KR20010075413A

KR20010075413A - 운동 기능 장해 치료제 및 ｇａｐｄｈ 발현 저해제

Info

Publication number: KR20010075413A
Application number: KR1020017003933A
Authority: KR
Inventors: 이시타니료이치; 가츠베노부오
Original assignee: 우에노 도시오; 오노 야꾸힝 고교 가부시키가이샤
Priority date: 1998-10-02
Filing date: 1999-10-01
Publication date: 2001-08-09
Also published as: EP1120408A1; EP1120408A9; WO2000020387A1; US6348488B1

Abstract

본 발명은 N-[3-N-(4-클로로페닐메틸)카르바모일]프로파노일]-L-프롤리날을 유효 성분으로서 함유하는 운동 기능 장해 치료제, 및 GAPDH 발현 억제제에 관한 것이다.

N-[3-[N-(4-클로로페닐메틸)카르바모일]프로파노일]-L-프롤리날은 운동 기능 장해의 개선 작용을 가져 외상, 감염, 변성, 허혈, 종양 등에 의한 운동 기능 저해의 치료에 유용하며, 또 GAPDH 과잉 발현에 의한 소뇌나 척수의 신경핵 또는 전도로의 아포토시스가 원인인 질환(파킨슨병, 파킨슨 증후군, 헌팅톤병, MJD, ALS, CHJ증 등)의 치료에 유용하다.

Description

운동 기능 장해 치료제 및 ＧＡＰＤＨ 발현 저해제{REMEDIES FOR MOTOR DYSFUNCTION AND GAPDH EXPRESSION INHIBITORS}

프롤릴엔드펩티다아제(포스트프롤린클리빈엔자임; PPCE라 약기함)는 많은 프롤린 함유 펩티드 호르몬을 가수 분해하여, 실활(失活)시키는 효소이다. 프롤린 함유 펩티드 호르몬에는 바소푸렛신, 옥시토신, 서브스탠스 P, 뉴로텐신, 브라디키닌, 안지오텐신 Ⅱ, 갑상선 자극 호르몬 방출 인자(TRH) 등이 있고, 이들 신경 펩티드, 그 중에서도 바소푸렛신은 기억 학습에 관련되어 있다. 따라서, 이 효소를 저해함으로써, 인지 기능 장해의 치료에 유용하다고 생각되며, N-[3-[N-(4-클로로페닐메틸)카르바모일]프로파노일]-L-프롤리날은 항치매약으로서 개발되어 있다.

N-[3-[N-(4-클로로페닐메틸)카르바모일]프로파노일]-L-프롤리날은 일본국 특허 공고 평6-4583호(유럽 특허 제2681190호) 중, 실시예 2(f)에 기재된 화합물이다. 일본국 특허 공고 평6-4583호에는 이 화합물을 포함하는 프롤린 유도체가, PPCE를 저해하기 때문에, 건망증의 예방 및/또는 치료에 유용하다는 것이 기재되어 있다.

본 발명자들은 먼저 래트 소뇌 과립 세포(CGC)가, 새로운 배양액으로의 교환이나 글루코오스의 보충 없이, KCl(25 mM) 존재하에서 계속 배양하면, 배양 시작에서부터 2주 이상 경과후, 돌연스럽게 아포토시스가 생기는 것을 보고하고 있다(일본국 특허 공개 평8-92127호).

이 CGC의 age-유발성 아포토시스는 N-메틸-D-아스파테이트(N-methyl-D-aspartate)(NMDA) 수용체 길항제나 항산화제에 의해서 억제되므로, 내인성으로 유리된 글루타민산에 의한 NMDA 수용체의 과잉 자극이나, 그 후에 형성되는 활성 산소종에 의한 것이라고 생각되고 있다.

또한, 이 CGC의 age-유발성 아포토시스에는 글리세르알데히드-3-포스페이트데히드로게나아제(GAPDH)(대표적인 해당계(解糖系) 효소로 많은 비해당계 기능도 갖고 있음)의 과잉 발현이, 밀접하게 관여하고 있는 것도 밝혀지고 있다.

GAPDH 안티센스올리고뉴클레오티드에 의해, GAPDH의 mRNA를 억제하면, 단백질의 과잉 발현이 억제되어, age-유발성 신경 세포 아포토시스는 억제된다. 따라서, GAPDH mRNA 또는 GAPDH 단백질의 발현을 억제함으로써, 아포토시스를 억제할 수 있다.

또, GAPDH는 다른 신경 변성 질환에 있어서의 원인 단백인 유전자 산물(특히트리플렛리피트 단백)과 선택적으로 결합하는 것으로 알려져 있다(Burke et al., 1996; koshy et al., 1996). 그 유전자 산물이란, 헌팅톤병의 헌팅틴(huntingtin),치상핵 적핵 담창구(淡蒼球) 루이체 위축증(DRPLA)의 아토르핀(atorphin), 유전성 척수 소뇌 변성증(SCA-1)의 아탁신(ataxin), 마샤드죠세프병의 아탁신-3(ataxin-3), 구척수성 근위축증(SBMA)의 안드로젠 수용체 등이다. 그 때문에, GAPDH는 이들 질환에 어떠한 역활을 하고 있다고 생각된다.

본 발명은,

1) N-[3-[N-(4-클로로페닐메틸)카르바모일]프로파노일]-L-프롤리날을 유효 성분으로서 함유하는 운동 기능 장해 치료제,

2) 동 화합물을 유효 성분으로서 함유하는 글리세르알데히드-3-포스페이트데히드로게나아제(이하, GAPDH라 함) 과잉 발현에 의한 질환 치료제, 및

3) 동 화합물을 유효 성분으로서 함유하는 아포토시스 억제제에 관한 것이다.

도 1은 척수 손상 모델에 있어서의 운동 기능 장해에 의한 대조군(부형제) 및 N-[3-[N-(4-클로로페닐메틸)카르바모일]프로파노일]-L-프롤리날(본 발명 약제) 투여군의 마우스의 신경 스코어를 도시한다.

도 2는 척수 손상 모델에 있어서의 운동 기능 장해에 의한 대조군(부형제) 및 N-[3-[N-(4-클로로페닐메틸)카르바모일]프로파노일]-L-프롤리날(본 발명 약제) 투여군의 마우스의 체중 변화를 도시한다.

도 3은 CGC를 이용한, age-유발 아포토시스에 미치게 하는 대조군, 본 발명 약제 투여군 및 THA 투여군의 시간 경과적 효과를 도시한다.

도 4는 CGC를 이용한, age-유발 아포토시스에 미치게 하는 본 발명 약제 및 THA의 용량 의존성을 도시한다.

도 5는 CGC를 이용한, age-유발 아포토시스에 앞서 증가하는 GAPDH mRNA 발현량에 미치게 하는 본 발명 약제(O), THA(T) 및 대조(C)의 효과를 나타내는 노던 블로트 해석의 결과를 도시한다.

도 6은 CGC을 이용한, age-유발 아포토시스에 앞서 증가하는 GAPDH 단백 발현량에 미치게 하는 본 발명 약제(O), THA(T) 및 대조(C)의 효과를 나타내는 SDS-PAGE(A) 및 웨스턴 블로트(B) 해석의 결과를 도시한다.

본 발명 화합물의 약리 활성

N-[3-[N-(4-클로로페닐메틸)카르바모일]프로파노일]-L-프롤리날은 운동 기능 장해의 개선 작용을 갖고 있기 때문에, 예컨대, 중추 혹은 말초 신경의 외상(척수 손상, 척수 압박 등), 중추 혹은 말초 신경의 감염, 중추 혹은 말초 신경의 변성(각종 신경 변성 질환 등), 중추 혹은 말초 신경의 허혈(뇌허혈, 척수 허혈, 말초 신경 장해 등) 또는 종양 등의 원인에 의한 운동 기능 장해의 치료에 유용하다.

또, 앞서도 말한 바와 같이, N-[3-[N-(4-클로로페닐메틸)카르바모일]프로파노일]-L-프롤리날은 GAPDH 발현 저해 작용을 보이고, age-유발 아포토시스를 억제한다. 이 때문에, 운동 기능 장해, 또는 운동 기능 장해를 수반하는 신경 변성 질환에의 응용이 기대된다. 보다 구체적으로는 파킨슨병 및 파킨슨 증후군, 헌팅톤병, 마샤드죠세프병(MJD), 근위축성 측삭경화증(ALS), 클로이츠펠트야콥병(CHJ) 등의 GAPDH 과잉 발현에 의한 소뇌나 척수의 신경핵이나 전도로의 아포토시스가 원인이 되는 운동 기능 장해의 치료에 유용하다.

독성

본 발명에 따른 N-[3-[N-(4-클로로페닐메틸)카르바모일]프로파노일]-L-프롤리날의 급성 독성(LD₅₀)은 래트에서의 정맥내 투여에서는 200 mg/kg (동물 체중) 이상, 마우스의 경구 투여에서는 2500∼5000 mg/kg (동물 체중)인 것이 확인되고 있다. 그 때문에, 본 발명의 N-[3-[N-(4-클로로페닐메틸)카르바모일]프로파노일]-L-프롤리날은 의약품으로서 사용하기 위해 충분히 안전하다는 것을 판단할 수 있다.

의약품에의 적용

N-[3-[N-(4-클로로페닐메틸)카르바모일]프로파노일]-L-프롤리날, 그 비독성의 염, 산 부가염, 또는 그 수화물을 상기한 목적으로 이용하려면 통상, 전신적 또는 국부적으로, 경구 또는 비경구의 형태로 투여한다.

투여량은 연령, 체중, 증상, 치료 효과, 투여 방법, 처리 시간 등에 따라 다르지만, 통상, 성인 1인당 일회에, 1 mg에서 1000 mg의 범위로, 하루 1회에서부터 수회 경구 투여하거나, 또는 성인 1인당 일회에, 1 mg에서 300 mg의 범위에서, 하루 1회에서부터 수회 비경구 투여(바람직하게는 정맥내 투여)하거나, 또는 하루 1시간에서 24시간의 범위에서 정맥 내에 지속 투여한다.

물론 상기한 바와 같이, 투여량은 여러 가지 조건에 따라 변동되기 때문에, 상기 투여량보다 작은 양으로 충분한 경우도 있고, 또 범위를 넘을 필요가 있는 경우도 있다.

본 발명 화합물을 투여할 때에는 경구 투여를 위한 내복용 고형제, 내복용 액제 및 비경구 투여를 위한 주사제, 외용제, 좌제 등으로서 이용된다.

경구 투여를 위한 내복용 고형제에는 정제, 환제, 캡슐제, 산제, 과립제 등이 포함된다. 캡슐제에는 하드캡슐 및 소프트캡슐이 포함된다.

이러한 내복용 고형제에 있어서는 하나 또는 그 이상의 활성 물질은 그대로, 또는 부형제(락토오스, 만니톨, 글루코스, 미결정 셀룰로오스, 전분 등), 결합제(히드록시프로필셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 메타규산알루민산마그네슘 등), 붕괴제(섬유소글리콜산칼슘 등), 활택제(스테아린산마그네슘 등), 안정제, 용해 보조제(글루타민산, 아스파라긴산 등) 등과 혼합되어, 통상의 방법에 따라서 제제화하여 이용된다. 또, 필요에 따라 코팅제(백당, 젤라틴, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스프탈레이트 등)로 피복되어 있어도 좋고, 또 2이상의 층으로 피복되어 있어도 좋다. 또한 젤라틴과 같은 흡수될 수 있는 물질의 캡슐도 포함된다.

경구 투여를 위한 내복용 액제는 약제적으로 허용되는 수제(水劑), 현탁제, 유제, 시럽제, 엘릭시르제 등을 포함한다. 이러한 액제에 있어서는 하나 또는 그 이상의 활성 물질이, 일반적으로 이용되는 희석제(정제수, 에탄올 또는 그들의 혼합액 등)에 용해, 현탁 또는 유화된다. 또한 이 액제는 습윤제, 현탁화제, 유화제, 감미제, 풍미제, 방향제, 보존제, 완충제 등을 함유하고 있어도 좋다.

비경구 투여를 위한 주사제로서는 용액, 현탁액, 유탁액 및 사용시 용제에 용해 또는 현탁하여 사용하는 고형의 주사제를 포함한다. 주사제는 하나 또는 그 이상의 활성 물질을 용제에 용해, 현탁 또는 유화시켜 사용된다. 용제로서, 예컨대 주사용 증류수, 생리 식염수, 식물유, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 에탄올과 같은 알콜류 등 및 이들의 조합이 이용된다. 또한 이 주사제는 안정제, 용해 보조제(글루타민산, 아스파라긴산, 폴리솔베이트80(등록 상표) 등), 현탁화제, 유화제, 무통화제, 완충제, 보존제 등을 포함하고 있어도 좋다. 이들은 최종 공정에서 멸균하거나 무균 조작법에 의해서 조제된다. 또 무균의 고형제, 예컨대 동결 건조품을 제조하여, 그 사용전에 무균화 또는 무균의 주사용 증류수 또는 다른 용제에 용해하여 사용할 수도 있다.

비경구 투여를 위한 그 밖의 제제로서는 하나 또는 그 이상의 활성 물질을 포함하고, 통상의 방법에 의해 처방되는 외용 액제, 연고제, 도포제, 흡입제, 스프레이제, 좌제 및 질내 투여를 위한 페서리 등이 포함된다.

스프레이제는 일반적으로 이용되는 희석제 이외에 아황산수소나트륨과 같은 안정제와 등장성을 부여하는 완충제, 예컨대 염화나트륨, 시트르산나트륨 혹은 시트르산과 같은 등장제를 함유하고 있어도 좋다. 스프레이제의 제조 방법은, 예컨대 미국 특허 제2,868,691호 및 동 제3,095,355호에 자세히 기재되어 있다.

본 발명은,

1) N-[3-N-(4-클로로페닐메틸)카르바모일]프로파노일]-L-프롤리날을 유효 성분으로서 함유하는 운동 기능 장해 치료제,

2) 동 화합물을 유효 성분으로서 함유하는 GAPDH 과잉 발현에 의한 질환 치료제, 및,

본 발명자들은 종래, PPCE 저해제로서 알려져 있던, N-[3-[N-(4-클로로페닐메틸)카르바모일]프로파노일]-L-프롤리날이, 신경 상해성의 운동 기능 장해 모델에 대하여 유효하며, 유의적으로 장해를 개선하는 것을 알아내어, 본 발명을 완성하였다.

본 발명자들은 또, N-[3-[N-(4-클로로페닐메틸)카르바모일]프로파노일]-L-프롤리날이, GAPDH 과잉 발현을 억제하고, age-유발성 아포토시스에 대하여, 강력하고 또한 안정된 억제 작용을 보이는 것을 아울러 알아내었다. N-[3-[N-(4-클로로페닐메틸)카르바모일]프로파노일]-L-프롤리날은 GAPDH mRNA의 유도를 억제하고, GAPDH 단백의 발현을 억제함으로써, 아포토시스를 억제하였다.

이들 사실은 N-[3-[N-(4-클로로페닐메틸)카르바모일]프로파노일]-L-프롤리날의 프롤린엔드펩티다아제(EC 3.4.21.26) 저해 작용으로는 설명할 수 없는 것으로, 새로운 적응을 나타내는 것이다. 실제로, age-유발성 아포토시스 과정에서는 PPCE 활성의 변동이 인정되지 않으므로, PPCE는 관여하지 않고 있다고 생각된다. 또, N-[3-[N-(4-클로로페닐메틸)카르바모일]프로파노일]-L-프롤리날은 CGC의 age-유발성 아포토시스에 있어서, 지나치게 활성화되는 NMDA 수용체를 포함하는 30종 이상의 세포막 표면 수용체에 대하여 영향을 주지 않았다.

실험예

이하에 N-[3-[N-(4-클로로페닐메틸)카르바모일]프로파노일]-L-프롤리날의 운동 기능 장해 억제 작용, 신경 세포사 억제 작용 및 GAPDH 발현 저해 작용을, 실험예로써 상술하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것이 아니다.

실험예 1

척수 압박 모델에 있어서의 운동 기능 장해 억제 작용

방법

위스타(wistar)계 웅성 래트(250 g 전후)를 사용하여, 펜트발비탈나트륨(40 mg/kg, i.p.) 마취하에서, 복와위(腹臥位)로 고정하였다. 제5 요추를 부분 추궁(椎弓) 절제한 후, 제4 및 제6 요추에 실리콘 고무(높이: 1 mm, 길이: 4 mm, 폭: 1.25 mm)를 삽입하였다.

시술 후, 1, 2, 3, 5, 7, 14일째에 트레드밀을 사용하여 최대 보행 거리를 측정하였다.

즉, 트레드밀의 속도를 10 m/min에서부터 시작하여, 그 후 3분마다 5 m/min씩 올려 나가, 동물이 보행 벨트로부터 탈락하여 보행 불가능하게 될 때까지의 시간으로부터 보행 거리를 산출하였다.

결과

표 1에 나타낸 바와 같이, 용매 대조군의 최대 보행 거리는 위(僞) 수술군에 비하여 유의적으로 저하하였다. N-[3-[N-(4-클로로페닐메틸)카르바모일]프로파노일]-L-프롤리날(본 발명 약제) 10 mg/kg 경구 투여군은 시술후 5일째(투여 2일째)부터 연장 경향이 인정되고, 시술후 14일째(투여 11일째)에는 용매 대조군이 133±93 m에 대하여 408±30 m로 유의적인 개선이 인정되었다. 한편, N-[3-[N-(4-클로로페닐메틸)카르바모일]프로파노일]-L-프롤리날(본 발명 약제) 투여에 의해 자발 운동량, 통각 감수성에는 영향이 보이지 않았다.

	최대 보행 거리(m)
	투여 2일째	투여 4일째	투여 11일째
용매 대조군	108±83	118±91	133±93
본 발명 약제(1 mg/kg)	237±49	414±58	347±77
본 발명 약제(1 mg/kg)	p＜0.05
본 발명 약제(10 mg/kg)	329±15	455±34	408±30
본 발명 약제(10 mg/kg)	p＜0.05	p＜0.01	p＜0.01

실험예 2

척수 손상 모델에 있어서의 운동 기능 장해

방법

위스타(Wistar)계 수컷 래트(250∼300 g)를 사용하여 펜트발비탈 마취하에, 등부 한가운데를 절개하고, 흉추(T11) 추궁 절제한 후 경막(硬膜)을 노출시켰다. 금속 기둥(직경: 3 mm, 길이: 40 mm, 무게: 3.8 g)을 경막 상에 놓고, 그 위에 10 g의 추를 10 cm의 높이로부터 원통을 통해서 낙하시킴으로써, 파쇄 장해(crush lesion) 모델을 작성하였다. 그 후, 근층(筋層) 및 피부를 봉합하였다.

행동 이상은 변법 탈로프 스케일(modifications of Tarlov scale)을 이용하여 평가하였다. 즉, 하기 스코어의 좌우 후지(後肢)의 평균 스코어에 의해 평가하였다.

신경 스코어(Neurologic score)

0: 후지 완전 마비

1: 약간 후지의 움직임이 인정됨.

2: 명쾌히 후지가 움직이지만, 체중을 지지할 수 없고 자발 운동도 할 수 없음

3: 양 후지로 배밀기로 걸어 체중을 지지할 수 없음

4: 설 때도 걸을 때도 후지로 체중을 지지할 수 있으나 명쾌하게 무능함

5: 자세, 보행 능력이 정상에 가까움

결과

용매 대조군(도 1 및 도 2 중의 「부형제」), N-[3-[N-(4-클로로페닐메틸)카르바모일]프로파노일-L-프롤리날 투여군(10 mg/kg)(도 1 및 도 2 중의 「본 발명 약제」) 모두 마취 각성후부터 전체예(15예)에 있어서 스코어 0의 후지 완전 마비를 초래하여 후지를 질질 끌면서 걷게 되었다. 시술후 4일째부터, 모든 군에 있어서도 약간의 운동 기능 장해의 회복이 보이며, 시술후 9일째에는 N-[3-[N-(4-클로로페닐메틸)카르바모일]프로파노일]-L-프롤리날 투여군의 회복 정도는 용매 대조군에 비해 우수한 경향을 보이고, 그것은 시술후 21일째까지 지속되었다(도 1 참조). 또, 시술후의 체중 추이도 N-[3-[N-(4-클로로페닐메틸)카르바모일]프르파노일]-L-프롤리날 투여군 쪽이 용매 대조군에 비해서 우수한 경향을 보였다(도 2 참조).

실험예 3

N-[3-[N-(4-클로로페닐메틸)카르바모일]프로파노일]-L-프롤리날의 age-유발성 신경 세포사 억제 작용

실험 재료 및 방법

A) 초대 배양 소뇌 과립 세포(CGC)의 조제

이시타니(Ishitani) 등의 방법에 기초하여, CGC를 다음과 같이 조제하였다(Ishitani et al.J. Neurochem., 66:928-35, 1996).

8일 된 스프라그-다우리계 래트(Sprague-Dawley)로부터 소뇌를 적출하고, 매클웨인(Mcllwain) 티슈쵸퍼로 0.4 mm 각 절편으로 만들었다. 또한, 0.025% 트립신 함유 크레브스-인산 완충액(Krebs-Phosphate buffer(KPB)) 중에서 37℃에서 15분간 소화를 수행하였다.

0.008% 대두 트립신 인히비터(soybean trypsin Inhibitor) 및 0.0016% 데옥시리보누클레아제 I(deoxyribonuclease I) 함유 크레브스 인산 완충액(KPB)으로 반응 정지후, 0.01% 데옥시리보누클레아제 I 및 0.05% 대두 트립신 인히비 함유 크레브스 인산 완충액(KPB) 중에서, 끝이 가는 파스퇴르 피펫으로 트리튜레이션(trituration)을 수행하여, 분산 과립 세포를 얻었다.

이 세포를 10% 소 태아 혈청(FCS), 2 mM 글루타민 50 ㎍/ml 겐타마이신 및 25 mM 염화칼륨(KCl) 함유 변법 이글 배양액(basal modified Eagle's medium(BME))에 현탁하고, 폴리-L-리신(분자량 3∼7×10⁴, 100 ㎍/ml) 도포 플라스틱 샤알레(35 mm) 상에, 2.1×10⁵생세포/cm²의 세포 밀도로 뿌렸다.

탄산 가스 5%(CO₂) 하에 37℃에서 배양을 시작하여, 18∼24 시간 후에 비신경 세포의 증식을 저지하는 목적의 시트신아라비노프라노시드(cytosine arabinofuranoside(10 μM))를 첨가하여 배양을 계속하고, 7DIV(days in vitro)에 각종 약물을 첨가하여, 이후 동일 배지로 배양을 계속하였다.

B) FDA-PI의 생체 이중 염색법에 의한 세포 생존율의 계측

목적 배양 일수의 CGC를, 록 용액(Locke's(154 mM NaCl, 5.6 mM KCl, 2.3 mM CaCl₂, 1.2 mM MgS0₄, 5 mM HEPES, 5.6 mM 글루코스, 3.6 mM NaHCO₃, pH 7.4)) 2 ml로 2회 세정후, 0.0008% 플루오렛센 디아세트산(FDA) 및 0.0002% 요드화프로피듐(PI)로 3∼5분간 염색하였다.

형광 관찰에는 낙사 형광 현미경(Olympus, IMT2-RFL)에 B 여기용 다이클로익 미러(IMT2-DMB), 보조 여기 필터(EY455) 및 보조 흡수 필터(O530)를 장착하여 수행하였다.

FDA는 생세포 중의 에스테라제에 의해 분해하여 형광을 일으키고, 녹∼황색의 한쪽 PI는 사세포막을 투과하여 DNA와 결합함으로써 적∼등색 형광을 발하며, 상기 형광 현미경에 의해 양자를 동시에 관찰하는 것이 가능하다.

세포 생존율(Viability)은 이하의 식에 의해 산출하였다.

세포 생존율=[FDA 염색 세포수/(FDA 염색 세포수+PI 염색 세포수)]×100

결과

초대 배양 CGC는 생후 8일된 래트로부터 조제하여, 25 mM KCl 함유 배양액 중에서 새로운 배양액으로의 교환이나 글루코스의 보충 없이 계속하였다.

도 3에 도시한 바와 같이 16일 DIV까지는 세포사는 거의 검출되지 않지만, 그 후 급격한 세포사를 보였다. 7DIV에 있어서 N-[3-[N-(4-클로로페닐메틸)카르바모일]프로파노일]-L-프롤리날(본 발명 약제)(0.03 μM)을 첨가함으로써, 신경 세포사는 유의적으로 지연되었다. 즉, 17DIV에 있어서의 CGC 미처리 대조군의 생세포수는 28.5±2.2%로 감소하는 데에 대하여 N-[3-[N-(4-클로로페닐메틸)카르바모일]프로파노일]-L-프롤리날(0.03 μM) 처치군에서는 92.0±4.4%에 머물렀다. 즉, age-유발 아포토시스는 본 발명 약제 및 THA 첨가시에 억제되었다.

도 3 중, 「부형제」는 증류수, 「THA」는 9-아미노-1,2,3,4-테트라히드로아크리딘(10 μM)을 첨가한 것을 나타내고 있다.

또, 도 4에 도시된 바와 같이, N-[3-[N-(4-클로로페닐메틸)카르바모일]프로파노일]-L-프롤리날의 신경 보호 작용은 용량 의존적인 것이 인정되었다. 17DIV에 있어서 N-[3-[N-(4-클로로페닐메틸)카르바모일]프로파노일]-L-프롤리날은 수 nM의 농도에서 보호 작용을 보이고, 최대 혹은 그것에 가까운 작용은 0.03에서 1 μM의 사이에서 보였다. 그 후, 10에서 100 μM의 사이에서는 작용이 감소하였다. 한편, THA는 1 μM에서 약 30%, 10 μM의 농도에서는 세포사를 거의 완전히 저해하였지만, 100 μM에서는 중도(重度)의 신경 독성을 보였다. 따라서, age-유발 아포토시스가, 본 발명 약제 첨가에 의해 광범위한 농도 영역에서 용량 의존적으로 억제되었다.

실험예 4

N-[3-[N-(4-클로로페닐메틸)카르바모일]프로파노일]-L-프롤리날의 신경 세포 아포토시스에 따른 GAPDH mRNA 및 단백질의 발현 저해 작용

실험 재료 및 방법

A) 노던 블로트 해석

초대 배양 소뇌 과립 세포(CGC)의 조제는 실험예 3A)에 준하여 수행하였다.

이어서, 후카마우치(Fukamauchi) 등의 방법에 따라서, 목적 배양 일수의 CGC로부터 총 RNA를 추출하였다. 총 RNA(91 ㎍/레인)을 1.2% 아가로스포름알데히드겔로 전기 영동하고, 나일론막(Hybond-N; Amersham)에 전사후, 5×SSPE(750 mM NaCl, 50 mM NaH₂PO₄,5 mM EDTA), 5×덴하르트 용액(Denhardt's solution(0.1% Ficol 400, 0.1% 폴리비닐 피롤리돈, 0.1% BSA)), 50% 포름아미드 50 ㎍/ml 연어 정소 DNA 및 0.5% SDS를 포함하는 용액 중에서 42℃에서 3∼5시간 프리하이브리다이즈(prehybridization)하였다(Fukamauchi et al.J. Neurochem. 56:716-9, 1991, Sunaga et al.Neurosci. Lett. 163:27-30,1993).

멀티프라임 DNA 라벨 키트(Multiprime DNA labelling kit(Amersham))를 이용하여, [α-32p]데옥시티딘-5'-트리포스페이(3000 Ci/mmpl)로 표지한 인간 GAPDH cDNA 프로브(Clontech, Palo Alto, CA, U.S.A.)를 열 변성한 후, 프리하이브리다이즈 용액 중에 첨가하여 42℃에서 24시간 하이브리다이즈(hybridization)를 수행하였다.

막(Membrane)을 0.1% SDS 함유 0.1×SSC(35 mM NaCl, 3.5 mM 시트르산 나트륨, pH7.0) 중에서 60℃에서 10분간 철야 세정을 수행하고, 고감도 엑스레이 필름(ISO3000, Fuji) 상에 노광하여 오토라디오그램을 작성하였다. 정량 해석은 CCD형 이미지 분석기(BIOPROFIL, M&S)로 수행하였다.

B) SDS-PAGE 및 웨스턴 블로트 해석

목적 배양 일수의 배양 세포를(PBS) 2 ml로 3회 세정한 후, 러버폴리스만으로 박리, 4℃ 하에서 188×G로 5분간의 원심 분리에 의해 세포를 회수하였다. 동세포를 빙냉 50 mM 트리스 염산 완충액(pH7.4)에 재현탁한 후, 초음파 처리로 세포막을 파괴하였다.

호모지네이트를 4℃ 하에 2×10⁵×G로 30분간의 원심 분리에 의해 얻은 침사(불용성 분획(pellet))를 동 완충액에 재현탁한 후, 상청(가용성)부와 함께 단백질 정량을 수행하였다.

양 분획을 라에밀리 등의 방법에 따라서, 등량의 2×라에밀리 검체 완충액(Laemmli sample buffer(20% 글리세롤, 4% SDS, 10% 2-머캅토에탄올, 125 mM Tris-HCl 중의 0.005% 브로모페놀 블루, pH6.8))과 혼합하여, 100℃에서 5분간 가열 변성하였다(Laemmli UK.Nature 227:680-5,1970).

동 시료를 8∼16%의 직선 구배 폴리아크릴아미 겔(TEFCO제)로 트리스-글리신 완충액(25 mM Tris, 192 mM 글리신, 0.1% SDS)을 영동 완충액(running buffer)으로서 18 mA 정전류로 전기 영동 처리하였다.

영동후의 겔은 0.1% 쿠마시 블루(coomassie blue)로 염색하였다. 38-k Da 단백질 밴드량의 정량 해석은 CCD형 이미지 분석기(BIOPROFIL, N&S)로 수행하였다. 불용성 분획 단백질의 SDS-PAGE 분석을 한 후, 이시타니 등의 방법에 의해 PVDF막(polyscreen TM, NEN) 상에 일렉트로 블로팅하였다(Ishitani et al.,Mol. Phamacol. 51:S42-50, 1997).

전사후의 PVDF막을 0.5% 스킴 밀크(skim milk) 함유 TBS-T(20 mM Tris, 137 mM NaCl, 0.05% Tween 20, pH7.4) 중에서 60분간 블로킹(blocking)을 수행한 후, 일차 항체(anti-rabbit GAPDH 모노클로날 항체 1:15000 희석)를 포함하는 TBS-T 중에서 실온에서 60분간 반응시켰다. TBS-T로 세정한 후, 같은 식으로 2차 항체(퍼옥시다아제-접합 토끼 항마우스 Ig 항혈청(peroxydase-conjugated rabbitt anti-mouse Igs, Dako, Glostrup, Denmark))을 반응시켰다. PVDF 막을 세정한 후, 화학 발광 검출시약(Renaissance TM, NEN)을 사용하여 고감도 엑스레이 필름 상에서 GAPDH 단백질의 정량을 수행하였다.

결과

1. 본 발명자들은 CGC의 age-유발성 아포토시스에 있어서 GAPDH mRNA의 증가 및 막 분획에 있어서의 GAPDH 단백질의 축적이 관여하고 있음을 보고하였다(Ishitani et al.,J. Neurochem. 66:928-35, 1996). 그러므로, N-[3-[N-(4-클로로페닐메틸)카르바모일]프로파노일]-L-프롤리날의 신경 보호 작용의 메카니즘 해명의 제1단계로서 전처치한 두 약물이, 아포토시스 과정에서의 GAPDH mRNA의 증가 및 막 분획에 있어서의 GAPDH 단백질의 축적에 영향을 주는지의 여부를 검토하였다.

도 5에 도시한 바와 같이 N-[3-[N-(4-클로로페닐메틸)카르바모일〕프로파노일]-L-프롤리날은 7DIV의 첨가에 의해 15DIV(CGC)에 있어서의 GAPDH mRNA의 2∼3배의 증가를 완전히 억제하였다. 도 5에서, C는 대조군을, O는 본 발명 약제를, T는 THA를 나타낸다.

2. CGC 호모지네이트의 원심 분리막 분획 및 세포질 분획 단백질의 SDS-PAGE 분석을 행한 후, 웨스턴 블로트 분석을 수행하였다. 도 6에 도시되어 있는 바와 같이 SDS-PAGE 분석, 웨스턴 블로트 분석의 결과, CGC의 age-유발성 세포사의 과정에서 38-kDa 단백질, 즉 GAPDH의 레벨이 약 2배 증가하는 것이 분명하게 되었다.

N-[3-[N-(4-클로로페닐메틸)카르바모일]프로파노일]-L-프롤리날 처리를 함으로써, 본 단백질의 증가는 억제되었다. 더욱 주목할 것은 CGC 상청 분획에 있어서의 GAPDH 레벨은 age-유발성 세포사의 과정, 또한 이들 약물 처리에 의해서도 변화하지 않았다(도 6 참조). 도 6에서, C는 대조군을, O는 본 발명 약제를, T는 THA를 나타낸다.

제제 실시예

정제의 제조

이하의 화합물을 통상의 방법에 의해 혼합하고, 타정하여 1정 중에 6 mg의 활성 성분을 함유하는 나정(裸錠)을 얻은 후, 히드록시프로필메틸셀룰로오스(HPMC)로 코팅하여 필름 코팅정 100정을 얻었다.

·N-[3-[N-(4-클로로페닐메틸)카르바모일]프로파노일]-L-프롤리날 --- 600 g

·국방 유당 -------------------------------------------------- 14.18 g

·부분 α화 전분(PCS) ---------------------------------------- 600 mg

·폴리히드록시프로필셀룰로오스(HPC) -------------------------- 300 mg

·경질 무수 규산 ---------------------------------------------- 40 mg

·티오황산나트륨·5수화물 ------------------------------------- 200 mg

·스테아린산마그네슘 ------------------------------------------ 80 mg

Claims

N-[3-[N-(4-클로로페닐메틸)카르바모일]프로파노일]-L-프롤리날을 유효 성분으로서 함유하는 운동 기능 장해 치료제.
제1항에 있어서, 운동 기능 장해가 척수 손상에 의한 것임을 특징으로 하는 치료제.
제1항에 있어서, 운동 기능 장해가 척수 압박에 의한 것임을 특징으로 하는 치료제.
제1항에 있어서, 운동 기능 장해가 뇌 허혈에 의한 것임을 특징으로 하는 치료제.
제1항에 있어서, 운동 기능 장해가 말초 신경 상해에 의한 것임을 특징으로 하는 치료제.
N-[3-[N-(4-클로로페닐메틸)카르바모일]프로파노일]-L-프롤리날을 유효 성분으로서 함유하는, 글리세르알데히드-3-포스페이트데히드로게나아제(GAPDH) 과잉 발현에 의한 질환 치료제.
제6항에 있어서, GAPDH 과잉 발현에 의한 질환이 파킨슨병 및 파킨슨 증후군인 것을 특징으로 하는 치료제.
제6항에 있어서, GAPDH 과잉 발현에 의한 질환이 헌팅톤병인 것을 특징으로 하는 치료제.
제6항에 있어서, GAPDH 과잉 발현에 의한 질환이 마샤드죠세프병인 것을 특징으로 하는 치료제.
제6항에 있어서, GAPDH 과잉 발현에 의한 질환이 근위축성 측삭경화증인 것을 특징으로 하는 치료제.
제6항에 있어서, GAPDH 과잉 발현에 의한 질환이 클로이츠펠트야콥병인 것을 특징으로 하는 치료제.
N-[3-[N-(4-클로로페닐메틸)카르바모일]프로파노일]-L-프롤리날을 유효 성분으로서 함유하는 아포토시스 억제제.