KR20010076920A - 두릅을 용매로 추출한 백내장에 유효한 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 두릅 추출물 및 이를 유효 성분으로 하는 치료제에 관한 것으로, 본 발명의 조성물 및 치료제는 백내장의 예방, 진행의 지연 및 치료의 효과가 있다. 본 발명에 따라, 두릅의 수(水)추출물을 4가지 용매-클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 그리고 물로 추출한다. 이 추출물에 마이오-이노시톨 또는 타우린을 추가하면 백내장 치료의 상승 효과를 얻을 수 있다. 또한, 두릅 추출물을 유효 성분으로 포함하는 음료, 생약제제, 건강보조식품은 경구 투여에 의해 당에 기인하는 백내장의 예방, 지연, 치료 및 회복의 효과를 얻을 수 있다.

Description

두릅을 용매로 추출한 백내장에 유효한 조성물{COMPOSITION COMPRISING ARALIA EXTRACTS FOR CATARACT}

본 발명은 두릅을 용매로 추출한 백내장 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 두릅을 에틸아세테이트, 클로포포름, 부탄올 또는 물로 추출하여 알도즈 환원 경로 및 산화 스트레스를 억제함으로써 백내장을 치료하는 조성물에 관한 것이다.

우리 나라의 당뇨병은 1991년 통계청의 사망원인 특별 조사 보고서에 의하면 전체 사망원인 중 2.8로 6위를 차지하고 있으며(통계청, 1992), 당뇨병에 의한 사망원인은 고혈당으로 인한 합병증 때문으로 고혈당이 나타나고 15-20년이 지나면 체내 여러 기관이 손상을 받아 당뇨병성 백내장, 신장병, 말초신경 장애, 고지혈증등의 만성 당뇨 합병증이 나타난다(Vlassara H. (1990), Chronic diabetic complications and tissue glycosylation.Diabetes Care13(11):1180-1185). 당뇨병 환자들은 정상인에 비해 실명의 위험이 25배, 신부전증이 20배, 관상 동맥성 심장질환의 위험이 2-6배 높은 것으로 나타난다.

한편, 백내장으로 인한 실명은 전체 실명의 약 35를 차지하여(Chylack L.T. (1984), Mechanism of senile cataract formation.Ophthalmol.91;596-602.), 실명의 중요한 원인이 되고 있다. 백내장은 사람이 60대에 이르면 50, 70대에서는 60그리고 80대에 이르면 70이상의 노인에게서 발견되며 당뇨 시엔 40내지 50대에 일찍 백내장이 생기고 빨리 악화되어 시력이 급속히 떨어진다. 특히 인슐린 의존성 당뇨인 경우엔 백내장이 20내지 30대에도 나타난다. 백내장은 수정체의 혼탁으로 빛이 망막에 이르는 것이 차단되어 시각장애가 일어나는 질병으로 인공 수정체를 삽입하는 수술로써 치료가 가능하나 당뇨병이 있으면 수술후 염증의 발생이 잘 되고 상처 치유 기간이 늦으며 출혈이 되는 경향이 있다. 특히 인슐린 의존성 당뇨로 인한 백내장의 경우 수술 후 좋아진 시력이 다시 나빠지는 후발 백내장이 생기는 경우가 많다.

당뇨 합병증 치료제로 개발된 알도즈 환원효소 저해제(aldose reductase inhibitors)는 부작용으로 현재 사용되고 있지 않으나 이것의 부작용을 극복하고 좀더 약효가 뛰어난 약물을 개발하기 위한 시도로써 최근에는 알도즈 환원효소 저해제의 구조와 활성간의 관계를 규명해 좀더 활성이 높고 지속적으로 작용 할 수 있는 구조의 특징을 알아내어 그런 구조의 알도즈 환원효소의 저해제를 합성해 내려는 연구가 활발히 진행돠고 있다(Potier N., Barth P., Tritsch D., Biellmann J-F. and Van Dorsselaer A. (1997), Study of non-covalent enzyme inhibitor complexes of aldose reductase by electrospray mass spectrometry,Eur. J. Biochem.243:274-282.).

국내에서는 황금 (Scutellaldose reductaseia baicalensis)의 뿌리에서 추출한 플라보노이드 성분 등을 이용해서 알도즈 환원효소를 효과적으로 저해하려는 연구가 시도되고 있으며, 현재 백내장 약물로서 사용되고 있는 것들은 여러 항 산화 물질들, 즉 비타민 C, 비타민 E, 글루타치온(glutathione)을 포함해 카탈린(catalin), 바이네이팅(baineiting), 카타크롬-OFTAN(catachrome-OFTAN), 비타-요두롤(Vita-iodurol), 퀴낙스(quinax) 등이 알려져 있다.(Chasovnikova L.V., Formazyuk V.E., Sergienko V.I., Boldrev A.A., and Severin S.E. (1990), The antioxidative properties of carnosine and other drugs.Biochem. International20(6):1097-1103).

현재 우리 나라에서는 백내장 치료제로서 일본에서 개발된 카탈린(catalin)이 많이 사용되고 있으나, 이런 약물에 의한 치료는 변성된 수정체 단백을 원래의 투명한 상태로 만드는 것이 불가능해 확실한 가치는 인정받고 있지 못하고 있는 실정이다. 그러므로, 백내장의 치료는 현재 실질적으로 수술에 의존하는 실정에 있다.

한국 특허공보 10-195886 호는 동충하초, 우황, 황백 등을 포함하는 17종의 생약성분으로 당뇨병 환자의 혈당을 강하시키고 혈중 지질 농도를 저하시켜 당뇨병의 예방, 합병증의 예방 및 치료 효과를 도모하고 있으나. 이 발명은 기존에 알려진 생약 성분을 조합한 것으로 새로운 당뇨병 치료의 화합물이나 추출물을 제시하는 것은 아니다.

따라서, 본 발명의 목적은, 당에 기인하는 백내장의 예방, 지연 및 치료의 효과가 있는 두릅 추출물을 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 추출물에 다른 유효 성분을 포함하는 혼합 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 추출물을 포함하는 건강보조식품을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 추출물을 포함하는 생약제제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 추출물을 포함하는 단위투여형으로 제형화된 백내장 예방 및 치료제를 제공하는 것이다.

도 1은 폴리올 경로를 표시한 모식도,

도 2는 본 발명에 따라 두릅으로부터 분획물을 분리하는 단계를 나타낸 모식도,

도 3은 20 mM 자일로즈에 의해 유도된 수정체의 혼탁을 등급으로 구분한 사진,

도 4는 20 mM 자일로즈 배지에서 72시간 배양한 수정체의 혼탁 밀도를 표시한 그래프,

도 5는 ABEI-마이크로페록시다제를 사용한 CL 분석에 의한 항산화 활성을 표시한 그래프,

도 6은 20 mM 자일로즈로 유도된 백내장에 대해 각각의 추출물로 처리하였을때 혼탁의 밀도를 나타낸 그래프,

도 7은 ABEI-마이크로페록시다제를 사용한 CL 분석에 의한 각각의 추출물의 항산화 활성을 표시한 그래프,

도 8은 각각의 분획물로 처리된 백내장 수정체의 혼탁의 밀도를 나타낸 그래프,

도 9는 AC 분획물의 백내장 발생의 지연 효과를 표시한 그래프,

도 10은 AC 분획물의 백내장 발생의 예방 효과를 표시한 그래프,

도 11은 AC 분획물의 백내장 회복의 효과를 표시한 그래프,

도 12는 자일로즈 처리 배지에 수정체를 48시간 배양한 후 자일리톨에 대한 두릅 추출물의 클로로포름 분획의 영향을 도시한 그래프,

도 13은 자일로즈 처리 배지에 수정체를 48시간 배양한 후 알도즈 환원효소 활성에 대한 두릅 추출물의 클로로포름 분획의 영향을 도시한 그래프,

도 14는 TBARS 형성에 대한 AC 분획물의 영향을 표시한 그래프,

도 15은 콘쥬게이트 다이엔 형성에 대한 AC 분획물의 영향을 표시한 그래프,

도 16는 글루타치온 함량에 대한 AC 분획물의 영향을 표시한 그래프,

도 17는 AC 분획물과 마이오-이노시톨을 첨가한 백내장에 대한 영향을 표시한 그래프,

도 18은 AC 분획물과 타우린을 첨가한 백내장에 대한 영향을 표시한 그래프,

도 19 및 도 20은 AC 분획물과, 마이오-이노시톨 및 타우린을 첨가한 백내장의 회복에 대한 영향을 표시한 그래프,

도 21는 AC 분획물에 마이오-이노시톨과 타우린을 각각 2.5 mM씩 보충하여 전배양함으로써 백내장의 예방 효과를 측정한 그래프.

이와 같은 본 발명의 목적은 두릅을 용매로 추출한 추출물에 의해 달성될 수 있다.

눈은 크게 안구(eyeball)와 안부속기(accessary organ)로 나뉜다. 안구는 가장 바깥쪽부터 공막, 중막, 망막의 3가지 막과 안 내용물인 수정체, 초자체(vitreous body), 방수(aqueous humor)로 이루어져 있다. 눈의 수정체는 신체에서 유일하게 투명한 기관으로 대략 35단백질과 63의 물로 이루어져있으며 다른 조직과 달리 혈관이 없고 단백질 대사율이 매우 느려 한번 일어난 단백질의 손상은 회복되기가 힘들며 노화에 의해서도 나타난다. 수정체의 영양 공급은 방수로부터 공급받고 방수는 혈관에 연결되어 있어 수정체는 혈액으로부터 간접적인 영향을 받는다.

당 백내장(sugar cataract)은 당뇨병성 백내장을 일으키는 기작인 폴리올 경로(polyol pathway)와 산화적 스트레스의 증가가 관여하고 있는 것으로 알려져 있어 당뇨병성 백내장의 실험 모델로 많이 이용되어지고 있다(Kubo E., Miyoshi N., Fukuda M. and Akagi Y. (1999), Cataract formation through the polyol pathway is associated with free radical production.Exp. Eye Res.68;457-464). 또한, 당 백내장은 당(glucose, galactose, xylose)에 의해 생성되는 백내장으로, 갈락토즈 백내장은 생체내(in vivo) 실험에서 총 식이의 30-50를 갈락토즈로 섭취시켜 유도하면 4주 정도부터 혼탁이 보인다. 자이로즈 백내장은 총 식이의 20-35를 자일로즈로 섭취시켜 유도하는데 갈락토즈 백내장과는 생체내(in vivo)에서 백내장이 저절로 회복되는 경우가 있다.

당 백내장이 일어나는 기전으로 가장 잘 알려진 것이 폴리올 경로(polyol pathway)의 증가와 산화 스트레스(oxidative stress)의 증가이다(Beyer T.A. and Hutson N.J. (1986), Introduction: Evidence for the role of the polyol pathway in the pathophysiology of diabetic complications,Metabolism35(4):1-3).

수정체에서 폴리올 경로는 당뇨 쥐의 수정체에서 과다한 소르비톨을 발견한 이래 백내장을 일으키는 삼투압의 변화를 이해하는 열쇠로 잘 알려져 왔다(Chylack L.T. and Kinoshita J.H. (1969), A biochemical evaluation of a cataract induced in a high-glucose medium.Invest. Ophthalmol.8:401-406). 당뇨인 경우 혈당의 증가에 이어 곧 방수의 포도당 농도가 혈당의 90수준까지 빠르게 증가한다. 방수의 포도당은 수정체로 용이 수송(facilitated transportation)에 의해 확산에 의해 유입돨 수 있는 속도보다 더욱 빠르게 흡수된다. 이때 인슐린은 필요치 않은 것으로 알려져 있다. 수정체 안으로 들어온 포도당은 헥소키나제(hexokinase(HK))나 알도즈 환원효소(aldose reductase)에 의해 대사된다. 폴리올 경로는 도 1에서 보는 바와 같이, 2가지 효소로 이루어져 있으며 이중 속도 제한 효소는 알도즈 환원효소(aldose reductase)이다. 이 효소는 당 알데히드(glucose, galactose)를 대응하는 알코올(sorbitol, galacitol)로 전환시키며 이는 Km(Michaelis-Menten Constant)이 낮은 알데히드 환원효소(low Kmaldehyde reductase) 및 글리세롤 탈수소 효소(glycerol dehydrogenase)와 동일한 것으로 알려져 있다.

이러한 폴리올 경로는 정상적인 생리 하에서는 활성화되어 있지 않으나 당뇨병에서는 알도즈 환원효소의 활성도는 증가되고 소르비톨 탈수소효소의 활성도는 저하되어 폴리올(소르비톨)을 생성하는 경로가 활성화되어 있다. 이것은 알도즈 환원효소의 Km이 포도당에 대해 70-150 mM로 커서 고혈당시엔 폴리올 경로가 더 우세하기 때문이다(Raskin and Rosenstock, 1987). 백서 수정체의 경우 포도당에 대한 HK의 Km이 0.01-0.03 mM인 반면 알도즈 환원효소의 Km은 100 mM이다. 이러한 효소활성도의 변화는 세포내의 포도당 농도의 증가와 함께 소르비톨의 축적을 유도하는 기작이 된다.

더욱이 알도즈 환원효소는 다양한 기질과 반응하여 다른 당 알코올이나 알데히드들을 환원시키는 한편, 폴리올 탈수소효소는 폴리올과 특징적으로 반응하므로, 더 이상 대사되지 않는 폴리올들의 세포내 축적을 일으키게 된다. 폴리올은 극성의 성질을 갖고 있어 세포막을 빠져나가지 못해 세포내에 축적되어 삼투압적 손상(osmotic damage)이 일어난다. 삼투압의 증가로 세포 내 액이 증가하여 수정체가 팽창하게 되고 수정체 막의 투과성이 증가된다. 이 결과 세포내 K+, 아미노산, 글루타치온, 마이오-이노시톨(myo-inositol), ATP의 농도와 Na+-K+-ATPase 활성은 감소하고 Na,와 Cl은 증가하며 더불어 수정체의 섬유조직이 계속적으로 팽창하고 파열되어 액포(visible vacuole)를 형성하게 된다. 액포 형성이 증가되면 수정체의 혼탁이 일어나 백내장이 되고 Na과 Cl 증가로 삼투압적 스트레스가 가중되어 수정체 팽창이 악화된다. 또한 증가된 폴리올 경로로 인한 NADP+/NADPH와 NAD+/NADH의 레독스 상태(redox state)의 변화는 포도당 대사에 영향을 주고 글루타치온이나 단백질의 설프하이드릴(sulfhydryl)기의 산화를 촉진시킨다. 폴리올 경로의 증가, 즉 소르비톨의 축적은 신경, 망막, 신장, 수정체 등 당뇨 합병증이 잘 일어나는 조직에서 관찰되었고 당뇨병성 백내장, 말초신경 장애, 망막증, 신질환을 발생시킨다고 알려져 있다.

한편, 당 백내장의 진행에도 산화적 스트레스(oxidative stress)가 관여되는 것으로 밝혀졌다. 즉, 폴리올 경로가 증가되면 그것에 상응해서 NADPH의 소모가 증가해 산화된 글루타치온(GSSG)이 환원형(GSH)이 되기 위해 필요한 NADPH가 상대적으로 부족하게 되어 H₂O2를 H₂O로 환원시키는 GSH 부족으로 하이드록실 라디칼 형성이 증가되는 것이며, 따라서 백내장이 형성되는 과정은 삼투압과 산화적 스트레스가 복합된 과정이다.

이와 같이 당뇨병으로 기인하는 백내장을 예방, 경감 또는 치료하기 위하여 폴리올 경로에서 폴리올(소르비톨)의 생성을 억제하는 알도즈 환원효소 저해제가 효과를 나타낼 수 있으며, 퀘르세틴(quercetin), 퀘르시트린(quercitrin), 소르비닐(sorbinil), AL1576, TMG, 스타틸(statil), 톨레스타트(tolrestat), 마포르핀류(aporphine type), 벤질아이소퀴놀린류(benzylisoquinoline type), 베르베린류(berberine type) 등이 알려져 있다. 그러나, 이들 화합물 중에는 상당수의 물질이 발암성이 있는 것으로 의심되고 있고, 오심과 같은 부작용을 일으키며 간과같이 인체의 장기에 부작용이 있는 것도 보고되고 있다.

본 발명자들은 이와 같은 당 백내장의 발병 및 진행의 메카니즘에 기초해서, 두릅나무의 추출물이 폴리올 경로에서 알도즈 환원효소의 저해제로서 기능이 우수하고 산화적 스트레스를 경감시켜 당뇨병으로 인한 당 백내장의 예방 및 치료 효과를 나타낼 수 있다는 것을 발견하여 본 발명에 도달하였다.

두릅나무는 아라리아 속(Araliasp.)에 속하는 식물로 동아시아에서 자생하는 다년생 초본이다. 두릅의 껍질에는 사포닌을 포함한 여러 종류의 트리테르페노이드(triterpenoids)가 있고, 수피에는 혈당강하 효과가 있는 엘라토시드(elatoside) E를 포함해 엘라토시드 F와 올레놀산 글리코시드 등 몇 가지의 글리코시드가 함유되어 있으며 에탄올 흡수를 저해하는 엘라토시드 A와 B 도 포함되어 있다(Yoshikawa M., Harada E., Matsuda H., Murakami T., Yamahara J. and Murakami N. (1993), Elatosides A and B, potent inhibitors of ethanol absorption in rats from the bark of Aralia elata See,: the structure-activity relationships of oleanolic acid oligoglycosides.Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) 41:2069-2071). 사포닌의 일종인 올레아놀산는 여러 화학물질에 의한 급성 간손상을 막아주는 역할을 한다.

본 발명에서는 두릅을 용매로 추출해서 그 추출물을 쥐에서 적출된 수정체 배양 배지에 처리한 결과, 혼탁도가 감소하였다. 또한, 두릅에서 추출물을 얻기 위해 여러 용매를 사용할 수 있으며, 에틸아세테이트, 클로포포름, 부탄올 또는 물 등을 사용할 수 있다. 이들 중에서 클로로포름 추출물이 가장 좋은 효과를 나타낸다.

본 발명의 두릅 추출물은 단독으로 사용할 수도 있고, 황백(Phellodendronsp.)의 추출물과 혼합하여 사용하여도 좋다. 당 백내장의 치료 효과를 강화하기 위하여 백내장 형성시 수정체내 함량이 감소하는 마이오-이노시톨 또는 타우린을 보충할 수 있도록 이들 화합물을 각각 또는 동시에 추가한 혼합물로 사용하는 것이 특히 바람직하다.

본 발명은 두릅 추출물을 유효성분으로 하여 물과 감미료 및 적당한 첨가제를 포함하는 음료를 제공한다. 이 음료에는 마이오-이노시톨 또는 타우린이 추가될 수 있으며, 이들 두 성분이 함께 혼합되어도 좋다. 두릅은 예로부터 자체로서 식용되어온 식품으로서 이를 추출한 추출물은 독성이 없으므로, 적당한 감미료와 방부제 등을 함유하여 음료로 제공됨으로써 백내장, 당뇨병 또는 내당 불능증 환자가 이 음료를 수시로 음용하여 유익한 효과를 얻을 수 있다.

본 발명은 두릅 추출물을 유효성분으로 한 생약 제제 나 건강보조식품, 음료를 제공한다. 두릅추출물을 생약제제나 건강보조식품 등으로 사용할 때의 투여는 치료상 유효량을 단독으로 또는 약리학적으로 수용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 함유한 형태로 피하내, 경구, 근육내 투여, 안약 또는 당업계에 알려져 있는 기타 다른 적절한 방법을 포함하는 다양한 방법으로 투여된다. 본 발명의 추출물에 적합한 경구투여용 제제에는 정제, 캅셀제, 용액제, 현탁제, 시럽제, 또는 음료의 형태가 있다. 경구외 투여를 위한 두릅 추출물을 포함하는 제제는 멸균되고 주사가능한 액체 또는 유질 서스펜션과 같은 멸균 주사제 형태가 될 수 있다. 상기 서스펜션은 적당한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제(suspending agent)를 사용하여 본 발명이 속한 기술 분야에서 잘 알려져 있는 방법에 따라 제조된다. 상기 멸균 주사제는 또한 1,3-부탄디올과 같이 경구외로 받아들일 수 있는 희석제 또는 용매를 포함한 멸균 주사액 또는 서스펜션이 될 수 있다. 적당한 희석제는 예를 들어, 물, 링거용액, 및 등장 식염수를 포함한다. 추가로 멸균된 고정유(fixed oils)가 용이하게 용매 또는 현탁 매질로써 사용될 수 있다. 상기 목적을 위해 합성 모노- 또는 디-글리세라이드를 포함하는 어떠한 무자극 고정유도 사용될 수 있다. 추가로 올레인산과 같은 지방산이 마찬가지로 주사제 제제에 사용될 수 있다.

본 발명의 두릅 추출물은 물과 감미료 및 적당한 첨가제를 포함하는 음료로 사용할 수 있다. 이 음료에는 마이오-이노시톨 또는 타우린이 추가될 수 있으며, 이들 두 성분이 함께 혼합되어도 좋다. 두릅은 예로부터 자체로서 식용되어온 식품으로서 이를 추출한 추출물은 독성이 없으므로, 적당한 감미료와 방부제 등을 함유하여 음료로 제공됨으로써 당에 의한 백내장 환자가 수시로 음용하여 백내장의 치료에 도움이 될 수 있는 것이다.

본 발명에 따르는 두릅 추출물을 생약제제로 사용할 때 투여용량은 질환의 중증도, 투여대상 환자의 성별, 연령, 체중, 및 목적하는 효과가 어떤 것인지에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로는 성인에게 경구 투여하는 경우, 체중 1 kg당 1 일 20-70 mg, 바람직하게는 30-50 mg의 용량을 투여할 수 있고, 경구 외로 주사제로 투여하는 경우는 체중 60 kg인 사람을 기준으로 10-50 mg의 용량을 투여할 수 있다.

이하에서 실시예에 의거하여 본 발명을 상세히 설명하지만, 본 발명의 범위가 이들 실시예로 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 실험동물에서 당 백내장의 유도

1-1. 수정체 조직 배양(lens organ culture)

중량이 180-200g인 수컷 생쥐(SD-rats)를 CO₂gas로 희생시킨 후 바로 안구를 적출해 요오드 용액에 넣어 잠시 소독 후 안구에서 수정체를 posterior approach법(Spector A. and Garner W.H. (1981), Hydrogen peroxide and human cataract.Exp. Eye Res.33(6): 673-681)을 이용해 실체 현미경 하에서 적출해 내었다. 이때 수정체에 금속이 직접 닿지 않도록 하였다. 적출된 수정체는 M199 배지(Sigma, USA)에 넣고 CO₂5, 공기95, 37℃로 유지되는 세포 배양기에서 배양하였다. M199 배지에는 gentamycin(Gibco, USA)을 5 mg/l 농도로, fungizone (Gibco, USA)을 0.5 ug/ml 농도로 넣었다.

모든 수정체는 처음 24시간 동안에는 처리를 하지 않고 M199 컨트롤(control) 배지에서 배양해 손상된 수정체를 제거한 후 실험하였다.

1-2. 수정체의 손상 측정

수정체 손상 시 밖으로 빠져 나오는 단백질의 양과 현미경 관찰로 손상 여부를 판단하였다. 투미니아 등의 방법(Tumminia S.J., Qin C., Zigler J.S. andRussel P. (1994), The integrity of mammalian lenses in organ culture.Exp. Eye Res.58:367-374.)에 따라 조직 배양 1시간만에 배지의 단백질 양이 7 ug/ml이상인 수정체는 버렸고 나머지 수정체 중에서도 배양 24시간까지 현미경 관찰로 손상이 발견되지 않은 수정체만 실험에 사용하였다.

1-3. 백내장 유도

당뇨병성 백내장의 실험 모델로 사용되어지는 당 백내장은 당뇨와 거의 같은 기전(polyol pathway, 산화 스트레스)에 의해 유발되어 많이 이용되고 있는 백내장 모델이다. 본 실험에서는 여러 당의 종류 중에서 d(+)-xylose 20 mM을 사용하였다.

실시예 2: 백내장의 분류

2-1. 수정체의 혼탁도 관찰

형광등이 장착된 실체 현미경(Olympus, Japan) 에서 dark field photography technique(Chand D., EL-Aguizy H., Richards R.D. and Varma S.D.(1982), Sugar cataracts in vitro : Implication of oxidative stress and aldose reductase Ⅰ.Exp. Eye Res. 35:491-497)을 사용해 CCD camera로 사진을 찍어 혼탁도를 관찰하여 혼탁정도에 따른 등급을 설정하였다. 수정체 혼탁 정도에 따라 6개의 등급으로 나누었다.

등급 0: 혼탁이 전혀 없는 맑은 상태

등급 1: 적도 부분에만 혼탁이 있는 상태

등급 2: 수정체 반지름의 1/4 정도 혼탁이 있는 상태

등급 3: 수정체 반지름의 1/2 정도 혼탁이 있는 상태

등급 4: 수정체 반지름의 1/2 이상 혼탁이 있는 상태

등급 5: 수정체 전면에 혼탁이 있는 상태

2-2. 수정체 혼탁의 밀도 측정

Image pro-plus 4.0(Media cybernetics, USA) 소프트웨어가 실린 영상 분석기(image analyzer)를 이용해 CCD camera에 의해 찍힌 수정체 혼탁의 밀도를 픽셀당 임의 단위(arbitrary unit)의 값으로 구하였다. 임의 단위의 값은 가장 어두운 것이 0이고 가장 밝은 것이 255로 표시된다.

실시예 3: 두릅나무와 황백의 추출

두릅나무(Aralia Canescens Sieb. Et ZUCC.)와 황백(Phellodendron AmurenseRUPR.)은 98년 산을 구입하였다. 두릅나무의 가지와 황백의 껍질을 분쇄해 열을 가해 물로 추출한 각각의 추출물(A extract and P extract)과 중량비 1:1로 혼합해 열을 가해 물로 추출하였다(AP extract). 추출법은 다음과 같다.

두릅나무 가지와 황백의 껍질을 중량기준으로 1:1 혼합한 혼합물과 각각을 600g씩 분쇄하고 증류수 5 L를 가해 40-50 시간 동안 교반하면서 추출, 여과, 원심분리 하였다. 원심분리 후 생성된 여액에 클로로포름 2L를 가해 수지, 섬유질, 단백질 등을 용출시킨 후에 클로로포름 층을 제거하였다. 여기에 다시 n-헥산을 가해나머지의 수지, 섬유질, n-헥산 가용성 물질 등을 용출시킨 후 수층을 회수하고 탈크를 가하여 여과, 정제하면서 탈크를 제거하였다. 잔존하는 탈크는 멤브레인 필터 장치에서 여과하여 제거하고 정제한 여액은 동결건조하여 분말화 하였다. 이 방법에 의해 두릅나무와 황백의 혼합 추출물(AP extract)은 36g(수율 약 6), 두릅나무 추출물(A extract)은 25.8g(수율 약 4.3), 황백피 추출물(P extract)은 46.8g(수율 약 7.8)이 수득 되었다. AP 추출물에는 두릅나무와 황백피가 약 1:2의 비율로 존재하였다.

또한 AP extract와 A extract를 도 2와 같은 용매 추출법에 의해 4가지 분획 (CHCl₃층, ethylacetate층, BuOH층, 물층)으로 나누었다. 도 2에 나타낸 용매 추출법을 살펴보면 두릅 추출물을 물에 녹인 후 클로로필과 그 밖의 불순물을 제거하기 위해 페트롤리엄 에테르(petroleum ether)로 2회 분배하여 페트롤리엄 에테르 층은 버리고 나머지 물 층을 다시 클로로포름로 분배시 클로로포름 층으로 이행하는 물질을 완전히 이행시키기 위해 TLC로 확인하면서 92회 회수하였다. 그 다음, 남아있는 물 층을 에틸아세테이트로 35회 회수한 후 또 남아 있는 물 층을 부탄올로 11회 회수하였다.

포지티브 기준으로 알도즈 환원효소 저해능이 강하고 항산화능이 뛰어난 퀘르세틴(Sigma, USA)을 사용하였다.

실시예 4: 두릅나무 추출물을 포함하는 제제

1. 정제

실시예 3에서 제조된 본 발명의 동결 건조된 분말상의 추출물 250 mg을 부형제 직타용 락토즈 260 mg 과 아비셀(미결정 셀룰로오스) 35 mg, 붕해 보조제인 나트륨 전분 글리코네이트 15 mg, 결합제인 직타용 L-HPC(Low-hydroxyprophylcell ulose) 80 mg을 섞어 U형 혼합기에 넣고 20 분간 혼합하였다. 혼합완료 후 활탁제 마그네슘 스테아레이트 10 mg를 추가로 넣고 3분간 혼합하였다. 정량시험과 항습도 시험을 거쳐 타정하고 필름 코팅하여, 1 정당 추출물 250 mg을 함유하는 정제를 제조하였다.

2. 시럽제

일정량의 물에 적당량의 백당을 용해시키고, 여기에 보존제로서 파라옥시메틸벤조에이트 80 ㎎ 및 파라옥시프로필벤조에이트 16 ㎎ 을 가하고, 실시예 3에서 제조된 본 발명의 동결 건조된 분말상의 추출물 4.5 g 을 넣고, 60 ℃로 유지시키면서 완전히 용해시킨 후, 냉각시키고 증류수를 가해 150 ㎖로 만들어 시럽제를 제조하였다.

3. 캅셀제

상기 실시예 3에서 제조된 본 발명의 동결 건조된 분말상의 추출물 300 ㎎ 을 담체로서 락토즈 200 ㎎ 과 혼합시켜 경질 젤라틴 캅셀에 충진하여 캅셀제를 제조하였다.

4. 음료

상기 실시예 3에서 제조된 본 발명의 동결건조된 분말상의 추출물 500 ㎎을적당량의 물에 용해시킨 후에 보조성분으로서 비타민 C, 교미제로서 구연산, 구연산나트륨, 고과당을 적당량 가하고, 보존제로서 적당량의 나트륨벤조에이트를 가한 후에 물을 가하여 전량을 100 ㎖로 만들어 음료용 조성물을 제조하였다.

5. 주사제

상기 실시예 3에서 제조된 본 발명의 동결 건조된 분말상의 추출물 200 mg을 1 의 폴리옥시에틸렌 수소화 카스트로 오일을 함유하는 생리 식염수 200 mg에 가열 용해시켜 추출물을 0.1 의 농도로 함유하는 주사 제제를 제조하였다.

실시예 5: 추출물들의 백내장 형성에 미치는 능력 실험

I) 백내장 형성의 지연(Delay); 백내장의 유도와 동시에 추출물을 투여하였다.

II) 백내장 형성의 예방(Prevention); 백내장 유도 24시간 또는 48시간 전에 추출물을 투여하였다.

III) 백내장 형성 후의 회복(Reversion); 백내장 유도 후 24시간 또는 48시간 후에 추출물을 투여하였다.

추출물 중 지용성인 것은 디메틸설폭시드를 0.1(v/v) 이내로 사용해 배지에 투여하였다. 추출물 투여 농도는 추출물이 투여 된 배지의 삼투압이 320mOsm가 넘지 않은 범위에서 사용하였다. 배지의 삼투압은 빙점 강하도를 이용해 오스모미터(Precision System Inc., USA)로 측정하였다.

실시예 6: 추출물들의 시험관내 생화학적 특성 분석

6-1. 각 추출물들의 알도즈 환원효소에 대한 IC₅₀값 구하기

알도즈 환원효소 효소원의 조제는 헤이만(Hayman S. and Kinoshita J.H.(1965), Isolation and properties of lens aldose reductase.J. Biol. Chem.240(5);877-882)의 방법을 따랐다. 백서의 수정체의 습중량의 10배 부피에 해당하는 100 mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0)을 가해 균질화 한 후 균질액을 4℃, 10,000 rpm에서 20분간 원심분리 한 상등액을 효소원으로 하였다.

알도즈 환원효소의 활성은 다스 등의 방법(Das B. and Srivastava S.K. (1985) Purification and properties of aldose reductase and aldehyde reductase II from human erythrocyte.Anal. Biochem. Biophys.238 (2);670-677)을 따랐다. 위의 방법으로 조제한 효소원과 10 mM DL-glyceraldehyde, 0.16 mM NADPH를 0.1 M 인산 완충액(pH 6.2)에 용해하여 340 nm에서 5분간 1분 간격으로 흡광도의 감소율을 측정하여 대조군의 효소활성으로 하였다. 이 때 블랭크(blank)로 기질인 글리세르알데히드 대신 완충액만을 가해 반응시켜 흡광도의 변화를 측정하고 대조군에서 블랭크를 감하여 준 흡광도의 변화가 5분간 0.100±0.005이 되도록 하였다. 위의 반응액에 각 추출물들을 여러 농도로 넣어흡광도 변화를 측정해 대조군의 그것에서 추출물 투여군의 흡광도를 감한 값을 구해 대조군의 흡광도에 대한 비의 백분율을 추출물의 효소저해율로 표시하였다. 추출물의 농도(log값)에 대한 효소 저해율()을 plot하여 50효소 저해 농도를 구하였다.

저해 퍼센트 = [(컨트롤-샘플)/(Control-Blank)]×100

지용성인 추출물은 총 반응액의 1(v/v) 이내가 되도록 DMSO에 녹여 사용하였다.

6-2. 추출물들의 항산화 능력 측정

케미루미네슨스(CL: chemiluminescence)를 이용해 측정 하였다(Birks J.W. (1989), Chemiluminescence and photochemical reaction detection. In; Chromatography. VCH Publisher, pp:10-13). 케미루미네슨스는 화학반응시 방출되는 빛 에너지로 루미놀(luminol), 아미노부틸에틸 이소루미놀(ABEI) 같은 고리형 디아실히드라지드류가 증폭제로 사용된다. 이 증폭제는 페록시다제의 기질로서도 사용되며 H₂O₂존재하에서 산화반응을 일으킨다. 항산화 물질은 이런 산화반응을 억제하여 반응시 방출되는 CL을 감소시킨다.

0.6 uM ABEI 200 ul와 추출물 200 ul를 폴리스티렌 튜브에 놓고 35히드로페록시드와 10 mg/ml 마이크로페록시다제를 각각 1:100으로 희석하여 루미노미터에 자동 주입하였다. 화학반응에 의한 빛의 강도는 루미노미터(LB9501, Clilumat, Germany)에 의해 2초간 감지되었다. 추출물의 항 산화 능력은 반응 시 빛 강도의 저해 퍼센트()로 표시한다.

실시예 7: 수정체의 수집 및 전처리

일정기간 배양된 수정체를 파라핀으로 덮은 핀셋으로 조심스럽게 꺼내 여과지에서 수정체 밖의 수분을 제거하고 수정체에 붙어 있는 홍채 세포를 떼어내었다. 액체질소로 급속 냉동시킨 후 ?80?C에서 보관하였다가 1주일 이내로 분석에 사용하였다. 수정체는 분석하기 전에 정확한 무게를 측정한 후 3-4개씩 풀링(pooling)하여 질소 포화 100 mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0)를 넣고 4℃에서 균질화한 다음 균질액의 일부는 10,000×g에서 20분간 원심분리 후 상층액을 -80℃에서 보관하였다가 알도즈 환원효소 활성 측정 및 웨스턴 블로팅 실험 시 사용하였다.

또한 수정체 중 일부는 생리 식염수로 균질화한 다음 균질액 중 일부는 4,000 rpm에서 5분간 원심분리 후 상층액을 얼려 타우린 분석에 사용하였고 나머지 균질액에는 10트리클로로아세트산을 넣어 격렬히 혼합 후 4,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 이것의 상층액을 2.5 M KOH로 pH 6.8-7.6이 되도록 중화 시켜 -80℃에 보관하였다가 자일리톨과 마이오-이노시톨 분석에 사용하였다.

실시예 8: 수정체의 생화학적 분석 방법

8-1. 알도즈 환원효소의 활성도 측정

수정체의 알도즈 환원효소 활성도를 측정하기 위하여 시료를 1ml의 반응계(50 mM phosphate buffer(pH 6.0), 400 mM LiSO4, 10 mM DL-glyceraldehyde, 0.1 mM NADPH)에 첨가해 340 nm, 37℃에서 흡광도의 변화를 5분 동안 관찰하였다.

8-2. TBARS 측정

수정체에서 산화적 스트레스의 지표인 지질과산화물로 티오바르비투르산 반응물질(thiobarbituric acid reacting substances) 함량을 오카와의 방법(Ohkawa H., Ohish N. and Yagi K. (1979), Assay for lipid peroxdation in animal tissue by thiobarbituric acid reaction.Anal. Biochem.95:351-356)에 따라 측정하였다. 각 시료의 단백질 농도가 2 mg/ml 정도가 되도록 10 mM 인산칼륨 완충액(pH7.4)로 희석한 후 스크루-캡 튜브에 1ml씩 넣고 37℃에서 60분간 진탕 가온 하였다. 여기에 10(w/v) 트리클로로아세트산 1ml과 0.67티오바르비투르산(thiobarbituric acid) 1ml을 가한 뒤 30초 동안 격렬하게 혼합해 끓는 물에 마개를 닫고 15분간 중탕하였다. 중탕 후 빙수에 급히 냉각시키고 부탄올 2ml을 각 tube에 넣고 격렬히 혼합 후 4,000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 부탄올 층으로 535 nm에서 흡광도룰 측정하였다. 이때, 표준용액으로 테트라에톡시프로판을 메탄올에 녹여 사용하였다.

8-3. 콘쥬게이트 디엔 함량 측정

수정체의 균질액에서 먼저 지방을 추출한 후 그 추출 액에서 콘주게이트 디엔의 함량을 측정하였다. 클로로포름:메탄올(2:1) 혼합액 2ml과 균질액 0.5ml을 넣고 격렬히 혼합한 후 2,000×g, 10분간 원심분리 한 후 하층의 글로로포름 층을 뽑아 튜브에 옮기고 다시 상층액을 위와 같은 방법으로 지방층을 분리하여 총 부피를 기록하였다. 지방 추출액 100ul는 총 지방 농도를 측정하기 위해 질소 가스하에서 말려 잘 봉합한 후 -85℃에서 보관하였다. 지방 추출액 중 500ul를 질소 가스하에서 잘 말린 후 시클로헥산 1ml에 넣어 용해시킨 후 233 nm에서 흡광도를 측정하여 지방 1mg당 흡광도로 표시하였다.

8-4. 총 지방 함량

수정체의 균질액에서의 총 지방 농도의 측정은 설포포스포-바닐린 반응법(Fring C.S. and Dunn R.R. (1970), A colorimetric method for determination for total serum lipids based on the sulfo- phosphovanillin reaction.Am. J. Clin. Path.53;89-91)으로 측정하였다. 질소 가스하에서 잘 마른 지방추출물에 0.2ml의 진한 황산을 넣고 끓는 물에서 10분간 중탕하였다. 이것을 냉각시켜 5ml의 포스포바닐린 시약을 넣고 37℃ 항온 수조에서 15분간 활성화 시킨 후 10분 이내에 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준용액으로 올리브유를 사용하였다.

8-5. 클루타치온(GSH) 함량 측정

GSH 함량은 GSH가 DTNB(5,5'-dithiobis;2-nitrobenzoic acid)와 반응하여 흡광을 나타내는 원리를 이용한 엘만의 방법(Ellman G.L. (1959), Tissue sulphydryl groups.Arch. Biochem. Biophys. 82;70-77)으로 분석하였다. 수정체의 균질액 0.5ml에 20트리클로로아세트산 0.5ml을 넣고 격렬히 혼합 후 2700 rpm에서 20분간 원심분리 하였다. 원심분리 후 상층액 0.5ml에 0.3 M Na₂HPO₄4ml과 DTNB 0.5ml을 넣고 혼합 후 412 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준용액으로 클루타치온(환원형)을 증류수에 녹여 사용하였다.

8-6. 마이오-이노시톨과 자일리톨의 함량

마이오-이노시톨과 자일리톨의 함량 측정은 전처리 된 시료를 0.45um 필터(millipore)로 걸러 HPLC를 이용해 측정하였다. 칼슘 양이온교환 컬럼(300×6.5mm ID)을 90℃까지 온도를 높이고 이동상인 50 mg/l 칼슘 디소디움 EDTA 수용액을 0.5 ml/min 속도로 흘려 베이스라인이 안정화 된 후 샘플을 50ul씩 주입하여 분석하였다.

8-7. 타우린 함량

수정체를 0.9NaCl 용액으로 균질한 후 원심분리한 상층액에서 아세토니트릴을 이용해 단백질을 제거하고 다시 원심분리한 상층액에 유도체인 Dabsyl chloride 를 넣고 70℃에서 10분간 반응시켜 필터링한 후 HPLC에 주입하였다. 컬럼은 waters symmetry C18(3.9×150mm)를 40℃에서 사용했고 이동상은 완충액(20 mM sodium acetate, 0.05triethylamine, pH 6.5) : 아세토니트릴을 73 : 27로 섞어 사용하였으며 속도는 1.0 ml/min으로 하였다.

8-8. 전기영동 (SDS-PAGE)

추출물이 알도즈 환원효소 단백질의 합성에도 영향을 주는지 알아보기 위해 이 단백질의 양을 정량하였다. 알도즈 환원효소의 분자량은 약 38kd이므로 SDS-PAGE는 10.0separating gel를 사용하였다.

수정체의 균질액에서 단백질 정량을 한 후 각 well에 동량의 단백질을 포함한 시료가 25ul씩 들어가도록 하였다. 각 시료에 5×Laemmli's sample buffer를 가해 5분간 끓인 후 loading하여 120V 항 전압 하에 전기영동하였다.

8-9. 웨스턴 블로팅

SDS-PAGE를 시행한 후 Bio-Rad의 Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell을 이용해 15V로 30분간 단백질을 겔에서 니트로셀룰로스 멤브레인으로 이동, 부착시켰다. 니트로셀룰로스 멤브레인은 PBS(phosphate-buffered saline)에 0.1트윈 20을 넣은 용액(PBS-T)에 5탈지우유를 녹여만든 블로킹 용액에 담가 4℃ 냉장고에서 하룻밤을 보관하였다. 1차 항체는 PBS-T에 1:2,000으로 희석해 1시간 동안 방치한 후 15분간 1번, 5분간 3번 세척한 후 알칼라인 포스파타제-커플링 2차 항체(rabbit anti-goat IgG, Sigma, USA)를 1:30,000으로 희석한 후 40분간 반응 시켰다. 다시 멤브레인을 위와 같이 세척하고 전개용액(0.1 M Tris, 0.1 M NaCl, 5 mM MgCl₂, pH9.5)에 NBT(p-nitro blue tetrazolium chloride) 용액과 BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate)를 2:1로 섞어 암실에서 5분간 전개시킨 후 건조시켜 사진을 찍었다.

8-10. 수정체의 조직학적 검사

수정체를 0.1M 인산 완충액 (pH 7.4)에서 준비된 4글루트알데히드에 하룻밤 고정시킨 후 1오스뮴 데타록시드(OsO₄)로 1시간 동안 다시 고정 시켰다. 그 후 에탄올 시리즈에 의해 탈수과정을 거치고 100에폰으로 포매한 후 섹션(1 micron)하였다. 1소디움 보레이트에서 준비된 0.1톨로이딘으로 염색 후 광학 현미경(×200)으로 관찰하였다.

8-11. 단백질 정량

단백질 정량은 BSA(Sigma)을 표준용액으로 사용하여 DC 프로틴 분석 시스템(Bio-Rad, USA)을 이용해 측정하였다.

실험 결과

1. 당 백내장의 혼탁도 측정

20mM D-자일로즈 배지에서 배양된 수정체에 혼탁이 형성되는 정도를 실체 현미경으로 관찰하여 시간에 따른 혼탁의 변화를 촬영하였다. 사진을 도 3으로 나타낸다.

시간이 지남에 따라 혼탁은 피질로 진행이 되었고 배양 24시간에는 봉합선(suture line)이 약간씩 보이기 시작했다. 배양 24시간까지는 당 백내장의 초기라 진단 할 수 있는 피질 혼탁이 명백히 보였고 배양 48시간에는 수정체 전면이 혼탁해지는 성숙 백내장이 형성되었다. 수정체를 입체적으로 관찰해 본 결과 혼탁이 적도면과 전반구에만 생기는 것으로 관찰되었다.

현미경으로 관찰된 수정체의 혼탁 정도를 정량화하기 위해 영상 분석기(Image analyzer)를 이용해 수정체 혼탁의 평균 밀도 값으로 혼탁의 정도를 표시하였다. 도 4는 배지를 20 mM 자일로즈로 처리한 후 72시간 배양한 쥐 수정체의 혼탁 밀도를 표시한 것이다. 이 실험은 4 내지 5개의 수정체에 대해 3회 이상 실험한 값을 평균한 것이다. 배양 48시간까지 관찰 시간에 따라 혼탁밀도가 유의적으로 증가하였으나 배양 48시간 이상부터 유의적인 증가를 보이지 않았다.

2. 두릅(A), 황백(P) 그리고 두릅과 황백의 혼합(AP) 추출물의 알도즈 환원효소의 활성 억제능

추출물들의 알도즈 환원효소의 활성에 대한 억제능은 IC₅₀값으로 나타내었다.

두릅(A), 황백(P) 그리고 두릅과 황백의 혼합(AP) 추출물의 알도즈 환원효소에 대한 활성 억제능

추출물	IC50(㎍/㎖)
두릅 추출물(A 추출물)	11.3
황백 추출물(P 추출물)	29.4
두릅(A) 추출물 + 황백(P) 추출물	16.8

3. 두릅(A), 황백(P) 그리고 두릅과 황백의 혼합(AP) 추출물의 항산화능

위 추출물들의 항산화능은 실험관 내에서 아미노부틸에틸 이소루미놀(ABEI)를 기질로 이용해 H₂O₂에 의한 산화반응시 방출되는 케미루미네슨스(CL)를 측정해이 반응의 억제 정도로 나타내었다. 추출물을 첨가하지 않았을 때 나오는 CL의 카운트를 기준으로 추출물이 이 카운트를 감소시키는 퍼센트로 항 산화 능을 표시하였다. 이 퍼센트가 음의 값을 갖는 것은 산화를 촉진시키는 정도를 의미한다. 결과를 도 5에 나타낸다.

도 5의 그래프에서 보는 바와 같이 A 추출물이 AP나 P 추출물보다 항산화능이 강한 것으로 나타났으나 포지티브 컨트롤인 아스코르브산보다는 약했다.

4. 두릅(A), 황백(P) 그리고 두릅과 황백의 혼합(AP) 추출물이 수정체의 당 백내장 형성의 지연에 미치는 영향

수정체를 배양하여 실험할 수 있는 기간을 정하기 위해 컨트롤 배지에서 현미경으로 맑은 상태가 며칠까지 유지되는지 관찰하였다. 8-9일이 되면서 약간의 혼탁이 생기는 수정체가 생겨 실험 기간을 8일 이내로 정했다. 8일째에도 혼탁이 전혀 없는 수정체를 조직검사 해 본 결과 배양 1일 된 것과 거의 동일하였다.

3가지 추출물을 동일한 1 mg/ml 농도로 첨가하였다. 48시간동안 백내장 형성을 어느 정도 억제했는지 혼탁의 밀도를 측정해 도 6의 그래프로 표시한다. A, AP 그리고 P 추출물 순으로 백내장 형성의 지연효과가 좋았다. 그러나 P 추출물의 경우는 1mg/ml에서 거의 효과가 없는 것으로 나타났고 AP추출물도 A와 P추출물에 비해 별다른 상승 효과를 보이지 않았다. AP 추출물은 배양 24, 48시간에 각각 15.7, 8.1씩 혼탁의 밀도를 유의적으로 감소 시켰고 A 추출물은 배양 24, 48시간에 각각 36.4, 31.3씩 혼탁의 밀도를 유의적으로 감소 시켰다. AP추출물은 배양 24, 48시간에 각각 수정체의 92가 grade 3, 100가 grade 4를 보였고 A 추출물은 배양24시간에 각각 수정체의 75가 grade 2와 25가 grade 3이었고 48시간에는 95가 grade 3과 5가 grade 4를 보였다. 수정체에서 백내장 지연 효과는 시험관내 실험 결과(aldose reductase 활성 억제와 항 산화 효과)와 일치하는 결과를 보였다.

5. 두릅 추출물의 4가지 분획물의 알도즈 환원효소 활성 억제능

당 백내장 형성의 지연 효과를 실험한 결과 두릅 추출물의 효과가 가장 뛰어나 두릅 추출물을 용매 추출하여 나온 4가지 - chloroform(AC), ethylacetate(AE), butanol(AB), water(AW) 분획물로 실험을 진행하였다. 클로로포름(AC) 분획물은 진한 갈색의 반고체 상태이고 물에 불용성이었고 에틸아세테이트(AE) 분획물은 진한 갈색의 반고체 상태이고 흡습성이 강하며 뜨거운 물에 잘 녹았다. 부탄올(AB) 분획물은 연한 갈색의 분말 상태이고 물에 잘 녹았으며 물(AW) 분획물도 진한 갈색의 분말 상태이고 물에 잘 녹았다. 결과를 표 2로 나타낸다.

분획물의 IC₅₀(㎍/㎖)

분획물	IC50(㎍/㎖)
AE 분획물	5.92
AC 분획물	2.11
AB 분획물	27.2
AW 분획물	16.9

따라서, 알도즈 환원효소 활성에 대한 억제능은 AC, AE, AW, AB 분획물 순으로 높았다.

6. 두릅 추출물의 4가지 분획물의 항산화능

CL을 이용해 측정한 두릅 추출물의 4가지 분획물의 항 산화 능력을 시험하였다. 아미노부틸에틸 이소루미놀을 페록시다제의 기질로 사용하여 H₂O₂의 존재 하에 페록시다제로 산화를 진행시키면서 각각의 분획물을 가하여 산화반응을 저해시키고 그 저해율을 나타낸 것이다(도 7 참조). AE 분획물은 0.01 mg/ml 농도까지 95이상의 CL 억제능을 보여 4가지 분획 중 가장 뛰어났고 AC와 AB 분획물은 비슷한 정도의 항 산화 능을 보였고 AW 분획의 항 산화 능이 가장 저조했다.

7. 두릅 추출물의 4가지 분획물이 당 백내장 형성 지연에 미치는 영향

두릅 추출물의 4가지 분획물을 배지에 첨가하여 당 백내장의 형성 지연에 미치는 영향을 측정하였다. 수정체를 20 mM 자일로즈 배지에서 배양하고 각각의 분획물을 1 mg/ml 첨가하였다. 도 8을 보면 4가지 분획물을 1 mg/ml 농도로 처리했을 때 AC 분획물이 가장 크게 유의적(P<0.05)으로 백내장 형성을 지연시켰음을 알 수 있다. AC 분획은 배양 24시간에 90가 등급 2이고 10가 등급 1을 48시간에는 75가 등급 1, 25가 등급 2를 보였다.

도 9는 20 mM 자일로즈 배지에서 수정체를 96시간 배양하여 수정체의 백내장 지연에 관한 시험 결과를 나타낸다. AC 분획이 어느 정도 백내장을 지연시킬 수 있는지 96시간까지 배양한 결과를 보이고 있다. 20 mM xylose가 첨가된 대조군과 AC군간에 t-test를 실행한 결과 96시간까지 유의적으로(P<0.05) 백내장 형성을 지연시켰다. AC 분획의 백내장 형성 억제 정도는 48시간에 66.4로 최고조에 이르렀고 시간이 지남에 따라 차츰 줄어들어 96시간에는 36.9의 억제 정도를 보였다.

AC 분획물의 당 백내장 형성에 대한 예방 효과에 대한 결과는 도 10에 나타내었다. AC 분획물을 컨트롤 배지에 넣고 24시간 또는 48시간 배양한 후 자일로즈 첨가된 배지로 바꾸어 백내장을 유도하였다. 그 결과 24시간과 48시간의 전배양(pre-incubation) 간에는 백내장 형성 억제 정도에 거의 차이가 없었고 AC 분획의 전배양은 백내장 유도 72시간까지 백내장 형성을 유의적으로 억제했다.

AC 분획물이 이미 형성된 당 백내장을 회복시키는 능력과 관련하여, 20 mM 자일로즈 배지에서 24시간, 48사긴...배양된 수정체를 클로로포름 분획물로 처리한 후 혼탁의 변화를 측정한 결과을 도 11에 나타내었다. 백내장 유도 24시간 후에 AC 분획물을 투여한 경우는 2일째까지 유의적인 차이 없이 혼탁에 큰 변화가 없다가 3일째에 유의적으로 크게 혼탁이 감소되었다. 3일째의 혼탁은 AC 분획물 투여 시점의 혼탁보다 35.7감소 되었고 3일 하루 동안의 혼탁 감소는 3일간 전체 감소의 약 80를 차지한다. 백내장 유도 48 시간후에 AC 분획물을 투여한 경우는 3일 동안 약간의 감소(약 2.4)는 있었으나 유의적이지 않았고 백내장 유도 1일째에는 오히려 약간 혼탁이 상승하는 경향을 보였다.

도 12에는 AC 분획물이 농도별로 배양 48시간에 자일리톨 함량에 미친 결과를 나타내었다. AC 분획물의 농도가 증가함에 따라 자일리톨 함량이 유의적으로 감소하였다. AC 분획 0.1 ㎎/㎖시 16.8, 0.5 ㎎/㎖시 51.0, 1 ㎎/㎖시 87.7감소시켰다. 그래프에서 각 막대는 각 그룹에서 4-5개의 수정체에 대해 4회 실험한 데이터의 평균치를 나타낸 것이다. 실험은 20 mM 자일로즈로 처리된 배지에서 수정체를 배양한 후 자일리톨의 형성에 대한 두릅 추출물의 클로로포름 분획물의 영향을 측정한 것이다.

도 13에는 1 mg/ml AC 분획물이 백내장 유도 48 시간에 알도즈 환원효소의 활성에 농도별로 미치는 영향을 보여 주었다. 이 실험은 20 mM 자일로즈로 처리된 배지에서 수정체를 48시간 배양한 후 알도즈 환원효소의 활성에 대한 두릅 추출물의 클로로포름 분획물의 영향을 측정한 것이다. 컨트롤은 자이로즈 처리 배지로 수정체를 배양한 것이고, AC는 수정체를 AC 분획으로 처리한 자일로즈 배지의 실험 결과를 나타낸다. 그래프에서 각각의 막대는 각 그룹에서 4-5개의 수정체에 대해 4회 실험한 평균치를 나타낸 것이다. AC 분획의 농도가 증가함에 따라 알도즈 환원효소의 활성은 유의적으로 감소했다. 그러므로 AC 분획은 시험관내에서 뿐만 아니라 수정체 내에서도 알도즈 환원 효소의 활성을 저해하여 폴리올 경로를 저하시키는 것으로 나타났다.

8. 산화 스트레스에 미치는 영향

티오바르비투르산(TBA)와 반응하는 주요 지질과산화물인 MDA는 지질 과산화 과정의 중간산물로 3개 이상의 이중 결합을 갖는 다가 불포화 지방산이 유리 활성 라디칼에 의한 산화적 분해로 생기며 지질 과산화의 지표로 가장 널리 이용된다(Ohkawa H., Ohish N. and Yagi K. (1979), Assay for lipid peroxdation in animal tissue by thiobarbituric acid reaction.Anal. Biochem.95:351-356).

도 14에서 AC는 AC로 처리된 20 mM 자일로즈 배지에서 배양된 수정체와, 처리하지 않은 그룹의 수정체에서 TBARS의 형성에 관한 결과를 나타낸다. 각각의 수치는 4 또는 5개의 수정체에 대해 4회 실험한 값의 평균치를 나타낸 것이다. AC 분획의 첨가는 도 14에서 보이듯 TBARS 함량에는 약간의 감소를 보였으나 농도에 상관없이 유의적인 영향을 끼치지 못했다. 그러나 CL을 이용한 생체내 실험에서는 AC 분획물이 항 산화 효과가 있었다.

도 15은 20 mM 자일로즈 배지에서 배양한 수정체에서 AC 분획물을 처리한 그룹과 처리하지 않은 컨트롤 그룹을 48시간 배양한 후 콘쥬게이트 디엔의 형성에 관한 결과를 표시한다. 콘쥬게이티드 디엔 함량을 AC 분획 1 mg/ml만이 유의적으로 낮추었다. 그러므로 AC 분획은 수정체 내에서 지질과산화의 초기 산물인 콘쥬게이티드 디엔 형성을 억제하는 효과가 있는 것으로 사료된다.

글루타치온(GSH)은 H₂O₂로 백내장 유도시 가장 먼저 산화되는 물질이며 외부의 스트레스에 가장 민감하게 반응하고, 폴리올 경로 증가시 NADPH의 소모로 글루타치온 환원효소 저해제에 의한 GSH로의 환원 감소로 GSH 함량이 감소한다고 알려져 있다.

도 16에는 당 백내장 유도시 수정체의 총 GSH 함량의 변화를 나타내었다. 20 mM 자일로즈 배지에서 48시간 배양된 수정체의 GSH 함량의 변화를 표시한 것이다. 백내장 유도 시간에 따라 48 시간까지 GSH의 유의적인 감소가 계속 되었다. GSH의 감소는 백내장 유도 초기에도 유의적인 감소를 보였는데 이것은 초기에 증가하는폴리올 경로(알도즈 환원효소 활성)의 영향을 받은 것으로 보인다. 또한 GSH의 지속적인 감소는 당 백내장 형성시 증가하는 산화 스트레스의 영향 때문인 것으로 생각된다. 이 실험에서 GSH의 감소와 혼탁의 증가는 서로 유의적인 높은 음의 상관관계(r=-0.891, p< 0.001)를 보였다. AC 분획물은 농도가 증가함에 따라 GSH 함량을 증가시키는 경향을 보이며, 백내장 유도 48 시간에서 AC 분획물은 0.5 mg/ml 이상시 유의적으로 GSH 함량을 증가시켰다. 그러나 AC 분획물 1 mg/ml처리시 대조군(20 mM xylose)보다 GSH 함량이 28.6증가했다. 그러나, AC 분획물 1 mg/ml 처리시 GSH 함량은 백내장 유도 전 GSH 함량의 38.3에 해당하므로 백내장 유도 전의 수준으로는 회복시키지 못했다.

9. 수정체의 마이오-이노시톨과 타우린 함량에 미치는 영향

당뇨병성 백내장인 경우와 당 백내장의 경우 여러 연구에서 수정체로의 마이오-이노시톨이나 타우린의 농도가 감소되므로, 이 실험에서는 당 백내장이 진행됨에 따라 마이오-이노시톨과 타우린의 함량의 변화를 측정하였고 AC 분획이 이에 미치는 영향을 실험하였다.

도 17 및 도 18에는 20 mM 자일로즈 배지에서 AC 분획 1 mg/ml이 백내장 유도 시간에 따라 마이오-이노시톨과 타우린의 함량에 미치는 영향을 나타내었다. AC 분획 처리시 마이오-이노시톨의 경우 6, 24, 48 시간에 각각 대조군 함량의 35.6, 434.6, 296.7의 증가를 보였고 타우린의 경우 같은 시간에 각각 77.9, 403.0, 136.8의 증가를 보였다. 위 두 물질 다 AC 분획 처리 24시간의 함량 증가율이 가장컸다.

10. 두릅의 클로로포름(AC) 분획물 처리시 마이오-이노시톨과 타루인의 보충이 당 백내장의 예방 및 회복에 미치는 영향

백내장 회복시 AC 분획에 각각 2.5 mM의 마이오-이노시톨과 타우린의 보충이 회복속도에 미치는 영향과 수정체의 마이오-이노시톨과 타우린 함량의 변화를 측정하였다.

도 19 및 20에는 백내장 회복시 마이오-이노시톨과 타우린의 보충의 영향을 혼탁의 밀도로 나타내었다. 20 mM 자일로즈 배지에서 24시간 수정체를 배양해서 유기된 수정체의 혼탁의 회복과 관련하여 2.5 mM의 마이오-이노시톨과 타우린을 첨가하여, 1 mg/ml의 두릅 추출물의 AC 분획물의 영향을 보인 것이다. 도 19는 자일로즈 배지에서 24시간 동안 유도된 혼탁된 수정체에 마이오-이노시톨과 타우린 및 AC 분획을 첨가한 영향을 도시하고, 도 20은 48시간 동안 혼탁이 유도된 수정체에 대한 영향을 도시한다. 혼탁백내장 유도 24시간에서의 회복은 마이오-이노시톨과 타우린의 보충이 회복 1일, 2일째에는 AC 분회만 처리했을 때보다 유의적으로 혼탁을 낮추었으나 회복 3일째에는 AC 분회만 처리했을 때와 비슷했다. AC 분획만 처리했을 때는 회복 2일째까지는 혼탁 감소의 폭이 크지 않았으나 3일째에 크게 감소하였고 AC 분획에 마이오-이노시톨과 타우린을 보충했을 때는 회복 1일부터 크게 감소하기 시작했다.

결국 마이오-이노시톨과 타우린의 보충은 혼탁의 회복 속도를 빠르게 해주었다. 컨트롤 배지에서의 회복을 보면 회복 1일부터 혼탁의 감소가 크게 진행되다가 혼탁 밀도가 60AU/픽셀 정도로 낮아지면 혼탁의 회복 속도가 매우 감소되었다. AC 분획에 마이오-이노시톨과 타우린 처리시에는 좀더 높은 혼탁 밀도(80-90AU/pixel)에서 회복 속도가 감소되는 것으로 보였다. 백내장 유도 48시간에서의 회복은 회복 1일째에는 마이오-이노시톨과 타우린 보충 시에도 거의 같은 혼탁 밀도로 약간 증가하였고 2일, 3일째에는 마이오-이노시톨과 타우린 보충의 보충이 유의적으로 AC 분회만 처리했을 때보다 혼탁 밀도를 감소시켰다.

도 21에는 AC 분획에 마이오-이노시톨과 타우린을 각각 2.5 mM 씩 보충하여 전배양시 백내장 예방효과를 알아보았다. 그래프는 4 또는 5개의 수정체에 대해 3회 이상 실험한 평균치를 나타낸 것이다. ○은 컨트롤 배지, □은 AC 배지, ■은 마이오-이노시톨, 타우린 및 AC-처리 배지의 결과를 나타낸다. 20 mM 자일로즈 배지에서 72시간 배양한 수정체에 두릅 추출물의 1 mg/ml AC 분획물과 2.5 mM의 마이오-이노시톨 및 2.5 mM의 타우린 첨가하였다. 백내장 유도 1, 2일째에는 AC 분획 처리와 여기에 위 두 물질 각각 2.5 mM의 첨가로 인한 혼탁 밀도의 차이가 거의 없었고 3일째에도 혼탁 밀도를 약 13.8정도만 감소시켜 큰 영향을 끼치지는 못했다. 백내장 유도 48시간 이상이 되면 측정하기 힘들 정도로 수정체에서 두 물질의 결핍이 일어났다. 이 실험에서 타우린을 수정체 배양 배지에 10 mM, 30 mM로 보충해 주었을 때 농도에 비례하게 수정체내 타우린 함량이 증가한 것을 관찰하였다. 본 실험에서 백내장 유도 3일째에 두 물질의 함량을 수정체에서 측정해 본 결과 AC 분획만 전배양했을 경우 마이오-이노시톨은 측정이 되지 않았고 타우린은 약0.01±0.008 mM 이었다. AC 분획과 더불어 두 물질을 같이 전배양한 경우에 타우린은 약 0.08±0.012 mM, 마이오-이노시톨은 약 0.40±0.023 mM 이었다.

실시예 9: 본 발명에 따르는 두릅 추출물에 대한 독성 실험

본 발명에 따르는 두릅 추출물을 생약 또는 건강보조식품으로 사용할 때 안전성을 확인하기 위하여 약물의 급성 독성을 나타내는 지표가 되는 중요한 의미가 있는 수치로서 LD₅₀(실험동물의 50 를 치사시킬 수 있는 양)치를 다음과 같은 방법에 의하여 구하였다.

정상 ICR 마우스(male, 22±1 g) 36 마리를 1 개 군에 6 마리씩 A 내지 F의 6개 군으로 나누어, A 군에게는 체중 1 ㎏당 본 발명에 따라 실시예 3에서 제조된 두릅 추출물 5 g을 투여하는 것으로부터 등차적으로, B 군에는 7.5 g, C 군에는 10 g, D 군에는 12.5 g 및 E 군에는 15 g을 각각 경구 투여하고 베렌스-칼버(Behrens-Karber)법(참고문헌: 高木敬次郞 外: 藥物實驗, 南山堂, Japan, p131, 1960)으로 본 발명의 추출물을 경구(p.o.)투여하여 LD₅₀값을 측정하였다. 결과는 하기 표 3에 기재하였다.

두릅 추출물의 경구 투여에 의한 치사량(LD₅₀)

실험군	용 량(g/㎏)	경구투여 군(p.o.)	*Z	**d
		사망동물 수/사용동물 수
A	5	0 / 6	-	-
B	7.5	0 / 6	0	2.5
C	10	0 / 6	0	2.5
D	12.5	0 / 6	0	2.5
E	15	0 / 6	0	2.5

* Z: 2 개의 연속되는 용량으로 사망동물수의 ½ 값

** d : 2 개의 연속되는 용량의 차이

상기 표 3에 기재된 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따르는 두릅 추출물을 경구투여 했을 때의 LD₅₀값은 15 g/㎏ 이상이며, 따라서 생체에 매우 안전한 물질임을 알 수 있었다. 즉, 본 발명에 따르는 두릅 추출물 독성이 거의 없이 안전하게 투여될 수 있는 것임을 명백히 알 수 있다.

또한, LD₅₀값의 측정시 사용한 시험동물에 대해 부검 및 병리조직학적 시험을 다음과 같은 방법으로 시행하였다. 시험 종료시 전 생존동물에 대하여 에테르 마취 후 방혈 치사시킨 다음 장기를 적출하여 육안적으로 모든 장기의 이상을 검사하였다. 병리조직 검사를 위하여 부검한 전 장기들을 10 중성포르말린 용액에 10 일 이상 고정시킨 다음 탈수 과정을 거쳐 파라핀 포매기(Fisher, Histomatic Tissue Processor, 166A)에 포매한 후 로터리 마이크로톱 (AO Rotary Microtome)으로 5 μm 절편을 만들어 헤마톡실린과 에오신 염색을 하여 관찰하였다.

각 군의 모든 동물을 해부하고 H&E 염색을 한 후 현미경으로 조사한 병리조직학적 소견은 다음과 같다. 본 발명의 추출물을 마우스 체중 1 kg당 15 g까지 투여시 간 조직과 신장에 있어서 약물 투여에 의한 이상적인 소견은 관찰되지 않았다. 또한, 심장의 심근세포, 위·장관, 췌장, 폐장, 비장, 부신, 뇌, 고환, 난소, 골수 등에 있어서 두릅 추출물 투여에 의한 이상 소견은 관찰되지 않았다.

따라서, 본 발명에 따르는 두릅 추출물은 마우스에 투여할 수 있는 최대 용량인 체중 1 kg당 15 g 투여 시에도 전 장기에 대하여 급성독성에 의한 부작용이 없었으며, 또한 어떠한 장기손상 등의 독성도 유발하지 않는 안전한 물질인 것으로 판단되었다.

실시예 10: HPLC(고성능액체크로마토그래피) 분석에 따른 본 발명의 추출물의 특성

본 발명인 두릅 추출물을 HPLC로 분석하기 위하여 추출물을 10 mg/ml의 농도로 물에 녹였다. 용해된 추출물 용액 10 μL를 취하여 HPLC(HP1090)를 사용하여 분석하였다.

(분석조건)

칼럼 : LuNa 5u C18(2); 4.6 mm i.d. x 250 mm L

이동상 : 2아세트산과 메탄올의 구배 시스템

유속 : 1 ml/min

검출 : photodioid array detector로 254 nm에서 측정

반복 실험에서 추출물의 특징적인 피크들이 관찰되었다. 도 20은 두릅 추출물의 HPLC 프로필로서 두릅 추출물에는 페놀성 물질들이 상당량 함유되어 있는 것으로 확인되었다. 특히 함량이 많은 페놀성 물질들은 3,4-dihydroxybenzoic acid (retention time :RT=10.941 분)로 두릅 추출물에 1정도 포함되어 있었고, 카페인산 (caffeic acid, RT=18.824 분)에 나타나며 함량은 0.16, 페룰린산 (ferulic acid, RT=25.53 분)에 관찰되며 함량은 0.04정도였다. 그러나 두릅 추출물에는 아직 확인되지 않은 많은 물질이 함유되어 있다.

일반적으로 페놀성 물질들은 항산화작용이 뛰어난 것으로 알려져 있기 때문에 두릅 추출물의 항산화작용은 이 추출물에 포함되어 있는 페놀성 물질들에 기인하는 것으로 보인다.

이상에서 바람직한 실시예에 의거하여 본 발명을 상세히 설명하였으나, 본 발명의 범위는 이에 제한되는 것은 아니고, 본 발명의 사상과 범위 내에서 이 분야의 전문가에게 자명한 치환, 변형 및 변경은 본 발명의 범위에 속하는 것을 이해되어야 한다.

이상 설명으로부터 명백한 바와 같이, 본 발명에 따른 두릅 추출물을 포함하는 조성물은 당에 의해 유도된 백내장의 예방, 진행의 지연, 치료 및 회복에 효과를 나타낸다. 특히, 본 발명의 조성물에 마이오-이노시톨과 타우린의 첨가한 조성물은 백내장의 진행에 따라 감소되는 이들 화합물을 보충함으로써 백내장에 대한 치료 효과를 상승시키는 효과가 있다. 본 발명에 따른 두릅 추출물을 유효 성분으로 포함하는 음료, 생약제제, 건강보조식품 및 치료제는 백내장의 예방 및 치료에 효과가 있다.

Claims (9)

1. 두릅을 용매로 추출한 백내장 치료용 조성물.
2. 제 1 항 에 있어서, 상기 용매가 에틸아세테이트, 클로포포름, 부탄올 및 물로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 제 1 항에 있어서, 마이오-이노시톨 또는 타우린으로 구성된 군에서 선택된 1 또는 그 이상의 화합물을 더 포함하는 조성물.
4. 두릅 추출물을 유효 성분으로 포함하는 백내장에 효과가 있는 음료.
5. 두릅 추출물을 유효 성분으로 포함하는 백내장에 효과가 있는 생약제제.
6. 두릅 추출물을 유효 성분으로 포함하는 백내장에 효과가 있는 건강보조식품.
7. 두릅 추출물을 포함하는 조성물에 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가하여 약제학적 단위투여형으로 제형화된 백내장 예방 및 치료제.
8. 제 7 항에 있어서, 상기 약제학적 단위투여형이 정제, 캅셀제, 용액제, 현탁제, 시럽제, 음료, 및 주사제로 이루어진 군에서 선택되는 백내장 예방 및 치료제.
9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 마이오-이노시톨 또는 타우린으로 구성된 군에서 선택된 1 또는 그 이상의 화합물을 더 포함하는 조성물.