KR20010093339A

KR20010093339A - 비타민 ｄ 수용체에 친화성을 갖는 화합물의 스크리닝법

Info

Publication number: KR20010093339A
Application number: KR1020017010500A
Authority: KR
Inventors: 우찌야마야스시; 사또히데끼; 가께다께이
Original assignee: 나가야마 오사무; 쥬가이 세이야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 1999-02-18
Filing date: 2000-02-04
Publication date: 2001-10-27
Also published as: CN1341213A; IL144726A0; WO2000049403A1; EP1158297A1; NO20014001D0; HK1042337A1; NO20014001L; EP1158297A4; CA2362071A1; AU2326300A

Abstract

본 발명의 목적은 유용한 생리활성을 유지하면서 혈중 칼슘상승작용만을 경감 또는 제거한 비타민 D 유도체를 스크리닝하기 위한 방법을 제공하는 것이다.

본 발명에 의해 비타민 D 수용체에 친화성을 갖는 화합물의 스크리닝법에서 시험화합물이 갖는 비타민 D 수용체에 의한 VDRE 를 매개로 하는 전사 촉진 활성과, 시험화합물이 갖는 비타민 D 수용체에 의한 전사인자의 활성 저해 작용을 측정하여, VDRE 를 매개로 하는 전사 촉진 활성보다도 전사인자의 활성 저해 작용 쪽이 상대적으로 강한 화합물을 선택하는 방법이 제공된다.

Description

비타민 Ｄ 수용체에 친화성을 갖는 화합물의 스크리닝법{METHOD FOR SCREENING COMPOUND HAVING AFFINITY FOR VITAMIN D RECEPTOR}

1α,25-디히드록시비타민 D₃또는 1α-히드록시비타민 D₃등의 활성형비타민 D₃유도체는 이미 골다공증 등의 대사성 골질환의 치료약으로 널리 임상에서 사용되고 있다. 이들 활성형비타민 D₃유도체는 비타민 D 수용체를 매개로 하여 생리작용이 발휘되는 것이 알려져 있다. 비타민 D 수용체는 소장, 골, 신장, 부갑상선 등의 조직에 존재할 뿐만 아니고, 면역계세포나 악성종양세포를 포함하는 다양한 세포에 존재하고 있기 때문에 활성형비타민 D₃유도체는 (1) 칼슘·골대사 조절작용; (2) 악성종양세포, 표피세포 및 상피성세포의 증식저해; 및 (3) 면역계세포에 대한 조절작용; 등과 같은 다양한 생리활성을 가짐이 알려져 있다.

임상사용할 경우에 문제가 되는 활성형비타민 D₃유도체의 부작용으로는 고칼슘혈증이 알려져 있으며, 활성형비타민 D₃유도체가 유지하는 생리작용에서 혈중 칼슘상승작용을 선택적으로 경감 또는 제거할 수 있으면, 부작용이 적은 우수한 대사성 골질환의 치료약을 창출할 수 있게 됨과 동시에 그 다양한 생리활성에 기초하는 신규한 치료약의 창출이 가능해진다.

현재까지 활성형비타민 D₃유도체의 혈중 칼슘상승작용은, 활성형비타민 D₃유도체가 비타민 D 수용체에 결합하여 형성된 복합체가 소장에서의 칼슘흡수에 관여하는 단백질 (예컨대, 장관 상피세포내의 칼슘수송을 담당하는 칼빈딘-D (Calbindin-D) 또는 흡수된 칼슘을 혈관측으로 주고 받는 기능을 가지는 Ca-ATPase 등) 의 유전자의 프로모터 영역에 존재하는 VDRE 에 결합하여 유전자의 전사를 촉진함으로써 상기 단백질의 발현이 유도되어 장관으로부터의 칼슘흡수가 촉진됨으로써 발생하는 것이 밝혀져 있다.

또한, 활성형비타민 D₃유도체의 유용한 생리활성 역시, 비타민 D 수용체와의 복합체가 VDRE 에 결합함으로써 발현하는 것으로 지금까지 여겨져 왔다. 그로 인해, 유용한 생리활성을 유지하면서 혈중 칼슘상승작용만을 경감 또는 제거한 화합물을 스크리닝하는 것이 매우 곤란하다고 여겨져 왔다.

최근, 다른 전사인자의 전사조절기능을 저해하는 활성에 기초하는 비타민 D수용체에 의한 유전자의 발현조절기구가 존재하는 것이 AP-1 복합체 또는 NF-κB 패밀리 등의 전사인자에서 확인되었다 (Xiao-Peng Yu et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, Vol.92, pp.10990-10994, 1995; Hanna Harant et al., Eur.J.Biochem.250, 63-71(1997); Daniele D'Ambrosio et al., J.Clin.Invest., Vol 101, No.1,(1998), 252-262; Yasuo Kuroki et al., Journal of Cellular Physiology 164:459-464(1995); Terri L.Towers et al., The Journal of Biological Chemistry, Vol.273, No.17, pp.10338-10348(1998); Atsuko Takeuchi et al., The Journal of Immunology, 1998, 160:209-218; 및 Iris Alroy et al., Molecular and Cellular Biology, Vol.15, No.10, pp:5789-5799(1995) 를 참조). 이와 같은 전사인자의 활성 저해 작용에 기초하는 비타민 D 수용체에 의한 유전자의 발현조절기구는, 종래부터 알려져 있던 비타민 D 수용체가 VDRE 에 결합하는 유전자의 발현조절기구와는 완전히 상이하며 VDRE 로의 결합을 매개로 하지 않는 작용양식임이 시사되어 있다.

그러나, 비타민 D 유도체에 있어서, 비타민 D 수용체에 의한 VDRE 를 매개로 하는 전사 촉진 활성과, AP-1 복합체 또는 NF-κB 패밀리 등의 전사인자에서 확인된 비타민 D 수용체에 의한 전사인자의 활성 저해 작용을 분리하고자 하는 시도는 현재까지 보고된 바 없다.

발명의 개시

본 발명의 한 목적은 유용한 생리활성을 유지하면서 혈중 칼슘상승작용만을 경감 또는 제거한 비타민 D 유도체를 스크리닝하기 위한 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 스크리닝법을 사용함으로써 유용한 생리활성을 유지하면서 혈중 칼슘상승작용만을 경감 또는 제거한 비타민 D 유도체를 선택적으로 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 비타민 D 유도체를 포함하는 비타민 D 수용체에 의해 활성이 저해될 수 있는 전사인자의 작용이 관여하는 질환의 치료약을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 의한 스크리닝법을 실시하기 위한 키트를 제공하는 것이다.

본 발명자들은 프로모터 영역에 AP-1 복합체의 결합부위를 갖고, VDRE 를 전혀 포함하지 않는 리포터 유전자 벡터를 사용한 리포터 유전자 분석 및 프로모터 영역에 NF-κB 패밀리의 결합부위를 갖고, VDRE 를 전혀 포함하지 않는 리포터 유전자 벡터를 사용한 리포터 유전자 분석에서 비타민 D 유도체가 VDRE 를 매개로 하지 않고 리포터유전자의 발현을 저해함을 우선 확인하였다.

이로 인해, 비타민 D 유도체가 갖는 비타민 D 수용체에 의한 VDRE 를 매개로 하는 전사 촉진 활성을 저하 또는 상실시키며, 또한 VDRE 를 매개로 하지 않는 AP-1 복합체 또는 NF-κB 패밀리의 활성 저해 작용으로 대표되는 비타민 D 수용체에 의한 다른 전사인자의 활성 저해 작용을 유지 또는 증강시키는 것, 즉 VDRE 를 매개로 하는 전사 촉진 활성보다도 전사인자의 활성 저해 작용에 대한 선택성을 높임으로써, 부작용인 혈중 칼슘상승작용을 경감 또는 소실시키고 또한 AP-1 복합체 또는 NF-κB 패밀리 등의 전사인자의 활성화가 병태의 발증 또는 진전에 관여하는 질환에 대한 치료효과를 기대할 수 있음을 생각할 수 있다.

예컨대, 골다공증에서는 파골세포의 과잉형성이 발증원인으로 여겨지고 있지만, AP-1 복합체 또는 NF-κB 패밀리의 전사인자로서의 기능을 결손시킨 마우스에서는 파골세포의 형성이 저해됨이 알려져 있기 때문에, 이들 전사인자의 활성을 저해함으로써 골다공증에 대한 치료효과를 기대할 수 있음을 상정할 수 있다. 또한, 활성형비타민 D 유도체의 골다공증에 대한 치료효과도 지금까지 생각해 왔던 비타민 D 수용체가 VDRE 에 결합하여 유전자의 전사를 촉진하는 작용양식이 아니고, 비타민 D 수용체에 의한 AP-1 복합체 또는 NF-κB 패밀리 등의 전사인자의 활성 저해 작용을 매개로 함으로써 발생되는 것으로 여겨진다.

또, 이와 같은 개념은 비타민 D 유도체에 한정하지 않고 비타민 D 수용체에 대해 친화성을 갖는 물질에서도 동일하게 적용할 수 있다.

본 발명자들은 상술한 새로운 개념에 기초하여 유용한 생리활성을 유지하면서 부작용이 적은 비타민 D 유도체를 탐색하는 스크리닝계를 개발하기 위해 검토하였다. 그 결과, 비타민 D 유도체가 갖는 VDRE 를 매개로 하는 전사 촉진 활성 (혈중 칼슘상승작용을 발생시키는 메카니즘) 을 VDRE 를 갖는 리포터 유전자 벡터를 사용한 리포터 유전자 분석에 의해 측정하는 한편, AP-1 복합체 또는 NF-κB 패밀리의 저해활성으로 대표되는 전사인자의 활성 저해 작용 (약리활성) 을, 프로모터 영역에 AP-1 복합체의 결합부위를 갖고 VDRE 를 전혀 포함하지 않는 리포터 유전자 벡터를 사용한 리포터 유전자 분석과, 프로모터 영역에 NF-κB 패밀리의 결합부위를 갖고 VDRE 를 전혀 포함하지 않는 리포터 유전자 벡터를 사용한 리포터 유전자 분석로 측정하여, 1α,25-디히드록시비타민 D₃보다도 전사인자의 활성 저해 작용에 대한 선택성이 높은 유도체를 선택하는 스크리닝 실험계를 발견하였다.

본 발명의 스크리닝계를 사용하여 스크리닝을 실시한 결과, 1α,25-디히드록시비타민 D₃에 비해 전사인자의 활성 저해 작용에 대한 선택성이 매우 높은 유도체가 발견되었다. 이 유도체의 약제로서의 유용성에 대해 골다공증 모델로 검증한 결과, 뇨중 칼슘배설에 영향을 끼치지 않고, 혈중 칼슘상승도 발생시키지 않고, 골다공증 치료약으로서의 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다. 본 발명은 이들 견지에 기초하여 완성된 것이다.

즉, 본 발명에 의하면 비타민 D 수용체에 친화성을 갖는 화합물의 스크리닝법에 있어서 시험화합물이 갖는 비타민 D 수용체에 의한 VDRE 를 매개로 하는 전사 촉진 활성과 시험화합물이 갖는 비타민 D 수용체에 의한 전사인자의 활성 저해 작용을 측정하여 VDRE 를 매개로 하는 전사 촉진 활성보다도 전사인자의 활성 저해 작용 쪽이 상대적으로 강한 화합물을 선택하는 방법이 제공된다.

본 발명에 있어서 비타민 D 수용체에 친화성을 갖는 화합물은 바람직하게는 비타민 D 유도체이다.

본 발명에 있어서 전사인자의 바람직한 구체예는 AP-1 복합체 또는 NF-κB 패밀리이다.

본 발명의 한 양태에서는 VDRE 를 매개로 하는 전사 촉진 활성은 리포터 유전자 분석계로 측정한다.

본 발명의 한 양태에 있어서는 전사인자의 활성 저해 작용은 리포터 유전자 분석계로 측정한다.

본 발명의 한 양태에서는 시험화합물과 표준화합물의 각각에 대해 VDRE 를 매개로 하는 전사 촉진 활성과 전사인자의 활성 저해 작용을 측정하여, 하기 식:(시험화합물의 전사인자의 활성 저해 작용을 표준화합물의 것과 비교한 상대값)/(시험화합물의 VDRE 를 매개로 하는 전사 촉진 활성을 표준화합물의 것과 비교한 상대값)＞1 을 만족하는 화합물; 특히 바람직하게는, 하기 식:(시험화합물의 전사인자의 활성 저해 작용을 표준화합물의 것과 비교한 상대값)/(시험화합물의 VDRE 를 매개로 하는 전사 촉진 활성을 표준화합물의 것과 비교한 상대값)≥10 을 만족하는 화합물이 VDRE 를 매개로 하는 전사 촉진 활성보다도 전사인자의 활성 저해 작용 쪽이 상대적으로 강한 화합물로서 선택된다.

본 발명의 바람직한 양태에서는 표준화합물은 1α,25-디히드록시비타민 D₃이다.

본 발명의 다른 측면에 의하면, 상기한 바와 같은 스크리닝법에 의해 선택되며, VDRE 를 매개로 하는 전사 촉진 활성보다도 전사인자의 활성 저해 작용 쪽이 상대적으로 강한 것을 특징으로 하는 비타민 D 수용체에 친화성을 갖는 화합물이 제공된다.

선택되는 비타민 D 수용체에 친화성을 갖는 화합물은 바람직하게는 비타민 D 유도체이다.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 본 발명의 스크리닝법에 의해 선택되는 비타민 D 수용체에 친화성을 갖는 화합물을 포함하는, 비타민 D 수용체에 의해 활성이 저해되는 전사인자가 관여하는 질환의 치료약이 제공된다.

비타민 D 수용체에 의해 활성이 저해되는 전사인자가 관여하는 질환의 비한정적 구체예는 대사성 골질환, 특히 골다공증이다.

본 발명의 치료약의 대상이 되는 질환이 관여하는 전사인자의 바람직한 구체예는 AP-1 복합체 또는 NF-κB 패밀리이다.

본 발명의 치료약은 구체적으로는 비타민 D 수용체를 매개로 하는 AP-1 복합체의 활성저해제 또는 NF-κB 패밀리의 활성저해제로 사용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 본 발명의 스크리닝법에 따라 VDRE 를 매개로 하는 전사 촉진 활성과 전사인자의 활성 저해 작용을 측정했을 때의, 하기 식:(시험화합물의 전사인자의 활성 저해 작용을 표준화합물의 것과 비교한 상대값)/(시험화합물의 VDRE 를 매개로 하는 전사 촉진 활성을 표준화합물의 것과 비교한 상대값) 이 1 보다 큰 화합물, 보다 바람직하게는 10 이상의 화합물을 유효성분으로 하는 골다공증 치료약이 제공된다.

이 화합물이 하기 일반식 (1):

(식중, X 는 산소원자 또는 황원자를 나타내고, R₁은 수산기 또는 보호된 수산기로 치환되어 있어도 좋은 포화 또는 불포화 지방족탄화수소기, 또는 -COR₁₂기 (식중 R₁₂는 알킬기, 아릴기 또는 알콕시기를 나타낸다) 를 의미하고, R₂는 -OR₉또는 수소원자를 나타내고, R₉및 R₁₀은 동일 또는 상이하며 수소원자 또는 보호기를 나타낸다) 로 나타내어지는 비타민 D 유도체인 것이 바람직하다. R₂가 -OR₉인 것이 보다 바람직하다.

바람직하게는 R₁은 수산기로 치환되어 있어도 좋은 탄소수 1∼15 의 포화 지방족탄화수소기 또는 수산기로 치환되어 있어도 좋은 탄소수 2∼15 의 불포화 지방족탄화수소기이다. 보다 바람직하게는 R₁은 기 (2):

(식중, R₃및 R₄는 동일 또는 상이하며 수소원자 또는 수산기를 나타내거나일체가 되어 산소원자를 갖는 = 0 을 나타낸다. 단, R₃와 R₄가 동시에 수산기가 되지는 않는다. R₅및 R₆은 수소원자 또는 수산기를 나타내지만, R₆은 R₃또는 R₄와 동시에 수산기가 되지는 않는다. m 은 1∼4 의 정수를 나타내고, n 은 0∼2 의 정수를 나타낸다) 또는 기 (3):

(식중, R₅및 R₆는 동일 또는 상이하며 수소원자 또는 수산기를 나타낸다. R₇및 R₈은 수소원자 또는 일체가 되어 공유결합을 나타낸다. p 는 1∼3 의 정수를 나타내고, q 는 0∼2 의 정수를 나타낸다) 이다. 보다 바람직하게는 R₁은 3-히드록시-3-메틸부틸기이다.

또, 일반식 (1) 로 나타내어지는 비타민 D 유도체에서 20 위치가 S 배치여도 되고 R 배치여도 된다.

일반식 (1) 로 나타내어지는 비타민 D 유도체의 구체예로는, 1,3-디히드록시-20-(3-히드록시-3-메틸부틸티오)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19),16-테트라엔, 1α,3β-디히드록시-20(S)-(3-히드록시-3-메틸부틸티오)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19),16-테트라엔, 1α,3β-디히드록시-20(R)-(3-히드록시-3-메틸부틸티오)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19),16-테트라엔, 1α,3β-디히드록시-20(R)-((E)-4-히드록시-4-메틸-2-펜테닐티오)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19),16-테트라엔, 1α,3β-디히드록시-20(R)-((E)-4-에틸-4-히드록시-2-헥세닐티오)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19),16-테트라엔, 1α,3β-디히드록시-20(S)-(2-히드록시-2-메틸프로필티오)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19),16-테트라엔, 1α,3β-디히드록시-20(R)-(2-히드록시-2-메틸프로필티오)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19),16-테트라엔, 1α,3β-디히드록시-20(S)-{2(S)-히드록시-3-메틸부틸옥시}-9,10-세코프레그나-5,7,10(19),16-테트라엔, 1α,3β-디히드록시-20(S)-{2(R)-히드록시-3-메틸부틸옥시}-9,10-세코프레그나-5,7,10(19),16-테트라엔, 1α,3β-디히드록시-20(S)-(2-에틸-2-히드록시부틸티오)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19),16-테트라엔, 1α,3β-디히드록시-20(R)-(2-에틸-2-히드록시부틸티오)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19),16-테트라엔, 1α,3β-디히드록시-20(R)-(4-에틸-4-히드록시-2-헥시닐옥시)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19),16-테트라엔, 1α,3β-디히드록시-20(R)-{3-에틸-2(S)-히드록시펜틸티오}-9,10-세코프레그나-5,7,10(19),16-테트라엔 등을 들 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면,

(a) 전사인자의 결합서열 및 리포터유전자를 포함하는 전사인자의 활성 저해 작용을 평가하기 위한 벡터;

(b) VDRE 서열 및 리포터유전자를 포함하는 VDRE 를 매개로 하는 전사 촉진 활성을 평가하기 위한 벡터;

(c) 원하는 바에 따라 비타민 D 수용체 발현벡터; 및

(d) 상기 리포터유전자의 산물을 검출하기 위한 시약;

을 포함하는 본 발명에 의한 스크리닝법을 실시하기 위한 키트가 제공된다.

본 발명은 유용한 생리활성을 유지하면서 부작용이 적은 비타민 D 유도체를 스크리닝하기 위한 신규한 방법, 보다 구체적으로는 시험화합물의 (비타민 D 수용체에 의함) 비타민 D 반응성 영역 (vitamin D responsive element, 이하 「VDRE」로 표기함) 을 매개로 하는 전사 촉진 활성과 (비타민 D 수용체에 의한 것 이외) 특정 전사인자의 전사조절활성에 대한 저해활성을 측정하는 것을 포함하는 스크리닝법에 관한 것이다. 본 발명은 상기 스크리닝법에 의해 선택되는 화합물, 및 해당 화합물을 포함하는 의약에 관한 것이기도 하다.

도 1 은 VDRE 를 매개로 하는 전사 촉진 활성과 AP-1 복합체에 대한 저해활성에 관한 스크리닝의 결과를 나타낸다.

도 2 는 VDRE 를 매개로 하는 전사 촉진 활성과 NF-κB 패밀리에 대한 저해활성에 관한 스크리닝의 결과를 나타낸다.

도 3 은 뇨중 칼슘배설, 혈중 칼슘농도 및 골밀도에 대한 비타민 D 유도체 (피하 투여) 의 작용을 나타내는 그래프이다.

도 4 는 뇨중 칼슘배설, 혈중 칼슘농도 및 골밀도에 대한 비타민 D 유도체 (경구 투여) 의 작용을 나타내는 그래프이다.

도 5 는 혈중 Ca 값, 뇨중 데옥시피리디놀린 (Dpyr) 배설, 골밀도, 골강도에 대한 비타민 D 유도체 (경구 투여) 의 작용을 나타내는 그래프이다.

발명을 실시하기 위한 최량의 형태

이하, 본 발명의 보다 구체적인 양태, 및 본 발명을 실시하기 위한 방법에 대해 설명하지만, 본 발명은 하기의 기재에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 방법에서 스크리닝의 대상이 되는 물질은 비타민 D 수용체에 친화성을 갖는 화합물이면 무엇이든 되며 특별히 한정되지 않지만, 일반적으로는 비타민 D 유도체, 특히 비타민 D₃유도체, 특히 바람직하게는 활성형비타민 D₃유도체이다. 비타민 D 유도체의 비한정적 구체예로는 상술한 일반식 (1) 로 나타내어지는 비타민 D 유도체 등을 들 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어는 특별히 정의하지 않는 한, 이하의 의미를 나타낸다.

포화 지방족탄화수소기란, 일반적으로 탄소수 1∼15 의 직쇄 또는 분지쇄상의 알킬기를 나타내고, 예컨대 메틸기, 에틸기, n-프로필기, i-프로필기, n-부틸기, s-부틸기, i-부틸기, t-부틸기 외, 펜틸기, 헥실기, 헵틸기, 옥틸기, 노닐기, 데카닐기 등을 들 수 있고, 바람직하게는 3-메틸부틸기, 3-에틸펜틸기, 4-메틸펜틸기, 3-(n-프로필)헥실기, 4-에틸헥실기, 5-메틸헥실기, 6-메틸헵틸기, 5-에틸헵틸기, 4-(n-프로필)헵틸기 등을 들 수 있고, 보다 바람직하게는 3-메틸부틸기, 3-에틸펜틸기, 4-메틸펜틸기 등을 들 수 있다.

불포화 지방족탄화수소기란, 일반적으로 탄소수 2∼15 의 직쇄 또는 분지쇄의 알케닐기 또는 알키닐기를 나타내고, 예컨대 2-프로페닐기, 2-부테닐기, 3-부테닐기, 2-펜테닐기, 3-펜테닐기, 4-펜테닐기, 2-헥세닐기, 3-헥세닐기, 4-헥세닐기, 5-헥세닐기, 2-헵테닐기, 3-헵테닐기, 4-헵테닐기, 5-헵테닐기, 6-헵테닐기, 2-프로피닐기, 2-부티닐기, 3-부티닐기, 2-펜티닐기, 3-펜티닐기, 4-펜티닐기, 2-헥시닐기, 3-헥시닐기, 4-헥시닐기, 5-헥시닐기, 2-헵티닐기, 3-헵티닐기, 4-헵티닐기, 5-헵티닐기, 6-헵티닐기 등을 들 수 있고, 임의의 수소원자가 1 이상의 전술한 알킬기로 치환되어 있어도 좋고, 이중결합에 관해서는 시스 또는 트랜스 중 어느 것이어도 된다. 바람직하게는 4-메틸-2-펜티닐기, 4-에틸-2-헥시닐기, 4-메틸-2-펜테닐기, 4-에틸-2-헥세닐기 등을 들 수 있다.

또 수산기로 치환되어 있어도 좋은 포화 또는 불포화 지방족탄화수소기란, 상기의 포화 또는 불포화 탄화수소기의 임의의 수소원자가 1 이상의 수산기로 치환되어 있어도 좋은 기를 의미하고, 치환하고 있는 수산기 수의 예로는, 0, 1, 2, 3 등을 들 수 있고, 바람직하게는 1 또는 2 이며, 보다 바람직하게는 1 이다. 구체적인 예로는 상기의 지방족탄화수소기 외에, 2-히드록시-2-메틸프로필기, 3-히드록시-2-메틸프로필기, 2,3-디히드록시-2-메틸프로필기, 2-에틸-2-히드록시부틸기, 2-에틸-3-히드록시부틸기, 2-에틸-2,3-디히드록시부틸기, 2-히드록시-2-(n-프로필)펜틸기, 3-히드록시-2-(n-프로필)펜틸기, 2,3-디히드록시-2-(n-프로필)펜틸기, 2-히드록시-3-메틸부틸기, 3-히드록시-3-메틸부틸기, 4-히드록시-3-메틸부틸기, 2,3-디히드록시-3-메틸부틸기, 2,4-디히드록시-3-메틸부틸기, 3,4-디히드록시-3-메틸부틸기, 3-에틸-2-히드록시펜틸기, 3-에틸-3-히드록시펜틸기, 3-에틸-4-히드록시펜틸기, 3-에틸-2,3-디히드록시펜틸기, 3-에틸-2,4-디히드록시펜틸기, 3-에틸-3,4-디히드록시펜틸기, 2-히드록시-3-(n-프로필)헥실기, 3-히드록시-3-(n-프로필)헥실기, 4-히드록시-3-(n-프로필)헥실기, 2,3-디히드록시-3-(n-프로필)헥실기, 2,4-디히드록시-3-(n-프로필)헥실기, 3,4-디히드록시-3-(n-프로필)헥실기, 3-히드록시-4-메틸펜틸기, 4-히드록시-4-메틸펜틸기, 5-히드록시-4-메틸펜틸기, 3,4-디히드록시-4-메틸펜틸기, 3,5-디히드록시-4-메틸펜틸기, 4,5-디히드록시-4-메틸펜틸기, 4-에틸-3-히드록시헥실기, 4-에틸-4-히드록시헥실기, 4-에틸-5-히드록시헥실기, 4-에틸-3,4-디히드록시헥실기, 4-에틸-3,5-디히드록시헥실기, 4-에틸-4,5-디히드록시헥실기, 3-히드록시-4-(n-프로필)헵틸기, 4-히드록시-4-(n-프로필)헵틸기, 5-히드록시-4-(n-프로필)헵틸기, 3,4-디히드록시-4-(n-프로필)헵틸기, 3,5-디히드록시-4-(n-프로필)헵틸기, 4,5-디히드록시-4-(n-프로필)헵틸기, 4-히드록시-5-메틸헥실기, 5-히드록시-5-메틸헥실기, 6-히드록시-5-메틸헥실기, 4,5-디히드록시-5-메틸헥실기, 4,6-디히드록시-5-메틸헥실기, 5,6-디히드록시-5-메틸헥실기, 5-에틸-4-히드록시헵틸기, 5-에틸-5-히드록시헵틸기, 5-에틸-6-히드록시헵틸기, 5-에틸-4,5-디히드록시헵틸기, 5-에틸-4,6-디히드록시헵틸기, 5-에틸-5,6-디히드록시헵틸기, 4-히드록시-5-(n-프로필)옥틸기, 5-히드록시-5-(n-프로필)옥틸기, 6-히드록시-5-(n-프로필)옥틸기, 4,5-디히드록시-5-(n-프로필)옥틸기, 4,6-디히드록시-5-(n-프로필)옥틸기, 5,6-디히드록시-5-(n-프로필)옥틸기, 5-히드록시-6-메틸헵틸기, 6-히드록시-6-메틸헵틸기, 7-히드록시-6-메틸헵틸기, 5,6-디히드록시-6-메틸헵틸기, 5,7-디히드록시-6-메틸헵틸기, 6,7-디히드록시-6-메틸헵틸기, 6-에틸-5-히드록시옥틸기, 6-에틸-6-히드록시옥틸기, 6-에틸-7-히드록시옥틸기, 6-에틸-5,6-히드록시옥틸기, 6-에틸-5,7-히드록시옥틸기, 6-에틸-6,7-히드록시옥틸기, 5-히드록시-6-(n-프로필)노닐기, 6-히드록시-6-(n-프로필)노닐기, 7-히드록시-6-(n-프로필)노닐기, 5,6-디히드록시-6-(n-프로필)노닐기, 5,7-디히드록시-6-(n-프로필)노닐기, 6,7-디히드록시-6-(n-프로필)노닐기 등의 포화 지방족탄화수소기인 것, 또 4-히드록시-4-메틸-2-펜테닐기, 5-히드록시-4-메틸-2-펜테닐기, 4,5-디히드록시-4-메틸-2-펜테닐기, 4-에틸-4-히드록시-2-헥세닐기, 4-에틸-5-히드록시-2-헥세닐기, 4-에틸-4,5-디히드록시-2-헥세닐기, 4-히드록시-4-(n-프로필)-2-헵테닐기, 5-히드록시-4-(n-프로필)-2-헵테닐기, 4,5-디히드록시-4-(n-프로필)-2-헵테닐기, 5-히드록시-5-메틸-3-헥세닐기, 6-히드록시-5-메틸-3-헥세닐기, 5,6-디히드록시-5-메틸-3-헥세닐기, 5-에틸-5-히드록시-3-헵테닐기, 5-에틸-6-히드록시-3-헵테닐기, 5-에틸-5,6-디히드록시-3-헵테닐기, 5-히드록시-5-(n-프로필)-3-옥테닐기, 6-히드록시-5-(n-프로필)-3-옥테닐기, 5,6-디히드록시-5-(n-프로필)-3-옥테닐기, 4-히드록시-5-메틸-2-헥세닐기, 5-히드록시-5-메틸-2-헥세닐기, 6-히드록시-5-메틸-2-헥세닐기, 4,5-디히드록시-5-메틸-2-헥세닐기, 4,6-디히드록시-5-메틸-2-헥세닐기, 5,6-디히드록시-5-메틸-2-헥세닐기, 5-에틸-4-히드록시-2-헵테닐기, 5-에틸-5-히드록시-2-헵테닐기, 5-에틸-6-히드록시-2-헵테닐기, 5-에틸-4,5-디히드록시-2-헵테닐기, 5-에틸-4,6-디히드록시-2-헵테닐기, 5-에틸-5,6-디히드록시-2-헵테닐기, 4-히드록시-5-(n-프로필)-2-옥테닐기, 5-히드록시-5-(n-프로필)-2-옥테닐기, 6-히드록시-5-(n-프로필)-2-옥테닐기, 4,5-디히드록시-5-(n-프로필)-2-옥테닐기, 4,6-디히드록시-5-(n-프로필)-2-옥테닐기, 5,6-디히드록시-5-(n-프로필)-2-옥테닐기, 6-히드록시-6-메틸-4-헵테닐기, 7-히드록시-6-메틸-4-헵테닐기, 6,7-디히드록시-6-메틸-4-헵테닐기, 6-에틸-6-히드록시-4-옥테닐기, 6-에틸-7-히드록시-4-옥테닐기, 6-에틸-6,7-디히드록시-4-옥테닐기, 6-히드록시-6-(n-프로필)-4-노네닐기, 7-히드록시-6-(n-프로필)-4-노네닐기, 6,7-디히드록시-6-(n-프로필)-4-노네닐기, 5-히드록시-6-메틸-3-헵테닐기, 6-히드록시-6-메틸-3-헵테닐기, 7-히드록시-6-메틸-3-헵테닐기, 5,6-디히드록시-6-메틸-3-헵테닐기, 5,7-디히드록시-6-메틸-3-헵테닐기, 6,7-디히드록시-6-메틸-3-헵테닐기, 6-에틸-5-히드록시-3-옥테닐기, 6-에틸-6-히드록시-3-옥테닐기, 6-에틸-7-히드록시-3-옥테닐기, 6-에틸-5,6-디히드록시-3-옥테닐기, 6-에틸-5,7-디히드록시-3-옥테닐기, 6-에틸-6,7-디히드록시-3-옥테닐기, 5-히드록시-6-(n-프로필)-3-노네닐기, 6-히드록시-6-(n-프로필)-3-노네닐기, 7-히드록시-6-(n-프로필)-3-노네닐기, 5,6-디히드록시-6-(n-프로필)-3-노네닐기, 5,7-디히드록시-6-(n-프로필)-3-노네닐기, 6,7-디히드록시-6-(n-프로필)-3-노네닐기, 5-히드록시-6-메틸-2-헵테닐기, 6-히드록시-6-메틸-2-헵테닐기, 7-히드록시-6-메틸-2-헵테닐기, 5,6-디히드록시-6-메틸-2-헵테닐기, 5,7-디히드록시-6-메틸-2-헵테닐기, 6,7-디히드록시-6-메틸-2-헵테닐기, 6-에틸-5-히드록시-2-옥테닐기, 6-에틸-6-히드록시-2-옥테닐기, 6-에틸-7-히드록시-2-옥테닐기, 6-에틸-5,6-디히드록시-2-옥테닐기, 6-에틸-5,7-디히드록시-2-옥테닐기, 6-에틸-6,7-디히드록시-2-옥테닐기, 5-히드록시-6-(n-프로필)-2-노네닐기, 6-히드록시-6-(n-프로필)-2-노네닐기, 7-히드록시-6-(n-프로필)-2-노네닐기, 5,6-디히드록시-6-(n-프로필)-2-노네닐기, 5,7-디히드록시-6-(n-프로필)-2-노네닐기, 6,7-디히드록시-6-(n-프로필)-2-노네닐기, 4-히드록시-4-메틸-2-펜티닐기, 5-히드록시-4-메틸-2-펜티닐기, 4,5-디히드록시-4-메틸-2-펜티닐기, 4-에틸-4-히드록시-2-헥시닐기, 4-에틸-5-히드록시-2-헥시닐기, 4-에틸-4,5-디히드록시-2-헥시닐기, 4-히드록시-4-(n-프로필)-2-헵티닐기, 5-히드록시-4-(n-프로필)-2-헵티닐기, 4,5-디히드록시-4-(n-프로필)-2-헵티닐기, 5-히드록시-5-메틸-3-헥시닐기, 6-히드록시-5-메틸-3-헥시닐기, 5,6-디히드록시-5-메틸-3-헥시닐기, 5-에틸-5-히드록시-3-헵티닐기, 5-에틸-6-히드록시-3-헵티닐기, 5-에틸-5,6-디히드록시-3-헵티닐기, 5-히드록시-5-(n-프로필)-3-옥티닐기, 6-히드록시-5-(n-프로필)-3-옥티닐기, 5,6-디히드록시-5-(n-프로필)-3-옥티닐기, 4-히드록시-5-메틸-2-헥시닐기,5-히드록시-5-메틸-2-헥시닐기, 6-히드록시-5-메틸-2-헥시닐기, 4,5-디히드록시-5-메틸-2-헥시닐기, 4,6-디히드록시-5-메틸-2-헥시닐기, 5,6-디히드록시-5-메틸-2-헥시닐기, 5-에틸-4-히드록시-2-헵티닐기, 5-에틸-5-히드록시-2-헵티닐기, 5-에틸-6-히드록시-2-헵티닐기, 5-에틸-4,5-디히드록시-2-헵티닐기, 5-에틸-4,6-디히드록시-2-헵티닐기, 5-에틸-5,6-디히드록시-2-헵티닐기, 4-히드록시-5-(n-프로필)-2-옥티닐기, 5-히드록시-5-(n-프로필)-2-옥티닐기, 6-히드록시-5-(n-프로필)-2-옥티닐기, 4,5-디히드록시-5-(n-프로필)-2-옥티닐기, 4,6-디히드록시-5-(n-프로필)-2-옥티닐기, 5,6-디히드록시-5-(n-프로필)-2-옥티닐기, 6-히드록시-6-메틸-4-헵티닐기, 7-히드록시-6-메틸-4-헵티닐기, 6,7-디히드록시-6-메틸-4-헵티닐기, 6-에틸-6-히드록시-4-옥티닐기, 6-에틸-7-히드록시-4-옥티닐기, 6-에틸-6,7-디히드록시-4-옥티닐기, 6-히드록시-6-(n-프로필)-4-노니닐기, 7-히드록시-6-(n-프로필)-4-노니닐기, 6,7-디히드록시-6-(n-프로필)-4-노니닐기, 5-히드록시-6-메틸-3-헵티닐기, 6-히드록시-6-메틸-3-헵티닐기, 7-히드록시-6-메틸-3-헵티닐기, 5,6-디히드록시-6-메틸-3-헵티닐기, 5,7-디히드록시-6-메틸-3-헵티닐기, 6,7-디히드록시-6-메틸-3-헵티닐기, 6-에틸-5-히드록시-3-옥티닐기, 6-에틸-6-히드록시-3-옥티닐기, 6-에틸-7-히드록시-3-옥티닐기, 6-에틸-5,6-디히드록시-3-옥티닐기, 6-에틸-5,7-디히드록시-3-옥티닐기, 6-에틸-6,7-디히드록시-3-옥티닐기, 5-히드록시-6-(n-프로필)-3-노니닐기, 6-히드록시-6-(n-프로필)-3-노니닐기, 7-히드록시-6-(n-프로필)-3-노니닐기, 5,6-디히드록시-6-(n-프로필)-3-노니닐기, 5,7-디히드록시-6-(n-프로필)-3-노니닐기, 6,7-디히드록시-6-(n-프로필)-3-노니닐기, 5-히드록시-6-메틸-2-헵티닐기, 6-히드록시-6-메틸-2-헵티닐기, 7-히드록시-6-메틸-2-헵티닐기, 5,6-디히드록시-6-메틸-2-헵티닐기, 5,7-디히드록시-6-메틸-2-헵티닐기, 6,7-디히드록시-6-메틸-2-헵티닐기, 6-에틸-5-히드록시-2-옥티닐기, 6-에틸-6-히드록시-2-옥티닐기, 6-에틸-7-히드록시-2-옥티닐기, 6-에틸-5,6-디히드록시-2-옥티닐기, 6-에틸-5,7-디히드록시-2-옥티닐기, 6-에틸-6,7-디히드록시-2-옥티닐기, 5-히드록시-6-(n-프로필)-2-노니닐기, 6-히드록시-6-(n-프로필)-2-노니닐기, 7-히드록시-6-(n-프로필)-2-노니닐기, 5,6-디히드록시-6-(n-프로필)-2-노니닐기, 5,7-디히드록시-6-(n-프로필)-2-노니닐기, 6,7-디히드록시-6-(n-프로필)-2-노니닐기 등을 들 수 있고, 바람직하게는 3-히드록시-3-메틸부틸기, 4-히드록시-3-메틸부틸기, 3,4-디히드록시-3-메틸부틸기, 3-에틸-3-히드록시펜틸기, 3-에틸-4-히드록시펜틸기, 3-에틸-3,4-디히드록시펜틸기, 4-히드록시-4-메틸펜틸기, 5-히드록시-4-메틸펜틸기, 4,5-디히드록시-4-메틸펜틸기, 4-에틸-4-히드록시헥실기, 4-에틸-5-히드록시헥실기, 4-에틸-4,5-디히드록시헥실기, 4-히드록시-4-메틸-2-펜테닐기, 5-히드록시-4-메틸-2-펜테닐기, 4,5-디히드록시-4-메틸-2-펜테닐기, 4-에틸-4-히드록시-2-헥세닐기, 4-에틸-5-히드록시-2-헥세닐기, 4-에틸-4,5-디히드록시-2-헥세닐기, 4-히드록시-4-메틸-2-펜티닐기, 5-히드록시-4-메틸-2-펜티닐기, 4,5-디히드록시-4-메틸-2-펜티닐기, 4-에틸-4-히드록시-2-헥시닐기, 4-에틸-5-히드록시-2-헥시닐기, 4-에틸-4,5-디히드록시-2-헥시닐기 등을 들 수 있다.

본 명세서중에서 알킬기란 일반적으로는 탄소수 1∼15, 바람직하게는 탄소수 1∼8 의 직쇄 또는 분지쇄의 알킬기를 의미하고, 아릴기란 일반적으로는 탄소수 6∼20, 바람직하게는 탄소수 6∼14 의 아릴기를 의미하고, 알콕시기란 일반적으로는 탄소수 1∼15, 바람직하게는 탄소수 1∼8 의 직쇄 또는 분지쇄의 알콕시기를 의미한다.

보호기란, 아실기, 치환실릴기, 치환알킬기 등을 들 수 있고, 바람직하게는 아실기, 치환실릴기이다.

아실기란, 치환된 카르보닐기를 의미하고, 여기서 말하는 카르보닐기의 치환기란, 수소원자, 치환기를 가지고 있어도 좋은 저급알킬기, 치환기를 가지고 있어도 좋은 아릴기, 치환기를 가지고 있어도 좋은 저급알킬옥시기, 치환기를 가지고 있어도 좋은 아릴옥시기, 치환기를 가지고 있어도 좋은 아르알킬옥시기 등을 의미한다. 아실기는 바람직하게는 포르밀기, 저급알킬카르보닐기, 치환기를 가지고 있어도 좋은 페닐카르보닐기, 저급알킬옥시카르보닐기, 치환기를 가지고 있어도 좋은 페닐알킬옥시카르보닐기 등을 나타내고, 보다 바람직하게는 포르밀기, 아세틸기, 프로피오닐기, 부티릴기, 피발로일기, 벤조일기, 메톡시카르보닐기, 에톡시카르보닐기, t-부톡시카르보닐기, 벤질옥시카르보닐기 등을 나타낸다.

치환실릴기란, 1 이상의 치환기를 가지고 있어도 좋은 저급알킬기 또는 치환기를 가지고 있어도 좋은 아릴기 등으로 치환된 실릴기를 의미하고, 바람직하게는 3 치환된 실릴기를 나타낸다. 치환실릴기의 바람직한 예로는, 트리메틸실릴기, 트리에틸실릴기, 트리이소프로필실릴기, t-부틸디페닐실릴기, t-부틸디메틸실릴기 등을 들 수 있다.

치환알킬기란 1 이상의 치환기로 치환되어 있는 알킬기를 나타내고, 여기서치환기의 바람직한 예로는, 치환기를 가지고 있어도 좋은 알킬옥시기나 치환기를 가지고 있어도 좋은 아릴기를 들 수 있고, 특히 치환기를 가지고 있어도 좋은 알킬옥시기를 들 수 있다. 알킬옥시기 등의 치환기를 가지고 있어도 좋은 알킬옥시기로 치환된 치환알킬기로는, 예컨대 메톡시메틸기, 2-메톡시에톡시메틸기 외에 테트라히드로피란-2-일기 등을 들 수 있다. 또 치환기의 예로는, 할로겐원자, 시아노기, 니트로기, 아미노기, 수산기, 알킬기, 알킬옥시기, 아실옥시기, 술포닐기 등을 들 수 있다.

본 발명의 일반식 (1) 로 나타내어지는 화합물 중, X 가 황원자인 화합물은, 예컨대 일본 공개특허공보 평 10-231284 호에 기재된 방법 등으로 제조할 수 있다.

본 발명의 골다공증 치료약의 유효성분이 되는 화합물로는, 1,3-디히드록시-20-(3-히드록시-3-메틸부틸티오)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19),16-테트라엔, 1α,3β-디히드록시-20(S)-(3-히드록시-3-메틸부틸티오)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19),16-테트라엔, 1α,3β-디히드록시-20(R)-(3-히드록시-3-메틸부틸티오)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19),16-테트라엔, 1α,3β-디히드록시-20(R)-((E)-4-히드록시-4-메틸-2-펜테닐티오)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19),16-테트라엔, 1α,3β-디히드록시-20(R)-((E)-4-에틸-4-히드록시-2-헥세닐티오)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19),16-테트라엔, 1α,3β-디히드록시-20(S)-(2-히드록시-2-메틸프로필티오)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19),16-테트라엔, 1α,3β-디히드록시-20(R)-(2-히드록시-2-메틸프로필티오)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19),16-테트라엔, 1α,3β-디히드록시-20(S)-{2(S)-히드록시-3-메틸부틸옥시}-9,10-세코프레그나-5,7,10(19), 16-테트라엔, 1α,3β-디히드록시-20(S)-{2(R)-히드록시-3-메틸부틸옥시}-9,10-세코프레그나-5,7,10(19),16-테트라엔, 1α,3β-디히드록시-20(S)-(2-에틸-2-히드록시부틸티오)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19),16-테트라엔, 1α,3β-디히드록시-20(R)-(2-에틸-2-히드록시부틸티오)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19),16-테트라엔, 1α,3β-디히드록시-20(R)-(4-에틸-4-히드록시-2-헥시닐옥시)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19),16-테트라엔, 1α,3β-디히드록시-20(R)-{3-에틸-2(S)-히드록시펜틸티오}-9,10-세코프레그나-5,7,10(19),16-테트라엔 등을 바람직하게 사용할 수 있다.

본 발명의 스크리닝법에서는 시험화합물의 VDRE 를 매개로 하는 전사 촉진 활성을 측정한다. VDRE 란, 비타민 D 유도체 등의 리간드가 결합된 비타민 D 수용체가 결합하여 작용함으로써 그 하류에 있는 유전자의 발현이 활성화되는 DNA 상의 조절서열의 1 종이다. 예컨대, 비타민 D 의 부작용인 고칼슘혈증은 VDRE 를 매개로 하여 발생한다고 여겨지고 있다. VDRE 의 DNA 염기서열은 생물종, 및 동일한 생물종 중에서도 조절 대상이 되는 유전자의 종류 등에 따라서 상이한 경우가 있지만, 본 발명에서는 어느 VDRE 서열을 사용해도 된다. 이하의 실시예에서는 마우스의 오스테오폰틴 유전자의 VDRE 서열을 사용하여 리포터 유전자 분석계로 스크리닝하였지만, 이것은 VDRE 서열의 일례를 나타내는 것에 지나지 않는다. 다른 VDRE 서열로는, 에컨대 래트 오스테오칼신 유전자, 인간 오스테오칼신 유전자, 래트 칼빈딘-D_9K유전자, 인간 칼빈딘-D_9K유전자, 마우스 칼빈딘-D_28K유전자, 래트 24- 하이드록실라아제유전자, 인간 24- 하이드록실라아제유전자, 닭인테그린 β3 유전자 등을 들 수 있고, 이들도 본 발명의 방법에서 사용할 수 있다.

본 발명의 스크리닝법에서는 시험화합물의 전사인자의 활성 저해 작용을 측정한다. 전사인자란, 일반적으로는 핵내에서 DNA 에서 RNA 로의 전사반응에 필요한 단백질성의 인자를 의미하고, 본 발명에서는 특히 특정 유전자의 상류의 특정 염기서열을 인식하여 결합함으로써 그 유전자의 발명을 제어하는 인자를 의미한다. 본 발명의 스크리닝법에서 사용되는 전사인자는 비타민 D 수용체에 의해 활성이 저해되는 인자이면 그 종류는 특별히 한정되지 않는다. 전사인자의 예로는, AP-1 복합체, NF-κB 패밀리, Sp1 패밀리, Oct 패밀리, ATF/CREB 패밀리, NF-AT 패밀리, STAT 패밀리, Egr 패밀리 등을 들 수 있고, 보다 바람직하게는 본 명세서 중 이하의 실시예에서 사용한 AP-1 복합체 및 NF-κB 패밀리이다.

AP-1 (activator protein-1) 복합체는 Jun 패밀리의 호모이량체 또는 Fos 패밀리와 Jun 패밀리의 헤테로이량체로 구성되며, AP-1 결합부위인 TRE 서열에 결합되는 전사인자이다. Jun 패밀리로는 c-Jun, JunB, JunD 가, Fos 패밀리로는 c-Fos, FosB, Fra-1, Fra-2 가 동정되어 있다.

AP-1 결합부위를 갖는 유전자로는, 인터루킨-1, 인터루킨-2, 인터루킨-5, GM-CSF, TNF-α 등의 사이토카인이나, ICAM-1 등의 접착분자, 콜라게나아제 등의 효소가 알려져 있고, 이들 유전자의 AP-1 결합부위를 사용한 리포터 유전자 분석도 이용가능하다. AP-1 결합부위의 DNA 염기서열은 생물종, 및 동일한 생물종 중에서도 조절 대상이 되는 유전자의 종류 등에 따라서 상이한 경우가 있지만, 본 발명에서는 어느 AP-1 결합부위의 서열을 사용해도 된다.

NF-κB (nuclear factor-κB) 패밀리는 Rel 패밀리의 이량체로 구성되며, NF-κB 결합부위인 κB 서열에 결합되는 전사인자이다.

Rel 패밀리로는, NF-κBp50, NF-κBp52, NF-κBp65 (RelA), c-Rel 및 RelB 가 동정되어 있다.

NF-κB 결합부위를 갖는 유전자로는, 인터루킨-1, 인터루킨-2, 인터루킨-6, 인터루킨-8, TNF-α 등의 사이토카인이나, ICAM-1, VCAM 등의 접착분자 등이 알려져 있고, 이들 유전자의 NF-κB 결합부위를 사용한 리포터 유전자 분석도 이용가능하다. NF-κB 결합부위의 DNA 염기서열은 생물종, 및 동일한 생물종 중에서도 조절 대상이 되는 유전자의 종류 등에 따라서 상이한 경우가 있지만, 본 발명에서는 어느 NF-κB 결합부위의 서열을 사용해도 된다.

또한, 본 발명의 스크리닝법은 비타민 D 수용체가 전사인자에 대해 활성 저해 작용을 나타내는지의 여부를 측정하는 것을 하나의 특징으로 하는 것이지만, 사용하는 전사인자에 따라서는 활성 저해 작용이 아니고 활성화작용 (활성촉진작용) 을 나타내는 경우도 생각할 수 있다. 따라서, 이와 같은 전사인자를 사용하는 경우에는 활성 저해 작용이 아니고 활성촉진작용을 측정하게 되는데, 이것도 본 발명의 범위내의 것이다.

상기한 전사인자 중에서, 예컨대 AP-1 복합체는 AP-1 결합부위에 결합하여 그 하류에 있는 유전자의 발현을 활성화함으로써 골파괴를 일으키는 것이 알려져 있다. 그래서, 비타민 D 유도체가 결합된 상태의 비타민 D 수용체에 의해 AP-1복합체의 활성화를 저해할 수 있으면, 골파괴를 발생시키는 상기한 바와 같은 유전자의 발현을 저해할 수 있을 것으로 생각할 수 있다. 이와 같이 골파괴 또는 염증 등 어느 한 질환의 발증 또는 진행에 관여하는 것으로 생각되는 유전자 발현의 활성화인자가 동정된 경우에, 그 활성화인자의 작용을 비타민 D 수용체에 의해 저해할 수 있음을 알 수 있으면, VDRE 를 매개로 하는 전사 촉진 활성에 비해 그와 같은 활성화인자의 저해활성에 대한 선택성이 높은 화합물 (즉, VDRE 를 매개로 하는 전사 촉진 활성보다도 전사인자의 활성 저해 작용 쪽이 상대적으로 강한 화합물) 을 본 발명의 스크리닝법에 의해 선택함으로써 부작용이 적은 유리한 약제를 개발하는 것이 가능해진다. 따라서, 본 발명에서의 전사인자란, 골파괴 또는 염증 등 어느 한 질환의 발증 또는 진행에 관여하는 것이 바람직하다.

VDRE 를 매개로 하는 전사 촉진 활성, 및 전사인자의 활성 저해 작용의 측정은 해당 기술분야에서 알려져 있는 임의의 방법에 의해 실시할 수 있으며 그 방법은 특별히 한정되지 않는다. 바람직하게는 리포터 유전자 분석법을 들 수 있다. 리포터 유전자 분석법이란, 예컨대 VDRE 서열, 프로모터서열 및 바람직한 리포터유전자를 이 순서로 연결시킨 벡터와 비타민 D 수용체의 발현벡터를 각각 구축하고, 바람직한 숙주에 이들 벡터를 동시에 트랜스펙션한 후, 시험물질을 첨가하여 세포를 배양하고 세포중의 리포터유전자의 발현량을 측정함으로써 시험물질의 VDRE 를 매개로 하는 전사 촉진 활성을 평가하는 방법이다.

리포터유전자를 포함하는 벡터를 트랜스펙션하는 숙주의 종류도 특별히 한정되지 않고, 당업자라면 해당 분야에서 상용되는 바람직한 숙주를 적당하게 선택할수 있다. 숙주세포의 비한정적 예로는 인간 유래 세포에서는 쟈컷 (Jurkat) 세포, HeLa 세포, HepG2, CaCO-2, SaOS, K562, 원숭이유래세포에서는 CV-1, COS-1, COS-7, 마우스유래세포에서는 NIH3T3, L929, F9, MC-3T3-E1, 래트 유래세포에서는 PC-12, ROS17/2.8, 햄스터유래세포에서는 CHO-K1, BHK-21 등을 들 수 있다.

벡터를 숙주에 트랜스펙션하는 방법도 특별히 한정되지 않고, 당업자라면 해당 분야에서 상용되는 방법 중에서 적당하게 선택할 수 있다. 트랜스펙션법의 비한정적 예로는, 인산칼슘법, DEAE-덱스트란처리법, 전기천공법, 리포펙션법 등을 들 수 있다.

리포터유전자란, 프로모터나 인핸서의 전사활성 등을 조사하기 위해 DNA 로 삽입되는 표시용 유전자이며, 그 발현량을 측정할 수 있는 유전자이면 특별히 한정되지 않지만, 일반적으로는 검출이 간단하고 정량화 가능한 것이 바람직하다. 예컨대, 발색 또는 발광반응을 촉매하는 효소의 유전자 등이 바람직하며, 이 경우, 세포용해액에 발색반응의 기질을 첨가함으로써 나타난 발색의 정도를 측정함으로써 발현된 효소량, 즉 전사 촉진 활성을 평가할 수 있다. 또는 ELISA 법 등을 사용하여 항체에 의해 단백질을 정량함으로써 리포터유전자의 발현량을 측정할 수도 있다.

리포터유전자의 구체예로는, CAT(클로람페닐콜아세틸트랜스페라아제)유전자, Luc(루시페라아제)유전자, β-Gal(β-갈락토시다아제)유전자, hGH(분비형 인간성장호르몬)유전자, SEAP(인간분비형 알칼리포스파타아제)유전자, GFP(그린플루오레센트단백질)유전자 및 GUS(β-글루쿠로니다아제)유전자 등을 들 수 있다.

리포터유전자로서 CAT 유전자를 사용하는 CAT 분석에서는 전사활성을 측정하고자 하는 조절영역의 염기서열을 CAT 유전자의 상류에 접속된 리포터 유전자 벡터를 세포로 트랜스펙션 등에 의해 도입하여 일과성으로 발현시킨다. 일반적으로는 12∼72 시간 후에 세포추출액을 조제하고, 그것에 아세틸 CoA 와 클로람페니콜을 첨가하여 반응시켜 아세틸화된 클로람페니콜을 박층크로마토그래피 등에 의해 분리동정한다. 즉, CAT 분석에서는 유전자의 전사활성은 클로람페닐콜을 아세틸화하는 효소활성으로 측정한다.

또, 루시페라아제는 식:

루시페린 + O₂→옥시루시페린 + 광

으로 나타내어지는 발광반응을 촉매하는 발광성효소의 총칭이다. 루시페라아제를 리포터유전자로 사용함으로써 세포추출액에 기질과 산소를 부여하여 발광반응을 일으켜 발광의 정도를 측정함으로써 루시페라아제의 발현량을 평가할 수 있다.

상기한 바와 같은 리포터 유전자 분석법은 예컨대, S.K.Nordeen, Biotechniques, Vol.6, pp.454-456, (1988) 등에 기재되어 있는 당업자에게 공지된 통상적인 방법에 의해 실시할 수 있다. 또는, 리포터 유전자 분석법은 베링거만하임 사, 클론텍 사 또는 프로메가 사 등에서 시판되고 있는 리포터 유전자 분석용 시약을 사용하여 그 설명서에 따라 간편하게 실시할 수도 있다.

전사 촉진 활성 또는 전사인자의 활성 저해 작용을 평가하기 위한 다른 방법으로는, 예컨대 겔 시프트 분석법, 런-온 (Run-on) 분석법 및 런-오프 (Run-off)분석법 등을 들 수 있다.

겔 시프트 분석법은 DNA 의 결합성 인자를 조사하는 간편하고 효과적인 방법의 하나이다. 그 원리는 DNA 와 DNA 결합성 인자를 반응시킨 후에 비변성폴리아크릴아미드겔을 사용하여 전기영동을 실시하면, 단백질과 결합된 DNA 의 이동도가 결합하고 있지 않은 DNA 의 이동도보다 작아지기 때문에 이것을 라벨한 DNA 를 사용하여 검출하는 것이다.

런-온 분석법도 특정 유전자의 전사활성을 조사하는 방법의 하나이다. 세포에서 단리한 핵을 사용하여 시험관내에서 전사합성시키면 전사개시점에서의 새로운 합성은 일어나지 않고, 세포상태로 이미 전사가 개시되고 있는 RNA 사슬의 계속적인 RNA 가 신장하는 합성반응만이 관찰된다. 그래서, 단리핵을 사용한 시스템에서 전사산물을 방사성 동위원소로 표지하고, 표지된 RNA 로부터 조사하고 자 하는 유전자를 프로브에 의해 선택적으로 검출한다. 그럼으로써, 특정 유전자의 핵을 단리한 시점에서의 전사활성을 측정하여 시간 경과에 따른 변화나 전사의 상대량을 비교검토할 수 있다.

런-오프 분석법도 인히드로전사법의 하나이며, 주형 DNA 를 직쇄상으로 하고 일정한 길이의 전사산물을 합성하는 방법이다. 주형 DNA 는 전사개시점에서 수백 염기하류를 제한효소로 절단한 것을 사용한다. 이 직쇄상의 주형 DNA 를 사용하여 인히드로전사법을 실시하면, RNA 폴리머라아제는 절단부위에서 주형 DNA 로부터 해리하여 전사반응이 정지하기 때문에 일정 길이의 RNA 가 생긴다. 이 때, 반응중에 표지 리보뉴클레오티드를 넣어두고, RNA 를 표지, 전기영동 후, 오토라디오그램을 제작하여 RNA 양을 측정한다.

본 발명의 스크리닝법에서는 VDRE 를 매개로 하는 전사 촉진 활성보다도 전사인자의 활성 저해 작용 쪽이 상대적으로 강한 화합물을 선택한다. 이것은 VDRE 를 매개로 하는 전사 촉진 활성보다도 전사인자의 활성 저해 작용이 강하게 발현됨으로써, 비타민 D 유도체의 부작용인 혈중 칼슘상승작용이 없거나 약하기 때문에 골량증가작용 등의 유용한 생리활성이 발현한다는 예측에 기초하는 것이다. 따라서, 스크리닝시 전사인자의 활성 저해 작용에 대한 선택성을 어느 정도로 설정할지는 선택되는 화합물의 용도 등에 따라 적당하게 선택할 수 있고, 특정한 값으로 한정되어야 하는 것은 아니다.

본 스크리닝법의 바람직한 실시양태에서는 전사인자의 활성 저해 작용에 대한 선택성을 평가하기 위한 기준으로 표준물질을 사용할 수 있다. 표준물질의 종류는 특별히 한정되지 않고, 임의의 물질을 적당하게 사용할 수 있다. 예컨대, 1α,25-디히드록시비타민 D₃를 표준물질로 사용하고, 이 표준물질보다도 전사인자의 활성 저해 작용에 대한 선택성이 높은 화합물을 선택하면, 부작용이 적은 유리한 화합물을 탐색할 수 있다.

특히, VDRE 를 매개로 하는 전사 촉진 활성 또는 전사인자의 활성 저해 작용을 본 발명의 스크리닝법으로 측정하는 경우, 일반적으로는 각 시험물질의 EC50 값 또는 IC50 값을 측정함으로써 각 시험물질의 VDRE 를 매개로 하는 전사 촉진 활성 또는 전사인자의 활성 저해 작용을 평가할 수 있다. 또, 전사인자의 활성 저해작용에 대한 선택성은 하기 식:

[시험화합물의 전사인자의 활성 저해 작용을 표준물질 (예컨대, 1α,25-디히드록시비타민 D₃) 의 것과 비교한 상대값]/[시험화합물의 VDRE 를 매개로 하는 전사 촉진 활성을 표준물질 (예컨대, 1α,25-디히드록시비타민 D₃) 의 것과 비교한 상대값]

으로 나타내어지는 값으로 평가하고, 이 값이 일반적으로 1 보다 높은 경우, 특히 바람직하게는 10 이상인 경우를, 표준물질 (예컨대, 1α,25-디히드록시비타민 D₃) 보다도 전사인자의 활성 저해 작용에 대한 선택성이 높은 화합물로 평가할 수 있다.

본 발명에 의하면, 본 발명의 스크리닝법에 의해 선택되는 비타민 D 수용체에 친화성을 갖는 신규 화합물이 제공된다. 이와 같은 화합물은 전사인자의 활성화가 발증 또는 진행에 관여하는 질환의 치료약으로 유용하다.

전사인자의 활성화가 발증 또는 진행에 관여하는 질환의 예로는, 대사성 골질환 (예컨대, 골다공증, 신성골이영양증), 각종 염증 (예컨대, 만성관절류머티즘, 변형성관절염, 천식, 동맥경화증, 장기이식), 각종 종양 (예컨대, 대장암, 유방암, ATL), 또는 당뇨병, 심근경색 등을 들 수 있다.

본 발명의 스크리닝법에 의해 선택되는 화합물을 질환의 치료약으로 사용하는 경우, 그 제형은 특별히 한정되지 않고, 용도 등에 따라 정제, 캡슐제, 분산제, 용액, 현탁액, 유제 등 임의의 형태를 취할 수 있다.

투여경로로는, 경구 투여이어도 되고 비경구 투여이어도 되고, 비경구 투여에서는 정맥내, 피내, 피하, 근육내, 복강내, 외용 등 임의의 투여경로를 사용할 수 있다.

또, 투여량도 특별히 한정되지 않고, 환자의 체중, 성별, 병상의 정도 등에 따라 적당하게 설정할 수 있고, 일반적으로는 0.001 ㎍/kg/일∼1000 ㎍/kg/일, 바람직하게는 0.01 ㎍/kg/일∼100 ㎍/kg/일, 보다 바람직하게는 0.1 ㎍/kg/일∼10 ㎍/kg/일 정도이다.

또, 투여회수도 한정되지 않고, 상기 투여량을 1 일 1 회에서 수회로 나눠 투여해도 되고, 투여기간도 수일∼수주간 또는 수주간∼수개월간에 걸쳐 투여할 수 있다.

또, 본 발명에 의하면 리포터유전자를 포함하는 전사인자의 활성 저해 작용을 평가하기 위한 벡터, 리포터유전자를 포함하는 VDRE 를 매개로 하는 전사 촉진 활성을 평가하기 위한 벡터, 원하는 바에 따라 비타민 D 수용체 발현벡터, 및 상기 리포터유전자의 산물을 검출하기 위한 시약을 포함하는 본 발명의 스크리닝법을 실시하기 위한 키트가 제공된다.

이와 같은 키트를 사용하여 적당한 조건하에서 배양한 숙주세포에 전사인자의 저해활성을 평가하기 위한 벡터 또는 VDRE 를 매개로 하는 전사 촉진 활성을 평가하기 위한 벡터 중 어느 1 종의 벡터와 비타민 D 수용체 발현벡터를 동시에 트랜스펙션하고, 이어서 시험화합물을 첨가하여 세포를 적당하게 배양한 후, 세포용해액을 회수하고, 리포터유전자의 산물을 검출하기 위한 시약을 사용하여 리포터유전자의 발현량을 평가함으로써 시험물질의 스크리닝을 간단히 실시할 수 있다. 또한, 숙주세포로 비타민 D 수용체 고발현세포를 사용하는 경우는 반드시 비타민 D 수용체 발현벡터의 트랜스펙션은 필요로 하지 않는다.

또한, 본 출원이 갖는 우선권주장의 기초가 되는 출원인 일본 특허출원 평11-40090 호의 명세서에 기재된 내용은 모두 인용으로 본 명세서에 포함되는 것으로 한다.

이하의 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 스크리닝계

(A) 리포터 유전자 분석계를 사용하는 AP-1 복합체 및 NF-κB 패밀리에 대한 저해활성의 평가

(1) AP-1 결합서열 또는 NF-κB 결합서열을 갖는 리포터 유전자 벡터

루시페라아제의 카세트벡터 (pXP2;S.K.Nordeen, Biotechniques, Vol.6, pp.454-456, (1988) 에 기재된 바와 같은 것) 에 인간 IL-2 유전자의 프로모터 영역 (-72/+47) 을 삽입한 기본 (basic) 벡터를 구축하고, 이에 AP-1 결합서열을 갖는 리포터 유전자 벡터에 대해서는 인간콜라게나아제 (MMP-1) 유전자의 AP-1 결합서열 (ATGAGTCAG) 를 5 개 탠덤으로 삽입하고, NF-κB 결합서열을 갖는 리포터 유전자 벡터에 대해서는 인간면역 글로빈 경쇄 κ유전자의 NF-κB 결합서열 (CAGAGGGGACTTTTCCGAGA) 을 4 개 탠덤으로 삽입하여 각 리포터 유전자 벡터로 사용하였다.

(2) 래트 비타민 D 수용체 발현벡터

래트 비타민 D 수용체 발현벡터는 래트 비타민 D 수용체의 cDNA (James K.Burmester et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, Vol.85, pp.9499-9502, (1998) 에 기재) 를 pSG5 (STRATAGENE 사) 에 삽입한 것을 사용하였다.

(3) AP-1 결합서열 또는 NF-κB 결합서열을 갖는 리포터 유전자 벡터를 사용한 리포터 유전자 분석

Jurkat 세포는 10 % FBS 와 항생물질류를 포함하는 RPMI-1640 (GIBCO BRL) 으로 배양하였다. 5 ×10⁴개의 세포/mL 의 밀도로 배양을 개시하고, 3 또는 4 일마다 5 ×10⁴개의 세포/mL 이 되도록 세포를 계대하였다. 배양 조건은 37 ℃, 5 % CO₂이다. 리포터 유전자 벡터의 트랜스펙션은 3∼5 ×10⁶개의 Jurkat 세포에 대해, 용액 A (LIPOFECT AMINE (GIBCO BRL) 5 μL, OPTI-MEMI (GIBCO BRL) 0.5 mL) 와 용액 B (리포터 유전자 벡터와 래트 비타민 D 수용체 발현벡터를 각각 1 ㎍ 포함하는 OPTI-MEMI 0.5 mL) 를 조제하고, 두 액을 혼합 후, 실온에서 30 분간 방치하였다. 그 동안 세포를 무혈청 배지에서 2 회 세정하였다. 30 분 후, 이 혼합액으로 세포를 현탁하고, 37 ℃, 5 % CO₂의 조건하에서 5∼6 시간 처리하였다. 그 후, 세포 밀도가 1 ×10⁶개의 세포/mL 가 되도록 10 % FBS 와 항생물질류를 포함하는 RPMI-1640 을 첨가하여 하룻밤동안 배양하였다. 다음날, 96웰 흑색플레이트 (Nunc.) 에 2 ×10⁵개의 세포/200 μL/웰의 밀도로 세포를 처음부터 다시 뿌리고, 자극제로 PMA (포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트) 와 이오노마이신 (SIGMA) 를 각각 10 ng/mL, 1 ㎍/mL 이 되도록 첨가하고 (20 배 용액을 10 μL 씩 첨가), 다시 20 배 농도로 조제한 비타민 D 유도체를 10 μL 씩 첨가하였다 (비타민 D 유도체는 비히클 (2 % 에탄올, 10 % FBS, 항생물질류를 포함하는 RPMI-1640) 에 희석하여 20 배 농도로 조제하였다. 대조군에 비히클을 10 μl/웰 첨가하였다).

시험한 비타민 D 유도체는 이하에 구조를 나타내는 28 종의 화합물 (즉, 화합물번호 1∼화합물번호 28) 이다. 또, 표준화합물로 1α,25-디히드록시비타민 D₃를 사용하였다.

8∼10 시간 배양 후, 플레이트를 원심 (1500 rpm, 15 분) 하고, 배양 상청을 제거하였다. 세포는 20 μL/웰의 리포터 용해 완충제 (Reporter LysisBuffer, Promega) 로 용해하고, 전량을 루시페라아제 분석에 사용하였다. 루시페라아제에서는 상기의 세포용해액에 100 μL 의 루시페라아제·분석·시약 (Promega) 을 첨가하여 루미노스캔 RS (Labsystems) 로 5 초간 형광강도를 측정하였다.

(4) AP-1 복합체 및 NF-κB 패밀리에 대한 저해활성의 평가 (IC 37.5 값의 산출)

루시페라아제 분석의 측정값을 기초로 각 비타민 D 유도체의 IC 37.5 값을산출하여 AP-1 복합체 및 NF-κB 패밀리에 대한 저해활성을 평가하였다. 유도체를 첨가하지 않은 대조의 측정값을 100 % 의 AP-1 복합체 또는 NF-κB 패밀리의 전사활성으로 하여 각 유도체에 의한 37.5 % 저해가 발생하는 용량을 IC 37.5 값으로 산출하였다.

얻어진 IC 37.5 값을 1α,25-디히드록시비타민 D₃의 값에 대한 백분율로 표시한 결과를 이하의 표 1 에 나타낸다. 표 중, 「-」는 시험하지 않은 것을 나타낸다.

화합물	AP-1 복합체에 대한 저해활성	NF-κB 패밀리에 대한 저해활성
1α,25-디히드록시비타민 D₃	100.00	100.00
1	17.59	-
2	18.79	-
3	13.91	46.54
4	24.09	13.84
5	3.85	2.90
6	16.67	2.50
7	2.30	3.94
8	10.12	3.55
9	15.82	38.80
10	1262.83	520.18
11	6.29	4.78
12	0.95	12.45
13	4.15	12.32
14	2.19	10.21
15	4.29	3.86
16	3.92	10.88
17	31.22	63.51
18	6.60	9.63
19	1.88	19.63
20	14.95	29.37
21	2.41	4.21
22	3.74	5.19
23	171.89	157.78
24	20.55	36.87
25	6.37	1.90
26	22.24	6.42
27	41.80	24.74
28	20.98	26.13

(B) 리포터 유전자 분석계를 사용하는 VDRE 를 매개로 하는 전사 촉진 활성의 평가

(1) VDRE 를 갖는 리포터 유전자 벡터

VDRE 를 갖는 리포터 유전자 벡터는 마우스의 오스테오폰틴 유전자의 VDRE (GGTTCACGAGGTTCA) 를, 토끼 β-글로빈의 프로모터 영역 (-109/+10) 과 CAT (클로람페니콜아세틸트랜스페라아제) 를 포함하는 카세트벡터 (pGCAT;Kato S et al., Cell (1992)68, 731-742) 에 삽입한 것을 사용하였다. 트랜스펙션효율의 보정에 사용하는 β-갈락토시다아제의 발현벡터는 pCH110 (Pharmacia 사) 을 사용하였다. 또, 캐리어벡터로서 BSM (BluescribeM13+:STRATAGENE 사) 을 사용하였다.

(2) 래트 비타민 D 수용체 발현벡터

래트 비타민 D 수용체 발현벡터는 래트 비타민 D 수용체의 cDNA 를 pSG5 (STRATAGENE 사) 에 삽입한 것을 사용하였다.

(3) VDRE 를 갖는 리포터 유전자 벡터를 사용한 리포터 유전자 분석

COS-1 세포는 5 % FBS 와 10 nM 인슐린을 포함하는 DMEM 배지에서 배양하고, 3 또는 4 일마다 1500∼3000 개의 세포/㎠ 의 밀도로 계대하였다. 배양 조건은 37 ℃, 5 % CO₂로 하였다. 리포터 유전자 분석시 COS-1 세포의 배양에는 5 % DCC-FBS (차콜처리한 FBS) 와 10 nM 인슐린을 포함하는 페놀레드 불포함의 DMEM 배지를 사용하였다. COS-1 세포를 6 웰 플레이트에 5∼8 ×10⁴개의 세포/1.75mL/웰의 밀도로 뿌려 하룻밤동안 배양 후, 인산칼슘법으로 리포터 유전자 벡터 등을 트랜스펙션하였다.

구체적으로는 트랜스펙션은 1 웰 당, 3.33 ㎍ DNA/35 μL TE 용액 (0.33 ㎍ 리포터 유전자 벡터, 0.08 ㎍ 래트 비타민 D 수용체 발현벡터, 0.5 ㎍ pCH110, 2.42 ㎍ BSM 을 포함하는 TE;TE는 10 mM Tris-HCl(pH 7.5), 1 mMEDTA) 을 조제하고, 이것에 2 MCaCl₂를 5 μL 첨가하여, 다시 천천히 혼합하면서 40 μL 의 HBS (280 mM NaCl, 50 mM HEPES, 1.5 mM Na₂HPO₄) 를 첨가하여 실온에서 1 시간 방치하였다. 그 후, 각 웰에 상기에서 얻은 용액 80 μL 을 첨가하고, 이것과 아울러100 배 농도로 조제한 비타민 D 유도체를 17.5 μL 씩 첨가하였다 (비타민 D 유도체는 비히클 (10 % 에탄올을 포함하는 DMEM) 에 희석하여 100 배 농도로 조제하였다. 대조군에는 비히클을 첨가하였다).

그 후, 하룻밤 배양한 후, 페놀레드 불포함의 DMEM 배지 1 mL/웰로 각 웰을 세정하고, 다시 5 % DCC-FBS 와 10 nM 인슐린을 포함하는 페놀레드 불포함의 DMEM 배지 1.75 mL/웰로 하여 비타민 D 유도체를 첨가하여 다시 하룻밤동안 배양 후, 각 웰을 2 mL 의 PBS 로 세정하고, 세포를 1 mL 의 PBS 중에서 세포스크레이퍼를 사용하여 박리하여 튜브에 회수하였다. 원심 후, 세포를 150 μL 의 0.25 M Tris-HCl (pH 7.8) 에 현탁하고, 동결-융해법에 의해 세포용해액을 조제하였다. 이 세포 용해액을 사용하여 트랜스펙션 효율을 보정하기 위해 β-갈락토시다아제 분석을 실시한 후, CAT ELISA 키트 (베링거만하임 사) 를 사용하여 CAT 의 발현량을 측정하였다.

(4) β-갈락토시다아제 분석

세포용해액을 10 μL, 완충제 Z (60 mM Na₂HOP₄, 40 mM NaH₂PO₄, 10 mM KCl, 1 mM MgSO₄) 175 μL, 4 mg/mL ONPG (O-니트로페닐-β-D-갈락토피라노시드;SIGMA) 35 μL 을 96 웰 플레이트 (Nunc-lmmuno plate MaxiSorpSurface) 중에서 혼합하고, 37 ℃ 에서 1 시간 보온 후, 1 M Na₂CO₃를 100 μL 첨가하여 반응을 정지시켜 플레이트리더로 A415 를 측정하였다. 이 측정값을 기초로, 이하 식에 따라 세포용해액의 유닛수를 산출하고 15 유닛분의 세포용해액을 CATELISA 에서의 측정에 사용하였다.

유닛/μL = (A415 ×100)/(세포용해액량 ×2 ×반응시간)

= A415 ×5

(5) EC50 값의 산출

CAT ELISA 에서의 측정결과를 기초로 각 유도체의 VDRE 를 매개로 하는 작용의 평가를 EC50 값을 산출하여 평가하였다. 1α,25-디히드록시비타민 D₃에 의해 발현이 유도된 CAT 의 최대량을 100 % 의 기준값으로 하여, 50 % 량의 CAT 의 발현량을 유도하는 용량을 각 유도체의 EC50 값으로 산출하였다.

얻어진 결과를 1α,25-디히드록시비타민 D₃의 EC50 값을 100 % 로 한 경우의 상대값으로 하여 이하의 표 2 에 나타낸다.

화합물	VDRE 를 매개로 하는 전사 촉진 활성
1α,25-디히드록시비타민 D₃	100.00
1	82.17
2	25.58
3	13.60
4	12.70
5	12.60
6	14.30
7	13.00
8	23.80
9	13.30
10	23.80
11	7.20
12	140.27
13	37.90
14	22.20
15	101.80
16	82.00
17	924.75
18	127.30
19	466.85
20	607.10
21	136.35
22	1032.20
23	234.60
24	207.70
25	15.30
26	19.20
27	334.50
28	1517.40

(C) 스크리닝의 결과

VDRE 를 매개로 하는 전사 촉진 활성과 AP-1 복합체 또는 NF-κB 패밀리에 대한 저해활성

상기한 각종 비타민 D 유도체에 대해 VDRE 를 매개로 하는 전사 촉진 활성과 AP-1 복합체 또는 NF-κB 패밀리에 대한 저해활성을 측정하고, 각 비타민 D 유도체의 양 활성의 괴리도에 대해 평가한 결과, 1α,25-디히드록시비타민 D₃와 비교하여양 활성의 괴리도가 우수한 유도체가 복수 얻어졌다.

얻어진 결과를 도 1 및 도 2 에 나타낸다. 도 1 에서 세로축은 VDRE 를 매개로 하는 전사 촉진 활성을 1α,25-디히드록시비타민 D₃의 EC50 값을 100 % 로 한 경우의 상대값으로 나타내고, 가로축은 AP-1 복합체에 대한 저해활성을 1α,25-디히드록시비타민 D₃의 IC 37.5 값을 100 % 로 한 경우의 상대값으로 나타낸다.

도 2 에서 세로축은 VDRE 를 매개로 하는 전사 촉진 활성을 1α,25-디히드록시비타민 D₃의 EC50 값을 100 % 로 한 경우의 상대값으로 나타내고, 가로축은 NF-κB 패밀리에 대한 저해활성을 1α,25-디히드록시비타민 D₃의 IC 37.5 값을 100 % 로 한 경우의 상대값으로 나타낸다.

또, 도 1 및 도 2 중의 숫자는 화합물번호 (No.) 를 나타낸다.

양 활성의 괴리도에 관해 가장 우수한 유도체는 화합물번호 22 로 불리우는 유도체 (즉, 1α,3β-디히드록시-20(R)-(2-에틸-2-히드록시부틸티오)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19),16-테트라엔) 이며, AP-1 복합체 또는 NF-κB 패밀리에 대한 저해활성은 1α,25-디히드록시비타민 D₃에 비해 약 25∼35 배 강하고, 또한 VDRE 를 매개로 하는 전사 촉진 활성은 1α,25-디히드록시비타민 D₃에 비해 약 1/10 의 활성이었다.

이상의 결과로부터 비타민 D 유도체가 갖는 VDRE 를 매개로 하는 전사 촉진 활성과 AP-1 복합체 또는 NF-κB 패밀리에 대한 저해활성의 양자를 분리하는 것이가능함을 확인할 수 있었다.

실시예 2 : 화합물 번호 22 및 1α,25-디히드록시비타민 D ₃ 의 골다공증 모델 래트의 골량 감소에 대한 효과 (피하 투여)

(A) 실험방법

7∼9 주령의 W-I 계 암컷 래트 (동물번식연구소) 의 양측 난소를 적출하여 다음날부터 1α,25-디히드록시비타민 D₃또는 화합물번호 22 를 주 5 회, 6 주간, 1 회당 1α,25-디히드록시비타민 D₃의 경우에는 0.01∼0.04 ㎍/kg 의 투여량으로, 화합물번호 22 의 경우에는 0.01∼0.1 ㎍/kg 의 투여량으로 피하 투여하였다. 최종 투여 후, 24 시간 축뇨를 채취하고, 에테르마취하에서 채혈을 실시하여 안락사시킨 후, 요추를 적출하였다.

요추골밀도는 이중 X 선 골염량 측정장치 (DCS-600, 아로카) 를 사용하여 제 3 요추부위에서 측정하였다. 혈중 및 뇨중 칼슘값 및 뇨중 크레아티닌값은 히타치자동분석장치 7170 형으로 측정하였다.

통계처리는 통계해석기본소프트 (SAS) 에 의해 실시하였다. 가수술 (sham) 군과 난소적출 (OVX) 군의 비교는 대응이 없는 t-검정에 의해, 또 OVX 군과 약제투여군의 비교 또는 sham 군과 약제투여군의 비교는 다네트 (Dunnett) 다중비교에 의해 유의수준 5 % 미만을 유의로 하여 검정하였다.

(B) 실험결과

실험결과를 도 3a∼3f 에 나타냈다. 도 3a∼3c 에서 1α,25-디히드록시비타민 D₃(1, 25(OH)₂D₃) 투여실험의 뇨중 Ca 배설, 혈중 Ca 값 및 골밀도를 각각 나타낸다. 각 개체의 골밀도는 sham 군의 평균 골밀도를 100 % 로 한 경우의 비율 (%) 로 산출하였다.

OVX 군에서는 요추골밀도가 12 % 감소한 것에 대해, 1α,25-디히드록시비타민 D₃의 0.04 ㎍/kg 의 투여량에서는 OVX 에 의한 골밀도의 감소가 유의하게 억제되었다. 그러나, 1α,25-디히드록시비타민 D₃의 0.04 ㎍/kg 의 투여량에서는 혈중 Ca 값 및 뇨중 Ca 배설은 모두 sham 군 및 OVX 군과 비교하여 유의하게 상승하고 있고, 1α,25-디히드록시비타민 D₃에서는 골밀도에 대한 작용과 혈중 Ca 값 및 뇨중 Ca 배설의 상승작용이 동시에 관찰되었다.

또한, 도 3d∼3f 에서 화합물번호 22 투여실험의 뇨중 Ca 배설, 혈중 Ca 값 및 골밀도를 각각 나타낸다. 각 개체의 골밀도는 sham 군의 평균 골밀도를 100 % 로 한 경우의 비율 (%) 로 산출하였다.

OVX 군에서는 요추골밀도가 11 % 감소한 것에 대해, 화합물번호 22 투여군에서는 0.01∼0.1 ㎍/kg 에서 투여량에 따른 골밀도의 감소억제효과가 관찰되고, 0.1 ㎍/kg 의 투여량에서 유의한 억제효과가 관찰되었다. 또한, 1α,25-디히드록시비타민 D₃와는 달리, 화합물번호 22 에서는 혈중 Ca 값 및 뇨중 Ca 배설의 상승은 전혀 관찰되지 않고, 골밀도에 대한 작용과 Ca 에 대한 작용의 괴리가 관찰되었다.

또한, 화합물번호 22 의 비타민 D 수용체에 대한 친화성은 1α,25-디히드록시비타민 D₃의 0.8 배였다.

실시예 3 : 화합물번호 22 및 1α히드록시비타민 D ₃ 의 골다공증 모델 래트의 골량 감소에 대한 효과 (경구 투여)

(A) 실험방법

8 주령의 W-I 계 암컷 래트 (동물번식연구소) 의 양측 난소를 적출하여 다음날부터 1α히드록시비타민 D₃를 1 일 당 0.1 ㎍/kg, 주 5 회 또는 화합물번호 22 를 1 일 당 3 ㎍/kg 의 투여량을 1 회 또는 2 회로 나눠 5 주간, 연일 경구 투여하였다. 최종 투여 후, 24 시간 축뇨를 채취하고, 에테르마취하에서 채혈을 실시하여 안락사시킨 후, 요추를 적출하였다. 요추골밀도는 이중 X 선 골염량 측정장치 (DCS-600EX, 아로카) 를 사용하여 제 3 요추부위에서 측정하였다. 혈중 및 뇨중 칼슘값 및 뇨중 크레아티닌값은 히타치자동분석장치 7170 형으로 측정하였다.

통계처리는 통계해석기본소프트 (SAS) 에 의해 실시하였다. sham 군과 OVX 군의 비교, OVX 군과 1α히드록시비타민 D₃투여군의 비교 또는 sham 군과 1α히드록시비타민 D₃투여군의 비교는 대응이 없는 t-검정에 의해 유의수준 5 % 미만을 유의로 하여 검정하였다. 또, OVX 군과 화합물번호 22 투여군의 비교 또는 sham 군과 화합물번호 22 투여군의 비교는 다네트 (Dunnett) 다중비교에 의해 유의수준 5 % 미만을 유의로 하여 검정하였다.

(B) 실험결과

실험결과를 도 4a∼4c 에 나타냈다. 도 4a∼4c 에서 뇨중 Ca 배설, 혈중 Ca 값, 골밀도를 각각 나타낸다.

OVX 군에서는 요추골밀도가 유의하게 감소하였다. 1α히드록시비타민 D₃(1α(OH)D₃) 의 0.1 ㎍/kg 경구 투여군에서는 OVX 에 의한 골밀도의 감소가 유의하게 억제되었지만, 혈중 Ca 값 및 뇨중 Ca 배설은 모두 sham 군 및 OVX 군과 비교하여 유의하게 상승하였다.

또한, 화합물번호 22 의 3 ㎍/kg 를 1 일 1 회 경구 투여한 군 또는 1.5 ㎍/kg 를 1 일 2 회 경구 투여한 군에서는 모두 1α히드록시비타민 D₃와 같은 정도 또는 그 이상의 골밀도 감소 억제효과를 나타냈지만, 1α히드록시비타민 D₃와는 달리 혈청 Ca 값 및 뇨중 Ca 배설의 상승은 발생하지 않고, 골밀도에 대한 작용과 Ca 에 대한 작용에 대한 괴리가 확인되었다.

실시예 4 : 화합물번호 22 의 골다공증 모델 래트의 골강도의 감소 및 골흡수에 대한 효과 (경구 투여)

(A) 실험방법

13 개월령의 W-I 계 암컷 래트 (동물번식연구소) 의 양측 난소를 적출하여 다음날부터 화합물번호 22 를 1 일 당 1.5∼6 ㎍/kg 의 투여량을 2 회로 나눠 3 개월간 연일 경구 투여하였다. 최종 투여 후, 24 시간 축뇨를 채취하고, 에테르마취하에서 채혈을 실시하여 안락사시킨 후, 요추를 적출하였다.

요추골밀도는 이중 X 선 골염량 측정장치 (DCS-600EX, 아로카) 를 사용하여 제 2∼4 요추부위에서 측정하였다. 제 5 요추의 골강도는 오토그래프 AG-2000E (시마즈제작소) 로 측정하였다. 혈중 칼슘값 및 뇨중 크레아티닌값은 히타치자동분석장치 7170 형으로 뇨중 데옥시피리디놀린은 오스테오링크스 DPD 로 측정하였다.

통계처리는 통계해석기본소프트 (SAS) 에 의해 실시하였다. sham 군과 OVX 군의 비교는 대응이 없는 t-검정에 의해, 또 OVX 군과 화합물번호 22 투여군의 비교 또는 sham 군과 화합물번호 22 투여군의 비교는 Dunnett 다중비교에 의해 유의수준 5 % 미만을 유의로 하여 검정하였다.

(B) 실험결과

실험결과를 도 5a∼5d 에 나타냈다. 도 5a∼5d 에서 혈중 Ca 값, 뇨중 데옥시피리디놀린 (Dpyr) 배설, 골밀도, 골강도를 각각 나타낸다.

화합물번호 22 를 0.75, 1.5 또는 3 ㎍/kg 의 투여량으로 1 일 2 회, 3 개월간 연일 경구 투여한 모든 군도 혈청 Ca 값을 상승시키지 않고, OVX 에 의한 골밀도의 감소를 유의하게 억제함과 동시에 OVX 에 의한 골강도의 저하도 유의하게 억제하였다.

또, 화합물번호 22 의 투여에 의해 OVX 에서 증가한 뇨중 Dpyr 배설이 유의하게 저하함으로써 화합물번호 22 의 골에 대한 효과는 골흡수억제작용을 매개로 함이 확인되었다.

본 발명의 스크리닝법에 의해 전사인자 (특히, 비타민 D 수용체를 매개로 하여 활성화가 저해되는 전사인자) 를 표적으로 하여 고칼슘혈증을 발생시키지 않고 골에 대한 효과를 발휘할 수 있는 비타민 D 유도체를 검색하는 것이 가능해진다. 특히, 본 발명의 스크리닝법에 의해 검색되는 비타민 D 유도체는 표적으로 하는 전사인자의 활성화를 저해함으로써 그 활성화가 병태의 발증 또는 병태의 진전에 관여하는 질환에서 치료효과를 가짐을 기대할 수 있다.

Claims

비타민 D 수용체에 친화성을 갖는 화합물의 스크리닝법에 있어서, 시험화합물이 갖는 비타민 D 수용체에 의한 비타민 D 반응성영역 (VDRE) 을 매개로 하는 전사 촉진 활성과, 시험화합물이 갖는 비타민 D 수용체에 의한 전사인자의 활성 저해 작용을 측정하여, VDRE 를 매개로 하는 전사 촉진 활성보다도 전사인자의 활성 저해 작용 쪽이 상대적으로 강한 화합물을 선택하는 방법.
제 1 항에 있어서, 비타민 D 수용체에 친화성을 갖는 화합물이 비타민 D 유도체인 스크리닝법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 전사인자가 AP-1 복합체 또는 NF-κB 패밀리인 스크리닝법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, VDRE 를 매개로 하는 전사 촉진 활성을 리포터 유전자 분석계로 측정하는 스크리닝법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 전사인자의 활성 저해 작용을 리포터 유전자 분석계로 측정하는 스크리닝법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 시험화합물과 표준화합물의 각각에 대해 VDRE 를 매개로 하는 전사 촉진 활성과 전사인자의 활성 저해 작용을 측정하여, 하기 식:

(시험화합물의 전사인자의 활성 저해 작용을 표준화합물의 것과 비교한 상대값)/(시험화합물의 VDRE 를 매개로 하는 전사 촉진 활성을 표준화합물의 것과 비교한 상대값)＞1

을 만족하는 화합물을, VDRE 를 매개로 하는 전사 촉진 활성보다도 전사인자의 활성 저해 작용 쪽이 상대적으로 강한 화합물로 선택하는 스크리닝법.
제 6 항에 있어서, 하기 식:

(시험화합물의 전사인자의 활성 저해 작용을 표준화합물의 것과 비교한 상대값)/(시험화합물의 VDRE 를 매개로 하는 전사 촉진 활성을 표준화합물의 것과 비교한 상대값)≥10

을 만족하는 화합물을, VDRE 를 매개로 하는 전사 촉진 활성보다도 전사인자의 활성 저해 작용 쪽이 상대적으로 강한 화합물로 선택하는 스크리닝법.
제 6 항 또는 제 7 항에 있어서, 표준화합물이 1α,25-디히드록시비타민 D₃인 스크리닝법.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 기재된 스크리닝법에 의해 선택되는, VDRE 를 매개로 하는 전사 촉진 활성보다도 전사인자의 활성 저해 작용 쪽이 상대적으로 강한 것을 특징으로 하는 비타민 D 수용체에 친화성을 갖는 화합물.
제 9 항에 있어서, 비타민 D 유도체인 화합물.
제 9 항 또는 제 10 항에 기재된 화합물을 포함하는, 비타민 D 수용체에 의해 활성이 저해되는 전사인자가 관여하는 질환의 치료약.
제 11 항에 있어서, 비타민 D 수용체에 의해 활성이 저해되는 전사인자가 관여하는 질환이 대사성 골질환인 치료약.
제 12 항에 있어서, 대사성 골질환이 골다공증인 치료약.
제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 전사인자가 AP-1 복합체 또는 NF-κB 패밀리인 치료약.
제 11 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 비타민 D 수용체를 매개로 하는 AP-1 복합체의 활성저해제 또는 NF-κB 패밀리의 활성저해제인 치료약.
(a) 전사인자의 결합서열 및 리포터유전자를 포함하고, 전사인자의 활성 저해 작용을 평가하기 위한 벡터;

(b) VDRE 서열 및 리포터유전자를 포함하고, VDRE 를 매개로 하는 전사 촉진 활성을 평가하기 위한 벡터;

(c) 원하는 바에 따라 비타민 D 수용체 발현벡터;및

(d) 상기 리포터유전자의 산물을 검출하기 위한 시약;

을 포함하는, 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 기재된 스크리닝법을 실시하기 위한 키트.
제 1 항에 기재된 방법에 따라, VDRE 를 매개로 하는 전사 촉진 활성과 전사인자의 활성 저해 작용을 측정했을 때의 하기 식:

(시험화합물의 전사인자의 활성 저해 작용을 표준화합물의 것과 비교한 상대값)/(시험화합물의 VDRE 를 매개로 하는 전사 촉진 활성을 표준화합물의 것과 비교한 상대값)

이 1 보다 큰 화합물을 유효성분으로 하는 골다공증 치료약.
제 17 항에 기재된 하기 식:

(시험화합물의 전사인자의 활성 저해 작용을 표준화합물의 것과 비교한 상대값)/(시험화합물의 VDRE 를 매개로 하는 전사 촉진 활성을 표준화합물의 것과 비교한 상대값)

이 10 이상인 화합물을 유효성분으로 하는 골다공증 치료약.
제 17 항 또는 제 18 항에 있어서, 화합물이 하기 일반식 (1):

(식중, X 는 산소원자 또는 황원자를 나타내고, R₁은 수산기 또는 보호된 수산기로 치환되어 있어도 좋은 포화 또는 불포화 지방족탄화수소기, 또는 -COR₁₂기 (식중 R₁₂는 알킬기, 아릴기 또는 알콕시기를 나타냄) 를 의미하고, R₂는 -OR₉또는 수소원자를 나타내고, R₉및 R₁₀은 동일 또는 상이하며 수소원자 또는 보호기를 나타낸다)

으로 나타내어지는 비타민 D 유도체인 골다공증 치료약.
제 19 항에 있어서, R₂가 -OR₉인 골다공증 치료약.
제 19 항에 있어서, R₁이 수산기로 치환되어 있어도 좋은 탄소수 1∼15 의포화 지방족탄화수소기인 골다공증 치료약.
제 19 항에 있어서, R₁이 수산기로 치환되어 있어도 좋은 탄소수 2∼15 의 불포화 지방족탄화수소기인 골다공증 치료약.
제 19 항에 있어서, R₁이 기 (2):

(식중, R₃및 R₄는 동일 또는 상이하며 수소원자 또는 수산기를 나타내거나 일체가 되어 산소원자를 갖는 = 0 을 나타낸다. 단, R₃와 R₄가 동시에 수산기가 되는 것은 아니다. R₅및 R₆은 수소원자 또는 수산기를 나타내지만, R₆은 R₃또는 R₄와 동시에 수산기가 되는 것은 아니다. m 은 1∼4 의 정수를 나타내고, n 은 0∼2 의 정수를 나타낸다) 또는 기 (3):

(식중, R₅및 R₆은 동일 또는 상이하며 수소원자 또는 수산기를 나타낸다. R₇및 R₈은 수소원자 또는 일체가 되어 공유결합을 나타낸다. p 는 1∼3 의 정수를 나타내고, q 는 0∼2 의 정수를 나타낸다) 인 골다공증 치료약.
제 19 항에 있어서, R₁이 3-히드록시-3-메틸부틸기인 골다공증 치료약.
제 19 항에 있어서, 일반식 (1) 로 나타내어지는 비타민 D 유도체의 20 위치가 S 배치인 골다공증 치료약.
제 19 항에 있어서, 일반식 (1) 로 나타내어지는 비타민 D 유도체의 20 위치가 R 배치인 골다공증 치료약.
제 19 항에 있어서, 일반식 (1) 로 나타내어지는 비타민 D 유도체가 1,3-디히드록시-20-(3-히드록시-3-메틸부틸티오)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19),16-테트라엔인 골다공증 치료약.
제 19 항에 있어서, 일반식 (1) 로 나타내어지는 비타민 D 유도체가 1α,3β-디히드록시-20(S)-(3-히드록시-3-메틸부틸티오)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19),16-테트라엔인 골다공증 치료약.
제 19 항에 있어서, 일반식 (1) 로 나타내어지는 비타민 D 유도체가1α,3β-디히드록시-20(R)-(3-히드록시-3-메틸부틸티오)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19),16-테트라엔인 골다공증 치료약.
제 19 항에 있어서, 일반식 (1) 로 나타내어지는 비타민 D 유도체가 1α,3β-디히드록시-20(R)-((E)-4-히드록시-4-메틸-2-펜테닐티오)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19),16-테트라엔인 골다공증 치료약.
제 19 항에 있어서, 일반식 (1) 로 나타내어지는 비타민 D 유도체가 1α,3β-디히드록시-20(R)-((E)-4-에틸-4-히드록시-2-헥세닐티오)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19),16-테트라엔인 골다공증 치료약.
제 19 항에 있어서, 일반식 (1) 로 나타내어지는 비타민 D 유도체가 1α,3β-디히드록시-20(S)-(2-히드록시-2-메틸프로필티오)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19),16-테트라엔인 골다공증 치료약.
제 19 항에 있어서, 일반식 (1) 로 나타내어지는 비타민 D 유도체가 1α,3β-디히드록시-20(R)-(2-히드록시-2-메틸프로필티오)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19),16-테트라엔인 골다공증 치료약.
제 19 항에 있어서, 일반식 (1) 로 나타내어지는 비타민 D 유도체가1α,3β-디히드록시-20(S)-{2(S)-히드록시-3-메틸부틸옥시}-9,10-세코프레그나-5,7,10(19),16-테트라엔인 골다공증 치료약.
제 19 항에 있어서, 일반식 (1) 로 나타내어지는 비타민 D 유도체가 1α,3β-디히드록시-20(S)-{2(R)-히드록시-3-메틸부틸옥시}-9,10-세코프레그나-5,7,10(19),16-테트라엔인 골다공증 치료약.
제 19 항에 있어서, 일반식 (1) 로 나타내어지는 비타민 D 유도체가 1α,3β-디히드록시-20(S)-(2-에틸-2-히드록시부틸티오)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19),16-테트라엔인 골다공증 치료약.
제 19 항에 있어서, 일반식 (1) 로 나타내어지는 비타민 D 유도체가 1α,3β-디히드록시-20(R)-(2-에틸-2-히드록시부틸티오)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19),16-테트라엔인 골다공증 치료약.
제 19 항에 있어서, 일반식 (1) 로 나타내어지는 비타민 D 유도체가 1α,3β-디히드록시-20(R)-(4-에틸-4-히드록시-2-헥시닐옥시)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19),16-테트라엔인 골다공증 치료약.
제 19 항에 있어서, 일반식 (1) 로 나타내어지는 비타민 D 유도체가1α,3β-디히드록시-20(R)-{3-에틸-2(S)-히드록시펜틸티오}-9,10-세코프레그나-5,7,10(19),16-테트라엔인 골다공증 치료약.