KR20010071453A - 식세포의 분석 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 어떤 화합물이 아폽토틱 세포의 식작용을 촉진하는 시그널 형질도입 경로의 인헨서(enhancer)인지 또는 저해제(inhibitor)인지를 결정하는 분석 방법을 제공한다. 상기 방법은 식세포를, 선택적으로 리포터 유전자로 형질감염된, 아폽토틱 세포에 노출하는 단계 및 상기 테스트 화합물의 존재 또는 부재중에서 식작용의 정도를 측정하는 단계를 포함한다. 발현벡터는 인간의 상동기관인C. elegansced-6 유전자 같이 발현시에 아폽토틱 세포의 식작용의 비율에 영향을 주는 DNA 서열을 가진 포유류 세포를 형질감염시키기 위해 제공된다.
Description
생 조직의 발생 및 유지기간 동안 많은 세포들은 세포 예정사 또는 아폽토시스를 경험한다. 전술한 것은 척추동물 및 무척추동물 모두에서 관찰된다. 예를 들면, 이것은 선충C. elegans 131세포가 세포 예정사를 경험하는 것에서 보여졌다(루이 및 헹가트너(Lui and Hengatner) (1997) 1997 초반 International Worm Meeting, Abstract 371). 아폽토틱 세포의 용해는 그 내용물이 주위 조직들에 독성의 해를 끼칠지도 모르기 때문에 잠재적으로 위험하다. 전술한 해로운 영향은 아폽토틱 세포가 다른 세포에 의해 잡아먹혀서 분해되기(degraded) 때문에 없어지는 것으로 관찰되어져왔다. 포유류에서, 잡아먹는(engulfing) 호중구나 마크로파지 (macrophage) 또는 상기 빈사 세포(dying cells)의 이웃일 수도 있는, 전문적 또는 준-전문적인(semi-professional) 식세포일 것이다.
세포 예정사 또는 아폽토시스 과정의 중요한 특징은 빈사 세포가 식세포에 의해 인식되고 잡아먹히는 효율이다(사빌 J. 등( Savill J. et al.), Immunol Today, 14:131~136, 1993). 아폽토시스는 세포 표면의 포스파티딜세린 (phosphatidylserine) 발현, DNA 단편화 또는 래더링(laddering), 및 아폽토틱 블렙(apoptotic blebs)과 바디(bodies)로 불리는 막-결합(membrane-bound) 세포 단편들의 방출로 특징지어지는 일련의 독특한 사건들을 유발한다(코헨 J.J 등(Cohen J.J. et al.), Annu Rev Immunol, 10:267-293, 1992; 케르 J.F.R. 등(Kerr J.F.R. et al.), Br J Cancer, 26:239, 1972). 아폽토틱 세포 및 바디는 포스파티딜세린 및 아폽토틱 물질 표면의 독특한 기타 미확인된 리간드를 인식하는 다양한 수용체들을 통하여 탐식된다(사빌, J.S. 등(Savill, J.S. et al), J Clin Invest, 83:865-875, 1989; 패독 V.A. 등(Fadok, V.A. et. al, J. Immunol, 148:2207-2216,1992; 사빌 J. 등(Savill, J. et al) Nature, 343:170-173, 1990). 이러한 방법으로 잠재적인 염증성 요소들을 포함한 아폽토틱 세포는 준-전문적인 식세포로 작용하는 이웃 세포 또는 염증성 응답을 유발시킴 없이 마크로파지 계통의 맹렬한 전문가들에 의해 빠르게 제거된다(패독 V.A. 등(Fadok,V.A. et. al, J Clin Invest, 101:890-898, 1998).
아폽토시스의 과정은 암, 자가면역의 질병, 근위축성 외측 경화증, 헌팅턴병과 알쯔하이머병과 같은, 다양한 신경퇴행성의 질병들, 발작, 심근 경색증 및 에이즈를 포함하는 많은 인간의 질병들과 관련되어 있다(톰슨(Thompson), CB, Science267, pp 1456-1462). 따라서, 상기 질병들에 대한 치료법적 전략 발전의 관점에서 이들을 조절하는 유전자 및 아폽토시스의 기작을 밝히는데 많은 주의가 집중되어져 왔다.
특이한 질병들은 아폽토틱 바디의 식작용 손상과 관련되어 있다. 이런 질병들의 예는 전신 낭창 홍반증(헤르만 M. 등(Herrmann, M. et. al), Arthritis Rheum, 41:1241-1250, 1998), 에이즈(족치 M.R. 등(Zocchi, M.R. et. al), AIDS, 11:1227-1235, 1997), 급성 폐질환 전염병들(콕스 G. 등(Cox, G. et. al), Am, J Respir. Cell Mol. Biol., 12:232-237, 1995) 및 알러지(잉 S. 등(Ying, S. et. al), Proc Assoc Am Physicians, 109:42-50, 1997)와 같은 자가 면역의 질병들을 포함한다. 약물에 의한 아폽토틱 세포의 식작용의 변형은 미래 치료법들에 대해 가망 있는 전략임이 분명하다.
척추동물에 있어서 아폽토틱 세포의 식작용은 매우 복잡한 과정인 것으로 관찰되어져 왔으며 빈사 세포에 의해 발생된 시그널이 상기 잡아먹는 세포에 의해 어떻게 수신되고 변환되는지 알지 못한다.
아폽토틱 세포의 빠른 잡아먹힘(engulfment)은 자웅동체의C. elegans에서 관찰되고 이러한 연충은 잡아먹힘 과정 연구에 있어서 유용한 도구를 제공해 왔다. 예를 들어,C. elegans에서 ced-1, ced-2, ced-5, ced-6, ced-7 및 ced-10으로 알려진 여섯 개의 유전자들은 잡아먹힘을 초래하는 것으로 확인되었다. 특정 연구를 위해서 본 발명자는 이들 중 ced-6을 선택하였다. ced-6이C. elegans에서 daf-4 근처의 염색체 Ⅲ(chromosome Ⅲ)에 위치한다고 알려져 있다(루이 및 헹가트너(Lui and Hengartner, 1997; 루이 및 헹가트너, 1996, East Coast Worm Meeting Abstract 128). 그와 같은 작업은 이러한 영역으로부터 두 개의 코스미드(cosmids) F56D2 및 F43F12가 ced-6(n1813)의 잡아먹힘 결함이 있는C. elegans를 구조할 수 있다고 나타났다. 구조 활성을 가진 F56D2로부터의 10 kb XhoⅠ서브클론(subclone)은 ced-6 유전자를 운반함으로써 확인되었다.
본 발명은 세포 예정사(programmed cell death) 또는 아폽토시스(apoptosis)의 분야와 관련되어 있고 특히 그 현상으로써 아폽토틱 세포(apoptotic cells)는 다른 세포들에 의해 빠르게 탐식되거나(phagocytosed) 잡아먹히게 된다(engulfed). 구체적으로 말하면, 본 발명은 아폽토틱 세포의 식작용을 측정하는데 사용하는 분석과 물질을 제공한다. 이러한 분석은 아폽토틱 세포의 상기 식세포 흡수에 영향을 주고 잠재적 약리 활성을 가지는 화학적 물질들을 동정하는데 쓰일 수 있다. 본 발명의 분석은 멀티-웰 플레이트 형(multi-well plate format)을 사용하는 중간- 및 많은-처리량의 스크리닝(medium- and high- throughput screening)에 아주 적합하다.
다음에 오는 비-제한적인 실시예에서 하기 도면들에 대해 언급된다:
도 1은 EST, RACE 및 콜로니(colony) 혼성화로부터 얻을 수 있는 2416bp의 공통 서열(consensus sequence)의 구조를 보여준다(실시예 1 참조). 상기 서열은 템플리트(template)로서 a159394와 멀티플 얼라인먼트(multiple alignment)에서 나타난 것과 같은 프라이머를 사용함으로써 모인다. rcc는 역보체(reverse compliment)를 상징한다. ced-6 및 hced-6 모두는 상기 멀티플 얼라인먼트 위에 표시되고; pGA101은 콜로니 혼성화에 의해 얻어졌다;
도 2는 h1ced-6의 공통 DNA 서열(2416 bp)을 보여준다. 개시 및 정지 코돈은 볼드체로 밑줄 그어져 있다. 택일적으로, 스플라이스된 영역(spliced region)이 밑줄 그어져 있다;
도 3은 상기 h2ced-6의 택일적으로 스플라이스된 DNA 서열(spliced DNA sequence)을 보여준다. 개시 및 정지 코돈은 볼드체로 밑줄 그어져 있다;
도 4는 hCED-6의 아미노산 서열을 보여준다. 잔기의 수는 304개, 분자량 34.4kDa이다. 또 상기 택일적으로 스플라이스된 영역이 밑줄 그어져 있다;
도 5는 상기 택일적으로 스플라이스된 버전(spliced version)인 h2CED-6의 아미노산 서열을 보여준다;
도 6은 실시예 3에서 기술된대로 생성된 상기 네스티드된 PCR 생성물의 겔 분석을 보여준다; 레인들은 다음과 같이 로드(loaded)된다: (1)100bp 마커, (2) 1차(primary) 살아있는 호중구, (3) 1차 아폽토틱 호중구, (4) 1차 마크로파지, (5) 아폽토틱 호중구와 상호 작용하는 1차 마크로파지, (6) J774, (7) COS-1 및 (8) THP-1;
도 7은 실시예 4와 8에 사용된 것과 같은 리포터 유전자 GFP를 포함하는 상업적으로 구입 가능한 클론테크 벡터 pEGFP-N3의 DNA 서열을 보여준다;
도 8은 pEGFP-N3의 플라스미드 지도를 보여준다;
도 9는 상기 pEGFP-N3 멀티클로닝 부위에서 h1ced-6을 포함하는, 실시예 4와 8에 사용된 것과 같은, 플라스미드 pGA3104의 DNA 서열을 보여준다;
도 10은 pGA3104의 플라스미드 지도를 보인다;
도 11은 Ba/F3 세포의 안정한 형질감염에 사용되는 상업적으로 구입 가능한 플라스미드 pcDNA3.1/His/LacZ의 DNA 서열을 보여준다;
도 12는 β-갈락토시다제가 상기 플루오로제닉 기질인 플루오르세인 디-b-D-갈락토피라노이드(di-b-D-galactopyranoside, FDG)와 반응할 때 형질감염된 세포 농도(concentration)의 함수로서 형광 세기를 보인다;
도 13은 실시예 5 분석의 리드-아웃(read-out)에 대한 (FDG) 농도의 영향을 보여준다;
도 14는 실시예 5의 분석의 리드-아웃에 대한 배양(incubation) 시간의 영향을 보여준다;
도 15는 실시예 5의 분석에 대한 Ba/F3 세포의 배지내 혈청 농도의 영향을 보여준다;
도 16은 폴리클로날(polyclonal) 항체를 생산하는데 사용된 h1CED-6 내의 상기 에피토프의 위치를 보여준다;
도 17은 실시예 7에 사용된 플라스미드 pGA1028 (pBAD/His A/-hced-6)의 DNA 서열을 보여준다;
도 18은 pGA 1028의 플라스미드 지도를 보여준다;
도 19는 리포터 유전자 루시페라제가 Ba/K3 세포내로 도입하는데 적합한 상업적으로 구입 가능한 프로메가 플라스미드 pGL2의 DNA 서열을 보여준다;
도 20 내지 25는 실시예 7에서 수행된 이뮤노블롯(immunoblots)의 결과들을 보여준다. 모든 도에서 레인은 다음과 같이 로드된다:
레인 1 : 낮은 범위의 미리 염색된 SDS - PAGE 표준(Prestained SDS - PAGE Standards)(Bio Rad - Hercules, CA, 미국)
레인 2 : pBAD/His A (Invitrogen, Leek, 네덜란드)
레인 3 : pGA1028 (pBAD/His A/-h1ced-6)
도 20은 실시예 7에서 동정된 에피토프 EP 990044에 대한 항체 및 대조 항체인 항-Xpress Ab(Invitrogen, Leek, 네덜란드) 및 마우스 1g, 호올스래디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase)가 결합된 전체 항체(양으로부터)로 염색된 겔을 보여준다(ECL 웨스턴 블로팅(Western blotting) 검출 시약 및 분석 시스템, 아메리샴 파마시아 바이오테크, UK. 잉글랜드);
도 21은 에피토프 990044에 대한 항체 및 실시예 7에 기술된 면역 혈청으로 염색된 겔을 보여준다;
도 22는 실시예 7에서 동정된 에피토프 990045에 대한 항체 및 도 20에 설명된 대조 항체를 보여준다;
도 23은 에피토프 990045에 대한 항체 및 실시예 7에 기술된 면역 혈청으로 염색된 겔을 보여준다;
도 24는 에피토프 990046에 대한 항체 및 도 20에 설명된 대조 항체로 염색된 겔을 보여준다;
도 25는 에피토프 990046에 대한 항체 및 실시예 7에 기술된 면역 혈청으로 염색된 겔을 보여준다;
도 26은 실시예 8에 사용된 리포터 유전자 GFP를 포함하는 상업적으로 구입 가능한 클론테크 벡터 pEGFP-C2의 DNA 서열을 보여준다;
도 27은 pEGFP-C2의 플라스미드 지도를 보여준다;
도 28은 pEGFP-C2의 멀티클로닝 부위내에 h1ced-6을 포함하는 실시예 8에 사용된 것과 같은 플라스미드 pGA3103의 DNA 서열을 보여준다;
도 29는 pGA3103의 플라스미드 지도를 보여준다;
도 30은 MOCK(형질감염에 대한 음성 대조구(negative control)), pEGFP-N3, pGA3103 및 pGA3104로 형질감염된 COS-1 세포로부터의 세포 리세이트(lysates); 첫 번째 항체가 있거나 또는 없는 상태에서 배양된 Ba/F3 세포로부터의 실제 공동면역 침강반응(co-immunoprecipitation)에 대한 대조 리세이트; 항-포스포티로신 항체에 대한 EGF-자극된 A431 세포 리세이트로부터의 양성 대조 리세이트의 웨스턴 블롯을 보여준다. 블롯 A는 세포 리세이트내의 티로신-인산화(tyrosine-phosphorylated) 단백질을 검출하는 마우스 모노클로날(monoclonal) lgG2로 탐침되었고; 블롯 B는 녹색 형광 단백질과 반응하는 폴리클로날(polyclonal) 항체로 탐침되었고; 블롯 C는 h1ced-6에 대한 토끼 면역혈청(immune serum)으로 탐침되었다. h1CED-6의 분자량은 34435.39이고; GFP의 분자량은 26886.32이고; 융합 단백질 GFP-CED-6 또는 CED-6-GFP의 분자량은 62385.95이다;
도 31은 pEGFP-N3의 멀티클로닝 부위에 삽입되는 세포 표면 수용체 CD36을코딩 DNA 서열을 포함하는 플라스미드 pGA1058의 DNA 서열을 보여준다;
도 32는 pGA1058의 플라스미드 지도를 보여준다;
도 33은 IL-3의 회수 후에 시간의 함수로서 Ba/F3 세포의 세포 집단(population) 내의 아넥신과 프로피디움 아이오다이드 양성 세포의 백분율을 보여준다;
도 34는 FDG 배양에 대한 온도 영향을 보이고, 생존한 그리고 아폽토틱한 Ba/F3 세포는 마크로파지 세포주 J774에 가해진다. 식작용 분석 후에, FDG(10 μM)는 4℃ 및 20℃에서 1 시간 동안 그리고 37℃에서 10분 및 20분 동안 배양되었다.
본 발명자들은 두 개의 인간 상동기관C. elegansced-6의 h1ced-6 및 h2ced-6을 확인하였고, h2ced-6은 h1ced-6의 스플라이스 변형체(splice variant)이고 그것의 유력한 네거티브 버전(a dominant negative version)이라고 생각하였다. 두 상동기관은 인간의 세포주(cell-line) THP-1에 존재하는 것으로 나타난다. hCED-6과C. elegansCED-6 사이에 놀랄 정도의 서열 상동 관계가 발견되었다. hCED-6은 티로신 키나아제 시그널 형질변환 경로(signal transduction pathway)에서 그것의 연관성을 제시하는 도 4에 도시된 바와 같은 약 아미노산 위치 11에서 약 아미노산 위치 190까지의 포스포티로신 결합 영역을 가진다.
h1CED-6과 h2CED-6 단백질 및 그들의 코딩 핵산은 아폽토틱 세포의 식작용을 촉진하는 시그널 형질도입 경로 저해제(inhibitors) 또는 인헨서(enhancers)인 화합물들을 동정하기 위해 본 명세서에 기술된 대로의 분석을 수행하는데 유용하다.특히 그것들은 h1CED-6과 h2CED-6의 저해제 또는 인헨서 또는 그들의 전사 저해제나 인헨서를 동정하는데 있어서 유용하다. 이러한 저해제나 인헨서는 전술한 질병들 중 약간의 질병을 치료하는데 있어 유용한 치료 약제일 수도 있다.
본 발명의 첫 번째 측면에 따르면 본 발명은 h1CED-6 또는 h2CED-6을 발현할 수 있는 발현벡터를 제공하는 것인 바, 이 벡터는 도 4 또는 도 5의 아미노산 서열 또는 생물학적 기능(biological function)을 보존하고 있는 아미노산 변이(amino acid changes)에서만 도 4 또는 도 5의 아미노산 서열과 다른 아미노산 서열을 코딩하는 데옥시뉴클레오티드의 서열을 포함한다.
본 명세서에서 "생물학적 기능"이라는 용어는 아폽토틱 세포의 식작용을 조절하거나 영향을 미칠 수 있는 능력을 의미하는 것으로 정의된다. "보존되는(conservative)" 아미노산 변이는 비록 상기 와일드-타입(wild-type) 인간 CED-6 단백질의 생물학적 기능의 레벨(level)보다 낮거나 또는 높을 수 있지만, 생물학적 기능이 유지되도록 허용된 것이다. 이러한 보존되는 변이는 하나 또는 그 이상 아미노산의 삽입이나 제거 또는 하나 또는 그 이상의 아미노산을 비슷한 화학적 특성을 갖는 또다른 아미노산 또는 산들로 치환하는 것을 포함할 수 있다. 보존되는 변이를 만들기 위해서 아미노산을 선택하는 것은 당업자에게 잘 알려진 공지기술일 것이다.
바람직한 구현예에서, 발현벡터는 도 2 또는 도 3에 도시된 전사 개시코돈(start codon)에서 전사 정지코돈(stop codon)까지 보여진 데옥시뉴클레오티드의 서열을 포함하는 것이고 선택적으로 도 2 또는 도 3에 도시된 데옥시뉴클레오티드의 서열을 포함하는 벡터이다.
특히 바람직한 구현예에서 본 발명의 발현벡터는 h1CED-6 또는 h2CED-6의 발현이 리포터 유전자(reporter gene)의 발현으로 되도록 위치가 정해진 리포터 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드들의 서열을 포함한다. 리포터 유전자는 상기 h1ced-6 또는 h2ced-6에 대해서 3' 또는 5'에 위치될 수 있고 h1CED-6 또는 h2CED-6과의 융합 단백질로서 발현될 수도 있다. 적합한 리포터 유전자는 녹색형광단백질(Green fluorescent protein, GFP)과 같은 형광성 물질을 발현하는 것들이다. 다른 적합한 리포터 유전자는 β-갈락토시다제(β-galactosidase) 또는 루시페라제(luciferase)와 같은 효소이며, 이는 예로써 형광 물질 또는 발광 물질과 같은 검출 가능한 물질을 생산하는 기질 위에 작용할 수 있는 것들이다. 본 발명에 따른 발현벡터의 예는 도 29 및 도 10에 각각 보여진 pGA3103 및 pGA3104이다.
또다른 바람직한 구현예에서 본 발명의 발현벡터는 h1CED-6 및 h2CED-6 단백질의 아미노 말단 및/또는 카르복시 말단에서 에피토프 태그(epitope tag)를 발현한다. 한 예는 도 17에 보여진 플라스미드 pBAD/HisA-h1ced-6의 DNA 서열이다.
상술된 발현벡터는 h1CED-6이나 h2CED-6 또는 그것의 기능적 변형체를 코딩하는 핵산 뿐만 아니라 DNA 단편 발현에 영향을 미칠 수 있는 프로모터 영역(promoter regions)과 같은, 상기 핵산에 기능적으로 연결된 조절(regulatory) 서열 또한 포함하는 것으로 이해될 것이다. "기능적으로 연결된" 이라는 용어는 상술된 구성 요소들이 그것들의 의도된 방식대로 기능하도록 허락되는 관계에 있는 병치(juxtaposition)를 말하는 것이다.
발현에 필요한 조절 요소는 RNA 폴리메라제에 결합하고 리보솜 결합을 위해서 전사 개시 및 번역 개시 서열의 적당한 레벨을 정하는 프로모터 서열들을 포함한다. 예를 들면, 박테리아의 발현벡터는 랙(lac) 프로모터와 같은 프로모터 및 번역 개시를 위해 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 서열 및 개시 코돈 AUG를 포함할 수도 있다. 비슷하게, 진핵세포의 발현벡터는 RNA 폴리메라제 Ⅱ에 대한 이종 또는 동종 프로모터, 하류 폴리아데닐레이션(polyadenylation) 시그널, 개시 코돈 AUG 및 리보솜의 분리를 위한 종결 코돈(terminal codon)을 포함할 수도 있다. 이러한 벡터는 상업적으로 얻어질 수도 있고 또는 당업계에 잘 알려진 공지 방법에 의한 서열로부터 집합된 것 일수도 있다. 본 발명의 발현벡터에 사용될 수도 있는 프로모터 서열은 ΔHSP, CMV, SV40, EF-1α, UbC, SG, RSV, TRE/minCMV, HSV TK, 5', LTR 및 QBISP136 증진된 CMV를 포함한다.
본 명세서에 기술된 발현벡터의 예는 플라스미드이지만 또한 바이러스 또는 파지(phage) 벡터일 수도 있다. 이러한 벡터는 통상적으로 복제기점(origin of replication) 및 항생물질의 저항에 대한 유전자와 같은 하나 또는 그 이상의 선택 가능한 마커(markers)를 소유할 것이다. 본 발명의 발현벡터가 포유류 세포의 형질감염(transfection)에 적합하고 따라서 상기 발현벡터에 적절하게 선택 가능한 마커를 제공할 수 있는 것이 특히 바람직하다.
두 번째 측면에 따르면 본 발명은 상기 기술된 발현벡터들 중 어느 것에 의해 형질감염된 포유류 세포주를 제공한다. 포유류 세포를 형질감염 시키는 방법은 당업자에게 잘 알려진 공지 방법이다. 세포주는 단층 배양 또는 현탁액 배양에서성장할 수 있는 것일 수 있다. 적합한 세포주는 COS1, BHK21, L929, pc12, CV1, SWISS3T3, HT144, IMR32, HEPG2, MDCK, MCF7, 293, Hela, A549, SW48 또는 G361 같은 상피 세포주 또는 섬유아세포 세포주이다. 인간 피부의 FIBs, 피부의 케라티노사이트(keratinocytes), 백혈구, 단구(monocytes), 임파구, 수지상 세포(dendritic cells) 또는 마크로파지와 같은 1차 세포주가 또한 사용될 수도 있다. 본 발명의 식작용 분석에 사용되기에 특히 바람직한 것은 전문적 또는 준-전문적인 포유류 식세포이며, 그 예로는 h1CED-6 또는 h2CED-6을 발현한다고 보여진 마우스 마크로파지 세포주 J774 또는 인간 단구 세포주 THP1이다(실시예 3과 도 6 참조). 상기 두 개의 세포주는 모두 단구라고 말할 수 있는데, 왜냐하면 단구가 본 발명의 분석에 사용되는 형태인 마크로파지로 분화할 수 있기 때문이다.
세 번째 측면에 따르면 본 발명은 어떤 화합물이 아폽토틱 세포의 식작용을 촉진하는 시그널 형질도입 경로의 저해제인지 인헨서인지를 결정하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 위에 상술된 h1ced-6 또는 h2ced-6으로 형질감염된 포유류 세포를 아폽토틱 입자에 노출시키는 단계와 상기 화합물의 존재 또는 부재중에서 상기 형질감염 세포에 의한 상기 입자의 식세포의 흡수 비율을 측정하는 단계를 포함한다. 상기 테스트 화합물은 상기의 아폽토틱 입자들이 첨가되기 전에 첨가되는 것이 바람직하다.
적합한 아폽토틱 입자는 아폽토틱되어 있으면서 선택적으로 혈청에 노출됨으로써 옵손화되는 호중구(neutrophils), 임파구, 적혈구, 또는 수지상 세포와 같은 세포이다. 아폽토틱 입자를 형성하는데 적합한 세포는 세포주 L929 및 PC12를 포함한다. 아폽토틱 입자로 사용하기에 특히 바람직한 세포주는 성장 인자 의존성 마우스 세포주 Ba/F3이다. 이것들은 실시예 5에서 설명된 것처럼 표준 배양 배지에서 성장할 수도 있고 사용하기 전에 적정 기간(예를 들면 약 20시간) 동안 성장 인자 IL-3의 부재하에서 성장함으로써 아폽토틱될 수 있다.
상기 세포의 아폽토틱 상태는 예를 들어, 베링거 만하임(Boeringher Mannheim)(부뤼셀, 벨기에)으로부터 구입할 수 있는 유용한 아넥신/프로피디움 아이오다이드 표지 키트(annexin/propidium iodide labelling kit)를 사용하여 결정될 수 있다. 만약 세포들이 약 20% 아넥신에 양성(annexin positive)이고 약 5% 미만의 프로피디움 아이오다이드에서 음성(propidium negative)이면 세포는 초기에 아폽토틱된 것으로 간주된다.
PC12 세포주는 신경 성장 인자 부재중의 표준 배지에서의 성장에 의해 아폽토틱될 수도 있다.
상기 기술된 세포에 대한 대안으로서, 아폽토틱 입자는 염료-표지된(dye-labelled) 라텍스 비드와 같은 비-생 물질(a non-living material)일 수 있다. 아미노기 또는 카르복시화기를 가진 0.1 μM, 1 μM, 4 μM 및 10 μM 비드(beads)는 벨기에 보르넴(Bornem)의 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) 또는 미국 유진(Eugene)의 몰레큘러 프로브스(Molecular Probes)로부터 구입할 수 있다.
상기 기술된 분석이 많은 처리량 화합물 스크리닝에 적합해지기 위해서 아폽토틱 입자가 형질감염된 포유류 세포에 의해 흡수되는 것을 쉽게 알 수 있고 이것이 정량화될 수 있도록 어떤 종류의 검출 가능한 표지를 가지는 것이 바람직하다.본 발명자는 이것이 리포터 유전자를 포함하는 발현벡터로 아폽토틱 입자를 포함하는 세포를 안정하게 형질감염 시킴에 의해 쉽게 얻어질 수도 있다는 것을 발견하였다. 특히 적합한 리포터 유전자는 코딩하여 플루오로제닉 기질(fluorogenic substrate)인 플루오르세인 디-b-D-갈락토피라노이드(fluorescein di-b-D-galactopyranoide)를 표준 형광 검출 장치를 사용하여 관찰할 수도 있는 형광성 화합물로 쪼갤 수 있는 β-갈락토시다제가 된다. 다른 형광 기질들이 β-갈락토시다제로 이용될 수 있다. β-갈락토시다제를 발현하고, 예를 들어 Ba/F3와 같은 아폽토틱 입자로 사용된 세포들을 형질감염 시키기에 적당한 플라스미드 pcDNA3.1/HIS/lacz는 도 11에 도시되어 있다. 다른 적합한 리포터 유전자들은 루시페라제 같은 발광 시그널을 생성할 수 있는 녹색형광단백질 또는 단백질들과 같은 형광 단백질을 코딩하는 것들이다. 클론테크(Clontech)에서 구입할 수 있는, 플라스미드, pEGFP-N3 또는 PEGFP-C2는 아폽토틱 입자로 사용되는 세포를 GFP로 형질감염하기에 적합하며 도 7, 8, 26 및 27에 도시되어 있다. 프로메가(Promega)로부터 구입할 수 있는 플라스미드 "PGL Control"은 루시페라제를 코딩하는 유전자로 Ba/F3 세포와 같은 아폽토틱 입자로 사용되는 세포를 형질감염하기에 적합하다. 상기 "PGL Control"의 DNA 서열은 도 19에 도시되어 있다.
아폽토틱 입자에 대한 리포터 유전자의 선택은 형질감염된 포유류 세포에 있는 어떤 리포터 유전자의 존재에 의해 결정될 수도 있음이 인식될 것이다. 예를 들면, h1 또는 h2 ced-6으로 형질감염된 형질감염 포유류 세포 및 아폽토틱 세포에서 동일 리포터 유전자의 존재는 시그널의 겹침 때문에 확실히 바람직하지 않지만, 이는 항상 그러한 것은 아닐 수 있다.
광범위하고 다양한 화합물들은 아폽토틱 세포의 식작용을 촉진하는 시그널 형질도입 경로의 저해제인지 또는 인헨서인지 알아보기 위해 테스트될 수 있음이 더욱 인식될 것이다. 상기 화합물은 고분자(polymer) 또는 단량체(monomer)의 어떠한 화학식일 수도 있다. 예를 들면, 상기 테스트 화합물은 게놈의(genomic) DNA, cDNA, RNA, PNA, 단백질 또는 폴리펩티드, 아미노산, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드일 수 있다. 상기 화합물은 공지된 생물학적 또는 약리 활성의 화합물, 그러한 활성이 없는 공지 화합물 또는 화합물의 컴비네토리얼 라이브러리(combinatorial library)에 존재하고 있을 수 있는 신규한 분자일 수도 있다.
어떤 화합물의 존재가 상기 형질감염된 포유류 세포에 의해 아폽토틱 입자의 잡아먹히는 양이 없거나 또는 감소하게 하는 경우에, 이런 세포는 반드시 생존능력(viability)에 대해 테스트되어져야 한다. 생존가능한 세포(viable cells)의 존재는 잡아먹힘 결핍이 식세포 활성에 대한 상기 테스트 화합물의 영향에 의한 것이며 단지 비-특이적인 독성 때문만은 아니라는 것을 입증할 것이다.
더 나아가서, 상술된 분석에 의해 아폽토틱 세포들의 식작용의 저해제 또는 인헨서로 동정된 어떤 화합물은 상기 영향이 CED-6으로 치료될지 아닐지 확립되도록 더 테스트될 것이다. 아폽토틱 세포들의 식작용의 인헨서로 동정된 화합물의 경우 이것은 h1ced-6 또는 h2ced-6으로 형질감염되지 않은 포유류 세포로 상술된 것과 똑같이 식작용 분석을 수행함에 의하여 달성될 수 있다. 만약 h1ced-6으로 형질감염될 때 이들 세포의 표현형과 유사한 형질감염되지 않은(untransfected) 세포에서 표현형을 유발할 수 있다면, 이것은 당해 화합물이 CED-6을 통해 또는 CED-6 시그널 형질도입 경로를 통해 그 효과를 발휘한다는 표시이다.
유사하게, 만약 상술된 분석에서 동정된 화합물이 아폽토틱 세포들의 식작용의 저해제이면 그것의 영향이 상기 화합물에 노출된 형질감염된 포유류 세포의 표현형을 검사함으로써 CED-6을 통한 것인지 또는 CED-6 시그널 형질도입 경로를 통한 것인지 입증될 수 있다. 와일드-타입 표현형으로의 전환은 CED-6 또는 상기 CED-6 시그널 형질도입 경로를 통한 작용을 나타내는 표시이다.
본 발명의 네 번째 측면에 따르면 본 발명은 하기 단계를 포함하는 것으로, 어떤 화합물이 아폽토틱 세포의 식작용을 촉진하는 시그널 형질도입 경로의 저해제인지 인헨서인지를 결정하는 방법을 제공한다:
(1) 도 4 또는 도 5에 도시된 아미노산의 서열 또는 기능이 보존되는 아미노산 변이에서만 도 4 또는 도 5에 도시된 것과 다른 아미노산 서열을 포함하는 인간 CED-6 단백질을 포유류 세포내로 마이크로 주입(micro-injecting)하는 단계, 및
(2) 단계 (1)에서 생산된 포유류 세포를 아폽토틱 입자에 노출시키고 상기 화합물의 존재 및 부재중에서 상기 세포에 의한 상기 입자의 식세포의 흡수 비율을 측정하는 단계.
바람직하게는, h1CED-6 또는 h2CED-6 그리고 상술된 리포터 유전자 중 어느 하나일 수 있는 리포터 유전자를 포함하는 융합 단백질이 포유류 세포에 마이크로-주사되는 것이다. 바람직한 융합 단백질은 도 9 또는 도 28에 도시된 플라스미드의 서열을 코딩하는 GFP 및 h1ced-6으로부터의 발현에 의해 얻을 수 있다.
형질감염된 포유류 세포주 분석에 대해 상술된 모든 바람직한 특징과 구현예는 h1ced-6이나 h2ced-6 또는 상술된 그들의 융합물이 마이크로-주입된 세포에 적용될 수 있다.
본 발명의 다섯 번째 측면에 따르면 본 발명은 하기 단계를 포함하는 것으로, 어떤 화합물이 아폽토틱 세포의 식작용을 촉진하는 시그널 형질도입 경로의 저해제인지 인헨서인지를 결정하는 방법을 제공한다:
(1) 도 2 또는 도 3에 도시된 뉴크레오티드의 서열의 전부 또는 일부분에 대해 RNA 안티센스(antisense)를 발현하는 포유류 세포 벡터에 마이크로 주입 또는 형질감염 시키는 단계;
(2) 단계 (1)에서 생산된 포유류 세포를 아폽토틱 입자에 노출시키고 상기 화합물의 존재 및 부재중에서 상기 세포에 의한 상기 입자의 식세포의 흡수 비율을 측정하는 단계.
바람직하게, 상기 안티센스 DNA는 2xSSC; 0.1% SDS; 25℃ 내지 50℃ 보다 심한 엄격한 조건하에서 도 2 또는 도 3에 도시된 뉴클레오티드의 서열에 혼성화(hybridizing)할 수 있는 뉴클레오티드의 서열을 포함한다.
형질감염된 포유류 세포주 분석에 대해 상술된 모든 바람직한 특징과 구현예는 안티센스 RNA로 주사된 세포주에 적용될 수 있다.
상술된 분석에 사용되는 형질감염된 포유류 세포는 h1ced-6 또는 h2ced-6으로 형질감염될 수도 있다고 인정될 것이다. h2ced-6은 정반대의 생물학적 효과를 가진 h1ced-6의 유력한 네거티브 버전으로 생각되기 때문에, 형질감염된 세포는 아폽토틱 세포 식작용의 저해제 또는 인헨서들인 화합물을 동정하기에 바람직한지에 따라 선택될 수 있다. 예를 들면 h1ced-6으로 형질감염된 세포는 아폽토틱 세포의 식작용의 저해제를 동정하는데 특히 적합할 것이고 반면에 h2ced-6으로 형질감염된 세포는 인헨서를 동정하는데 특히 적합할 것이다.
이에 본 발명은 또한 본 명세서에 기술된 분석 방법들 중 어느 방법에 따라서 동정된 바와 같이, 아폽토틱 세포의 식작용을 촉진하는 시그널 형질도입 경로의 저해제 또는 인헨서로 동정된 어떤 화합물과 관련되어 있다는 것이다.
h1ced-6 및 h2ced-6에 대한 뉴클레오티드 서열은 도 2 및 도 3에 각각 도시된다. 부가하여 상기 대체 스플라이스 h2CED-6을 코딩하는 cDNAs 및 h2ced-6으로부터 h1ced-6을 재구성하기 위한 삽입물(insert)은 벨기에(Laboratorium voor Moleculaire biologie-plasmidencollective(LMBP) B 9000, Gent, Belgium)의 BCCM(Belgian Coordinated Collections of Microorganisms)에 기탁되어 있고, 1998년 6월 8일에 부다페스트 조약(Budapest Treaty)에 따라, 수탁번호(Accession Nos) 제 3868호 및 제 3869호를 각각 부여받았다.
서열은 T3 또는 T7 프라이머(primer)(하나 혹은 두 개가 이용될 수 있고, 그것들은 상기 실제적 삽입물의 다른 부위에 있다)를 사용하여 두 침전물(deposits)에서 얻어질 수 있다. 두 개 모두는 클론테크로부터 상업적으로 구입할 수 있고(∼1227과 ∼1228) 서열은 아래에 도시되어 있다.
T7 프라이머: 5'(TAATACGACTCACTATAGGGAGA)3'
T3 프라이머: 5'(ATTAACCCTCACTAAAGGGA)3'
인간 CED-6 단백질을 과발현 또는 미발현하는 포유류 세포에 근거한 분석법을 발전시키는 일에 부가하여 본 발명자는 h1CED-6의 에피토프를 동정하였고 그것에 유용한 항체를 생성시켰다.
그러므로 본 발명의 여섯 번째 측면에 따르면 본 발명은 도 4에 도시된 것과 같은 아미노산 서열을 가진 인간 CED-6 단백질의 단편을 포함하며, 상기 단편은 아미노산의 서열 HRAFSRKKDKTC, FLGSTEVEQPKGTE 또는 TRNGTQPPPVPSRST를 포함한다. 상기 에피토프 중 하나 또는 그 이상에 대한 항체를 포함한 항체 제조물이 제조된다. 이러한 항체 제조물은 실시예 6에 기술된 방법에 의해 얻어질 수 있고 그것들의 특이성은 실시예 7에서 수행된 웨스턴 블롯(Western Blots)에 의해 나타내어진다(도 20 내지 도 25를 참조).
상술된 항체는 식세포내 인간 CED-6 단백질의 과발현 또는 미발현(over or under expression)과 관련된 질병을 갖는 환자의 질병을 진단하는 방법으로 사용될 수도 있다. 상세히 말하면 각각 하기 단계를 포함하는 것으로, 어떤 개체에서(an individual) 식세포내 인간 CED-6 단백질의 과발현 또는 미발현과 관련된 질병 진단에 대한 방법을 제공한다:
(a) 상기 개체로부터 식세포의 샘플을 얻는 단계;
(b) 상기 식세포를 상술된대로 항체 제조물에 노출시키는 단계;
(c) 상기 항체 및 상기 CED-6 단백질 사이에 형성된 어떤 면역 복합체(immune complexes)의 존재를 정량적으로 측정하는 단계; 그리고
(d) 상기 형성된 면역 복합체의 양을 대조구 개체(a control individual)로부터의 식세포를 사용하여 형성된 것과 비교하는 단계.
상술된 항체는 화합물이 아폽토틱 세포의 식작용을 촉진하는 시그널 형질도입 경로의 저해제인지 또는 인헨서인지 결정하는데 대한 분석에 더 사용될 수도 있다. 상세하게 말하면 하기 단계를 포함하는 것으로, 어떤 화합물이 아폽토틱 세포의 식작용을 촉진하는 시그널 형질도입 경로의 저해제인지 인헨서인지 결정하는 방법을 제공한다:
(a) 상술된 발현벡터로 형질감염된 포유류 세포를 상기 테스트되는 화합물에 노출시키는 단계;
(b) 상기 포유류 세포를 상술된 항체 제조물에 노출시키는 단계;
(c) 상기 항체 및 상기 세포에 의해 발현된 단백질 사이에 형성된 모든 면역 복합체의 존재를 정량적으로 측정하는 단계; 그리고
(d) 상기 검출된 면역 복합체의 레벨과 상기 화합물에 노출되지 않고 단계(a)에 설명된 것처럼 형질 감염된 포유류 세포에서 검출된 면역 복합체의 양과 비교하는 단계.
상술된 방법에서 상기 포유류 세포는 COS1, BHK21, L929, CU1, SWISS 3T3, HT144, IMR32, HEPG2, MDCK, MCF7, 293, hela, A549, SW48 또는 G361로부터 선택될 수 있으며, COS1 세포가 특히 바람직하다. 다른 대안으로, 상기 포유류 세포는 인간 피부의 FIB, 피부 케라티노사이트, 백혈구, 단구, 하이포사이트(hyphocyte), 수지상 세포 또는 마크로파지이다. 마우스 마그로파지 세포주 J774 또는 인간 단구 세포주 THP-1과 같은 전문적 식세포가 바람직하다.
본 발명의 상기 항체에 관한 다른 용도는 시그널 형질도입 경로가 hCED-6의 과발현 또는 미발현, 세포 국부화 또는 번역후의 변형(post-translation modifications)을 검출하는 것, 에피토프 맵핑(epitope mapping), 활성 부위(active sites)의 동정으로 특징될 수 있도록 h1CED-6의 정제 및 CED-6과 서로 작용하는 단백질의 동정 그리고 적합한 담체 또는 희석제에 상기 항체를 포함하는 약학적 조성물을 포함한다.
본 발명의 일곱 번째 측면에 따르면 본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 것으로, 개체에서 식세포내 인간 CED-6의 과발현 또는 미발현과 관련된 질병을 진단하는 방법을 제공한다:
(a) 상기 개체로부터 식세포의 샘플을 얻는 단계;
(b) 상기 식세포로부터 RNA를 분리시키는 단계;
(c) 상기 RNA로부터 cDNA를 제조하는 단계;
(d) 상기 cDNA상에 제1 PCR 반응을 행하는 단계;
(e) 상기 제1 PCR 반응의 반응 산물에 대해 제2 네스티드된(nested) PCR을 행하는 단계;
(f) 제1 및 제2 PCR로부터의 반응 산물을 분석함으로써 CED-6 RNA의 존재를 정량적 및 정성적으로 측량하는 단계; 및
(g) 제1 및 제2 PCR에서 형성된 반응 산물의 양 및 형태를 대조 개체로부터의 식세포를 사용하여 형성된 반응 산물의 것과 비교하는 단계.
바람직하게, 상기 PCR은 본 명세서에 정의된 것과 같은 h1ced-6 또는 h2ced-6의 서열로부터 유도되거나 또는 cDNA 생성에 사용된 벡터로부터 유도된 프라이머로 수행된다. 특히 상기 제 1 PCR은 다음의 뉴클레오티드 서열을 가지는 프라이머로 수행될 수도 있다:
(1) cgcaaggatccccatgaaccgtgcttttagcaggaag
(2) gatctactaggtactggag
상기 제2의 PCR은 다음의 뉴클레오티드 서열을 가지는 프라이머로 수행될 수도 있다:
(1) cgcaaggatccccatgaaccgtgcttttagcaggaag
(2) gcggatggtaccgtcgactgctgatacttgagttattctcag
본 명세서에 기술되어 있고, 어떤 화합물이 인간 CED-6의 인헨서인지 또는 저해제인지 결정하기 위해 어떤 기작에 의해 아폽토틱 세포의 식작용에 영향을 주는 화합물을 동정하는데 더욱 일반적으로 적용할 수 있다는 것을 알게 되었고, 반드시 인간 CED-6 또는 그것의 성분을 이루는 시그널 형질도입 경로에 관한 것은 아니다.
리우 Y. 등(Liu Y. et. al, 미국 면역학자 협회(The American Assocoation of Immunologists), 1: 1999)는 아폽토틱 세포의 식작용에 영향을 주는 화합물을 동정하는 분석법을 기술하고 있는데, 상기 분석법에서는 다양한 농도의 테스트될 화합물이 식세포에 첨가되고 이어서 상기 식세포에 아폽토틱 세포가 식종(植種)된다. 아폽토틱 세포의 식작용을 정량하기 위해서, 저자들은 식작용의 현미경을 사용하는 정량을 사용하는 바, 이 방법에서는 아폽토틱 세포의 섭취(uptake)가 전자 현미경에 의해 보였고 슬라이드마다 최소한의 세포들이 셈되면서 광현미경으로 산정되었다.(사빌(Savill), J.S. 윌리(J.S. Wyllie),A.H. 헨슨(A.H. Henson), J.E. 월포트(J.E. Walport), M.J. 헨슨(M.J. Henson), P.M. 헤슬렛(P.M. Haslett), C., J Clin Invest, 83:865-875, 1989).
아폽토틱 세포의 식작용을 정량하기 위한 최근의 공지 기술은 잠재적인 약학적 활성에 대한 화합물의 많은 처리량 스크리닝이 되도록 하는데 도움을 주기 어렵다. 이것은 대개 상기 공지의 분석 기술이 상기 테스트 화합물에 노출될 때 아폽토틱 세포를 섭취했을 식세포의 비율을 현미경을 사용하여 산정하는 것에 의존하기 때문이다. 하지만, 본발명의 분석법은 멀티-웰 분석 형에서 수행되고, 현미경법을 필요로 하지 않는 검출 시스템을 제공하기 때문에 이러한 결점을 극복했다.
그러므로, 본 발명의 또 다른 측면에 따르면 본 발명은 아폽토틱 세포의 식작용의 인헨서 또는 저해제인 화합물을 동정하는 방법으로:
(a) 테스트되는 화합물의 존재 및 부재중에, 현미경검사 없이도 검출 가능한 시그널을 발생할 수 있는 리포터 유전자로 안정하게 형질감염된 아폽토틱 포유류 세포에 포유류 전문적 또는 준-전문적 식세포를 노출시키는 단계,
(b) 상기 식세포에 의해 잡아먹히지 않는 모든 아폽토틱 세포를 제거하는 단계; 그리고
(c) 상기 식세포로부터 상기 리포터 유전자의 어떤 시그널이든지 검출하는 단계를 포함하며;
상기 화합물의 부재중의 시그널과 비교된 상기 화합물의 존재 중의 시그널과의 차이는 상기 화합물이 아폽토틱 세포의 식작용의 저해제인지 또는 인헨서인지를 나타내는 표시인 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
보통, 상기 방법에서 상기 아폽토틱 세포가 첨가되기 전에, 상기 테스트 화합물과 함께 상기 식세포를 배양하는 것이 바람직하다. 배양 시간은 약 15 내지 30분 정도가 적당할 것이다.
본 명세서 어딘가에 기술되어 있는 대로 본 발명의 방법을 수행하는데 적합한 식세포는 마우스 J774 세포 또는 인간 THP-1 세포이다. 이러한 세포는 단일 세포주이나 아폽토틱 세포 첨가 전에 그것을 마크로파지로 분화하도록 배양된다.
상기 방법에서 사용된 아폽토틱 세포는 아폽토틱 호중구, 아폽토틱 임파구 또는 아폽토틱 적혈구일수도 있다. 상기 아폽토틱 세포는 선택적으로 혈청에 노출됨으로써 옵손화된다. 바람직한 아폽토틱 세포는 점착성 세포주 L929 또는 PC12 및 특히, 본 명세서 어딘가에 기술되어 있는 상기 성장인자 의존성 마우스 세포주 Ba/F3이다.
상기 아폽토틱 세포는 상기 타입의 리포터 유전자로 상술된 방법을 사용하여 안정하게 형질감염된다. 리포터 유전자를 사용함에 따라 일어날 수 있는 한 가지 특이한 문제는 효과적으로 죽어가는, 아폽토틱 세포내에서 유전자의 발현이 완전하게 생존가능한 세포보다 훨씬 적다는 것이다. 만약에 생존 가능한 세포가 식세포에 첨가된 아폽토틱 입자 사이에 존재하고 탐식되지 않은 입자에 대해 부적절한 워싱(washing)이 이루어진다면, 상기 생존 가능한 세포의 시그널은 상기 탐식된 아폽토틱 세포의 시그널을 가려버릴 것이다. 비록 적절한 워싱이 일어난다고 보증할수 있지만 본 발명자는 이러한 문제가 없는 특별한 구현예를 발전시켜 왔다.
구체적으로 말하면, 이것은 단백질을 발현하는 리포터 유전자, 바람직하게는 효소를, 세포내에서 저 대사회전(low turnover)으로 사용하여, 상기 살아있는 세포 및 아폽토틱 입자가 거의 동일한 단백질 농도 또는 효소 활성을 가지도록 한다. 이는 상술된 단점을 극복한다. 몇몇 가능한 리포터 단백질 및 기질은 P. 헉랜드(P. Haugland; 몰레큘라 프로브스, 유진, OR, 미국)에 의해 편집된 핸드북 오브 프루오레센트 프루브 앤 리서치 케미칼(Handbook of fluorescent probes and research chemicals)에 기술되어 있으며, 그것들이 사용될 수도 있다. 그러나, 본 발명자는 β-갈락토시다제(lacZ)가 특히 적합하다는 것을 발견하였다. 상기 효소는 비교적 느린 대사회전을 가지고 있으며 그것은 상기 세포 및 아폽토틱 입자가 비교적 동일한 양의 활성을 가지고 있다는 것을 보여준다. 더욱이 몇몇 기질은 β-갈락토시다제(몰레큘라 프로브스, 유진, OR, 미국) 대신에 존재하고, 그것으로부터 본 발명자들은 전술된 FDG를 사용했다. 이것은 많은 처리량 스크리닝을 발전시켜 아폽토틱 입자의 식작용을 바꾸는 화합물을 선택할 수 있게 해준다.
본 발명의 방법에 사용되는 식세포는 와일드-타입 세포일 수도 있고 또는 트렌스제닉(transgenic)이나 돌연변이 세포(mutant cells)일 수도 있다. 돌연변이 세포는 와일드-타입에 비해 감소 또는 증가된 식세포 활성을 가질 수 있다. 트렌스제닉 세포는 발현될 때 아폽토틱 세포에 대한 식세포 활성의 비율을 좌우하는 유전자로 안정하게 형질감염되는 것 일 수도 있다. 예를 들면, 상기 포유류 세포는 상술한 바와 같은 h1ced-6 또는 h2ced-6으로, 바람직하게는 본 명세서의 상세한 설명이나 도면에 언급된 벡터 중 어느 것을 사용하여 형질감염될 수도 있다.
본 발명에 따르는 또 다른 구현예에서 상기 식세포는 상기 세포 표면 항원 CD36을 코딩하는 DNA로 형질감염 될 수도 있다. CD36의 발현에는 포스파티딜세린 (phosphatidylserine) 수용체나 상기 비트로넥틴(vitronectin) 수용체 중 어느 하나를 사용하는 인간 마크로파지에 의한 아폽토틱 세포의 식작용이 요구된다(패독 V.A. 등(Fadok V.A. et. al), J. Immunol 1998년 12월 1일 161(11):6250-7). 형질감염은 본 명세서에 기술된 방법들 중 어느 것에 의해 수행될 수도 있고 바람직하게는 도 31에 보인 CD36을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 벡터 또는 도 31의 전체 벡터를 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 방법은 모두 멀티 웰 플레이트 형에서 수행되었고 그러므로 특히 중간 내지 많은 처리량 스크리닝에 적합하다. 바람직한 구현예에서, 상기 멀티 웰 플레이트는 96개의 웰(well)을 가지나, 본 발명은 또한 6, 12, 24, 384, 864, 1536개 웰을 가진 플레이트를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아닌 다른 개수의 웰을 가진 멀티 웰 플레이트에도 적용될 수 있다.
본 발명의 모든 방법은 테스트 중에 상기 화합물의 존재중에서 아폽토틱 세포의 식작용을 정량하는 시그널의 검출을 필요로 한다. 이러한 시그널(리드아웃 (read-out)으로 언급됨)이 비시각적(non-visual) 검출 수단을 이용해 검출된다는 사실은 본 발명에 따른 방법의 중요한 특징이다. 본 명세서에 기술된 대로 상기 용어 '비시각적 검출 수단'은 현미경을 통한 검사(inspection)를 포함해서 인간의 눈으로의 시각적 검사를 필요로하지 않는 시그널을 검출하는 어떤 수단을 말한다. 상기 비시각적 검출 시스템의 사용은 식세포에 의한 아폽토틱 세포의 섭취를 검출하기 위해 눈에 의한 세포의 시각적 검사를 필요로하는 공지의 방법보다 더 중요한 특징을 나타낸다.
상기 아폽토틱 세포의 비시각적 검출을 할 수 있도록, 상기 식작용 분석에서 상기 많은 내지 중간 처리량을 스크리닝하는데 있어서, 상기 리포터 유전자는 빅터2(victor2) (월락(Wallac), 터쿠(Turku), 핀란드)와 같은 자동 플레이트 판독기(automatic plate reader)에 의해 검출 가능한 시그널을 생성할 수 있어야 한다. 형광성 시그널을 검출하는 자동 플레이트 판독기가 가장 바람직하다.
자동 멀티웰 플레이트 판독기로 판독될 수 있는 시그널을 발생시킴에 따라 정량 측정이 수행될 수 있고 이는 상기 화합물 간의 효과를 비교할 수 있을뿐만 아니라 동시에 많은 화합물의 효과를 평가할 수 있게 한다.
더 나아가 테스트될 상기 화합물이 상술된 화합물의 상기 타입 중 어떤 것이라도 될 수 있고, 특정 화합물이 상기 식세포에 대하여 시그널이 감소되거나 또는 시그널이 결과를 가져오는 경우, 상기 식세포는 당해 화합물의 비-특이적 독성을 배제하는 생존 가능성에 대해 테스트될 것이라고 지적된다.
실시예 1
퍼블릭 도메인 데이터베이스(public domain databases: EST, Genbank, EMBL, Swissprot 및 PIR)에 대한 상기 ced-6 서열(도 2의 hced-6의 공통 DNA 서열) 광범위한 조사(tblastn)는 단백질의 카르복시말단 영역에서 몇개의 ESTS(AA443368, AA431995, R33389 및 R53881)에 대해 통계적으로 현격한 상동 관계임을 밝혔다. 한 Est(T48513)는 PTB 영역의 카르복시말단과 전하를 가진 영역(charged region)의 시작부분에 상동관계를 보였다. 5' RACE 분석을 위해서 마라톤-래디 cDNA 콜로렉탈 아데노카르시노마(a Marathon-ready cDNA colorectal adenocarcinoma) 라이브러리(library)가 클론테크로부터 구입되었다. RACE와 시퀀싱에 사용된 프라이머의 위치는 도 1에 나타나 있다. 뒤이어 일어나는 클로닝과 서열 분석에 의해 부가적 서열 정보를 얻었다. 이러한 부가적 서열 정보의 이용과 뒤이은 데이터베이스 조사(blastn)의 과정(rounds)은 부가적인 EST를 밝혔으며, 이것은 우리가 대략 2400 bp의 공통 서열을 구성할 수 있도록 했다. 이러한 서열은 콜로니 혼성화와 부가적 RACE 산물(products)의 시퀀싱에 의해 더욱 더 확장되고 다양화되었다.
실시예 2
RNA 블롯:
여덟 가지 다른 인간의 조직(심장, 뇌, 태반, 폐, 간, 골격근, 신장 및 췌장)으로부터의 poly A + RNA의 2 ㎎을 각각의 레인에 함유하는 인간의 멀티플 티슈 노던(A human multiple tissue Northern)(MTN-Ⅰ,클론테크) 및 비장, 흉선, 전립선, 고환, 난소, 소장, 결장 및 말초의 백혈구로부터의 poly A + RNA의 2 ㎎을 각각의 레인에 함유하는 MTN-Ⅱ 인간의 멀티플 티슈 노던은 제조업체의 지시에 따라 혼성화되었고, 55℃ 에서 0.1 ×SSC 0.2 % SDS에서 세척되었다. 또한 클론테크로부터, 인간 암 세포주(흑색소 세포종(melanoma) G361, 폐암종(lung carcinoma) A549, 콜로렉탈 선암종(colorectal adenocarcinoma) SW480, 버키트 림프종 라지(Burkitt's lymphoma Raji), 림프구 모세포 백혈병(lymphoblastic Leukemia) Molt-4, 만성 골수 백혈병(chronic myelogenous) K562, Hela S3 및 전골수세포 백혈병(promyelocytic leukemia) HL60)로부터의 poly A + RNA 블롯이 테스트되었다.
정상적인 노던 블로팅에 의한 인간 조직에서와 암세포주에서의 hCED-6의 발현 패턴이 하기의 표 Ⅰ에 나타난다:
A) 인간의 멀티플 티슈 노던(MTN) 블롯
B) 인간의 멀티플 티슈 노던(MTN) 블롯 Ⅱ
C) 인간의 암 세포주 멀티플 티슈 노던(MTNTM) 블롯.
실시예 3
식세포 세포주에서의 CED-6(h1ced-6)과 그것의 스플라이스 변형체의 검출.
PMA(시그마-알드리치, St-Louise, MO, 미국)를 가지고 마크로파지로 분화될 수 있는 인간의 단구 세포주, 세포주 THP-1 (ATCC no: TIB-202)는 2 mM L-글루타민, 1.5 g/L 소디움 비카보네이트(Sodium bicarbonate), 4.5 g/L 글루코스(glucose), 10 mM HEPES, 1 mM 소디움 피루베이트(Sodium pyruvate) 및 0.05 mM β-머캅탄올(β-mercapthanol)을 포함한 RPMI 160 배지에서 표준 조건하에 배양되었다. (모두 gibcoBRL Life Technologies, Merelbeke, 벨기에 로부터 구매됨)
상기 제조업체의 지시를 따르거나 또는 최소한으로 변형한 키아젠(qiagen) (Westburg, Leusden, 네덜란드)으로부터의 RN이지 미니 키트를 사용해 RNA를 이러한 세포주로부터 분리하였다.
이러한 RNA에서 출발하여 cDNA의 제조업체의 지시를 따르거나 또는 최소한으로 변형한, 첫 번째 가닥(strand) cDNA를 파마시아 바이오테크(Pharmacia Biotech)(Piscataway, NJ, 미국)로부터의 레디 투 고 T-프라임드 퍼스트-스트랜드 키트(Ready-To-Go T-primed First-strand kit)를 사용하여 생성하였다.
상기 생성된 cDNA는 PCR 프로토콜에서 사용되어 하기 프라이머를 사용하여 DNA 단편들을 생성하였다:
oGA131: 5'-CGCAAGGATCCCCATGAACCGTGCTTTTAGCAGGAAG-3'
445-10934-13R: 5'-GATCTACTAGGTACTGGAG-3'
PCR은 상기 제조업체의 지시를 따르거나 또는 그것의 최소한으로 변형한 TaKaRa ex Taq kit (Takara Shuzo CO., LTD, Shiga, 일본)으로 실행되었고, h1ced-6 유전자를 포함하는 플라스미드 pGA1025는 양성 대조구로 사용되었다.
요약:
상기 레디 투 고 T-프라임드 퍼스트-스트랜드 키트로부터 분리된 첫 번째-가닥 cDNA에서의 PCR은 만들어진대로의 전체 cDNA, 0.4 ㎕ oGA131(100 pmol/㎕), 0.4 ㎕ 445-10934-13R(100 pmol/㎕), 0.5 ㎕ exTaq 5U/㎕ 및 65.7 ㎕ 물을 포함하였다.상기 양성 대조구에서의 PCR은 10 ㎕ 버퍼(buffer) exTaq 10×, 10 ㎕ dNTP mixexTaq 10×, 0.4 ㎕ oGA131(100 pmol/㎕), 0.4 ㎕ 445-10934-13R(100 pmol/㎕), 2 ㎕ pGA1025, 76.2 ㎕ 물을 포함하였다.
PCR-프로그램:
20 ㎕의 각 PCR 반응 및 1 ㎕의 상기 양성 대조구 PCR 반응이 사용되어 다음의 프라이머를 가지고 네스티드 PCR을 행하였다:
oGA131: 상기 참조
oGA141: 5'-GCGGATGGTACCGTCGACTGCTGATACTTGAGTTATTCTCAG-3'
PCR은 제조업체의 상기 지시를 따르거나 또는 최소한으로 변형한 TaKaRa ex Tag kit(Takara Shuzo CO., LTD, Shiga, 일본)으로 실행되었다.
상기 매스터믹스(mastermix): 5 ㎕ 버퍼 exTaq 10×, 5 ㎕ dNTP mix exTaq 10×, 0.2 ㎕ oGA131(100pmol/㎕), 0.2 ㎕ oGA141(100 pmol/㎕), 0.5 ㎕ exTaq 5U/㎕, 37.1 ㎕ 물.
PCR-프로그램:
10 ㎕ 네스티드-PCR 산물은 표준 프로토콜(standard protocols)을 사용하여겔 위에서 분석되었다. (몰레큘라 클로닝(Molecular Cloning), 실험실 매뉴얼(a laboratory manual), 샘브룩 등(Sambrook et. al), 1989, CSHL press)
상기 과정은 1차 살아있는 호중구, 1차 아폽토틱 호중구, 1차 마크로파지, 아폽토틱 호중구와 상호작용하는 1차 마크로파지, 마우스 단구 세포주 J774 및 COS-1 세포에 대하여 반복되었다. 상기 결과는 도 6에 보여진다. 주목할 만한 것은, 오직 세포주 THP-1에서만 h1ced-6 및 그것의 스플라이스 변형체인 h2ced-6이 검출될 수 있었다는 것이다(도 6의 레인 8 참조).
실시예 4
안정한 인간 CED-6의 세포주
J774 뮤린(murine) 단구 종양 세포주(모랜드 및 카프란(Morland and Kaplan),1978, Exp. Cell Res. 115:53-61; 모랜드 및 카프란,1978, Exp. Cell Res. 115:63-72 수탁 번호(Accession No) ATCC TIB67 - 또한 J774A.1로서 기술됨)는 글루타멕스(glutamax)Ⅰ, 10% 미오클론(myoclone) 혈청(모든 것은 GIBCOBRL, 라이프 테크놀로지스(Life Technologies), Merelbeke, 벨기에 제품)을 가진 DMEM에서 배양된 것으로 플라스미드 pEGFP-n3(클론테크: Clonetech, Palo Alto, CA, 미국)(도 7 및 도 8) 및 mock 형질감염, pGA3104, h1CED-6/GFP 융합 (도 9 및 도 10)을 가지고 전기영동(electroporation)에 의해 형질감염되었다.
연어 정액 DNA; 음성 대조구.
전기영동은 이퀴바이오(Equibio Ltd: Immunosource, Halle-Zoersel, 벨기에)의 이지젝트 플러스 일렉트로포레이터 시스템(Easyject Plus electroporator system)으로 수행되었고, 다음의 프로토콜이 사용되었다: 800 ㎕ 세포 배양 배지 내에 31 ×106개 세포를 넣고, 30㎍ DNA를 첨가하였다.
상기 이지젝트 플러스 일렉트로포레이터의 세팅은 더블 펄스(double pulse)였다:
전압 Ⅰ = 750 V, 커페시터 Ⅰ = 25 ㎌, 저항 Ⅰ = 99R, 인터펄스 딜레이 (Interpulse delay) = 0
전압 Ⅱ = 150 V, 커페시터 Ⅱ = 1500 ㎌, 저항 Ⅱ = 99R, 옵티펄스 옵션(Optipulse option)
구조당 3200 ㎕의 전기영동된 세포 가 175 cm2배양 플라스크 안에 심어졌고, 72 시간 후에 G418 항생물질(400 ㎍/ml)(Duchefa, Haarlem, 네덜란드)로 선택되었다. 클론의 서브클론이 수득되었고 GFP 발현에 대해 체크되었다.
실시예 5
식작용 분석
식세포의 제조
pEGFPn3 또는 pGA3104로 안정하게 형질감염된 단구 세포주 J774 또는 pGA1058을 식작용 분석을 수행하기 전에 37℃ 및 5% CO2에서 36시간동안 블랙 96-웰 플레이트(a black 96-well plate)에서 1 ×105의 밀도로 평판(plated)하였다.
아폽토틱 세포의 제조
리포터 유전자로서 β-갈락토시다제로 안정하게 감염된 성장인자 의존 세포주 Ba/F3는 아폽토틱 세포의 근원으로 사용되었다. Ba/F3를 형질감염시키기에 적합한 플라스미드는 도 11에 보인 pcDNA3.1/His/LacZ이다. IL-3 의존성 마우스 클론(팔레시오스 및 스테인메츠(Palacios and Steinmetz), 1985, Cell 41:727-734; 팔레시오스 등(Palacios et. al), 1984, Nature 309:126-131)인 Ba/F3 세포는 글루타맥스 Ⅰ, 10% FCS, 1% 항생물질(모두 GIBCOBRL, 상동의 제품) 및 WEHI-3 배양의 10% 상청액 (supernatant)을 가진 DMEM에서 성장되었다.
WEHI-3(ATCC no.: TIB-68)은 배양 배지인 글루타맥스 Ⅰ, 10% FCS 및 1 리터 당 3.6 ㎕의 β-머캅토에탄올을 가진 RPMI 1640에서 성장될 때 IL-3를 생산한다. Ba/F3 세포는 상호작용 분석 2일 전에 1/2로 분열되었고(지수 증식기(exponential growth phase)) Ba/F3 세포(5×106/ml)는 분석을 수행하기 전에 20시간 동안 성장인자 IL-3 없이 배양되었다. 아폽토틱 Ba/F3 세포는 베링거-만하임(브뤼셀, 벨기에)의 아넥신/프로피디움 아이오다이드 라벨링 키트에 의해 관찰되었다. Ba/F3 세포는 만약 20% 아넥신 양성 및 5% 프로피디움 아이오다이드 음성이면 초기에 아폽토틱된다. 성장인자 IL-3로 배양된 Ba/F3 세포는 음성 대조구로 사용되었다. 상기 아넥신/프로피디움 아이오다이드 테스트의 결과는 도 33에 보여진다.
상기 식세포에 상기 아폽토시스 세포 첨가
100 ㎕ Ba/F3 세포(1 ×107세포/ml)가 안정하게 형질감염된 J774를 포함한웰과 상기 음성 대조 웰에 첨가되었고 20분 내지 5시간 동안 37 ℃에서 배양되었고 그후 아폽토틱 세포가 모든 웰에서부터 제거되었다. 식세포는 PBS 버퍼(GIBCOBRL, 상동)에서 세 번 세척되었고, 이 때 상기 어떤 세포도 제거되지 않도록 주의하였다.
리드-아웃(Read-out)
상기 아폽토틱 바디의 상기 J774 세포에 의한 식작용은 상기 Ba/F3 세포에서 발현되는 것과 같은 상기 β-갈락토시다제를 검출함에 의해 측정되었다. 검출은 플루오로제닉 기질인 플루오레세인 디-b-D-갈락토피라노사이드(FDG)(몰레큘라 프로브스, 유진, OR, 미국)로 수행되었다. 10 μM FDG는 상기 웰에 첨가되었고 어두운 곳에서 실온으로 1 시간 동안 배양되었다. 계속해서 FDG는 상기 β-갈락토시다제의 활성에 의해 FMG 및 플루오레세인으로 가수분해되고, 녹색 플루오레세인 방출이 480mm 여기(excitation), 520mm 방출(emission) 및 적당한 감도 세팅(appropriate sensitivity setting)을 사용하는 표준 플레이트 판독기(standard plate reader)에서 측정되었다. 교정(calibration)의 목적으로 다른 Ba/F3 농도에 대해 형광성의 리드 아웃(read-out)이 검사되었다. 세포 농도의 함수로서 상기 형광성의 리드 아웃은 도 12에 보여진다. 추가의 실험들이 FDG의 농도, 분석의 배양 시간, 분석의 온도 및 Ba/F3 배지에서 혈청의 농도를 변화시키면서 수행되었다. 그 결과는 도 13, 14, 15 및 34에 각각 보여진다.
화합물 스크리닝
상술된 식작용 분석은 전문적인 식세포에 의해 아폽토틱 세포의 식작용의 레벨에 영향을 미치는 능력에 대해 화합물을 스크리닝하는데 사용된다. 상기 테스트 화합물 또는 화합물들은 상기 웰에 상기 Ba/F3 세포를 첨가하기 대략 30 분전에 테스트 웰에 첨가될 수 있다. 상기 분석의 멀티웰 형 및 표준 장치를 사용하는 형광의 자동 판독 때문에 상기 분석은 많은 처리량 화합물 스크리닝에 이상적으로 적합하다.
어떤 화합물의 존재로 상기 화합물에 노출되지 않은 식세포에 비교해 형광이 없거나 또는 형광이 감소하게 되는 경우, 그 웰내의 세포는 몰레큘라 프로브스(유진, 미국)로부터의 Live/Dead Viavility/Cytotoxicity Kit과 같은 상업적으로 구입 가능한 시약을 사용하여 생존능력에 대해 테스트될 것이라는 사실을 알게될 것이다. 이러한 키트는 세포 생존능력의 두 개의 인식 파라미터, 각각 세포내 에스테라아제(esterase) 활성 및 플라즈마 멤브레인 인테그리티(plasma membrane integrity)를 측정하는 두 개의 탐침, 칼세인(calcein) AM 및 에티디움 호모다이머(ethidium homodimer)를 가지고 살아 있는 및 죽은 세포의 동시 측정에 근거한 두가지-색 플루오레센스 세포 생존능력 분석을 제공한다. 이러한 키트는 플루오레센스 멀티웰 플레이트 스캐너로 사용하기에 적합하다. 생존 가능한 세포의 존재는 형광의 결여가 식세포 활성에서 상기 화합물의 영향 때문이고 단지 비-특이적 독성 때문만은 아니라는 것을 확인해 줄 것이다.
더 나아가서 상술된 분석에 의한 아폽토틱 세포의 식작용의 저해제 또는 인헨서로 동정된 어떤 화합물은 상기 영향이 CED-6을 통해 치료됨을 확인하기 위해서 좀더 테스트될 것이다. 아폽토틱 세포의 식작용의 인헨서로 동정된 화합물의 경우이것은 h1ced-6 또는 h2ced-6으로 감염되지 않은 J774 세포를 가지고 상술한대로 정확히 식작용 분석을 수행함에 의해 이루어질 수 있다. 상기 화합물이 hced-6으로 형질감염될 때 이들 세포의 표현형과 유사한 J774 세포에서의 표현형을 유도할 수 있다면, 그때 그것은 CED-6을 통해 또는 상기 CED-6 시그널 변환 경로를 통해 그것의 효과를 발휘한다는 표시이다.
비슷하게, 만약 상술된 분석에서 동정된 화합물이 아폽토틱 세포의 식작용의 저해제이면, 상기 화합물에 노출된 상기 형질감염된 J774 세포의 표현형을 검사함으로써 그것의 효과가 CED-6을 통한 것인지 또는 CED-6 시그널 변환 경로를 통한 것인지가 확인될 수 있다. 와일드-타입 표현형으로의 전환은 CED-6 시그널 변환 경로를 통한 작용의 표시이다.
실시예 6
인간 CED-6에 대한 폴리클로날 항체
토끼에서 하기 ced-6 에피토프에 대해 발생되는 폴리클로날 항체:
EP990044 H2N - NRA FSR KKD KTC CONH2
EP990045 H2N - CFL GST EVE QPK GTE CONH2
EP990046 H2N - CTR NGT QPP PVP SRS T CONH2
상기 ced-6 단백질에서 이러한 항원 결정 인자의 위치는 도 16에 보여진다.
상기 폴리클로날은 다음의 프로토콜을 사용하는 유로젠텍 벨(Eurogentec Bel, Herstal, 벨기에)에 의해 야기된다:
0 일 : 전면역 혈청(pre-immune serum)을 취한 후 첫 번째 면역화(immunisation)
14 일 : 두 번째 면역화
28 일 : 세 번째 면역화
38 일 : 혈액 샘플링(sampling) (2 ml 수송(shipping))
56 일 : 네 번째 면역화
66 일 : 혈액 샘플링(sampling) (2 ml + 20 ml 수송)
80 일 : 완전 방혈.
실시예 7
웨스턴 블롯에 의한 항체 테스트
플라스미드 pGA1028(pBAD/His A-hCED-6)(도 17 및 18 참조)의 형질 변환은 탑(TOP) 10 컴피턴트 세포(competent cells)에서 행해졌다. 더 나아가 pBAD/His는 음성 대조구로서 상기 동일한 이. 콜라이(E. Coli) 세포에서 형질 변환되었다. pBAS/HisA 및 이. 콜라이 탑 10은 Invitrogen(Leek, 네덜란드)으로부터 구입되었다.
상기 pBAD-벡터 발현 시스템이 사용되었으며, 이는 효과적인 발현 시스템으로 알려진 것이다. 상기 아라비노스(arabinose)의 존재에서, pBAD로부터의 발현은 나타나고, 아라비노스의 부재는 pBAD로부터의 매우 낮은 레벨의 전사를 생산하게 한다. 시험적인 발현(pilot expression)은 제조회사의 지시에 따라 수행되었고, 그 발현에서 아라비노스의 양은 여러분의 단백질의 최대 발현에 요구되는 아라비노스의 적당량을 결정하기 위해서 바뀌었다. 제조회사(invitrogen, Leek, 네덜란드)에따르는 프로토콜이 사용되었다. 발현은 상기 동일한 프로토콜을 사용하여 증가되었다.
단백질의 정제는 pGA1028로 형질 변환된 상기 이. 콜라이 세포로부터 행해졌다: 5 ml 용해 버퍼(lysis buffer)(10 ml TE 1× pH 8, 0.5 ㎎/ml 라이소자임(lysozyme), 0.1 ㎎/ml DNAse, 100 ㎕ 1M 염화 칼슘(CaCl2) 400 ㎕ 프로테아제 저해제 25×)가 50 ml 발현 도입된 배양의 펠렛에 첨가되고, 상기 펠렛은 이러한 용해 버퍼에서 재현탁 되었다. 상기 현탁액은 30분 동안 얼음에 놓여졌다가 5초간 3회 초음파처리된 후, 냉동-해동(frreze-defreeze)을 3회 반복하여 처리되고, 37℃에서 30 분간 방치되었다. 상기 현탁액은 최고 속도로 5분간 원심분리되었다. 불용성 부분과 또한 hCED-6 융합 단백질이 포함된 펠렛이 1 ml 2M 요소(urea) 속에서 재현탁되었고 1200 rpm에서 5분 동안 교반되었다. 이 현탁액은 5분간 최고 속도로 원심분리되었고, 상청액은 겔 전기영동 및 웨스턴 블롯팅에 사용되었다. 25 ㎕ 상청액과 25 ㎕의 미리 섞인 램리 샘플(Laemmli Sample) 버퍼(Bio Rad- Hercules, CA, 미국)는 혼합되었다.
상기 음성 대조구로부터의 단백질은 정제되지 않았다. pBAD/His으로 형질 변환된 이. 콜라이는 1 ml의 유도된 이. 콜라이 배양을 펠릿으로 만들고, 상기 펠릿을 1 ml의 미리 섞인 램리 샘플 버퍼(Bio Rad- Hercules, CA, 미국)에 재현탁함으로써 제조되었다. 그것으로써 이 현탁액이 PAGE 겔 전기영동에 사용될 수 있다.
겔에 로딩하기 위한 샘플의 제조:
상기 두 샘플을 5분간 끓이고 로딩하기 전에 얼음 위에 놓아두었다. 25 ㎕ 샘플이 레디 겔(Ready Gel) 50 ㎕ 웰 트리스HCl(well TrisHCl), 4-15%(Bio Rad- Hercules, CA, 미국) 로딩되었고 전기영동은 상기 제조업체의 지시에 따라 수행되었다. 상기 겔의 단백질은 제조업체(Bio Rad- Hercules, CA, 미국)의 지시에 따라 미니트랜스블롯(MiniTransBlot) 전기영동 셀을 가지고 니트로셀룰로오스 멤브레인 (Trans-blot Transfer medium, Bio Rad-Hercules, CA, 미국) 상으로 이동되었다.
웨스턴 블롯은 상기 항체 및 상기 검출 키트의 제공업체에 따라 수행되었다.
첫 번째 항체, 상기 웨스턴 블롯에서, 토끼의 면역 혈청 또는 전-면역 혈청은 PBST(1.44 g/L KH2PO4, 90 g/L NaCl, 7.75 g/L Na2HPO4ㆍ7H2O, 0.1 % Tween)에서 1/2000으로 희석한 것에서 사용되었다.
두 번째 항체: 항-토끼 PBST(0.1 %)에서 1/4000으로 희석된 호올스래디쉬 퍼옥시다아제-결합된 전체 항체(당나귀로부터)(ECL 웨스턴 블롯팅 검출 시약 및 분석 시스템, 아메리샴 파마시아 바이오테크, UK, 잉글랜드).
모든 배양은 하기 변형으로, 상기 제조업체에 따라 수행되었다. 첫 번째 항체는 TBST 대신에 PBST에서 밤새 배양되었다. 상기 항체의 검출은 제조업체의 지시에 의해 행해졌다(ECL 웨스턴 블롯팅 검출 시약 및 분석 시스템, 아메리샴 파마시아 바이오테크, UK, 잉글랜드). ECL 검출 키트 사용후 멤브레인 스트리핑 및 재탐침은 제조업체의 지시에 의해 행해졌다(ECL 웨스턴 블롯팅 검출 시약 및 분석 시스템, 아메리샴 파마시아 바이오테크, UK, 잉글랜드).
대조 항체를 가진 웨스턴 블롯은 상기 항-HisA 항체(invitrogen, Leek, 네덜란드)의 제조업체의 지시에 따라 행해졌다. PBST(0.1 %)에서 1/5000으로 희석된 항-Xpress 항체(invitrogen, Leek, 네덜란드)를 나타내는 항체가 첫 번째 항체로 사용되었다. 두 번째 항체: PBST(0.1 %)에서 1/4000으로 희석된 마우스 Ig, 호올스래디쉬 퍼옥시다아제-결합된 전체 항체(양으로부터)(ECL 웨스턴 브랏팅 검출 시약 및 분석 시스템, 아메리샴 파마시아 바이오테크, UK, 잉글랜드).
두 실험에서 상기 항체의 염색은 상기 제조업체의 지시에 따라 수행되었다(ECL 웨스턴 블롯팅 검출 시약 및 분석 시스템, 아메리샴 파마시아 바이오테크, UK, 잉글랜드).
그 결과들을 도 20 내지 도 25에 도시한다.
실시예 8
H-CED-6과 인산화된 티로신 단백질과의 상호작용
공동면역침강반응(Co-immunoprecipitation)
h1CED-6의 세 개의 에피토프에 대해서 야기된 항체를 웨스턴 블로팅에 사용하여 인산화된 티로신 단백질과의 CED-6 상호작용을 검출하고 단백질과 상호작용하는 CED-6을 동정하였다.
형질감염(Transfection)
COS-1 세포의 형질감염을 175 ㎠ 플라스크(1 x 107세포)에서 플라스미드 pGA3103(도 26 내지 도 29 참조) 및 pGA3104(도 7 내지 도 10 참조)로 행하였다.음성 대조구(a negative control)로서는 MOCK 및 pEGFP-N3를 사용하였다. 전 길이의 인간 ced-6(GFP, 양쪽의 N 및 C 말단 융합, 내부 대조구(internal control)를 가진 프레임에서)를 조사하였다. COS-1 세포를 리포펙타민 플러스 시약 (lipofectamine Plus reagent) (GIBCO-BRL)으로 형질감염시켰다. 라이프 테크놀로지스의 프로토콜을 따랐으며 이용한 서적을 표 2에 나타낸다.
MOCK 형질감염 세포는 형질감염을 위한 음성 대조구이다. DNA를 첨가하는 대신에, DNA의 용매만을 상기 세포에 첨가한다. DNA의 용매는 TE 버퍼, pH=8: H2O에서 1M 트리스 (ICN) pH=8 및 0.5M EDTA (Merck-Belgolabo) pH=8이다.
인산화 반응(phosphorylation)을 위한 양성 대조구로서, 인산화된 Ba/F3 세포의 IL-3 수용체의 β-사슬을 사용하였다.
COS-1 세포 리세이트(lysates)를 디지토닌(DIGITONIN)을 사용하여 제조하였고(가능한 살며시 행하여 상호작용을 방해하지 않도록 함) 포스파타아제 저해제(phosphatase inhibitors) (프로테아제(protease) 저해제, 바람직하게는 칵테일필(cocktailpils) 또는 페파블록(pefablock))를 용해 버퍼에 첨가하였다.
·비엄격 디지토닌계 버퍼(Low stringency DIGITONIN based buffer):
10 ml 비디(bidi)에 디지토닌을 가진 버퍼
·1% 디지토닌 (Serva 19551, MW 1229.3) SERVA
2% 군체(stock) = 12.5 ml에 250 mg
·10 mM 트리에탄올아민 pH 7.8 (Sigma-Aldrich; Bornem, 벨기에)
10X 군체 100 mM= 10 ml에 185.7 mg pH 7.8 (50 ml에 5 ml)
·0.15 M NaCl (MW 58.44) 10ml당 87.66 mg
·2 mM Na3VO4(Sigma-Aldrich, Bornem, 벨기에) 10 ml당 3.687 mg
·2 mM EDTA (Titriplex Ⅲ; MW 372.24)(Darmstadt, 독일)
10 ml당 7.444 mg
·200 U/ml 아프로티닌-트라질올 (Sigma-Aldrich, Bornem, 벨기에)
1 mg = 11 TIU = 9900 KU
200X 군체: 2 ml PBS에 10 mg = 49500 KU (10 ml에 50 ㎕)
·1 mM 페파블록 (Merck, Darmstadt, 독일) 10 ml당 2.4 mg
세포의 용해(Lysis of cells)
·형질감염 세포를 팔콘(falcon)내의 PBS 둘베코(Dulbecco's)(GIBCOBRL)에서 2번 세척하였다.
·세포를 긁고 펠릿을 300㎕ 용해 버퍼에 재현탁시켰다.
·모든 조작을 4℃에서 행하였다.
·상기 조제물(preparation)을 4000 rpm에서 원심분리기로 분리하고 상청액은 새로운 관으로 이동시켰다.
선제거(Preclearance)
·단백질 G 세파로즈 CL-4B 비드(Amersham Pharmacia, Roosendaal, 네덜란드)를 제공하고 첨가제 존재하에서 동결건조시켰다. 이들 첨가제를 중성 pH에서 세척하여 제거하고 에탄올을 용해 버퍼로 대체하였다.
·50% v/v 단백질 G 세파로즈 현탁액:
1 ml 50/50 v/v 단백질 G 세파로즈를 피펫으로 재고 고속으로 5초 동안 원심분리기로 분리하였다. 그런 다음 이것을 흡인기로 제거하고 동량의 용해 버퍼에 재현탁시켰다. 세척과정을 세 번 반복하였다.
·300㎕의 리세이트에 50㎕의 단백질 G 세파로즈 CL-4B 비드(Amersham Pharmacia, 상동)를 첨가하고 이것을 1시간 동안 반응시켰다.
·이어서 이것을 10초 동안 14000 rpm과 4℃에서 원심분리기로 분리시키고 상청액은 새로운 관으로 이동시켰다.
공동면역침강반응
·COS-1 리세이트: 5㎕ 항 녹색형광단백질(GFP) 폴리클로날 토끼 항체 (Immunosource, Halle-Zoersel, 벨기에)를 첨가하였다.
·동결건조물(lyophilized form)을 100 ㎕ 증류수에서 용해시킨 다음 -20℃에서 동결시켰다.
·Ba/F3 리세이트 번호 5: IL-3 수용체의 β-사슬에 대한 5 ㎕의 렛(rat) 항체 (Van der Heyden J., Devos R., Plaetinck G., Fache I., Fiers W., Tavernier J. 1991. 한 패널의 모노클로날 항체의 사용에 따른 뮤린(murine) IL-5 수용체 복합물(complex)의 특징. 뮤린 IL-3 수용체와의 관계. J Immunol. 147:3413-3418)를 첨가하였다.
·Ba/F3 리세이트 번호 6: 아무런 항체도 첨가하지 않았다.
·샘플들을 4시간 내지 24시간(밤새도록) 동안 4℃에서 회전시키면서 배양시켰다.
·50 ㎕ 단백질 A 비드를 첨가하고 1시간 동안 4℃에서 배양시켰다.
·샘플들을 3분 동안 3000rpm에서 (4℃) 원심분리기로 분리하였다.
·비드를 800 ㎕ 용해 버퍼에 재현탁시키고, 수 차례 뒤집어 놓거나 또는 수 분 동안 회전시키고, 3000 rpm에서 3분 동안 (4℃) 원심분리기로 분리하였다. 이러한 과정을 세 번 반복하며 마지막 순서에서는 세정 버퍼(wash buffer)를 모세관 끝으로 제거하였다.
·비드를 20 ㎕ SDS 로딩 버퍼(loading buffer)(머캅토(-mercapto)를 가짐)에 현탁시켰다.
·리세이트 번호 7= EGF-자극된 A431 세포 리세이트
(안티-포스포티로신에 대한 양성 대조구)
(Upstate Biotechnology, cat. No. 12-302)
·2.5 ㎕의 β-머캅토에탄올을 100 ㎕의 리세이트에 첨가하고 샘플들을 끓였다.
·샘플들을 3분 동안 3000 rpm에서 (4℃) 원심분리기로 분리하고 바이오래드(BioRad)(cat. no 161-0305)로부터 낮은 범위의 미리 염색된 SDS-Page 표준을 사용하여 SN을 SDS PAGE상에 로딩시켰다.
웨스턴 블로팅(Western-blotting)
·세포 리세이트를 니트로셀룰로오즈로 이동시켰다:
·이동 버퍼= 48 mM 트리스, 39 mM 글리신, 20% 메탄올, pH 9.2 (H2O에서 5.82 g 트리스, 2.93 g 글리신, 1 L H2O에 대해서 200 ml 메탄올)
·블록킹 버퍼(blocking buffer): 1x PBS, 0.1% 트윈(Tween), 5% 우유 분말, 블롯을 밤새 배양시킴
·젤을 안티-포스포티로신(cat. 05-321, Upstate Biotechnology): 1㎍/ml으로 3시간 동안 탐침하고 5분 동안 PBS, 0.1% 트윈으로 두 번 세척하였다
·1시간 동안 실온에서 두 번째 Ab로서 1:4000 고트 안티-마우스 호올스래디시 퍼옥시다제(goat anti-mouse horseradish peroxidase)(cat. no RPN 2108, Amersham pharmacia biotech)를 사용하여 단백질을 시각화하였다.
·블롯을 5분 동안 PBS, 0.1% 트윈으로 두 번, 5분 동안 블록킹 버퍼로 두 번, 그리고 H2O로 두 번 (5분) 세척하였다.
ECL 웨스턴 블로팅 분석 시스템
아머샴 파마시아 바이오텍사(Amersham Pharmacia Biotech)의 ECL 웨스턴 블로팅 검출 시약(cat. no RPN 2108)을 사용하였다.
ECL 검출 키트 다음에 블롯을 스트립핑하는 과정과 재탐침하는 과정
멤브레인에서 결합되어 있는 항체를 스트립핑하고 재탐침하였다. 각각의 면역검출 후에 멤브레인을 4℃에서 사란 랩(saran wrap)에 습한 상태로 저장했다.
·상기 멤브레인을 스트립핑 버퍼(100 mM β-머캅토에탄올, 2% SDS, 62.5 mM 트리스-HCl pH 6.7)에 잠기게 하고 30분 동안 50℃에서 종종 교반시키면서 배양시켰다.
·상기 멤브레인을 2 x 10분 동안 PBS, 0.1% 트윈에서 실온으로 다량의 세정 버퍼를 사용하여 세척하였다.
·상기 멤브레인을 1시간 동안 실온에서 블록킹 버퍼에 담가 차단시켰다.
·항 녹색형광단백질 GFP로 면역검출(immunodetection)을 행하고 항-인간 CED-6으로 반복해서 실행하였다.
결과
CED-6에 대해 안티-포스포티로신, 항 녹색형광단백질(GFP) 또는 토끼 혈청중 어느 하나로 탐침된 모든 세포 리세이트의 웨스턴 블롯을 도 30에, 블롯 (A), (B) 및 (C)로 도시하고 있다. 안티-포스포티로신으로 염색된 49와 74k 사이의 한 밴드는 GFP 및 CED-6의 융합 단백질로 형질감염된 COS-1 세포 리세이트에 존재하고 대조구 COS-1 세포 리세이트에는 존재하지 않는다. 웨스턴 블롯을 항-GFP 및 항-CED-6으로 탐침하여, 49와 74K 사이의 동일 밴드를 염색하였다.
결론
융합 단백질 CED-6-GFP 및 GFP-CED-6은 모두 인산화된 티로신이다. 그들의 분자량은 62385.95K이고 이는 염색된 49와 74K 사이의 밴드가 안티-포스포티로신, 항-녹색형광단백질(GFP) 및 항-CED-6에 대해 양성임을 나타낸다.
실시예 9
안정된 세포주를 인간 세포 표면 수용체 CD36으로 형질감염시켰다.
J774 뮤린 단구 종양 세포주를 도 31 및 32에 도시된 플라스미드 pGA1058로 전기영동함으로써 형질감염시켰다. 사용된 방법은 인간 ced-6에 관한 실시예 4에 설명된 것과 같았다.
실시예 5의 프로토콜을 사용하여 식작용 분석을 수행하는데 있어서 상기 형질감염된 세포주를 양성 대조구로 사용하였다.
실시예 10
PC12에서 시작하는 아폽토틱 입자(apoptotic particles)의 생성
상기 PC-12 세포주(ATCC 번호: CRL-1721)(Mesner P.W., Winters T.R., Green S. H.,(1992) J. Cell Biol.119:1669-1680)는 작은 덩어리(clusters)로 성장하기 쉽다. 신경 성장 인자-베타(50ng/ml 최종 농축물, Sigma)를 첨가함에 따라서, PC-12 세포는 신경단위 세포(neuronal cells)로 분화한다. 처리한 지 5일 후에 신경 성장 인자를 회수시킴에 따라, 신경단위의 렛 PC12 세포에서 세포 예정사가 야기된다.
상기 세포를 1.5g/L 소디움 비카르보네이트, 4.5g/L 글루코오스, 10mM HEPES 및 1mM 소디움 피루베이트, 10% 말의 혈청, 5% 소의 태아 혈청을 함유하도록 맞춘2mM L-글루타민으로 RPMI 1640 (라이프 테크놀로지스)에서 배양한다.
이들 세포를 상술된 아넥신/PI 키트(annexin/PI kit)를 사용하여 아폽토틱 특징에 대해 테스트할 수 있다.
상기 내용에 포함되어 있음.
서열 목록
본 명세서의 도면에 도시된 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 하기 SEQ ID 번호로 지정되어 있다.
SEQ ID 번호: 1 도 1
SEQ ID 번호: 2 도 2
SEQ ID 번호: 3 도 3
SEQ ID 번호: 4 도 4
SEQ ID 번호: 5 도 5
SEQ ID 번호: 6 도 7
SEQ ID 번호: 7 도 9
SEQ ID 번호: 8 도 11
SEQ ID 번호: 9 도 17
SEQ ID 번호: 10 도 19
SEQ ID 번호: 11 도 26
SEQ ID 번호: 12 도 28
SEQ ID 번호: 13 도 31
Claims (114)
- 도 4 또는 도 5의 아미노산 서열 또는 기능을 보존하고 있는 아미노산 변이(amino acid changes)에서만 도 4 또는 도 5의 아미노산 서열과 다른 아미노산 서열을 포함하는 인간 CED-6 단백질을 코딩하는 데옥시뉴클레오티드의 서열을 포함하는 발현 벡터.
- 제1항에 있어서,전사 개시 코돈에서부터 전사 정지 코돈까지 도 2 또는 도 3에 도시된 데옥시뉴클레오티드의 서열을 포함함을 특징으로 하는 발현 벡터.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,상기 인간 CED-6 단백질 또는 기능적으로 보존된 그들의 변형체의 발현이 리포터 유전자로부터의 리포터 단백질의 발현으로 되도록 벡터에 위치된 리포터 유전자를 코딩하는 데옥시뉴클레오티드의 서열을 포함함을 특징으로 하는 발현 벡터.
- 제3항에 있어서,상기 리포터 유전자는 상기 인간 CED-6 단백질 또는 기능적으로 보존된 그들의 변형체를 코딩하는 데옥시뉴클레오디드의 서열에 대해서 5'에 위치됨을 특징으로 하는 발현 벡터.
- 제3항에 있어서,상기 리포터 유전자는 상기 인간 CED-6 단백질 또는 기능적으로 보존된 그들의 변형체를 코딩하는 데옥시뉴클레오디드의 서열에 대해서 3'에 위치됨을 특징으로 하는 발현 벡터.
- 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,상기 리포터 유전자는 녹색 형광 단백질(GFP)을 암호화함을 특징으로 하는 발현 벡터.
- 제4항에 있어서,멀티클로닝 부위에 삽입되고, 도 4 또는 도 5에 도시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 인간 CED-6 단백질 또는 기능적으로 보존된 그들의 변형체를 코딩하는 데옥시뉴클레오티드의 서열을 가진 pEGFP-C2임을 특징으로 하는 발현 벡터.
- 제5항에 있어서,멀티클로닝 부위에 삽입되고, 도 4 또는 도 5에 도시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 인간 CED-6 상동기관(homologue) 또는 기능적으로 보존된 그들의 변형체를 코딩하는 데옥시뉴클레오티드의 서열을 가진 pEGFP-N3임을 특징으로 하는 발현 벡터.
- 제4항 또는 제7항에 있어서,상기 벡터는 도 28의 뉴클레오티드 서열(pGA3103)을 포함함을 특징으로 하는 발현 벡터.
- 제5항 또는 제8항에 있어서,상기 벡터는 도 9의 뉴클레오티드 서열(pGA3104)을 포함함을 특징으로 하는 발현 벡터.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,상기 벡터로부터 발현된 상기 인간 CED-6 단백질 또는 기능적으로 보존된 그들의 변형체는 그들의 아미노 및/또는 카르복시 말단에 에피토프 태그를 포함함을 특징으로 하는 발현 벡터.
- 제11항에 있어서,상기 에피토프 태그는 His A인 것임을 특징으로 하는 발현 벡터.
- 제11항에 있어서,그안에 삽입되고, 도 4 또는 도 5에 도시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 인간 CED-6 단백질, 또는 기능적으로 보존된 그들의 변형체를 코딩하는 데옥시뉴클레오티드의 서열을 가진 pBAD/HisA임을 특징으로 하는 발현 벡터.
- 제12항에 있어서,도 17에 도시된 데옥시뉴클레오티드의 서열(pGA 1028)을 가진 것임을 특징으로 하는 발현 벡터.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 발현 벡터로 형질감염된 포유류 세포주.
- 제15항에 있어서,상기 세포주는 섬유아세포 세포주 또는 상피 세포주로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 포유류 세포주.
- 제16항에 있어서,상기 세포주는 COS1, BHK21, L929, CV1, SWISS 3T3, HT144, IMR32, HEPG2, MDCK, MCF7, 293, Hela, A549, SW48 또는 G361로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 포유류 세포주.
- 제15항에 있어서,상기 세포주는 1차 세포주(a primary cell-line)인 것임을 특징으로 하는 포유류 세포주.
- 제18항에 있어서,상기 세포주는 인간 피부 FIB(human dermal FIBs), 피부 케라티노시트(dermal keratinocytes), 백혈구, 단구(monocytes), 림프구, 수상돌기 세포(dendritic cells) 또는 마크로파지(macrophages)로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 포유류 세포주.
- 제19항에 있어서,마우스 마크로파지 세포주 J774 또는 인간 단구 세포주 THP-1임을 특징으로 하는 포유류 세포주.
- 어떤 화합물이 아폽토틱 세포(apoptotic cells)의 식작용을 촉진하는 시그널 형질도입 경로(a signal transduction pathway)의 저해제인지 인헨서(an enhancer)인지를 결정하는 방법으로, 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항의 형질감염된 포유류 세포를 아폽토틱 입자에 노출시키는 단계와 상기 화합물의 존재 및 부재중에서 상기 형질감염 세포에 의해 상기 입자의 식세포의 섭취 비율을 측정하는 단계를 포함하는 방법.
- 제21항에 있어서,상기 형질감염 세포는 상기 아폽토틱 입자가 첨가되기 전에 상기 화합물에노출되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제21항 또는 제22항에 있어서,상기 아폽토틱 입자는 선택적으로 옵손화된(opsonised) 아폽토틱 호중구, 아폽토틱 임파구 및 아폽토틱 적혈구로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,상기 아폽토틱 입자는 점착성(adherent) 세포주 PC12를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,상기 아폽토틱 입자는 성장인자 의존성 마우스 세포주 Ba/F3를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제25항에 있어서,상기 Ba/F3 세포는 성장 인자 IL-3의 부재중에 배양되어 아폽토틱되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,상기 아폽토틱 입자를 포함하는 상기 세포는 리포터 유전자로 안정하게 형질감염되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제27항에 있어서,상기 리포터 유전자는 β-갈락토시다제를 코딩하는 유전자, 형광 단백질을 코딩하는 유전자 또는 발광(luminescence)을 일으킬 수 있는 단백질을 코딩하는 유전자로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제28항에 있어서,상기 발광을 일으킬 수 있는 단백질은 루시페라제인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제28항에 있어서,상기 형광 단백질은 녹색 형광 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제26항에 있어서,상기 아폽토틱 입자는 β-갈락토시다제 또는 루시페라제로 안정하게 형질감염된 Ba/F3 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제31항에 있어서,식작용의 수준은 상기 β-갈락토시다제에 의해 형광성 화합물로 전환되는 기질(a substrate)을 첨가함으로써 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제21항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,상기 테스트 화합물에 노출될 때 식작용이 관찰되지 않거나 또는 식작용의 양이 감소된 것으로 관찰되면, 상기 형질감염된 포유류 세포는 생존능력 (viability)에 대해 검사되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제33항에 있어서,생존 가능하다면 상기 형질감염된 포유류 세포의 표현형은 동일 세포주의 형질감염되지 않은 포유류 세포의 표현형과 비교되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제21항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,상기 테스트 화합물의 존재 중에 식작용의 양이 증가된 것이 관찰되면, 상기 방법은 상기 화합물을 상기 동일 세포주의 형질감염되지 않은 포유류 세포에 노출시키는 단계 및 상기 화합물이 상기 형질감염된 포유류 세포에 의해 나타난 표현형과 실질적으로 동일한 표현형을 유발하는지를 관찰하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제21항 내지 제35항 중 어느 한 항의 방법에 의해 아폽토틱 세포의 식작용을촉진하는 시그널 형질도입 경로의 저해제 또는 인헨서로서 동정된 화합물.
- (1) 도 4 또는 도 5에 도시된 아미노산의 서열 또는 기능이 보존되는 아미노산 변이에서만 도 4 또는 도 5에 도시된 것과 다른 아미노산 서열을 포함하는 인간 CED-6 단백질을 포유류 세포내로 마이크로 주입(micro-injecting)하는 단계;(2) 단계 (1)에서 생산된 포유류 세포를 아폽토틱 입자에 노출시키고 상기 화합물의 존재 및 부재중에서 상기 세포에 의한 상기 입자의 식세포의 섭취 비율을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 어떤 화합물이 아폽토틱 세포의 식작용을 촉진하는 시그널 형질도입 경로의 저해제인지 인헨서인지를 결정하는 방법.
- 제37항에 있어서,상기 마이크로 주입된 포유류 세포는 상기 아폽토틱 입자가 첨가되기 전에 상기 화합물에 노출되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제38항에 있어서,상기 아폽토틱 입자는 선택적으로 옵손화된 아폽토틱 호중구, 아폽토틱 임파구 및 아폽토틱 적혈구로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제37항 또는 제38항 중 어느 한 항에 있어서,상기 아폽토틱 입자는 점착성 세포주 PC12를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서,상기 아폽토틱 입자는 성장인자 의존성 마우스 세포주 Ba/F3를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제41항에 있어서,상기 Ba/F3 세포는 성장 인자 IL-3의 부재중에 배양되어 아폽토틱되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,상기 아폽토틱 입자를 포함하는 상기 세포는 리포터 유전자로 안정하게 형질감염되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제27항에 있어서,상기 리포터 유전자는 β-갈락토시다제를 코딩하는 유전자, 형광 단백질을 코딩하는 유전자 또는 발광을 일으킬 수 있는 단백질을 코딩하는 유전자로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제44항에 있어서,상기 발광을 일으킬 수 있는 단백질은 루시페라제인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제44항에 있어서,상기 형광 단백질은 녹색 형광 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제42항에 있어서,상기 아폽토틱 입자는 β-갈락토시다제로 안정하게 형질감염된 Ba/F3 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제47항에 있어서,식작용의 수준은 상기 β-갈락토시다제에 의해 형광성 화합물로 전환되는 기질을 첨가함으로써 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제37항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,상기 포유류 세포는 섬유아세포 또는 상피 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제49항에 있어서,상기 포유류 세포는 COS1, BHK21, L929, CV1, SWISS 3T3, HT144, IMR32,
- 제37항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,상기 포유류 세포는 1차 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제51항에 있어서,상기 포유류 세포는 인간 피부 FIB, 피부 케라티노시트, 백혈구, 단구 또는 마크로파지로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제52항에 있어서,상기 포유류 세포는 마우스 마크로파지 세포 J774 또는 인간 단구 세포 THP-1인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제37항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서,상기 테스트 화합물에 노출될 때 식작용이 관찰되지 않거나 또는 식작용의 양이 감소된 것으로 관찰되면, 상기 형질감염된 포유류 세포는 생존능력에 대해 검사되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제54항에 있어서,생존 가능하다면, 상기 형질감염된 포유류 세포의 표현형은 동일 세포주의 형질감염되지 않은 포유류 세포의 표현형과 비교되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제21항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,상기 테스트 화합물의 존재 중에 식작용의 양이 증가된 것이 관찰되면, 상기 방법은 상기 화합물을 상기 동일 세포주의 형질감염되지 않은 포유류 세포에 노출시키는 단계 및 상기 화합물이 상기 형질감염된 포유류 세포에 의해 나타난 표현형과 실질적으로 동일한 표현형을 유발하는지를 관찰하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제37항 내지 제56항 중 어느 한 항의 방법에 의해 아폽토틱 세포의 식작용을 촉진하는 시그널 형질도입 경로의 저해제 또는 인헨서로서 동정된 화합물.
- (1) 도 2 또는 도 3에 도시된 뉴클레오티드의 서열의 전부 또는 일부에 대해 RNA 안티센스를 발현하는 벡터를 포유류 세포내로 마이크로 주입하거나 또는 형질감염시키는 단계;(2) 단계 (1)에서 생산된 포유류 세포를 아폽토틱 입자에 노출시키고 상기 화합물의 존재 또는 부재중에서 상기 세포에 의한 상기 입자의 식세포의 섭취 비율을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 어떤 화합물이 아폽토틱 세포의 식작용을 촉진하는 시그널 형질도입 경로의 저해제인지 인헨서인지를 결정하는 방법.
- 제58항에 있어서,상기 안티센스 RNA는 2xSSC; 0.1% SDS; 25℃ 내지 50℃ 보다 심한 엄격한 조건하에서 도 2 또는 도 3에 도시된 뉴클레오티드의 서열에 혼성화(hybridizing)할 수 있는 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제58항 또는 제59항에 있어서,제38항 내지 제56항 중 어느 한 항의 특징을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제58항 내지 제60항 중 어느 한 항의 방법에 의해 아폽토틱 세포의 식작용을 촉진하는 시그널 형질도입 경로의 저해제 또는 인헨서로서 동정된 화합물.
- 도 4에 도시된 아미노 서열을 갖는 인간 CED-6 상동기관의 단편(a fragment)을 포함하고 상기 단편은 아미노산의 서열 NRAFSRKKDKTC, FLGSTEVEQPKGTE 또는 TRNGTQPPPVPSRST을 포함하는 것임을 특징으로 하는 펩티드.
- 제62항에 있어서,아미노산의 서열 NRAFSRKKDKTC, FLGSTEVEQPKGTE 또는 TRNGTQPPPVPSRST로 이루어지는 것임을 특징으로 하는 펩티드.
- 도 4에 도시된 인간 CED-6 상동기관의 하기 에피토프 중 하나 또는 그 이상에 대한 항체를 포함하는 항체 조제물(an antibody preparation): NRAFSRKKDKTC, FLGSTEVEQPKGTE 또는 TRNGTQPPPVPSRST.
- 상기 인간 CED-6 상동기관 에피토프 NRAFSRKKDKTC에 대한 항체를 포함하는 항체 조제물.
- 상기 인간 CED-6 상동기관 에피토프 FLGSTEVEQPKGTE에 대한 항체를 포함하는 항체 조제물.
- 상기 인간 CED-6 상동기관 에피토프 TRNGTQPPPVPSRST에 대한 항체를 포함하는 항체 조제물.
- 제63항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서,상기 항체는 폴리클로날 항체인 것임을 특징으로 하는 항체 조제물.
- (a) 상기 개체로부터 식세포의 샘플을 얻는 단계;(b) 상기 식세포를 제64항 내지 제68항 중 어느 한 항의 항체 조제물에 노출시키는 단계;(c) 상기 항체 및 상기 CED-6 단백질 사이에 형성된 모든 면역 복합체(immune complexes)의 존재를 정량적으로 측정하는 단계; 그리고(d) 상기 형성된 면역 복합체의 양을 대조 개체(a control individual)로부터의 식세포를 사용하여 형성된 것과 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 어떤 개체(an individual)에서 식세포내의 인간 CED-6 단백질의 과발현 또는 미발현(over or under expression)과 관련된 질병을 진단하는 방법:
- (a) 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 발현 벡터로 형질감염된 포유류 세포를 상기 테스트되는 화합물에 노출시키는 단계;(b) 상기 포유류 세포를 제64항 내지 제68항 중 어느 한 항의 항체 조제물에 노출시키는 단계;(c) 상기 항체 및 상기 세포에 의해 발현된 단백질 사이에 형성된 모든 면역 복합체의 존재를 정량적으로 측정하는 단계; 그리고(d) 상기 검출된 면역 복합체의 수준과 상기 화합물에 노출되지 않고 단계(a)에 설명된 것처럼 형질 감염된 포유류 세포에서 검출된 면역 복합체의 양과 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 어떤 화합물이 아폽토틱 세포의 식작용을 촉진하는 시그널 형질도입 경로의 저해제인지 인헨서인지 결정하는 방법.
- 제70항에 있어서,상기 포유류 세포는 COS1, BHK21, L929, CU1 SWISS 3T3, HT144, IMR32, HEPG2, MDCK, MCF7, 293, Hela, A549, SW48 또는 G361로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제71항에 있어서,상기 포유류 세포는 COS1 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제70항에 있어서,상기 포유류 세포는 인간 피부 FIB, 피부 케라티노시트, 백혈구, 단구 또는 마크로파지인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제73항에 있어서,상기 세포는 마우스 단구 세포 J774 또는 인간 단구 세포 THP-1인 것을 특징으로 하는 방법.
- (1) 도 4 또는 도 5에 도시된 아미노산의 서열 또는 기능이 보존되는 아미노산 변이에서만 도 4 또는 도 5에 도시된 서열과 다른 아미노산 서열; 및(2) 리포터 유전자의 발현 산물인 단백질을 포함하는 융합 단백질.
- 제75항에 있어서,도 9 또는 도 28에 도시된 서열을 코딩하는 GFP 및 hlced-6의 발현에 의해 얻어진 것임을 특징으로 하는 융합 단백질.
- (1) 도 4 또는 도 5에 도시된 아미노산의 서열 또는 기능이 보존되는 아미노산 변이에서만 도 4 또는 도 5에 도시된 서열과 다른 아미노산의 서열, 그리고(2) 에피토프 테그를 포함하는 융합 단백질.
- 제77항에 있어서,도 17에 도시된 서열을 코딩하는 HisA 및 hlced-6의 발현에 의해 얻어질 수 있는 것임을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 아폽토틱 세포의 식작용의 인헨서 또는 저해제인 화합물을 동정하는 방법으로:(a) 테스트되는 화합물의 존재 및 부재중에, 현미경검사 없이도 검출가능한 시그널을 발생할 수 있는 리포터 유전자로 안정하게 형질감염된 아폽토틱 포유류 세포에 포유류 전문 또는 준전문 식세포를 노출시키는 단계,(b) 상기 식세포에 의해 잡아먹히지 않는 모든 아폽토틱 세포를 제거하는 단계; 그리고(c) 상기 식세포로부터 상기 리포터 유전자의 어떤 시그널이든지 검출하는 단계를 포함하며;상기 화합물의 부재중의 시그널과 비교된 상기 화합물의 존재중의 시그널과의 차이는 상기 화합물이 아폽토틱 세포의 식작용의 저해제인지 또는 인헨서인지를 나타내는 표시인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제79항에 있어서,상기 식세포는 마우스 마크로파지 세포주 J774 또는 인간 단구 세포주 THP-1인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제80항에 있어서,상기 단구 세포주는 상기 아폽토틱 입자에 노출되기 전에 그것을 마크로파지로 분화하기 위한 조건하에서 배양되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제79항 내지 제81항 중에 어느 한 항에 있어서,상기 식세포는 트렌스제닉 세포(a transgenic cell)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제82항에 있어서,상기 식세포는 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 발현 벡터로 형질감염된것을 특징으로 하는 방법.
- 제82항에 있어서,상기 식세포는 세포 표면 수용체 CD36을 코딩 발현 벡터로 형질감염된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제84항에 있어서,상기 식세포는 도 31에 도시된 벡터로 형질감염된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제79항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서,상기 아폽토틱 세포는 상기 점착성 세포주 PC12를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제79항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서,상기 아폽토틱 세포는 상기 성장 인자 의존성 마우스 세포주 Ba/F3를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제26항에 있어서,상기 Ba/F3 세포는 성장 인자 IL-3의 부재중에 배양시킴으로써 아폽토틱되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제88항에 있어서,상기 세포는 약 20% 아넥신 양성이고 약 5% 미만의 프로피디움 아이오다이드(propidium iodide) 음성인 경우 아폽토틱으로 간주되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제79항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서,상기 리포터 유전자는 β-갈락토시다제를 코딩하는 유전자, 형광 단백질을 코딩하는 유전자 또는 발광을 일으킬 수 있는 단백질을 코딩하는 유전자로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제90항에 있어서,상기 발광을 일으킬 수 있는 단백질은 루시페라제인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제91항에 있어서,상기 아폽토틱 세포는 도 19상에 도시된 PGL2 대조구의 발현 특징을 나타내는 플라스미드로 안정하게 형질감염된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제92항에 있어서,상기 아폽토틱 세포는 도 19에 도시된 데옥시뉴클레오티드의 서열을 포함하는 플라스미드로 안정하게 형질감염된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제79항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서,상기 형광 단백질은 녹색 형광 단백질(GFP)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제94항에 있어서,상기 아폽토틱 세포는 상기 발현 특징을 나타내는 플라스미드 또는 도 10 또는 도 29에 도시된 플라스미드로 안정하게 형질감염된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제95항에 있어서,상기 아폽토틱 세포는 도 9 또는 도 28에 도시된 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 플라스미드로 형질감염된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제79항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서,상기 아폽토틱 세포는 β-갈락토시다제를 발현하는 플라스미드로 안정하게 형질감염된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제97항에 있어서,상기 플라스미드는 도 11에 도시된 플라스미드의 발현 특징으로 갖는 것을특징으로 하는 방법.
- 제98항에 있어서,상기 플라스미드는 도 11에 도시된 데옥시뉴클레오티드의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제79항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서,상기 아폽토틱 입자는 β-갈락토시다제로 안정하게 형질감염된 세포주 Ba/F3를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제100항에 있어서,상기 식작용의 수준은 상기 β-갈락토시다제에 의해 형광성 화합물로 전환되는 기질을 첨가함으로써 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제79항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서,상기 테스트 화합물에 노출될 때 식작용이 관찰되지 않거나 또는 식작용의 양이 감소된 것으로 관찰되면, 상기 식세포는 생존능력에 대해 테스트되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제79항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서,상기 식세포는 멀티웰 플레이트(multiwell plates)에서 배양되고 상기 아폽토틱 세포 및 상기 테스트 화합물은 각각의 웰에 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 선행하는 청구항 중 어느 항에 있어서,상기 리포터 유전자로부터의 시그널은 자동 플레이트 판독기(an automatic plate reader)에 의해 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제101항에 있어서,상기 리포터 유전자로부터의 시그널은 형광성 시그널을 검출할 수 있는 자동 플레이트 판독기에 의해 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제79항 내지 제105항 중 어느 항의 방법에 의해서 아폽토틱 세포의 식작용의 저해제 또는 인헨서로서 동정된 화합물.
- 제22항 내지 제35항, 제39항 내지 제56항, 및 제58항 내지 제60항 중 어느 항에 있어서,식세포의 섭취는 비현미경적 수단에 의해 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제107항에 있어서,상기 비현미경적 수단은 멀티웰 플레이트 판독기인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제108항에 있어서,상기 멀티웰 플레이트 판독기는 발광, 형광을 측정하거나 또는 분광측광기 검출을 실행하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제79항 내지 제105항 중 어느 항에 있어서 제108항 및 제109항의 특징을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
- (a) 상기 개체로부터 식세포의 샘플을 얻는 단계;(b) 상기 식세포로부터 RNA를 분리시키는 단계;(c) 상기 RNA로부터 cDNA를 제조하는 단계;(d) 상기 cDNA상에 제1 PCR 반응을 행하는 단계;(e) 상기 제1 PCR 반응의 반응 산물에 대해 제2 네스티드 PCR을 행하는 단계;(f) 제1 및 제2 PCR로부터의 반응 산물을 분석함으로써 CED-6 RNA의 존재를 정량적 및 정성적으로 측량하는 단계; 및(g) 제1 및 제2 PCR에서 형성된 반응 산물의 양 및 형태를 대조구 개체로부터의 식세포를 사용하여 형성된 반응 산물의 것과 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 어떤 개체에서 식세포내의 인간 CED-6의 과발현 또는 미발현(over- or under-expression)과 관련된 질병을 진단하는 방법.
- 제111항에 있어서,상기 PCR은 인간 CED-6의 서열로부터 유도되거나, 또는 cDNA의 발생에 사용된 벡터로부터 유도된 프라이머(primers)로 행해지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제111항 또는 제112항에 있어서,상기 제1 PCR은 하기 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머로 행해지는 것을 특징으로 하는 방법:1) cgcaaggatccccatgaaccgtgcttttagcaggaag2) gatctactaggtactggag
- 제111항, 제112항 또는 제113항에 있어서,상기 제2 PCR은 하기 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머로 행해지는 것을 특징으로 하는 방법:1) cgcaaggatccccatgaaccgtgcttttagcaggaag2) gcggatggtaccgtcgactgctgatacttgagttattctcag
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