KR20010086306A - 접합체의 제조방법 및 알레르기성 반응과 자가면역 질환을예방 및 치료하기 위한 이의 용도 - Google Patents

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모저 하., 라우페 하. 페.
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Abstract

본 발명은 제1 폴리펩타이드를 폴리에틸렌 옥사이드 스페이서를 통해 결합된 N-하이드록실석신이미드 에스테르 그룹과 말레이미드 그룹을 포함하는 헤테로이작용성 가교결합제의 존재하에 항온처리하는 단계(a), 과량의 헤테로이작용성 가교결합제를 제거하는 단계(b), 단계(b)의 반응 생성물을 하나 이상의 설프하이드릴 그룹을 포함하는 제2 폴리펩타이드와 함께 항온처리하는 단계(c)를 포함하는, 제1 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드를 포함하는 접합체의 제조방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 수득할 수 있는 접합체에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 접합체와 임의의 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물, 및 알레르기성 질환 또는 자가면역 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 약제학적 조성물을 제조하기 위한 접합체의 용도가 기재되어 있다.

Description

접합체의 제조방법 및 알레르기성 반응과 자가면역 질환을 예방 및 치료하기 위한 이의 용도{Method for the production of conjugates and uses thereof for the prevention and treatment of allergic reactions and autoimmune diseases}
본 발명은 제1 폴리펩타이드를 폴리에틸렌 옥사이드 스페이서를 통해 결합된 N-하이드록실석신이미드 에스테르 그룹과 말레이미드 그룹을 포함하는 헤테로이작용성 가교결합제의 존재하에 항온처리하는 단계(a), 과량의 헤테로이작용성 가교결합제를 제거하는 단계(b), 단계(b)의 반응 생성물을 하나 이상의 설프하이드릴 그룹을 포함하는 제2 폴리펩타이드와 함께 항온처리하는 단계(c)를 포함하는, 제1 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드를 포함하는 접합체의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 수득할 수 있는 접합체에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 접합체와, 약제학적으로 허용되는 임의의 담체 및/또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물, 및 알레르기성 질환 또는 자가면역 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 약제학적 조성물을 제조하기 위한 접합체의 용도가 기재되어 있다.
면역학적 관용(tolerence)은 항원에의 예비 노출에 의해 유도되는 항원-특이적 무반응 상태로 정의될 수 있다. 항원이 알레르겐인 경우, 면역 반응은 알레르기, 즉 IgE 면역글로블린에 의해 매개된 면역학적 기준에 따른 부작용으로서 정의된다[참조: Sampson (1986), J. Allergy Clin. Immunol. 78: 212-219]. 또한, 면역계는 자기/비-자기 인지의 원칙이 파괴되고 신체 자신의 성분이, 자가면역 질환을 일으킬 수 있는 비-자기(자가항원)로서 인지되는 경우에 질환을 유발하거나 다른 바람직하지 않은 결과를 유발할 수 있다.
거의 반세기 전에 메다워(Medawar)[참조: Billingham et al. (1953), Nature 172: 603-606]에 의해 발견된 면역학적 관용에 대한 관심은 2가지 이유로 증가되고 있다: (1) 클론 결실[참조: Kappler et al. (1987), Cell 49:273-280], 아네르기[참조: Jenkins and Schwartz(1987), J. Exp. Med. 165: 302-319] 및 조절 T 세포[참조: Gershon and Kondo (1971), Immunology 21: 903-914]와 같은 이들의 몇몇 기작은 밝혀져 있지 않다. (2) 전신 및 경구 관용[참조: Cremer et al. (1983), J. Immunol. 131: 2995-3000; Weiner et al. (1994), Ann. Rev. Immunol. 12: 809-837] 모두는 바람직하게는 자가면역 또는 알레르기성 질환을 방지하기 위해 유도될 수 있다. 예를 들면, 변형된 알레르겐[참조: Lee and Sehon (1977), Nature 267: 618-649], 비면역원성 캐리어에 결합된 알레르겐[참조: Kats et al. (1971), J. Exp. Med. 134:201-203], 단일 펩타이드[참조: Muckerheide et al. (1977), J. Immunol. 119: 1340-1345] 또는 알레르겐-항체 복합체[참조: Machiels et al. (1990), J. Clin. Invest. 85: 1024-1035]의 투여를 포함하는 몇몇 방법이 알레르기를 방지하기 위해 사용되어 왔다.
항원 제시는 면역 반응의 유형에 영향을 줄 수 있는 것으로 알려져 있다. 합텐[참조: Borel (1989), in "Concepts in Immunopathology", Cruse and Lewis(Eds.), 7: 145-161, Karger, Basel; Sehon(1982), Prog. Allergy 32: 161-202] 뿐만 아니라, 동종성 면역글로블린과 같이 숙주에게 자연적으로 관용성이 있는 캐리어 분자에 공유 결합된 단백질은 이들 단백질에 대해 무반응을 유도할 수 있다[참조: Filion et al. (1980), Cell Immunol. 54: 115-128; Borel and Borel(1990), J. Immunol. Methods 126: 159-168].
그러나, 상기 방법은 부분적으로는 성공적인 것으로 판명되었으나, 치료 특성이 개선된 접합체를 포함하는 알레르겐 및/또는 자가-항원이 여전히 요구되고 있다.
따라서, 본 발명의 기본적인 기술적 과제는 접합체를 포함하는 이러한 알레르겐 및/또는 자가-항원의 제조방법을 제공하는 것이다.
이러한 기술적 과제의 해결방법은 특허청구범위에서 특성화된 양태를 제공함으로써 달성된다.
도 1은 1차 챌린지 프로토콜이다. 마우스를 1일 및 14일째에 알룸과 함께 Amba-1(두드러기쑥 추출물)로 감작화시킨 다음 26일, 27일 및 28일째에 분무된(연무된) Amba-1으로 챌린지시킨다. 순수한(Nu) 동물은 감작화시키지 않는다. IPNeb: 복강내 감작화/기도 연무; Amba/AL: Amba-1/알룸; AHR: 기도 과민증; BAL: 기관지폐포 세정; PBLN: 기관지 주위 림프절; SC: 비장 세포
도 2는 접합체의 크로마토그래피 및 웨스턴 블롯팅을 나타낸다.
도 3은 기도 작용에 대한 접합체의 효과를 나타낸다. Penh: 향상된 휴지-기도 작용의 측정
도 4는 기관지폐포 세정액 속의 호산구 침윤과 혈청 항원-특이적 IgE 농도에 대한 접합체의 효과를 나타낸다. EU/ml: 엘리사 단위/ml.
도 5는 BALF 임파구 수, 전체 IgE 및 항원-특이적 IgG1과 IgG2의 혈청 농도에 대한 접합체의 효과를 나타낸다.
도 6은 기도 작용에 대한 상이한 접합체의 효과를 나타낸다.
도 7은 2차 챌린지 프로토콜을 나타낸다.
도 8은 2차 챌린지후 기도 작용에 대한 상이한 접합체의 효과를 나타낸다.
따라서, 본 발명은 제1 폴리펩타이드를 폴리에틸렌 옥사이드 스페이서를 통해 결합된 N-하이드록실석신이미드 에스테르 그룹과 말레이미드 그룹을 포함하는 헤테로이작용성 가교결합제의 존재하에 항온처리하는 단계(a), 과량의 헤테로이작용성 가교결합제를 제거하는 단계(b) 및 단계(b)의 반응 생성물을 하나 이상의 설프하이드릴 그룹을 포함하는 제2 폴리펩타이드와 함께 항온처리하는 단계(c)를 포함하는, 제1 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드를 포함하는 접합체의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따라, 폴리에틸렌 옥사이드 스페이서는 1개 내지 10개의 단량체 단위로 이루어질 수 있는 것으로 간주된다. 바람직하게는, 스페이서는 2개 내지 5개의 단량체 단위로 이루어진다.
본 발명에 따라서, 예상치 않게, 가교결합제의 사용에 기인하여 본 발명의 방법에 의해 제조된 접합체가 선행 기술의 방법에 의해 제조된 접합체와 비교하여 우수한 특징을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 예를 들면, 두드러기쑥(ragweed) 유도된 항원(Amba-I)과 마우스 IgG의 접합체를 본 발명의 방법과, 바람직한 가교결합제로서 N-(γ-말레이미도부티록시)설포석신이미드 에스테르(설포-GMBS)를 사용하는 선행 기술의 방법으로 제조한다(하기 실시예 1 참조). 두드러기쑥 유도된 항원에 대한 알레르기 반응의 치료에 있어서 두 접합체의 효과를 조사한다. 놀랍게도, 본 발명의 접합체는 기도 과민증을 현저히 감소시킨 반면, 선행 기술의 접합체는 감작화된 동물과 비교하는 경우 거의 어떠한 효과도 갖지 않는다(실시예 5 및 도 3 참조). 추가로, 본 발명의 접합체는 기관지폐포 세정액(BALF)에서 호산구를 실질적으로 제거하였다. 이러한 현상은 특이적 항-Amba-I IgE의 전체적인 억제를 수반한다. 대조적으로, 선행 기술의 접합체는 호산구를 단지 적당하게만 감소시켰고, 특이적 항-Amba-I IgE는 단지 부분적으로만 억제되었다(실시예 5 및 도 4 참조). 이들 결과는 가교결합제의 사용에 기인하여 본 발명의 방법이 당업자에게, 당해 접합체를 염증과 알레르기 반응의 면역학적 반응의 하향조절에 적합하게 하는 유리한 면역학적 특성을 갖는 접합체를 제조할 수 있게 한다는 것을 명백히 입증하는 것이다.
본 발명의 바람직한 양태에 있어서, 제2 폴리펩타이드의 하나 이상의 설프하이드릴 그룹은 제2 폴리펩타이드를 N-석신이미딜-S-아세틸티오아세테이트(SATA)의 존재하에 항온처리하는 단계(i), 과량의 SATA를 제거하는 단계(ii), 단계(ii)의 반응 생성물을 하이드록실아민의 존재하에 항온처리하는 단계(iii) 및 과량의 하이드록실아민과 아세틸화된 하이드록실아민를 제거하는 단계(iv)에 의해 도입된다.
이러한 양태는 제2 폴리펩타이드가, 아미노산 서열내의 시스테인 잔기에 의해 제공되고 디설파이드 결합을 통해 제2 폴리펩타이드를 제1 폴리펩타이드와 가교결합시키는데 적합한 하나 이상의 내인성 설프하이드릴 그룹을 포함하지 않는 경우에 특히 중요하다. 가교결합에 적합하지 않은 설프하이드릴 그룹은 예를 들어 상기 제2 폴리펩타이드의 3차원 구조에 기인하여 제1 폴리펩타이드의 설프하이드릴 그룹에 용이하게 접근할 수 없거나 분자간 또는 분자내 디설파이드 결합에 기인하여 이용할 수 없는 설프하이드릴 그룹일 수 있다. 제2 폴리펩타이드가 효과적인 가교결합을 일으키게 하는 하나 이상의 설프하이드릴 그룹을 포함하는지의 여부 또는 설프하이드릴 그룹이 상기 제2 폴리펩타이드내로 도입되어야 하는지의 여부는 추가의 노력 없이도 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들면, 2개의 폴리펩타이드는 본 발명의 방법에 의해 가교결합시킬 수 있고, 수득된 접합체의 성질 및 양은 비-환원 조건하의 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 및 2개의 가교결합된 폴리펩타이드중 하나에 특이적인 항체를 사용한 면역블롯팅으로 분석할 수 있다. 바람직하게는, 당해 접합체의 동일성은 2개의 폴리펩타이드중 제2 폴리펩타이드에 특이적인제2 항체에 의해 입증된다. 상기 요약된 실험에 대한 상세한 기술은 실시예 1을 참조하라. 예를 들어, 실시예 1에서 제조된 IgG/Amba-I 접합체와 같은 참조 접합체와 비교하여 당해 접합체의 성질 및 양이 만족스럽지 않은 결과를 나타내는 경우, 설프하이드릴 그룹은 상기 기재된 바와 같이 도입될 수 있다.
또다른 바람직한 양태에 있어서, 폴리에틸렌 옥사이드 스페이서를 통해 결합된 N-하이드록실석신이미드 에스테르 그룹과 말레이미드 그룹을 포함하는 상기 헤테로이작용성 가교결합제는 하기 화학식을 갖는다:
본 발명의 방법의 추가의 바람직한 양태에 있어서, 헤테로이작용성 가교결합제는 제1 폴리펩타이드보다 5배 내지 50배 높은 몰 농도로 단계(a)에서 사용된다.
또다른 바람직한 양태에 있어서, 단계(a)와 단계(c)는 20℃ 내지 37℃의 온도 범위에서 수행된다.
추가의 바람직한 양태에 있어서, 단계(a)와 단계(c)는 30분 내지 120분의 시간 범위에서 수행된다.
본 발명의 방법의 또다른 바람직한 양태에 있어서, 단계(a)와 단계(c)는 7.0 내지 9.0의 pH 범위에서 수행된다.
추가의 바람직한 양태에 있어서, 제1 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드의 몰 비는 1:1 내지 1:10이다.
본 발명의 방법의 더욱 바람직한 양태에 있어서, 단계(a)와 단계(c)는 0.15M보레이트(pH 8.0)을 포함하는 완충액 속에서 37℃에서 30분 동안 수행되고, 헤테로이작용성 가교결합제는 상기 제1 폴리펩타이드보다 30배 높은 몰 농도로 사용되며, 제1 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드의 몰 비는 1:10이다.
이들 조건은 본 발명에 따라 예를 들어 길항작용 알레르기성 반응에 가장 효과적이고 유리한 접합체에서의 결과로 제시될 수 있다.
또다른 바람직한 양태에 있어서, 본 발명의 방법은 응집된 접합체를 제거하고 접합체를 단량체 형태로 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 예상치 않게, 이 단계는 본 발명의 접합체의 특성을 추가로 향상시킨다.
또다른 바람직한 양태에 있어서, 제1 폴리펩타이드는 면역글로블린 또는 이의 구조적으로 동등한 단편이다. 상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 방법은 특히, 알레르겐을 포함하는 경우, "관용원(tolerogen)", 즉 이것이 포함하는 알레르겐에 알레르기성인 개체에 있어서 면역학적 관용을 유도할 수 있는 접합체로서 사용될 수 있는 접합체를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 특정한 과학적 이론에 국한되지 않고서, 이들 관용원 특성은, 이들 접합체에 의해 이루어져 있고 예를 들어 동종성 또는 자가성 면역글로블린 등과 같이 "자기"로서 개체가 인지하는 분자에 의해 접합체에 제공된다. 따라서, 본 발명에 따라 사용된 용어 "구조적으로 동등한 단편"은 완전한 면역글로블린과 동일한 면역학적 특성을 나타내는 단편, 즉 개체에서 면역 반응을 유도하지 않는 단편을 의미한다. 이러한 단편은 예를 들어 면역글로블린의 Fc 부분일 수 있다.
더욱 바람직한 양태에 있어서, 상기 면역글로블린 또는 이의 구조적으로 동등한 단편은 면역글로블린 G 또는 이의 구조적으로 동등한 단편이다.
또다른 바람직한 양태에 있어서, 상기 제2 폴리펩타이드는 알레르겐, 자가항원 또는 이들의 면역학적으로 동등한 단편이다.
본 발명에 따라 사용된 "면역학적으로 동등한 단편"은 상응하는 알레르겐 또는 자가항원과 동일한 면역 반응, 즉 동일한 알레르기 또는 자가항원 반응을 개체에서 유도할 수 있는 알레르겐 또는 자가항원의 단편을 의미한다.
면역글로블린 및 예를 들어 알레르겐을 포함하는 접합체는 상기 알레르겐에 알레르기성인 개체에서 무반응성을 유도한다는 것을 알 수 있기 때문에, 본 발명은 면역글로블린 및 예를 들어 자가항원을 포함하는 접합체를 사용하여 상기 자가항원에 대해 무반응성을 유도할 수 있고 따라서 상응하는 자가면역 질환으로 진행될 소인을 갖는 것으로 의심되는 개체에 있어서 예방학적으로 사용될 수 있을 것으로 예상된다.
더욱 바람직한 양태에 있어서, 상기 알레르겐은 두드러기쑥, 자작나무 화분, 낙화생, 가정의 먼지 진드기, 동물 비듬 또는 곰팡이로부터 유도되거나, 트로포미오신 또는 이의 면역학적으로 동등한 단편이다.
또다른 더욱 바람직한 양태에 있어서, 상기 자가항원은 아세틸콜린 수용체, 인슐린, 인슐린 수용체, 수초 염기성 단백질 또는 이들 단백질의 면역학적으로 동등한 단편이다.
또다른 양태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 수득할 수 있는 접합체에 관한 것이다.
본 발명에 따라 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 접합체는 과민증 I형 반응으로부터 개체를 보호할 뿐만 아니라 알레르기의 진행으로부터 개체를 보호한다. 본 발명의 접합체는 또한 알레르기 반응을 하향조절하는데 효과적이며, 따라서 알레르기 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 마찬가지로, 면역글로블린 및 예를 들어 자가항원을 포함하는 접합체는 상응하는 자가면역 질환 및/또는 이와 관련된 징후를 완화시키고/시키거나 치료하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 접합체와, 임의의 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
적합한 약제학적 담체의 예은 당업자에게 공지되어 있고, 식염 용액, 물, 유탁액, 예를 들어 오일/물 유탁액, 멸균 용액 등이 포함된다. 이러한 담체를 포함하는 조성물은 공지된 통상의 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 약제학적 조성물은 적합한 용량으로 개체에게 투여할 수 있다. 적합한 조성물의 투여는 경구 또는 비경구적으로, 예를 들어 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 국소, 경피내, 비내 또는 기관지내 투여로 수행하거나, 표적 부위에 예를 들어 내부 또는 외부 표적 부위에 바이오리스틱 전달 또는 동맥내 부위에 카테터에 의해 직접 투여할 수 있다. 용량 섭생은 주치의 및 임상 요인에 따라 결정될 것이다. 의약 분야에 공지된 바와 같이, 특정한 환자에 대한 용량은 환자의 크기와 체중, 신체 표면적, 연령, 투여되는 특정 화합물, 성별, 투여 시간과 투여 경로, 일반 건강 및 동시 투여되는 다른 약물을 포함하는 다수의 요인에 따라 달라진다. 전형적인 용량은 예를 들어 0.001㎍ 내지 1000㎍의 범위일 수 있다. 그러나, 특히 상술된 요인을 고려하여 예시적인이러한 범위 이하 또는 이상을 예상할 수 있다. 일반적으로, 약제학적 조성물의 규칙적인 투여와 같은 섭생은 1㎍ 내지 10㎎/1일의 범위이어야 한다. 당해 섭생이 연속 주입인 경우, 또한 각각 1㎍ 내지 10mg 단위/체중 kg/분의 범위이어야 한다. 진행은 주기적인 평가로 모니터링할 수 있다. 본 발명의 조성물은 국소 또는 전신 투여할 수 있다. 비경구 투여용 제제는 멸균 수성 또는 비-수성 용액, 현탁액 및 유탁액을 포함한다. 비-수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일(예: 올리브유) 및 주사가능한 유기 에스테르(예: 에틸 올레에이트)이다. 수성 담체에는 염수 및 완충된 매질을 포함하여 물, 알콜성/수성 용액, 유탁액 또는 현탁액이 포함된다. 비경구 비히클에는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로즈, 덱스트로즈와 염화나트륨, 락테이트화된 링거액, 또는 비휘발성 오일이 포함된다. 정맥내 비히클에는 유체 및 영양소 보충물, 전해질 보충물(예: 링거 덱스트로즈를 기본으로 하는 것들) 등이 포함된다. 예를 들면, 항생제, 항-산화제, 킬레이트화제 및 불활성 기체 등의 방부제 및 기타 첨가제가 또한 존재할 수 있다.
또한, 본 발명은 알레르기성 질환 또는 자가면역 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제조하기 위한 본 발명의 접합체의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 용도의 더욱 바람직한 양태에 있어서, 상기 알레르기성 질환은 두드러기쑥, 자작나무 화분, 낙화생, 가정의 먼지 진드기, 동물의 비듬, 곰팡이 또는 트로포미오신 또는 이의 면역학적으로 동등한 단편으로부터 기원한 알레르겐에 대한 알레르기 반응이다.
또다른 바람직한 양태에 있어서, 상기 자가면역 질환은 중증 근무력증, I형 당뇨병 또는 다발성 경화증이다.
하기 실시예는 본 발명을 설명한다.
실시예 1
C 22 H 31 N 3 O 11 또는 설포-GMBS를 사용한 마우스 IgG/Amba-I 접합체의 제조
마우스 IgG 50mg(Gracow Poland의 Ptak 박사로부터 구입)을 0.15M 보레이트 완충액(pH 8.0) 5mL에 용해시킨다. C22H31N3O11가교결합제 100㎕를 에탄올에 97mM의 농도로 가하고, 샘플을 실온에서 1시간 동안 온화하게 혼합한다. C22H31N3O11대신에 설포-GMBS를 사용하는 경우, H2O중의 9mM 농도의 설포-GMBS 150㎕를 0.15M 보레이트 완충액 5mL(pH 8.0)중의 마우스 IgG 50mg에 30분 동안 37℃에서 가한다. 즉시, 10mM EDTA와 함께 0.15M 보레이트 완충액(pH 7.5) 중에서 G25 세파덱스 컬럼을 사용하는 겔 여과에 의해 과량의 가교결합제를 제거한다. 단백질 피크를 함유하는 분획을 수집하고, 3ml의 용적으로 감소시킨다.
이 때, 말레이미드-활성화된 단백질을 설프하이드릴-함유 단백질과의 접합 반응에 즉시 사용할 수 있다. 자유 SH 그룹을 이용할 수 없는 경우, SATA 시약을 알레르겐에 가할 수 있다. 그렇게 하기 위해, Amba-I 4.8mg(Greer laboratory로부터 구입한 정제된 두드러기쑥)을 보레이트 완충액에 용해시킨다. DMSO중의 65mM SATA 50㎕를 가하고, 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 항온처리한다. 10mM EDTA와 함께 0.15M 보레이트 완충액(pH 7.5)중에서 세파덱스 G25 컬럼상에서 겔 여과에의해 과량의 SATA를 제거한다. SATA로 변형시킨 Amba-I을 함유하는 분획을 수집하고, 6ml로 농축시킨다. 보레이트 완충액, 10mM EDTA중에서 0.5M 하이드록실아민 600㎕를 Amba-I/SATA 6ml에 가하고, 일정하게 혼합하면서 실온에서 2시간 동안 항온처리한다. 0.15M 보레이트 완충액, 10mM EDTA(pH 7.5)중에서 G25 세파덱스 컬럼상에서 과량의 하이드록실아민을 제거한다. SATA 및 하이드록실아민으로 변형시킨 Amba-I을 함유하는 분획을 수집하고, 5ml로 농축시킨다. 마우스 IgG(3ml) 및 변형된 Amba-I(5ml)를 혼합하고, 일정하게 혼합하면서 30분 동안 37℃에서 항온처리한다. 마우스 IgG/Amba-I 접합체를 여과한 다음 0.15M 보레이트 완충액, NaN30.05%(pH 8.0)중에서 세파크릴-S 300HR상에서 크로마토그래피하고, 4℃에서 진공하에 탈기시킨다. 접합체를 함유하는 분획을 모으고, 0.15M NaCl에 대해 투석한 후 4ml(약 4mg/ml)로 농축시킨다.
SATA를 사용한 알레르겐의 활성화를 생략하는 경우, 마우스 IgG/C22H31N3O11를 실온에서 2시간 동안 Amba-I 5mg과 직접 혼합한 다음 일정하게 혼합하면서 30분 동안 37℃에서 항온처리한다. 이어서, 접합체를 여과하고, 상기 기재된 바와 같은 세파크릴-S 300 HR상에서 크로마토그래피한다.
각각의 경우, 8% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 특이 항체(즉, 항-IgG 및 항-두드러기쑥)를 사용한 면역블롯팅에 의해 성공적인 접합이 입증되었다.
실시예 2:
감작화 및 챌린지
1일 및 14일에, Balb/c 마우스에게 수산화알루미늄(Pierce) 2mg과 함께 Amba-I 펩타이드(Greer Laboratories) 20㎍를 복강내 주사한다. 26일, 27일 및 28일에, 밀폐된 플라스틱 박스 속에서 Amba-I 0.2% 용액을 마우스에게 20분간 분무주입한다. 기도 반응은 용량-반응 방식으로 흡입된 메타콜린(Mch)에 반응하는 살아있는 비제한되고 비통기된 마우스에 있어서 전체 플레티스모그래피(WBP)(Buxco, Troy, NY)를 사용하는 기압 플레티스모그래피로 마지막 챌린지후 48시간 경과하여 평가한다. 판독하기 전, 박스를 주요 챔버내로 150㎕ 공기를 신속히 주입하면서 조정한다. 동물을 함유하는 WBP의 주요 챔버와 참조 챔버 사이의 압력차를 측정한다. 주요 챔버의 벽 속에 규정된 내성을 갖는 호흡유량계로 주요 챔버 내부와 외부의 유량(박스유량, 모의유량)을 측정한다. 측정된 박스 유량은 정상 동물에 있어서 동물의 유량과 상호관련되고, 비-기관지 수축된 조건에 있어서 박스 압력 시그날로부터 호흡 용적 및 유량 크기(모의용적, 모의유량)을 측정하게 한다. 최초 밀폐된 펜(Fenn) 박스와는 대조적으로, WBP는 벽 속의 호흡유량을 이용한다. 따라서, 박스 압력 시그날은 호흡에 기인하는 박스 용적 변화보다는 오히려 호흡에 기인하는 박스 유량 변화를 반영하지만, 여전히 펜 방정식을 이용한 호흡 용적을 측정하게 한다.
흡식 및 호식은 박스 압력 곡선이 영점을 가로지르므로 출발-흡식 및 최종-흡식을 확립함으로써 기록한다. 흡식의 출발은 2개의 고도로부터 그려진 직선으로부터 상승하는 흡식 박스 유량을 추정함으로써 측정된다. 지표 실험에 있어서,비-기관지 수축된 자각 마우스를 라텍스 칼라로 밀폐된 헤드-아웃 신체 플레티스모그래프 속에 위치시킨 다음 유동 WBP내로 위치시킨다. 흉부 유량 시그날을 WBP 유량 시그날과 비교한 결과, WBP 시그날의 출발-흡식의 약간(<10ms)의 지연 및 최종 흡식의 합동과 거의 동일한 파장 형태를 나타냈다(개인적 통신, M. Lomask, Buxco). 흡식 시간(Ti)은 출발 흡식으로부터 최종 흡식까지의 시간으로서 정의되며, 호식 시간(TE)은 최종 흡식으로부터 다음의 출발 흡식까지의 시간으로서 정의된다. 한번의 호흡중에 네가티브 또는 포지티브 방향으로 발생하는 최대 박스 유량은 각각 피크 흡식 유량(PIF) 또는 피크 호식 유량(PEF)로서 정의된다. 10번의 호흡마다의 기록은 분당 호흡율을 정의하기 위해 추정된다. 이완 시간(Tr)은 36%까지 모의-호식 용적(호식에 있어서 박스 유량 파형 아래의 면적)의 용적 감소 시간으로서 정의된다. 따라서, 이것은 수동적 호식에 있어서 피크 용적의 36%까지 용적 시그날 감소의 시간 상수(RC)에 대한 대비로서 사용된다. 기관지수축 동안, 주요한 변화는 초기 호식 동안 발생하며, 박스 압력 시그날의 파형 변화를 유도한다. 파형의 이러한 변화는 초기 호식(MF1) 동안의 평균 호식 박스 유량을 후기 호식(MF2)의 평균 호식 박스 유량과 휴지에 의해 다음과 같이 비교하는 것을 정량화할 수 있다:
MF1 = 평균 모의유량 1
MF2 = 평균 모의유량 2
V=모의-호식 용적
MF1 = 0.65V/Tr
MF2 = 0.35V/Te-Tr
휴지 = Te-Tr/Tr-0.35V/0.65V × MF1/MF2 - MF1/MF2
기관지수축 동안, 박스 유량 호식(PEF)의 변화가 흡식(PIF) 보다 더욱 현저하다. 이것은 향상된 휴지(Penh), 즉 기도 작용을 수학적으로 모니터하기 위해 본원에서 사용된 크기가 없는 값에 대한 수학식으로 반영된다:
Penh = 휴지 × PEF/PIF
Penh는 흡식 및 호식(PIF, PEF) 모두로부터의 박스 유량 파형이 변화하며, 이를 초기 및 후기 호식 박스 유량(휴지)과의 비교 값과 조합한다. Penh는 절대 박스 유량 크기 또는 호흡율의 작용이 아니라, 오히려 호식 유량에 대한 흡식 유량의 비율 및 호식 시간의 작용이다. 마우스를 주요 챔버에 위치시키고, 기준선 판독을 수행하여 3분 동안을 평균한다. 농도 증가(3 내지 50mg/ml)에 있어서 분무된 PBS 또는 메타콜린은 3분 동안 주요 챔버의 입구를 통해 연무하고, 판독을 수행하고 각각의 연무후 3분 동안을 평균한다. 기도 활성은 PBS 챌린지(PenhPBS) 후 Penh 값과 비교하여 MCh(PenhMCh)의 각 농도에 대한 증가 배율로서 표시한다. 메타콜린에 대한 용량-반응의 정량화를 위해, 각각의 마우스에 대해 log 2에 대한 Penh의 선형 회귀를 계산한다. 각각 Penh의 100% 또는 200% 증가에 상응하는 log 용량을 측정하고, 상이한 그룹의 평균 log 용량을 편차 분석으로 비교한다. 이 데이타는 95% 신뢰 구간의 상한 및 하한을 갖는 기하 평균으로 기록한다.
접합체를 500㎍의 용량으로 1일, 7일 및 14일에 정맥내 투여한다. 마지막 챌린지 후 48시간 경과하여 혈청을 수득하고(기도 작용의 평가후), 전체 IgE 및 항원 특이적 IgE, IgG1, IgG2를 ELISA로 평가한다. 기도 작용을 측정한 후에 기관지폐포 세정액(BALF)를 수집하고, 호산구 수 뿐만 아니라 전체 임파구 수를 측정한다. 전형적인 실험 프로토콜의 요약은 도 1에 제시되어 있다. 각각의 그룹은 5 내지 6마리의 동물로 구성되어 있다.
실시예 3
기관지폐포 세정(BAL), 폐 세포 분리
기관 튜브를 통해 폐를 행크 평형된 염 용액(HBSS, 3×0.5ml)로 세정하고, 세정액 속의 세포를 계수한다. BAL 또는 폐로부터의 세포를 HBSS에 재현탁시키고, 혈구계로 계수한다. 사이토스핀 슬라이드를 류코스타트(Leukostat)(Fisher Diagnostics)로 염색하고, 광학 현미경으로 300개 이상의 세포를 계수함으로써 맹검 방식으로 감별한다.
실시예 4
항-OVA 항체 및 전체 Ig 수준의 측정
항-Amba-1 Ig 혈청 수준은 ELISA로 측정한다. 샘플의 항체 역가를 실험에서 생성된 수집된 표준물과 관련시키고, ELISA 단위/ml(EU/ml)로서 표시한다. 전체 IgE 및 IgG 수준은 공지된 마우스 IgE 또는 IgG 표준물(PharMingen, San Diego,CA)과 비교된 동일한 방법을 사용하여 측정한다. 검출 한계는 IgE의 경우 100pg/ml이고 IgG의 경우 1ng/ml이다.
실시예 5
C 22 H 31 N 3 O 11 접합체와 설포-GMBS 접합체의 비교
도 2의 프로파일 1과 프로파일 2는 각각 C22H31N3O11접합체(접합체 1) 및 설포-GMBS 접합체(접합체 2)의 크로마토그래피로 수득한 용출 프로파일을 나타낸다. 두 경우에 있어서, 접합체를 항-IgG 또는 항-두드러기쑥과 반응시키는데, 이는 면역블롯팅상에서 관찰되는 바와 같이 마우스 IgG에 대한 Amba-I의 공유 결합을 입증한다.
접합체(1)과 접합체(2)의 투여는 기도 작용에 대한 영향이 현저히 상이하다. 접합체(1)는 기도 작용을 현저히 감소시키는 반면, 접합체(2)는 감작화된 동물(포지티브 대조군)과 비교하는 경우 거의 효과가 없었다(도 3 참조). 마찬가지로, 접합체(1)는 BALF 속의 호산구를 실질적으로 제거하였다. 이는 특이적 항 Amba-I IgE의 전체적인 억제를 수반한다(도 4). 예상한 바와 같이, 전체 IgE는 전체 임파구 수 뿐만 아니라 치료에 영향을 미치지 않았다. 특이적 IgG1과 IgG2가 관여하는 경우에는 차이가 있었다. 접합체(1) 또는 접합체(2)의 투여는 IgG1 항-Amba-I 항체를 증가시킨다. 대조적으로, 접합체(1)는 접합체(2)와 비교하여 항 IgG2 항체를 감소시킬 것이다(도 5).
접합체를 투여한 후 IgG2의 감소와는 대조적으로 IgG1 특이적 동종형의 증가는 흥미로운 것이다. 이는 다음과 같은 몇몇 요인에 기인할 수 있다: (a) 접합체의 용량, 동물의 종류, 관용원을 투여한 후 각종 면역 반응의 감수성 차이. 이를 암시하는 현상은 "면역 편향" 또는 "분할 관용"[참조: Borel et al., J. Exp. Med 131(1970), 603]으로서 언급된다; (b) 세포 및 체액성 면역성 모두에 대해 제시된 바와 같은 모든 면역 반응의 억제 여부[참조: Borel et al., Parenteral and oral administration of Tolerogens i.e. Protein IgG conjugates, Proc. N.Y. Acad. of Sci. 778(1996), 80-87]; 또는 IgG1 특이적 "차단" 항체의 형성이 측정될 알레르기성 반응을 하향조절하는데 요구되는지의 여부.
실시예 6
접합체의 효과에 대한 가교결합에 사용된 Amba-I의 양의 영향
도 6의 결과는 기도 과민증의 감소 또는 정상화와 관련하여 Amba-I 5mg이 효과적임을 보여준다(접합체 3). 대조적으로, 2.5mg은 효과적이지 않았다(접합체 4). 흥미롭게도, 동일한 용량의 Amba-I(5mg)의 경우, SATA가 가교결합전에 사용된 것과 사용되지 않은 것에는 실질적으로 차이가 없었다(도 6).
실시예 7
이전에 감작화된 알레르기성 동물에 대한 접합체의 효과
접합체가 순수한 동물 뿐만 아니라 이전에 감작화된 알레르기성 동물에서 효과적인지를 측정한다. 수행된 프로토콜은 도 7에 제시되어 있다. 접합체(6)과 접합체(7)을 사용한 결과는 이들 접합체가 감작화된 마우스를 하향 조절한다는 것을 명백히 증명한다.
실시예 8
접합체 합성에 사용된 면역글로블린 형태의 효과
캐리어 분자로서 2개의 상이한 동종형 γ1과 γ2a를 갖는 모노클로날 항체를 폴리클로날 IgG와 비교하여 시험한다. 이 결과는, 폴리클로날 IgG(접합체 8)이 부분적인 억제를 나타내는 반면 γ1(접합체 9)는 효과가 없음을 입증한다. 대조적으로, γ2a(접합체 10)는 아토피성 천식에서 기도 반응성을 하향조절한다.
염증과 알레르기 반응의 면역학적 반응을 하향조절하는데 적합한 본 발명에 따르는 접합체는 기도 과민증을 현저히 감소시키고, 기관지폐포 세정액(BALF)에서 호산구를 실질적으로 제거한다.

Claims (20)

  1. 제1 폴리펩타이드를 폴리에틸렌 옥사이드 스페이서를 통해 결합된 N-하이드록실석신이미드 에스테르 그룹과 말레이미드 그룹을 포함하는 헤테로이작용성 가교결합제의 존재하에 항온처리하는 단계(a),
    과량의 헤테로이작용성 가교결합제를 제거하는 단계(b),
    단계(b)의 반응 생성물을 하나 이상의 설프하이드릴 그룹을 포함하는 제2 폴리펩타이드와 함께 항온처리하는 단계(c)를 포함하는, 제1 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드를 포함하는 접합체의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 제2 폴리펩타이드의 하나 이상의 설프하이드릴 그룹이
    제2 폴리펩타이드를 N-석신이미딜-S-아세틸티오아세테이트(SATA)의 존재하에 항온처리하는 단계(v),
    과량의 SATA를 제거하는 단계(vi),
    단계(vi)의 반응 생성물을 하이드록실아민의 존재하에 항온처리하는 단계(vii) 및
    과량의 하이드록실아민과 아세틸화된 하이드록실아민를 제거하는 단계(viii)에 의해 도입되는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 폴리에틸렌 옥사이드 스페이서를 통해 결합된N-하이드록실석신이미드 에스테르 그룹과 말레이미드 그룹을 포함하는 헤테로이작용성 가교결합제가 하기 화학식을 갖는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계(a)에서 헤테로이작용성 가교결합제가 제1 폴리펩타이드보다 5배 내지 50배 높은 몰 농도로 사용되는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계(a)와 단계(c)가 20℃ 내지 37℃의 온도 범위에서 수행되는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계(a)와 단계(c)가 30분 내지 120분의 시간 범위 내에서 수행되는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계(a)와 단계(c)가 7.0 내지 9.0의 pH 범위에서 수행되는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드의 몰 비가 1:1 내지 1:10인 방법.
  9. 제4항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계(a)와 단계(c)가 0.15M 보레이트(pH 8.0)를 포함하는 완충액 속에서 37℃에서 30분 동안 수행되고, 헤테로이작용성 가교결합제가 제1 폴리펩타이드보다 30배 높은 몰 농도로 사용되며, 제1 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드의 몰 비가 1:10인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 응집된 접합체를 제거하고 접합체를 단량체 형태로 제공하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1 폴리펩타이드가 면역글로블린 또는 구조적으로 동등한 이의 단편인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 면역글로블린 또는 구조적으로 동등한 이의 단편이 면역글로블린 G 또는 구조적으로 동등한 이의 단편인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 제2 폴리펩타이드가 알레르겐(allergen), 자가항원 또는 면역학적으로 동등한 이들의 단편인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 알레르겐이 두드러기쑥(ragweed), 자작나무 화분, 낙화생, 가정의 먼지 진드기, 동물의 비듬 또는 곰팡이로부터 기원하거나, 트로포미오신 또는 면역학적으로 동등한 이의 단편인 방법.
  15. 제13항에 있어서, 자가항원이 아세틸콜린 수용체, 인슐린, 인슐린 수용체, 수초 염기성 단백질 또는 면역학적으로 동등한 이들 단백질의 단편인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 따르는 방법으로 수득할 수 있는 접합체.
  17. 제16항의 접합체와 약제학적으로 허용되는 임의의 담체 및/또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물.
  18. 알레르기성 질환 또는 자가면역 질환의 예방 및/또는 치료용 약제학적 조성물을 제조하기 위한, 제16항에 따르는 접합체의 용도.
  19. 제18항에 있어서, 알레르기성 질환이 두드러기쑥, 자작나무 화분, 낙화생, 가정의 먼지 진드기, 동물의 비듬 또는 곰팡이로부터 기원한 알레르겐, 또는 트로포미오신 또는 면역학적으로 동등한 이의 단편인 알레르겐에 대한 알레르기성 반응인 용도.
  20. 제18항에 있어서, 자가면역 질환이 중증 근무력증, I형 당뇨병 또는 다발성 경화증인 용도.
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