列（配列番号：２）を有するｈＳｕ（ｆｕ）のアミノ酸残基１から
４３３番目と少なくとも約８０％のアミノ酸配列相同性を有し、以下に定義され
るような活性を有するｈＳｕ（ｆｕ）を意味する。このようなｈＳｕ（ｆｕ）変
異体は、例えば、Ｆｉｇ１(配列番号：２)の配列のＮ-又はＣ-末端において一又
は複数のアミノ酸残基が付加、もしくは欠失されたｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチド
を含む。通常、ｈＳｕ（ｆｕ）変異体は、Ｆｉｇ１に示す配列番号：２のアミノ
酸１〜４３３番目までのアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、より好ましくは
少なくとも約８５％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好
ましくは少なくとも９５％、よりさらに好ましくは少なくとも９８％の配列同一
性を有する。変異体は、天然配列もしくはＦｉｇ１（配列番号；４）に示されて
いるショウジョウバエのｆｕｓｅｄサプレッサーのような既知のサプレッサーを
含まない。
定アミノ酸配列（配列番号：２）を有するｈＳｕ（ｆｕ）のアミノ酸残基１から
４３３番目と少なくとも約８０％のアミノ酸配列相同性を有し、以下に定義され
るような活性を有するｈＳｕ（ｆｕ）を意味する。このようなｈＳｕ（ｆｕ）変
異体は、例えば、Ｆｉｇ１(配列番号：２)の配列のＮ-又はＣ-末端において一又
は複数のアミノ酸残基が付加、もしくは欠失されたｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチド
を含む。通常、ｈＳｕ（ｆｕ）変異体は、Ｆｉｇ１に示す配列番号：２のアミノ
酸１〜４３３番目までのアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、より好ましくは
少なくとも約８５％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好
ましくは少なくとも９５％、よりさらに好ましくは少なくとも９８％の配列同一
性を有する。変異体は、天然配列もしくはＦｉｇ１（配列番号；４）に示されて
いるショウジョウバエのｆｕｓｅｄサプレッサーのような既知のサプレッサーを
含まない。
【００１３】 ｈＳｕ（ｆｕ）配列に対してここで同定されている「パーセント(％)アミノ酸
配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必
要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとし
た、ｈＳｕ（ｆｕ）配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基
のパーセントとして定義される。ここで用いられるパーセント同一性値は、入手
可能WＵ-BLAST-2（Altschul等, Methods in Enzymology, 266: 460-480 (1996);
またここに参考文献として記載してある http://blast.wustl/edu/blast/README
.html, を参照のこと ）を使用することにより達成可能である。WＵ-BLAST-2は
その多くが初期設定値に対してセットされるようなサーチパラメータを利用する
。適切なパラメータは以下の値を有する組である：オーバーラップ スパン=1,
オーバーラプ フラクション=0.125, ワード 閾値(T)=11である。
配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必
要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとし
た、ｈＳｕ（ｆｕ）配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基
のパーセントとして定義される。ここで用いられるパーセント同一性値は、入手
可能WＵ-BLAST-2（Altschul等, Methods in Enzymology, 266: 460-480 (1996);
またここに参考文献として記載してある http://blast.wustl/edu/blast/README
.html, を参照のこと ）を使用することにより達成可能である。WＵ-BLAST-2は
その多くが初期設定値に対してセットされるようなサーチパラメータを利用する
。適切なパラメータは以下の値を有する組である：オーバーラップ スパン=1,
オーバーラプ フラクション=0.125, ワード 閾値(T)=11である。
【００１４】 上述のように実施される配列比較の文脈における「ポジティブ（陽性）」とい
う用語は、比較された配列において同一であるばかりでなく類似の性質を有する
ものも含む（例えば、結果として保存的な置換となるような）。ポジティブ％値
は上記定義のように、より長い配列における全残基数により除したＢＬＯＳＵＭ
６２マトリックスにおけるポジティブ値のスコアされるアミノ酸残基の画分によ
って決定される。 同様に、ここで同定されているｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドのコード配列に関
して「パーセント(％)核酸配列同一性」は、ｈＳｕ（ｆｕ）コード配列中のヌク
レオチド残基と同一である候補配列中のヌクレオチド残基のパーセントとして定
義される。ここで使用される同一性値は、オーバーラップ スパンと オーバー
ラプ フラクションがそれぞれ１及び0.125である組み合わせをもつ、初期設定値
に対するWＵ-BLAST-2セットのBLASTINモジュールにより算出される。
う用語は、比較された配列において同一であるばかりでなく類似の性質を有する
ものも含む（例えば、結果として保存的な置換となるような）。ポジティブ％値
は上記定義のように、より長い配列における全残基数により除したＢＬＯＳＵＭ
６２マトリックスにおけるポジティブ値のスコアされるアミノ酸残基の画分によ
って決定される。 同様に、ここで同定されているｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドのコード配列に関
して「パーセント(％)核酸配列同一性」は、ｈＳｕ（ｆｕ）コード配列中のヌク
レオチド残基と同一である候補配列中のヌクレオチド残基のパーセントとして定
義される。ここで使用される同一性値は、オーバーラップ スパンと オーバー
ラプ フラクションがそれぞれ１及び0.125である組み合わせをもつ、初期設定値
に対するWＵ-BLAST-2セットのBLASTINモジュールにより算出される。
【００１５】 「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために
使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収され
たポリペプチドを意味する。その自然環境の狭雑成分とは、そのポリペプチドの
診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び
他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様におい
て、ポリペプチドは、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することに
より、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分な
ほど、あるいは、(２) 非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥを行い、
クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色によって、均一になるまで精製され
る。単離されたポリペプチドには、ｈＳｕ（ｆｕ）の自然環境の少なくとも１つ
の成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのタンパク質が含まれる。
しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程に
より調製される。 「単離された」ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチド核酸分子は、同定され、ｈＳｕ（
ｆｕ）核酸の天然源に通常付随している少なくとも１つの汚染核酸分子から分離
された核酸分子である。単離されたｈＳｕ（ｆｕ）コード化核酸分子は、天然に
見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離されたｈＳｕ（ｆ
ｕ）コード化核酸分子は、天然の細胞中に存在するｈＳｕ（ｆｕ）核酸分子から
区別される。しかしながら、ｈＳｕ（ｆｕ）をコードする単離された核酸分子は
、例えば、核酸分子が天然の細胞の場合とは異なる染色体上の位置に存在するよ
うな、通常ｈＳｕ（ｆｕ）を発現している細胞に含まれるようなｈＳｕ（ｆｕ）
-コード化核酸分子を包含する。
使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収され
たポリペプチドを意味する。その自然環境の狭雑成分とは、そのポリペプチドの
診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び
他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様におい
て、ポリペプチドは、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することに
より、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分な
ほど、あるいは、(２) 非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥを行い、
クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色によって、均一になるまで精製され
る。単離されたポリペプチドには、ｈＳｕ（ｆｕ）の自然環境の少なくとも１つ
の成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのタンパク質が含まれる。
しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程に
より調製される。 「単離された」ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチド核酸分子は、同定され、ｈＳｕ（
ｆｕ）核酸の天然源に通常付随している少なくとも１つの汚染核酸分子から分離
された核酸分子である。単離されたｈＳｕ（ｆｕ）コード化核酸分子は、天然に
見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離されたｈＳｕ（ｆ
ｕ）コード化核酸分子は、天然の細胞中に存在するｈＳｕ（ｆｕ）核酸分子から
区別される。しかしながら、ｈＳｕ（ｆｕ）をコードする単離された核酸分子は
、例えば、核酸分子が天然の細胞の場合とは異なる染色体上の位置に存在するよ
うな、通常ｈＳｕ（ｆｕ）を発現している細胞に含まれるようなｈＳｕ（ｆｕ）
-コード化核酸分子を包含する。
【００１６】 「コントロール配列」という表現は、特定の宿主生物において作用可能に結合
したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好
適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及び
リボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化
シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。 核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」てい
る。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に
参画するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡ
に作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影
響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合
部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用
可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤ
ＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読み枠の合った
状態にあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要
はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのよう
な部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダ
プターあるいはリンカーが使用される。
したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好
適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及び
リボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化
シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。 核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」てい
る。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に
参画するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡ
に作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影
響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合
部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用
可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤ
ＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読み枠の合った
状態にあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要
はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのよう
な部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダ
プターあるいはリンカーが使用される。
【００１７】 「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、特に単一の抗ｈＳｕ（
ｆｕ）抗体モノクローナル抗体(アゴニスト、アンタゴニスト及び中和抗体を含
む)、及び多エピトープ特異性を持つ抗体組成物を包含している。ここで使用さ
れる「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団、すなわ
ち、構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能性のある突然変異
を除いて同一である集団から得られる抗体を指す。
ｆｕ）抗体モノクローナル抗体(アゴニスト、アンタゴニスト及び中和抗体を含
む)、及び多エピトープ特異性を持つ抗体組成物を包含している。ここで使用さ
れる「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団、すなわ
ち、構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能性のある突然変異
を除いて同一である集団から得られる抗体を指す。
【００１８】 ハイブリッド形成反応の「緊縮性」は、当業者によって容易に決定され、一般
的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に
、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブ
が短くなると温度は低くなる。ハイブリッド形成は、一般的に、相補的鎖がその
融点より低い環境に存在する場合における変性ＤＮＡの再アニールする能力に依
存する。プローブとハイブリッド形成可能な配列との間の所望の相同性の程度が
高くなると、使用できる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、
反応条件をより緊縮性にするが、低い温度は緊縮性を低下させる。さらに、緊縮
性は塩濃度に逆比例する。ハイブリッド形成反応の緊縮性の更なる詳細及び説明
は、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照のこと。 ここで定義される「緊縮性条件」、「高緊縮性条件」は、（１）洗浄のために
低イオン強度及び高温度、例えば、５０℃において０．０１５Ｍの塩化ナトリウ
ム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウム
を用いるもの；（２）ハイブリッド形成中にホルムアミド等の変性剤、例えば、
４２℃において５０％（vol/vol）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン
／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．
５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭ
クエン酸ナトリウムを用いるもの；（３）４２℃における５０％ホルムアミド、
５ｘＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５
０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、
５ｘデンハード液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％Ｓ
ＤＳ、及び１０％デキストラン硫酸を４２℃で用い、洗浄を０．２ｘＳＳＣ（塩
化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）及び０．１％ＳＤＳ中で４２℃で行うもの
；もしくは（４）１０％のデキストラン硫酸と２ｘＳＳＣ及び５５℃での５０％
ホルムアミド、ついで５５℃におけるＥＤＴＡを含む０．１ｘＳＳＣからなる高
緊縮性洗浄を用いるものによって同定される。 「中程度の緊縮性条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory
Manual、New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989、に記載されているように同定され、上記の緊縮性より低い洗浄溶液及びハ
イブリッド形成条件（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。
中程度の緊縮性条件は、２０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣ
ｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．
６）、５ｘデンハード液、１０％デキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍＬの変性
剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中の３７℃での終夜インキュベーション、ついで
１ｘＳＳＣ中３７−５０℃でのフィルターの洗浄といった条件である。当業者で
あれば、プローブ長などの因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度
、イオン強度等を調節するかを認識するであろう。
的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に
、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブ
が短くなると温度は低くなる。ハイブリッド形成は、一般的に、相補的鎖がその
融点より低い環境に存在する場合における変性ＤＮＡの再アニールする能力に依
存する。プローブとハイブリッド形成可能な配列との間の所望の相同性の程度が
高くなると、使用できる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、
反応条件をより緊縮性にするが、低い温度は緊縮性を低下させる。さらに、緊縮
性は塩濃度に逆比例する。ハイブリッド形成反応の緊縮性の更なる詳細及び説明
は、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照のこと。 ここで定義される「緊縮性条件」、「高緊縮性条件」は、（１）洗浄のために
低イオン強度及び高温度、例えば、５０℃において０．０１５Ｍの塩化ナトリウ
ム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウム
を用いるもの；（２）ハイブリッド形成中にホルムアミド等の変性剤、例えば、
４２℃において５０％（vol/vol）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン
／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．
５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭ
クエン酸ナトリウムを用いるもの；（３）４２℃における５０％ホルムアミド、
５ｘＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５
０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、
５ｘデンハード液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％Ｓ
ＤＳ、及び１０％デキストラン硫酸を４２℃で用い、洗浄を０．２ｘＳＳＣ（塩
化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）及び０．１％ＳＤＳ中で４２℃で行うもの
；もしくは（４）１０％のデキストラン硫酸と２ｘＳＳＣ及び５５℃での５０％
ホルムアミド、ついで５５℃におけるＥＤＴＡを含む０．１ｘＳＳＣからなる高
緊縮性洗浄を用いるものによって同定される。 「中程度の緊縮性条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory
Manual、New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989、に記載されているように同定され、上記の緊縮性より低い洗浄溶液及びハ
イブリッド形成条件（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。
中程度の緊縮性条件は、２０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣ
ｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．
６）、５ｘデンハード液、１０％デキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍＬの変性
剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中の３７℃での終夜インキュベーション、ついで
１ｘＳＳＣ中３７−５０℃でのフィルターの洗浄といった条件である。当業者で
あれば、プローブ長などの因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度
、イオン強度等を調節するかを認識するであろう。
【００１９】 「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチ
ド」に融合したｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドを意味する。タグポリペプチドは、
その抗体が産生され得るエピトープを提供するに十分な残基を有しているが、ｈ
Ｓｕ（ｆｕ）ポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリ
ペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないよ
うにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のア
ミノ酸残基、通常は約８〜約５０のアミノ酸残基(好ましくは約１０〜約２０の
残基)を有する。
ド」に融合したｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドを意味する。タグポリペプチドは、
その抗体が産生され得るエピトープを提供するに十分な残基を有しているが、ｈ
Ｓｕ（ｆｕ）ポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリ
ペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないよ
うにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のア
ミノ酸残基、通常は約８〜約５０のアミノ酸残基(好ましくは約１０〜約２０の
残基)を有する。
【００２０】 ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質（「アド
ヘシン」）の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインとを結合した抗体様分子
を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗
原認識及び結合部位以外である（即ち「異種の」）アミノ酸配列と、免疫グロブ
リン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部
分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミ
ノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、Ｉｇ
Ｇ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３又はＩｇＧ-４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ-１及
びＩｇＡ-２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブリン
から得ることができる。
ヘシン」）の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインとを結合した抗体様分子
を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗
原認識及び結合部位以外である（即ち「異種の」）アミノ酸配列と、免疫グロブ
リン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部
分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミ
ノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、Ｉｇ
Ｇ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３又はＩｇＧ-４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ-１及
びＩｇＡ-２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブリン
から得ることができる。
【００２１】 「変調」又は「変調する」という語句は、シグナル伝達経路のアップレギュレ
ーション又はダウンレギュレーションを意味する。シグナル伝達の制御下での細
胞プロセスは、これらに限られないが、特定遺伝子の転写；代謝、増殖、分化、
接着、アポトーシス及び生存などの正常な細胞機能、並びに、形質転換、分化及
び転移の阻止といった異常なプロセスを含みうる。 「ポリメラーゼ連鎖反応」又は「ＰＣＲ」の技術は、ここで用いられる場合、
一般に核酸、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡの特定の切片の少量が1987年7月28日発行
の米国特許第4,683,195号に記載されたように増幅される方法を意味する。一般
的に、対象とする領域の両末端から又は利用可能の必要な部分をカバーする配列
情報は、オリゴヌクレオチドプライマーの設計を可能にし；これらのプライマー
は増幅されるテンプレートの反対鎖の配列と同一又は類似している。２つのプラ
イマーの５’末端ヌクレオチドは増幅された物質の末端と一致する。ＰＣＲ配列
は、全ゲノムＤＮＡ、及び全細胞性ＲＮＡから転写されたｃＤＮＡ、バクテリオ
ファージ、又はプラスミド配列等を形成する。一般的に、Mullis等, Cold Sprin
g Harbor Symp. Quant Biol. 51: 263 (1987); Erlich, Ed., PCR Technology,
(Stockton Press, NY, 1989)を参照のこと。ここで用いられるように、ＰＣＲは
、プライマーとして公知の核酸を、そして核酸の特定の切片を増幅又は生成する
ために核酸ポリメラーゼを使用することを含む核酸試験試料の唯一ではない一例
であると考えられる。
ーション又はダウンレギュレーションを意味する。シグナル伝達の制御下での細
胞プロセスは、これらに限られないが、特定遺伝子の転写；代謝、増殖、分化、
接着、アポトーシス及び生存などの正常な細胞機能、並びに、形質転換、分化及
び転移の阻止といった異常なプロセスを含みうる。 「ポリメラーゼ連鎖反応」又は「ＰＣＲ」の技術は、ここで用いられる場合、
一般に核酸、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡの特定の切片の少量が1987年7月28日発行
の米国特許第4,683,195号に記載されたように増幅される方法を意味する。一般
的に、対象とする領域の両末端から又は利用可能の必要な部分をカバーする配列
情報は、オリゴヌクレオチドプライマーの設計を可能にし；これらのプライマー
は増幅されるテンプレートの反対鎖の配列と同一又は類似している。２つのプラ
イマーの５’末端ヌクレオチドは増幅された物質の末端と一致する。ＰＣＲ配列
は、全ゲノムＤＮＡ、及び全細胞性ＲＮＡから転写されたｃＤＮＡ、バクテリオ
ファージ、又はプラスミド配列等を形成する。一般的に、Mullis等, Cold Sprin
g Harbor Symp. Quant Biol. 51: 263 (1987); Erlich, Ed., PCR Technology,
(Stockton Press, NY, 1989)を参照のこと。ここで用いられるように、ＰＣＲは
、プライマーとして公知の核酸を、そして核酸の特定の切片を増幅又は生成する
ために核酸ポリメラーゼを使用することを含む核酸試験試料の唯一ではない一例
であると考えられる。
【００２２】 ここで意図している「活性な」及び「活性」とは、天然又は天然発生ｈＳｕ（
ｆｕ）の生物学的及び／又は免疫学的活性を保持するｈＳｕ（ｆｕ）の形態を意
味する。好ましい活性は、例えば、ヘッジホッグシグナル伝達経路を調節する能
力、最も好ましくはｆｕｓｅｄの活性を調節し、活性化し、抑制する能力を含む
。
ｆｕ）の生物学的及び／又は免疫学的活性を保持するｈＳｕ（ｆｕ）の形態を意
味する。好ましい活性は、例えば、ヘッジホッグシグナル伝達経路を調節する能
力、最も好ましくはｆｕｓｅｄの活性を調節し、活性化し、抑制する能力を含む
。
【００２３】 ここで用いられる「アンタゴニスト」なる用語は、最も広い意味において、こ
こに開示の天然ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドの生物学的活性を阻止、防止、阻害
、中和する任意の分子を含む。同様に、ここで用いられる「アゴニスト」なる用
語は、最も広い意味において、ここに開示の天然ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドの
生物学的活性を模倣するいかなる分子をも含む。特に、適切なアゴニスト又はア
ンタゴニスト分子には、アゴニスト又はアンタゴニスト抗体、天然ｈＳｕ（ｆｕ
）ポリペプチド、ペプチド、小分子有機的分子の断片もしくはアミノ酸配列上の
変異体等が含まれる。 「処置」は、治療的処置及び予防的又は防護的処置の両方を意味し、目的は、
対象である病的な状態、疾患を防ぎ、進行を遅らせる（減少させ）ことである。
治療を必要とする対象には、既に障害を受けているもの並びに障害を予防される
べきものが含まれる。 「慢性的」投与とは、長期的に初期の治療効果（活性）を維持するために、急
性的な機序に対して連続的な薬剤の投与をすることを意味する。「断続的な」投
与とは、中断することなしに連続的にということではなく、むしろ自然なサイク
ルでの治療のことである。 治療の対象となる「哺乳動物」とは、ヒト、イヌ，ウマ，ネコ，ウシのような
家庭及び農場の家畜、動物園の動物、スポーツ用の動物、又はペット動物を含む
、哺乳類として分類されるあらゆる動物を意味する。好ましくは、哺乳動物はヒ
トである。 一又は複数の薬剤とさらに「組み合わせて」の投与とは、同時に（併用して）
そして任意な順序での断続的な投与を含む。
こに開示の天然ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドの生物学的活性を阻止、防止、阻害
、中和する任意の分子を含む。同様に、ここで用いられる「アゴニスト」なる用
語は、最も広い意味において、ここに開示の天然ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドの
生物学的活性を模倣するいかなる分子をも含む。特に、適切なアゴニスト又はア
ンタゴニスト分子には、アゴニスト又はアンタゴニスト抗体、天然ｈＳｕ（ｆｕ
）ポリペプチド、ペプチド、小分子有機的分子の断片もしくはアミノ酸配列上の
変異体等が含まれる。 「処置」は、治療的処置及び予防的又は防護的処置の両方を意味し、目的は、
対象である病的な状態、疾患を防ぎ、進行を遅らせる（減少させ）ことである。
治療を必要とする対象には、既に障害を受けているもの並びに障害を予防される
べきものが含まれる。 「慢性的」投与とは、長期的に初期の治療効果（活性）を維持するために、急
性的な機序に対して連続的な薬剤の投与をすることを意味する。「断続的な」投
与とは、中断することなしに連続的にということではなく、むしろ自然なサイク
ルでの治療のことである。 治療の対象となる「哺乳動物」とは、ヒト、イヌ，ウマ，ネコ，ウシのような
家庭及び農場の家畜、動物園の動物、スポーツ用の動物、又はペット動物を含む
、哺乳類として分類されるあらゆる動物を意味する。好ましくは、哺乳動物はヒ
トである。 一又は複数の薬剤とさらに「組み合わせて」の投与とは、同時に（併用して）
そして任意な順序での断続的な投与を含む。
【００２４】 ＩＩ. 本発明の組成物と方法 分泌性シグナル伝達タンパク質であるヘッジホッグ（ＨＨ）ファミリーのメン
バーは、脊椎動物及び無脊椎動物の初期胚発生期の多数組織のパターン化現象に
おいて重要な役割を果たす（1、2）。ショウジョウバエハッジホッグ（Ｈｈ）シ
グナル伝達は、幼虫の適切な分節化、及び成虫おける成育及び羽及びその他の外
肢形成において必要とされる。哺乳動物ＨＨタンパク質ファミリーには３つのメ
ンバー、ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）、インディアンハッジホッグ（Ｉｈｈ
）、デザートヘッジホッグ（Ｄｈｈ）が含まれる。これら３つのタンパク質は組
織特異的に発現され、多くの発生過程において重要な役割を果たしている：中枢
神経系における腹側細胞の特定化、左右非対称性の制御、体節、肢の生育及びパ
ターン化、軟骨の分化、器官形成、精子形成を含む。多くの脊椎動物ＨＨ経路の
シグナル伝達因子における遺伝子の変異は、ヒトのガン、発達障害と関連性が認
められており（３に総説されている）、従って正常細胞の増殖制御におけるこの
経路の重要な役割が確立されている。 Ｈｈシグナル伝達機構は充分に理解されてはいない。しかしながら、ショウジ
ョウバエにおける遺伝学的研究により、Ｈｈシグナル伝達経路における特異的因
子として役割を果たしている、多くの膜貫通及び細胞内タンパク質が同定されて
きた（3、4、5に総説されている）。この経路はキュビタス インターラプタス
（Ｃｉ）（6,7）、脊椎動物のＧｌｉタンパク質のジンクフィンガー転写因子ホ
モログ（8）の活性化によって最高潮に達する。Ｈｈシグナル伝達機構が保存さ
れているという事実は、アフリカツメガエルもしくはヒトのＧｌｉ（ｈＧｌｉ）
を異所的に発現させたものが、カエル（9）及びマウス（10）の底板特異的マー
カー及と腹側神経細胞の誘導において、Ｓｈｈの機能を模倣し得るといる能力に
より示唆された。サイクリックＡＭＰ依存的プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）は、
ハエ（11,12）及びげっ歯類（13-16）に双方におけるＨＨシグナル伝達に対して
、共通の負の制御効果を発揮する。遺伝学的解析によりＨｈよりも下流のシグナ
ル伝達を阻害するように機能することが明らかとなり（18,19）となった複数膜
透過性膜貫通タンパク質であるショウジョウバエではＰａｔｃｈｅｄに対して脊
椎動物のホモログが同定され（17）、さらに７回膜貫通タンパク質であって、Ｈ
ｈシグナル伝達過程において絶対的に必要とされる（18,21）ショウジョウバエ
のＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄの脊椎動物ホモログも同定された（20）。脊椎動物の系
から得られる生化学的なデータとショウジョウバエにおける遺伝学的分析結果を
合わせると、Ｐａｔｃｈｅｄはリガンド結合因子として、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ
はシグナル伝達因子としてＨＨタンパク質に対する多数サブユニット受容体複合
体中に存在していることが予想される（20,22-24）。以上の結果を総合すると、
進化上保存されているという証拠により、他に同定されたショウジョウバエのシ
グナル伝達経路におけるメンバーが脊椎動物のカウンターパートであるであろう
ことが示唆される。
バーは、脊椎動物及び無脊椎動物の初期胚発生期の多数組織のパターン化現象に
おいて重要な役割を果たす（1、2）。ショウジョウバエハッジホッグ（Ｈｈ）シ
グナル伝達は、幼虫の適切な分節化、及び成虫おける成育及び羽及びその他の外
肢形成において必要とされる。哺乳動物ＨＨタンパク質ファミリーには３つのメ
ンバー、ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）、インディアンハッジホッグ（Ｉｈｈ
）、デザートヘッジホッグ（Ｄｈｈ）が含まれる。これら３つのタンパク質は組
織特異的に発現され、多くの発生過程において重要な役割を果たしている：中枢
神経系における腹側細胞の特定化、左右非対称性の制御、体節、肢の生育及びパ
ターン化、軟骨の分化、器官形成、精子形成を含む。多くの脊椎動物ＨＨ経路の
シグナル伝達因子における遺伝子の変異は、ヒトのガン、発達障害と関連性が認
められており（３に総説されている）、従って正常細胞の増殖制御におけるこの
経路の重要な役割が確立されている。 Ｈｈシグナル伝達機構は充分に理解されてはいない。しかしながら、ショウジ
ョウバエにおける遺伝学的研究により、Ｈｈシグナル伝達経路における特異的因
子として役割を果たしている、多くの膜貫通及び細胞内タンパク質が同定されて
きた（3、4、5に総説されている）。この経路はキュビタス インターラプタス
（Ｃｉ）（6,7）、脊椎動物のＧｌｉタンパク質のジンクフィンガー転写因子ホ
モログ（8）の活性化によって最高潮に達する。Ｈｈシグナル伝達機構が保存さ
れているという事実は、アフリカツメガエルもしくはヒトのＧｌｉ（ｈＧｌｉ）
を異所的に発現させたものが、カエル（9）及びマウス（10）の底板特異的マー
カー及と腹側神経細胞の誘導において、Ｓｈｈの機能を模倣し得るといる能力に
より示唆された。サイクリックＡＭＰ依存的プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）は、
ハエ（11,12）及びげっ歯類（13-16）に双方におけるＨＨシグナル伝達に対して
、共通の負の制御効果を発揮する。遺伝学的解析によりＨｈよりも下流のシグナ
ル伝達を阻害するように機能することが明らかとなり（18,19）となった複数膜
透過性膜貫通タンパク質であるショウジョウバエではＰａｔｃｈｅｄに対して脊
椎動物のホモログが同定され（17）、さらに７回膜貫通タンパク質であって、Ｈ
ｈシグナル伝達過程において絶対的に必要とされる（18,21）ショウジョウバエ
のＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄの脊椎動物ホモログも同定された（20）。脊椎動物の系
から得られる生化学的なデータとショウジョウバエにおける遺伝学的分析結果を
合わせると、Ｐａｔｃｈｅｄはリガンド結合因子として、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ
はシグナル伝達因子としてＨＨタンパク質に対する多数サブユニット受容体複合
体中に存在していることが予想される（20,22-24）。以上の結果を総合すると、
進化上保存されているという証拠により、他に同定されたショウジョウバエのシ
グナル伝達経路におけるメンバーが脊椎動物のカウンターパートであるであろう
ことが示唆される。
【００２５】 ｆｕｓｅｄのショウジョウバエサプレッサー（ｄＳｕ（ｆｕ））は新規細胞質
性ＰＥＳＴタンパク質であり（25）、野生型のバックグラウンドにおいて変異し
た場合、構成的なＨｈシグナルを示唆するような中間的表現型を与える（26）。
さらに、同様の変異は、Ｈｈシグナル伝達において必要とされるセリン-トレオ
ニンキナーゼである幼虫及び成虫のＦｕｓｅｄ（Ｆｕ）（28）における突然変異
の表現型を完全に抑制する（27）。ｄＳｕ（ｆｕ）はＦｕ及びＣｉと物理的に相
互作用し（29）、後者の相互作用はＣｉを細胞質に取り込むことにより、及び/
又は活性化状態に移行することを防ぐことにより（26）、Ｃｉを不活性な状態に
維持していると予想されているものである。Ｈｈシグナル伝達が存在しない場合
、おそらく、ＰＫＡによるリン酸化Ｃｉ（23）をＦボックスタンパク質であるＳ
ｌｉｍｂ（31）によるユビキチン-プロテアソーム経路にターゲットすることを
通じて、アミノ末端の７５ｋＤａの転写抑制形（30）を産生するように、全長の
Ｃｉはタンパク的に切断される。Ｈｈシグナルを受容すると、Ｆｕを活性化し、
ｄＳｕ（ｆｕ）を不活性化することが予想され、さらに下流の諸現象を誘引し、
最終的にはＣｉをＨｈ標的遺伝子に対する転写活性化因子に変換することになる
。
性ＰＥＳＴタンパク質であり（25）、野生型のバックグラウンドにおいて変異し
た場合、構成的なＨｈシグナルを示唆するような中間的表現型を与える（26）。
さらに、同様の変異は、Ｈｈシグナル伝達において必要とされるセリン-トレオ
ニンキナーゼである幼虫及び成虫のＦｕｓｅｄ（Ｆｕ）（28）における突然変異
の表現型を完全に抑制する（27）。ｄＳｕ（ｆｕ）はＦｕ及びＣｉと物理的に相
互作用し（29）、後者の相互作用はＣｉを細胞質に取り込むことにより、及び/
又は活性化状態に移行することを防ぐことにより（26）、Ｃｉを不活性な状態に
維持していると予想されているものである。Ｈｈシグナル伝達が存在しない場合
、おそらく、ＰＫＡによるリン酸化Ｃｉ（23）をＦボックスタンパク質であるＳ
ｌｉｍｂ（31）によるユビキチン-プロテアソーム経路にターゲットすることを
通じて、アミノ末端の７５ｋＤａの転写抑制形（30）を産生するように、全長の
Ｃｉはタンパク的に切断される。Ｈｈシグナルを受容すると、Ｆｕを活性化し、
ｄＳｕ（ｆｕ）を不活性化することが予想され、さらに下流の諸現象を誘引し、
最終的にはＣｉをＨｈ標的遺伝子に対する転写活性化因子に変換することになる
。
【００２６】 ＨＨシグナル伝達におけるＳｕ（ｆｕ）の役割に対する生化学的、機能的な見
識をさらに得るために、このタンパク質ヒトホモログを取得し、発生過程及び成
体における発現パターンが調べられた。さらに、ｈＳｕ（ｆｕ）と脊椎動物のＧ
ｌｉタンパク質ファミリー及び脊椎動物のＳｌｉｍｂホモログ等を含むＨＨ経路
における他のシグナル伝達構成因子との間における物理的な相互作用が解析され
、これら相互作用における機能的意味が確定された。 ショウジョウバエのｆｕｓｅｄ（Ｓｕ（ｆｕ））サプレッサーは、４６８アミ
ノ酸残基で構成される新規細胞質タンパク質であり、遺伝学的な解析によりヘッ
ジホッグのセグメントポラリティー経路における負の制御因子として機能するこ
とが明らかとなっている。ここにおいて、脊椎動物のＳｕ（ｆｕ）−ヒトＳｕ（
ｆｕ）の生化学的及び機能的解析と共に、その一次構造と組織分布について報告
する。ここで明らかにしたように、ヒトＳｕ（ｆｕ）は予想される分子量48ｋＤ
ａの４３３アミノ酸残基で構成されるＰＥＳＴタンパク質で、相当するショウジ
ョウバエのタンパク質と全体で37.7％の同一性（63％の相同性）を有するもので
ある。ラットＳｕ（ｆｕ）に対するメッセンジャーＲＮＡは、神経板、体節、精
巣、腸、皮膚を含む胎児のヘッジホッグ応答組織において広く発現されていた。
成体においては、増殖能が残っていることが知られている精巣及び脳の領域にお
いて強くその発現が残存していた。ヒトＳｕ（ｆｕ）遺伝子座は、染色体10ｑ24
-ｑ25にマップされ、その領域はグリア芽細胞腫、前立腺癌、悪性メラノーマ及
び子宮内膜癌においては欠失している。ヒトＳｕ（ｆｕ）は、脊椎動物において
ヘッジホッグシグナル伝達を媒介するジンクフィンガーモチーフを有する転写活
性化因子Ｇｌｉによる転写活性化を阻害し、物理的にＧｌｉ、Ｇｌｉ２、及びＧ
ｌｉ３と相互作用することが見出された。また、ヒトＳｕ（ｆｕ）は、Ｆボック
スタンパク質であり、ハエにおいてハエＧｌｉホモログの分解をＳｌｉｍｂと促
すことである程度ヘッジホッグ反応を抑制する因子であるＳｌｉｍｂと複合体を
形成している。以上を総合すると、ここに示されたデータは（実施例を参照のこ
と）、Ｓｕ（ｆｕ）が脊椎動物のヘッジホッグシグナル伝達経路における主要な
負の制御因子であるとの仮説に対する生化学的、機能的証拠を提供する。さらに
、本データはＳｕ（ｆｕ）が、ＧｌｉをＳｌｉｍｂ依存的プロテアーソム的分解
経路へ誘導するようなアダプタータンパク質として役に立つことと同様に、Ｇｌ
ｉと結合しＧｌｉ媒介転写活性化を阻害することにより作用しうる事を示す。
識をさらに得るために、このタンパク質ヒトホモログを取得し、発生過程及び成
体における発現パターンが調べられた。さらに、ｈＳｕ（ｆｕ）と脊椎動物のＧ
ｌｉタンパク質ファミリー及び脊椎動物のＳｌｉｍｂホモログ等を含むＨＨ経路
における他のシグナル伝達構成因子との間における物理的な相互作用が解析され
、これら相互作用における機能的意味が確定された。 ショウジョウバエのｆｕｓｅｄ（Ｓｕ（ｆｕ））サプレッサーは、４６８アミ
ノ酸残基で構成される新規細胞質タンパク質であり、遺伝学的な解析によりヘッ
ジホッグのセグメントポラリティー経路における負の制御因子として機能するこ
とが明らかとなっている。ここにおいて、脊椎動物のＳｕ（ｆｕ）−ヒトＳｕ（
ｆｕ）の生化学的及び機能的解析と共に、その一次構造と組織分布について報告
する。ここで明らかにしたように、ヒトＳｕ（ｆｕ）は予想される分子量48ｋＤ
ａの４３３アミノ酸残基で構成されるＰＥＳＴタンパク質で、相当するショウジ
ョウバエのタンパク質と全体で37.7％の同一性（63％の相同性）を有するもので
ある。ラットＳｕ（ｆｕ）に対するメッセンジャーＲＮＡは、神経板、体節、精
巣、腸、皮膚を含む胎児のヘッジホッグ応答組織において広く発現されていた。
成体においては、増殖能が残っていることが知られている精巣及び脳の領域にお
いて強くその発現が残存していた。ヒトＳｕ（ｆｕ）遺伝子座は、染色体10ｑ24
-ｑ25にマップされ、その領域はグリア芽細胞腫、前立腺癌、悪性メラノーマ及
び子宮内膜癌においては欠失している。ヒトＳｕ（ｆｕ）は、脊椎動物において
ヘッジホッグシグナル伝達を媒介するジンクフィンガーモチーフを有する転写活
性化因子Ｇｌｉによる転写活性化を阻害し、物理的にＧｌｉ、Ｇｌｉ２、及びＧ
ｌｉ３と相互作用することが見出された。また、ヒトＳｕ（ｆｕ）は、Ｆボック
スタンパク質であり、ハエにおいてハエＧｌｉホモログの分解をＳｌｉｍｂと促
すことである程度ヘッジホッグ反応を抑制する因子であるＳｌｉｍｂと複合体を
形成している。以上を総合すると、ここに示されたデータは（実施例を参照のこ
と）、Ｓｕ（ｆｕ）が脊椎動物のヘッジホッグシグナル伝達経路における主要な
負の制御因子であるとの仮説に対する生化学的、機能的証拠を提供する。さらに
、本データはＳｕ（ｆｕ）が、ＧｌｉをＳｌｉｍｂ依存的プロテアーソム的分解
経路へ誘導するようなアダプタータンパク質として役に立つことと同様に、Ｇｌ
ｉと結合しＧｌｉ媒介転写活性化を阻害することにより作用しうる事を示す。
【００２７】 ここに開示のものは、以下の実施例において示すように、ｄＳｕ（ｆｕ）に対
して６３％の相同性を示し、発生における発現プロフィールは脊椎動物のＨＨシ
グナル伝達における役割と一致する。ｈＳｕ（ｆｕ）は、ｄＳｕ（ｆｕ）におけ
る保存された潜在的なリン酸化部位を含み、それらの３個所の部位はＰＫＡリン
酸化部位の候補であり、さらにそのＣ末端半分側には低スコアーのＰＥＳＴ領域
を含んでいる。ＰＥＳＴ領域はアスパラギン酸、プロリン、グルタミン酸、セリ
ン、トレオニンに富む短い配列であり、低い疎水性インデックスで混成されてい
る。それらは、細胞内における短い半減期（２時間以内）を有する多くのタンパ
ク質において見出される（４０）。ヒト及びショウジョウバエＳｕ（ｆｕ）タン
パク質において同定されたＰＥＳＴ領域は、最低限のスコアのみ（それぞれ、2.
56及び1.48で、５以上が有意なスコアと考えられる）を受けている；それ故、そ
れらはこのような観点からは機能的に関連し得ない。ＦＩＳＨ解析により、ｈＳ
ｕ（ｆｕ）遺伝子は染色体10ｑ24−25（以下の実施例を参照のこと）にマップさ
れた。興味深いことに、癌抑制遺伝子における２箇所の遺伝子座が10ｑ.２3-ｑ
ｔｅｒ間に存在し、そのことは、グリア芽細胞腫の多形体、前立腺癌、悪性ミエ
ローマ、子宮内膜癌を含む多くの腫瘍におけるヘテロ接合性欠失に基づく（44-4
7）。この観点から、多くのガンにおいて変異が見出されている２つの候補とな
るガン抑制遺伝子も、この領域にマップされるものとして最近記述された：10ｑ
23.3におけるＭＭＡＣ１/ＰＴＥＮ（48、49）及び10ｑ25.3-26.1におけるＤＭＢ
Ｔ１（悪性脳腫瘍において欠損されている）（５０）。ｈＳｕ（ｆｕ）の染色体
上の局在は、ｈＳｕ（ｆｕ）が活発な細胞増殖領域において高度に発現されてお
り、ＨＨシグナル伝達の阻害因子であるという事実と合わせて考えると、Ｐａｔ
ｃｈｅｄのようなｈＳｕ（ｆｕ）は腫瘍のサプレッサーである可能性がかなり高
いという事を示している。
して６３％の相同性を示し、発生における発現プロフィールは脊椎動物のＨＨシ
グナル伝達における役割と一致する。ｈＳｕ（ｆｕ）は、ｄＳｕ（ｆｕ）におけ
る保存された潜在的なリン酸化部位を含み、それらの３個所の部位はＰＫＡリン
酸化部位の候補であり、さらにそのＣ末端半分側には低スコアーのＰＥＳＴ領域
を含んでいる。ＰＥＳＴ領域はアスパラギン酸、プロリン、グルタミン酸、セリ
ン、トレオニンに富む短い配列であり、低い疎水性インデックスで混成されてい
る。それらは、細胞内における短い半減期（２時間以内）を有する多くのタンパ
ク質において見出される（４０）。ヒト及びショウジョウバエＳｕ（ｆｕ）タン
パク質において同定されたＰＥＳＴ領域は、最低限のスコアのみ（それぞれ、2.
56及び1.48で、５以上が有意なスコアと考えられる）を受けている；それ故、そ
れらはこのような観点からは機能的に関連し得ない。ＦＩＳＨ解析により、ｈＳ
ｕ（ｆｕ）遺伝子は染色体10ｑ24−25（以下の実施例を参照のこと）にマップさ
れた。興味深いことに、癌抑制遺伝子における２箇所の遺伝子座が10ｑ.２3-ｑ
ｔｅｒ間に存在し、そのことは、グリア芽細胞腫の多形体、前立腺癌、悪性ミエ
ローマ、子宮内膜癌を含む多くの腫瘍におけるヘテロ接合性欠失に基づく（44-4
7）。この観点から、多くのガンにおいて変異が見出されている２つの候補とな
るガン抑制遺伝子も、この領域にマップされるものとして最近記述された：10ｑ
23.3におけるＭＭＡＣ１/ＰＴＥＮ（48、49）及び10ｑ25.3-26.1におけるＤＭＢ
Ｔ１（悪性脳腫瘍において欠損されている）（５０）。ｈＳｕ（ｆｕ）の染色体
上の局在は、ｈＳｕ（ｆｕ）が活発な細胞増殖領域において高度に発現されてお
り、ＨＨシグナル伝達の阻害因子であるという事実と合わせて考えると、Ｐａｔ
ｃｈｅｄのようなｈＳｕ（ｆｕ）は腫瘍のサプレッサーである可能性がかなり高
いという事を示している。
【００２８】 インサツハイブリダイズ化分析により（以下の実施例を参照のこと）、胎児の
組織において、げっ歯類のＳｕ（ｆｕ）ｍＲＮＡはかなり偏在的に発現しており
、それはラットＳｍｏｏｔｈｅｒｎｅｄのｍＲＮＡを連想させるような発生過程
における発現プロフィールである（20：データは示さず）。Ｓｈｈ応答胎児性神
経褶及び神経管（1、2）、前原体節中胚葉及び体節、胎性前腸、食道及び肺（51
、52）、Ｉｈｈ応答軟骨（53）、及びＤｈｈ応答精巣（41）を含む多くのＨＨ応
答組織は、顕著にＳｕ（ｆｕ）のｍＲＮＡを発現する（Ｆｉｇ．３Ｄを参照のこ
と）。さらに、調査された多くの組織においてＳｕ（ｆｕ）のｍＲＮＡは発生過
程において下方制御される一方で、発現は成体の精巣、及び海馬の錐体、顆粒細
胞、小脳顆粒、プルキンエ細胞、嗅球顆粒細胞、において維持されており、依然
として分裂が活発であり、又はそのような活性を維持している領域はＳｕ（ｆｕ
）の連続した発現を必要とする。成体ラット脳において、Ｓｕ（ｆｕ）の発現は
Ｓｈｈ、Ｓｍｏｏｔｈｅｒｎｅｄ、及びＰａｔｃｈｅｄのｍＲＮＡの小脳プルキ
ンエ細胞における発現と重複していた（Ｆｉｇ．3Ｊ）（Traiffort等, 1998）。
変異体Ｐａｔｃｈｅｄ遺伝子に対するヘテロ接合体が小脳髄様上皮腫において発
達しているという事実により、これらの発見は成体小脳におけるＳｈｈシグナル
伝達の潜在的な役割を示唆する。精巣において、Ｄｈｈは発育中の一次及び二次
精母細胞と非常に近接して存在するセルトリー細胞（41）において発現されてい
る。生殖細胞におけるＳｕ（ｆｕ）のｍＲＮＡの発現は、Ｐａｔｃｈｅｄと相同
性のある第二の脊椎動物ＨＨ結合タンパク質であるＰａｔｃｈｅｄ２のｍＲＮＡ
（55）、及び脊椎動物Ｆｕホモログ（55）のｍＲＮＡの発現と重複していた。さ
らに、Ｇｌｉ及びＧｌｉ３の双方は、発育中の精母細胞において発現されており
（56）；総合すると、このデータはこれらの細胞が機能的なＨＨシグナル伝達系
を保持し、Ｓｕ（ｆｕ）はこの系において不可欠な部分であることを示唆する。
細胞内でＤｈｈレセプターが３つの仮想的細胞内ＨＨシグナル伝達タンパク質と
同一の個所に局在をすることから、セルトリー細胞由来のＤｈｈ（41）がＰａｔ
ｃｈｅｄ２受容体を通した発育中の生殖細胞に直接影響を与えているという仮説
を、さらに支持することになる。Ｓｕ（ｆｕ）は、腸のレイディッグ細胞、成体
の精巣におけるＰａｔｃｈｅｄ遺伝子の発現部位には見出されない（41、55）。
Ｓｈｈ，Ｉｈｈ，及びＤｈｈに応答する組織にＳｕ（ｆｕ）のｍＲＮＡが存在す
るということは、同様な伝達因子及び伝達機構が全ての哺乳動物のＨＨファミリ
ーのメンバーによって利用しうるということを示唆する。
組織において、げっ歯類のＳｕ（ｆｕ）ｍＲＮＡはかなり偏在的に発現しており
、それはラットＳｍｏｏｔｈｅｒｎｅｄのｍＲＮＡを連想させるような発生過程
における発現プロフィールである（20：データは示さず）。Ｓｈｈ応答胎児性神
経褶及び神経管（1、2）、前原体節中胚葉及び体節、胎性前腸、食道及び肺（51
、52）、Ｉｈｈ応答軟骨（53）、及びＤｈｈ応答精巣（41）を含む多くのＨＨ応
答組織は、顕著にＳｕ（ｆｕ）のｍＲＮＡを発現する（Ｆｉｇ．３Ｄを参照のこ
と）。さらに、調査された多くの組織においてＳｕ（ｆｕ）のｍＲＮＡは発生過
程において下方制御される一方で、発現は成体の精巣、及び海馬の錐体、顆粒細
胞、小脳顆粒、プルキンエ細胞、嗅球顆粒細胞、において維持されており、依然
として分裂が活発であり、又はそのような活性を維持している領域はＳｕ（ｆｕ
）の連続した発現を必要とする。成体ラット脳において、Ｓｕ（ｆｕ）の発現は
Ｓｈｈ、Ｓｍｏｏｔｈｅｒｎｅｄ、及びＰａｔｃｈｅｄのｍＲＮＡの小脳プルキ
ンエ細胞における発現と重複していた（Ｆｉｇ．3Ｊ）（Traiffort等, 1998）。
変異体Ｐａｔｃｈｅｄ遺伝子に対するヘテロ接合体が小脳髄様上皮腫において発
達しているという事実により、これらの発見は成体小脳におけるＳｈｈシグナル
伝達の潜在的な役割を示唆する。精巣において、Ｄｈｈは発育中の一次及び二次
精母細胞と非常に近接して存在するセルトリー細胞（41）において発現されてい
る。生殖細胞におけるＳｕ（ｆｕ）のｍＲＮＡの発現は、Ｐａｔｃｈｅｄと相同
性のある第二の脊椎動物ＨＨ結合タンパク質であるＰａｔｃｈｅｄ２のｍＲＮＡ
（55）、及び脊椎動物Ｆｕホモログ（55）のｍＲＮＡの発現と重複していた。さ
らに、Ｇｌｉ及びＧｌｉ３の双方は、発育中の精母細胞において発現されており
（56）；総合すると、このデータはこれらの細胞が機能的なＨＨシグナル伝達系
を保持し、Ｓｕ（ｆｕ）はこの系において不可欠な部分であることを示唆する。
細胞内でＤｈｈレセプターが３つの仮想的細胞内ＨＨシグナル伝達タンパク質と
同一の個所に局在をすることから、セルトリー細胞由来のＤｈｈ（41）がＰａｔ
ｃｈｅｄ２受容体を通した発育中の生殖細胞に直接影響を与えているという仮説
を、さらに支持することになる。Ｓｕ（ｆｕ）は、腸のレイディッグ細胞、成体
の精巣におけるＰａｔｃｈｅｄ遺伝子の発現部位には見出されない（41、55）。
Ｓｈｈ，Ｉｈｈ，及びＤｈｈに応答する組織にＳｕ（ｆｕ）のｍＲＮＡが存在す
るということは、同様な伝達因子及び伝達機構が全ての哺乳動物のＨＨファミリ
ーのメンバーによって利用しうるということを示唆する。
【００２９】 脊椎動物のＨＨシグナル伝達おけるｈＳｕ（ｆｕ）の役割に一致して、培養細
胞における共発現されたｈＳｕ（ｆｕ）とｈＧｌｉ免疫組織的な局在により、２
つのタンパク質がお互いに微小管上に共局在していることが明らかになった（Ｆ
ｉｇ．５Ａ及び、データは示さず）。これらの結果はショウジョウバエＨｈシグ
ナル伝達因子Ｃｉ及びＦｕの細胞内局在と相関し、それらの微小管との相互作用
はキネシン関連タンパク質Ｃｏｓｔａｌ２（57,58）によって仲介されている。
Ｈｈ非存在下において、Ｃｏｓｔａｌ２はシグナル伝達装置（ＦｕはｄＳｕ（ｆ
ｕ）及びＣｉと複合体を形成して）を細胞骨格に繋ぎとめることによりシグナル
伝達を抑制していると考えられる。脊椎動物のＣｏｓｔａｌ２に対するホモログ
は未だに記述されてない。 関連する生化学的実験によると（実施例を参照のこと）、２通りの異なる系に
おいてｈＧｌｉが物理的にｈＳｕ（ｆｕ）と相互作用することが見出された。ま
ず一つに、エピトープタグを付与したｈＳｕ（ｆｕ）に対する抗体もしくはエピ
トープタグを付与したｈＧｌｉを用いることで、ｈＳｕ（ｆｕ）及びｈＧｌｉを
共形質転換させたＮＩＨ-３Ｔ３細胞から共免疫沈降させることができた（Ｆｉ
ｇ．５Ｂ）。二つには、インビトロにおいて翻訳された35Ｓ標識化ｈＧｌｉは、
特異的にＧＳＴ融合ｈＳｕ（ｆｕ）タンパク質とインビトロ結合分析において結
合することが示された（Ｆｉｇ．５Ｃ）。これらのデータはショウジョウバエＣ
ｉとｄＳｕ（ｆｕ）の間の類似の相互作用を証明したMonnierと同僚（29）のも
のを補完する。酵母のＴｗｏハイブリッドシステムを用いることで、セリントレ
オニンキナーゼであるＦｕの制御ドメインであると予想されるカルボキシ末端が
ｄＳｕ（ｆｕ）と直接的に、Ｃｉと間接的に結合し三分子複合体を形成している
（29）ことがわかる。後者の結合はｄＳｕ（ｆｕ）がリンカー分子として機能す
ることに依存している。結果として、Ｆｕの活性化がｄＳｕ（ｆｕ）とＣｉとの
分離の引き金となり、それはおそらくｄＳｕ（ｆｕ）におけるＰＥＳＴ配列のリ
ン酸化その結果として生じるｄＳｕ（ｆｕ）の分解を通じて行われているという
モデルが得られた。内在性のＳｈｈ受容体を発現している形質転換体ＮＩＨ-３
Ｔ３細胞（Marigo等, 1996）からの共免疫沈降することにより、Ｓｈｈの存在下
にてｈＳｕ（ｆｕ）とｈＧｌｉとの相互作用の僅かな減少しかここにおいて見ら
れていない（実施例を参照のこと）。しかしながら、ここにおいて免疫組織化学
的なデータがｈＳｕ（ｆｕ）はｈＧｌｉと核内において共局在し得る（Ｆｉｇ．
５Ａ参照）ことを示しているため、ＧｌｉからＳｕ（ｆｕ）が分離することは、
Ｓｈｈに誘導されるＧｌｉの活性化に対して必要ではないようである。その代わ
りに、シグナル伝達は、Ｓｕ（ｆｕ）の翻訳後修飾（リン酸化）により伝達され
得るのである。
胞における共発現されたｈＳｕ（ｆｕ）とｈＧｌｉ免疫組織的な局在により、２
つのタンパク質がお互いに微小管上に共局在していることが明らかになった（Ｆ
ｉｇ．５Ａ及び、データは示さず）。これらの結果はショウジョウバエＨｈシグ
ナル伝達因子Ｃｉ及びＦｕの細胞内局在と相関し、それらの微小管との相互作用
はキネシン関連タンパク質Ｃｏｓｔａｌ２（57,58）によって仲介されている。
Ｈｈ非存在下において、Ｃｏｓｔａｌ２はシグナル伝達装置（ＦｕはｄＳｕ（ｆ
ｕ）及びＣｉと複合体を形成して）を細胞骨格に繋ぎとめることによりシグナル
伝達を抑制していると考えられる。脊椎動物のＣｏｓｔａｌ２に対するホモログ
は未だに記述されてない。 関連する生化学的実験によると（実施例を参照のこと）、２通りの異なる系に
おいてｈＧｌｉが物理的にｈＳｕ（ｆｕ）と相互作用することが見出された。ま
ず一つに、エピトープタグを付与したｈＳｕ（ｆｕ）に対する抗体もしくはエピ
トープタグを付与したｈＧｌｉを用いることで、ｈＳｕ（ｆｕ）及びｈＧｌｉを
共形質転換させたＮＩＨ-３Ｔ３細胞から共免疫沈降させることができた（Ｆｉ
ｇ．５Ｂ）。二つには、インビトロにおいて翻訳された35Ｓ標識化ｈＧｌｉは、
特異的にＧＳＴ融合ｈＳｕ（ｆｕ）タンパク質とインビトロ結合分析において結
合することが示された（Ｆｉｇ．５Ｃ）。これらのデータはショウジョウバエＣ
ｉとｄＳｕ（ｆｕ）の間の類似の相互作用を証明したMonnierと同僚（29）のも
のを補完する。酵母のＴｗｏハイブリッドシステムを用いることで、セリントレ
オニンキナーゼであるＦｕの制御ドメインであると予想されるカルボキシ末端が
ｄＳｕ（ｆｕ）と直接的に、Ｃｉと間接的に結合し三分子複合体を形成している
（29）ことがわかる。後者の結合はｄＳｕ（ｆｕ）がリンカー分子として機能す
ることに依存している。結果として、Ｆｕの活性化がｄＳｕ（ｆｕ）とＣｉとの
分離の引き金となり、それはおそらくｄＳｕ（ｆｕ）におけるＰＥＳＴ配列のリ
ン酸化その結果として生じるｄＳｕ（ｆｕ）の分解を通じて行われているという
モデルが得られた。内在性のＳｈｈ受容体を発現している形質転換体ＮＩＨ-３
Ｔ３細胞（Marigo等, 1996）からの共免疫沈降することにより、Ｓｈｈの存在下
にてｈＳｕ（ｆｕ）とｈＧｌｉとの相互作用の僅かな減少しかここにおいて見ら
れていない（実施例を参照のこと）。しかしながら、ここにおいて免疫組織化学
的なデータがｈＳｕ（ｆｕ）はｈＧｌｉと核内において共局在し得る（Ｆｉｇ．
５Ａ参照）ことを示しているため、ＧｌｉからＳｕ（ｆｕ）が分離することは、
Ｓｈｈに誘導されるＧｌｉの活性化に対して必要ではないようである。その代わ
りに、シグナル伝達は、Ｓｕ（ｆｕ）の翻訳後修飾（リン酸化）により伝達され
得るのである。
【００３０】 ジンクフィンガー転写因子であるＧｌｉのさらなる２つのメンバーのＧｌｉ２
及びＧｌｉ３がｈＳｕ（ｆｕ）と相互作用する能力は、ここにおいて決定された
（実施例参照のこと）。３つのＧｌｉタンパク質は、それらの異なる発現パター
ン（59）、及びＧｌｉ２、Ｇｌｉ３変異体マウスの観察された表現型（60-63）
により証拠づけられるように、Ｈｈ媒介の発育過程において、特異的及び重複的
な機能を補足的に発揮しているようにみえる。ｍＧｌｉ２及びｈＧｌｉ３はＧＳ
Ｔ-ｈＳｕ（ｆｕ）タンパク質と我々のインヴィトロにおける結合解析において
特異的に結合していることが分かった（Ｆｉｇ．５Ｃ）。従って、我々のデータ
はＧｌｉタンパク質ファミリーの全てのメンバーの活性制御における、ｈＳｕ（
ｆｕ）の役割を支持する。 これまでの遺伝学的な研究により、ｄＳｕ（ｆｕ）とＣｉの相互作用がＣｉの
活性型の転写活性因子を阻害するように機能することができ（26,29）、その阻
害はＨｈシグナルを受容することにより解除されると考えられる。ここにおいて
、ｈＳｕ（ｆｕ）がＧｌｉの転写活性化レポーターアッセイにおいてｈＧｌｉ活
性を阻害し得るかどうか、結論づけられた（24）。ｈＧｌｉがレポーターの発現
を１００倍近く活性化することができ、この誘導はｈＳｕ（ｆｕ）によって劇的
に抑制されることが見出された（実施例及びＦｉｇ．５Ｄ参照）。逆に言うと、
共発現されたｈＧｌｉ非存在下において、ｈＳｕ（ｆｕ）はレポターの発現の増
加を誘発することも見出された。これらの結果は、Ｇｌｉ活性化の負の内在性制
御因子（例えば、Ｓｌｉｍｂ，Ｃｏｓｔａｌ２もしくはＰＫＡ）を希釈するよう
な過発現されたｈＳｕ（ｆｕ）の能力を示す。この解釈は、細胞の応答を決定す
る際に、Ｈｈシグナル伝達カスケードにおいてＣｉとｄＳｕ（ｆｕ）の間のスト
イキオメトリカルな比率の重要性を示すショウジョウバエの遺伝学的研究（26）
に由来する証拠によって支持される。
及びＧｌｉ３がｈＳｕ（ｆｕ）と相互作用する能力は、ここにおいて決定された
（実施例参照のこと）。３つのＧｌｉタンパク質は、それらの異なる発現パター
ン（59）、及びＧｌｉ２、Ｇｌｉ３変異体マウスの観察された表現型（60-63）
により証拠づけられるように、Ｈｈ媒介の発育過程において、特異的及び重複的
な機能を補足的に発揮しているようにみえる。ｍＧｌｉ２及びｈＧｌｉ３はＧＳ
Ｔ-ｈＳｕ（ｆｕ）タンパク質と我々のインヴィトロにおける結合解析において
特異的に結合していることが分かった（Ｆｉｇ．５Ｃ）。従って、我々のデータ
はＧｌｉタンパク質ファミリーの全てのメンバーの活性制御における、ｈＳｕ（
ｆｕ）の役割を支持する。 これまでの遺伝学的な研究により、ｄＳｕ（ｆｕ）とＣｉの相互作用がＣｉの
活性型の転写活性因子を阻害するように機能することができ（26,29）、その阻
害はＨｈシグナルを受容することにより解除されると考えられる。ここにおいて
、ｈＳｕ（ｆｕ）がＧｌｉの転写活性化レポーターアッセイにおいてｈＧｌｉ活
性を阻害し得るかどうか、結論づけられた（24）。ｈＧｌｉがレポーターの発現
を１００倍近く活性化することができ、この誘導はｈＳｕ（ｆｕ）によって劇的
に抑制されることが見出された（実施例及びＦｉｇ．５Ｄ参照）。逆に言うと、
共発現されたｈＧｌｉ非存在下において、ｈＳｕ（ｆｕ）はレポターの発現の増
加を誘発することも見出された。これらの結果は、Ｇｌｉ活性化の負の内在性制
御因子（例えば、Ｓｌｉｍｂ，Ｃｏｓｔａｌ２もしくはＰＫＡ）を希釈するよう
な過発現されたｈＳｕ（ｆｕ）の能力を示す。この解釈は、細胞の応答を決定す
る際に、Ｈｈシグナル伝達カスケードにおいてＣｉとｄＳｕ（ｆｕ）の間のスト
イキオメトリカルな比率の重要性を示すショウジョウバエの遺伝学的研究（26）
に由来する証拠によって支持される。
【００３１】 Ｇｌｉファミリーメンバーに加えて、ｈＳｕ（ｆｕ）はそれ自身及びＳｌｉｍ
ｂの脊椎動物のホモログと結合することが見出された（Ｆｉｇ．５Ｃ）。前者の
相互作用は、酵母２ハイブリッドスクリーンにおいて独立に同定されたもので、
そのスクリーニングに用いたヒト精巣のライブラリーに由来するｈＳｕ（ｆｕ）
はベイトとして用いた全長のｈＳｕ（ｆｕ）タンパク質の結合相手として単離さ
れた（データは示さず）。関連する共免疫沈降実験において、ｍＳｌｉｎｂはｈ
Ｇｌｉとの物理的な複合体中にも見出される事が分かった。この相互作用は間接
的であり、リンカータンパク質としての内在性のｈＳｕ（ｆｕ）を利用している
。ＨＩＶ-１タンパク質であるＶｐｕはβＴｒＣｐと関連していることが示され
、明らかにヒトＳｌｉｍｂの選択特異的スプライシング型（33）、及び同様な方
法によるＣＤ４である（34）。ｈＳｕ（ｆｕ）の二量体化により、Ｓｕ（ｆｕ）
Ｇｌｉ活性を制御する異なるエフェクタータンパク質を引き合わせる事を可能な
らしめ、一方、Ｓｌｉｍｂとの結合は、Ｓｕ（ｆｕ）たＧｌｉの分解を制御する
ことを可能にしている。 Ｓｌｉｍｂは、Ｆボックス及び幾つかのＷＤ４０リピートドメイン（64-66）
を含み、それぞれユビキチン結合Ｅ２タンパク質分解複合体の構成因子に対する
結合領域、（34,65）及びタンパク質-タンパク質相互作用領域として（64）機能
している。ショウジョウバエでは、Ｓｌｉｍｂの欠失が、細胞におけるインタク
トなＣｉの自己蓄積（26,31）、活性なＨｈシグナルの示唆的な効果を誘導する
。さらに、ショウジョウバエのＴＧＦβホモログであるdecepentaplegic（ｄｐ
ｐ）及びＷｎｔファミリーメンバーであるwingless（ｗｇ）、これらは二つのＨ
ｈ応答遺伝子であるが、そのような変異体の前-後軸において異所的に発現され
ている（31,33）。データを総合すると、Ｓｌｉｍｂは通常Ｃｉ/Ｇｌｉを分解を
促進することにより、リガンドの非存在下、Ｈｈシグナルを抑えるように機能す
ることができることが示される。我々の知見は、ｈＳｕ（ｆｕ）及び/又はｈＧ
ｌｉの細胞内活性を制御することに脊椎動物のＳｌｉｍｂが潜在的に関与してい
ることに一致する。しかしながら、これに関連してＳｌｉｍｂの正確な役割にお
いて明確にすべきことが残されている。Ｃｉとは異なり、Ｇｌｉの活性化/抑制
化機能の制御においてタンパク質分解に対する役割は報告されていなかった。Yo
on及び共同実験者は（67）、Ｇｌｉが転写抑制因子に変換するような条件を見出
すことができなかった。本発明者は、培養細胞において過発現されたｈＧｌｉの
異なるカルボキシ末端欠失切断産物を見出したが、これらの切断産物がＳｈｈに
よって制御されていること示すことができなかった。にもかかわらず、Ｓｌｉｍ
ｂ/Ｇｌｉ/Ｓｕ（ｆｕ）の相互作用が、ある程度Ｇｌｉ及びＳｕ（ｆｕ）の定常
状態レベルを維持し、直接的にＨＨシグナル伝達には関与していない可能性もあ
る。
ｂの脊椎動物のホモログと結合することが見出された（Ｆｉｇ．５Ｃ）。前者の
相互作用は、酵母２ハイブリッドスクリーンにおいて独立に同定されたもので、
そのスクリーニングに用いたヒト精巣のライブラリーに由来するｈＳｕ（ｆｕ）
はベイトとして用いた全長のｈＳｕ（ｆｕ）タンパク質の結合相手として単離さ
れた（データは示さず）。関連する共免疫沈降実験において、ｍＳｌｉｎｂはｈ
Ｇｌｉとの物理的な複合体中にも見出される事が分かった。この相互作用は間接
的であり、リンカータンパク質としての内在性のｈＳｕ（ｆｕ）を利用している
。ＨＩＶ-１タンパク質であるＶｐｕはβＴｒＣｐと関連していることが示され
、明らかにヒトＳｌｉｍｂの選択特異的スプライシング型（33）、及び同様な方
法によるＣＤ４である（34）。ｈＳｕ（ｆｕ）の二量体化により、Ｓｕ（ｆｕ）
Ｇｌｉ活性を制御する異なるエフェクタータンパク質を引き合わせる事を可能な
らしめ、一方、Ｓｌｉｍｂとの結合は、Ｓｕ（ｆｕ）たＧｌｉの分解を制御する
ことを可能にしている。 Ｓｌｉｍｂは、Ｆボックス及び幾つかのＷＤ４０リピートドメイン（64-66）
を含み、それぞれユビキチン結合Ｅ２タンパク質分解複合体の構成因子に対する
結合領域、（34,65）及びタンパク質-タンパク質相互作用領域として（64）機能
している。ショウジョウバエでは、Ｓｌｉｍｂの欠失が、細胞におけるインタク
トなＣｉの自己蓄積（26,31）、活性なＨｈシグナルの示唆的な効果を誘導する
。さらに、ショウジョウバエのＴＧＦβホモログであるdecepentaplegic（ｄｐ
ｐ）及びＷｎｔファミリーメンバーであるwingless（ｗｇ）、これらは二つのＨ
ｈ応答遺伝子であるが、そのような変異体の前-後軸において異所的に発現され
ている（31,33）。データを総合すると、Ｓｌｉｍｂは通常Ｃｉ/Ｇｌｉを分解を
促進することにより、リガンドの非存在下、Ｈｈシグナルを抑えるように機能す
ることができることが示される。我々の知見は、ｈＳｕ（ｆｕ）及び/又はｈＧ
ｌｉの細胞内活性を制御することに脊椎動物のＳｌｉｍｂが潜在的に関与してい
ることに一致する。しかしながら、これに関連してＳｌｉｍｂの正確な役割にお
いて明確にすべきことが残されている。Ｃｉとは異なり、Ｇｌｉの活性化/抑制
化機能の制御においてタンパク質分解に対する役割は報告されていなかった。Yo
on及び共同実験者は（67）、Ｇｌｉが転写抑制因子に変換するような条件を見出
すことができなかった。本発明者は、培養細胞において過発現されたｈＧｌｉの
異なるカルボキシ末端欠失切断産物を見出したが、これらの切断産物がＳｈｈに
よって制御されていること示すことができなかった。にもかかわらず、Ｓｌｉｍ
ｂ/Ｇｌｉ/Ｓｕ（ｆｕ）の相互作用が、ある程度Ｇｌｉ及びＳｕ（ｆｕ）の定常
状態レベルを維持し、直接的にＨＨシグナル伝達には関与していない可能性もあ
る。
【００３２】 要するに、ここに示されるｈＳｕ（ｆｕ）とＧｌｉファミリーメンバーとの生
化学的相互作用は、Ｇｌｉ活性アッセイから得られる結果と共に、ショウジョウ
バエにおける遺伝学的研究を補完し、Ｓｕ（ｆｕ）はGliの直接的な負の制御因
子であることを示すものである。これらの研究は、HHファミリーメンバーに対す
る細胞内応答を決定するにあたり、様々なシグナル伝達因子の相対的な細胞内濃
度の重要性をさらに強調するものである。これらの結果および腫瘍サプレッサー
遺伝子座として知られている染色体上へｈＳｕ（ｆｕ）が局在していという観点
から、ｈＳｕ（ｆｕ）における突然変異が発ガン過程において重要な役割を担っ
ている可能性がある。ここでの発見は、Ｈｈシグナル伝達構成因子及び機構の保
存性（いくつかの顕著な相違はあるものの）をショウジョウバエからヒトへと拡
張するものである。
化学的相互作用は、Ｇｌｉ活性アッセイから得られる結果と共に、ショウジョウ
バエにおける遺伝学的研究を補完し、Ｓｕ（ｆｕ）はGliの直接的な負の制御因
子であることを示すものである。これらの研究は、HHファミリーメンバーに対す
る細胞内応答を決定するにあたり、様々なシグナル伝達因子の相対的な細胞内濃
度の重要性をさらに強調するものである。これらの結果および腫瘍サプレッサー
遺伝子座として知られている染色体上へｈＳｕ（ｆｕ）が局在していという観点
から、ｈＳｕ（ｆｕ）における突然変異が発ガン過程において重要な役割を担っ
ている可能性がある。ここでの発見は、Ｈｈシグナル伝達構成因子及び機構の保
存性（いくつかの顕著な相違はあるものの）をショウジョウバエからヒトへと拡
張するものである。
【００３３】 Ａ．全長ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチド 本発明は、本出願においてｈＳｕ（ｆｕ）（ＵＮＱ650）と称されるポリペプ
チドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下
に示す実施例においてされに詳細に開示するように、ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチ
ドをコードするｃＤＮＡが同定され、単離された。異なる発現ラウンドで生成さ
れたタンパク質は異なるＰＲＯ番号が与えられるが、ＵＮＱ番号は任意の与えら
れたＤＮＡ及びコードされたタンパク質に独特であり変化しない。しかしながら
、単純化のために、本明細書では、DNA３３４５５−１５４８によりコードされ
るタンパク質並びに前述のｈＳｕ（ｆｕ）定義に含まれる更なる天然相同体及び
変異体は、それらの起源又は調製方法に関わらず「ｈＳｕ（ｆｕ）」と呼ばれる
。 ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、ヒ
トｈＳｕ（ｆｕ）の全長配列（Ｆｉｇ２に示す（配列番号：２））の一部がショ
ウジョウバエ メラノガスターのｆｕｓｅｄタンパク質のサプレッサーに対する
ヒトホモログ（S５５６９５）の一部と３９％のアミノ酸配列同一性を有するこ
とが見出された。従って、現在では、本出願で開示されるヒトｈＳｕ（ｆｕ）が
ヘッジホッグシグナル伝達カスケードの新たに同定されたメンバーであり、ショ
ウジョウバエｆｕｓｅｄタンパク質のサプレッサーポリペプチドの典型的な活性
を有することができると考えられている。
チドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下
に示す実施例においてされに詳細に開示するように、ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチ
ドをコードするｃＤＮＡが同定され、単離された。異なる発現ラウンドで生成さ
れたタンパク質は異なるＰＲＯ番号が与えられるが、ＵＮＱ番号は任意の与えら
れたＤＮＡ及びコードされたタンパク質に独特であり変化しない。しかしながら
、単純化のために、本明細書では、DNA３３４５５−１５４８によりコードされ
るタンパク質並びに前述のｈＳｕ（ｆｕ）定義に含まれる更なる天然相同体及び
変異体は、それらの起源又は調製方法に関わらず「ｈＳｕ（ｆｕ）」と呼ばれる
。 ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、ヒ
トｈＳｕ（ｆｕ）の全長配列（Ｆｉｇ２に示す（配列番号：２））の一部がショ
ウジョウバエ メラノガスターのｆｕｓｅｄタンパク質のサプレッサーに対する
ヒトホモログ（S５５６９５）の一部と３９％のアミノ酸配列同一性を有するこ
とが見出された。従って、現在では、本出願で開示されるヒトｈＳｕ（ｆｕ）が
ヘッジホッグシグナル伝達カスケードの新たに同定されたメンバーであり、ショ
ウジョウバエｆｕｓｅｄタンパク質のサプレッサーポリペプチドの典型的な活性
を有することができると考えられている。
【００３４】 Ｂ．ｈＳｕ（ｆｕ）変異体 ここに記載した全長天然配列ｈＳｕ（ｆｕ）に加えて、ｈＳｕ（ｆｕ）変異体
も調製できると考えられる。ｈＳｕ（ｆｕ）変異体は、公知のｈＳｕ（ｆｕ）Ｄ
ＮＡに適当なヌクレオチド変化を導入することにより、及び/又は所望のｈＳｕ
（ｆｕ）ポリペプチドを合成することにより調製できる。当業者は、適切なアミ
ノ酸変化が、グリコシル化部位の番号を変えたりもしくは膜固着特性を変更する
ようなｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドの翻訳後プロセスを変えうることを理解する
であろう。 天然全長配列ｈＳｕ（ｆｕ）又はここに記載したｈＳｕ（ｆｕ）の種々のドメ
インにおける変異は、例えば、米国特許第5,364,934号に記載されている保存的
及び非保存的変異についての任意の技術及び指針を用いてなすことができる。変
異は、結果として天然配列ｈＳｕ（ｆｕ）と比較してｈＳｕ（ｆｕ）のアミノ酸
配列が変化するｈＳｕ（ｆｕ）をコードする一又は複数のコドンの置換、欠失又
は挿入であってよい。場合によっては、変異は少なくとも１つのアミノ酸のｈＳ
ｕ（ｆｕ）一又は複数のドメインの任意の他のアミノ酸による置換である。いず
れのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失さ
れるかの指針は、ｈＳｕ（ｆｕ）の配列を相同性の知られたタンパク質分子の配
列と比較し、相同性の高い領域内でなされるアミノ酸配列変化を最小にすること
によって見出される。アミノ酸置換は、一のアミノ酸を類似した構造及び／又は
化学特性を持つ他のアミノ酸で置換した結果、例えばロイシンのセリンでの置換
、即ち保存的アミノ酸置換とすることができる。挿入及び欠失は、場合によって
は１から５のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列に
おいてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、全長配列又は成熟天然
配列により示される活性に対して、得られる変異体を試験することにより決定さ
れる。
も調製できると考えられる。ｈＳｕ（ｆｕ）変異体は、公知のｈＳｕ（ｆｕ）Ｄ
ＮＡに適当なヌクレオチド変化を導入することにより、及び/又は所望のｈＳｕ
（ｆｕ）ポリペプチドを合成することにより調製できる。当業者は、適切なアミ
ノ酸変化が、グリコシル化部位の番号を変えたりもしくは膜固着特性を変更する
ようなｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドの翻訳後プロセスを変えうることを理解する
であろう。 天然全長配列ｈＳｕ（ｆｕ）又はここに記載したｈＳｕ（ｆｕ）の種々のドメ
インにおける変異は、例えば、米国特許第5,364,934号に記載されている保存的
及び非保存的変異についての任意の技術及び指針を用いてなすことができる。変
異は、結果として天然配列ｈＳｕ（ｆｕ）と比較してｈＳｕ（ｆｕ）のアミノ酸
配列が変化するｈＳｕ（ｆｕ）をコードする一又は複数のコドンの置換、欠失又
は挿入であってよい。場合によっては、変異は少なくとも１つのアミノ酸のｈＳ
ｕ（ｆｕ）一又は複数のドメインの任意の他のアミノ酸による置換である。いず
れのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失さ
れるかの指針は、ｈＳｕ（ｆｕ）の配列を相同性の知られたタンパク質分子の配
列と比較し、相同性の高い領域内でなされるアミノ酸配列変化を最小にすること
によって見出される。アミノ酸置換は、一のアミノ酸を類似した構造及び／又は
化学特性を持つ他のアミノ酸で置換した結果、例えばロイシンのセリンでの置換
、即ち保存的アミノ酸置換とすることができる。挿入及び欠失は、場合によって
は１から５のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列に
おいてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、全長配列又は成熟天然
配列により示される活性に対して、得られる変異体を試験することにより決定さ
れる。
【００３５】 変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキ
ャンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発等のこの分野で周知の技術を用いてなすこ
とができる。部位特異的突然変異誘発［Carter等, Nucl. Acids Res., 13: 4331
(1986); Zoller等, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)］、カセット突然変異
誘発［Wells等, Gene, 34: 315 (1985)］、制限的選択突然変異誘発［Wells等,
Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)］又は他のこの分野で
知られた技術をクローニングしたＤＮＡに実施して、ｈＳｕ（ｆｕ）変異体ＤＮ
Ａを作成することもできる。 また、隣接配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニング
アミノ酸分析を用いることができる。中でも好ましいスキャンニングアミノ酸は
、比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グ
リシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖
を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好まし
いスキャンニングアミノ酸である［Cunningham及びWells, Science, 244: 1081-1085 (1989)］。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸
であるため典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両
方に見られることが多い［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.
Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)］。アラニン置換が十分な量の変
異体を生じない場合は、アイソテリック(isoteric)アミノ酸を用いることができ
る。
ャンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発等のこの分野で周知の技術を用いてなすこ
とができる。部位特異的突然変異誘発［Carter等, Nucl. Acids Res., 13: 4331
(1986); Zoller等, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)］、カセット突然変異
誘発［Wells等, Gene, 34: 315 (1985)］、制限的選択突然変異誘発［Wells等,
Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)］又は他のこの分野で
知られた技術をクローニングしたＤＮＡに実施して、ｈＳｕ（ｆｕ）変異体ＤＮ
Ａを作成することもできる。 また、隣接配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニング
アミノ酸分析を用いることができる。中でも好ましいスキャンニングアミノ酸は
、比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グ
リシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖
を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好まし
いスキャンニングアミノ酸である［Cunningham及びWells, Science, 244: 1081-1085 (1989)］。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸
であるため典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両
方に見られることが多い［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.
Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)］。アラニン置換が十分な量の変
異体を生じない場合は、アイソテリック(isoteric)アミノ酸を用いることができ
る。
【００３６】 Ｃ．ｈＳｕ（ｆｕ）の修飾 ｈＳｕ（ｆｕ）の共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修
飾の一型は、ｈＳｕ（ｆｕ）の標的とするアミノ酸残基を、ｈＳｕ（ｆｕ）の選
択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させる
ことである。二官能性試薬での誘導体化が、例えばｈＳｕ（ｆｕ）を水不溶性支
持体マトリクスあるいは抗ｈＳｕ（ｆｕ）抗体の精製方法又はその逆で用いるた
めの表面に架橋させるのに有用である。通常用いられる架橋剤は、例えば、１，
１-ビス（ジアゾアセチル）-２-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒド
ロキシスクシンイミドエステル、例えば４-アジドサリチル酸、３，３’-ジチオ
ビス（スクシンイミジルプロピオネート）等のジスクシンイミジルエステルを含
むホモ二官能性イミドエステル、ビス-Ｎ-マレイミド-１，８-オクタン等の二官
能性マレイミド、及びメチル-３-[(ｐ-アジドフェニル)-ジチオ]プロピオイミダ
ート等の試薬を含む。 他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル
及びアスパルチルへの脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリ
ル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及び
ヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Structur
e and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp.79-86
(1983)]、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミ
ド化を含む。 本発明の範囲内に含まれるｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドの共有結合的修飾の他
の型は、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンを変更することを含む。「天
然グリコシル化パターンの変更」とは、ＨＳＵ（ＦＵ）に見出される１つ又は複
数の炭水化物部分の欠失（存在するグリコシル化部位の除去又は化学的及び／又
は酵素的手段によるグリコシル化の削除による）、及び／又はｈＳｕ（ｆｕ）に
存在しない１つ又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。さらに、この語
句は、存在する種々の炭水化物部分の性質及び比率の変化を含む、天然タンパク
質のグリコシル化の定性的変化を含む。
飾の一型は、ｈＳｕ（ｆｕ）の標的とするアミノ酸残基を、ｈＳｕ（ｆｕ）の選
択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させる
ことである。二官能性試薬での誘導体化が、例えばｈＳｕ（ｆｕ）を水不溶性支
持体マトリクスあるいは抗ｈＳｕ（ｆｕ）抗体の精製方法又はその逆で用いるた
めの表面に架橋させるのに有用である。通常用いられる架橋剤は、例えば、１，
１-ビス（ジアゾアセチル）-２-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒド
ロキシスクシンイミドエステル、例えば４-アジドサリチル酸、３，３’-ジチオ
ビス（スクシンイミジルプロピオネート）等のジスクシンイミジルエステルを含
むホモ二官能性イミドエステル、ビス-Ｎ-マレイミド-１，８-オクタン等の二官
能性マレイミド、及びメチル-３-[(ｐ-アジドフェニル)-ジチオ]プロピオイミダ
ート等の試薬を含む。 他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル
及びアスパルチルへの脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリ
ル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及び
ヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Structur
e and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp.79-86
(1983)]、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミ
ド化を含む。 本発明の範囲内に含まれるｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドの共有結合的修飾の他
の型は、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンを変更することを含む。「天
然グリコシル化パターンの変更」とは、ＨＳＵ（ＦＵ）に見出される１つ又は複
数の炭水化物部分の欠失（存在するグリコシル化部位の除去又は化学的及び／又
は酵素的手段によるグリコシル化の削除による）、及び／又はｈＳｕ（ｆｕ）に
存在しない１つ又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。さらに、この語
句は、存在する種々の炭水化物部分の性質及び比率の変化を含む、天然タンパク
質のグリコシル化の定性的変化を含む。
【００３７】 ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドへのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列の
変更によって達成されうる。この変更は、例えば、ｈＳｕ（ｆｕ）への一又は複
数のセリン又はスレオニン残基の付加、又はこれによる置換によってもなされる
(Ｏ-結合グリコシル化部位の場合)。場合によっては、ｈＳｕ（ｆｕ）アミノ酸
配列はＤＮＡレベルでの変化によって、特に所望のアミノ酸に翻訳されるコドン
が産生されるように予め選んだ塩基でｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドをコードして
いるＤＮＡを突然変異させることによって変更される。 ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチド上の炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、
ポリペプチドへのグリコシドの化学的又は酵素的結合による。これらの方法は19
87年9月11日公開の国際特許出願第WO 87/05330号及びAplin及びWriston, CRC Cr
it. Rev. Biochem., pp259-306 (1981)に記載されている。 ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は
酵素的あるいはグリコシル化の標的となるアミノ酸残基をコードするコドンの突
然変異的置換によりなされる。例えば、化学的脱グリコシル化技術は、この分野
で知られており、例えば、Hakimuddin等, Arch. Biochem Biophys., 259:52 (19
87)及びEdge等, Anal. Biochem., 118:131 (1981)により記載されている。ポリ
ペプチド上の炭水化物部分の酵素的開裂は、Thotakura等, Meth. Enzymol., 138
:350 (1987)に記載されているように種々のエンド-及びエキソ-グリコシダーゼ
を使用して達成することができる。
変更によって達成されうる。この変更は、例えば、ｈＳｕ（ｆｕ）への一又は複
数のセリン又はスレオニン残基の付加、又はこれによる置換によってもなされる
(Ｏ-結合グリコシル化部位の場合)。場合によっては、ｈＳｕ（ｆｕ）アミノ酸
配列はＤＮＡレベルでの変化によって、特に所望のアミノ酸に翻訳されるコドン
が産生されるように予め選んだ塩基でｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドをコードして
いるＤＮＡを突然変異させることによって変更される。 ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチド上の炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、
ポリペプチドへのグリコシドの化学的又は酵素的結合による。これらの方法は19
87年9月11日公開の国際特許出願第WO 87/05330号及びAplin及びWriston, CRC Cr
it. Rev. Biochem., pp259-306 (1981)に記載されている。 ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は
酵素的あるいはグリコシル化の標的となるアミノ酸残基をコードするコドンの突
然変異的置換によりなされる。例えば、化学的脱グリコシル化技術は、この分野
で知られており、例えば、Hakimuddin等, Arch. Biochem Biophys., 259:52 (19
87)及びEdge等, Anal. Biochem., 118:131 (1981)により記載されている。ポリ
ペプチド上の炭水化物部分の酵素的開裂は、Thotakura等, Meth. Enzymol., 138
:350 (1987)に記載されているように種々のエンド-及びエキソ-グリコシダーゼ
を使用して達成することができる。
【００３８】 ｈＳｕ（ｆｕ）の共有結合的修飾の他の型は、ｈＳｕ（ｆｕ）ポリぺプチドの
、種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、
ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの一つへの、米国特許第
4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号
又は第4,179,337号に記載された方法での結合を含む。 また、本発明のｈＳｕ（ｆｕ）は、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に
融合したｈＳｕ（ｆｕ）を含むキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。
、種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、
ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの一つへの、米国特許第
4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号
又は第4,179,337号に記載された方法での結合を含む。 また、本発明のｈＳｕ（ｆｕ）は、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に
融合したｈＳｕ（ｆｕ）を含むキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。
【００３９】 一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗-タグ抗体が選択的に結合でき
るエピトープを提供するタグポリペプチドとｈＳｕ（ｆｕ）との融合を含む。エ
ピトープタグは、一般的にはｈＳｕ（ｆｕ）のアミノ-又はカルボキシル-末端に
位置する。このようなｈＳｕ（ｆｕ）のエピトープタグ形態の存在は、タグポリ
ペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの
提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを
用いたアフィニティ精製によってｈＳｕ（ｆｕ）を容易に精製できるようにする
。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている
。例としては、ポリ-ヒスチジン（poly-his）又はポリ-ヒスチジン-グリシン（p
oly-his-gly）タグ；flu HAタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Field等
, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；c-mycタグ及びそれに対する８Ｆ
９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Evan等, Molecular and
Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)］；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパ
ク質Ｄ（gD）タグ及びその抗体［Paborsky等, Protein Engineering, 3(6):547-
553 (1990)］を含む。他のタグポリペプチドは、Flag-ペプチド［Hopp等, BioTe
chnology, 6:1204-1210 (1988)］；ＫＴ３エピトープペプチド［Martin等, Scie
nce, 255:192-194 (1992)］；α-チューブリンエピトープペプチド［Skinner等,
J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)］；及びＴ７遺伝子１０タンパク質
ペプチドタグ［Lutz-Freyermuth等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-639
7 (1990)］を含む。 これに換わる実施態様では、キメラ分子はｈＳｕ（ｆｕ）の免疫グロブリン又
は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含んでもよい。キメラ分子の二価形態
（「イムノアドヘシン」とも呼ばれる）については、そのような融合体はＩｇＧ
分子のＦｃ領域であり得る。Ｉｇ融合体は、好ましくはＩｇ分子内の少なくとも
１つの可変領域に換えてｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドの可溶化（膜貫通ドメイン
欠失又は不活性化）形態を含む。特に好ましい実施態様では、免疫グロブリン融
合体は、ＩｇＧ分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２
及びＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の製造については、1995年6月27
日発行の米国特許第5,428,130号を参照のこと。
るエピトープを提供するタグポリペプチドとｈＳｕ（ｆｕ）との融合を含む。エ
ピトープタグは、一般的にはｈＳｕ（ｆｕ）のアミノ-又はカルボキシル-末端に
位置する。このようなｈＳｕ（ｆｕ）のエピトープタグ形態の存在は、タグポリ
ペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの
提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを
用いたアフィニティ精製によってｈＳｕ（ｆｕ）を容易に精製できるようにする
。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている
。例としては、ポリ-ヒスチジン（poly-his）又はポリ-ヒスチジン-グリシン（p
oly-his-gly）タグ；flu HAタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Field等
, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；c-mycタグ及びそれに対する８Ｆ
９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Evan等, Molecular and
Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)］；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパ
ク質Ｄ（gD）タグ及びその抗体［Paborsky等, Protein Engineering, 3(6):547-
553 (1990)］を含む。他のタグポリペプチドは、Flag-ペプチド［Hopp等, BioTe
chnology, 6:1204-1210 (1988)］；ＫＴ３エピトープペプチド［Martin等, Scie
nce, 255:192-194 (1992)］；α-チューブリンエピトープペプチド［Skinner等,
J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)］；及びＴ７遺伝子１０タンパク質
ペプチドタグ［Lutz-Freyermuth等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-639
7 (1990)］を含む。 これに換わる実施態様では、キメラ分子はｈＳｕ（ｆｕ）の免疫グロブリン又
は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含んでもよい。キメラ分子の二価形態
（「イムノアドヘシン」とも呼ばれる）については、そのような融合体はＩｇＧ
分子のＦｃ領域であり得る。Ｉｇ融合体は、好ましくはＩｇ分子内の少なくとも
１つの可変領域に換えてｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドの可溶化（膜貫通ドメイン
欠失又は不活性化）形態を含む。特に好ましい実施態様では、免疫グロブリン融
合体は、ＩｇＧ分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２
及びＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の製造については、1995年6月27
日発行の米国特許第5,428,130号を参照のこと。
【００４０】 Ｄ．ｈＳｕ（ｆｕ）の調製 以下の説明は、主として、ｈＳｕ（ｆｕ）核酸を含むベクターで形質転換又は
形質移入された細胞を培養することにより特定のｈＳｕ（ｆｕ）を生産する方法
に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてｈＳ
ｕ（ｆｕ）を調製することはできると考えられる。例えば、ｈＳｕ（ｆｕ）配列
、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生産してもよい
［例えば、Stewart等, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., Sa
n Francisco, CA (1969)；Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (196
3)参照］。手動技術又は自動によるインビトロタンパク質合成を行ってもよい。
自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機（Foster
City, CA）を用いて、製造者の指示により実施してもよい。ｈＳｕ（ｆｕ）の
種々の部分を、別々に化学的に合成し、化学的又は酵素的方法を用いて結合させ
て全長ｈＳｕ（ｆｕ）を生産してもよい。
形質移入された細胞を培養することにより特定のｈＳｕ（ｆｕ）を生産する方法
に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてｈＳ
ｕ（ｆｕ）を調製することはできると考えられる。例えば、ｈＳｕ（ｆｕ）配列
、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生産してもよい
［例えば、Stewart等, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., Sa
n Francisco, CA (1969)；Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (196
3)参照］。手動技術又は自動によるインビトロタンパク質合成を行ってもよい。
自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機（Foster
City, CA）を用いて、製造者の指示により実施してもよい。ｈＳｕ（ｆｕ）の
種々の部分を、別々に化学的に合成し、化学的又は酵素的方法を用いて結合させ
て全長ｈＳｕ（ｆｕ）を生産してもよい。
【００４１】 １．ｈＳｕ（ｆｕ）をコードするＤＮＡの単離 ｈＳｕ（ｆｕ）をコードするＤＮＡは、ｈＳｕ（ｆｕ）ｍＲＮＡを保有してい
てそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡ
ライブラリから得ることができる。従って、ヒトｈＳｕ（ｆｕ）ＤＮＡは、実施
例に記載されるように、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから簡便
に得ることができる。またｈＳｕ（ｆｕ）コード化遺伝子は、ゲノムライブラリ
から又はオリゴヌクレオチド合成により得ることもできる。 ライブラリは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタン
パク質を同定するために設計されたｈＳｕ（ｆｕ）に対する抗体又は少なくとも
約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド等の)プローブによってスクリーニング
できる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリのスクリーニ
ングは、例えばSambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New Yor
k: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されている標準的な手
順を使用して実施することができる。ｈＳｕ（ｆｕ）をコードする遺伝子を単離
する他の方法はＰＣＲ法を使用するものである［Sambrook等,上掲；Dieffenbach
等, PCR Primer：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1995)］。
てそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡ
ライブラリから得ることができる。従って、ヒトｈＳｕ（ｆｕ）ＤＮＡは、実施
例に記載されるように、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから簡便
に得ることができる。またｈＳｕ（ｆｕ）コード化遺伝子は、ゲノムライブラリ
から又はオリゴヌクレオチド合成により得ることもできる。 ライブラリは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタン
パク質を同定するために設計されたｈＳｕ（ｆｕ）に対する抗体又は少なくとも
約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド等の)プローブによってスクリーニング
できる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリのスクリーニ
ングは、例えばSambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New Yor
k: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されている標準的な手
順を使用して実施することができる。ｈＳｕ（ｆｕ）をコードする遺伝子を単離
する他の方法はＰＣＲ法を使用するものである［Sambrook等,上掲；Dieffenbach
等, PCR Primer：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1995)］。
【００４２】 下記の実施例は、ｃＤＮＡライブラリのスクリーニング技術を記載している。
プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽性が
最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スク
リーニングされるライブラリ内のＤＮＡとのハイブリッド形成時に検出可能であ
るように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く
知られており、３２Ｐ標識されたＡＴＰのような放射線標識、ビオチン化あるい
は酵素標識の使用が含まれる。中程度の緊縮性及び高度の緊縮性を含むハイブリ
ッド形成条件は、上掲のSambrook等に与えられている。 このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、GenBan
k等の公共データベース又は個人の配列データベースに寄託され公衆に利用可能
とされている周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の一
定の領域内又は全長に渡っての（アミノ酸又は核酸レベルのいずれかでの）配列
同一性は、相同性測定のための種々のアルゴリズムを用いるＡＬＩＧＮ、ＤＮＡ
ｓｔａｒ、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２及びＩＮＨＥＲＩＴ等のコンピュータソ
フトウェアプログラムを用いた配列アラインメントを通して決定することができ
る。 タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ
酸配列を使用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されなかったｍＲＮＡの生
成中間体及び前駆体を検出する上掲のSambrook等に記述されているような従来の
プライマー伸展法を使用することにより得られる。
プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽性が
最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スク
リーニングされるライブラリ内のＤＮＡとのハイブリッド形成時に検出可能であ
るように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く
知られており、３２Ｐ標識されたＡＴＰのような放射線標識、ビオチン化あるい
は酵素標識の使用が含まれる。中程度の緊縮性及び高度の緊縮性を含むハイブリ
ッド形成条件は、上掲のSambrook等に与えられている。 このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、GenBan
k等の公共データベース又は個人の配列データベースに寄託され公衆に利用可能
とされている周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の一
定の領域内又は全長に渡っての（アミノ酸又は核酸レベルのいずれかでの）配列
同一性は、相同性測定のための種々のアルゴリズムを用いるＡＬＩＧＮ、ＤＮＡ
ｓｔａｒ、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２及びＩＮＨＥＲＩＴ等のコンピュータソ
フトウェアプログラムを用いた配列アラインメントを通して決定することができ
る。 タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ
酸配列を使用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されなかったｍＲＮＡの生
成中間体及び前駆体を検出する上掲のSambrook等に記述されているような従来の
プライマー伸展法を使用することにより得られる。
【００４３】 ２．宿主細胞の選択及び形質転換 宿主細胞を、ここに記載したｈＳｕ（ｆｕ）生成のための発現又はクローニン
グベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選
択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された常
套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等々は、過度の実
験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大
にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechno
logy: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及びSambrook等,
上掲に見出すことができる。 形質移入の方法、例えば、ＣａＰＯ４及びエレクトロポレーションは当業者に
知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な
方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等に記載された塩化カルシウ
ムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、原核生物又は実質的
な細胞壁障壁を含む他の細胞に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメ
ファシエンスによる感染が、Shaw等, Gene, 23:315 (1983)及び1989年6月29日公
開のWO 89/05859に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用い
られる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan de
r Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法が好ましい。哺
乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第4,399,216号に記載さ
れている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van Solingen等, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞
中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレ
ーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン
等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を
形質転換するための種々の技術については、Keown等, Methods in Enzymology,
185:527-537 (1990)及び Mansour等, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと
。
グベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選
択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された常
套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等々は、過度の実
験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大
にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechno
logy: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及びSambrook等,
上掲に見出すことができる。 形質移入の方法、例えば、ＣａＰＯ４及びエレクトロポレーションは当業者に
知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な
方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等に記載された塩化カルシウ
ムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、原核生物又は実質的
な細胞壁障壁を含む他の細胞に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメ
ファシエンスによる感染が、Shaw等, Gene, 23:315 (1983)及び1989年6月29日公
開のWO 89/05859に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用い
られる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan de
r Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法が好ましい。哺
乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第4,399,216号に記載さ
れている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van Solingen等, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞
中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレ
ーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン
等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を
形質転換するための種々の技術については、Keown等, Methods in Enzymology,
185:527-537 (1990)及び Mansour等, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと
。
【００４４】 ここに記載のベクターにおいてＤＮＡをクローン化あるいは発現するために適
切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。適切な原核
生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性
生物体、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公衆に利用
可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ATCC31,446）；大腸菌Ｘ１７
７６（ATCC31,537）；大腸菌株Ｗ３１１０（ATCC27,325）及びＫ５７７２（ATCC
53,635）である。 原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ｈＳｕ（ｆｕ）
をコードするベクターのための適切なクローン化又は発現宿主である。サッカロ
ミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。 ｈＳｕ（ｆｕ）の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊
椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエＳ２及びスポドスペラＳｆ９等の昆
虫細胞並びに植物細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、チャイ
ニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）及びＣＯＳ細胞を含む。より詳細な例は、ＳＶ
４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (COS-7, ATCC CRL 1651);ヒト胚
腎臓株（293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Grah
am等, J. Gen Virol., 36:59 (1977)）;チャイニーズハムスター卵巣細胞／-Ｄ
ＨＦＲ(CHO, Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)
)；マウスのセルトリ細胞（TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）
；ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL 75)；ヒト肝細胞 (Hep G2, HB 8065)；及びマウ
ス乳房腫瘍細胞 (MMT 060562, ATTC CCL51)を含む。適切な宿主細胞の選択は、
この分野の技術常識内にある。
切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。適切な原核
生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性
生物体、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公衆に利用
可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ATCC31,446）；大腸菌Ｘ１７
７６（ATCC31,537）；大腸菌株Ｗ３１１０（ATCC27,325）及びＫ５７７２（ATCC
53,635）である。 原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ｈＳｕ（ｆｕ）
をコードするベクターのための適切なクローン化又は発現宿主である。サッカロ
ミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。 ｈＳｕ（ｆｕ）の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊
椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエＳ２及びスポドスペラＳｆ９等の昆
虫細胞並びに植物細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、チャイ
ニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）及びＣＯＳ細胞を含む。より詳細な例は、ＳＶ
４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (COS-7, ATCC CRL 1651);ヒト胚
腎臓株（293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Grah
am等, J. Gen Virol., 36:59 (1977)）;チャイニーズハムスター卵巣細胞／-Ｄ
ＨＦＲ(CHO, Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)
)；マウスのセルトリ細胞（TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）
；ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL 75)；ヒト肝細胞 (Hep G2, HB 8065)；及びマウ
ス乳房腫瘍細胞 (MMT 060562, ATTC CCL51)を含む。適切な宿主細胞の選択は、
この分野の技術常識内にある。
【００４５】 ３．複製可能なベクターの選択及び使用 ｈＳｕ（ｆｕ）をコードする核酸(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、ク
ローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される
。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、
コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸
配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野
で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクタ
ー成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、一又は複数のシ
グナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメン
ト、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の一又は複数を含む
適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用
いる。 ｈＳｕ（ｆｕ）は直接組換え的に生産されるだけではなく、シグナル配列あ
るいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する
他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産され
る。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるｈ
Ｓｕ（ｆｕ）-コード化ＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリ
ホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定なエンテロトキシンII
リーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に
関しては、シグナル配列は、例えば酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子
リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α
因子リーダーを含み、後者は米国特許第5,010,182号に記載されている)、又は酸
ホスフォターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(1990年4
月4日発行のEP 362,179)、又は1990年11月15日に公開された国際特許出願第WO 9
0/13646号に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現において
は、同一あるいは関連する種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列、ウイルス
分泌リーダーのような他の哺乳動物のシグナル配列をタンパク質の直接分泌に使
用してもよい。
ローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される
。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、
コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸
配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野
で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクタ
ー成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、一又は複数のシ
グナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメン
ト、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の一又は複数を含む
適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用
いる。 ｈＳｕ（ｆｕ）は直接組換え的に生産されるだけではなく、シグナル配列あ
るいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する
他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産され
る。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるｈ
Ｓｕ（ｆｕ）-コード化ＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリ
ホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定なエンテロトキシンII
リーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に
関しては、シグナル配列は、例えば酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子
リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α
因子リーダーを含み、後者は米国特許第5,010,182号に記載されている)、又は酸
ホスフォターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(1990年4
月4日発行のEP 362,179)、又は1990年11月15日に公開された国際特許出願第WO 9
0/13646号に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現において
は、同一あるいは関連する種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列、ウイルス
分泌リーダーのような他の哺乳動物のシグナル配列をタンパク質の直接分泌に使
用してもよい。
【００４６】 発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞におい
てベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、
酵母菌及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来
する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２：プラスミド開始点
は酵母菌に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノ
ウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに
有用である。
てベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、
酵母菌及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来
する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２：プラスミド開始点
は酵母菌に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノ
ウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに
有用である。
【００４７】 発現及びクローニングベクターは、典型的には、選択マーカーとも称される選
択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メ
トトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に
耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)例えばバシリに対する遺伝子コ
ードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を
供給するタンパク質をコードする。 哺乳動物細胞に適切な選択マーカーの他の例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキ
ナーゼのように、ｈＳｕ（ｆｕ）核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定す
ることのできるものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、
Urlaub 等により, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されて
いるようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞で
ある。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母菌プラスミドＹＲｐ７に存在
するｔｒｐ１遺伝子である［Stinchcomb等, Nature, 282：39(1979)；Kingman等
, Gene, 7：141(1979)；Tschemper等, Gene, 10：157(1980)］。ｔｒｐ１遺伝子
は、例えば、ＡＴＣＣ第４４０７６号あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトフ
ァン内で成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供す
る［Jones, Genetics, 85:12 (1977)］。
択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メ
トトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に
耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)例えばバシリに対する遺伝子コ
ードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を
供給するタンパク質をコードする。 哺乳動物細胞に適切な選択マーカーの他の例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキ
ナーゼのように、ｈＳｕ（ｆｕ）核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定す
ることのできるものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、
Urlaub 等により, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されて
いるようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞で
ある。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母菌プラスミドＹＲｐ７に存在
するｔｒｐ１遺伝子である［Stinchcomb等, Nature, 282：39(1979)；Kingman等
, Gene, 7：141(1979)；Tschemper等, Gene, 10：157(1980)］。ｔｒｐ１遺伝子
は、例えば、ＡＴＣＣ第４４０７６号あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトフ
ァン内で成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供す
る［Jones, Genetics, 85:12 (1977)］。
【００４８】 発現及びクローニングベクターは、通常、ｈＳｕ（ｆｕ）核酸配列に作用可能
に結合し、ｍＲＮＡ合成を制御するプロモーターを含む。種々の可能な宿主細胞
により認識される好適なプロモーターが知られている。原核生物宿主での使用に
好適なプロモーターは -ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Chang等
, Nature, 275:615 (1978)； Goeddel等, Nature, 281:544 (1979)］、アルカリ
ホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系［Goeddel, Nucleic Acid
s Res., 8:4057 (1980); EP 36,776］、及びハイブリッドプロモーター、例えば
ｔａｃプロモーター［deBoer 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (198
3)］を含む。細菌系で使用するプロモータもまたｈＳｕ（ｆｕ）をコードするＤ
ＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列を有する。 酵母菌宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグ
リセラートキナーゼ［Hitzeman 等, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)］又は他
の糖分解酵素［Hess 等, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Bioch
emistry, 17：4900(1978)］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン
酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホ
フルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレー
トムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコ
ースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
に結合し、ｍＲＮＡ合成を制御するプロモーターを含む。種々の可能な宿主細胞
により認識される好適なプロモーターが知られている。原核生物宿主での使用に
好適なプロモーターは -ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Chang等
, Nature, 275:615 (1978)； Goeddel等, Nature, 281:544 (1979)］、アルカリ
ホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系［Goeddel, Nucleic Acid
s Res., 8:4057 (1980); EP 36,776］、及びハイブリッドプロモーター、例えば
ｔａｃプロモーター［deBoer 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (198
3)］を含む。細菌系で使用するプロモータもまたｈＳｕ（ｆｕ）をコードするＤ
ＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列を有する。 酵母菌宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグ
リセラートキナーゼ［Hitzeman 等, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)］又は他
の糖分解酵素［Hess 等, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Bioch
emistry, 17：4900(1978)］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン
酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホ
フルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレー
トムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコ
ースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
【００４９】 他の酵母菌プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的
効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソ
チトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオ
ネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及び
ガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現
に好適に用いられるベクターとプロモータはEP 73,657に更に記載されている。 哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのｈＳｕ（ｆｕ）転写は、例えば、
ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(1989年7月5日公開のUK 2,211,504)
、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウ
ィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウ
ィルス４０(SV40)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性
哺乳動物から得られるプロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロ
ブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによっ
て、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソ
チトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオ
ネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及び
ガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現
に好適に用いられるベクターとプロモータはEP 73,657に更に記載されている。 哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのｈＳｕ（ｆｕ）転写は、例えば、
ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(1989年7月5日公開のUK 2,211,504)
、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウ
ィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウ
ィルス４０(SV40)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性
哺乳動物から得られるプロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロ
ブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによっ
て、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
【００５０】 より高等の真核生物によるｈＳｕ（ｆｕ）をコードしているＤＮＡの転写は、
ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハン
サーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を
増強するＤＮＡのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサ
ー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプ
ロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来
のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４
０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモータ
ーエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィル
スエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、ｈＳｕ（ｆｕ）コード化配列の５
’又は３’位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモータ
ーから５’位に位置している。 また真核生物宿主細胞(酵母菌、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多
細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮ
Ａの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤ
ＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５’、時には３’の非翻訳領域から取得できる。これ
らの領域は、ｈＳｕ（ｆｕ）をコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデ
ニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。 組換え脊椎動物細胞培養でのｈＳｕ（ｆｕ）の合成に適応化するのに適切なさ
らに他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 293:620-625 (19
81); Mantei等, Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060; 及びEP 117,058に記
載されている。
ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハン
サーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を
増強するＤＮＡのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサ
ー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプ
ロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来
のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４
０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモータ
ーエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィル
スエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、ｈＳｕ（ｆｕ）コード化配列の５
’又は３’位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモータ
ーから５’位に位置している。 また真核生物宿主細胞(酵母菌、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多
細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮ
Ａの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤ
ＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５’、時には３’の非翻訳領域から取得できる。これ
らの領域は、ｈＳｕ（ｆｕ）をコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデ
ニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。 組換え脊椎動物細胞培養でのｈＳｕ（ｆｕ）の合成に適応化するのに適切なさ
らに他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 293:620-625 (19
81); Mantei等, Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060; 及びEP 117,058に記
載されている。
【００５１】 ４．遺伝子増幅／発現の検出 遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識
されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写
を定量化するノーザンブロット法［Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:52
01-5205 (1980)］、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリッ
ド形成法によって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、ＤＮＡ
二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タン
パク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもで
きる。ついで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は
表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合
した抗体の存在を検出することができる。 あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な
方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のア
ッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又
はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意
の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列ｈＳｕ（ｆｕ
）ポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成
ペプチドに対して、又はｈＳｕ（ｆｕ）ＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープを
コードする外因性配列に対して調製され得る。
されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写
を定量化するノーザンブロット法［Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:52
01-5205 (1980)］、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリッ
ド形成法によって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、ＤＮＡ
二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タン
パク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもで
きる。ついで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は
表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合
した抗体の存在を検出することができる。 あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な
方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のア
ッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又
はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意
の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列ｈＳｕ（ｆｕ
）ポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成
ペプチドに対して、又はｈＳｕ（ｆｕ）ＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープを
コードする外因性配列に対して調製され得る。
【００５２】 ５．ポリペプチドの精製 ｈＳｕ（ｆｕ）の形態は、培地又は宿主細胞の溶解液から回収することができ
る。膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-X100)又は酵素的切
断を用いて膜から引き離すことができる。ｈＳｕ（ｆｕ）の発現に用いられる細
胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々
の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。 ｈＳｕ（ｆｕ）を、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製することが
望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち、イ
オン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン
交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング
；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用
いるゲル濾過;ＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラム；
及びｈＳｕ（ｆｕ）のエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムで
ある。この分野で知られ、例えば、Deutcher, Methodes in Enzymology, 182 (1
990)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Ve
rlag, New York (1982)に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることが
できる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生産方法及び特に生産される
ｈＳｕ（ｆｕ）の性質に依存する。
る。膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-X100)又は酵素的切
断を用いて膜から引き離すことができる。ｈＳｕ（ｆｕ）の発現に用いられる細
胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々
の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。 ｈＳｕ（ｆｕ）を、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製することが
望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち、イ
オン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン
交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング
；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用
いるゲル濾過;ＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラム；
及びｈＳｕ（ｆｕ）のエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムで
ある。この分野で知られ、例えば、Deutcher, Methodes in Enzymology, 182 (1
990)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Ve
rlag, New York (1982)に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることが
できる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生産方法及び特に生産される
ｈＳｕ（ｆｕ）の性質に依存する。
【００５３】 Ｅ．ｈＳｕ（ｆｕ）の用途 ｈＳｕ（ｆｕ）をコードする核酸配列（又はそれらの補体）は、ハイブリッド
形成プローブとしての使用を含む分子生物学の分野において、染色体及び遺伝子
マッピングにおいて、及びアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡの生成において種々の
用途を有している。また、ｈＳｕ（ｆｕ）核酸は、ここに記載される組み換え技
術によるｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドの調製にも有用であろう。 全長天然配列ｈＳｕ（ｆｕ）遺伝子（配列番号：１）、又はその一部は、全長
遺伝子の単離又はＦｉｇ１（配列番号：１）に開示されたｈＳｕ（ｆｕ）配列に
対して所望の配列同一性を持つ更に他の遺伝子（例えば、ｈＳｕ（ｆｕ）の天然
発生変異体又は他の種からのｈＳｕ（ｆｕ）をコードするもの）の単離のための
ｃＤＮＡライブラリ用のハイブリッド形成プローブとして使用できる。場合によ
っては、プローブの長さは約２０〜約５０塩基である。ハイブリッド形成プロー
ブは、配列番号：１の核酸配列から、又は天然配列ｈＳｕ（ｆｕ）のプロモータ
ー、エンハンサー成分及びイントロンを含むゲノム配列から誘導され得る。例え
ば、スクリーニング法は、ｈＳｕ（ｆｕ）遺伝子のコード化領域を周知のＤＮＡ
配列を用いて単離して約４０塩基の選択されたプローブを合成することを含む。
ハイブリッド形成プローブは、３２Ｐ又は３５Ｓ等の放射性ヌクレオチド、又は
アビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合したアルカリホスファターゼ
等の酵素標識を含む種々の標識で標識されうる。本発明のｈＳｕ（ｆｕ）遺伝子
に相補的な配列を有する標識されたプローブは、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又
はｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、それらのライブラリーの何れの
メンバーがプローブにハイブッド形成するかを決定するのに使用できる。ハイブ
リッド形成技術は、以下の実施例において更に詳細に記載する。 また、プローブは、ＰＣＲ技術に用いて、密接に関連したｈＳｕ（ｆｕ）配列
の同定のための配列のプールを作成することができる。
形成プローブとしての使用を含む分子生物学の分野において、染色体及び遺伝子
マッピングにおいて、及びアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡの生成において種々の
用途を有している。また、ｈＳｕ（ｆｕ）核酸は、ここに記載される組み換え技
術によるｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドの調製にも有用であろう。 全長天然配列ｈＳｕ（ｆｕ）遺伝子（配列番号：１）、又はその一部は、全長
遺伝子の単離又はＦｉｇ１（配列番号：１）に開示されたｈＳｕ（ｆｕ）配列に
対して所望の配列同一性を持つ更に他の遺伝子（例えば、ｈＳｕ（ｆｕ）の天然
発生変異体又は他の種からのｈＳｕ（ｆｕ）をコードするもの）の単離のための
ｃＤＮＡライブラリ用のハイブリッド形成プローブとして使用できる。場合によ
っては、プローブの長さは約２０〜約５０塩基である。ハイブリッド形成プロー
ブは、配列番号：１の核酸配列から、又は天然配列ｈＳｕ（ｆｕ）のプロモータ
ー、エンハンサー成分及びイントロンを含むゲノム配列から誘導され得る。例え
ば、スクリーニング法は、ｈＳｕ（ｆｕ）遺伝子のコード化領域を周知のＤＮＡ
配列を用いて単離して約４０塩基の選択されたプローブを合成することを含む。
ハイブリッド形成プローブは、３２Ｐ又は３５Ｓ等の放射性ヌクレオチド、又は
アビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合したアルカリホスファターゼ
等の酵素標識を含む種々の標識で標識されうる。本発明のｈＳｕ（ｆｕ）遺伝子
に相補的な配列を有する標識されたプローブは、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又
はｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、それらのライブラリーの何れの
メンバーがプローブにハイブッド形成するかを決定するのに使用できる。ハイブ
リッド形成技術は、以下の実施例において更に詳細に記載する。 また、プローブは、ＰＣＲ技術に用いて、密接に関連したｈＳｕ（ｆｕ）配列
の同定のための配列のプールを作成することができる。
【００５４】 また、ｈＳｕ（ｆｕ）をコードする核酸配列は、そのｈＳｕ（ｆｕ）をコード
する遺伝子のマッピングのため、及び遺伝子疾患を持つ個体の遺伝子分析のため
のハイブリッド形成プローブの作成にも用いることができる。ここに提供される
核酸配列は、インサイツハイブリッド形成、既知の染色体マーカーに対する結合
分析、及びライブラリーでのハイブリッド形成スクリーニング等の周知の技術を
用いて、染色体及び染色体の特定領域にマッピングすることができる。 本発明は、Ｈｈ関連腫瘍、好ましくはｈＳｕ（ｆｕ）に関連するものを検出す
るために使用することができる。異常なＨＨシグナル伝達を伴うことが疑われる
腫瘍を持つ患者からのＤＮＡについて、ｈＳｕ（ｆｕ）遺伝子中の発癌性突然変
異の有無を分析する。散発性腫瘍の遺伝的特徴付けには、一般に、簡便には細胞
診試料を用いた腫瘍細胞ＤＮＡ又はＲＮＡの分析が必要となる。ここに提示した
正常な配列と比較して、核酸について、発癌性突然変異の有無をスクリーニング
する。Ｈｈシグナル伝達の変化を伴う散発性腫瘍には、基底細胞癌、メラノーマ
、扁平上皮癌、乳癌、移行膀胱細胞癌、髄膜腫、心臓及び卵巣の線維腫、肺、大
腸、卵巣、腎臓及び食道癌、及び多の腸の癌が含まれる。 ここに教示するものを含み、ゲノムＤＮＡ配列を分析するための多くの方法が
利用できる。多量のＤＮＡが利用できる場合にはゲノムＤＮＡを直接用いる。あ
るいは、対象領域を適当なベクター中にクローニングし、分析のために十分な量
になるように増殖させ、あるいはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような一般
的な方法により増幅させることができる。異常なｈＳｕ（ｆｕ）タンパク質の有
無についての腫瘍細胞の分析は、以下に検討するイムノアッセイにより実施する
ことができる。
する遺伝子のマッピングのため、及び遺伝子疾患を持つ個体の遺伝子分析のため
のハイブリッド形成プローブの作成にも用いることができる。ここに提供される
核酸配列は、インサイツハイブリッド形成、既知の染色体マーカーに対する結合
分析、及びライブラリーでのハイブリッド形成スクリーニング等の周知の技術を
用いて、染色体及び染色体の特定領域にマッピングすることができる。 本発明は、Ｈｈ関連腫瘍、好ましくはｈＳｕ（ｆｕ）に関連するものを検出す
るために使用することができる。異常なＨＨシグナル伝達を伴うことが疑われる
腫瘍を持つ患者からのＤＮＡについて、ｈＳｕ（ｆｕ）遺伝子中の発癌性突然変
異の有無を分析する。散発性腫瘍の遺伝的特徴付けには、一般に、簡便には細胞
診試料を用いた腫瘍細胞ＤＮＡ又はＲＮＡの分析が必要となる。ここに提示した
正常な配列と比較して、核酸について、発癌性突然変異の有無をスクリーニング
する。Ｈｈシグナル伝達の変化を伴う散発性腫瘍には、基底細胞癌、メラノーマ
、扁平上皮癌、乳癌、移行膀胱細胞癌、髄膜腫、心臓及び卵巣の線維腫、肺、大
腸、卵巣、腎臓及び食道癌、及び多の腸の癌が含まれる。 ここに教示するものを含み、ゲノムＤＮＡ配列を分析するための多くの方法が
利用できる。多量のＤＮＡが利用できる場合にはゲノムＤＮＡを直接用いる。あ
るいは、対象領域を適当なベクター中にクローニングし、分析のために十分な量
になるように増殖させ、あるいはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような一般
的な方法により増幅させることができる。異常なｈＳｕ（ｆｕ）タンパク質の有
無についての腫瘍細胞の分析は、以下に検討するイムノアッセイにより実施する
ことができる。
【００５５】 ｈＳｕ（ｆｕ）のコード配列が他のタンパク質に結合するタンパク質をコード
するときは（例、ｈＳｕ（ｆｕ）がレセプターである場合）、ｈＳｕ（ｆｕ）は
結合相互作用に関与する他のタンパク質又は分子を同定するアッセイにおいて使
用することができる。このような方法により、レセプター／リガンド結合相互作
用のインヒビターを同定することができる。このような結合相互作用に関与する
タンパク質はまた結合相互作用のペプチドもしくは小分子インヒビター又はアゴ
ニストをスクリーニングするために使用することもできる。また、レセプターｈ
Ｓｕ（ｆｕ）は相関するリガンド（類）を単離するために使用することができる
。スクリーニングアッセイは、ｈＳｕ（ｆｕ）のレセプター又は天然ｈＳｕ（ｆ
ｕ）の生物活性を模倣するリード化合物を見出すように構築することができる。
このようなスクリーニングアッセイには、化学ライブラリの高性能スクリーニン
グに受け入れられるアッセイが含まれ、小分子薬物候補を同定するためにこれを
特に適したものにする。考えられる小分子には、合成の有機もしくは無機化合物
が含まれる。アッセイは、当該分野において十分に特徴付けられているタンパク
質間結合アッセイ、生化学スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ及び細胞ベ
ースアッセイを含む様々な形態で実施することができる。
するときは（例、ｈＳｕ（ｆｕ）がレセプターである場合）、ｈＳｕ（ｆｕ）は
結合相互作用に関与する他のタンパク質又は分子を同定するアッセイにおいて使
用することができる。このような方法により、レセプター／リガンド結合相互作
用のインヒビターを同定することができる。このような結合相互作用に関与する
タンパク質はまた結合相互作用のペプチドもしくは小分子インヒビター又はアゴ
ニストをスクリーニングするために使用することもできる。また、レセプターｈ
Ｓｕ（ｆｕ）は相関するリガンド（類）を単離するために使用することができる
。スクリーニングアッセイは、ｈＳｕ（ｆｕ）のレセプター又は天然ｈＳｕ（ｆ
ｕ）の生物活性を模倣するリード化合物を見出すように構築することができる。
このようなスクリーニングアッセイには、化学ライブラリの高性能スクリーニン
グに受け入れられるアッセイが含まれ、小分子薬物候補を同定するためにこれを
特に適したものにする。考えられる小分子には、合成の有機もしくは無機化合物
が含まれる。アッセイは、当該分野において十分に特徴付けられているタンパク
質間結合アッセイ、生化学スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ及び細胞ベ
ースアッセイを含む様々な形態で実施することができる。
【００５６】 ｈＳｕ（ｆｕ）又はその修飾形態をコードする核酸は、トランスジェニック動
物又は「ノックアウト」動物を産生するのに用いることができ、該動物は順に治
療的に有用な試薬の開発とスクリーニングに有用である。トランスジェニック動
物（例えば、マウス又はラット）は、出生前、例えば胚段階で、その動物又はそ
の動物の祖先に導入された導入遺伝子を含む細胞を有する動物である。導入遺伝
子とは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれたＤＮＡ
である。一実施態様では、ｈＳｕ（ｆｕ）をコードするｃＤＮＡを、確立された
技術によりｈＳｕ（ｆｕ）をコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使
用することができ、ゲノム配列を、ｈＳｕ（ｆｕ）をコードするＤＮＡを発現す
る細胞を含むトランスジェニック動物を産生するために使用することができる。
特にマウス又はラット等のトランスジェニック動物を産生する方法は当該分野に
おいて常套的になっており、例えば米国特許第4,736,866号や第4,870,009号に記
述されている。典型的には、特定の細胞を組織特異的エンハンサーでのｈＳｕ（
ｆｕ）導入遺伝子の導入の標的にする。胚段階で動物の生殖系列に導入されたｈ
Ｓｕ（ｆｕ）をコードする導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物は
、ｈＳｕ（ｆｕ）をコードするＤＮＡの増大した発現の影響を調べるために使用
できる。このような動物は、例えばその過剰発現を伴う病理的状態に対して保護
をもたらすと思われる試薬のテスター動物として使用できる。発明のこの側面に
おいては、動物を試薬で処理し、導入遺伝子を有する未処理の動物に比べ病状の
発病率が低ければ、疾患に対する治療的処置の可能性が示される。
物又は「ノックアウト」動物を産生するのに用いることができ、該動物は順に治
療的に有用な試薬の開発とスクリーニングに有用である。トランスジェニック動
物（例えば、マウス又はラット）は、出生前、例えば胚段階で、その動物又はそ
の動物の祖先に導入された導入遺伝子を含む細胞を有する動物である。導入遺伝
子とは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれたＤＮＡ
である。一実施態様では、ｈＳｕ（ｆｕ）をコードするｃＤＮＡを、確立された
技術によりｈＳｕ（ｆｕ）をコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使
用することができ、ゲノム配列を、ｈＳｕ（ｆｕ）をコードするＤＮＡを発現す
る細胞を含むトランスジェニック動物を産生するために使用することができる。
特にマウス又はラット等のトランスジェニック動物を産生する方法は当該分野に
おいて常套的になっており、例えば米国特許第4,736,866号や第4,870,009号に記
述されている。典型的には、特定の細胞を組織特異的エンハンサーでのｈＳｕ（
ｆｕ）導入遺伝子の導入の標的にする。胚段階で動物の生殖系列に導入されたｈ
Ｓｕ（ｆｕ）をコードする導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物は
、ｈＳｕ（ｆｕ）をコードするＤＮＡの増大した発現の影響を調べるために使用
できる。このような動物は、例えばその過剰発現を伴う病理的状態に対して保護
をもたらすと思われる試薬のテスター動物として使用できる。発明のこの側面に
おいては、動物を試薬で処理し、導入遺伝子を有する未処理の動物に比べ病状の
発病率が低ければ、疾患に対する治療的処置の可能性が示される。
【００５７】 あるいは、ｈＳｕ（ｆｕ）の非ヒト相同体は、動物の胚性細胞に導入されたｈ
Ｓｕ（ｆｕ）をコードする変更ゲノムＤＮＡと、ｈＳｕ（ｆｕ）をコードする内
在性遺伝子との間の相同的組換えによって、ｈＳｕ（ｆｕ）をコードする欠陥又
は変更遺伝子を有するｈＳｕ（ｆｕ）「ノックアウト」動物を作成するために使
用できる。例えば、ｈＳｕ（ｆｕ）をコードするｃＤＮＡは、確立された技術に
従い、ｈＳｕ（ｆｕ）をコードするゲノムＤＮＡのクローニングに使用できる。
ｈＳｕ（ｆｕ）をコードするゲノムＤＮＡの一部を欠失したり、組み込みを監視
するために使用する選択可能なマーカーをコードする遺伝子等の他の遺伝子で置
換することができる。典型的には、ベクターは無変化のフランキングＤＮＡ(５'
と３'末端の両方)を数キロベース含む［例えば、相同的組換えベクターについて
はThomas and Capecchi, Cell, 51:503 (1987)を参照のこと］。ベクターは胚性
幹細胞に(例えば電気穿孔法等によって)導入し、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮ
Ａと相同的に組換えられた細胞を選択する［例えば、Li等, Cell, 69:915 (1992
)参照］。選択された細胞は次に動物(例えばマウス又はラット)の胚盤胞内に注
入され、集合キメラを形成する［例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embr
yonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxfor
d, 1987), pp. 113-152参照］。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母
に移植し、「ノックアウト」動物を作ると言われる。胚細胞に相同的に組換えら
れたＤＮＡを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物
の全細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖させることができる。
ノックアウト動物は、ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドが不在であることによるある
種の病理的状態及び病理的状態の進行に対して防御する能力によって特徴付けら
れる。
Ｓｕ（ｆｕ）をコードする変更ゲノムＤＮＡと、ｈＳｕ（ｆｕ）をコードする内
在性遺伝子との間の相同的組換えによって、ｈＳｕ（ｆｕ）をコードする欠陥又
は変更遺伝子を有するｈＳｕ（ｆｕ）「ノックアウト」動物を作成するために使
用できる。例えば、ｈＳｕ（ｆｕ）をコードするｃＤＮＡは、確立された技術に
従い、ｈＳｕ（ｆｕ）をコードするゲノムＤＮＡのクローニングに使用できる。
ｈＳｕ（ｆｕ）をコードするゲノムＤＮＡの一部を欠失したり、組み込みを監視
するために使用する選択可能なマーカーをコードする遺伝子等の他の遺伝子で置
換することができる。典型的には、ベクターは無変化のフランキングＤＮＡ(５'
と３'末端の両方)を数キロベース含む［例えば、相同的組換えベクターについて
はThomas and Capecchi, Cell, 51:503 (1987)を参照のこと］。ベクターは胚性
幹細胞に(例えば電気穿孔法等によって)導入し、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮ
Ａと相同的に組換えられた細胞を選択する［例えば、Li等, Cell, 69:915 (1992
)参照］。選択された細胞は次に動物(例えばマウス又はラット)の胚盤胞内に注
入され、集合キメラを形成する［例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embr
yonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxfor
d, 1987), pp. 113-152参照］。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母
に移植し、「ノックアウト」動物を作ると言われる。胚細胞に相同的に組換えら
れたＤＮＡを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物
の全細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖させることができる。
ノックアウト動物は、ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドが不在であることによるある
種の病理的状態及び病理的状態の進行に対して防御する能力によって特徴付けら
れる。
【００５８】 ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドをコードする核酸はまた遺伝子療法に使用するこ
とができる。遺伝子療法の用途では、例えば欠陥遺伝子の置換のために治療的有
効量の遺伝子産物のインビボ合成を達成するために遺伝子が細胞に導入される。
「遺伝子療法」には、持続効果が単一の治療によって達成される一般的な遺伝子
療法と、治療的有効量のＤＮＡ又はｍＲＮＡの一回又は繰り返し投与を含む遺伝
子治療剤の投与の双方が含まれる。アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡを、ある種の
遺伝子のインビボでの発現を阻止するための治療剤として使用することができる
。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞膜によるその制限された取り込
みにより引き起こされるその低細胞内濃度にもかかわらず、阻害剤として作用す
る細胞中に移入されうることは既に示されている。（Zamecnik等, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 83:4143-4146 [1986]）。オリゴヌクレオチドは、例えば負に荷
電したホスホジエステル基を無電荷基により置換することにより、その取り込み
を亢進するように修飾することができる。 一実施態様では、製薬組成物は、遺伝子療法のための腫瘍抑制活性を有するｈ
Ｓｕ（ｆｕ）の非突然変異型をコード化するヌクレオチド配列を含む。当該分野
において知られているように、腫瘍又は他の疾患は、細胞が癌抑制遺伝子の双方
の機能性コピーを失うか、あるいは欠陥型に突然変異した一又は複数のコピーを
有しているときにしばしば進化する。そのような場合、ｈＳｕ（ｆｕ）の機能性
コピーを導入すると状態を改善するのに役立ちうる。
とができる。遺伝子療法の用途では、例えば欠陥遺伝子の置換のために治療的有
効量の遺伝子産物のインビボ合成を達成するために遺伝子が細胞に導入される。
「遺伝子療法」には、持続効果が単一の治療によって達成される一般的な遺伝子
療法と、治療的有効量のＤＮＡ又はｍＲＮＡの一回又は繰り返し投与を含む遺伝
子治療剤の投与の双方が含まれる。アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡを、ある種の
遺伝子のインビボでの発現を阻止するための治療剤として使用することができる
。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞膜によるその制限された取り込
みにより引き起こされるその低細胞内濃度にもかかわらず、阻害剤として作用す
る細胞中に移入されうることは既に示されている。（Zamecnik等, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 83:4143-4146 [1986]）。オリゴヌクレオチドは、例えば負に荷
電したホスホジエステル基を無電荷基により置換することにより、その取り込み
を亢進するように修飾することができる。 一実施態様では、製薬組成物は、遺伝子療法のための腫瘍抑制活性を有するｈ
Ｓｕ（ｆｕ）の非突然変異型をコード化するヌクレオチド配列を含む。当該分野
において知られているように、腫瘍又は他の疾患は、細胞が癌抑制遺伝子の双方
の機能性コピーを失うか、あるいは欠陥型に突然変異した一又は複数のコピーを
有しているときにしばしば進化する。そのような場合、ｈＳｕ（ｆｕ）の機能性
コピーを導入すると状態を改善するのに役立ちうる。
【００５９】 生細胞中に核酸を導入するために利用できる様々な技術がある。その技術は、
核酸がインビトロで培養細胞中に移されるか、意図した宿主の細胞中にインビボ
で移されるかどうかに依存して変わる。哺乳動物細胞へのインビトロでの核酸の
移送に好適な技術には、リポソームの使用、エレクトロポレーション、マイクロ
インジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈殿
法等々が含まれる。現在好適なインビボでの遺伝子移送技術には、ウィルス（典
型的にはレトロウィルス）ベクターでの形質移入とウィルスコートタンパク質−
リポソーム媒介形質移入（Dzau等, Trends in Biotechnology 11:205-210[1993]
）が含まれる。ある状況では、核酸源に標的細胞をターゲッティングする薬剤、
例えば細胞表面膜タンパク質又は標的細胞に対して特異的な抗体、標的細胞上の
レセプターに対するリガンドを提供することが望ましい。リポソームが用いられ
る場合、エンドサイトーシスに関連する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパ
ク質は、例えば特定の細胞型向けのキャプシドタンパク質又はその断片、サイク
リングにおいて内部移行を受けるタンパク質の抗体、細胞内局在化を標的にし細
胞内半減期を亢進するタンパク質を標的とする、及び／又は取り込みを容易にす
るために使用しうる。レセプター媒介エンドサイトーシスの方法は、例えばWu等
, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987);及びWagner等, Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 87:3410-3414(1990)に記載されている。遺伝子標識及び遺伝子療法プロ
トコールのレビューについてはAnderson等, Science 256:808-813 (1992)を参照されたい。
核酸がインビトロで培養細胞中に移されるか、意図した宿主の細胞中にインビボ
で移されるかどうかに依存して変わる。哺乳動物細胞へのインビトロでの核酸の
移送に好適な技術には、リポソームの使用、エレクトロポレーション、マイクロ
インジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈殿
法等々が含まれる。現在好適なインビボでの遺伝子移送技術には、ウィルス（典
型的にはレトロウィルス）ベクターでの形質移入とウィルスコートタンパク質−
リポソーム媒介形質移入（Dzau等, Trends in Biotechnology 11:205-210[1993]
）が含まれる。ある状況では、核酸源に標的細胞をターゲッティングする薬剤、
例えば細胞表面膜タンパク質又は標的細胞に対して特異的な抗体、標的細胞上の
レセプターに対するリガンドを提供することが望ましい。リポソームが用いられ
る場合、エンドサイトーシスに関連する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパ
ク質は、例えば特定の細胞型向けのキャプシドタンパク質又はその断片、サイク
リングにおいて内部移行を受けるタンパク質の抗体、細胞内局在化を標的にし細
胞内半減期を亢進するタンパク質を標的とする、及び／又は取り込みを容易にす
るために使用しうる。レセプター媒介エンドサイトーシスの方法は、例えばWu等
, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987);及びWagner等, Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 87:3410-3414(1990)に記載されている。遺伝子標識及び遺伝子療法プロ
トコールのレビューについてはAnderson等, Science 256:808-813 (1992)を参照されたい。
【００６０】 本発明のｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドは、製薬的に有用な組成物を調製するた
めの既知の方法で製剤化することができ、それにより、本ｈＳｕ（ｆｕ）産物は
製薬的に許容可能な担体ビヒクルと混合して組み合わされる。治療用製剤は、所
望の純度を持つ活性成分を、任意の生理学的に許容される担体、賦形剤又は安定
化剤（Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Osol, A.編, (1980)
）と混合することにより、凍結乾燥製剤又は水溶液として調製されて保存される
。許容可能な担体、賦形剤又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で受容者に
非毒性であり、例えばホスファート、シトラート及び他の有機酸のような緩衝液
；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基以下）のポリペプチド
；血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニル
ピロリドンのような親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ア
ルギニン又はリジンのようなアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキスト
リンを含む単糖類、二糖類及び他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マ
ンニトール又はソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような塩形成
対イオン；及び／又はトゥイーン（Tween）、プルロニクス（Pluronics）又はＰ
ＥＧのような非イオン性界面活性剤を含む。インビボ投与のために使用される製
剤は殺菌したものでなければならない。これは、凍結乾燥及び再構成に先だって
、又はその後に、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成される。 ここに記載する治療用組成物は、一般に、無菌のアクセスポート、例えば、静
脈内溶液バッグ又は皮下注射針が貫通可能なストッパーを備えたバイアルに入れ
られる。 投与経路は、既知の方法、例えば、静脈内、腹膜内、脳内、筋肉内、眼内、動
脈内、又は病巣内経路での注射又は注入、局所投与、あるいは徐放システムに従
う。 本発明の製薬組成物の容量と所望される薬物濃度は考えられる特定の用途に依
存して変わりうる。適切な用量と投与経路の決定は通常の医師の技量の範囲内で
ある。動物実験はヒトの治療のために効果的な用量を決定するための信頼のある
指針を提供する。有効用量の種間スケーリングは、Toxicokinetics and New Dru
g Development, Yacobi等, 編, Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96のM
ordenti, J.とChappell, W.「The use of interspecies scaling in toxicokine
tics」に記載された原理に従って実施できる。
めの既知の方法で製剤化することができ、それにより、本ｈＳｕ（ｆｕ）産物は
製薬的に許容可能な担体ビヒクルと混合して組み合わされる。治療用製剤は、所
望の純度を持つ活性成分を、任意の生理学的に許容される担体、賦形剤又は安定
化剤（Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Osol, A.編, (1980)
）と混合することにより、凍結乾燥製剤又は水溶液として調製されて保存される
。許容可能な担体、賦形剤又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で受容者に
非毒性であり、例えばホスファート、シトラート及び他の有機酸のような緩衝液
；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基以下）のポリペプチド
；血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニル
ピロリドンのような親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ア
ルギニン又はリジンのようなアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキスト
リンを含む単糖類、二糖類及び他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マ
ンニトール又はソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような塩形成
対イオン；及び／又はトゥイーン（Tween）、プルロニクス（Pluronics）又はＰ
ＥＧのような非イオン性界面活性剤を含む。インビボ投与のために使用される製
剤は殺菌したものでなければならない。これは、凍結乾燥及び再構成に先だって
、又はその後に、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成される。 ここに記載する治療用組成物は、一般に、無菌のアクセスポート、例えば、静
脈内溶液バッグ又は皮下注射針が貫通可能なストッパーを備えたバイアルに入れ
られる。 投与経路は、既知の方法、例えば、静脈内、腹膜内、脳内、筋肉内、眼内、動
脈内、又は病巣内経路での注射又は注入、局所投与、あるいは徐放システムに従
う。 本発明の製薬組成物の容量と所望される薬物濃度は考えられる特定の用途に依
存して変わりうる。適切な用量と投与経路の決定は通常の医師の技量の範囲内で
ある。動物実験はヒトの治療のために効果的な用量を決定するための信頼のある
指針を提供する。有効用量の種間スケーリングは、Toxicokinetics and New Dru
g Development, Yacobi等, 編, Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96のM
ordenti, J.とChappell, W.「The use of interspecies scaling in toxicokine
tics」に記載された原理に従って実施できる。
【００６１】 Ｆ．抗ｈＳｕ（ｆｕ）抗体 本発明は、さらに抗ｈＳｕ（ｆｕ）抗体を提供するものである。抗体の例とし
ては、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロ抱合体
抗体が含まれる。 １．ポリクローナル抗体 本発明の抗ｈＳｕ（ｆｕ）抗体はポリクローナル抗体を含む。ポリクローナル
抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体
は、例えば免疫化剤、及び所望するのであればアジュバントを、一又は複数回注
射することで発生させることができる。典型的には、免疫化剤及び／又はアジュ
バントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫化剤は、
ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫化剤を免
疫化された哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に抱合させるの
が有用である。このような免疫原タンパク質の例は、これらに限られないが、キ
ーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び
大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、
フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ-ＴＤＭアジュバント(モノホスホリル脂
質Ａ、合成トレハロースジコリノミコラート)が含まれる。免疫化プロトコール
は、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。
ては、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロ抱合体
抗体が含まれる。 １．ポリクローナル抗体 本発明の抗ｈＳｕ（ｆｕ）抗体はポリクローナル抗体を含む。ポリクローナル
抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体
は、例えば免疫化剤、及び所望するのであればアジュバントを、一又は複数回注
射することで発生させることができる。典型的には、免疫化剤及び／又はアジュ
バントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫化剤は、
ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫化剤を免
疫化された哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に抱合させるの
が有用である。このような免疫原タンパク質の例は、これらに限られないが、キ
ーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び
大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、
フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ-ＴＤＭアジュバント(モノホスホリル脂
質Ａ、合成トレハロースジコリノミコラート)が含まれる。免疫化プロトコール
は、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。
【００６２】 ２．モノクローナル抗体 あるいは、抗ｈＳｕ（ｆｕ）抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノ
クローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されて
いるようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリ
ドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化
剤により免疫化することで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するかある
いは生成可能なリンパ球を誘発する。また、リンパ球をインビトロで免疫化する
こともできる。 免疫化剤は、典型的にはｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチド又はその融合タンパク質
を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「ＰＢＬ」)
が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリ
ンパ節細胞が使用される。ついで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を
用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する［
Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press,
(1986) pp. 59-103］。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞
、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマ
ウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融
合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培
地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボ
シルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠いていると、ハイブリドーマの培
地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプチリン及びチミジンを含み(「ＨＡ
Ｔ培地」)、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。
クローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されて
いるようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリ
ドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化
剤により免疫化することで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するかある
いは生成可能なリンパ球を誘発する。また、リンパ球をインビトロで免疫化する
こともできる。 免疫化剤は、典型的にはｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチド又はその融合タンパク質
を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「ＰＢＬ」)
が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリ
ンパ節細胞が使用される。ついで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を
用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する［
Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press,
(1986) pp. 59-103］。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞
、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマ
ウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融
合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培
地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボ
シルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠いていると、ハイブリドーマの培
地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプチリン及びチミジンを含み(「ＨＡ
Ｔ培地」)、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。
【００６３】 好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による
安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性
のものである。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例
えばカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Cente
rやメリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ンより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及
びマウス-ヒト異種骨髄腫株化細胞も開示されている［Kozbor, J. Immunol., 13
3:3001 (1984)、Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and
Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63］。 ついでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、ｈＳｕ（ｆｕ）に対する
モノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞
によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイム
ノアッセイ(ＲＩＡ)や酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)等のインビトロ結合検定
法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知で
ある。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. B
iochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード分析法によって測定すること
ができる。 所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを制限希釈工程によりサ
ブクローニングし、標準的な方法で成長させることができる［Goding, 上掲］。
この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及び
ＲＰＭＩ-１６４０倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物
においてインビボで腹水として成長させることもできる。 サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ
−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳
動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン
精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性
のものである。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例
えばカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Cente
rやメリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ンより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及
びマウス-ヒト異種骨髄腫株化細胞も開示されている［Kozbor, J. Immunol., 13
3:3001 (1984)、Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and
Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63］。 ついでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、ｈＳｕ（ｆｕ）に対する
モノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞
によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイム
ノアッセイ(ＲＩＡ)や酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)等のインビトロ結合検定
法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知で
ある。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. B
iochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード分析法によって測定すること
ができる。 所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを制限希釈工程によりサ
ブクローニングし、標準的な方法で成長させることができる［Goding, 上掲］。
この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及び
ＲＰＭＩ-１６４０倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物
においてインビボで腹水として成長させることもできる。 サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ
−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳
動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン
精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
【００６４】 また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第4,816,567
号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体
をコードするＤＮＡは、常套的な方法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖及び
軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使
用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細
胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡ
は発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞
、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク
質を生成などしない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクロ
ーナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列
に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［US
. Patent No.4,816,567；Morrison等, 上掲］、又は免疫グロブリンコード配列
に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合するこ
とにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、
本発明の抗体の定常ドメインの代わりに置換するか、本発明の抗体の一つの抗原
結合部位の可変ドメインの代わりに置換し、キメラ性二価抗体を産生することが
できる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメ
インに置換でき、あるいは本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに
置換でき、キメラ性二価抗体を生成する。 抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく
知られてる。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現
を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意のポイン
トで切断される。あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換
するか欠失させて架橋を防止する。 一価抗体の調製にはインビトロ法がまた適している。抗体の消化による、その
断片、特にＦａｂ断片の生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使
用して達成できる。
号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体
をコードするＤＮＡは、常套的な方法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖及び
軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使
用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細
胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡ
は発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞
、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク
質を生成などしない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクロ
ーナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列
に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［US
. Patent No.4,816,567；Morrison等, 上掲］、又は免疫グロブリンコード配列
に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合するこ
とにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、
本発明の抗体の定常ドメインの代わりに置換するか、本発明の抗体の一つの抗原
結合部位の可変ドメインの代わりに置換し、キメラ性二価抗体を産生することが
できる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメ
インに置換でき、あるいは本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに
置換でき、キメラ性二価抗体を生成する。 抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく
知られてる。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現
を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意のポイン
トで切断される。あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換
するか欠失させて架橋を防止する。 一価抗体の調製にはインビトロ法がまた適している。抗体の消化による、その
断片、特にＦａｂ断片の生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使
用して達成できる。
【００６５】 ３．ヒト化抗体 本発明の抗ｈＳｕ（ｆｕ）抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非
ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリ
ン鎖あるいはその断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２あるいは抗
体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配
列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残
基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有す
る非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン
(レシピエント抗体)を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレー
ムワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗
体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列に
も見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは
ほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるい
はほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである
、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト
化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロ
ブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる［Jones等, Nature, 321:522-5
25 (1986); Riechmann等, Nature, 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op
Struct. Biol., 2:593-596 (1992)］。
ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリ
ン鎖あるいはその断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２あるいは抗
体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配
列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残
基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有す
る非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン
(レシピエント抗体)を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレー
ムワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗
体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列に
も見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは
ほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるい
はほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである
、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト
化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロ
ブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる［Jones等, Nature, 321:522-5
25 (1986); Riechmann等, Nature, 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op
Struct. Biol., 2:593-596 (1992)］。
【００６６】 非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト
化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒト
アミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移
入」残基と称される。ヒト化は基本的に齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト
抗体の該当する配列を置換することによりウィンター(winter)及び共同研究者［
Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1
988)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、齧歯類
ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施され
る。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的
に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4
,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及
び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によ
って置換されたヒト抗体である。 また、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリ［Hoogenboom及びWinter, J. Mol
. Biol., 227:381 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)］を含むこの分野で知られた
種々の方法を用いて作成することもできる。また、Cole等及びBoerner等の技術
も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる［Cole等, Monoclon
al Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985)及びBoerner等,
J. Immunol., 147(1)：86-95(1991) ］。同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリ
ン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子は部分的
又は完全に不活性化されたマウスに導入することにより産生することができる。
投与の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含むあらゆる観点に
おいてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生産が観察される。
このアプローチは、例えば米国特許第5,545,807号；同第5,545,806号；同第5,56
9,825号；同第5,625,126号；同第5,633,425号；同第5,661,016号、及び次の科学
文献：Marks等, Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg等, Nature 368
856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild等, Nature
Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826
(1996); Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)に記載
されている。
化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒト
アミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移
入」残基と称される。ヒト化は基本的に齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト
抗体の該当する配列を置換することによりウィンター(winter)及び共同研究者［
Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1
988)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、齧歯類
ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施され
る。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的
に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4
,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及
び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によ
って置換されたヒト抗体である。 また、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリ［Hoogenboom及びWinter, J. Mol
. Biol., 227:381 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)］を含むこの分野で知られた
種々の方法を用いて作成することもできる。また、Cole等及びBoerner等の技術
も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる［Cole等, Monoclon
al Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985)及びBoerner等,
J. Immunol., 147(1)：86-95(1991) ］。同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリ
ン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子は部分的
又は完全に不活性化されたマウスに導入することにより産生することができる。
投与の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含むあらゆる観点に
おいてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生産が観察される。
このアプローチは、例えば米国特許第5,545,807号；同第5,545,806号；同第5,56
9,825号；同第5,625,126号；同第5,633,425号；同第5,661,016号、及び次の科学
文献：Marks等, Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg等, Nature 368
856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild等, Nature
Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826
(1996); Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)に記載
されている。
【００６７】 ４．二重特異性抗体 二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有する
モノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合
において、結合特異性の一方はｈＳｕ（ｆｕ）に対してであり、他方は任意の他
の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニ
ットに対してである。 二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的に
は、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免
疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく［Milstein及びCuello, Nature,
305:537-539 (1983)］。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため
、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合
物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精
製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の
手順が1993年5月13日公開のWO 93/08829、及びTraunecker等, EMBO J.,10:3655-
3656 (1991)に開示されている。 所望の結合特異性(抗体-抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロ
ブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部
、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのもの
である。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常
領域(ＣＨ１)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードする
ＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入
し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作成するための更な
る詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210(1986)を
参照されたい。
モノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合
において、結合特異性の一方はｈＳｕ（ｆｕ）に対してであり、他方は任意の他
の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニ
ットに対してである。 二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的に
は、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免
疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく［Milstein及びCuello, Nature,
305:537-539 (1983)］。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため
、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合
物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精
製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の
手順が1993年5月13日公開のWO 93/08829、及びTraunecker等, EMBO J.,10:3655-
3656 (1991)に開示されている。 所望の結合特異性(抗体-抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロ
ブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部
、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのもの
である。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常
領域(ＣＨ１)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードする
ＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入
し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作成するための更な
る詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210(1986)を
参照されたい。
【００６８】 ５．ヘテロ抱合体抗体 ヘテロ抱合抗体もまた本発明の範囲に入る。ヘテロ抱合抗体は、２つの共有結
合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対
してターゲティングさせるため［米国特許第4,676,980号］及びＨＩＶ感染の治
療のために［WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089］提案されている。この抗
体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用
して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド
交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を
作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレー
ト及びメチル-４-メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第4,6767,980
号に開示されているものが含まれる。
合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対
してターゲティングさせるため［米国特許第4,676,980号］及びＨＩＶ感染の治
療のために［WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089］提案されている。この抗
体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用
して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド
交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を
作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレー
ト及びメチル-４-メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第4,6767,980
号に開示されているものが含まれる。
【００６９】 Ｇ．抗ｈＳｕ（ｆｕ）抗体の用途 本発明の抗ｈＳｕ（ｆｕ）抗体は様々な有用性を有している。例えば、抗ｈＳ
ｕ（ｆｕ）抗体は、ｈＳｕ（ｆｕ）の診断アッセイ、例えばその特定細胞、組織
、又は血清での発現の検出に用いられる。競合的結合アッセイ、直接又は間接サ
ンドウィッチアッセイ及び不均一又は均一相で行われる免疫沈降アッセイ［Zola
, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987)
pp. 147-158］等のこの分野で知られた種々の診断アッセイ技術が使用される。
診断アッセイで用いられる抗体は、検出可能な部分で標識される。検出可能な部
分は、直接的にか又は間接的に検出可能なシグナルを発生することができなけれ
ばならない。例えば、検出可能な部分は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ又は１ ２５ Ｉ等の放射性同位体、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン又は
ルシフェリン等の蛍光又は化学発光化合物、あるいはアルカリホスファターゼ、
β-ガラクトシダーゼ又はセイヨウワサビペルオキシダーゼ等の酵素であってよ
い。Hunter等 Nature, 144:945 (1962)；David等, Biochemistry, 13: 1014 (19
74)；Pain等, J. Immunol. Meth., 40:219 (1981) ;及びNygren, J. Histochem.
and Cytochem., 30:407 (1982)に記載された方法を含む、抗体を検出可能な部
位に抱合するためにこの分野で知られた任意の方法が用いられる。 より好ましくは、異常なｈＳｕ（ｆｕ）タンパク質の有無のための腫瘍細胞の
分析はイムノアッセイによって実施することができる。Ｈｈ関連腫瘍を疑われる
患者から試料を採取する。ここで使用される試料としては、生物学的体液、例え
ば血液、脳脊髄液、涙、唾液、リンパ液、透析液等々；器官又は組織培養由来の
流体；及び生理組織から抽出した流体が含まれる。該用語にまた含まれるのは、
このような流体の誘導体及びフラクションである。皮膚損傷、器官組織断片等々
の生検試料が特に興味深い。転移が疑わしい場合には、血液試料が好適となりう
る。試料中の細胞の数は一般に少なくとも１０３、通常は少なくとも１０４、よ
り通常は少なくとも１０５である。細胞は、固形組織の場合には分離でき、ある
いは組織切片を分析してもよい。あるいは細胞の溶解物を調製することができる
。
ｕ（ｆｕ）抗体は、ｈＳｕ（ｆｕ）の診断アッセイ、例えばその特定細胞、組織
、又は血清での発現の検出に用いられる。競合的結合アッセイ、直接又は間接サ
ンドウィッチアッセイ及び不均一又は均一相で行われる免疫沈降アッセイ［Zola
, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987)
pp. 147-158］等のこの分野で知られた種々の診断アッセイ技術が使用される。
診断アッセイで用いられる抗体は、検出可能な部分で標識される。検出可能な部
分は、直接的にか又は間接的に検出可能なシグナルを発生することができなけれ
ばならない。例えば、検出可能な部分は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ又は１ ２５ Ｉ等の放射性同位体、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン又は
ルシフェリン等の蛍光又は化学発光化合物、あるいはアルカリホスファターゼ、
β-ガラクトシダーゼ又はセイヨウワサビペルオキシダーゼ等の酵素であってよ
い。Hunter等 Nature, 144:945 (1962)；David等, Biochemistry, 13: 1014 (19
74)；Pain等, J. Immunol. Meth., 40:219 (1981) ;及びNygren, J. Histochem.
and Cytochem., 30:407 (1982)に記載された方法を含む、抗体を検出可能な部
位に抱合するためにこの分野で知られた任意の方法が用いられる。 より好ましくは、異常なｈＳｕ（ｆｕ）タンパク質の有無のための腫瘍細胞の
分析はイムノアッセイによって実施することができる。Ｈｈ関連腫瘍を疑われる
患者から試料を採取する。ここで使用される試料としては、生物学的体液、例え
ば血液、脳脊髄液、涙、唾液、リンパ液、透析液等々；器官又は組織培養由来の
流体；及び生理組織から抽出した流体が含まれる。該用語にまた含まれるのは、
このような流体の誘導体及びフラクションである。皮膚損傷、器官組織断片等々
の生検試料が特に興味深い。転移が疑わしい場合には、血液試料が好適となりう
る。試料中の細胞の数は一般に少なくとも１０３、通常は少なくとも１０４、よ
り通常は少なくとも１０５である。細胞は、固形組織の場合には分離でき、ある
いは組織切片を分析してもよい。あるいは細胞の溶解物を調製することができる
。
【００７０】 診断は多くの方法によって実施することができる。異なる方法は全て発癌性突
然変異を有することが疑われる患者の細胞における異常なｈＳｕ（ｆｕ）の有無
を決定する。ここで検討した本発明の組成物と方法を用いることができる。例え
ば、一般的な方法に従って実施される無傷の細胞又は組織切片の染色を利用する
ことができる。対象の抗体を細胞試料に加え、エピトープへの結合を可能にする
のに十分な時間、通常は少なくとも約１０分の間、インキュベートする。抗体は
放射性同位元素、酵素、蛍光剤、化学発光剤、又は他の直接検出用の標識で標識
することができる。あるいは、第二段階の抗体又は試薬を用いてシグナルを増幅
させる。このような試薬は当該分野においてよく知られている。例えば、一次抗
体は第２段階の試薬として添加される西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲー
トアビジンを用いて、ビオチンにコンジュゲートさせることができる。最終の検
出はペルオキシダーゼの存在下で色彩変化を受ける基質を検出する。抗体結合の
有無は、解離細胞のフローサイトメトリー、顕微鏡検査、放射線写真撮影、シン
チレーション計数等々を含む様々な方法により決定することができる。 診断の更に他の代替方法は、腫瘍細胞が活性なｈＳｕ（ｆｕ）タンパク質を分
泌（又は細胞死のときに放出）しうる細胞溶解物、上清又は他の流体中における
抗体とｈＳｕ（ｆｕ）の間の結合のインビトロでの検出に依存する。試料又はそ
のフラクション中のｈＳｕ（ｆｕ）結合濃度の測定は、ここで検討した様々な特
定のアッセイによって達成できる。一般的なサンドイッチ型のアッセイを使用す
ることができる。例えば、サンドイッチアッセイは、最初にｈＳｕ（ｆｕ）特異
的抗体を不溶性表面又は支持体に付着させうる。結合の特定の形式は、それが本
発明の試薬と全体的な方法と適合性がある限り、重要ではない。それらはプレー
トに共有的に又は非共有的に、好ましくは非共有的に結合されうる。不溶性支持
体はポリペプチドが結合しうる任意の組成物であり得、それは可溶性物質から容
易に分離され、方法全体と適合性等がある。そのような支持体の表面は中実か多
孔性であり得、任意の一般的な形状であり得る。レセプターが結合させられる好
適な不溶性支持体の例としては、ビーズ、例えば磁性ビーズ、膜及びマイクロタ
イタープレートが含まれる。これらは典型的にはガラス、プラスチック（例えば
ポリスチレン）、多糖類、ナイロン又はニトロセルロースである。マイクロタイ
タープレートは、少量の試薬と試料を使用して、非常に多数のアッセイを同時に
行うことができるので、特に好都合である。 抗ｈＳｕ（ｆｕ）抗体はまた組換え細胞培養もしくは天然源からのｈＳｕ（ｆ
ｕ）のアフィニティー精製に対して有用である。この方法では、ｈＳｕ（ｆｕ）
に対する抗体を、当該分野に置いてよく知られた方法を用いてセファデックス樹
脂又は濾過紙のような適当な支持体上に固定化する。ついで、固定化した抗体を
、精製されるｈＳｕ（ｆｕ）を含む試料に接触させ、ついで支持体を、固定化抗
体に結合するｈＳｕ（ｆｕ）を除く試料中の実質的に全ての物質を取り除く適当
な溶媒で洗浄する。最後に、抗体からｈＳｕ（ｆｕ）を切り離す他の好適な溶媒
で支持体を洗浄する。
然変異を有することが疑われる患者の細胞における異常なｈＳｕ（ｆｕ）の有無
を決定する。ここで検討した本発明の組成物と方法を用いることができる。例え
ば、一般的な方法に従って実施される無傷の細胞又は組織切片の染色を利用する
ことができる。対象の抗体を細胞試料に加え、エピトープへの結合を可能にする
のに十分な時間、通常は少なくとも約１０分の間、インキュベートする。抗体は
放射性同位元素、酵素、蛍光剤、化学発光剤、又は他の直接検出用の標識で標識
することができる。あるいは、第二段階の抗体又は試薬を用いてシグナルを増幅
させる。このような試薬は当該分野においてよく知られている。例えば、一次抗
体は第２段階の試薬として添加される西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲー
トアビジンを用いて、ビオチンにコンジュゲートさせることができる。最終の検
出はペルオキシダーゼの存在下で色彩変化を受ける基質を検出する。抗体結合の
有無は、解離細胞のフローサイトメトリー、顕微鏡検査、放射線写真撮影、シン
チレーション計数等々を含む様々な方法により決定することができる。 診断の更に他の代替方法は、腫瘍細胞が活性なｈＳｕ（ｆｕ）タンパク質を分
泌（又は細胞死のときに放出）しうる細胞溶解物、上清又は他の流体中における
抗体とｈＳｕ（ｆｕ）の間の結合のインビトロでの検出に依存する。試料又はそ
のフラクション中のｈＳｕ（ｆｕ）結合濃度の測定は、ここで検討した様々な特
定のアッセイによって達成できる。一般的なサンドイッチ型のアッセイを使用す
ることができる。例えば、サンドイッチアッセイは、最初にｈＳｕ（ｆｕ）特異
的抗体を不溶性表面又は支持体に付着させうる。結合の特定の形式は、それが本
発明の試薬と全体的な方法と適合性がある限り、重要ではない。それらはプレー
トに共有的に又は非共有的に、好ましくは非共有的に結合されうる。不溶性支持
体はポリペプチドが結合しうる任意の組成物であり得、それは可溶性物質から容
易に分離され、方法全体と適合性等がある。そのような支持体の表面は中実か多
孔性であり得、任意の一般的な形状であり得る。レセプターが結合させられる好
適な不溶性支持体の例としては、ビーズ、例えば磁性ビーズ、膜及びマイクロタ
イタープレートが含まれる。これらは典型的にはガラス、プラスチック（例えば
ポリスチレン）、多糖類、ナイロン又はニトロセルロースである。マイクロタイ
タープレートは、少量の試薬と試料を使用して、非常に多数のアッセイを同時に
行うことができるので、特に好都合である。 抗ｈＳｕ（ｆｕ）抗体はまた組換え細胞培養もしくは天然源からのｈＳｕ（ｆ
ｕ）のアフィニティー精製に対して有用である。この方法では、ｈＳｕ（ｆｕ）
に対する抗体を、当該分野に置いてよく知られた方法を用いてセファデックス樹
脂又は濾過紙のような適当な支持体上に固定化する。ついで、固定化した抗体を
、精製されるｈＳｕ（ｆｕ）を含む試料に接触させ、ついで支持体を、固定化抗
体に結合するｈＳｕ（ｆｕ）を除く試料中の実質的に全ての物質を取り除く適当
な溶媒で洗浄する。最後に、抗体からｈＳｕ（ｆｕ）を切り離す他の好適な溶媒
で支持体を洗浄する。
【００７１】 Ｈ．ｈＳｕ（ｆｕ）アンタゴニスト及びアゴニスト 最近、ヒトのヘッジホッグシグナル伝達経路における興味は、発育異常と度重
なる皮膚癌により特徴づけられた希な常染色体優性疾患である基底細胞母斑症候
群を持つ患者における遺伝した継ぎ接ぎ(patched)遺伝子突然変異の発見によっ
て掻き立てられた。patched遺伝子の体細胞性に獲得した変異が、基底細胞癌、
一次性乳癌、髄芽細胞腫及び髄膜種を含む散発性癌において特定されている。継
ぎ接ぎは腫瘍サプレッサーとして作用し、これらの突然変異が継ぎ接ぎ遺伝子産
物における機能の喪失を引き起こしていると現在は考えられている。従って、ヘ
ッジホッグ／patchedシグナル伝達経路は腫瘍形成の因子でありうる。増加した
細胞成長と腫瘍形成に至る遺伝子改変の検出は臨床医学にとって非常に興味深い
。改変した細胞成長に至る特定の変化を特定することは関連した腫瘍の改良され
た診断と可能な治療法への扉を開ける可能性がある。 本発明のｈＳｕ（ｆｕ）アンタゴニスト及びアゴニスト化合物を生成するのに
幾つかの方法を好適に用いることができる。アンタゴニスト分子が細胞内部に標
的化でき、変異体ｈＳｕ（ｆｕ）（例えば、腫瘍形成に本質的な、腫瘍抑制機能
を喪失した変異体）を作用から阻害又は防止する任意の方法が好適である。例え
ば、ドミナント変異体等の変異体ｈＳｕ（ｆｕ）を含む競合的阻害剤は、欠陥性
又は構成的ｈＳｕ（ｆｕ）を補足してＧｌｉネガティブ調節の正常なｈＳｕ（ｆ
ｕ）機能を回復させ、もってＨｈシグナル伝達を阻止する。膜貫通輸送に適した
サイズ、電荷及び疎水性等の、かかるアンタゴニスト又はアゴニスト分子の更な
る特性は、当業者によって容易に決定される。 ｈＳｕ（ｆｕ）の模倣物又は他の相同体が同定され評価される場合、細胞を試
験化合物に暴露し、ヒトｈＳｕ（ｆｕ）のみに暴露したポジティブ対照、化合物
にも天然リガンドにも暴露していないネガティブ対照と比較する。ｈＳｕ（ｆｕ
）シグナル変調のアンタゴニスト又はアゴニストを同定死評価する場合は、細胞
を天然リガンドの存在下で本発明の化合物に暴露し、試験化合物に暴露していな
い対照と比較する。 本発明のスクリーニングアッセイは、化学的ライブラリの高スループットスク
リーニングに適用でき、特に、小分子薬剤候補の同定に適している。
なる皮膚癌により特徴づけられた希な常染色体優性疾患である基底細胞母斑症候
群を持つ患者における遺伝した継ぎ接ぎ(patched)遺伝子突然変異の発見によっ
て掻き立てられた。patched遺伝子の体細胞性に獲得した変異が、基底細胞癌、
一次性乳癌、髄芽細胞腫及び髄膜種を含む散発性癌において特定されている。継
ぎ接ぎは腫瘍サプレッサーとして作用し、これらの突然変異が継ぎ接ぎ遺伝子産
物における機能の喪失を引き起こしていると現在は考えられている。従って、ヘ
ッジホッグ／patchedシグナル伝達経路は腫瘍形成の因子でありうる。増加した
細胞成長と腫瘍形成に至る遺伝子改変の検出は臨床医学にとって非常に興味深い
。改変した細胞成長に至る特定の変化を特定することは関連した腫瘍の改良され
た診断と可能な治療法への扉を開ける可能性がある。 本発明のｈＳｕ（ｆｕ）アンタゴニスト及びアゴニスト化合物を生成するのに
幾つかの方法を好適に用いることができる。アンタゴニスト分子が細胞内部に標
的化でき、変異体ｈＳｕ（ｆｕ）（例えば、腫瘍形成に本質的な、腫瘍抑制機能
を喪失した変異体）を作用から阻害又は防止する任意の方法が好適である。例え
ば、ドミナント変異体等の変異体ｈＳｕ（ｆｕ）を含む競合的阻害剤は、欠陥性
又は構成的ｈＳｕ（ｆｕ）を補足してＧｌｉネガティブ調節の正常なｈＳｕ（ｆ
ｕ）機能を回復させ、もってＨｈシグナル伝達を阻止する。膜貫通輸送に適した
サイズ、電荷及び疎水性等の、かかるアンタゴニスト又はアゴニスト分子の更な
る特性は、当業者によって容易に決定される。 ｈＳｕ（ｆｕ）の模倣物又は他の相同体が同定され評価される場合、細胞を試
験化合物に暴露し、ヒトｈＳｕ（ｆｕ）のみに暴露したポジティブ対照、化合物
にも天然リガンドにも暴露していないネガティブ対照と比較する。ｈＳｕ（ｆｕ
）シグナル変調のアンタゴニスト又はアゴニストを同定死評価する場合は、細胞
を天然リガンドの存在下で本発明の化合物に暴露し、試験化合物に暴露していな
い対照と比較する。 本発明のスクリーニングアッセイは、化学的ライブラリの高スループットスク
リーニングに適用でき、特に、小分子薬剤候補の同定に適している。
【００７２】 １. アンタゴニスト及びアゴニスト分子 正常なｈＳｕ（ｆｕ）タンパク質のアンタゴニストは、不十分なＨｈシグナル
伝達経路活性に特徴付けられる状態、又はＨｈシグナル伝達の増加が望ましい場
合に治療的に投与することができる。ヘッジホッグ生物活性には、胎児の頭、肢
、肺、中枢神経系又は中胚葉パターン形成を含む、様々な組織の生成と分化を誘
発もしくは変調等する能力が含まれる。増殖はまた多数の組織のＨｈによって変
調される。このような変調はインビトロ、エキソビボ又はインビボの状態で達成
することができる。例えば、創傷治癒、骨形成、低増殖性又は過剰増殖性皮膚疾
患の治療、分化の誘発は対象のアンタゴニストの投与に影響を受ける。 Ｈｈは運動神経誘発活性、神経分化誘発活性又は神経生存促進活性のような神
経形成を調節することができる。Ｈｈはまた軟骨細胞誘発能力又は精子形成にお
ける関与を含む、幹細胞又は胚細胞分化の誘発及び器官形成を調節する。関節炎
、例えば骨関節炎、関節リウマチ等々の治療は、ｈＳｕ（ｆｕ）アンタゴニスト
の投与と、続く軟骨細胞及び軟骨形成の誘発により恩恵を受けうる。Ｈｈは毛鞘
中の細胞の成長を変調することにより毛髪の成長を調節することができ、この目
的のためにｈＳｕ（ｆｕ）アンタゴニストを投与することができる。 ＨＨの投与は、ＴＧＦβファミリーのメンバー、骨形成タンパク質、及び線維
芽細胞成長因子ファミリーのような二次シグナル伝達分子の発現を誘発するので
、ｈＳｕ（ｆｕ）のアンタゴニストが同じことをしうる。 多くの神経性疾患がニューロン要素の離散集合の変性に関連しており、アンタ
ゴニストによって治療されうる。特定の疾患には、外傷、卒中から生じる虚血症
から生じる損傷、神経系の感染症及び／又は炎症から生じる損傷、アルツハイマ
ー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳失
調、及び中枢神経系の慢性免疫疾患、例えば多発性硬化症が含まれる。アンタゴ
ニストはまた末梢神経系の自律神経障害、例えば心臓の横紋筋を神経支配する神
経の変性状態から生じる心房心不整脈又は頻脈を治療するのにも有用である。
伝達経路活性に特徴付けられる状態、又はＨｈシグナル伝達の増加が望ましい場
合に治療的に投与することができる。ヘッジホッグ生物活性には、胎児の頭、肢
、肺、中枢神経系又は中胚葉パターン形成を含む、様々な組織の生成と分化を誘
発もしくは変調等する能力が含まれる。増殖はまた多数の組織のＨｈによって変
調される。このような変調はインビトロ、エキソビボ又はインビボの状態で達成
することができる。例えば、創傷治癒、骨形成、低増殖性又は過剰増殖性皮膚疾
患の治療、分化の誘発は対象のアンタゴニストの投与に影響を受ける。 Ｈｈは運動神経誘発活性、神経分化誘発活性又は神経生存促進活性のような神
経形成を調節することができる。Ｈｈはまた軟骨細胞誘発能力又は精子形成にお
ける関与を含む、幹細胞又は胚細胞分化の誘発及び器官形成を調節する。関節炎
、例えば骨関節炎、関節リウマチ等々の治療は、ｈＳｕ（ｆｕ）アンタゴニスト
の投与と、続く軟骨細胞及び軟骨形成の誘発により恩恵を受けうる。Ｈｈは毛鞘
中の細胞の成長を変調することにより毛髪の成長を調節することができ、この目
的のためにｈＳｕ（ｆｕ）アンタゴニストを投与することができる。 ＨＨの投与は、ＴＧＦβファミリーのメンバー、骨形成タンパク質、及び線維
芽細胞成長因子ファミリーのような二次シグナル伝達分子の発現を誘発するので
、ｈＳｕ（ｆｕ）のアンタゴニストが同じことをしうる。 多くの神経性疾患がニューロン要素の離散集合の変性に関連しており、アンタ
ゴニストによって治療されうる。特定の疾患には、外傷、卒中から生じる虚血症
から生じる損傷、神経系の感染症及び／又は炎症から生じる損傷、アルツハイマ
ー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳失
調、及び中枢神経系の慢性免疫疾患、例えば多発性硬化症が含まれる。アンタゴ
ニストはまた末梢神経系の自律神経障害、例えば心臓の横紋筋を神経支配する神
経の変性状態から生じる心房心不整脈又は頻脈を治療するのにも有用である。
【００７３】 また興味があるのはインビトロ及びエキソビボでの用途であり、そこでは、特
定の細胞培養物、例えば神経前駆細胞に加えられるＨｈはニューロンとグリアに
末期的に分化しうることが予想されもしくは知られている。Ｈｈは当該分野で知
られているように、適切な培地と組み合わされて、培養中のそのような細胞の再
生産を維持する。ｈＳｕ（ｆｕ）のアンタゴニストを同様に使用することができ
る。 本発明の化合物の投与に対してはここで検討されたように様々な方法を使用す
ることができる。 薬物スクリーニングは、異常な細胞におけるｈＳｕ（ｆｕ）機能の代替品を提
供する薬剤を同定する。腫瘍サプレッサーとしてのｈＳｕ（ｆｕ）の役割は、そ
の機能にアゴニズする（又は腫瘍抑制活性を失った突然変異ｈＳｕ（ｆｕ）型の
機能をアンタゴナイズする）薬剤が腫瘍形成プロセスを阻害することを示す。逆
に、正常なｈＳｕ（ｆｕ）機能をアンタゴナイズする薬剤は調節された成長と治
癒を刺激することができる。特に興味深いものは、ヒト細胞に対して低毒性の薬
剤に対するスクリーニングアッセイである。標識インビトロタンパク質間結合ア
ッセイ、電気泳動度シフトアッセイ、タンパク質結合、酵母ハイブリッド系等の
イムノアッセイを含む広範なアッセイをこの目的に対して使用することができる
。ここで使用される「薬剤」という用語は所望の生理的機能を変化もしくは模倣
する能力を持つ任意の分子、例えばタンパク質又は医薬を記述する。一般に、複
数のアッセイ混合物を異なった薬剤濃度で平行して流して、様々な濃度に対する
差次的な応答を得る。典型的には、これらの濃度の一つが負の対照、つまりゼロ
濃度又は検出レベル以下である。
定の細胞培養物、例えば神経前駆細胞に加えられるＨｈはニューロンとグリアに
末期的に分化しうることが予想されもしくは知られている。Ｈｈは当該分野で知
られているように、適切な培地と組み合わされて、培養中のそのような細胞の再
生産を維持する。ｈＳｕ（ｆｕ）のアンタゴニストを同様に使用することができ
る。 本発明の化合物の投与に対してはここで検討されたように様々な方法を使用す
ることができる。 薬物スクリーニングは、異常な細胞におけるｈＳｕ（ｆｕ）機能の代替品を提
供する薬剤を同定する。腫瘍サプレッサーとしてのｈＳｕ（ｆｕ）の役割は、そ
の機能にアゴニズする（又は腫瘍抑制活性を失った突然変異ｈＳｕ（ｆｕ）型の
機能をアンタゴナイズする）薬剤が腫瘍形成プロセスを阻害することを示す。逆
に、正常なｈＳｕ（ｆｕ）機能をアンタゴナイズする薬剤は調節された成長と治
癒を刺激することができる。特に興味深いものは、ヒト細胞に対して低毒性の薬
剤に対するスクリーニングアッセイである。標識インビトロタンパク質間結合ア
ッセイ、電気泳動度シフトアッセイ、タンパク質結合、酵母ハイブリッド系等の
イムノアッセイを含む広範なアッセイをこの目的に対して使用することができる
。ここで使用される「薬剤」という用語は所望の生理的機能を変化もしくは模倣
する能力を持つ任意の分子、例えばタンパク質又は医薬を記述する。一般に、複
数のアッセイ混合物を異なった薬剤濃度で平行して流して、様々な濃度に対する
差次的な応答を得る。典型的には、これらの濃度の一つが負の対照、つまりゼロ
濃度又は検出レベル以下である。
【００７４】 候補薬剤は無数の化学クラスを包含するが、典型的には有機分子、好ましくは
５０を越え約２５００ダルトン未満の分子量を有する小有機分子である。候補薬
剤はタンパク質との構造的な相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含み、典
型的には少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルもしくはカルボキシル基
、好ましくは少なくとも２つの官能化学基を含む。候補薬剤はしばしば環状炭素
又は複素環構造及び／又は芳香族又は多芳香族構造で、一又は複数の上記官能基
で置換されているものを含む。候補薬剤はまたペプチド、糖、脂肪酸、ステロイ
ド、プリン、ピリミジン、それらの誘導体、構造類似体又は組み合わせを含む生
体分子から見出される。 候補薬剤は、合成又は天然の化合物のライブラリを含む広範な供給源から得る
ことができる。例えば、無作為化オリゴヌクレオチド及びオリゴペプチドの発現
を含む無数の手段が、広範な有機化合物及び生体分子の無作為及び定方向合成の
ために利用できる。あるいは、細菌、真菌、植物及び動物抽出物の形態の天然化
合物のライブラリが利用できもしくは直ぐに作り出せる。また、天然又は合成的
に作られたライブラリと化合物は通常の化学的、物理的及び生化学的手段によっ
て容易に変更され、コンビナトリアルライブラリを作るのに使用することができ
る。既知の薬物に、定方向もしくは無作為化学修飾、例えばアシル化、アルキル
化、エステル化、アミド化等々を施して構造類似体を作ってもよい。
５０を越え約２５００ダルトン未満の分子量を有する小有機分子である。候補薬
剤はタンパク質との構造的な相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含み、典
型的には少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルもしくはカルボキシル基
、好ましくは少なくとも２つの官能化学基を含む。候補薬剤はしばしば環状炭素
又は複素環構造及び／又は芳香族又は多芳香族構造で、一又は複数の上記官能基
で置換されているものを含む。候補薬剤はまたペプチド、糖、脂肪酸、ステロイ
ド、プリン、ピリミジン、それらの誘導体、構造類似体又は組み合わせを含む生
体分子から見出される。 候補薬剤は、合成又は天然の化合物のライブラリを含む広範な供給源から得る
ことができる。例えば、無作為化オリゴヌクレオチド及びオリゴペプチドの発現
を含む無数の手段が、広範な有機化合物及び生体分子の無作為及び定方向合成の
ために利用できる。あるいは、細菌、真菌、植物及び動物抽出物の形態の天然化
合物のライブラリが利用できもしくは直ぐに作り出せる。また、天然又は合成的
に作られたライブラリと化合物は通常の化学的、物理的及び生化学的手段によっ
て容易に変更され、コンビナトリアルライブラリを作るのに使用することができ
る。既知の薬物に、定方向もしくは無作為化学修飾、例えばアシル化、アルキル
化、エステル化、アミド化等々を施して構造類似体を作ってもよい。
【００７５】 スクリーニングアッセイが結合アッセイである場合、一又は複数の分子を標識
に結合させることができ、標識が検出可能なシグナルを直接的に又は間接的に提
供しうる。様々な標識には放射性元素、蛍光剤、化学発光剤、酵素、特異的結合
分子、粒子、例えば磁性粒子等々が含まれる。特異的結合分子には、対、例えば
ビオチンとストレプトアビジン、ジゴキシンと抗ジゴキシン等々が含まれる。特
異的結合メンバーに対して、相補的メンバーは、通常は、既知の手順に従って、
検出をもたらす分子で標識される。 様々な他の試薬がスクリーニングアッセイにおいて含まれうる。これらには、
最適なタンパク質間結合塩類を容易にし、及び／又は非特異的又はバックグラウ
ンド相互作用を低減するために使用される中性タンパク質、例えばアルブミン、
洗浄剤等々のような試薬が含まれる。プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼ
インヒビター、抗菌剤等々のようなアッセイの効率を改善する試薬を使用しても
よい。成分の混合物は、必要な結合をもたらす任意の順序で添加される。インキ
ュベーションは、任意の好適な温度、典型的には４℃と４０℃の間で実施される
。インキュベーション時間は最適な活性が得られるように選択されるが、また高
速の高性能スクリーニングを容易にするために最適化することもで、典型的には
０．１時間と１時間の間とするのが十分であろう。 所望の薬理活性を有する化合物は、Ｈｈ経路機能又はｈＳｕ（ｆｕ）の不足に
帰する癌又は発達異常の治療のために宿主に生理的に許容可能な担体にて投与さ
れうる。 ｈＳｕ（ｆｕ）は、転写活性化因子Ｇｌｉの負の調節に関与しているＨｈのず
っと下流のモジュレータであるので、本発明の候補分子は非常に多くの状況、例
えば上流の経路分子に欠陥があり腫瘍形成に至るか、又は不十分な成長及び治癒
に至るときに、有用であるという利点を有する。本発明の化合物はＨｈ経路の重
要な転写工程に影響を及ぼすことによってこれらの妨害と欠陥を克服することが
できる。従って、本発明の化合物は、創傷治癒、加齢、腫瘍形成等々におけるヘ
ッジホッグ経路機能を亢進（又はＨｈ経路の上流の欠陥を解消する）ために使用
することができる。ここで検討したように、薬剤は、様々な形で、経口的に、局
所的に、非経口的に、例えば皮下的に、腹腔内に、ウィルス感染により、血管内
等々に投与することができる。
に結合させることができ、標識が検出可能なシグナルを直接的に又は間接的に提
供しうる。様々な標識には放射性元素、蛍光剤、化学発光剤、酵素、特異的結合
分子、粒子、例えば磁性粒子等々が含まれる。特異的結合分子には、対、例えば
ビオチンとストレプトアビジン、ジゴキシンと抗ジゴキシン等々が含まれる。特
異的結合メンバーに対して、相補的メンバーは、通常は、既知の手順に従って、
検出をもたらす分子で標識される。 様々な他の試薬がスクリーニングアッセイにおいて含まれうる。これらには、
最適なタンパク質間結合塩類を容易にし、及び／又は非特異的又はバックグラウ
ンド相互作用を低減するために使用される中性タンパク質、例えばアルブミン、
洗浄剤等々のような試薬が含まれる。プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼ
インヒビター、抗菌剤等々のようなアッセイの効率を改善する試薬を使用しても
よい。成分の混合物は、必要な結合をもたらす任意の順序で添加される。インキ
ュベーションは、任意の好適な温度、典型的には４℃と４０℃の間で実施される
。インキュベーション時間は最適な活性が得られるように選択されるが、また高
速の高性能スクリーニングを容易にするために最適化することもで、典型的には
０．１時間と１時間の間とするのが十分であろう。 所望の薬理活性を有する化合物は、Ｈｈ経路機能又はｈＳｕ（ｆｕ）の不足に
帰する癌又は発達異常の治療のために宿主に生理的に許容可能な担体にて投与さ
れうる。 ｈＳｕ（ｆｕ）は、転写活性化因子Ｇｌｉの負の調節に関与しているＨｈのず
っと下流のモジュレータであるので、本発明の候補分子は非常に多くの状況、例
えば上流の経路分子に欠陥があり腫瘍形成に至るか、又は不十分な成長及び治癒
に至るときに、有用であるという利点を有する。本発明の化合物はＨｈ経路の重
要な転写工程に影響を及ぼすことによってこれらの妨害と欠陥を克服することが
できる。従って、本発明の化合物は、創傷治癒、加齢、腫瘍形成等々におけるヘ
ッジホッグ経路機能を亢進（又はＨｈ経路の上流の欠陥を解消する）ために使用
することができる。ここで検討したように、薬剤は、様々な形で、経口的に、局
所的に、非経口的に、例えば皮下的に、腹腔内に、ウィルス感染により、血管内
等々に投与することができる。
【００７６】 ｈＳｕ（ｆｕ）シグナル伝達のアンタゴニスト及び／又はアゴニストをスクリ
ーニングするために、アッセイ混合物を、候補となる製薬剤の存在下であるが、
ｈＳｕ（ｆｕ）が参照活性でヘッジホッグシグナル伝達を誘発する条件下でイン
キュベートする。混合物成分は、必要なヘッジホッグ活性を与えるために任意の
順序で添加できる。インキュベーションは、最適な結合を促進する任意の温度、
典型的には４℃から４０℃、より通常は１５℃から４０℃で実施する。インキュ
ベーション時間も同様に最適結合のために選択されるが、迅速で高スループット
のスクリーニングを促進するために最小化され、典型的には約０．１から１０時
間、好ましくは５時間未満、より好ましくは２時間未満である。インキュベーシ
ョンの後、候補製薬剤のｈＳｕ（ｆｕ）シグナル伝達に対する効果を任意の便利
な方法で決定する。無細胞結合型アッセイでは、結合及び非結合成分を分離する
ための分離工程がしばしば用いられる。分離は、例えば、沈殿（例えばＴＣＡ沈
殿、免疫沈降など）、固定化（例えば、固体基体上）によってなされ、ついで洗
浄される。結合したタンパク質は、それに結合した検出可能な標識により、例え
ば放射活性放出、光学又は電子密度を測定することにより、あるいは、例えば抗
体抱合を用いて間接的な検出により検出される。 例えば、ｈＳｕ（ｆｕ）アンタゴニスト及び／又はアゴニストに適したスクリ
ーニング方法は、ｈＳｕ（ｆｕ）発現組織における候補アンタゴニスト及び／又
はアゴニストの存在下又は不存在下でのインサイツハイブリッド形成の比較、並
びにｈＳｕ（ｆｕ）変調細胞成長の不存在の確認を含む。このようなｈＳｕ（ｆ
ｕ）結合リガンドを同定するために、ｈＳｕ（ｆｕ）を細胞表面で発現させ、合
成候補化合物又は（例えば、血清又は細胞などの内因性供給源からの）天然に生
じる化合物のライブラリのスクリーニングに用いることができる。
ーニングするために、アッセイ混合物を、候補となる製薬剤の存在下であるが、
ｈＳｕ（ｆｕ）が参照活性でヘッジホッグシグナル伝達を誘発する条件下でイン
キュベートする。混合物成分は、必要なヘッジホッグ活性を与えるために任意の
順序で添加できる。インキュベーションは、最適な結合を促進する任意の温度、
典型的には４℃から４０℃、より通常は１５℃から４０℃で実施する。インキュ
ベーション時間も同様に最適結合のために選択されるが、迅速で高スループット
のスクリーニングを促進するために最小化され、典型的には約０．１から１０時
間、好ましくは５時間未満、より好ましくは２時間未満である。インキュベーシ
ョンの後、候補製薬剤のｈＳｕ（ｆｕ）シグナル伝達に対する効果を任意の便利
な方法で決定する。無細胞結合型アッセイでは、結合及び非結合成分を分離する
ための分離工程がしばしば用いられる。分離は、例えば、沈殿（例えばＴＣＡ沈
殿、免疫沈降など）、固定化（例えば、固体基体上）によってなされ、ついで洗
浄される。結合したタンパク質は、それに結合した検出可能な標識により、例え
ば放射活性放出、光学又は電子密度を測定することにより、あるいは、例えば抗
体抱合を用いて間接的な検出により検出される。 例えば、ｈＳｕ（ｆｕ）アンタゴニスト及び／又はアゴニストに適したスクリ
ーニング方法は、ｈＳｕ（ｆｕ）発現組織における候補アンタゴニスト及び／又
はアゴニストの存在下又は不存在下でのインサイツハイブリッド形成の比較、並
びにｈＳｕ（ｆｕ）変調細胞成長の不存在の確認を含む。このようなｈＳｕ（ｆ
ｕ）結合リガンドを同定するために、ｈＳｕ（ｆｕ）を細胞表面で発現させ、合
成候補化合物又は（例えば、血清又は細胞などの内因性供給源からの）天然に生
じる化合物のライブラリのスクリーニングに用いることができる。
【００７７】 ｈＳｕ（ｆｕ）のタンパク質−タンパク質相互作用に影響する好適な分子及び
その結合タンパク質は、後者の断片又は相互作用及び正しい複合体形成を阻害す
る小分子、例えばペプチド模倣物を含む。そのような小分子は、通常１０Ｋ分子
量未満であり、細胞に等価しやすいので治療薬として好適であり、種々の細胞機
構による分解を受けにくく、タンパク質のように免疫を生じやすくない。小分子
は、これらに限られないが、合成有機又は無機化合物を含む。多くの製薬会社が
、そのような分子のライブラリを有しており、それは本発明のアッセイを用いて
便利にスクリーニングできる。非限定的な例は、タンパク質、ペプチド、糖タン
パク質、グリコペプチド、糖脂質、多糖類、オリゴ糖、核酸、生物有機分子、ペ
プチド模倣物、薬理学的試薬、及びそれらの代謝物、転写及び翻訳制御配列等を
含む。 ｈＳｕ（ｆｕ）に結合する分子の同定に好ましい技術は、アッセイ用プレート
のウェルなどの固相に結合したキメラ基質（例えば、エピトープタグｈＳｕ（ｆ
ｕ）又はｈＳｕ（ｆｕ）イムノアドヘシン）を利用する。場合によっては標識さ
れた（例えば放射性標識された）候補分子の、固定化レセプターへの結合が測定
できる。あるいは、Ｇｌｉの活性化についての競合が測定できる。アンタゴニス
ト及び／又はアゴニストのスクリーニングにおいて、ｈＳｕ（ｆｕ）はｈＳｕ（
ｆｕ）基質に暴露され、ついで推定アンタゴニスト及び／又はアゴニスト、又は
ｈＳｕ（ｆｕ）結合タンパク質及びアンタゴニスト及び／又はアゴニストが同時
に添加され、アンタゴニスト及び／又はアゴニストのｈＳｕ（ｆｕ）活性化を阻
止する能力が評価される。
その結合タンパク質は、後者の断片又は相互作用及び正しい複合体形成を阻害す
る小分子、例えばペプチド模倣物を含む。そのような小分子は、通常１０Ｋ分子
量未満であり、細胞に等価しやすいので治療薬として好適であり、種々の細胞機
構による分解を受けにくく、タンパク質のように免疫を生じやすくない。小分子
は、これらに限られないが、合成有機又は無機化合物を含む。多くの製薬会社が
、そのような分子のライブラリを有しており、それは本発明のアッセイを用いて
便利にスクリーニングできる。非限定的な例は、タンパク質、ペプチド、糖タン
パク質、グリコペプチド、糖脂質、多糖類、オリゴ糖、核酸、生物有機分子、ペ
プチド模倣物、薬理学的試薬、及びそれらの代謝物、転写及び翻訳制御配列等を
含む。 ｈＳｕ（ｆｕ）に結合する分子の同定に好ましい技術は、アッセイ用プレート
のウェルなどの固相に結合したキメラ基質（例えば、エピトープタグｈＳｕ（ｆ
ｕ）又はｈＳｕ（ｆｕ）イムノアドヘシン）を利用する。場合によっては標識さ
れた（例えば放射性標識された）候補分子の、固定化レセプターへの結合が測定
できる。あるいは、Ｇｌｉの活性化についての競合が測定できる。アンタゴニス
ト及び／又はアゴニストのスクリーニングにおいて、ｈＳｕ（ｆｕ）はｈＳｕ（
ｆｕ）基質に暴露され、ついで推定アンタゴニスト及び／又はアゴニスト、又は
ｈＳｕ（ｆｕ）結合タンパク質及びアンタゴニスト及び／又はアゴニストが同時
に添加され、アンタゴニスト及び／又はアゴニストのｈＳｕ（ｆｕ）活性化を阻
止する能力が評価される。
【００７８】 ２. 検出アッセイ ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドは、ｈＳｕ（ｆｕ）ヘッジホッグシグナル伝達を
変調させる治療的活性薬のためのリード化合物を同定するアッセイにおいて有用
である。特に、腫瘍成長を生じる欠陥性ｈＳｕ（ｆｕ）の場合には、ｈＳｕ（ｆ
ｕ）シグナル伝達複合体の生成を防止するか又はｈＳｕ（ｆｕ）変調ヘッジホッ
グシグナル伝達を防止又は減弱し（例えば、ｈＳｕ（ｆｕ）自身又は基質に結合
し）−よってＧｌｉ活性をダウンレギュレーションする−リード化合物が簡便に
同定できる。特に、候補化合物を、Ｇｌｉへの結合とＧｌｉのダウンレギュレー
ションに対する活性でスクリーニングすることができる。このような候補分子は
Ｇｌｉとの結合について正常なｈＳｕ（ｆｕ）と競合すべきで、Ｇｌｉ結合に対
するｈＳｕ（ｆｕ）の破壊を測定するアッセイで容易に同定することができる。 この分野で知られた種々の方法が、本発明のｈＳｕ（ｆｕ）タンパク質の活性
阻害の同定、評価又は検定に使用できる。
変調させる治療的活性薬のためのリード化合物を同定するアッセイにおいて有用
である。特に、腫瘍成長を生じる欠陥性ｈＳｕ（ｆｕ）の場合には、ｈＳｕ（ｆ
ｕ）シグナル伝達複合体の生成を防止するか又はｈＳｕ（ｆｕ）変調ヘッジホッ
グシグナル伝達を防止又は減弱し（例えば、ｈＳｕ（ｆｕ）自身又は基質に結合
し）−よってＧｌｉ活性をダウンレギュレーションする−リード化合物が簡便に
同定できる。特に、候補化合物を、Ｇｌｉへの結合とＧｌｉのダウンレギュレー
ションに対する活性でスクリーニングすることができる。このような候補分子は
Ｇｌｉとの結合について正常なｈＳｕ（ｆｕ）と競合すべきで、Ｇｌｉ結合に対
するｈＳｕ（ｆｕ）の破壊を測定するアッセイで容易に同定することができる。 この分野で知られた種々の方法が、本発明のｈＳｕ（ｆｕ）タンパク質の活性
阻害の同定、評価又は検定に使用できる。
【００７９】 （ａ）生化学的検出技術 生化学的分析技術は種々の技術によって評価できる。本発明で使用できる一つ
の典型的なアッセイ混合物は、ｈＳｕ（ｆｕ）及び通常はｈＳｕ（ｆｕ）に付随
するタンパク質（例えばＧｌｉ）を、通常は単離された、部分的に純粋又は純粋
な形態で含有する。これらの成分の一方又は両方は、例えばアッセイ条件下でタ
ンパク質−タンパク質結合を提供又は促進し、安定性を向上させる他のペプチド
又はポリペプチドに融合してよい。さらに、成分の一方は、通常検出可能な標識
を含むかそれに結合している。標識は、放射活性、蛍光、光学又は電子密度等の
測定による直接検出、あるいはエピトープタグ、酵素等の間接的検出を提供する
。アッセイ混合物は候補製薬剤をさらに含み、場合によっては、結合を促進し、
安定性を向上させ、非特異的又はバックグラウンド相互作用を減少させ、又はア
ッセイの効率又は感度を向上させる種々の他の成分、例えば塩、バッファー、担
体タンパク質、例えばアルブミン、洗浄剤、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ
阻害剤、抗微生物剤等を含む。 以下の検出方法は、シグナル伝達基質分子及びｈＳｕ（ｆｕ）を含む細胞溶解
物が本発明の化合物と混合された無細胞系で使用できる。結果は、化合物を添加
しない反応混合物で得られた結果と比較する。無細胞系は、天然リガンド又はそ
の同定の知識を必要としない。無細胞系は、化合物を添加しない混合物を必要と
しない。無細胞系は、天然リガンド又はその同定の知識を必要としない。
の典型的なアッセイ混合物は、ｈＳｕ（ｆｕ）及び通常はｈＳｕ（ｆｕ）に付随
するタンパク質（例えばＧｌｉ）を、通常は単離された、部分的に純粋又は純粋
な形態で含有する。これらの成分の一方又は両方は、例えばアッセイ条件下でタ
ンパク質−タンパク質結合を提供又は促進し、安定性を向上させる他のペプチド
又はポリペプチドに融合してよい。さらに、成分の一方は、通常検出可能な標識
を含むかそれに結合している。標識は、放射活性、蛍光、光学又は電子密度等の
測定による直接検出、あるいはエピトープタグ、酵素等の間接的検出を提供する
。アッセイ混合物は候補製薬剤をさらに含み、場合によっては、結合を促進し、
安定性を向上させ、非特異的又はバックグラウンド相互作用を減少させ、又はア
ッセイの効率又は感度を向上させる種々の他の成分、例えば塩、バッファー、担
体タンパク質、例えばアルブミン、洗浄剤、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ
阻害剤、抗微生物剤等を含む。 以下の検出方法は、シグナル伝達基質分子及びｈＳｕ（ｆｕ）を含む細胞溶解
物が本発明の化合物と混合された無細胞系で使用できる。結果は、化合物を添加
しない反応混合物で得られた結果と比較する。無細胞系は、天然リガンド又はそ
の同定の知識を必要としない。無細胞系は、化合物を添加しない混合物を必要と
しない。無細胞系は、天然リガンド又はその同定の知識を必要としない。
【００８０】 （ｂ）生物学的検出技術 本発明のアンタゴニスト／アゴニスト化合物の、それ自身がヘッジホッグシグ
ナル伝達を変調するｈＳｕ（ｆｕ）の活性を変調させる能力は、リガンド結合に
伴う形態又は機能変化についての評点化によって測定することができる。当該分
野で知られている任意の定性的又は定量的技術を、ｈＳｕ（ｆｕ）の制御下で起
こる細胞プロセスを観察し測定するために利用できる。また、本発明の化合物の
活性は、ヘッジホッグシグナル伝達の機能不全によって生ずるか又はそれに関連
する疾患の実験的モデルを用いて動物で評価することもできる。例えば、マウス
における効果のないＤＨｈヘッジホッグシグナル伝達は、生存できるが繁殖でき
ないマウスを導く。また、変異体ｈｆｕｓｅｄ-ＤＮの効果も、ＩＨｈ発現によ
って調節される腸の発達に影響する。さらに、正しいＳＨｈシグナル伝達は、脊
索及び底板、神経管、末端肢構造、脊柱及び肋骨におけるマウス胚成長に重要で
ある。また、不正なＳＨｈシグナル伝達は単眼症に相関している。これらのフェ
ノタイプ特性の何れも、ｈＳｕ（ｆｕ）アンタゴニスト及び／又はアゴニストに
ついてのスクリーニングアッセイにおいて評価され定量化される。ヘッジホッグ
の過剰発現に伴う疾患状態は、基底細胞癌に関連するが、不活性なソニックヘッ
ジホッグシグナル伝達は、異常な神経発達に至る。 本発明の基礎は、ｈＳｕ（ｆｕ）タンパク質が生理的条件下でＧｌｉ及び／又
はＳｌｉｍｂタンパク質と複合体を形成するという驚くべき知見である。この知
見は、ｈＳｕ（ｆｕ）タンパク質がＧｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂ機能のモジュレ
ーターとなり、Ｈｈシグナル経路を変調することを示している。従って、Ｇｌｉ
及び／又はＳｌｉｍｂへのｈＳｕ（ｆｕ）の結合を阻害又は増強する薬剤の能力
を検出するアッセイは、ｈＳｕ（ｆｕ）又はＧｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂアンタ
ゴニスト又はアゴニストを同定するための薬剤バンク（例えば、化合物ライブラ
リ、ペプチドライブラリ等々）の容易な高性能スクリーニング法を提供する。こ
のようなｈＳｕ（ｆｕ）又はＧｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂアンタゴニスト及びア
ゴニストはｈＳｕ（ｆｕ）及び／又はＳｌｉｍｂ活性を変調することができ、よ
ってアポトーシスを変調できる。
ナル伝達を変調するｈＳｕ（ｆｕ）の活性を変調させる能力は、リガンド結合に
伴う形態又は機能変化についての評点化によって測定することができる。当該分
野で知られている任意の定性的又は定量的技術を、ｈＳｕ（ｆｕ）の制御下で起
こる細胞プロセスを観察し測定するために利用できる。また、本発明の化合物の
活性は、ヘッジホッグシグナル伝達の機能不全によって生ずるか又はそれに関連
する疾患の実験的モデルを用いて動物で評価することもできる。例えば、マウス
における効果のないＤＨｈヘッジホッグシグナル伝達は、生存できるが繁殖でき
ないマウスを導く。また、変異体ｈｆｕｓｅｄ-ＤＮの効果も、ＩＨｈ発現によ
って調節される腸の発達に影響する。さらに、正しいＳＨｈシグナル伝達は、脊
索及び底板、神経管、末端肢構造、脊柱及び肋骨におけるマウス胚成長に重要で
ある。また、不正なＳＨｈシグナル伝達は単眼症に相関している。これらのフェ
ノタイプ特性の何れも、ｈＳｕ（ｆｕ）アンタゴニスト及び／又はアゴニストに
ついてのスクリーニングアッセイにおいて評価され定量化される。ヘッジホッグ
の過剰発現に伴う疾患状態は、基底細胞癌に関連するが、不活性なソニックヘッ
ジホッグシグナル伝達は、異常な神経発達に至る。 本発明の基礎は、ｈＳｕ（ｆｕ）タンパク質が生理的条件下でＧｌｉ及び／又
はＳｌｉｍｂタンパク質と複合体を形成するという驚くべき知見である。この知
見は、ｈＳｕ（ｆｕ）タンパク質がＧｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂ機能のモジュレ
ーターとなり、Ｈｈシグナル経路を変調することを示している。従って、Ｇｌｉ
及び／又はＳｌｉｍｂへのｈＳｕ（ｆｕ）の結合を阻害又は増強する薬剤の能力
を検出するアッセイは、ｈＳｕ（ｆｕ）又はＧｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂアンタ
ゴニスト又はアゴニストを同定するための薬剤バンク（例えば、化合物ライブラ
リ、ペプチドライブラリ等々）の容易な高性能スクリーニング法を提供する。こ
のようなｈＳｕ（ｆｕ）又はＧｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂアンタゴニスト及びア
ゴニストはｈＳｕ（ｆｕ）及び／又はＳｌｉｍｂ活性を変調することができ、よ
ってアポトーシスを変調できる。
【００８１】 ｈＳｕ（ｆｕ）／Ｇｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂ複合体形成又はｈＳｕ（ｆｕ）
／Ｇｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂ複合体形成を特異的に阻害可能な有効量の薬剤の
患者への投与は、ｈＳｕ（ｆｕ）及び／又はＧｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂ活性を
変調することにより効果的に治療される病理状態（例えば、癌、炎症、リンパ増
殖性疾患、自己免疫疾患、神経変性疾患等々）を治療するための治療もしくは予
防方法として使用することができる。 結合アッセイは一般に二つの形態のうち一つを取る：固定化ｈＳｕ（ｆｕ）ポ
リペプチド（類）が標識Ｇｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂポリペプチド（類）を結合
するために使用されうるか、逆に、固定化されたＧｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂポ
リペプチド（類）が標識ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチド類を結合するために使用さ
れうる。あるいは、ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドが結合してｈＳｕ（ｆｕ）ポリ
ペプチドとホモ二量体を形成することを検出するために結合アッセイを実施する
ことができる；典型的には、標識ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドを水性結合条件下
で固定化ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドと接触させ、結合の度合いを固定化標識ｈ
Ｓｕ（ｆｕ）の量を測定することによって決定する。それぞれの場合、標識ポリ
ペプチドを、ポリペプチドが特異的に結合して、添加される薬剤がない状態でｈ
Ｓｕ（ｆｕ）のＧｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂとの複合体の形成が可能になる条件
下で固定化ポリペプチドに接触させる。特定の水性条件は一般的な方法に従って
実務家によって選択されうる。一般的な目安としては、次の緩衝水性条件を使用
することができる：１０−２５０ｍＭのＮａＣｌ、５−５０ｍＭトリスＨＣｌ、
ｐＨ５−８で、二価カチオン及び／又は金属キレート剤及び／又は非イオン性洗
浄剤及び／又は膜フラクションが任意に添加される。付加、欠失、修飾（例えば
ｐＨ）及び置換（例えばＮａＣｌにＫＣｌを置換又は緩衝液の置換）をこれらの
基本的条件に加えることができることは当業者により理解されるであろう。ｈＳ
ｕ（ｆｕ）ポリペプチド（類）のＧｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂポリペプチドに対
する特異的結合がコントロール反応において生じる限り、基礎的結合反応条件に
修飾を行うことができる。ある実施態様では、アッセイがｈＳｕ（ｆｕ）／ｈＳ
ｕ（ｆｕ）ホモ二量体の形成を検出する場合、ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドのｈ
Ｓｕ（ｆｕ）ポリペプチドに対する特異的結合がコントロール反応において生じ
る限り、基礎的結合反応条件に修飾を行うことができる。コントロール反応（薬
剤を含まず）において特異的結合を生じない条件は結合アッセイでの使用には適
していない。予め決められたポリペプチド配列に結合するポリペプチド配列を同
定するアプローチは、その予め決められたポリペプチド配列が融合タンパク質に
存在しているいわゆる「ツーハイブリッド(two-hybrid)」系を使用することであ
る（Chien等, (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88:9578）。このアプロー
チは転写活性化因子、酵母Ｇａ１４転写タンパク質の再構成を通して（Fields S
及びSong O (1989) Nature 340:245）インビボでのタンパク質間相互作用を同定
する。典型的には、該方法は、ＤＮＡ-結合と転写活性化の役割を担う分離可能
なドメインからなる酵母Ｇａｌ４転写タンパク質の特性に基づく。一つが既知の
タンパク質のポリペプチド配列に融合した酵母Ｇａｌ４ ＤＮＡ-結合ドメインか
らなり、他方が第二のタンパク質のポリペプチド配列に融合したＧａｌ４活性化
ドメインからなる二つのハイブリッドタンパク質をコードするポリヌクレオチド
を作成し、酵母宿主細胞中に導入する。二つの融合タンパク質間の分子間結合が
、Ｇａｌ４活性化ドメインを持つＧａｌ４ ＤＮＡ-結合ドメインを再構成し、こ
れがＧａｌ４結合部位に作用可能に結合したレポーター遺伝子（例えば、ｌａｃ
Ｚ、ＨＩＳ３）の転写活性化に至る。典型的には、ツーハイブリッド法は、既知
のタンパク質と相互作用をする新規なポリペプチド配列を同定するために使用さ
れる（Silver S C及びHunt S W (1993) Mol. Biol. Rep. 17:155；Durfee等 (19
93) Genes Devel. 7;555；Yang等 (1992) Science 257:680；Luban等 (1993) Ce
ll 73: 1067；Hardy等 (1992) Genes Devel. 6; 801；Bartel等 (1993) Biotech
nipues 14:920；及びVojtek等(1993) Cell 74:205）。しかし、ツーハイブリッ
ド法の変形法は第二の既知のタンパク質への結合に影響を及ぼす既知のタンパク
質の突然変異を同定するために使用されている（Li B及びFields S(1993) FASEB
J. 7:957；Lalo等 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 90: 5524；Jackson
等 (1993) Mol. Cell. Biol. 13; 2899；及びMadura等(1993) J. Biol. Chem. 2
68: 12046）。ツーハイブリッド法はまた二つの既知のタンパク質の相互作用し
ている構造ドメイン（Bardwell等 (1993) med. Microbiol. 8: 1177；Chakrabor
ty等 (1992) J. Biol. Chem. 267: 17498；Staudinger等 (1993) J. Biol. Chem
. 268: 4608；及びMilne GT及びWeaver DT (1993) Genes Devel. 7; 1755）又は
単一のタンパク質のオリゴマー形成の役割を担うドメイン（Iwabuchi等 (1993)
Oncogene 8; 1693；Bogerd等 (1993) J. Virol. 67: 5030）を同定するために使
用されている。ツーハイブリッド系の変形系はタンパク質分解酵素のインビボ活
性を研究するために使用されている（Dasmahapatra等(1992) Proc. Natl. Acad.
Sci. (USA) 89: 4159）。あるいは、大腸菌／ＢＣＣＰ相互作用的スクリーニン
グ系（Germino等 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A) 90: 933；Guarente
L (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A) 90: 1639）を用いて相互作用するタ
ンパク質配列（すなわち、ヘテロ二量体化するか又はより高次のヘテロ多量体を
形成するタンパク質配列）を同定することができる。
／Ｇｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂ複合体形成を特異的に阻害可能な有効量の薬剤の
患者への投与は、ｈＳｕ（ｆｕ）及び／又はＧｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂ活性を
変調することにより効果的に治療される病理状態（例えば、癌、炎症、リンパ増
殖性疾患、自己免疫疾患、神経変性疾患等々）を治療するための治療もしくは予
防方法として使用することができる。 結合アッセイは一般に二つの形態のうち一つを取る：固定化ｈＳｕ（ｆｕ）ポ
リペプチド（類）が標識Ｇｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂポリペプチド（類）を結合
するために使用されうるか、逆に、固定化されたＧｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂポ
リペプチド（類）が標識ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチド類を結合するために使用さ
れうる。あるいは、ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドが結合してｈＳｕ（ｆｕ）ポリ
ペプチドとホモ二量体を形成することを検出するために結合アッセイを実施する
ことができる；典型的には、標識ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドを水性結合条件下
で固定化ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドと接触させ、結合の度合いを固定化標識ｈ
Ｓｕ（ｆｕ）の量を測定することによって決定する。それぞれの場合、標識ポリ
ペプチドを、ポリペプチドが特異的に結合して、添加される薬剤がない状態でｈ
Ｓｕ（ｆｕ）のＧｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂとの複合体の形成が可能になる条件
下で固定化ポリペプチドに接触させる。特定の水性条件は一般的な方法に従って
実務家によって選択されうる。一般的な目安としては、次の緩衝水性条件を使用
することができる：１０−２５０ｍＭのＮａＣｌ、５−５０ｍＭトリスＨＣｌ、
ｐＨ５−８で、二価カチオン及び／又は金属キレート剤及び／又は非イオン性洗
浄剤及び／又は膜フラクションが任意に添加される。付加、欠失、修飾（例えば
ｐＨ）及び置換（例えばＮａＣｌにＫＣｌを置換又は緩衝液の置換）をこれらの
基本的条件に加えることができることは当業者により理解されるであろう。ｈＳ
ｕ（ｆｕ）ポリペプチド（類）のＧｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂポリペプチドに対
する特異的結合がコントロール反応において生じる限り、基礎的結合反応条件に
修飾を行うことができる。ある実施態様では、アッセイがｈＳｕ（ｆｕ）／ｈＳ
ｕ（ｆｕ）ホモ二量体の形成を検出する場合、ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドのｈ
Ｓｕ（ｆｕ）ポリペプチドに対する特異的結合がコントロール反応において生じ
る限り、基礎的結合反応条件に修飾を行うことができる。コントロール反応（薬
剤を含まず）において特異的結合を生じない条件は結合アッセイでの使用には適
していない。予め決められたポリペプチド配列に結合するポリペプチド配列を同
定するアプローチは、その予め決められたポリペプチド配列が融合タンパク質に
存在しているいわゆる「ツーハイブリッド(two-hybrid)」系を使用することであ
る（Chien等, (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88:9578）。このアプロー
チは転写活性化因子、酵母Ｇａ１４転写タンパク質の再構成を通して（Fields S
及びSong O (1989) Nature 340:245）インビボでのタンパク質間相互作用を同定
する。典型的には、該方法は、ＤＮＡ-結合と転写活性化の役割を担う分離可能
なドメインからなる酵母Ｇａｌ４転写タンパク質の特性に基づく。一つが既知の
タンパク質のポリペプチド配列に融合した酵母Ｇａｌ４ ＤＮＡ-結合ドメインか
らなり、他方が第二のタンパク質のポリペプチド配列に融合したＧａｌ４活性化
ドメインからなる二つのハイブリッドタンパク質をコードするポリヌクレオチド
を作成し、酵母宿主細胞中に導入する。二つの融合タンパク質間の分子間結合が
、Ｇａｌ４活性化ドメインを持つＧａｌ４ ＤＮＡ-結合ドメインを再構成し、こ
れがＧａｌ４結合部位に作用可能に結合したレポーター遺伝子（例えば、ｌａｃ
Ｚ、ＨＩＳ３）の転写活性化に至る。典型的には、ツーハイブリッド法は、既知
のタンパク質と相互作用をする新規なポリペプチド配列を同定するために使用さ
れる（Silver S C及びHunt S W (1993) Mol. Biol. Rep. 17:155；Durfee等 (19
93) Genes Devel. 7;555；Yang等 (1992) Science 257:680；Luban等 (1993) Ce
ll 73: 1067；Hardy等 (1992) Genes Devel. 6; 801；Bartel等 (1993) Biotech
nipues 14:920；及びVojtek等(1993) Cell 74:205）。しかし、ツーハイブリッ
ド法の変形法は第二の既知のタンパク質への結合に影響を及ぼす既知のタンパク
質の突然変異を同定するために使用されている（Li B及びFields S(1993) FASEB
J. 7:957；Lalo等 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 90: 5524；Jackson
等 (1993) Mol. Cell. Biol. 13; 2899；及びMadura等(1993) J. Biol. Chem. 2
68: 12046）。ツーハイブリッド法はまた二つの既知のタンパク質の相互作用し
ている構造ドメイン（Bardwell等 (1993) med. Microbiol. 8: 1177；Chakrabor
ty等 (1992) J. Biol. Chem. 267: 17498；Staudinger等 (1993) J. Biol. Chem
. 268: 4608；及びMilne GT及びWeaver DT (1993) Genes Devel. 7; 1755）又は
単一のタンパク質のオリゴマー形成の役割を担うドメイン（Iwabuchi等 (1993)
Oncogene 8; 1693；Bogerd等 (1993) J. Virol. 67: 5030）を同定するために使
用されている。ツーハイブリッド系の変形系はタンパク質分解酵素のインビボ活
性を研究するために使用されている（Dasmahapatra等(1992) Proc. Natl. Acad.
Sci. (USA) 89: 4159）。あるいは、大腸菌／ＢＣＣＰ相互作用的スクリーニン
グ系（Germino等 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A) 90: 933；Guarente
L (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A) 90: 1639）を用いて相互作用するタ
ンパク質配列（すなわち、ヘテロ二量体化するか又はより高次のヘテロ多量体を
形成するタンパク質配列）を同定することができる。
【００８２】 これらのツーハイブリッド法の各々は二つのＧａｌ４融合タンパク質間のポジ
ティブな会合に依存し、もって機能性Ｇａｌ４転写活性化因子を再構成し、これ
がついでＧａｌ４結合部位に作用可能に結合したレポーター遺伝子の転写を誘発
する。レポーター遺伝子の転写は、（１）熱量酵素アッセイにより同定できる酵
素活性（例えば、β-ガラクトシダーゼ）としてか、（２）決まった媒質上の向
上した細胞成長（例えば、ＨＩＳ３）として典型的には現れるポジティブな読み
出しをつくる。ポジティブな読み出し条件は一般には次の検出可能な条件の一又
は複数として特定される：（１）予め決められたレポーター遺伝子の転写速度の
増加、（２）典型的には、インビボで容易にアッセイできる酵素のような、予め
決められたレポーター遺伝子によりコードされるポリペプチド産物の濃度の増加
又は豊富さ、及び／又は（３）逆ツーハイブリッド系を有する生物（例えば酵母
）における選択可能な又は他の同定可能なフェノタイプの変化。一般には、ポジ
ティブな読み出し条件を特徴づける選択可能な又は他の同定可能なフェノタイプ
の変化が生物体に、決まった媒質への選択性成長効果、接合フェノタイプ、特徴
ある形態又は発達段階、薬物耐性、又は検出可能な酵素活性（例えば、β-ガラ
クトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ等々）を付与する。転
写活性化因子は特異的遺伝子の発現をポジティブに調節するタンパク質である。
それらは、特異的ＤＮＡ配列に結合して特異性を付与する一つの領域と、基本遺
伝子発現機構のタンパク質成分に結合する活性化ドメインと称される他の領域の
二つの構造ドメインに機能的に分割できる（Ma及びPtashne (1988) Cell 55:443
）。これらの二つのドメインは転写活性化因子として機能するためには物理的に
連結される必要がある。ツーハイブリッド系は、単離されたＤＮＡ結合ドメイン
を一タンパク質（タンパク質Ｘ）につなぎながら、単離された活性化ドメインを
他のタンパク質（タンパク質Ｙ）につなぐことにより、この知見を利用する。Ｘ
とＹが有意な程度に相互作用するとき、ＤＮＡ結合及び活性化ドメインが今度は
連結され転写活性化因子の機能が再構成される（Fields及びSong (1989) Nature
340: 245）。酵母宿主株は、再構成された転写活性化因子がＨＩＳ３又はｌａ
ｃＺのような特定のレポーター遺伝子を発現させるように操作され、これがタン
パク質間の相互作用の読み出しをもたらす（上掲のField及びSong (1989)；上掲
のChien等 (1991)）。タンパク質間相互作用を監視するためのツーハイブリッド系の一つの
利点は物理的に弱いが生理的に重要なタンパク質間相互作用の検出の感度である
。しかして、これは、タンパク質間相互作用を検出するための他の方法に対して
顕著な利点を提供する。
ティブな会合に依存し、もって機能性Ｇａｌ４転写活性化因子を再構成し、これ
がついでＧａｌ４結合部位に作用可能に結合したレポーター遺伝子の転写を誘発
する。レポーター遺伝子の転写は、（１）熱量酵素アッセイにより同定できる酵
素活性（例えば、β-ガラクトシダーゼ）としてか、（２）決まった媒質上の向
上した細胞成長（例えば、ＨＩＳ３）として典型的には現れるポジティブな読み
出しをつくる。ポジティブな読み出し条件は一般には次の検出可能な条件の一又
は複数として特定される：（１）予め決められたレポーター遺伝子の転写速度の
増加、（２）典型的には、インビボで容易にアッセイできる酵素のような、予め
決められたレポーター遺伝子によりコードされるポリペプチド産物の濃度の増加
又は豊富さ、及び／又は（３）逆ツーハイブリッド系を有する生物（例えば酵母
）における選択可能な又は他の同定可能なフェノタイプの変化。一般には、ポジ
ティブな読み出し条件を特徴づける選択可能な又は他の同定可能なフェノタイプ
の変化が生物体に、決まった媒質への選択性成長効果、接合フェノタイプ、特徴
ある形態又は発達段階、薬物耐性、又は検出可能な酵素活性（例えば、β-ガラ
クトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ等々）を付与する。転
写活性化因子は特異的遺伝子の発現をポジティブに調節するタンパク質である。
それらは、特異的ＤＮＡ配列に結合して特異性を付与する一つの領域と、基本遺
伝子発現機構のタンパク質成分に結合する活性化ドメインと称される他の領域の
二つの構造ドメインに機能的に分割できる（Ma及びPtashne (1988) Cell 55:443
）。これらの二つのドメインは転写活性化因子として機能するためには物理的に
連結される必要がある。ツーハイブリッド系は、単離されたＤＮＡ結合ドメイン
を一タンパク質（タンパク質Ｘ）につなぎながら、単離された活性化ドメインを
他のタンパク質（タンパク質Ｙ）につなぐことにより、この知見を利用する。Ｘ
とＹが有意な程度に相互作用するとき、ＤＮＡ結合及び活性化ドメインが今度は
連結され転写活性化因子の機能が再構成される（Fields及びSong (1989) Nature
340: 245）。酵母宿主株は、再構成された転写活性化因子がＨＩＳ３又はｌａ
ｃＺのような特定のレポーター遺伝子を発現させるように操作され、これがタン
パク質間の相互作用の読み出しをもたらす（上掲のField及びSong (1989)；上掲
のChien等 (1991)）。タンパク質間相互作用を監視するためのツーハイブリッド系の一つの
利点は物理的に弱いが生理的に重要なタンパク質間相互作用の検出の感度である
。しかして、これは、タンパク質間相互作用を検出するための他の方法に対して
顕著な利点を提供する。
【００８３】 本発明は、典型的には第一のハイブリッドタンパク質、第二のハイブリッドタ
ンパク質、及びレポーター遺伝子をコードするポリヌクレオチドの形態のｈＳｕ
（ｆｕ）関連タンパク質ツーハイブリッド系を有する宿主生物体（典型的には単
細胞生物）をまた提供し、ここで、上記ポリヌクレオチドは一過性発現のために
導入されるか安定に複製される。ある実施態様では、宿主生物は酵母細胞（例え
ば、サッカロミセス・セレビシエ）であり、そこでは、レポーター遺伝子転写調
節配列がＧａｌ４応答性プロモーターを含む。（１）ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチ
ドに結合可能なＧｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂの結合断片に融合したＧＡＬ４ Ｄ
ＮＡ結合ドメイン（又はＧＡＬ４活性化ドメイン）をコードする発現カセット、
（２）Ｇｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂポリペプチドに結合可能なｈＳｕ（ｆｕ）の
結合断片に融合したＧＡＬ４ ＤＮＡ活性化ドメイン（又はそれぞれＧＡＬ４結
合ドメイン）をコードする発現カセット、及び（３）シス結合ＧＡＬ４転写応答
要素を含むレポーター遺伝子（β-ガラクトシダーゼ）を含む酵母を薬剤スクリ
ーニングに使用することができる。このような酵母は試験薬剤と共にインキュベ
ートされ、レポーター遺伝子（例えば、β-ガラクトシダーゼ）の発現が決定さ
れる；対照培養物と比較してレポーター遺伝子の発現を阻害する薬剤の能力は、
候補Ｇｌｉ調節薬剤又はｈＳｕ（ｆｕ）調節薬剤として薬剤を同定する。酵母ツ
ーハイブリッド系を用いて哺乳動物（典型的にはヒト）ｃＤＮＡ発現ライブラリ
をスクリーニングすることができ、そこでは、ｃＤＮＡがＧＡＬ４ ＤＮＡ結合
ドメイン又は活性化ドメインに融合し、ｈＳｕ（ｆｕ）又はＧｌｉ及び／又はＳ
ｌｉｍｂポリペプチド配列の何れかはＧＡＬ４活性化ドメイン又はＤＮＡ結合ド
メインにそれぞれ融合される。このような酵母ツーハイブリッド系はｈＳｕ（ｆ
ｕ）又はＧｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂ配列に結合するタンパク質をコードするｃ
ＤＮＡをスクリーニングすることができる。例えば、ＤＮＡライブラリを、ヒト
成熟Ｂ細胞（Namalwa）系統（Ambrus等, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.
A)）又は他の適切な細胞型からのｍＲＮＡからつくり出すことができる。酵母ツ
ーハイブリッド発現系（Chien等, (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A)88:9
578）においてクローニングされたこのようなｃＤＮＡライブラリを、ｈＳｕ（
ｆｕ）又はＧｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂと相互作用するタンパク質をコードし、
それによってＧＡＬ４-依存性レポーター遺伝子の発現を生じるｃＤＮＡｓを同
定するために使用することができる。ｈＳｕ（ｆｕ）又はＧｌｉ及び／又はＳｌ
ｉｍｂと相互作用するポリペプチドは、また、抗体と共にｈＳｕ（ｆｕ）又はＧ
ｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂの免疫沈降と共沈種の同定によって同定することがで
きる。更に、ｈＳｕ（ｆｕ）又はＧｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂと結合するポリペ
プチドを、ｈＳｕ（ｆｕ）又はＧｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂポリペプチドでペプ
チドライブラリ（例えば、バクテリオファージペプチドディスプレイライブラリ
、空間的に定まったＶＬＳＩＰＳペプチドアレイ等々）をスクリーニングするこ
とによって同定することができる。
ンパク質、及びレポーター遺伝子をコードするポリヌクレオチドの形態のｈＳｕ
（ｆｕ）関連タンパク質ツーハイブリッド系を有する宿主生物体（典型的には単
細胞生物）をまた提供し、ここで、上記ポリヌクレオチドは一過性発現のために
導入されるか安定に複製される。ある実施態様では、宿主生物は酵母細胞（例え
ば、サッカロミセス・セレビシエ）であり、そこでは、レポーター遺伝子転写調
節配列がＧａｌ４応答性プロモーターを含む。（１）ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチ
ドに結合可能なＧｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂの結合断片に融合したＧＡＬ４ Ｄ
ＮＡ結合ドメイン（又はＧＡＬ４活性化ドメイン）をコードする発現カセット、
（２）Ｇｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂポリペプチドに結合可能なｈＳｕ（ｆｕ）の
結合断片に融合したＧＡＬ４ ＤＮＡ活性化ドメイン（又はそれぞれＧＡＬ４結
合ドメイン）をコードする発現カセット、及び（３）シス結合ＧＡＬ４転写応答
要素を含むレポーター遺伝子（β-ガラクトシダーゼ）を含む酵母を薬剤スクリ
ーニングに使用することができる。このような酵母は試験薬剤と共にインキュベ
ートされ、レポーター遺伝子（例えば、β-ガラクトシダーゼ）の発現が決定さ
れる；対照培養物と比較してレポーター遺伝子の発現を阻害する薬剤の能力は、
候補Ｇｌｉ調節薬剤又はｈＳｕ（ｆｕ）調節薬剤として薬剤を同定する。酵母ツ
ーハイブリッド系を用いて哺乳動物（典型的にはヒト）ｃＤＮＡ発現ライブラリ
をスクリーニングすることができ、そこでは、ｃＤＮＡがＧＡＬ４ ＤＮＡ結合
ドメイン又は活性化ドメインに融合し、ｈＳｕ（ｆｕ）又はＧｌｉ及び／又はＳ
ｌｉｍｂポリペプチド配列の何れかはＧＡＬ４活性化ドメイン又はＤＮＡ結合ド
メインにそれぞれ融合される。このような酵母ツーハイブリッド系はｈＳｕ（ｆ
ｕ）又はＧｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂ配列に結合するタンパク質をコードするｃ
ＤＮＡをスクリーニングすることができる。例えば、ＤＮＡライブラリを、ヒト
成熟Ｂ細胞（Namalwa）系統（Ambrus等, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.
A)）又は他の適切な細胞型からのｍＲＮＡからつくり出すことができる。酵母ツ
ーハイブリッド発現系（Chien等, (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A)88:9
578）においてクローニングされたこのようなｃＤＮＡライブラリを、ｈＳｕ（
ｆｕ）又はＧｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂと相互作用するタンパク質をコードし、
それによってＧＡＬ４-依存性レポーター遺伝子の発現を生じるｃＤＮＡｓを同
定するために使用することができる。ｈＳｕ（ｆｕ）又はＧｌｉ及び／又はＳｌ
ｉｍｂと相互作用するポリペプチドは、また、抗体と共にｈＳｕ（ｆｕ）又はＧ
ｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂの免疫沈降と共沈種の同定によって同定することがで
きる。更に、ｈＳｕ（ｆｕ）又はＧｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂと結合するポリペ
プチドを、ｈＳｕ（ｆｕ）又はＧｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂポリペプチドでペプ
チドライブラリ（例えば、バクテリオファージペプチドディスプレイライブラリ
、空間的に定まったＶＬＳＩＰＳペプチドアレイ等々）をスクリーニングするこ
とによって同定することができる。
【００８４】 本発明は（１）第一のｈＳｕ（ｆｕ）関連ポリペプチドと転写活性化因子活性
化ドメインを含む第一のハイブリッドタンパク質、（２）第二のｈＳｕ（ｆｕ）
関連ポリペプチドと転写活性化因子ＤＮＡ-結合ドメインを含む第二のハイブリ
ッドタンパク質を有するツーハイブリッド系、宿主細胞、及び指示マニュアルを
含んでなるキットをまた提供する。このようなキットは第一及び第二ハイブリッ
ドタンパク質間の分子間結合を変える能力を試験する薬剤パネルを任意に含んで
もよい。 これらの細胞培養アッセイ及び動物実験で得られたデータは、ヒトで使用する
ための用量範囲の処方に用いられる。本発明の化合物の用量は、毒性を殆ど又は
全く持たない循環濃度の範囲内になければならない。用量は、用いる投与形態と
投与経路に依存してこの範囲内で変わりうる。
化ドメインを含む第一のハイブリッドタンパク質、（２）第二のｈＳｕ（ｆｕ）
関連ポリペプチドと転写活性化因子ＤＮＡ-結合ドメインを含む第二のハイブリ
ッドタンパク質を有するツーハイブリッド系、宿主細胞、及び指示マニュアルを
含んでなるキットをまた提供する。このようなキットは第一及び第二ハイブリッ
ドタンパク質間の分子間結合を変える能力を試験する薬剤パネルを任意に含んで
もよい。 これらの細胞培養アッセイ及び動物実験で得られたデータは、ヒトで使用する
ための用量範囲の処方に用いられる。本発明の化合物の用量は、毒性を殆ど又は
全く持たない循環濃度の範囲内になければならない。用量は、用いる投与形態と
投与経路に依存してこの範囲内で変わりうる。
【００８５】 ３．アンチセンスヌクレオチド アンタゴニストの他の好ましい部類は遺伝子治療技術の使用を含み、アンチセ
ンスヌクレオチドの投与を含む。適用可能な遺伝子治療技術は、治療的に有効な
ＤＮＡ又はｍＲＮＡの一回又は複数回投与を含む。アンチセンスＲＮＡ及びＤＮ
Ａは、インビボでの或る種の遺伝子の発現を阻止するための治療薬として使用で
きる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に移入でき、それらは、細胞
膜による制限された取り込みによって引き起こされる低い細胞内濃度にも関わら
ず、阻害剤として作用する、Zamecnik等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 414
3-4146 (1986)。オリゴヌクレオチドは、例えば負に荷電したホスホジエステル
基を不荷電基で置換することにより、それらの取り込みを促進させるように修飾
することができる。 生存細胞に核酸を導入するために知られた種々の技術がある。該技術は、核酸
がインビトロ、エキソビボ、又はインビトロで培養された細胞に、又はインビボ
で対象とする宿主の細胞に移されるかに応じて変わる。インビトロで哺乳動物細
胞に核酸を移行するのに適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、
マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシ
ウム沈殿法などの使用を含む。現在好ましいインビボ遺伝子移行技術は、ウイル
ス（典型的にはレトロウイルス）ベクターでの形質移入及びウイルスコートタン
パク質−リポソーム媒介形質移入を含む、Dzau等, Trends Biotech. 11: 205-21
0 (1993)。幾つかの状況では、核酸供給源に標的細胞をターゲティングする試薬
を提供するのが好ましく、例えば、エンドサイトーシスを伴う細胞表面膜タンパ
ク質に特異的な抗体をターゲティング及び／又は取り込みの促進のために用いて
もよく、例えば、特定の細胞型向性のカプシドタンパク質又はその断片、サイク
リングで内部移行を受けるタンパク質の抗体、及び細胞内局在化をターゲティン
グし細胞内半減期を向上させるタンパク質である。レセプター媒介エンドサイト
ーシスの技術は、例えば、Wu等, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432 (1987); Wagner等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3410-3414 (19
90)に記載されている。既知の遺伝子標識及び遺伝子治療プロトコールのレビュ
ーについては、Anderson等, Science 256: 808-813 (1992)を参照のこと。 一実施態様では、ｈＳｕ（ｆｕ）アンタゴニスト及び／又はアゴニスト分子は
細胞の内因性リガンドに結合するのに用いることができ、それにより、特に細胞
内のｈＳｕ（ｆｕ）のレベルが正常な生理的レベルを越える場合、細胞をｈＳｕ
（ｆｕ）野生型に非応答性とする。また、内因性ｈＳｕ（ｆｕ）基質、又は望ま
しくない細胞反応（腫瘍細胞の増殖など）を活性化する複合体形成剤に結合する
のが有利であろう。 本発明の更なる実施態様では、ｈＳｕ（ｆｕ）発現は、ｈＳｕ（ｆｕ）タンパ
ク質の発現を低下させるのに有効な量のｈＳｕ（ｆｕ）アンチセンスＲＮＡ又は
ＤＮＡをｈＳｕ（ｆｕ）発現細胞に提供することにより低下させうる。
ンスヌクレオチドの投与を含む。適用可能な遺伝子治療技術は、治療的に有効な
ＤＮＡ又はｍＲＮＡの一回又は複数回投与を含む。アンチセンスＲＮＡ及びＤＮ
Ａは、インビボでの或る種の遺伝子の発現を阻止するための治療薬として使用で
きる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に移入でき、それらは、細胞
膜による制限された取り込みによって引き起こされる低い細胞内濃度にも関わら
ず、阻害剤として作用する、Zamecnik等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 414
3-4146 (1986)。オリゴヌクレオチドは、例えば負に荷電したホスホジエステル
基を不荷電基で置換することにより、それらの取り込みを促進させるように修飾
することができる。 生存細胞に核酸を導入するために知られた種々の技術がある。該技術は、核酸
がインビトロ、エキソビボ、又はインビトロで培養された細胞に、又はインビボ
で対象とする宿主の細胞に移されるかに応じて変わる。インビトロで哺乳動物細
胞に核酸を移行するのに適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、
マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシ
ウム沈殿法などの使用を含む。現在好ましいインビボ遺伝子移行技術は、ウイル
ス（典型的にはレトロウイルス）ベクターでの形質移入及びウイルスコートタン
パク質−リポソーム媒介形質移入を含む、Dzau等, Trends Biotech. 11: 205-21
0 (1993)。幾つかの状況では、核酸供給源に標的細胞をターゲティングする試薬
を提供するのが好ましく、例えば、エンドサイトーシスを伴う細胞表面膜タンパ
ク質に特異的な抗体をターゲティング及び／又は取り込みの促進のために用いて
もよく、例えば、特定の細胞型向性のカプシドタンパク質又はその断片、サイク
リングで内部移行を受けるタンパク質の抗体、及び細胞内局在化をターゲティン
グし細胞内半減期を向上させるタンパク質である。レセプター媒介エンドサイト
ーシスの技術は、例えば、Wu等, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432 (1987); Wagner等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3410-3414 (19
90)に記載されている。既知の遺伝子標識及び遺伝子治療プロトコールのレビュ
ーについては、Anderson等, Science 256: 808-813 (1992)を参照のこと。 一実施態様では、ｈＳｕ（ｆｕ）アンタゴニスト及び／又はアゴニスト分子は
細胞の内因性リガンドに結合するのに用いることができ、それにより、特に細胞
内のｈＳｕ（ｆｕ）のレベルが正常な生理的レベルを越える場合、細胞をｈＳｕ
（ｆｕ）野生型に非応答性とする。また、内因性ｈＳｕ（ｆｕ）基質、又は望ま
しくない細胞反応（腫瘍細胞の増殖など）を活性化する複合体形成剤に結合する
のが有利であろう。 本発明の更なる実施態様では、ｈＳｕ（ｆｕ）発現は、ｈＳｕ（ｆｕ）タンパ
ク質の発現を低下させるのに有効な量のｈＳｕ（ｆｕ）アンチセンスＲＮＡ又は
ＤＮＡをｈＳｕ（ｆｕ）発現細胞に提供することにより低下させうる。
【００８６】 腫瘍形成ｈＳｕ（ｆｕ）遺伝子、例えば本発明の遺伝子配列を使用して容易に
同定され単離される腫瘍抑制活性に欠陥のある変異体遺伝子に特異的なアンチセ
ンス分子を用いて、ｈＳｕ（ｆｕ）関連腫瘍が疑われるか有していることが示さ
れた細胞における発現をダウンレギュレートする。アンチセンス分子の投与は腫
瘍形成ｈＳｕ（ｆｕ）活性を減少させる効果を有している。アンチセンス配列は
標的とされる欠陥性ｈＳｕ（ｆｕ）遺伝子のｍＲＮＡに相補的であり、標的遺伝
子産物の発現を阻害する。 アンチセンス分子は合成オリゴヌクレオチドでありうる。そのようなアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドは一般に少なくとも約７、通常は少なくとも約１２、よ
り通常は少なくとも約２０のヌクレオチド長で、約５００以下、通常は約５０以
下、より通常は約３５ヌクレオチド長以下であり、ここで長さは交差反応性の不
存在を含む特異性、阻害効果等々により支配される。７から８の塩基長の短いオ
リゴヌクレオチドは遺伝子発現の強い選択的な阻害剤となりうることが見いださ
れた（Wagner等, Nature Biotechnology 14:840-844(1996)を参照）。内在性有
意鎖ｍＲＮＡ配列の特異的領域又は領域群は、好ましくはｈＳｕ（ｆｕ）突然変
異を包含するアンチセンス配列により補完されるように選択される。インビトロ
か動物モデルでの標的遺伝子の発現の阻害について候補配列をアッセイする。配
列の組み合わせもまた使用でき、そこではｍＲＮＡ配列の幾つかの領域がアンチ
センス相補性に対して選択される。アンチセンス分子及び／又は他の阻害薬剤が
、進入を可能にする条件下で腫瘍細胞と接触させることによって投与される。該
分子は、例えばリポソーム懸濁液のような、溶液又は投与のための任意の他の薬
理学的に好適な形態で提供されうる。細胞による核酸の取り込みを向上させるた
めの当該分野で既知の多くの送達方法が存在する。有用な送達系は、センダイウ
ィルス-リポソーム送達系（Rapaport及びShai J. Biol. Chem. 269:15124-15131
(1994)を参照）、カチオン性リポソーム、ポリマー送達ゲル又はマトリックス、
多孔性気球カテーテル（Shi等, Circulation 90:955-951(1994)；及びShi等, Ge
ne Therapy 1:408-414(1994)）、レトロウィルス発現ベクター等々を含む。送達
ビヒクルとしてのリポソームの使用は興味ある方法の一つである。リポソームは
標的部位の細胞と融合し、細胞内腔の内容物を細胞内に送達する。リポソームは
、接触を維持する種々の手段、例えば隔離、結合剤等々を使用して、融合に十分
な時間の間、細胞との接触が維持される。リポソームは、センダイウィルス又は
インフルエンザウィルス等々のような膜の融合を媒介する精製タンパク質又はペ
プチドで調製されうる。脂質は、例えばホスファチジルコリンのようなカチオン
性脂質を含む既知のリポソーム形成脂質の任意の有用な組み合わせでありうる。
残りの脂質は通常は中性脂質、例えばコレステロール、ホスファチジルセリン、
ホスファチジルグリセロール等々である。
同定され単離される腫瘍抑制活性に欠陥のある変異体遺伝子に特異的なアンチセ
ンス分子を用いて、ｈＳｕ（ｆｕ）関連腫瘍が疑われるか有していることが示さ
れた細胞における発現をダウンレギュレートする。アンチセンス分子の投与は腫
瘍形成ｈＳｕ（ｆｕ）活性を減少させる効果を有している。アンチセンス配列は
標的とされる欠陥性ｈＳｕ（ｆｕ）遺伝子のｍＲＮＡに相補的であり、標的遺伝
子産物の発現を阻害する。 アンチセンス分子は合成オリゴヌクレオチドでありうる。そのようなアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドは一般に少なくとも約７、通常は少なくとも約１２、よ
り通常は少なくとも約２０のヌクレオチド長で、約５００以下、通常は約５０以
下、より通常は約３５ヌクレオチド長以下であり、ここで長さは交差反応性の不
存在を含む特異性、阻害効果等々により支配される。７から８の塩基長の短いオ
リゴヌクレオチドは遺伝子発現の強い選択的な阻害剤となりうることが見いださ
れた（Wagner等, Nature Biotechnology 14:840-844(1996)を参照）。内在性有
意鎖ｍＲＮＡ配列の特異的領域又は領域群は、好ましくはｈＳｕ（ｆｕ）突然変
異を包含するアンチセンス配列により補完されるように選択される。インビトロ
か動物モデルでの標的遺伝子の発現の阻害について候補配列をアッセイする。配
列の組み合わせもまた使用でき、そこではｍＲＮＡ配列の幾つかの領域がアンチ
センス相補性に対して選択される。アンチセンス分子及び／又は他の阻害薬剤が
、進入を可能にする条件下で腫瘍細胞と接触させることによって投与される。該
分子は、例えばリポソーム懸濁液のような、溶液又は投与のための任意の他の薬
理学的に好適な形態で提供されうる。細胞による核酸の取り込みを向上させるた
めの当該分野で既知の多くの送達方法が存在する。有用な送達系は、センダイウ
ィルス-リポソーム送達系（Rapaport及びShai J. Biol. Chem. 269:15124-15131
(1994)を参照）、カチオン性リポソーム、ポリマー送達ゲル又はマトリックス、
多孔性気球カテーテル（Shi等, Circulation 90:955-951(1994)；及びShi等, Ge
ne Therapy 1:408-414(1994)）、レトロウィルス発現ベクター等々を含む。送達
ビヒクルとしてのリポソームの使用は興味ある方法の一つである。リポソームは
標的部位の細胞と融合し、細胞内腔の内容物を細胞内に送達する。リポソームは
、接触を維持する種々の手段、例えば隔離、結合剤等々を使用して、融合に十分
な時間の間、細胞との接触が維持される。リポソームは、センダイウィルス又は
インフルエンザウィルス等々のような膜の融合を媒介する精製タンパク質又はペ
プチドで調製されうる。脂質は、例えばホスファチジルコリンのようなカチオン
性脂質を含む既知のリポソーム形成脂質の任意の有用な組み合わせでありうる。
残りの脂質は通常は中性脂質、例えばコレステロール、ホスファチジルセリン、
ホスファチジルグリセロール等々である。
【００８７】 Ｉ．診断的用途 ここに記載した本発明の化合物（例えば、ヒト及び脊椎動物ｈＳｕ（ｆｕ）、
脊椎動物ｈＳｕ（ｆｕ）変異体及び抗脊椎動物ｈＳｕ（ｆｕ）抗体）の他の用途
は、ｈＳｕ（ｆｕ）又はヘッジホッグシグナル伝達により疾患が幾分導かれたか
どうかの診断を助けることである。例えば、基底細胞癌細胞は活性なヘッジホッ
グシグナル伝達に関連している。 ヘッジホッグシグナル伝達によって特定の疾患が導かれるかどうかを決定する
診断アッセイは以下の工程を用いて実施される：（１）細胞又は組織の培養；（
２）ｈＳｕ（ｆｕ）変調ヘッジホッグシグナル伝達を阻害可能な化合物の投与；
及び（３）ヘッジホッグシグナル伝達が対照に対して変調されている度合いの測
定。これらの工程は、本開示に基づいて標準的な技術を用いて実施することがで
きる。例えば、細胞又は組織の単離と培養又はインビボに標準的な技術を使用で
きる。
脊椎動物ｈＳｕ（ｆｕ）変異体及び抗脊椎動物ｈＳｕ（ｆｕ）抗体）の他の用途
は、ｈＳｕ（ｆｕ）又はヘッジホッグシグナル伝達により疾患が幾分導かれたか
どうかの診断を助けることである。例えば、基底細胞癌細胞は活性なヘッジホッ
グシグナル伝達に関連している。 ヘッジホッグシグナル伝達によって特定の疾患が導かれるかどうかを決定する
診断アッセイは以下の工程を用いて実施される：（１）細胞又は組織の培養；（
２）ｈＳｕ（ｆｕ）変調ヘッジホッグシグナル伝達を阻害可能な化合物の投与；
及び（３）ヘッジホッグシグナル伝達が対照に対して変調されている度合いの測
定。これらの工程は、本開示に基づいて標準的な技術を用いて実施することがで
きる。例えば、細胞又は組織の単離と培養又はインビボに標準的な技術を使用で
きる。
【００８８】 以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、決して本発明の
範囲を限定することを意図するものではない。 本明細書で引用した全ての特許及び文献の全体を、出典明示によりここに取り
込む。 （実施例） 実施例で言及されている市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に
従って使用した。ＡＴＣＣ受託番号を用いて以下の実施例と明細書全体を通して
特定されている細胞の供給源はバージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクションである。
範囲を限定することを意図するものではない。 本明細書で引用した全ての特許及び文献の全体を、出典明示によりここに取り
込む。 （実施例） 実施例で言及されている市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に
従って使用した。ＡＴＣＣ受託番号を用いて以下の実施例と明細書全体を通して
特定されている細胞の供給源はバージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクションである。
【００８９】 実施例１．ヒトｈＳｕ（ｆｕ）をコードするｃＤＮＡクローンの単離 公的な配列データベース（Genbank）を検索して、ショウジョウバエのメラノ
ガスターの融合タンパク質のサプレッサーと相同性を示すマウスＥＳＴを同定し
た（ＡＡ２２３６３７）。マウスＥＳＴの想定される推定アミノ酸配列はｄＳｕ
（ｆｕ）タンパク質の８４のアミノ酸の６４に一致した。ついで、このＥＳＴ配
列を公的なＥＳＴデータベース（例えば、GenBank）と企業のＥＳＴデータベー
ス（例えば、LIFESEQ(登録商標)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を
含む様々なＥＳＴデータベースと比較して、相同性ＥＳＴ配列を同定した。比較
は、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２［Altschul等, Method
s in Enzymology, 266: 460-480 (1996)］を用いて実施した。既知のタンパク質
をコードせず、ＢＬＡＳＴスコア７０（又はある場合には９０）又はそれ以上を
持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington,
Seattle, Washington）でクラスター形成してコンセンサスＤＮＡ配列に構築し
た。このコンセンサス配列はＦｉｇ７（配列番号：３）に示され、ここでＤＮＡ
３３４５４と命名される。 Ｆｉｇ７（配列番号：３）に示されたＤＮＡ３３４５４コンセンサス配列に基
づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定する
ために、及び２）ｈＳｕ（ｆｕ）の全長コード化配列のクローンを単離するプロ
ーブとして用いるために、オリゴヌクレオチドを合成した。正方向及び逆方向Ｐ
ＣＲプライマーは一般に２０から３０のヌクレオチドの範囲であり、しばしば約
１００−１０００ｂｐ長のＰＣＲ産物をもたらすように設計される。プローブ配
列は、典型的には４０−５５ｂｐ長である。ある場合には、コンセンサス配列が
約１−１．５ｋｂｐより大きいときに更なるオリゴヌクレオチドが合成される。
全長クローンについて幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブ
ラリからのＤＮＡを、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology に
従って、ＰＣＲプライマー対でのＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。ついで
、ポジティブライブラリをプローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方
を用いて対象とする遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。 ＰＣＲプライマー（正及び逆）を合成した： 正方向ＰＣＲプライマー ５'-CAGCCGAACCCGCTCCAGGTTAC-３'（配列番号：７） 逆方向ＰＣＲプライマー ５'-CATGGACTCTGTTGTCACCATAGAG-３'（配列番号：８
） さらに、ヒト胎児肺ｐＲＫ５哺乳動物発現ライブラリを、次のヌクレオチド配列
を持つコンセンサスＤＮＡ３３４５４配列から作成された合成オリゴヌクレオチ
ドハイブリダイゼーションプローブでスクリーニングした： ハイブリダイゼー
ションプローブ ５'-GAGCACTGGCACTACATCAGCTTTGGCCTGAGTGATCTCT-３'（配列番号：９）
ガスターの融合タンパク質のサプレッサーと相同性を示すマウスＥＳＴを同定し
た（ＡＡ２２３６３７）。マウスＥＳＴの想定される推定アミノ酸配列はｄＳｕ
（ｆｕ）タンパク質の８４のアミノ酸の６４に一致した。ついで、このＥＳＴ配
列を公的なＥＳＴデータベース（例えば、GenBank）と企業のＥＳＴデータベー
ス（例えば、LIFESEQ(登録商標)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を
含む様々なＥＳＴデータベースと比較して、相同性ＥＳＴ配列を同定した。比較
は、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２［Altschul等, Method
s in Enzymology, 266: 460-480 (1996)］を用いて実施した。既知のタンパク質
をコードせず、ＢＬＡＳＴスコア７０（又はある場合には９０）又はそれ以上を
持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington,
Seattle, Washington）でクラスター形成してコンセンサスＤＮＡ配列に構築し
た。このコンセンサス配列はＦｉｇ７（配列番号：３）に示され、ここでＤＮＡ
３３４５４と命名される。 Ｆｉｇ７（配列番号：３）に示されたＤＮＡ３３４５４コンセンサス配列に基
づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定する
ために、及び２）ｈＳｕ（ｆｕ）の全長コード化配列のクローンを単離するプロ
ーブとして用いるために、オリゴヌクレオチドを合成した。正方向及び逆方向Ｐ
ＣＲプライマーは一般に２０から３０のヌクレオチドの範囲であり、しばしば約
１００−１０００ｂｐ長のＰＣＲ産物をもたらすように設計される。プローブ配
列は、典型的には４０−５５ｂｐ長である。ある場合には、コンセンサス配列が
約１−１．５ｋｂｐより大きいときに更なるオリゴヌクレオチドが合成される。
全長クローンについて幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブ
ラリからのＤＮＡを、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology に
従って、ＰＣＲプライマー対でのＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。ついで
、ポジティブライブラリをプローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方
を用いて対象とする遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。 ＰＣＲプライマー（正及び逆）を合成した： 正方向ＰＣＲプライマー ５'-CAGCCGAACCCGCTCCAGGTTAC-３'（配列番号：７） 逆方向ＰＣＲプライマー ５'-CATGGACTCTGTTGTCACCATAGAG-３'（配列番号：８
） さらに、ヒト胎児肺ｐＲＫ５哺乳動物発現ライブラリを、次のヌクレオチド配列
を持つコンセンサスＤＮＡ３３４５４配列から作成された合成オリゴヌクレオチ
ドハイブリダイゼーションプローブでスクリーニングした： ハイブリダイゼー
ションプローブ ５'-GAGCACTGGCACTACATCAGCTTTGGCCTGAGTGATCTCT-３'（配列番号：９）
【００９０】 ｃＤＮＡライブラリの作成のためのＲＮＡはヒト胎児肺組織から単離した。ｃ
ＤＮＡクローンの単離に用いたｃＤＮＡライブラリは、カリフォルニア州サンジ
エゴのInvitrogen からのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法によって作成
した。ｃＤＮＡは、ＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、平滑末端でＳ
ａｌＩヘミキナーゼ化アダプターに結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動
法で適当にサイズ分類し、適切なクローニングベクター（ｐＲＫＢ又はｐＲＫＤ
等；ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Holmes等
, Science, 253: 1278-1280 (1991)参照）に、独特のＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ部位
において、所定の方向でクローニングした。 上述のようにして単離されたクローンのＤＮＡ配列決定により、ｈＳｕ（ｆｕ
）の全長ＤＮＡ配列（ここでＤＮＡ３３４５５−１５４８と命名［Ｆｉｇ６Ａ−
６Ｂ、配列番号：１］）（ＵＮＱ６５０とも命名）と、ｈＳｕ（ｆｕ）の誘導タ
ンパク質配列（配列番号：２；Ｆｉｇ１）が得られた。クローンＵＮＱ６５０（
ここでＤＮＡ３３４５５−１５４８と命名）は１９９９年３月５日にＡＴＣＣに
寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２７が付与された。 ＵＮＱ６５０（ＤＮＡ３３４５５−１５４８）の全ヌクレオチド配列はＦｉｇ
６Ａ−６Ｂ（配列番号：１）に示す。クローンＵＮＱ６５０（ＤＮＡ３３４５５
−１５４８）はヌクレオチド位置７４−７６に見かけの転写開始部位を持ちヌク
レオチド位置１３７３−１３７５の停止コドンで終端する単一のオープンリーデ
ィングフレームを含む（Ｆｉｇ６Ａ−６Ｂ）。予想されたポリペプチド前駆体は
４３３アミノ酸長である（Ｆｉｇ１）。Ｆｉｇ１に示される全長ｈＳｕ（ｆｕ）
タンパク質は約４７９３２ダルトンの推定分子量と約５．６６のＰＩを有する。
Ｆｉｇ１（配列番号：２）に示された全長ｈＳｕ（ｆｕ）配列の分析により次の
ものの存在が明らかになった：約アミノ酸２６５から約アミノ酸２６８の潜在的
なＮ-グリコシル化部位。ｈＳｕ（ｆｕ）をｄＳｕ（ｆｕ）とアラインメントさ
せることにより、アミノ酸レベルで３７．７％の同一性が明らかになり（Ｆｉｇ
１）、保存的アミノ酸置換を考慮に入れると６３％まで増加した。Prositeデー
タベースに対してｈＳｕ（ｆｕ）を検索した結果、１５の潜在的なリン酸化部位
が明らかになり、その幾つかが種間で保存されていた（Ｆｉｇ１に示す）。Pros
iteの検索により３つの候補ＰＫＡリン酸化部位がｈＳｕ（ｆｕ）に同定され、
ｄＳｕ（ｆｕ）では何も同定されなかった。しかし、検索方策に幾つかの活性が
少ない潜在的なＰＫＡリン酸化部位モチーフを含めることにより、ｈＳｕ（ｆｕ
）に二つ（２）の更なる部位が同定され、ｄＳｕ（ｆｕ）に５つのそのような部
位が同定された（Ｆｉｇ１）。ＰＥＳＴアルゴリズム（４０）により、辺縁ＰＥ
ＳＴ配列が同定され、これはアミノ酸３４４−３５８にスパンしていた。ｈＳｕ
（ｆｕ）遺伝子をＦＩＳＨ解析により染色体１０、領域ｑ２４−ｑ２５にマッピ
ングした（Ｆｉｇ２）。 Ｆｉｇ１（配列番号：２）に示された全長配列のＷＵ−ＢＬＡＳＴ２配列アラ
インメント分析を使用した、Dayhoffデータベース（version 35.45 SwissProt 3
5）の解析により、ｈＳｕ（ｆｕ）アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：S55695,
A45983, PAC4_RAT, P_R93246, S49624, CA39_CHICK, S30127, MTCI28_32, MTV04
3_60及びLEG3_CRILOとの間の有意な相同性が証明された。
ＤＮＡクローンの単離に用いたｃＤＮＡライブラリは、カリフォルニア州サンジ
エゴのInvitrogen からのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法によって作成
した。ｃＤＮＡは、ＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、平滑末端でＳ
ａｌＩヘミキナーゼ化アダプターに結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動
法で適当にサイズ分類し、適切なクローニングベクター（ｐＲＫＢ又はｐＲＫＤ
等；ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Holmes等
, Science, 253: 1278-1280 (1991)参照）に、独特のＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ部位
において、所定の方向でクローニングした。 上述のようにして単離されたクローンのＤＮＡ配列決定により、ｈＳｕ（ｆｕ
）の全長ＤＮＡ配列（ここでＤＮＡ３３４５５−１５４８と命名［Ｆｉｇ６Ａ−
６Ｂ、配列番号：１］）（ＵＮＱ６５０とも命名）と、ｈＳｕ（ｆｕ）の誘導タ
ンパク質配列（配列番号：２；Ｆｉｇ１）が得られた。クローンＵＮＱ６５０（
ここでＤＮＡ３３４５５−１５４８と命名）は１９９９年３月５日にＡＴＣＣに
寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２７が付与された。 ＵＮＱ６５０（ＤＮＡ３３４５５−１５４８）の全ヌクレオチド配列はＦｉｇ
６Ａ−６Ｂ（配列番号：１）に示す。クローンＵＮＱ６５０（ＤＮＡ３３４５５
−１５４８）はヌクレオチド位置７４−７６に見かけの転写開始部位を持ちヌク
レオチド位置１３７３−１３７５の停止コドンで終端する単一のオープンリーデ
ィングフレームを含む（Ｆｉｇ６Ａ−６Ｂ）。予想されたポリペプチド前駆体は
４３３アミノ酸長である（Ｆｉｇ１）。Ｆｉｇ１に示される全長ｈＳｕ（ｆｕ）
タンパク質は約４７９３２ダルトンの推定分子量と約５．６６のＰＩを有する。
Ｆｉｇ１（配列番号：２）に示された全長ｈＳｕ（ｆｕ）配列の分析により次の
ものの存在が明らかになった：約アミノ酸２６５から約アミノ酸２６８の潜在的
なＮ-グリコシル化部位。ｈＳｕ（ｆｕ）をｄＳｕ（ｆｕ）とアラインメントさ
せることにより、アミノ酸レベルで３７．７％の同一性が明らかになり（Ｆｉｇ
１）、保存的アミノ酸置換を考慮に入れると６３％まで増加した。Prositeデー
タベースに対してｈＳｕ（ｆｕ）を検索した結果、１５の潜在的なリン酸化部位
が明らかになり、その幾つかが種間で保存されていた（Ｆｉｇ１に示す）。Pros
iteの検索により３つの候補ＰＫＡリン酸化部位がｈＳｕ（ｆｕ）に同定され、
ｄＳｕ（ｆｕ）では何も同定されなかった。しかし、検索方策に幾つかの活性が
少ない潜在的なＰＫＡリン酸化部位モチーフを含めることにより、ｈＳｕ（ｆｕ
）に二つ（２）の更なる部位が同定され、ｄＳｕ（ｆｕ）に５つのそのような部
位が同定された（Ｆｉｇ１）。ＰＥＳＴアルゴリズム（４０）により、辺縁ＰＥ
ＳＴ配列が同定され、これはアミノ酸３４４−３５８にスパンしていた。ｈＳｕ
（ｆｕ）遺伝子をＦＩＳＨ解析により染色体１０、領域ｑ２４−ｑ２５にマッピ
ングした（Ｆｉｇ２）。 Ｆｉｇ１（配列番号：２）に示された全長配列のＷＵ−ＢＬＡＳＴ２配列アラ
インメント分析を使用した、Dayhoffデータベース（version 35.45 SwissProt 3
5）の解析により、ｈＳｕ（ｆｕ）アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：S55695,
A45983, PAC4_RAT, P_R93246, S49624, CA39_CHICK, S30127, MTCI28_32, MTV04
3_60及びLEG3_CRILOとの間の有意な相同性が証明された。
【００９１】 実施例２．ハイブリダイゼーションプローブとしてのｈＳｕ（ｆｕ）の使用 以下の方法は、ｈＳｕ（ｆｕ）をコードするヌクレオチド配列のハイブリダイ
ゼーションプローブとしての使用を記載する。 全長又は成熟ｈＳｕ（ｆｕ）（Ｆｉｇ６Ａ−６Ｂ、配列番号：１に示す）のコ
ード配列を含むＤＮＡは、ヒト組織ｃＤＮＡライブラリ又はヒト組織ゲノムライ
ブラリにおける相同ＤＮＡ類（ｈＳｕ（ｆｕ）の天然に生じる変異体をコードす
るものなど）のスクリーニングのためのプローブとして用いられる。 何れかのライブラリＤＮＡを含むフィルターのハイブリダイゼーションと洗浄
は、以下の高緊縮性条件下で実施した。放射性標識ｈＳｕ（ｆｕ）誘導プローブ
のフィルターへのハイブリダイゼーションは、５０％ホルムアルデヒド、５ｘＳ
ＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリ
ウム、ｐＨ６．８、２ｘデンハード液、及び１０％デキストラン硫酸の溶液中で
４２℃において２０時間行った。フィルターの洗浄は、０．１ｘＳＳＣ及び０．
１％ＳＤＳの水溶液中、４２℃で行った。 ついで、全長天然配列ｈＳｕ（ｆｕ）をコードするＤＮＡと所望の配列同一性
を有するＤＮＡは、当該分野で知られている標準的な方法を用いて同定できる。
ゼーションプローブとしての使用を記載する。 全長又は成熟ｈＳｕ（ｆｕ）（Ｆｉｇ６Ａ−６Ｂ、配列番号：１に示す）のコ
ード配列を含むＤＮＡは、ヒト組織ｃＤＮＡライブラリ又はヒト組織ゲノムライ
ブラリにおける相同ＤＮＡ類（ｈＳｕ（ｆｕ）の天然に生じる変異体をコードす
るものなど）のスクリーニングのためのプローブとして用いられる。 何れかのライブラリＤＮＡを含むフィルターのハイブリダイゼーションと洗浄
は、以下の高緊縮性条件下で実施した。放射性標識ｈＳｕ（ｆｕ）誘導プローブ
のフィルターへのハイブリダイゼーションは、５０％ホルムアルデヒド、５ｘＳ
ＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリ
ウム、ｐＨ６．８、２ｘデンハード液、及び１０％デキストラン硫酸の溶液中で
４２℃において２０時間行った。フィルターの洗浄は、０．１ｘＳＳＣ及び０．
１％ＳＤＳの水溶液中、４２℃で行った。 ついで、全長天然配列ｈＳｕ（ｆｕ）をコードするＤＮＡと所望の配列同一性
を有するＤＮＡは、当該分野で知られている標準的な方法を用いて同定できる。
【００９２】 実施例３．インサイツハイブリダイゼーションのためのハイブリダイゼーション
プローブとしてのｈＳｕ（ｆｕ）の使用 齧歯類Ｓｕ（ｆｕ）ｍＲＮＡへのインサイツハイブリダイゼーションを実施し
た。胎齢８．５日（Ｅ８．５）のマウス胚に対するホールマウントインサイツハ
イブリダイゼーションを（３７）に記載されているようにして実施した。プロー
ブは、ヒト配列のヌクレオチド１１６−３９０（ヌクレオチド１＝イニシエータ
ＡＴＧのＡ）に対応する、マウスＳｕ（ｆｕ）ｃＤＮＡ ＰＣＲ鋳型とＴ７ＲＮ
Ａポリメラーゼで合成したジゴキシゲニン標識ＲＮＡであった。組織切片へのイ
ンサイツハイブリダイゼーションに対しては、ラットＥ１１．５及びＥ１５．５
全胚と、出生後１日（Ｐ１）のラット脳を、４％パラホルムアルデヒド中４℃で
終夜浸漬固定し、１５％スクロース中で終夜凍結保護し、Ｏ.Ｔ.Ｃ.（VWR Scien
tific）に包埋し、液体窒素で凍結させた。成体マウス脳を粉末ドライアイスで
新鮮凍結させた。成体ラット脊髄及びマウス精巣をＯ.Ｔ.Ｃ.に包埋し、液体窒
素で凍結させた。切片を１６μｍで切断し、過去に記載されているようにして（
３８）インサイツハイブリダイゼーションのために加工した。記載されたように
して（３９）、３３Ｐ-ＵＴＰで標識したＲＮＡプローブを産生した。センス及
びアンチセンスプローブを、ヒト配列のヌクレオチド９７−４２４を包含するｈ
Ｓｕ（ｆｕ）ｃＤＮＡ ＰＣＲ断片からＴ７ＲＮＡポリメラーゼで合成した。 ホールマウントインサイツハイブリダイゼーションにより、調べた最も早い発
育時点において、Ｓｕ（ｆｕ）ｍＲＮＡがＥ８．５マウスに広く発現されている
ことが明らかになった（Ｆｉｇ３Ａ−３Ｂ）。標識は発育中の神経板の全体にわ
たって一様に強く見えた。心臓の原基のみがこの段階で特に標識されていなかっ
た（Ｆｉｇ３Ｂ）。Ｅ１１．５のラットでは、Ｓｕ（ｆｕ）メッセージが中枢神
経系、脊髄及び体節の全体にわたって広範に残っていた（Ｆｉｇ３Ｃ）。Ｅ１１
．５及びＥ１５．５ラットの脊髄の横断面には、活性な細胞増殖の領域である室
領域の発育中の神経上皮内に顕著なシグナルが明らかになった（Ｆｉｇ３Ｅ及び
３Ｆ）。脳、脊髄、腸、肺、および精巣を含むＥ１５．５胚全体の組織がＳｕ（
ｆｕ）に対して標識された；肝臓はほんの僅かなシグナルを示していた（Ｆｉｇ
３Ｄ）。Ｐ１ラットの脳においては、Ｓｕ（ｆｕ）ｍＲＮＡが広く発現され、神
経上皮、副脳室領域、及び海馬神経細胞フィールドにわたる顕著なシグナルを示
した（Ｆｉｇ３Ｇ）。メッセージは成体脳においては大いにダウンレギュレート
されていたが、全体にわたってなお弱く検出できた；比較的高い発現が海馬、小
脳顆粒及びプルキンエ細胞層、及び嗅球に観察された（Ｆｉｇ３Ｈ−３Ｊ）。 Ｄｈｈは精巣に特異的に発現され精子形成のために重要であるので（４１）、
成体マウス精巣についてまたＳｕ（ｆｕ）ｍＲＮＡを調べた。精巣の断面には、
Ｓｕ（ｆｕ）ｍＲＮＡが精細管の部分集合に強く発現しており、その転写が胚芽
細胞の分化段階によって調節されうることを示唆している（Ｆｉｇ４Ａ）。Ｓｕ
（ｆｕ）メッセージが発達中の精母細胞の領域にわたって銀色顆粒の輪として観
察された（Ｆｉｇ４Ｃ及び４Ｄ）。尿細管内の多くの部位では、最も高い発現が
中央に集中しており、そこでは胚芽細胞分化の最後の段階が生じている（Ｆｉｇ
４Ｅ）。有意鎖対照プローブの隣接組織切片へのハイブリダイゼーションではバ
ックグラウンドを越えるシグナルは見られなかった（Ｆｉｇ４Ｂ）。
プローブとしてのｈＳｕ（ｆｕ）の使用 齧歯類Ｓｕ（ｆｕ）ｍＲＮＡへのインサイツハイブリダイゼーションを実施し
た。胎齢８．５日（Ｅ８．５）のマウス胚に対するホールマウントインサイツハ
イブリダイゼーションを（３７）に記載されているようにして実施した。プロー
ブは、ヒト配列のヌクレオチド１１６−３９０（ヌクレオチド１＝イニシエータ
ＡＴＧのＡ）に対応する、マウスＳｕ（ｆｕ）ｃＤＮＡ ＰＣＲ鋳型とＴ７ＲＮ
Ａポリメラーゼで合成したジゴキシゲニン標識ＲＮＡであった。組織切片へのイ
ンサイツハイブリダイゼーションに対しては、ラットＥ１１．５及びＥ１５．５
全胚と、出生後１日（Ｐ１）のラット脳を、４％パラホルムアルデヒド中４℃で
終夜浸漬固定し、１５％スクロース中で終夜凍結保護し、Ｏ.Ｔ.Ｃ.（VWR Scien
tific）に包埋し、液体窒素で凍結させた。成体マウス脳を粉末ドライアイスで
新鮮凍結させた。成体ラット脊髄及びマウス精巣をＯ.Ｔ.Ｃ.に包埋し、液体窒
素で凍結させた。切片を１６μｍで切断し、過去に記載されているようにして（
３８）インサイツハイブリダイゼーションのために加工した。記載されたように
して（３９）、３３Ｐ-ＵＴＰで標識したＲＮＡプローブを産生した。センス及
びアンチセンスプローブを、ヒト配列のヌクレオチド９７−４２４を包含するｈ
Ｓｕ（ｆｕ）ｃＤＮＡ ＰＣＲ断片からＴ７ＲＮＡポリメラーゼで合成した。 ホールマウントインサイツハイブリダイゼーションにより、調べた最も早い発
育時点において、Ｓｕ（ｆｕ）ｍＲＮＡがＥ８．５マウスに広く発現されている
ことが明らかになった（Ｆｉｇ３Ａ−３Ｂ）。標識は発育中の神経板の全体にわ
たって一様に強く見えた。心臓の原基のみがこの段階で特に標識されていなかっ
た（Ｆｉｇ３Ｂ）。Ｅ１１．５のラットでは、Ｓｕ（ｆｕ）メッセージが中枢神
経系、脊髄及び体節の全体にわたって広範に残っていた（Ｆｉｇ３Ｃ）。Ｅ１１
．５及びＥ１５．５ラットの脊髄の横断面には、活性な細胞増殖の領域である室
領域の発育中の神経上皮内に顕著なシグナルが明らかになった（Ｆｉｇ３Ｅ及び
３Ｆ）。脳、脊髄、腸、肺、および精巣を含むＥ１５．５胚全体の組織がＳｕ（
ｆｕ）に対して標識された；肝臓はほんの僅かなシグナルを示していた（Ｆｉｇ
３Ｄ）。Ｐ１ラットの脳においては、Ｓｕ（ｆｕ）ｍＲＮＡが広く発現され、神
経上皮、副脳室領域、及び海馬神経細胞フィールドにわたる顕著なシグナルを示
した（Ｆｉｇ３Ｇ）。メッセージは成体脳においては大いにダウンレギュレート
されていたが、全体にわたってなお弱く検出できた；比較的高い発現が海馬、小
脳顆粒及びプルキンエ細胞層、及び嗅球に観察された（Ｆｉｇ３Ｈ−３Ｊ）。 Ｄｈｈは精巣に特異的に発現され精子形成のために重要であるので（４１）、
成体マウス精巣についてまたＳｕ（ｆｕ）ｍＲＮＡを調べた。精巣の断面には、
Ｓｕ（ｆｕ）ｍＲＮＡが精細管の部分集合に強く発現しており、その転写が胚芽
細胞の分化段階によって調節されうることを示唆している（Ｆｉｇ４Ａ）。Ｓｕ
（ｆｕ）メッセージが発達中の精母細胞の領域にわたって銀色顆粒の輪として観
察された（Ｆｉｇ４Ｃ及び４Ｄ）。尿細管内の多くの部位では、最も高い発現が
中央に集中しており、そこでは胚芽細胞分化の最後の段階が生じている（Ｆｉｇ
４Ｅ）。有意鎖対照プローブの隣接組織切片へのハイブリダイゼーションではバ
ックグラウンドを越えるシグナルは見られなかった（Ｆｉｇ４Ｂ）。
【００９３】 実施例４．ｈＳｕ（ｆｕ）遺伝子の染色体位置をマッピングするためのハイブリ
ダイゼーションプローブとしてのｈＳｕ（ｆｕ）の使用 ｈＳｕ（ｆｕ）遺伝子の染色体の局在化を決定した。ヒト血液から単離したリ
ンパ球を、３７℃で６８−７２時間の間、１０％のウシ胎仔血清とフィトヘマグ
ルチニンを補填したアルファＭＥＭ中で培養した。培養物をＢｒｄＵ（０．１８
ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）で処理して細胞集団を同調させ、ついで無血清培地で
３ｘ洗浄し、チミジン（２．５ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）を含むアルファＭＥＭ
にて３７℃で６時間の間、再培養した。細胞を収集し、標準的な手順によってス
ライドを調製し、低張処理、固定及び空気乾燥を施した。全長ｈＳｕ（ｆｕ）ｃ
ＤＮＡをＢｉｏＮｉｃｋ標識キット（Gibco BRL）を使用して１５℃で２ｈ、ｄ
ＡＴＰの存在下にてビオチン標識した。蛍光インサイツハイブリダイゼーション
（FISH）を記載されたようにして実施した（３５，３６）。簡単には、スライド
を５５℃で１ｈの間、焼き、ＲＮＡ分解酵素で処理し、２ｘＳＳＣ中の７０％の
ホルムアミドで２分間（７０℃）変性させ、エタノール中で脱水した。プローブ
を、５０％のホルムアミドと１０％のデキストラン硫酸からなるハイブリダイゼ
ーション混合物中で５分間７５℃にて変性させた。変性させた染色体調製物をプ
ローブと終夜ハイブリダイズさせ、洗浄し、蛍光抗ビオチン抗体とＤＡＰＩ染色
で標識した。各染色体拡散体のＤＡＰＩバンド形成パターンとＦＩＳＨシグナル
を別個に記録し、ついで重ね合わせてｈＳｕ（ｆｕ）マッピング位置をあてがっ
た。 上記のＦＩＳＨ分析により、ｈＳｕ（ｆｕ）遺伝子は染色体１０ｑ２４−２５
にマッピングされた。興味深いことに、多形性膠芽腫、前立腺癌、悪性メラノー
マ及び子宮内膜癌を含む多くの腫瘍における異型接合性の喪失（ＬＯＨ）分析に
基づいて、区間１０ｑ.２３-qter内に腫瘍抑制遺伝子に対する二つの遺伝子座が
提案された（４４−４７）。この点において、多くの癌において突然変異してい
ることが見いだされ、この領域にまたマッピングする二つの候補腫瘍サプレッサ
ー遺伝子：１０ｑ２３.３でのＭＭＡＣ１／ＰＴＥＮ（４８，４９）と１０ｑ２
５.３−２６.１でのＤＭＢＴ１（悪性脳腫瘍において欠失）（５０）が、最近記
載されている。ｈＳｕ（ｆｕ）の染色体局在化は、ｈＳｕ（ｆｕ）が活性な細胞
増殖の領域に高度に発現され（Ｆｉｇ３Ｆ−Ｊを参照）、ＨＨシグナル伝達のイ
ンヒビターであるという知見と組み合わされて、ｈＳｕ（ｆｕ）がPatchedのよ
うに腫瘍サプレッサーである可能性が極めて高いことを示している。
ダイゼーションプローブとしてのｈＳｕ（ｆｕ）の使用 ｈＳｕ（ｆｕ）遺伝子の染色体の局在化を決定した。ヒト血液から単離したリ
ンパ球を、３７℃で６８−７２時間の間、１０％のウシ胎仔血清とフィトヘマグ
ルチニンを補填したアルファＭＥＭ中で培養した。培養物をＢｒｄＵ（０．１８
ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）で処理して細胞集団を同調させ、ついで無血清培地で
３ｘ洗浄し、チミジン（２．５ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）を含むアルファＭＥＭ
にて３７℃で６時間の間、再培養した。細胞を収集し、標準的な手順によってス
ライドを調製し、低張処理、固定及び空気乾燥を施した。全長ｈＳｕ（ｆｕ）ｃ
ＤＮＡをＢｉｏＮｉｃｋ標識キット（Gibco BRL）を使用して１５℃で２ｈ、ｄ
ＡＴＰの存在下にてビオチン標識した。蛍光インサイツハイブリダイゼーション
（FISH）を記載されたようにして実施した（３５，３６）。簡単には、スライド
を５５℃で１ｈの間、焼き、ＲＮＡ分解酵素で処理し、２ｘＳＳＣ中の７０％の
ホルムアミドで２分間（７０℃）変性させ、エタノール中で脱水した。プローブ
を、５０％のホルムアミドと１０％のデキストラン硫酸からなるハイブリダイゼ
ーション混合物中で５分間７５℃にて変性させた。変性させた染色体調製物をプ
ローブと終夜ハイブリダイズさせ、洗浄し、蛍光抗ビオチン抗体とＤＡＰＩ染色
で標識した。各染色体拡散体のＤＡＰＩバンド形成パターンとＦＩＳＨシグナル
を別個に記録し、ついで重ね合わせてｈＳｕ（ｆｕ）マッピング位置をあてがっ
た。 上記のＦＩＳＨ分析により、ｈＳｕ（ｆｕ）遺伝子は染色体１０ｑ２４−２５
にマッピングされた。興味深いことに、多形性膠芽腫、前立腺癌、悪性メラノー
マ及び子宮内膜癌を含む多くの腫瘍における異型接合性の喪失（ＬＯＨ）分析に
基づいて、区間１０ｑ.２３-qter内に腫瘍抑制遺伝子に対する二つの遺伝子座が
提案された（４４−４７）。この点において、多くの癌において突然変異してい
ることが見いだされ、この領域にまたマッピングする二つの候補腫瘍サプレッサ
ー遺伝子：１０ｑ２３.３でのＭＭＡＣ１／ＰＴＥＮ（４８，４９）と１０ｑ２
５.３−２６.１でのＤＭＢＴ１（悪性脳腫瘍において欠失）（５０）が、最近記
載されている。ｈＳｕ（ｆｕ）の染色体局在化は、ｈＳｕ（ｆｕ）が活性な細胞
増殖の領域に高度に発現され（Ｆｉｇ３Ｆ−Ｊを参照）、ＨＨシグナル伝達のイ
ンヒビターであるという知見と組み合わされて、ｈＳｕ（ｆｕ）がPatchedのよ
うに腫瘍サプレッサーである可能性が極めて高いことを示している。
【００９４】 実施例５：大腸菌におけるｈＳｕ（ｆｕ）の発現 この実施例は大腸菌中における組換え発現によるｈＳｕ（ｆｕ）の未グリコシ
ル化型の調製を例証する。 ｈＳｕ（ｆｕ）をコードするＤＮＡ配列（配列番号：１）を、選択したＰＣＲ
プライマーを用いて最初に増幅した。プライマーは、選択された発現ベクターの
制限酵素部位に対応する制限酵素部位を含まなければならない。種々の発現ベク
ターを用いることができる。好適なベクターの例は、ｐＢＲ３２２（大腸菌由来
のもの；Bolivar等, Gene, 2:95 (1977)を参照）であり、これはアンピシリン及
びテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含む。ベクターは、制限酵素で消化さ
れ脱リン酸される。ＰＣＲ増幅配列を、ついでベクターに結合させる。ベクター
は、好ましくは抗生物質耐性遺伝子、ｔｒｐプロモーター、ｐｏｌｙｈｉｓリー
ダー（最初の６つのＳＴＩＩコドン、ｐｏｌｙｈｉｓ配列、及びエンテロキナー
ゼ切断部位を含む）、ｈＳｕ（ｆｕ）コード化領域、ラムダ転写終結区、及びａ
ｒｇＵ遺伝子を含む。 ライゲーション混合物は、ついで、上掲のSambrook等に記載された方法を用い
て選択した大腸菌を形質転換するのに使用される。形質転換体は、それらのＬＢ
プレートで成長する能力により同定され、ついで抗生物質耐性クローンが選択さ
れる。プラスミドＤＮＡが単離され、制限分析及びＤＮＡ配列決定で確認される
。 選択されたクローンは、抗生物質を添加したＬＢブロスのような液体培地で終
夜成長させることができる。終夜培養物は、続いて大規模培養の播種に用いられ
る。次に細胞を所望の至適密度まで成長させ、その間に発現プロモーターが作動
される。 更に数時間の培養の後、細胞を遠心分離により収集することができる。遠心分
離で得られた細胞ペレットは、当該分野で知られた種々の試薬を用いて可溶化さ
れ得、ついで可溶化されたｈＳｕ（ｆｕ）タンパク質を金属キレート化カラムを
用いてタンパク質を緊密に結合させる条件下で精製する。
ル化型の調製を例証する。 ｈＳｕ（ｆｕ）をコードするＤＮＡ配列（配列番号：１）を、選択したＰＣＲ
プライマーを用いて最初に増幅した。プライマーは、選択された発現ベクターの
制限酵素部位に対応する制限酵素部位を含まなければならない。種々の発現ベク
ターを用いることができる。好適なベクターの例は、ｐＢＲ３２２（大腸菌由来
のもの；Bolivar等, Gene, 2:95 (1977)を参照）であり、これはアンピシリン及
びテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含む。ベクターは、制限酵素で消化さ
れ脱リン酸される。ＰＣＲ増幅配列を、ついでベクターに結合させる。ベクター
は、好ましくは抗生物質耐性遺伝子、ｔｒｐプロモーター、ｐｏｌｙｈｉｓリー
ダー（最初の６つのＳＴＩＩコドン、ｐｏｌｙｈｉｓ配列、及びエンテロキナー
ゼ切断部位を含む）、ｈＳｕ（ｆｕ）コード化領域、ラムダ転写終結区、及びａ
ｒｇＵ遺伝子を含む。 ライゲーション混合物は、ついで、上掲のSambrook等に記載された方法を用い
て選択した大腸菌を形質転換するのに使用される。形質転換体は、それらのＬＢ
プレートで成長する能力により同定され、ついで抗生物質耐性クローンが選択さ
れる。プラスミドＤＮＡが単離され、制限分析及びＤＮＡ配列決定で確認される
。 選択されたクローンは、抗生物質を添加したＬＢブロスのような液体培地で終
夜成長させることができる。終夜培養物は、続いて大規模培養の播種に用いられ
る。次に細胞を所望の至適密度まで成長させ、その間に発現プロモーターが作動
される。 更に数時間の培養の後、細胞を遠心分離により収集することができる。遠心分
離で得られた細胞ペレットは、当該分野で知られた種々の試薬を用いて可溶化さ
れ得、ついで可溶化されたｈＳｕ（ｆｕ）タンパク質を金属キレート化カラムを
用いてタンパク質を緊密に結合させる条件下で精製する。
【００９５】 実施例６：哺乳動物細胞におけるｈＳｕ（ｆｕ）の発現 この実施例は哺乳動物細胞中での組換え発現によるｈＳｕ（ｆｕ）の潜在的に
グリコシル化された型の調製を例証する。 発現ベクターとしてベクターｐＲＫ５（1989年3月15日公開のEP307,247を参照
）を用いた。場合によっては、上掲のSambrook等に記載されたようなライゲーシ
ョン方法を用いて、ｈＳｕ（ｆｕ）ＤＮＡを選択した制限酵素でｐＲＫ５に結合
させて、ｈＳｕ（ｆｕ）ＤＮＡの挿入を行う。得られたベクターは、ｐＲＫ５−
ｈＳｕ（ｆｕ）と呼ばれる。 一実施態様では、選択された宿主細胞は２９３細胞とすることができる。ヒト
２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １５７３）は、ウシ胎児血清及び場合によっては
滋養成分及び／又は抗生物質を添加したＤＭＥＭなどの培地中で組織培養プレー
トにおいて成長させて集密化した。約１０μｇのｐＲＫ５−ｈＳｕ（ｆｕ）ＤＮ
Ａを約１μｇのＶＡ ＲＮＡ遺伝子をコードするＤＮＡ［Thimmappaya等, Cell,
31:543 (1982))］と混合し、５００μｌの１ｍＭトリス-ＨＣｌ、０．１ｍＭの
ＥＤＴＡ、０．２２７ＭのＣａＣｌ２に溶解させた。この混合物に、滴下して、
５００μｌの５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３５）、２８０ｍＭのＮａＣｌ、
１．５ｍＭのＮａＰＯ４を添加し、２５℃で１０分間析出物を形成させた。析出
物を懸濁し、２９３細胞に加えて３７℃で約４時間静置した。培地を吸引し、２
ｍｌのＰＢＳ中２０％グリセロールを３０秒間添加した。２９３細胞をついで無
血清培地で洗浄し、新鮮培地を添加し、細胞を約５日間インキュベートした。 形質移入後約２４時間で、培地を除去し、培地（単独）又は２００μＣｉ／ｍ
ｌの３５Ｓ-システイン及び２００μＣｉ／ｍｌの３５Ｓ-メチオニンを含む培地
で置換した。１２時間のインキュベーション後、条件培地を収集し、スピンフィ
ルターで濃縮し、１５％ＳＤＳゲルに充填した。処理したゲルを乾燥させ、ｈＳ
ｕ（ｆｕ）ポリペプチドの存在を現す選択された時間の間フィルムに露出した。
形質転換した細胞を含む培養物に、更なるインキュベーションを施し（無血清培
地中で）、培地を選択されたバイオアッセイで試験した。 これに換わる技術では、ｈＳｕ（ｆｕ）は、Somparyac等, Proc. Natl. Acad.
Sci.,12:7575 (1981)に記載されたデキストラン硫酸法を用いて２９３細胞に一
過性に導入される。２９３細胞は、スピナーフラスコ内で最大密度まで成長させ
、７００μｇのｐＲＫ５−ｈＳｕ（ｆｕ）ＤＮＡを添加する。細胞は、先ずスピ
ナーフラスコから遠心分離によって濃縮し、ＰＢＳで洗浄した。ＤＮＡ−デキス
トラン沈殿物を細胞ペレット上で４時間インキュベートした。細胞を２０％グリ
セロールで９０秒間処理し、組織培養培地で洗浄し、組織培養培地、５μｇ／ｍ
ｌウシインスリン及び０．１μｇ／ｍｌウシトランスフェリンを含むスピナーフ
ラスコ中に再導入した。約４日後に、条件培地を遠心分離し、濾過して細胞及び
細胞片を除去した。ついで発現されたｈＳｕ（ｆｕ）を含む試料を濃縮し、透析
及び／又はカラムクロマトグラフィー等の任意の選択された方法によって精製し
た。
グリコシル化された型の調製を例証する。 発現ベクターとしてベクターｐＲＫ５（1989年3月15日公開のEP307,247を参照
）を用いた。場合によっては、上掲のSambrook等に記載されたようなライゲーシ
ョン方法を用いて、ｈＳｕ（ｆｕ）ＤＮＡを選択した制限酵素でｐＲＫ５に結合
させて、ｈＳｕ（ｆｕ）ＤＮＡの挿入を行う。得られたベクターは、ｐＲＫ５−
ｈＳｕ（ｆｕ）と呼ばれる。 一実施態様では、選択された宿主細胞は２９３細胞とすることができる。ヒト
２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １５７３）は、ウシ胎児血清及び場合によっては
滋養成分及び／又は抗生物質を添加したＤＭＥＭなどの培地中で組織培養プレー
トにおいて成長させて集密化した。約１０μｇのｐＲＫ５−ｈＳｕ（ｆｕ）ＤＮ
Ａを約１μｇのＶＡ ＲＮＡ遺伝子をコードするＤＮＡ［Thimmappaya等, Cell,
31:543 (1982))］と混合し、５００μｌの１ｍＭトリス-ＨＣｌ、０．１ｍＭの
ＥＤＴＡ、０．２２７ＭのＣａＣｌ２に溶解させた。この混合物に、滴下して、
５００μｌの５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３５）、２８０ｍＭのＮａＣｌ、
１．５ｍＭのＮａＰＯ４を添加し、２５℃で１０分間析出物を形成させた。析出
物を懸濁し、２９３細胞に加えて３７℃で約４時間静置した。培地を吸引し、２
ｍｌのＰＢＳ中２０％グリセロールを３０秒間添加した。２９３細胞をついで無
血清培地で洗浄し、新鮮培地を添加し、細胞を約５日間インキュベートした。 形質移入後約２４時間で、培地を除去し、培地（単独）又は２００μＣｉ／ｍ
ｌの３５Ｓ-システイン及び２００μＣｉ／ｍｌの３５Ｓ-メチオニンを含む培地
で置換した。１２時間のインキュベーション後、条件培地を収集し、スピンフィ
ルターで濃縮し、１５％ＳＤＳゲルに充填した。処理したゲルを乾燥させ、ｈＳ
ｕ（ｆｕ）ポリペプチドの存在を現す選択された時間の間フィルムに露出した。
形質転換した細胞を含む培養物に、更なるインキュベーションを施し（無血清培
地中で）、培地を選択されたバイオアッセイで試験した。 これに換わる技術では、ｈＳｕ（ｆｕ）は、Somparyac等, Proc. Natl. Acad.
Sci.,12:7575 (1981)に記載されたデキストラン硫酸法を用いて２９３細胞に一
過性に導入される。２９３細胞は、スピナーフラスコ内で最大密度まで成長させ
、７００μｇのｐＲＫ５−ｈＳｕ（ｆｕ）ＤＮＡを添加する。細胞は、先ずスピ
ナーフラスコから遠心分離によって濃縮し、ＰＢＳで洗浄した。ＤＮＡ−デキス
トラン沈殿物を細胞ペレット上で４時間インキュベートした。細胞を２０％グリ
セロールで９０秒間処理し、組織培養培地で洗浄し、組織培養培地、５μｇ／ｍ
ｌウシインスリン及び０．１μｇ／ｍｌウシトランスフェリンを含むスピナーフ
ラスコ中に再導入した。約４日後に、条件培地を遠心分離し、濾過して細胞及び
細胞片を除去した。ついで発現されたｈＳｕ（ｆｕ）を含む試料を濃縮し、透析
及び／又はカラムクロマトグラフィー等の任意の選択された方法によって精製し
た。
【００９６】 他の実施態様では、ｈＳｕ（ｆｕ）をＣＨＯ細胞中で発現させることができる
。ｐＲＫ５-ｈＳｕ（ｆｕ）は、ＣａＰＯ４又はＤＥＡＥ-デキストランなどの既
知の試薬を用いてＣＨＯ細胞中に形質移入することができる。上記したように、
細胞培地をインキュベートし、培地を培養培地（単独）又は３５Ｓ-メチオニン
等の放射性標識を含む培地に置換することができる。ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチ
ドの存在を決定した後、培地を無血清培地に置換することができる。好ましくは
、培地を約６日間インキュベートし、ついで条件培地を収集する。ついで、発現
されたｈＳｕ（ｆｕ）を含む培地を濃縮して、任意の選択される方法によって精
製することができる。 また、エピトープタグｈＳｕ（ｆｕ）は、宿主ＣＨＯ細胞において発現させる
ことができる。ｈＳｕ（ｆｕ）はｐＲＫ５ベクターからサブクローニングした。
サブクローン挿入物にＰＣＲを施して、バキュロウイルス発現ベクター中のｐｏ
ｌｙ-ｈｉｓタグ等の選択されたエピトープタグと枠内で融合させる。ｐｏｌｙ-
ｈｉｓタグｈＳｕ（ｆｕ）挿入物を、ついで、安定なクローンの選択のためのＤ
ＨＦＲ等の選択マーカーを含むＳＶ４０誘導ベクターにサブクローニングできる
。最後に、ＣＨＯ細胞をＳＶ４０誘導ベクターで（上記のように）形質移入する
ことができる。発現を実証するために、上記のように標識化を行ってもよい。発
現されたｐｏｌｙ-ｈｉｓタグｈＳｕ（ｆｕ）を含む培地を、ついで濃縮し、Ｎ
ｉ２＋-キレートアフィニティクロマトグラフィー等の任意の選択される方法に
より精製できる。 タンパク質間相互作用を研究すべく、様々なサブクローンとｃＤＮＡ作成物を
ｈＳｕ（ｆｕ）と多のタンパク質の生産のためにつくり出した。ｈＳｕ（ｆｕ）
ｃＤＮＡをＣＭＶ-系発現ベクター（ｐＲＫ）中にサブクローニングし、そのカ
ルボキシ末端をｆｌａｇペプチドでエピトープタグ化し、Ｆｉｇ１０に提示され
たｈＳｕ（ｆｕ）-ｆｌａｇ-エピトープタンパク質をコードする挿入物を含むｐ
ＲＫ.ｈＳｕ（ｆｕ）を作った（配列番号：１０）。（Ken Kinzler博士により提
供された）ヒトＧｌｉ ｃＤＮＡを同じ発現ベクターにクローニングし、９Ｅ１
０ｃ-ｍｙｃエピトープをアミノ末端（最初のＡＴＧの直ぐ後）に導入してｐＲ
Ｋ.ｈＧｌｉを作った。（Mike Ruppert博士により提供された）ヒトＧｌｉ ３を
ｐＲＫにまたクローニングした。挿入物の３'末端からの配列決定により、公開
された配列（３２）と比較して位置４７００に「Ｔ」ヌクレオチドが失われてい
て、タンパク質の早発の切断が生じていることが明らかにされた。部位特異的突
然変異誘発（Muta-Geneファージミドインビトロ突然変異誘発システム, Bio-Rad
）を用いてこの位置に「Ｔ」を加えてｐＲＫ.ｈＧｌｉ３を作った。マウスＧｌ
ｉ２のコード領域を、鋳型としてMarathon ReadyマウスＥ１１ｃＤＮＡ（Clonte
ch）を用いてＴａｋａｒａＬＡポリメラーゼ（宝酒造株式会社）でのＰＣＲによ
り得て、ｐＲＫにクローニングしてｐＲＫ.ｈＧｌｉ２を得た。ヒトＳｌｉｍｂ
配列（３３）と比較して最初の２２のアミノ酸を失っているマウスｃＤＮＡＳｌ
ｉｍｂをGenome Systemsから取得し（クローン＃１０６８７４２）５'ＲＡＣＥ
によって伸長させた。幾つかの異なった５'ＲＡＣＥ産物を回収したところ、遺
伝子がその５'末端に選択的スプライシングを受けていることが示唆された（（
３３）と（３４）も参照）。公開されたヒトＳｌｉｍｂのアミノ末端に最も密接
に一致する配列を単離し、ｐＲＫ中にクローニングしてｐＲＫ.ｍＳｌｉｍｂを
作った。ｍＳｌｉｍｂ ｃＤＮＡによって予測されるタンパク質はそのヒト対応
物（３３）からの５７２のアミノ酸の９だけで異なっていた。グルタチオン-Ｓ-
トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）-ｈＳｕ（ｆｕ）発現作成物（ｐＧＥＸ.ｈＳｕ（
ｆｕ））を、ファーマシアｐＧＥＸベクター系を使用して作製した。（ＧＳＴ）
-ｈＳｕ（ｆｕ）（配列番号：１１）の発現されたアミノ酸配列はＦｉｇ１１に
示している。
。ｐＲＫ５-ｈＳｕ（ｆｕ）は、ＣａＰＯ４又はＤＥＡＥ-デキストランなどの既
知の試薬を用いてＣＨＯ細胞中に形質移入することができる。上記したように、
細胞培地をインキュベートし、培地を培養培地（単独）又は３５Ｓ-メチオニン
等の放射性標識を含む培地に置換することができる。ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチ
ドの存在を決定した後、培地を無血清培地に置換することができる。好ましくは
、培地を約６日間インキュベートし、ついで条件培地を収集する。ついで、発現
されたｈＳｕ（ｆｕ）を含む培地を濃縮して、任意の選択される方法によって精
製することができる。 また、エピトープタグｈＳｕ（ｆｕ）は、宿主ＣＨＯ細胞において発現させる
ことができる。ｈＳｕ（ｆｕ）はｐＲＫ５ベクターからサブクローニングした。
サブクローン挿入物にＰＣＲを施して、バキュロウイルス発現ベクター中のｐｏ
ｌｙ-ｈｉｓタグ等の選択されたエピトープタグと枠内で融合させる。ｐｏｌｙ-
ｈｉｓタグｈＳｕ（ｆｕ）挿入物を、ついで、安定なクローンの選択のためのＤ
ＨＦＲ等の選択マーカーを含むＳＶ４０誘導ベクターにサブクローニングできる
。最後に、ＣＨＯ細胞をＳＶ４０誘導ベクターで（上記のように）形質移入する
ことができる。発現を実証するために、上記のように標識化を行ってもよい。発
現されたｐｏｌｙ-ｈｉｓタグｈＳｕ（ｆｕ）を含む培地を、ついで濃縮し、Ｎ
ｉ２＋-キレートアフィニティクロマトグラフィー等の任意の選択される方法に
より精製できる。 タンパク質間相互作用を研究すべく、様々なサブクローンとｃＤＮＡ作成物を
ｈＳｕ（ｆｕ）と多のタンパク質の生産のためにつくり出した。ｈＳｕ（ｆｕ）
ｃＤＮＡをＣＭＶ-系発現ベクター（ｐＲＫ）中にサブクローニングし、そのカ
ルボキシ末端をｆｌａｇペプチドでエピトープタグ化し、Ｆｉｇ１０に提示され
たｈＳｕ（ｆｕ）-ｆｌａｇ-エピトープタンパク質をコードする挿入物を含むｐ
ＲＫ.ｈＳｕ（ｆｕ）を作った（配列番号：１０）。（Ken Kinzler博士により提
供された）ヒトＧｌｉ ｃＤＮＡを同じ発現ベクターにクローニングし、９Ｅ１
０ｃ-ｍｙｃエピトープをアミノ末端（最初のＡＴＧの直ぐ後）に導入してｐＲ
Ｋ.ｈＧｌｉを作った。（Mike Ruppert博士により提供された）ヒトＧｌｉ ３を
ｐＲＫにまたクローニングした。挿入物の３'末端からの配列決定により、公開
された配列（３２）と比較して位置４７００に「Ｔ」ヌクレオチドが失われてい
て、タンパク質の早発の切断が生じていることが明らかにされた。部位特異的突
然変異誘発（Muta-Geneファージミドインビトロ突然変異誘発システム, Bio-Rad
）を用いてこの位置に「Ｔ」を加えてｐＲＫ.ｈＧｌｉ３を作った。マウスＧｌ
ｉ２のコード領域を、鋳型としてMarathon ReadyマウスＥ１１ｃＤＮＡ（Clonte
ch）を用いてＴａｋａｒａＬＡポリメラーゼ（宝酒造株式会社）でのＰＣＲによ
り得て、ｐＲＫにクローニングしてｐＲＫ.ｈＧｌｉ２を得た。ヒトＳｌｉｍｂ
配列（３３）と比較して最初の２２のアミノ酸を失っているマウスｃＤＮＡＳｌ
ｉｍｂをGenome Systemsから取得し（クローン＃１０６８７４２）５'ＲＡＣＥ
によって伸長させた。幾つかの異なった５'ＲＡＣＥ産物を回収したところ、遺
伝子がその５'末端に選択的スプライシングを受けていることが示唆された（（
３３）と（３４）も参照）。公開されたヒトＳｌｉｍｂのアミノ末端に最も密接
に一致する配列を単離し、ｐＲＫ中にクローニングしてｐＲＫ.ｍＳｌｉｍｂを
作った。ｍＳｌｉｍｂ ｃＤＮＡによって予測されるタンパク質はそのヒト対応
物（３３）からの５７２のアミノ酸の９だけで異なっていた。グルタチオン-Ｓ-
トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）-ｈＳｕ（ｆｕ）発現作成物（ｐＧＥＸ.ｈＳｕ（
ｆｕ））を、ファーマシアｐＧＥＸベクター系を使用して作製した。（ＧＳＴ）
-ｈＳｕ（ｆｕ）（配列番号：１１）の発現されたアミノ酸配列はＦｉｇ１１に
示している。
【００９７】 実施例７：酵母菌でのｈＳｕ（ｆｕ）の発現 以下の方法は、酵母菌中でのｈＳｕ（ｆｕ）の組換え発現を記載する。 最初に、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターからのｈＳｕ（ｆｕ）の細胞内生
産又は分泌のための酵母菌発現ベクターを作成する。プロモーター及びｈＳｕ（
ｆｕ）をコードするＤＮＡを選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入し
てｈＳｕ（ｆｕ）の細胞内発現を方向付ける。分泌のために、ｈＳｕ（ｆｕ）を
コードするＤＮＡを選択したプラスミドに、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーター
をコードするＤＮＡ、天然ｈＳｕ（ｆｕ）シグナルペプチド又は他の哺乳動物シ
グナルペプチド、あるいは例えば酵母菌アルファ因子もしくはインベルターゼ分
泌シグナル／リーダー配列、及び（必要ならば）ｈＳｕ（ｆｕ）の発現のための
リンカー配列と共にクローニングすることができる。 酵母菌株ＡＢ１１０等の酵母菌は、ついで上記の発現プラスミドで形質転換し
、選択された発酵培地中で培養できる。形質転換した酵母菌上清は、１０％トリ
クロロ酢酸での沈降及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離で分析し、ついでクマシー
ブルー染色でゲルの染色をすることができる。 続いて組換えｈＳｕ（ｆｕ）は、発酵培地から遠心分離により酵母菌細胞を除
去し、ついで選択されたカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することに
よって単離及び精製できる。ｈＳｕ（ｆｕ）を含む濃縮物は、選択されたカラム
クロマトグラフィー樹脂を用いて更に精製することができる。
産又は分泌のための酵母菌発現ベクターを作成する。プロモーター及びｈＳｕ（
ｆｕ）をコードするＤＮＡを選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入し
てｈＳｕ（ｆｕ）の細胞内発現を方向付ける。分泌のために、ｈＳｕ（ｆｕ）を
コードするＤＮＡを選択したプラスミドに、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーター
をコードするＤＮＡ、天然ｈＳｕ（ｆｕ）シグナルペプチド又は他の哺乳動物シ
グナルペプチド、あるいは例えば酵母菌アルファ因子もしくはインベルターゼ分
泌シグナル／リーダー配列、及び（必要ならば）ｈＳｕ（ｆｕ）の発現のための
リンカー配列と共にクローニングすることができる。 酵母菌株ＡＢ１１０等の酵母菌は、ついで上記の発現プラスミドで形質転換し
、選択された発酵培地中で培養できる。形質転換した酵母菌上清は、１０％トリ
クロロ酢酸での沈降及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離で分析し、ついでクマシー
ブルー染色でゲルの染色をすることができる。 続いて組換えｈＳｕ（ｆｕ）は、発酵培地から遠心分離により酵母菌細胞を除
去し、ついで選択されたカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することに
よって単離及び精製できる。ｈＳｕ（ｆｕ）を含む濃縮物は、選択されたカラム
クロマトグラフィー樹脂を用いて更に精製することができる。
【００９８】 実施例８：バキュロウイルス感染昆虫細胞でのｈＳｕ（ｆｕ）の発現 以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞中におけるｈＳｕ（ｆｕ）の組
換え発現を記載する。 ｈＳｕ（ｆｕ）をコードする配列は、バキュロウイルス発現ベクターに含まれ
るエピトープタグの上流に融合させた。このようなエピトープタグは、ｐｏｌｙ
-ｈｉｓタグと免疫グロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域など）を含む。ｐＶＬ１
３９３（Novagen）などの市販プラスミドから誘導されるプラスミドを含む種々
のプラスミドを用いることができる。簡単には、ｈＳｕ（ｆｕ）又はｈＳｕ（ｆ
ｕ）のコード配列の所望部分、例えば成熟タンパク質をコードする配列が、５'
及び３'領域に相補的なプライマーでのＰＣＲにより増幅される。５'プライマー
は、隣接する（選択された）制限酵素部位を包含することができる。生成物は、
ついで、その選択された制限酵素で消化され、発現ベクターにサブクローニング
される。 組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びBaculoGoldＴＭウイルスＤ
ＮＡ（Pharmingen）を、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)
（「Ｓｆ９」）細胞（ATCC CRL 1711）中にリポフェクチン（GIBCO-BRLから市販
）を用いて同時形質移入することにより産生される。２８℃で４−５日インキュ
ベートした後、放出されたウイルスを収集し、更なる増幅に用いた。ウイルス感
染及びタンパク質発現は、O'Reilley等, Baculovirus expression vectors: A L
aboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)に記載されている
ように実施した。
換え発現を記載する。 ｈＳｕ（ｆｕ）をコードする配列は、バキュロウイルス発現ベクターに含まれ
るエピトープタグの上流に融合させた。このようなエピトープタグは、ｐｏｌｙ
-ｈｉｓタグと免疫グロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域など）を含む。ｐＶＬ１
３９３（Novagen）などの市販プラスミドから誘導されるプラスミドを含む種々
のプラスミドを用いることができる。簡単には、ｈＳｕ（ｆｕ）又はｈＳｕ（ｆ
ｕ）のコード配列の所望部分、例えば成熟タンパク質をコードする配列が、５'
及び３'領域に相補的なプライマーでのＰＣＲにより増幅される。５'プライマー
は、隣接する（選択された）制限酵素部位を包含することができる。生成物は、
ついで、その選択された制限酵素で消化され、発現ベクターにサブクローニング
される。 組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びBaculoGoldＴＭウイルスＤ
ＮＡ（Pharmingen）を、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)
（「Ｓｆ９」）細胞（ATCC CRL 1711）中にリポフェクチン（GIBCO-BRLから市販
）を用いて同時形質移入することにより産生される。２８℃で４−５日インキュ
ベートした後、放出されたウイルスを収集し、更なる増幅に用いた。ウイルス感
染及びタンパク質発現は、O'Reilley等, Baculovirus expression vectors: A L
aboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)に記載されている
ように実施した。
【００９９】 ついで、発現されたｐｏｌｙ-ｈｉｓタグｈＳｕ（ｆｕ）は、例えば、Ｎｉ２
＋-キレートアフィニティクロマトグラフィーにより以下のように精製できる。
抽出物は、Rupert等, Nature, 362:175-179 (1993)に記載されているように、ウ
イルス感染した組換えＳｆ９細胞から調製した。簡単には、Ｓｆ９細胞を洗浄し
、超音波処理用バッファー（２５ｍＬのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．９；１２．５ｍＭ
のＭｇＣｌ２；０．１ｍＭのＥＤＴＡ；１０％のグリセロール；０．１％のＮＰ
-４０；０．４ＭのＫＣｌ）中に再懸濁し、氷上で２回２０秒間超音波処理した
。超音波処理物を遠心分離で透明化し、上清を添加液（５０ｍＭのリン酸塩、３
００ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、ｐＨ７．８）で５０倍希釈し、０
．４５μｍフィルターで濾過した。Ｎｉ２＋-ＮＴＡアガロースカラム（Qiagen
から市販）を５ｍＬの総容積で調製し、２５ｍＬの水で洗浄し、２５ｍＬの添加
液で平衡化させた。濾過した細胞抽出物は、毎分０．５ｍＬでカラムに充填した
。カラムを、分画回収が始まる点であるＡ２８０のベースラインまで添加液で洗
浄した。次に、カラムを、結合タンパク質を非特異的に溶離する二次洗浄バッフ
ァー（５０ｍＭのリン酸塩；３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、ｐ
Ｈ６．０）で洗浄した。Ａ２８０のベースラインに再度到達した後、カラムを二
次洗浄バッファー中で０から５００ｍＭのイミダゾール勾配で展開した。１ｍＬ
の分画を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色又はアルカリホスファターゼ（Qi
agen）に複合したＮｉ２＋-ＮＴＡでのウェスタンブロットで分析した。溶離し
たＨｉｓ１０−タグｈＳｕ（ｆｕ）を含む分画をプールし、添加液で透析した。 あるいは、ＩｇＧタグ（又はＦｃタグ）ｈＳｕ（ｆｕ）の精製は、例えば、プ
ロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含む既知のクロマトグ
ラフィー技術を用いて実施できる。
＋-キレートアフィニティクロマトグラフィーにより以下のように精製できる。
抽出物は、Rupert等, Nature, 362:175-179 (1993)に記載されているように、ウ
イルス感染した組換えＳｆ９細胞から調製した。簡単には、Ｓｆ９細胞を洗浄し
、超音波処理用バッファー（２５ｍＬのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．９；１２．５ｍＭ
のＭｇＣｌ２；０．１ｍＭのＥＤＴＡ；１０％のグリセロール；０．１％のＮＰ
-４０；０．４ＭのＫＣｌ）中に再懸濁し、氷上で２回２０秒間超音波処理した
。超音波処理物を遠心分離で透明化し、上清を添加液（５０ｍＭのリン酸塩、３
００ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、ｐＨ７．８）で５０倍希釈し、０
．４５μｍフィルターで濾過した。Ｎｉ２＋-ＮＴＡアガロースカラム（Qiagen
から市販）を５ｍＬの総容積で調製し、２５ｍＬの水で洗浄し、２５ｍＬの添加
液で平衡化させた。濾過した細胞抽出物は、毎分０．５ｍＬでカラムに充填した
。カラムを、分画回収が始まる点であるＡ２８０のベースラインまで添加液で洗
浄した。次に、カラムを、結合タンパク質を非特異的に溶離する二次洗浄バッフ
ァー（５０ｍＭのリン酸塩；３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、ｐ
Ｈ６．０）で洗浄した。Ａ２８０のベースラインに再度到達した後、カラムを二
次洗浄バッファー中で０から５００ｍＭのイミダゾール勾配で展開した。１ｍＬ
の分画を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色又はアルカリホスファターゼ（Qi
agen）に複合したＮｉ２＋-ＮＴＡでのウェスタンブロットで分析した。溶離し
たＨｉｓ１０−タグｈＳｕ（ｆｕ）を含む分画をプールし、添加液で透析した。 あるいは、ＩｇＧタグ（又はＦｃタグ）ｈＳｕ（ｆｕ）の精製は、例えば、プ
ロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含む既知のクロマトグ
ラフィー技術を用いて実施できる。
【０１００】 実施例９：ｈＳｕ（ｆｕ）に結合する抗体の調製 この実施例はｈＳｕ（ｆｕ）に特異的に結合できるモノクローナル抗体の調製
を例示する。 モノクローナル抗体を生産する技術は当該分野で知られており、例えば、上掲
のGodingに記載されている。用いられ得る免疫原は、精製ｈＳｕ（ｆｕ）、ｈＳ
ｕ（ｆｕ）を含む融合タンパク質、及び細胞表面に組換えｈＳｕ（ｆｕ）を発現
する細胞を含む。免疫原の選択は、当業者が過度の実験をすることなく、なすこ
とができる。 Ｂａｌｂ／ｃ等のマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化して皮下又は
腹腔内に１−１００マイクログラムで注入したｈＳｕ（ｆｕ）免疫原で免疫化す
る。あるいは、免疫原をＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（Ribi Immunochemical Re
searh, Hamilton, MT）に乳化し、動物の後足蹠に注入される。免疫化したマウ
スは、ついで１０から１２日後に、選択したアジュバント中に乳化した付加的免
疫源で追加免疫する。その後、数週間、マウスを更なる免疫化注射で追加免疫す
る。抗ｈＳｕ（ｆｕ）抗体の検出のためのＥＬＩＳＡアッセイで試験するために
、レトロオービタル出血からの血清試料をマウスから周期的に採取することがで
きる。
を例示する。 モノクローナル抗体を生産する技術は当該分野で知られており、例えば、上掲
のGodingに記載されている。用いられ得る免疫原は、精製ｈＳｕ（ｆｕ）、ｈＳ
ｕ（ｆｕ）を含む融合タンパク質、及び細胞表面に組換えｈＳｕ（ｆｕ）を発現
する細胞を含む。免疫原の選択は、当業者が過度の実験をすることなく、なすこ
とができる。 Ｂａｌｂ／ｃ等のマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化して皮下又は
腹腔内に１−１００マイクログラムで注入したｈＳｕ（ｆｕ）免疫原で免疫化す
る。あるいは、免疫原をＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（Ribi Immunochemical Re
searh, Hamilton, MT）に乳化し、動物の後足蹠に注入される。免疫化したマウ
スは、ついで１０から１２日後に、選択したアジュバント中に乳化した付加的免
疫源で追加免疫する。その後、数週間、マウスを更なる免疫化注射で追加免疫す
る。抗ｈＳｕ（ｆｕ）抗体の検出のためのＥＬＩＳＡアッセイで試験するために
、レトロオービタル出血からの血清試料をマウスから周期的に採取することがで
きる。
【０１０１】 適当な抗体力価が検出された後、抗体に「陽性」な動物に、ｈＳｕ（ｆｕ）の
静脈内注射の最後の注入をすることができる。３から４日後、マウスを屠殺し、
脾臓を取り出した。ついで脾臓細胞を（３５％ポリエチレングリコールを用いて
）、ＡＣＴＴから番号ＣＲＬ１５９７で入手可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１等の選
択されたマウス骨髄腫株化細胞に融合させた。融合によりハイブリドーマ細胞が
生成され、ついで、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン）
培地を含む９６ウェル組織培養プレートに蒔き、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッ
ド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害した。 ハイブリドーマ細胞は、ｈＳｕ（ｆｕ）に対する反応性についてのＥＬＩＳＡ
でスクリーニングされる。ｈＳｕ（ｆｕ）に対する所望のモノクローナル抗体を
分泌する「陽性」ハイブリドーマ細胞の決定は、当業者の技量の範囲内である。 陽性ハイブリドーマ細胞を同系のＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注入し、抗ｈＳ
ｕ（ｆｕ）モノクローナル抗体を含む腹水を生成させる。あるいは、ハイブリド
ーマ細胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトルで成長させることもできる。
腹水中に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降、それ
に続くゲル排除クロマトグラフィ−を用いて行うことができる。あるいは、抗体
のプロテインＡ又はプロテインＧへの結合に基づくアフィニティクロマトグラフ
ィーを用いることができる。
静脈内注射の最後の注入をすることができる。３から４日後、マウスを屠殺し、
脾臓を取り出した。ついで脾臓細胞を（３５％ポリエチレングリコールを用いて
）、ＡＣＴＴから番号ＣＲＬ１５９７で入手可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１等の選
択されたマウス骨髄腫株化細胞に融合させた。融合によりハイブリドーマ細胞が
生成され、ついで、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン）
培地を含む９６ウェル組織培養プレートに蒔き、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッ
ド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害した。 ハイブリドーマ細胞は、ｈＳｕ（ｆｕ）に対する反応性についてのＥＬＩＳＡ
でスクリーニングされる。ｈＳｕ（ｆｕ）に対する所望のモノクローナル抗体を
分泌する「陽性」ハイブリドーマ細胞の決定は、当業者の技量の範囲内である。 陽性ハイブリドーマ細胞を同系のＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注入し、抗ｈＳ
ｕ（ｆｕ）モノクローナル抗体を含む腹水を生成させる。あるいは、ハイブリド
ーマ細胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトルで成長させることもできる。
腹水中に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降、それ
に続くゲル排除クロマトグラフィ−を用いて行うことができる。あるいは、抗体
のプロテインＡ又はプロテインＧへの結合に基づくアフィニティクロマトグラフ
ィーを用いることができる。
【０１０２】 実施例１０．ｈＳｕ（ｆｕ）に結合する抗体の使用 抗ｈＳｕ（ｆｕ）抗体での免疫細胞化学。 ｈＳｕ（ｆｕ）ポリクローナル抗
体を、精製したＧＳＴ-ｈＳｕ（ｆｕ）融合タンパク質でのウサギの免疫化によ
り産生した。得られた抗体をプロテインＡカラムでのアフィニティークロマトグ
ラフィーによって精製した。 ProNectin F（Stratagene）被覆ガラスチャンバースライド中のサブコンフル
エントなＣＯＳ-７細胞に、ＤＥＡＥ-デキストランに続いてＤＭＳＯショックを
使用して、ｐＲＫ.ｈＳｕ（ｆｕ）、ｐＲＫ.ｈＧｌｉ、又は双方のプラスミドの
何れかを一過性に形質移入した。２４時間後に、細胞を４％のパラホルムアルデ
ヒド中で１０分間固定し、０．１％のトリトン-Ｘ１００中で５分間透過処理し
、ブロックバッファー（ＰＢＳ中５％のヤギ血清）中でブロックし、抗ｈＳｕ（
ｆｕ）ポリクローナル（以下を参照）及び／又は抗ｃ−ｍｙｃモノクローナル抗
体（ジェネンテク；ブロックバッファー中３μｇ／ｍｌで１時間）からなる一次
抗体と反応させた。細胞を洗浄し、それぞれ、ブロックバッファー中で１時間、
ｃｙ３−抗ウサギＩｇＧ（１：３５０）及び／又はｃｙ２-抗マウスＩｇＧ（１
：１００；Jackson ImmunoResearch）の何れかで標識した。スライドを洗浄し、
Fluoromount-G（Southern Biotechnology Assoc., Inc.）においてカバーガラス
をした。
体を、精製したＧＳＴ-ｈＳｕ（ｆｕ）融合タンパク質でのウサギの免疫化によ
り産生した。得られた抗体をプロテインＡカラムでのアフィニティークロマトグ
ラフィーによって精製した。 ProNectin F（Stratagene）被覆ガラスチャンバースライド中のサブコンフル
エントなＣＯＳ-７細胞に、ＤＥＡＥ-デキストランに続いてＤＭＳＯショックを
使用して、ｐＲＫ.ｈＳｕ（ｆｕ）、ｐＲＫ.ｈＧｌｉ、又は双方のプラスミドの
何れかを一過性に形質移入した。２４時間後に、細胞を４％のパラホルムアルデ
ヒド中で１０分間固定し、０．１％のトリトン-Ｘ１００中で５分間透過処理し
、ブロックバッファー（ＰＢＳ中５％のヤギ血清）中でブロックし、抗ｈＳｕ（
ｆｕ）ポリクローナル（以下を参照）及び／又は抗ｃ−ｍｙｃモノクローナル抗
体（ジェネンテク；ブロックバッファー中３μｇ／ｍｌで１時間）からなる一次
抗体と反応させた。細胞を洗浄し、それぞれ、ブロックバッファー中で１時間、
ｃｙ３−抗ウサギＩｇＧ（１：３５０）及び／又はｃｙ２-抗マウスＩｇＧ（１
：１００；Jackson ImmunoResearch）の何れかで標識した。スライドを洗浄し、
Fluoromount-G（Southern Biotechnology Assoc., Inc.）においてカバーガラス
をした。
【０１０３】 実施例１１．ｈＳｕ（ｆｕ）を含むタンパク質間相互作用 インビトロ共沈アッセイを実施してタンパク質間相互作用を研究した。ＮＩＨ
-３Ｔ３細胞を、１０％ウシ胎仔血清と１００単位／ｍｌのペンストレップ（成
長培地）を含むＤＭＥＭ中で、１０ｃｍ組織培養皿中で３０％の集密度まで成長
させた。全体で１０μｇのＤＮＡ／皿、３６μｌのリポフェクタミン及び５ｍｌ
のoptiＭＥＭ（Gibco BRL）を用いて製造者のプロトコル（Gibco BRL）に従って
、リポフェクタミンを細胞に一過性に形質移入した。二つのプラスミドを同時に
形質移入するとき、各々の５μｇを使用した。４２時間後、細胞をＰＢＳ（４℃
）中で２ｘ洗浄し、（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣ
ｌ、１％のＮＰ-４０、それぞれ５μｇ／ｍｌのロイペプチンとアプロチニン、
１ｍＭのＰＭＳＦ、及び２５０μＭのオルトバナデートを含む）１ｍｌの氷冷溶
解バッファー中に直接溶解させた。可溶化液を４℃で２０分間回転させ、ついで
１４０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離し、上清を、２μｌの抗ｆｌａｇＭ２モ
ノクローナル抗体（Kodak IBI）又は２μｌの抗ｍｙｃモノクローナル抗体（９
Ｅ１０；ジェネンテク）の何れかでの終夜（４℃）の免疫沈降を施した。プロテ
インＡセファロース（Pharmacia）を４℃にて１時間、添加した（溶解バッファ
ー中２５μｌの５０：５０スラリー）。ビーズを３ｘ溶解バッファーで、また１
ｘ０．５ＭのＮａＣｌで洗浄し、２ｘＳＤＳ添加液を添加し、試料を煮沸させ（
５分）、８％の変性ＳＤＳポリアクルルアミドゲル（Novex）上で電気泳動させ
た。ＥＣＬ検出システム（Amersham）を使用して、タンパク質を、ニトロセルロ
ースへのブロッティング、ｆｌａｇ又はｍｙｃエピトープへの抗体での探索によ
り検出した。 ＧＳＴ-融合タンパク質インビトロ結合アッセイを実施した。ｐＧＥＸ.ｈＳｕ
（ｆｕ）をＤＨ１２Ｓ細菌細胞に形質転換し、５００ｍｌの終夜培養物を、製造
者のプロトコル（Pharmacia）に従ってＧＳＴ-ｈＳｕ（ｆｕ）融合タンパク質の
精製のために処理した。融合タンパク質を過剰の還元グルタチオンでビーズから
溶出させ、溶出させたタンパク質を、変性ＳＤＳ-ポリアクルルアミドゲル上で
のＯＤ２８０測定と可視化によって定量化した（データは示さず）。グルタチオ
ンセファロースビーズに４μｇの融合タンパク質又はＧＳＴ（Sigma）を４℃に
て２時間の間、負荷し、ついで結合バッファーで３ｘ洗浄した。２５μｌのビー
ズ（５０：５０スラリー）を、５０μｌ結合バッファー中に入った２−８μｌの
の３５Ｓ-標識インビトロ翻訳ｈＧｌｉ、ｍＧｌｉ２、ｈＧｌｉ３、ｍＳｌｉｍ
ｂ、又はｈＳｕ（ｆｕ）と共に４℃にて２時間の間インキュベートした。ビーズ
を３ｘ溶解バッファーで洗浄し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥのために処理した。ゲルを続
いて固定し、ＥＮ３ＨＡＮＣＥ（Dupont NEN）において増幅し、乾燥させ、Koda
k X-ARフィルムに曝した。結合バッファーは５０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ８．
０、１５０ｍＭのＮａＣｌ及びプロテアーゼインヒビターである（上述の通り）
。５０μｌの反応容積中において２０μＣｉ[３５Ｓ]-メチオニン（Amersham）
及びＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼで、ＴＮＴ結合網状赤血球溶解液系（Promega）
を使用して、ｐＲＫ.ｈＧｌｉ、ｐＲＫ.ｍＧｌｉ２、ｐＲＫ.ｈＧｌｉ３、ｐＲ
Ｋ.ｍＳｌｉｍｂ、ｐＲＫ.ｈＳｕ（ｆｕ）及びＳＰ６-ルシフェラーゼ対照プラ
スミドを転写し、インビトロで翻訳した。およそのタンパク質の定量のために、
各反応物の１μｌに変性ＳＤＳ-ＰＡＧＥを施した。各タンパク質の等価量を結
合アッセイにおいて使用した。
-３Ｔ３細胞を、１０％ウシ胎仔血清と１００単位／ｍｌのペンストレップ（成
長培地）を含むＤＭＥＭ中で、１０ｃｍ組織培養皿中で３０％の集密度まで成長
させた。全体で１０μｇのＤＮＡ／皿、３６μｌのリポフェクタミン及び５ｍｌ
のoptiＭＥＭ（Gibco BRL）を用いて製造者のプロトコル（Gibco BRL）に従って
、リポフェクタミンを細胞に一過性に形質移入した。二つのプラスミドを同時に
形質移入するとき、各々の５μｇを使用した。４２時間後、細胞をＰＢＳ（４℃
）中で２ｘ洗浄し、（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣ
ｌ、１％のＮＰ-４０、それぞれ５μｇ／ｍｌのロイペプチンとアプロチニン、
１ｍＭのＰＭＳＦ、及び２５０μＭのオルトバナデートを含む）１ｍｌの氷冷溶
解バッファー中に直接溶解させた。可溶化液を４℃で２０分間回転させ、ついで
１４０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離し、上清を、２μｌの抗ｆｌａｇＭ２モ
ノクローナル抗体（Kodak IBI）又は２μｌの抗ｍｙｃモノクローナル抗体（９
Ｅ１０；ジェネンテク）の何れかでの終夜（４℃）の免疫沈降を施した。プロテ
インＡセファロース（Pharmacia）を４℃にて１時間、添加した（溶解バッファ
ー中２５μｌの５０：５０スラリー）。ビーズを３ｘ溶解バッファーで、また１
ｘ０．５ＭのＮａＣｌで洗浄し、２ｘＳＤＳ添加液を添加し、試料を煮沸させ（
５分）、８％の変性ＳＤＳポリアクルルアミドゲル（Novex）上で電気泳動させ
た。ＥＣＬ検出システム（Amersham）を使用して、タンパク質を、ニトロセルロ
ースへのブロッティング、ｆｌａｇ又はｍｙｃエピトープへの抗体での探索によ
り検出した。 ＧＳＴ-融合タンパク質インビトロ結合アッセイを実施した。ｐＧＥＸ.ｈＳｕ
（ｆｕ）をＤＨ１２Ｓ細菌細胞に形質転換し、５００ｍｌの終夜培養物を、製造
者のプロトコル（Pharmacia）に従ってＧＳＴ-ｈＳｕ（ｆｕ）融合タンパク質の
精製のために処理した。融合タンパク質を過剰の還元グルタチオンでビーズから
溶出させ、溶出させたタンパク質を、変性ＳＤＳ-ポリアクルルアミドゲル上で
のＯＤ２８０測定と可視化によって定量化した（データは示さず）。グルタチオ
ンセファロースビーズに４μｇの融合タンパク質又はＧＳＴ（Sigma）を４℃に
て２時間の間、負荷し、ついで結合バッファーで３ｘ洗浄した。２５μｌのビー
ズ（５０：５０スラリー）を、５０μｌ結合バッファー中に入った２−８μｌの
の３５Ｓ-標識インビトロ翻訳ｈＧｌｉ、ｍＧｌｉ２、ｈＧｌｉ３、ｍＳｌｉｍ
ｂ、又はｈＳｕ（ｆｕ）と共に４℃にて２時間の間インキュベートした。ビーズ
を３ｘ溶解バッファーで洗浄し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥのために処理した。ゲルを続
いて固定し、ＥＮ３ＨＡＮＣＥ（Dupont NEN）において増幅し、乾燥させ、Koda
k X-ARフィルムに曝した。結合バッファーは５０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ８．
０、１５０ｍＭのＮａＣｌ及びプロテアーゼインヒビターである（上述の通り）
。５０μｌの反応容積中において２０μＣｉ[３５Ｓ]-メチオニン（Amersham）
及びＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼで、ＴＮＴ結合網状赤血球溶解液系（Promega）
を使用して、ｐＲＫ.ｈＧｌｉ、ｐＲＫ.ｍＧｌｉ２、ｐＲＫ.ｈＧｌｉ３、ｐＲ
Ｋ.ｍＳｌｉｍｂ、ｐＲＫ.ｈＳｕ（ｆｕ）及びＳＰ６-ルシフェラーゼ対照プラ
スミドを転写し、インビトロで翻訳した。およそのタンパク質の定量のために、
各反応物の１μｌに変性ＳＤＳ-ＰＡＧＥを施した。各タンパク質の等価量を結
合アッセイにおいて使用した。
【０１０４】 Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Inc)を使用して、ルシフ
ェラーゼレポーターアッセイを、記載されているようにして（２４）、Ｃ３Ｈ１
０Ｔ１／２細胞において実施した。同時形質移入されたRenillaルシフェラーゼ
内部標準の活性に対してホタルルシフェラーゼレポーターの活性を基準化するこ
とにより、形質移入効率の差を修正した。 ｈＳｕ（ｆｕ）の生化学相互作用と生物活性を決定した。過去の研究はショウ
ジョウバエＧｌｉ相同体であるＣｉに対するｄＳｕ（ｆｕ）の結合を証明したの
で（２９）、我々は類似の相互作用がそのヒトタンパク質対応物の間に存在する
かどうかを試験した。我々は免疫細胞化学を用いて、形質移入したＣＯＳ-７細
胞における一過性に過剰発現されたｈＳｕ（ｆｕ）及びｈＧｌｉの細胞下局在化
を可視化した。個々に発現されると、ｈＳｕ（ｆｕ）とｈＧｌｉは細胞質全体に
わたって広く分散し、核内にしばしば検出された（Ｆｉｇ５Ａ、上部パネル）。
また、それらはβ-チューブリン（データを示さず）のものと同様の染色パター
ンを示しており、それらが微小管と共存していることを示唆している。細胞をｈ
Ｓｕ（ｆｕ）及びｈＧｌｉで同時形質移入したとき、二重標識化がその染色パタ
ーンにおける広範なオーバラップを明らかにした。更に、ｈＧｌｉは細胞質の全
体にわたってもはや見いだされず、代わりに点状の密に染色された領域に集まっ
ており、これはまたｈＳｕ（ｆｕ）に対しても強く標識された（Ｆｉｇ５Ａ、下
方パネル）。これらの密に染色された領域は、ｈＳｕ（ｆｕ）だけを過剰発現す
る細胞には見られず、常に両方のタンパク質に対して染色されていたが、ｈＳｕ
（ｆｕ）によるｈＧｌｉの細胞質隔離を表しているかもしれない。 ｈＳｕ（ｆｕ）によるｈＧｌｉの細胞下隔離が二つのタンパク質間の生化学的
相互作用によるものであるかどうかを調べるために、我々はｈＧｌｉでｈＳｕ（
ｆｕ）の共免疫沈降を調べた。ＮＩＨ-３Ｔ３細胞にｆｌａｇエピトープ-タグｈ
Ｓｕ（ｆｕ）（ｐＲＫ.ｈＳｕ（ｆｕ））及びｃ−ｍｙｃエピトープ-タグｈＧｌ
ｉ（ｐＲＫ.ｈＧｌｉ）のための発現プラスミドを一過性に形質移入し、細胞を
４２時間後に溶解し、溶解したタンパク質複合体を抗ｆｌａｇ又は抗ｍｙｃ抗体
の何れかで免疫沈降させ、ついで交互抗体を用いてウェスタンブロットにかけた
。ｈＳｕ（ｆｕ）又はｈＧｌｉだけを発現する細胞からは共免疫沈降タンパク質
は検出されなかった（Ｆｉｇ５Ｂ）。これに対して、両方のタンパク質を同時発
現する細胞から、ｈＳｕ（ｆｕ）がｈＧｌｉで直ぐに共免疫沈降させられ、ｈＧ
ｌｉがｈＳｕ（ｆｕ）で直ぐに共免疫沈降させられた（Ｆｉｇ５Ｂ）。ｈＳｕ（
ｆｕ）-ｈＧｌｉの相互作用はインビトロ結合アッセイを使用して確認された。
この目的のために、細菌により生産されたＧＳＴ-ｈＳｕ（ｆｕ）タンパク質を
グルタチオンセファロースビーズに負荷し、インビトロ翻訳３５Ｓ-標識ｈＧｌ
ｉを保持する能力を調べた。ｈＧｌｉはＧＳＴ-ｈＳｕ（ｆｕ）グルタチオンセ
ファロースビーズ上に特異的に保持されたが、ＧＳＴだけが負荷されたビーズに
は保持されなかった（Ｆｉｇ５Ｃ）。
ェラーゼレポーターアッセイを、記載されているようにして（２４）、Ｃ３Ｈ１
０Ｔ１／２細胞において実施した。同時形質移入されたRenillaルシフェラーゼ
内部標準の活性に対してホタルルシフェラーゼレポーターの活性を基準化するこ
とにより、形質移入効率の差を修正した。 ｈＳｕ（ｆｕ）の生化学相互作用と生物活性を決定した。過去の研究はショウ
ジョウバエＧｌｉ相同体であるＣｉに対するｄＳｕ（ｆｕ）の結合を証明したの
で（２９）、我々は類似の相互作用がそのヒトタンパク質対応物の間に存在する
かどうかを試験した。我々は免疫細胞化学を用いて、形質移入したＣＯＳ-７細
胞における一過性に過剰発現されたｈＳｕ（ｆｕ）及びｈＧｌｉの細胞下局在化
を可視化した。個々に発現されると、ｈＳｕ（ｆｕ）とｈＧｌｉは細胞質全体に
わたって広く分散し、核内にしばしば検出された（Ｆｉｇ５Ａ、上部パネル）。
また、それらはβ-チューブリン（データを示さず）のものと同様の染色パター
ンを示しており、それらが微小管と共存していることを示唆している。細胞をｈ
Ｓｕ（ｆｕ）及びｈＧｌｉで同時形質移入したとき、二重標識化がその染色パタ
ーンにおける広範なオーバラップを明らかにした。更に、ｈＧｌｉは細胞質の全
体にわたってもはや見いだされず、代わりに点状の密に染色された領域に集まっ
ており、これはまたｈＳｕ（ｆｕ）に対しても強く標識された（Ｆｉｇ５Ａ、下
方パネル）。これらの密に染色された領域は、ｈＳｕ（ｆｕ）だけを過剰発現す
る細胞には見られず、常に両方のタンパク質に対して染色されていたが、ｈＳｕ
（ｆｕ）によるｈＧｌｉの細胞質隔離を表しているかもしれない。 ｈＳｕ（ｆｕ）によるｈＧｌｉの細胞下隔離が二つのタンパク質間の生化学的
相互作用によるものであるかどうかを調べるために、我々はｈＧｌｉでｈＳｕ（
ｆｕ）の共免疫沈降を調べた。ＮＩＨ-３Ｔ３細胞にｆｌａｇエピトープ-タグｈ
Ｓｕ（ｆｕ）（ｐＲＫ.ｈＳｕ（ｆｕ））及びｃ−ｍｙｃエピトープ-タグｈＧｌ
ｉ（ｐＲＫ.ｈＧｌｉ）のための発現プラスミドを一過性に形質移入し、細胞を
４２時間後に溶解し、溶解したタンパク質複合体を抗ｆｌａｇ又は抗ｍｙｃ抗体
の何れかで免疫沈降させ、ついで交互抗体を用いてウェスタンブロットにかけた
。ｈＳｕ（ｆｕ）又はｈＧｌｉだけを発現する細胞からは共免疫沈降タンパク質
は検出されなかった（Ｆｉｇ５Ｂ）。これに対して、両方のタンパク質を同時発
現する細胞から、ｈＳｕ（ｆｕ）がｈＧｌｉで直ぐに共免疫沈降させられ、ｈＧ
ｌｉがｈＳｕ（ｆｕ）で直ぐに共免疫沈降させられた（Ｆｉｇ５Ｂ）。ｈＳｕ（
ｆｕ）-ｈＧｌｉの相互作用はインビトロ結合アッセイを使用して確認された。
この目的のために、細菌により生産されたＧＳＴ-ｈＳｕ（ｆｕ）タンパク質を
グルタチオンセファロースビーズに負荷し、インビトロ翻訳３５Ｓ-標識ｈＧｌ
ｉを保持する能力を調べた。ｈＧｌｉはＧＳＴ-ｈＳｕ（ｆｕ）グルタチオンセ
ファロースビーズ上に特異的に保持されたが、ＧＳＴだけが負荷されたビーズに
は保持されなかった（Ｆｉｇ５Ｃ）。
【０１０５】 更なる実験において、我々は、ｈＳｕ（ｆｕ）と相互作用するＧｌｉ相同体で
あるＧｌｉ２及びＧｌｉ３の能力を調べた。３５Ｓ-標識ｍＧｌｉ２及びｈＧｌ
ｉ３はＧＳＴ-ｈＳｕ（ｆｕ）-結合ビーズによって特異的に保持されたが、ルシ
フェラーゼ、負の対照は保持されなかった（Ｆｉｇ５Ｃ）。９Ｅ１０ｃ-ｍｙｃ
エピトープがタンパク質の端のカルボキシ末端に融合しているｈＧｌｉ３の型は
このアッセイにおいてｈＳｕ（ｆｕ）には結合せず（データは示さず）、Ｇｌｉ
３のカルボキシ末端領域が相互作用のためには重要であることを示している。 ここに提示された結合データは、脊椎動物Ｇｌｉの活性がＳｕ（ｆｕ）との相
互作用によって負に調節されることを示している。よって、機能性Ｇｌｉレポー
ターアッセイにおいてｈＧｌｉの活性をｈＳｕ（ｆｕ）が阻害できるかどうかを
調べた。このために、Ｇｌｉ結合部位（４２）の９のコピーを単純ヘルペスウィ
ルスチミジンキナーゼ最小プロモーターに結合させたが、これがレポーターホタ
ルルシフェラーゼ遺伝子の転写を方向付ける。この作成物からのルシフェラーゼ
遺伝子の発現はＧｌｉ及びＳｈｈレセプターの成分（２４）によって特異的に調
節されることが分かった。過去に実証されているように（２４）、無関係なタン
パク質をコードする発現プラスミド（ｐＲＫ.ＥＧＦＰ）とルシフェラーゼレポ
ーター作成物とのＣ３Ｈ１０Ｔ１／２の同時形質移入は、非常に低いレベルのル
シフェラーゼ活性という結果になった（Ｆｉｇ５Ｄ）。これに対して、ｈＧｌｉ
発現プラスミドとのレポーター遺伝子の同時形質移入は、ルシフェラーゼ活性の
レベルがおよそ１００倍増加する結果となった（Ｆｉｇ５Ｄ）。重要なことに、
ｄＳｕ（ｆｕ）がＣｉの負の制御因子であるという考えと一致して、ｈＧｌｉ活
性化レポーター発現が同時発現ｈＳｕ（ｆｕ）の存在下で有意に抑制されたが無
関係なタンパク質ではそうではない（Ｆｉｇ５Ｄ）。興味深いことには、バック
グラウンドを越えるルシフェラーゼ活性の増加は、ｈＳｕ（ｆｕ）が外因性ｈＧ
ｌｉの不在下でレポーター遺伝子と同時発現されたときに検出された（Ｆｉｇ５
Ｄ）。併せて考えると、我々の知見は、ｈＳｕ（ｆｕ）のｈＧｌｉとの物理的な
相互作用がその転写活性の不活性化に導くことを示している。 ｈＳｕ（ｆｕ）作用の可能な機構の調査を開始するために、我々はｈＳｕ（ｆ
ｕ）と、Ｓｌｉｍｂ／βＴｒＣＰの脊椎動物相同体である、Ｃｉと他のタンパク
質のユビキチン-プロテアソーム分解経路へのターゲティングに関係しているＦ-
ボックス含有タンパク質との間の相互作用を調べた（３１，３４，４３）。我々
は、インビトロ翻訳３５Ｓ-標識ｍＳｌｉｍｂは確かにＧＳＴ-ｈＳｕ（ｆｕ）-
抱合グルタチオンセファロースビーズに特異的に結合するが、ＧＳＴ-抱合ビー
ズ単独には結合しないことを見いだした（Ｆｉｇ５Ｃ）。如何なる特定の作用機
構によっても限定されることを望むものではないが、ｈＳｕ（ｆｕ）はおそらく
部分的にはｈＧｌｉとＳｌｉｍｂの双方とのその物理的相互作用を通してＳｌｉ
ｍｂ／βＴｒＣＰ-依存プロテアソーム分解経路までｈＧｌｉをターゲティング
することにより、ｈＧｌｉを不活性化することが提案される。あるいは、ｈＳｕ
（ｆｕ）自体がＳｌｉｍｂ-媒介分解の標的であり得、その分解がｈＧｌｉを機
能させるようにできる。何れの場合でも、ｈＳｕ（ｆｕ）はＺｎフィンガー転写
因子Ｇｌｉを通してのヘッジホッグシグナル伝達の負の制御因子である。興味深
いことに、３５Ｓ-標識Ｓｕ（ｆｕ）はまたＧＳＴ-ｈＳｕ（ｆｕ）に結合し（Ｆ
ｉｇ５Ｃ）、ｈＳｕ（ｆｕ）は２-ハイブリッドアッセイにおいてそれ自身に結
合することが見いだされており（データは示さず）、ｈＳｕ（ｆｕ）が二量体と
して機能する可能性が非常に高いことを示している。
あるＧｌｉ２及びＧｌｉ３の能力を調べた。３５Ｓ-標識ｍＧｌｉ２及びｈＧｌ
ｉ３はＧＳＴ-ｈＳｕ（ｆｕ）-結合ビーズによって特異的に保持されたが、ルシ
フェラーゼ、負の対照は保持されなかった（Ｆｉｇ５Ｃ）。９Ｅ１０ｃ-ｍｙｃ
エピトープがタンパク質の端のカルボキシ末端に融合しているｈＧｌｉ３の型は
このアッセイにおいてｈＳｕ（ｆｕ）には結合せず（データは示さず）、Ｇｌｉ
３のカルボキシ末端領域が相互作用のためには重要であることを示している。 ここに提示された結合データは、脊椎動物Ｇｌｉの活性がＳｕ（ｆｕ）との相
互作用によって負に調節されることを示している。よって、機能性Ｇｌｉレポー
ターアッセイにおいてｈＧｌｉの活性をｈＳｕ（ｆｕ）が阻害できるかどうかを
調べた。このために、Ｇｌｉ結合部位（４２）の９のコピーを単純ヘルペスウィ
ルスチミジンキナーゼ最小プロモーターに結合させたが、これがレポーターホタ
ルルシフェラーゼ遺伝子の転写を方向付ける。この作成物からのルシフェラーゼ
遺伝子の発現はＧｌｉ及びＳｈｈレセプターの成分（２４）によって特異的に調
節されることが分かった。過去に実証されているように（２４）、無関係なタン
パク質をコードする発現プラスミド（ｐＲＫ.ＥＧＦＰ）とルシフェラーゼレポ
ーター作成物とのＣ３Ｈ１０Ｔ１／２の同時形質移入は、非常に低いレベルのル
シフェラーゼ活性という結果になった（Ｆｉｇ５Ｄ）。これに対して、ｈＧｌｉ
発現プラスミドとのレポーター遺伝子の同時形質移入は、ルシフェラーゼ活性の
レベルがおよそ１００倍増加する結果となった（Ｆｉｇ５Ｄ）。重要なことに、
ｄＳｕ（ｆｕ）がＣｉの負の制御因子であるという考えと一致して、ｈＧｌｉ活
性化レポーター発現が同時発現ｈＳｕ（ｆｕ）の存在下で有意に抑制されたが無
関係なタンパク質ではそうではない（Ｆｉｇ５Ｄ）。興味深いことには、バック
グラウンドを越えるルシフェラーゼ活性の増加は、ｈＳｕ（ｆｕ）が外因性ｈＧ
ｌｉの不在下でレポーター遺伝子と同時発現されたときに検出された（Ｆｉｇ５
Ｄ）。併せて考えると、我々の知見は、ｈＳｕ（ｆｕ）のｈＧｌｉとの物理的な
相互作用がその転写活性の不活性化に導くことを示している。 ｈＳｕ（ｆｕ）作用の可能な機構の調査を開始するために、我々はｈＳｕ（ｆ
ｕ）と、Ｓｌｉｍｂ／βＴｒＣＰの脊椎動物相同体である、Ｃｉと他のタンパク
質のユビキチン-プロテアソーム分解経路へのターゲティングに関係しているＦ-
ボックス含有タンパク質との間の相互作用を調べた（３１，３４，４３）。我々
は、インビトロ翻訳３５Ｓ-標識ｍＳｌｉｍｂは確かにＧＳＴ-ｈＳｕ（ｆｕ）-
抱合グルタチオンセファロースビーズに特異的に結合するが、ＧＳＴ-抱合ビー
ズ単独には結合しないことを見いだした（Ｆｉｇ５Ｃ）。如何なる特定の作用機
構によっても限定されることを望むものではないが、ｈＳｕ（ｆｕ）はおそらく
部分的にはｈＧｌｉとＳｌｉｍｂの双方とのその物理的相互作用を通してＳｌｉ
ｍｂ／βＴｒＣＰ-依存プロテアソーム分解経路までｈＧｌｉをターゲティング
することにより、ｈＧｌｉを不活性化することが提案される。あるいは、ｈＳｕ
（ｆｕ）自体がＳｌｉｍｂ-媒介分解の標的であり得、その分解がｈＧｌｉを機
能させるようにできる。何れの場合でも、ｈＳｕ（ｆｕ）はＺｎフィンガー転写
因子Ｇｌｉを通してのヘッジホッグシグナル伝達の負の制御因子である。興味深
いことに、３５Ｓ-標識Ｓｕ（ｆｕ）はまたＧＳＴ-ｈＳｕ（ｆｕ）に結合し（Ｆ
ｉｇ５Ｃ）、ｈＳｕ（ｆｕ）は２-ハイブリッドアッセイにおいてそれ自身に結
合することが見いだされており（データは示さず）、ｈＳｕ（ｆｕ）が二量体と
して機能する可能性が非常に高いことを示している。
【０１０６】 更なる引用文献 1. Ingham,P.W. (1995) Curr. Opin. Genet. Dev. 5, 492-8 2. Hammerschmidt, M., Brook, A.及びMcMahon, A.P. (1997) Trends Genet. 13
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5-245 59. Hui, C.-C., Slusarski, D., Platt, K.A., Holmgren, R.及びJoyner, A.L.
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1998) Development 125, 2759-2770 63. Ding, J., Yang, L., Yan, Y.-T., Chen, A., Desai, N., Wynshaw-Boris,
A.及びShen, M.M. (1998) Nature 395, 702-707 64. Neer, E.J., Schmidt, C.J., Nambudripad, R.及びSmith, T.F. (1994) Nat
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ledge, S.J. (1996) Cell 86, 263-274 66. Skowyra, D., Craig, K.L., Tyers, M., Elledge, S.J.及びHarper, J.W. (
1997) Cell 91, 209-219 67. Yoon, J.W., Liu, C.Z., Yang, J.T., Swart, R., Iannaccone, P.及びWalt
erhouse, D. (1998) J. Biol. Chem. 6, 3496-3501
【０１０７】 材料の寄託 次の材料をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション, １０８０１ユニ
バーシティ・ブルーバード、バージニア州２０１１０−２２０９、米国(ＡＴＣ
Ｃ)に寄託した： 材料 ATCC寄託番号 寄託日 DNA33455-1548 PTA-127 1999年3月5日 この寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条
約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付
から３０年間、寄託の生存可能な培養が維持されることを保証するものである。
寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とＡＴＣＣとの間の
合意に従い、ＡＴＣＣから入手することができ、これは、どれが最初であろうと
も、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄
託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法
第１２２条及びそれに従う特許庁長官規則(特に参照番号８８６ＯＧ６３８の３
７ＣＦＲ第１．１４条を含む)に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定し
た者に子孫を入手可能とすることを保証するものである。
バーシティ・ブルーバード、バージニア州２０１１０−２２０９、米国(ＡＴＣ
Ｃ)に寄託した： 材料 ATCC寄託番号 寄託日 DNA33455-1548 PTA-127 1999年3月5日 この寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条
約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付
から３０年間、寄託の生存可能な培養が維持されることを保証するものである。
寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とＡＴＣＣとの間の
合意に従い、ＡＴＣＣから入手することができ、これは、どれが最初であろうと
も、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄
託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法
第１２２条及びそれに従う特許庁長官規則(特に参照番号８８６ＯＧ６３８の３
７ＣＦＲ第１．１４条を含む)に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定し
た者に子孫を入手可能とすることを保証するものである。
【０１０８】 本出願の譲受人は、寄託した培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に
死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のものと即座
に取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる
政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスである
とみなされるものではない。 上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十
分であると考えられる。寄託した態様は、本発明のある側面の一つの説明として
意図されており、機能的に等価なあらゆる作成物がこの発明の範囲内にあるため
、寄託された作成物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの
物質の寄託は、ここに含まれる文書による説明が、そのベストモードを含む、本
発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものでは
ないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈される
ものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に改変す
ることは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の
範囲内に入るものである。
死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のものと即座
に取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる
政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスである
とみなされるものではない。 上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十
分であると考えられる。寄託した態様は、本発明のある側面の一つの説明として
意図されており、機能的に等価なあらゆる作成物がこの発明の範囲内にあるため
、寄託された作成物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの
物質の寄託は、ここに含まれる文書による説明が、そのベストモードを含む、本
発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものでは
ないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈される
ものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に改変す
ることは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の
範囲内に入るものである。
【Ｆｉｇ１】 天然ｈＳｕ（ｆｕ）の誘導アミノ酸配列（配列番号：２）を
示す。ヒトＳｕ（ｆｕ）とショウジョウバエＳｕ（ｆｕ）（配列番号：４）の推
定タンパク質配列のアラインメントが提示されている。同一の残基はボックスで
囲み、灰色に塗り潰した領域は保存された潜在的プロテインキナーゼＣリン酸化
部位を示し、星印は保存された潜在的なカゼインキナーゼＩＩリン酸化部位を示
し、細い黒のバーはｈＳｕ（ｆｕ）（上のバーの配列）又はｄＳｕ（ｆｕ）（下
のバーの配列）における候補ＰＫＡリン酸化部位を示し、黒地に白の文字の部分
はＰＥＳＴドメインを示している。ニードルマン-ウェンチ(Needleman-Wench)ア
ルゴリズム（Needleman及びWunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443）をアライン
メントに用い、二つのタンパク質間の３７．７％の同一性と６３％のポジティブ
度が明らかになった。４３３のアミノ酸配列ヒトタンパク質は４７９３２の分子
量と５．６６のｐＩ（非グリコシル化）を有していると予想される。潜在的なＮ
-グリコシル化部位は２６５の位置にある、ＮＬＳＧ配列。図面と本出願全体を
通して用いた省略符号は次のものを含む：ａａ、アミノ酸（類）；ｂｐ、塩基対
（類）；ｃＤＮＡ、ＲＮＡに相補的なＤＮＡ；ＢＬＡＳＴ、ベーシックローカル
アラインメントサーチツール；ＯＲＦ、オープンリーディングフレーム；ＵＴＲ
、非翻訳領域；ＨＨ、ヘッジホッグタンパク質ファミリー；Ｈｈ、ショウジョウ
バエヘッジホッグタンパク質；Ｓｈｈ、ソニックヘッジホッグタンパク質；Ｄｈ
ｈ、デザートヘッジホッグタンパク質；Ｉｈｈ、インディアンヘッジホッグタン
パク質；ｄＳｕ（ｆｕ）；融合タンパク質のショウジョウバエサプレッサー；ｈ
Ｓｕ（ｆｕ）、融合タンパク質のヒトサプレッサー；Ｆｕ、ショウジョウバエ融
合タンパク質；ｈＧｌｉ、ヒトＧｌｉタンパク質；ｍＧｌｉ２、マウスＧｌｉ２
タンパク質；ｈＧｌｉ３、ヒトＧｌｉ３タンパク質；Ｃｉ、ショウジョウバエ・
キュビタス・インターラプタス（Drosophila Cubitus interruptus）タンパク質
；Ｓｌｉｍｂ、ショウジョウバエＳｌｉｍｂタンパク質；ｍＳｌｉｍｂ、マウス
Ｓｌｉｍｂタンパク質；ＰＫＡ、ｃＡＭＰ-依存性プロテインキナーゼ；ＦＩＳ
Ｈ、蛍光インサイツハイブリダイゼーション；ＰＣＲ、ポリメラーゼ連鎖反応；
ＥＳＴ、発現配列タグ；ＧＳＴ、グルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼタンパク
質；ＭＥＭ、最少基本培地；Ｅ、胎齢；及び、ＰＡＧＥ、ポリアクリルアミドゲ
ル電気得泳動法。
示す。ヒトＳｕ（ｆｕ）とショウジョウバエＳｕ（ｆｕ）（配列番号：４）の推
定タンパク質配列のアラインメントが提示されている。同一の残基はボックスで
囲み、灰色に塗り潰した領域は保存された潜在的プロテインキナーゼＣリン酸化
部位を示し、星印は保存された潜在的なカゼインキナーゼＩＩリン酸化部位を示
し、細い黒のバーはｈＳｕ（ｆｕ）（上のバーの配列）又はｄＳｕ（ｆｕ）（下
のバーの配列）における候補ＰＫＡリン酸化部位を示し、黒地に白の文字の部分
はＰＥＳＴドメインを示している。ニードルマン-ウェンチ(Needleman-Wench)ア
ルゴリズム（Needleman及びWunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443）をアライン
メントに用い、二つのタンパク質間の３７．７％の同一性と６３％のポジティブ
度が明らかになった。４３３のアミノ酸配列ヒトタンパク質は４７９３２の分子
量と５．６６のｐＩ（非グリコシル化）を有していると予想される。潜在的なＮ
-グリコシル化部位は２６５の位置にある、ＮＬＳＧ配列。図面と本出願全体を
通して用いた省略符号は次のものを含む：ａａ、アミノ酸（類）；ｂｐ、塩基対
（類）；ｃＤＮＡ、ＲＮＡに相補的なＤＮＡ；ＢＬＡＳＴ、ベーシックローカル
アラインメントサーチツール；ＯＲＦ、オープンリーディングフレーム；ＵＴＲ
、非翻訳領域；ＨＨ、ヘッジホッグタンパク質ファミリー；Ｈｈ、ショウジョウ
バエヘッジホッグタンパク質；Ｓｈｈ、ソニックヘッジホッグタンパク質；Ｄｈ
ｈ、デザートヘッジホッグタンパク質；Ｉｈｈ、インディアンヘッジホッグタン
パク質；ｄＳｕ（ｆｕ）；融合タンパク質のショウジョウバエサプレッサー；ｈ
Ｓｕ（ｆｕ）、融合タンパク質のヒトサプレッサー；Ｆｕ、ショウジョウバエ融
合タンパク質；ｈＧｌｉ、ヒトＧｌｉタンパク質；ｍＧｌｉ２、マウスＧｌｉ２
タンパク質；ｈＧｌｉ３、ヒトＧｌｉ３タンパク質；Ｃｉ、ショウジョウバエ・
キュビタス・インターラプタス（Drosophila Cubitus interruptus）タンパク質
；Ｓｌｉｍｂ、ショウジョウバエＳｌｉｍｂタンパク質；ｍＳｌｉｍｂ、マウス
Ｓｌｉｍｂタンパク質；ＰＫＡ、ｃＡＭＰ-依存性プロテインキナーゼ；ＦＩＳ
Ｈ、蛍光インサイツハイブリダイゼーション；ＰＣＲ、ポリメラーゼ連鎖反応；
ＥＳＴ、発現配列タグ；ＧＳＴ、グルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼタンパク
質；ＭＥＭ、最少基本培地；Ｅ、胎齢；及び、ＰＡＧＥ、ポリアクリルアミドゲ
ル電気得泳動法。
【Ｆｉｇ２Ａ−２Ｂ】 ヒトＳｕ（ｆｕ）遺伝子の染色体局在化を示す。Ｆ
ｉｇ２Ａはビオチン化ｈＳｕ（ｆｕ）プローブのＦＩＳＨ局在化を示す。染色体
１０の長腕への割当ては同じ有糸分裂像のＤＡＰＩ-染色像を重ね合わせること
により達成した（Ｆｉｇ２Ｂ中）。Ｆｉｇ２ＢはＦＩＳＨマッピングの結果を示
す図である。各ドットは単一の染色体拡散上の二重のＦＩＳＨシグナルを表して
いる。分析した全体で１００の細胞の内、７２が特異的に標識された。
ｉｇ２Ａはビオチン化ｈＳｕ（ｆｕ）プローブのＦＩＳＨ局在化を示す。染色体
１０の長腕への割当ては同じ有糸分裂像のＤＡＰＩ-染色像を重ね合わせること
により達成した（Ｆｉｇ２Ｂ中）。Ｆｉｇ２ＢはＦＩＳＨマッピングの結果を示
す図である。各ドットは単一の染色体拡散上の二重のＦＩＳＨシグナルを表して
いる。分析した全体で１００の細胞の内、７２が特異的に標識された。
【Ｆｉｇ３Ａ−３Ｊ】 胚性及び成体齧歯類組織におけるＳｕ（ｆｕ）ｍＲ
ＮＡの組織分布を示す。Ｆｉｇ３Ａは、ホールマウント８．５日の胎齢（Ｅ８．
５）のマウスに対するマウスＳｕ（ｆｕ）プローブを用いたインサイツハイブリ
ダイゼーションの背部の図を示し、Ｆｉｇ３Ｂは側部の図を表す。Ｆｉｇ３Ｃ−
３Ｊは、示した年齢での、ラット全胚（Ｆｉｇ３Ｃ及び３Ｄ）、神経管（Ｆｉｇ
３Ｅ及び３Ｆ）、又は脳（Ｆｉｇ３Ｇ、３Ｈ、３Ｉ及び３Ｊ）の矢状切片（Ｆｉ
ｇ３Ｃ、Ｆｉｇ３Ｄ、Ｆｉｇ３Ｉ及びＦｉｇ３Ｊ）又は冠状切片（Ｆｉｇ３Ｅ−
３Ｈ）に対するＳｕ（ｆｕ）のインサイツハイブリダイゼーションを示す。Ｆｉ
ｇ３ＪはＦｉｇ３Ｉの小脳の更に高倍率の図を示す。スケールバー＝０．２７ｍ
ｍ（Ｆｉｇ３Ａ及び３Ｂ）、０．５ｍｍ（Ｆｉｇ３Ｃ）；１．６７ｍｍ（Ｆｉｇ
３Ｄ）、０．１６ｍｍ（Ｆｉｇ３Ｅ）；０．５９ｍｍ（Ｆｉｇ３Ｆ）；１．１４
ｍｍ（Ｆｉｇ３Ｇ）；５．３３ｍｍ（Ｆｉｇ３Ｈ）；１０ｍｍ（Ｆｉｇ３Ｉ）；
及び１．０３ｍｍ（Ｆｉｇ３Ｊ）。省略符号は次のものを含む：ｐｓ、原始線条
；ｎｐ；神経板；ｈｂ、後脳；ｍｂ、中脳；ｆｂ、前脳；ｍｅｓ、中胚葉；ｓｏ
ｍ、体節；ａｌｌ、尿膜；ｍａｎ、第一大動脈弓の下顎骨成分；ｓｃ、脊髄；ｃ
ｔｘ、皮質；ｄｉ、間脳；ｃｅｒ、小脳；ｔｏｎ、舌；ｅｓｏ、食道；ｌｉｖ、
肝臓；ｇｔ、性器結節；ｌｕ、肺；ｄｉｓ、椎間板；ｍｇ、中腸；ｎｔ、神経管
；ｅｐｅｎ、上衣；ｎｎ、新皮質神経上皮；ｈｉｐ、海馬体；ｓｓｚ、線条体副
脳室領域；ｔｈ、視床；ｃａｕ、尾状核；ｈｙｐ、視床下部；ｏｌｆ、嗅球；ｉ
ｃ、下丘；ｓｕｃ、上丘。
ＮＡの組織分布を示す。Ｆｉｇ３Ａは、ホールマウント８．５日の胎齢（Ｅ８．
５）のマウスに対するマウスＳｕ（ｆｕ）プローブを用いたインサイツハイブリ
ダイゼーションの背部の図を示し、Ｆｉｇ３Ｂは側部の図を表す。Ｆｉｇ３Ｃ−
３Ｊは、示した年齢での、ラット全胚（Ｆｉｇ３Ｃ及び３Ｄ）、神経管（Ｆｉｇ
３Ｅ及び３Ｆ）、又は脳（Ｆｉｇ３Ｇ、３Ｈ、３Ｉ及び３Ｊ）の矢状切片（Ｆｉ
ｇ３Ｃ、Ｆｉｇ３Ｄ、Ｆｉｇ３Ｉ及びＦｉｇ３Ｊ）又は冠状切片（Ｆｉｇ３Ｅ−
３Ｈ）に対するＳｕ（ｆｕ）のインサイツハイブリダイゼーションを示す。Ｆｉ
ｇ３ＪはＦｉｇ３Ｉの小脳の更に高倍率の図を示す。スケールバー＝０．２７ｍ
ｍ（Ｆｉｇ３Ａ及び３Ｂ）、０．５ｍｍ（Ｆｉｇ３Ｃ）；１．６７ｍｍ（Ｆｉｇ
３Ｄ）、０．１６ｍｍ（Ｆｉｇ３Ｅ）；０．５９ｍｍ（Ｆｉｇ３Ｆ）；１．１４
ｍｍ（Ｆｉｇ３Ｇ）；５．３３ｍｍ（Ｆｉｇ３Ｈ）；１０ｍｍ（Ｆｉｇ３Ｉ）；
及び１．０３ｍｍ（Ｆｉｇ３Ｊ）。省略符号は次のものを含む：ｐｓ、原始線条
；ｎｐ；神経板；ｈｂ、後脳；ｍｂ、中脳；ｆｂ、前脳；ｍｅｓ、中胚葉；ｓｏ
ｍ、体節；ａｌｌ、尿膜；ｍａｎ、第一大動脈弓の下顎骨成分；ｓｃ、脊髄；ｃ
ｔｘ、皮質；ｄｉ、間脳；ｃｅｒ、小脳；ｔｏｎ、舌；ｅｓｏ、食道；ｌｉｖ、
肝臓；ｇｔ、性器結節；ｌｕ、肺；ｄｉｓ、椎間板；ｍｇ、中腸；ｎｔ、神経管
；ｅｐｅｎ、上衣；ｎｎ、新皮質神経上皮；ｈｉｐ、海馬体；ｓｓｚ、線条体副
脳室領域；ｔｈ、視床；ｃａｕ、尾状核；ｈｙｐ、視床下部；ｏｌｆ、嗅球；ｉ
ｃ、下丘；ｓｕｃ、上丘。
【Ｆｉｇ４Ａ−４Ｅ】 成体マウス精巣におけるＳｕ（ｆｕ）の組織分布を
示す。Ｆｉｇ４ＡはＳｕ（ｆｕ）プローブにハイブリダイズした成体精巣の断面
を示す。より高い倍率の図（Ｆｉｇ４Ｃ−４Ｅ）は、発達中の精母細胞（Ｆｉｇ
４Ｃ及び４Ｄ）への、又は幾つかの領域では、精細管の中心（Ｆｉｇ４Ｅ）への
Ｓｕ（ｆｕ）ｍＲＮＡの局在化を証明しており、そこでは、胚芽細胞分化の最後
の段階が生じている。Ｆｉｇ４Ｂはセンス鎖対照プローブでの精巣のハイブリダ
イゼーションを示している。スケールバーは１．０ｍｍ（Ｆｉｇ４Ａ及び４Ｂ）
と０．０６５ｍｍ（Ｆｉｇ４Ｃ−４Ｅ）を表している。省略符号は次のものを含
む：ｓｔ、精細管；ｔａ、白膜；ｓｇ、精原細胞；ｓｃ、精母細胞；ｌｃ、ライ
ディッヒ細胞；ｓｍ、成熟精子；ｌｕ、細胞内腔。
示す。Ｆｉｇ４ＡはＳｕ（ｆｕ）プローブにハイブリダイズした成体精巣の断面
を示す。より高い倍率の図（Ｆｉｇ４Ｃ−４Ｅ）は、発達中の精母細胞（Ｆｉｇ
４Ｃ及び４Ｄ）への、又は幾つかの領域では、精細管の中心（Ｆｉｇ４Ｅ）への
Ｓｕ（ｆｕ）ｍＲＮＡの局在化を証明しており、そこでは、胚芽細胞分化の最後
の段階が生じている。Ｆｉｇ４Ｂはセンス鎖対照プローブでの精巣のハイブリダ
イゼーションを示している。スケールバーは１．０ｍｍ（Ｆｉｇ４Ａ及び４Ｂ）
と０．０６５ｍｍ（Ｆｉｇ４Ｃ−４Ｅ）を表している。省略符号は次のものを含
む：ｓｔ、精細管；ｔａ、白膜；ｓｇ、精原細胞；ｓｃ、精母細胞；ｌｃ、ライ
ディッヒ細胞；ｓｍ、成熟精子；ｌｕ、細胞内腔。
【Ｆｉｇ５Ａ−５Ｄ】 ｈＳｕ（ｆｕ）の免疫細胞化学、生化学相互作用、
及び生物活性を示している。Ｆｉｇ５Ａは形質移入ＣＯＳ-７細胞中でのｈＳｕ
（ｆｕ）及びｈＧｌｉの共存を示す。Ｆｉｇ５Ａに示したように細胞を、ｐＲＫ
.ｈＳｕ（ｆｕ）（Ｆｉｇ５Ａ１）か、ｐＲＫ.ｈＧｌｉ（Ｆｉｇ５Ａ３）か、又
は二つのプラスミドの双方（Ｆｉｇ５Ａ２及び５Ａ４）で、形質移入した；タン
パク質を２４時間後に免疫化学的に染色し、蛍光顕微鏡で可視化した。形質移入
した細胞を固定し、膜透過化処理し、抗ｈＳｕ（ｆｕ）及び抗ｃ−ｍｙｃ一次抗
体を使用し、続いてｃｙ３抱合抗ウサギＩｇＧ又はｃｙ２抱合抗マウスＩｇＧそ
れぞれを用いて、ｈＳｕ（ｆｕ）（赤；Ｆｉｇ５Ａ１及び５Ａ２）及び／又はｈ
Ｇｌｉ（緑；Ｆｉｇ５Ａ３及び５Ａ４）に対して標識した。底部パネル（Ｆｉｇ
５Ａ２及び５Ａ４）は同時形質移入され両方のタンパク質に対して二重標識され
た細胞を示している。倍率：４００ｘ。Ｆｉｇ５Ｂは一過性に形質移入したＮＩ
Ｈ-３Ｔ３細胞におけるｈＧｌｉとｈＳｕ（ｆｕ）の共免疫沈降を示す。細胞を
、示されたプラスミド（全１０μｇ）で形質移入し、４２時間後に溶解し、溶解
物を抗ｆｌａｇＭ２抗体（ｆｌａｇタグｈＳｕ（ｆｕ）に対して）又は抗ｃ−ｍ
ｙｃ抗体（ｍｙｃ-タグｈＧｌｉに対して）で免疫沈降させた。タンパク質複合
体に８％ゲル上で変性ＳＤＳ-ＰＡＧＥを施し、ニトロセルロースに移し、示さ
れたように、抗ｍｙｃ又は抗ｆｌａｇ抗体でプローブ化した。ＥＣＬ検出によっ
て抗体を可視化した。Ｆｉｇ５ＣはＧＳＴ-融合タンパク質結合アッセイを示し
ている。タンパク質をインビトロ転写-翻訳によって３５Ｓで標識し、ＧＳＴ-ｈ
Ｓｕ（ｆｕ）又はＧＳＴの何れかに結合したグルタチオンセファロースビーズと
共に４℃で２時間の間、インキュベートした。洗浄後、結合したタンパク質をＳ
ＤＳ-泳動用バッファー中での煮沸により溶出させ、試料に１０％又は８％（ｈ
Ｓｕ（ｆｕ）のみ）の変性ＳＤＳ-ＰＡＧＥを施した。ゲルを固定し、増幅し、
乾燥させてフィルムに露出した。各反応に使用された標識タンパク質の量は入力
（「ｉｎ」）レーンに示したものの４倍であった。「Ｌｕｃｉｆ」はルシフェラ
ーゼを示している。Ｆｉｇ５ＤはＧｌｉ活性化レポーターアッセイを示している
。６ウェルのプレート中のＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を、ｈＳｕ（ｆｕ）、ｈＧｌ
ｉ、ｈＳｕ（ｆｕ）＋ｈＧｌｉのための発現作成物、又は空のベクター（ｐＲＫ
５）（それぞれ０．５μｇ）と共に、ルシフェラーゼレポータープラスミド（１
μｇ）で二通りに一過性に形質移入した；形質移入したＤＮＡの全量をｐＲＫ.
ＥＧＦＰで２μｇにした。細胞溶解物中の相対的ルシフェラーゼ活性を形質移入
後４８時間で測定し、レニラルシフェラーゼ活性（ｐＲＬ-ＴＫ；０．００２５
μｇ／ウェル）に規準化した。データは３つの中の代表的な実験からの二通りの
決定の平均＋／−ＳＤを表している。
及び生物活性を示している。Ｆｉｇ５Ａは形質移入ＣＯＳ-７細胞中でのｈＳｕ
（ｆｕ）及びｈＧｌｉの共存を示す。Ｆｉｇ５Ａに示したように細胞を、ｐＲＫ
.ｈＳｕ（ｆｕ）（Ｆｉｇ５Ａ１）か、ｐＲＫ.ｈＧｌｉ（Ｆｉｇ５Ａ３）か、又
は二つのプラスミドの双方（Ｆｉｇ５Ａ２及び５Ａ４）で、形質移入した；タン
パク質を２４時間後に免疫化学的に染色し、蛍光顕微鏡で可視化した。形質移入
した細胞を固定し、膜透過化処理し、抗ｈＳｕ（ｆｕ）及び抗ｃ−ｍｙｃ一次抗
体を使用し、続いてｃｙ３抱合抗ウサギＩｇＧ又はｃｙ２抱合抗マウスＩｇＧそ
れぞれを用いて、ｈＳｕ（ｆｕ）（赤；Ｆｉｇ５Ａ１及び５Ａ２）及び／又はｈ
Ｇｌｉ（緑；Ｆｉｇ５Ａ３及び５Ａ４）に対して標識した。底部パネル（Ｆｉｇ
５Ａ２及び５Ａ４）は同時形質移入され両方のタンパク質に対して二重標識され
た細胞を示している。倍率：４００ｘ。Ｆｉｇ５Ｂは一過性に形質移入したＮＩ
Ｈ-３Ｔ３細胞におけるｈＧｌｉとｈＳｕ（ｆｕ）の共免疫沈降を示す。細胞を
、示されたプラスミド（全１０μｇ）で形質移入し、４２時間後に溶解し、溶解
物を抗ｆｌａｇＭ２抗体（ｆｌａｇタグｈＳｕ（ｆｕ）に対して）又は抗ｃ−ｍ
ｙｃ抗体（ｍｙｃ-タグｈＧｌｉに対して）で免疫沈降させた。タンパク質複合
体に８％ゲル上で変性ＳＤＳ-ＰＡＧＥを施し、ニトロセルロースに移し、示さ
れたように、抗ｍｙｃ又は抗ｆｌａｇ抗体でプローブ化した。ＥＣＬ検出によっ
て抗体を可視化した。Ｆｉｇ５ＣはＧＳＴ-融合タンパク質結合アッセイを示し
ている。タンパク質をインビトロ転写-翻訳によって３５Ｓで標識し、ＧＳＴ-ｈ
Ｓｕ（ｆｕ）又はＧＳＴの何れかに結合したグルタチオンセファロースビーズと
共に４℃で２時間の間、インキュベートした。洗浄後、結合したタンパク質をＳ
ＤＳ-泳動用バッファー中での煮沸により溶出させ、試料に１０％又は８％（ｈ
Ｓｕ（ｆｕ）のみ）の変性ＳＤＳ-ＰＡＧＥを施した。ゲルを固定し、増幅し、
乾燥させてフィルムに露出した。各反応に使用された標識タンパク質の量は入力
（「ｉｎ」）レーンに示したものの４倍であった。「Ｌｕｃｉｆ」はルシフェラ
ーゼを示している。Ｆｉｇ５ＤはＧｌｉ活性化レポーターアッセイを示している
。６ウェルのプレート中のＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を、ｈＳｕ（ｆｕ）、ｈＧｌ
ｉ、ｈＳｕ（ｆｕ）＋ｈＧｌｉのための発現作成物、又は空のベクター（ｐＲＫ
５）（それぞれ０．５μｇ）と共に、ルシフェラーゼレポータープラスミド（１
μｇ）で二通りに一過性に形質移入した；形質移入したＤＮＡの全量をｐＲＫ.
ＥＧＦＰで２μｇにした。細胞溶解物中の相対的ルシフェラーゼ活性を形質移入
後４８時間で測定し、レニラルシフェラーゼ活性（ｐＲＬ-ＴＫ；０．００２５
μｇ／ウェル）に規準化した。データは３つの中の代表的な実験からの二通りの
決定の平均＋／−ＳＤを表している。
【Ｆｉｇ６Ａ−６Ｂ】 天然配列ｈＳｕ（ｆｕ）をコードするｃＤＮＡのヌ
クレオチド配列を示す。ヌクレオチド配列（配列番号：１）は天然ｈＳｕ（ｆｕ
）をコードするヌクレオチド配列（ヌクレオチド７４から１３７２）（配列番号
：２）を含み、ここでヌクレオチド配列（配列番号：１）はここで「ＵＮＱ６５
０」及び／又は「ＤＮＡ３３４５５−１５４８」と命名されたクローンである。
開始コドンはヌクレオチド７４から７６にあり、「Ｏ］と表された停止コドンは
ヌクレオチド１３７３から１３７５にある。
クレオチド配列を示す。ヌクレオチド配列（配列番号：１）は天然ｈＳｕ（ｆｕ
）をコードするヌクレオチド配列（ヌクレオチド７４から１３７２）（配列番号
：２）を含み、ここでヌクレオチド配列（配列番号：１）はここで「ＵＮＱ６５
０」及び／又は「ＤＮＡ３３４５５−１５４８」と命名されたクローンである。
開始コドンはヌクレオチド７４から７６にあり、「Ｏ］と表された停止コドンは
ヌクレオチド１３７３から１３７５にある。
【Ｆｉｇ７】 コンセンサス配列として構築された、ここでＤＮＡ３３４５
４（配列番号：３）と命名されたヌクレオチド配列を示す。下線の配列は融合体
のマウスサプレッサーと相同なプライマー配列を示している。
４（配列番号：３）と命名されたヌクレオチド配列を示す。下線の配列は融合体
のマウスサプレッサーと相同なプライマー配列を示している。
【Ｆｉｇ８】 ワシントン大学ＨＨＭＩマウスＥＳＴプロジェクトを経由し
てMarra等により提供された、GenBank受託番号ＡＡ０６１３９１の融合遺伝子の
マウスサプレッサーのＥＳＴマウス精巣ｃＤＮＡの２７５ｂｐのヌクレオチド配
列（配列番号：５）を示す。
てMarra等により提供された、GenBank受託番号ＡＡ０６１３９１の融合遺伝子の
マウスサプレッサーのＥＳＴマウス精巣ｃＤＮＡの２７５ｂｐのヌクレオチド配
列（配列番号：５）を示す。
【Ｆｉｇ９】 融合遺伝子のサプレッサーと類似性を持つＮＴ２ニューロン
前駆体９３７２３０ｃＤＮＡ（GenBank受託番号ＡＡ２２３６３７）として同定
されたＥＳＴヒト脳ｃＤＮＡの３４６ｂｐのヌクレオチド配列（配列番号：６）
を示す。ＥＳＴはワシントン大学ＨＨＭＩマウスＥＳＴプロジェクトを経由して
Hillier等により提供された。
前駆体９３７２３０ｃＤＮＡ（GenBank受託番号ＡＡ２２３６３７）として同定
されたＥＳＴヒト脳ｃＤＮＡの３４６ｂｐのヌクレオチド配列（配列番号：６）
を示す。ＥＳＴはワシントン大学ＨＨＭＩマウスＥＳＴプロジェクトを経由して
Hillier等により提供された。
【Ｆｉｇ１０】 ｈＳｕ（ｆｕ）エピトープタグｆｌａｇタンパク質のアミ
ノ酸配列（配列番号：１０）を示す。
ノ酸配列（配列番号：１０）を示す。
【Ｆｉｇ１１】 ｈＳｕ（ｆｕ）-ＧＳＴタンパク質のアミノ酸配列（配列
番号：１１）を示す。
番号：１１）を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ ４Ｃ０８４ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 ４Ｃ０８５ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ ４Ｃ０８６ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ ４Ｈ０４５ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ａ６１Ｋ 31/7088 33/50 39/395 Ｈ // Ａ６１Ｋ 31/7088 45/00 39/395 48/00 45/00 Ａ６１Ｐ 35/00 48/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ａ６１Ｐ 35/00 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 デ ソーバージュ，フレデリック ジェ ー． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94404， フォスター シティ，シューティング ス ター アイル 187 (72)発明者 ガーニー，オースティン，エル． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94402， ベルモント，デビー レーン １ (72)発明者 ムロン，マクシミリアン スイス国 エパリンゲス シーエイチ− 1066，グランド ケミン 128 (72)発明者 ローゼンタール，アーノン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94010， バーリンゲーム，チューリップ コート 40 (72)発明者 ストーン，ドンナ，エム． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94005， ブリスベーン，シエラ ポイント ロード 684 (72)発明者 ウッド，ウィリアム，アイ． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94010， ヒルズバラ，サウスダウン コート 35 Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 BB14 BB20 BB24 BB46 BB50 CB01 DA13 DA36 FB02 FB03 FB08 FB12 4B024 AA01 AA11 CA01 CA07 DA02 DA06 DA11 FA01 GA11 HA12 4B063 QA01 QA18 QQ08 QQ53 QQ79 QR32 QR55 QS33 QS34 QX01 4B064 AG01 AG27 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA26X AA72X AA91X AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA13 BA35 NA14 ZB26 4C085 AA14 CC23 4C086 AA03 EA16 MA01 NA14 ZB26 4H045 AA10 AA11 AA20 BA41 CA40 EA20 EA50 FA74
Claims (37)
- 【請求項１】 （ａ）Ｆｉｇ１（配列番号：２）のアミノ酸残基１〜４３３
の配列を持つｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）
（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＤ
ＮＡを含んでなる単離された核酸。 - 【請求項２】 Ｆｉｇ６Ａ−６Ｂ（配列番号：１）の約７４〜約１３７２の
ヌクレオチド位置の配列を含んでなる請求項１に記載の単離された核酸。 - 【請求項３】 Ｆｉｇ６Ａ−６Ｂ（配列番号：１）の配列を含んでなる請求
項１に記載の単離された核酸。 - 【請求項４】 Ｆｉｇ６Ａ−６Ｂ（配列番号：１）の約７４〜約１３７２の
ヌクレオチド位置の配列を有する核酸の相補鎖にハイブリダイズするＤＮＡを含
んでなる、ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドをコードする単離された核酸分子。 - 【請求項５】 （ａ）ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２７（ＤＮＡ３３４５５
−１５４８）のヒトタンパク質ｃＤＮＡにコードされるのと同じ成熟ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して少
なくとも８０％の配列同一性を有するＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子。 - 【請求項６】 ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２７（ＤＮＡ３３４５５−１５
４８）のヒトタンパク質ｃＤＮＡにコードされるのと同じ成熟ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡを含んでなる請求項５に記載の単離された核酸分子。 - 【請求項７】 （ａ）Ｆｉｇ１（配列番号：２）のアミノ酸残基約１〜約４
３３の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする
ＤＮＡ、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡの相補鎖を含んでなる単離された核酸分子。 - 【請求項８】 （ａ）Ｆｉｇ１（配列番号：２）のアミノ酸残基１〜約４３
３の配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ
の相補鎖を含んでなる請求項７に記載の単離された核酸分子。 - 【請求項９】 （ａ）Ｆｉｇ１（配列番号：２）のアミノ酸残基１〜約４３
３の配列と比較して少なくとも８０％のポジティブスコアを示すポリペプチドを
コードするＤＮＡ、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡの相補鎖を含んでなる単離された
核酸分子。 - 【請求項１０】 少なくとも１００のヌクレオチドを有し、（ａ）Ｆｉｇ１
（配列番号：２）のアミノ酸残基１〜約４３３の配列を有するｈＳｕ（ｆｕ）ポ
リペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に
緊縮性条件下で試験ＤＮＡ分子をハイブリダイズさせ、試験ＤＮＡ分子が（ａ）
又は（ｂ）に対して少なくとも約８０％の配列同一性を有する場合に該試験ＤＮ
Ａ分子を単離することにより製造される単離された核酸分子。 - 【請求項１１】 請求項１に記載の核酸を含んでなるベクター。
- 【請求項１２】 該ベクターで形質転換された宿主細胞に認識されるコント
ロール配列に作用可能に結合した請求項１１に記載のベクター。 - 【請求項１３】 請求項１２に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
- 【請求項１４】 上記細胞がＣＨＯ細胞である請求項１３に記載の宿主細胞
。 - 【請求項１５】 上記細胞が大腸菌である請求項１３に記載の宿主細胞。
- 【請求項１６】 前記細胞が酵母細胞である請求項１３に記載の宿主細胞。
- 【請求項１７】 請求項１２に記載の宿主細胞を、ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプ
チドの発現に適した条件下で培養し、細胞培養物からｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチ
ドを回収することを含んでなるｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドの製造方法。 - 【請求項１８】 請求項１に記載のＤＮＡによりコードされた単離されたｈ
Ｓｕ（ｆｕ）ポリペプチド。 - 【請求項１９】 Ｆｉｇ２（配列番号：２）のアミノ酸残基１〜約４３３の
配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドを含んでなる単離さ
れたｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチド。 - 【請求項２０】 Ｆｉｇ２（配列番号：２）のアミノ酸残基１〜約４３３の
アミノ酸残基を含んでなる請求項１９に記載の単離されたポリペプチド。 - 【請求項２１】 Ｆｉｇ１（配列番号：２）のアミノ酸残基１〜約４３３の
配列と比較して少なくとも８０％のポジティブスコアを示す単離されたｈＳｕ（
ｆｕ）ポリペプチド。 - 【請求項２２】 Ｆｉｇ１（配列番号：２）のアミノ酸残基１〜約４３３の
配列を含んでなる単離されたｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチド、又は抗ｈＳｕ（ｆｕ
）抗体のための結合部位を提供するのに十分なその断片。 - 【請求項２３】 ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２７（ＤＮＡ３３４５５−１
５４８）として寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコード化される単
離されたｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチド。 - 【請求項２４】 （ｉ）（ａ）Ｆｉｇ１（配列番号：２）のアミノ酸残基１
〜約４３３の配列を有するｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子
、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に緊縮性条件下で試験ＤＮＡ分子をハ
イブリダイズさせ、上記試験ＤＮＡ分子が（ａ）又は（ｂ）に対して少なくとも
約８０％の配列同一性を有する場合に、（ｉｉ）上記ポリペプチドの発現に適し
た条件下で上記試験ＤＮＡ分子を含んでなる宿主細胞を培養し、（ｉｉｉ）細胞
培養物から上記ポリペプチドを回収することにより製造される単離されたポリペ
プチド。 - 【請求項２５】 異種アミノ酸配列に融合したｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチド
を含んでなるキメラ分子。 - 【請求項２６】 上記異種アミノ酸配列がエピトープタグ配列である請求項
２５に記載のキメラ分子。 - 【請求項２７】 上記異種アミノ酸配列が免疫グロブリンのＦｃ領域である
請求項２５に記載のキメラ分子。 - 【請求項２８】 ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドに特異的に結合する抗体。
- 【請求項２９】 上記抗体がモノクローナル抗体である請求項２８に記載の
抗体。 - 【請求項３０】 上記抗体がヒト化抗体である請求項２８に記載の抗体。
- 【請求項３１】 ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドのアンタゴニスト。
- 【請求項３２】 生物有機化学的小分子である請求項３１に記載のアンタゴ
ニスト。 - 【請求項３３】 アンチセンスヌクレオチドである請求項３１に記載のアン
タゴニスト。 - 【請求項３４】 Ｈｈシグナル伝達経路においてｈＳｕ（ｆｕ）の正常な機
能を刺激又は亢進する脊椎動物ｈＳｕ（ｆｕ）のアゴニスト。 - 【請求項３５】 生物有機化学的小分子である請求項３４に記載のアゴニス
ト。 - 【請求項３６】 ｈＳｕ（ｆｕ）生物活性のアンタゴニスト又はアゴニスト
をスクリーニングする方法において、 （ａ）培地中でｈＳｕ（ｆｕ）発現標的細胞を候補化合物に暴露し、 （ｂ）処理した細胞のフェノタイプ又は機能変化を評点化し、 候補化合物に暴露していない対照細胞と該結果を比較することを含んでなる方法
。 - 【請求項３７】 特定の疾患がヘッジホッグシグナル伝達によって変調され
るかどうかを決定する診断方法において、 （ａ）試験細胞又は組織を培養し、 （ｂ）ｈＳｕ（ｆｕ）変調ヘッジホッグシグナル伝達を阻害可能な化合物を投
与し、 （ｃ）上記投与が試験細胞中におけるヘッジホッグ媒介フェノタイプ効果を生
じたかを測定することを含んでなる方法。
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