KR20010032243A - Stress resistance gene - Google Patents
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Abstract
본 발명은 알도오스 환원효소 상동 단백질의 발현 수준이 증가되고 상이한 기원을 갖는 스트레스 조건에 대해 고내성을 나타내는, 유리하게 형질전환된 식물 세포, 육종 재료, 식물 일부 및 식물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 알도오스 환원효소 상동 단백질을 발현시키기에 적합한 DNA 분자와 벡터 및 알도오스 환원효소 상동 단백질을 과잉생산하는 식물을 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 유해한 생물적 및 비생물적 스트레스 조건에 의해 유발된 작물의 손상을 줄이고, 이로써 수확 전망을 개선시키는데 적합하다.The present invention relates to advantageously transformed plant cells, breeding materials, plant parts and plants, in which the expression level of the aldose reductase homologous protein is increased and exhibits high resistance to stress conditions of different origin. The present invention also relates to a method for producing cells from plants overproducing DNA molecules and vectors and aldose reductase homologous proteins suitable for expressing aldose reductase homologous proteins. The present invention is suitable for reducing damage to crops caused by harmful biological and abiotic stress conditions, thereby improving harvest prospects.
Description
본 발명은 알도오스 환원효소 상동 단백질의 발현 수준이 증가하여 스트레스 조건에 대해 고내성을 나타내는 식물 세포, 육종 재료, 식물 일부 및 식물에 관한 것이다. 식물 세포, 육종 재료, 식물 일부 및 식물은 그 자체로 제공되어 있고, 이들은 형질전환되는 것이 유리하다. 또한, 본 발명은 DNA와 RNA와 같은 핵산 및 세포에서 알도오스 환원효소 상동 단백질을 발현시키기에 적당한 벡터 및 알도오스 환원효소 상동 단백질을 과잉생산하는 식물 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to plant cells, breeding materials, plant parts and plants which have increased expression levels of aldose reductase homologous protein and thus exhibit high resistance to stress conditions. Plant cells, breeding materials, plant parts and plants are provided by themselves, which are advantageously transformed. The present invention also relates to a method for producing plant cells overproducing a vector and aldose reductase homologous protein suitable for expressing aldose reductase homologous protein in nucleic acids and cells such as DNA and RNA.
본 발명은 유해한 생물적 및 비생물적 스트레스 조건에 의해 유발된 작물의 손상을 줄이고, 이로써 수확 전망을 개선시키는 특정 용도를 갖는다.The present invention has particular uses to reduce damage to crops caused by harmful biological and abiotic stress conditions, thereby improving harvest prospects.
일생 동안, 식물은 비생물적(예를 들어, 격렬한 광세기에 의한 광저해, UV-B 방사선, 오존, 중금속, 고온 및 저온, 수분 결핍, 홍수 및 상해) 및 생물적(예를 들어, 바이러스, 박테리아 및 진균 감염, 곤충 활동) 스트레스 조건 둘 모두에 노출된다. 이들 스트레스 조건은 식물 생산력을 크게 저하시켜서 경제적인 타격을 줄 수 있다; 따라서, 식물 스트레스 내성을 증가시키고, 높은 스트레스 내성을 갖는 식물 및 육종 재료를 생성시키는 것은 식물 육종가의 주된 목표중의 하나이다.During life, plants are abiotic (e.g. photoinhibition by intense light intensity, UV-B radiation, ozone, heavy metals, high and low temperatures, moisture deficiency, flooding and injury) and biological (e.g. viruses , Bacterial and fungal infections, insect activity). These stress conditions can drastically reduce plant productivity and can be economically damaging; Therefore, increasing plant stress tolerance and producing plants and breeding materials with high stress resistance are one of the main goals of plant breeders.
알도오스 환원효소(EC. 1.1.1.21) 및 알데히드 환원효소(EC. 1.1.1.2) 효소는 알도-케토 환원효소 수퍼패밀리에 속한다. 이들 효소는 알도오스 당 내지 방향족 알데히드에 걸친 광범위한 기질 특이성을 갖는 단량체 NADPH 의존성 산화환원효소이다 [참조: Bohren K.M. et al. 1989. J. Biol. Chem. 264: 9547-9551]. 현재까지 식물 알도오스 환원효소는 외떡잎식물에서만 단리되었다. 보리로부터의 알도오스 환원효소 상동 유전자의 발현은 배(embryo) 발생의 후기에서 유도된다 [참조: Bartels, D. et al. 1991. The EMBO J. 10: 1037-1043; Roncarati, R. 1995. The Plant Journal. 7(5):809-822]. 브로움그래스(bromegrass) 식물과 관련된 실험은 알도오스 환원효소 상동 유전자의 발현과 세포의 저온 내성 사이의 관련성을 제시하였다 [참조: Lee, S.P. 1993. J. Plant Physiol. 142: 749-753]. 일련의 실험은 동물 세포에서의 알도오스 환원효소의 삼투조절 기능을 암시하는데, 이는 이들 효소가 폴리올 반응 경로의 첫 번째 단계(즉, D-글루코오스의 소르비톨로의 환원)를 촉매할 수 있기 때문이다. 세포내 소르비톨 수준 뿐만 아니라 다른 오스몰리트의 조절은 삼투 균형 및 세포 부피를 유지시키는 작용을 하는 것으로 공지되어 있다 [참조: Moriyama, T. et al. 1989. J. Biol. Chem. 264: 16815-16821; Ferraris, J.D. 1996. J. Biol. Chem. 271: 18318-18321]. 그러나, 이들 효소의 생리학적 기능에 대해서는 높은 불확실성이 존재하는데, 이는 알도오스 및 알데히드 환원효소와 다수의 알데히드와의 고반응성이 동물 세포에서의 이들 효소의 해독제로서의 기능의 가능성을 열어주기 때문이다.The aldose reductase (EC. 1.1.1.21) and aldehyde reductase (EC. 1.1.1.2) enzymes belong to the aldo-keto reductase superfamily. These enzymes are monomeric NADPH dependent oxidoreductases with broad substrate specificities ranging from aldose sugars to aromatic aldehydes. See Bohren K.M. et al. 1989. J. Biol. Chem. 264: 9547-9551. To date, plant aldose reductase has been isolated only from monocotyledonous plants. Expression of the aldose reductase homologous gene from barley is induced later in embryo development. Bartels, D. et al. 1991. The EMBO J. 10: 1037-1043; Roncarati, R. 1995. The Plant Journal. 7 (5): 809-822]. Experiments involving bromgrass plants have suggested a link between the expression of aldose reductase homologous genes and the low temperature resistance of cells [Lee, S.P. 1993. J. Plant Physiol. 142: 749-753. A series of experiments suggest the osmotic function of aldose reductase in animal cells, since these enzymes can catalyze the first step of the polyol reaction pathway (ie, the reduction of D-glucose to sorbitol). . Regulation of intracellular sorbitol levels as well as other osmolites is known to act to maintain osmotic balance and cell volume. Moriyama, T. et al. 1989. J. Biol. Chem. 264: 16815-16821; Ferraris, J.D. 1996. J. Biol. Chem. 271: 18318-18321. However, there is a high uncertainty about the physiological function of these enzymes because the high reactivity of aldose and aldehyde reductase with many aldehydes opens the possibility of their function as antidote in animal cells.
이들 단백질의 해독 기능의 잠재적 모드는 다음과 같이 요약될 수 있다: 다수의 병리학적 작용은 세포 손상을 야기시킬 수 있는 유해한 자유 라디칼을 생성시킬 수 있다. 대부분의 이들 자유 라디칼은 매우 짧은 수명을 가지며, 이들의 독성 효과는 이들이 발생된 부위 주변의 좁은 영역에만 집중된다. 그러나, 이들 자유 라디칼과 막지질과의 반응은 반응성 알데히드 화합물을 생성시키도록 후속 분해될 수있는 지질 퍼옥시드 및 히드로퍼옥시드를 형성시킨다. 이들 알데히드는 자유 라디칼 보다 훨씬 더 안정하며, 더욱이, 이들은 이들의 형성 부위로부터 이동하여 독성 효과를 전체 세포로 확장시킬 수 있다. 가장 자주 형성되고 가장 독성인 지질 알데히드중의 하나는 4-히드록시-노네날 (HNE)이다. 이것의 반응성 α-β 불포화 이중 결합으로 인해, HNE는 세포 단백질의 -SH기 및 리신 또는 히스티딘 잔기와 마이클(Michael) 첨가생성물을 자발적으로 형성할 수 있다. HNE의 알데히드기는 단백질의 α 또는 ε 아미노기와 스키프(Schiff) 염기를 형성할 수 있고, 이로써, 가교를 통해 이것은 촉매적 특성 및 구조적 특성을 변화시킬 수 있다. 나노몰 농도에서, HNE는 DNA 손상을 유발시킬 수 있고, 마이크로몰과 같은 보다 높은 농도에서는 세포독성 효과를 갖는다.The potential modes of detoxification function of these proteins can be summarized as follows: A number of pathological actions can produce harmful free radicals that can cause cellular damage. Most of these free radicals have a very short lifespan and their toxic effects are concentrated only in the narrow area around the site where they occur. However, the reaction of these free radicals with membrane lipids results in the formation of lipid peroxides and hydroperoxides that can be subsequently degraded to produce reactive aldehyde compounds. These aldehydes are much more stable than free radicals and, moreover, they can migrate from their site of formation and extend the toxic effect to whole cells. One of the most frequently formed and most toxic lipid aldehydes is 4-hydroxy-nonenal (HNE). Due to its reactive α-β unsaturated double bonds, HNE can spontaneously form Michael adducts with -SH groups and lysine or histidine residues of cellular proteins. The aldehyde group of HNE can form a Schiff base with the α or ε amino group of the protein, thereby, through crosslinking, which can change catalytic and structural properties. At nanomolar concentrations, HNE can cause DNA damage and at higher concentrations such as micromolar have a cytotoxic effect.
HNE가 알데히드기를 갖기 때문에, 이것의 해독작용의 가능한 방식은 알도-케토 환원효소 수퍼패밀리의 일원에 의해 촉매되는 이것의 알코올로의 환원이다. 문헌을 검토한 결과, 이것의 해독 역할은 실험 결과와 일치하는 것으로 여겨질 수 있다 [참조: Van der Jagt, D.L. et al. 1995 Biochim. Biophys. Acta 1249: 117-126; Srivastava, S. et al. 1995. Biochem. Biophys. Res. Commun. 217: 741-746; Spycher S. et al. 1996. Biochem. Biophys. Res. Commun. 226: 512-516; Spycher S. et al. 1997. FASEB J. 11: 181-187].Since HNE has an aldehyde group, a possible mode of its detoxification is its reduction to alcohol catalyzed by a member of the aldo-keto reductase superfamily. In reviewing the literature, its detoxification role can be considered consistent with the experimental results. Van der Jagt, D.L. et al. 1995 Biochim. Biophys. Acta 1249: 117-126; Srivastava, S. et al. 1995. Biochem. Biophys. Res. Commun. 217: 741-746; Spycher S. et al. 1996. Biochem. Biophys. Res. Commun. 226: 512-516; Spycher S. et al. 1997. FASEB J. 11: 181-187.
본 발명의 목적은 출발 식물, 즉, 표준 작물 또는 장식류와 비교하여 비생물적 및 생물적 스트레스 조건 둘 모두에 대해 증가된 내성을 갖는, 신규하고, 유리하게는 형질전환된 식물 타입을 생성시키고, 이들을 생성시키는 방법을 제공하는데 있다.It is an object of the present invention to produce novel, advantageously transformed plant types with increased resistance to both abiotic and biological stress conditions compared to starting plants, ie standard crops or ornamentals, It is to provide a method for generating them.
본 발명은, 일반적 해독 및 삼투조절 효과를 갖는 알도오스 환원효소 상동 효소 수퍼패밀리 일원의 과잉생산을 통해, 이들로부터 재생된 식물 세포 및 식물이 동시에 상이한 기원을 갖는 다수의 스트레스 조건에 대해 광범위하게 내성을 띠게 되도록 할 수 있다는 발견을 기초로 한다. 특히, 효소의 효과는 다수의 기질, 예를 들어 4-히드록시-노네날(HNE) 및 DL-글리세르알데히드의 알데히드기를 환원시키는 이것의 능력과 상호관련있다.The present invention, through the overproduction of a member of the aldose reductase homologous enzyme superfamily member having general detoxification and osmoregulatory effects, is broadly resistant to a number of stress conditions in which plant cells and plants regenerated therefrom are of different origin at the same time. It is based on the discovery that it can be done. In particular, the effect of enzymes correlates with its ability to reduce the aldehyde groups of many substrates, such as 4-hydroxy-nonenal (HNE) and DL-glyceraldehyde.
본 발명을 실시하기 위해, 알팔파(Medicago sativa) 알도오스 환원효소 상동 효소(MsALRh)를 코딩하는 cDNA가 유전자 조작 방법을 적용시킴으로써 단리되었다. 이러한 cDNA를 조절 영역, 예를 들어 프로모터에 부착시켜서, 식물에서의 이소적 발현을 예를 들어 프레임과 같은 기능적 관계로 구성적 발현시켜서 보장함으로써, 일도오스 환원효소 상동 효소의 과잉생산이 형질전환된 식물의 세포에서 수행되었고, 이로써 알도오스 환원효소 상동 단백질의 해독 및/또는 삼투조절 기능을 통해 다수의 기원을 갖는 스트레스 조건에 노출된 식물의 손상을 줄일 수 있다.To practice the present invention, cDNA encoding alfalfa (Medicago sativa) aldose reductase homologous enzyme (MsALRh) was isolated by applying genetic engineering methods. By attaching these cDNAs to regulatory regions, such as promoters, to ensure constitutive expression of ectopic expression in plants, for example in a functional relationship such as a frame, overproduction of ilose reductase homologous enzymes is transformed. It has been carried out in the cells of plants, thereby reducing the damage of plants exposed to stress conditions of multiple origins through the detoxification and / or osmoregulation functions of the aldose reductase homologous protein.
따라서, 본 발명의 첫 번째 일면에서, 존재하는 알도오스 환원효소 상동 효소의 수준 증가의 결과로써 다수의 스트레스 조건, 특히 광범위한 스트레스 조건의 유해한 효과에 대해 증가된 내성을 나타내는 식물, 식물 세포, 식물 일부, 육종 재료 및 식물 생성물이 제공되며, 이들 모두는 유리하게는 형질전환된다.Thus, in a first aspect of the invention, plants, plant cells, plant parts that exhibit increased resistance to the deleterious effects of a number of stress conditions, in particular a wide range of stress conditions, as a result of increasing levels of aldose reductase homologous enzymes present. , Breeding materials and plant products are provided, all of which are advantageously transformed.
더욱 상세하게는, 본 발명은 알데히드기를 증가된 수준으로 환원시킬 수 있는 1종 이상의 알도오스 환원효소 상동 수퍼패밀리 효소를 생성시켜서, 자유 라디칼의 생성을 수반하는 스트레스 조건의 유해한 효과 및/또는 한발에 대해 증가된 내성을 갖는 식물 세포에 관한 것이다.More specifically, the present invention produces one or more aldose reductase homologous superfamily enzymes capable of reducing aldehyde groups to increased levels, thereby demonstrating the detrimental effects of and / or the detrimental effects of stress conditions involving the production of free radicals. It relates to plant cells with increased resistance to.
본 발명에 따른 식물 세포 및 식물은 서열번호 1로 나타나는 아미노산 서열, 더욱 바람직하게는 서열번호 3(MsALRh 단백질)으로 나타나는 알팔파 서열 또는 이것의 변형체 또는 유도체를 포함하는 알도오스 환원효소 상동 단백질을 유리하게 과잉생산하며, 상기 변형체는 유리하게는 서열번호 1에 나타난 알도오스 환원효소 상동 단백질 서열과 50% 이상 상동이고, 더욱 유리하게는 70% 이상 상동이고, 더욱더 유리하게는 90% 이상 상동이며, 더욱 바람직하게는 서열번호 3의 알팔파 단백질과 이러한 상동성을 갖는다. 더욱 바람직하게는, 세포 및 식물은 이러한 서열, 가장 바람직하게는 서열번호 3과 50% 이상 동일성, 더욱 바람직하게는 70% 동일성, 가장 바람직하게는 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 효소를 과잉생산한다.Plant cells and plants according to the invention advantageously comprise an aldose reductase homologous protein comprising an alfalfa sequence represented by SEQ ID NO: 1, more preferably an alfalfa sequence represented by SEQ ID NO: 3 (MsALRh protein) or a variant or derivative thereof. Overproduction, the variant is advantageously at least 50% homologous to the aldose reductase homologous protein sequence shown in SEQ ID NO: 1, more advantageously at least 70% homologous, even more advantageously at least 90% homologous, and moreover Preferably it has such homology with the alfalfa protein of SEQ ID NO: 3. More preferably, cells and plants overproduce an enzyme comprising a sequence having at least 50% identity, more preferably 70% identity, most preferably 90% identity with this sequence, most preferably SEQ ID NO: 3. do.
본 발명의 식물 세포는 유리하게는 형질전환되고, 알도오스 환원효소 상동 단백질을 발현시킬 수 있는 핵산 분자를 삽입시킴으로써 형질전환된다. 그러나, 본 발명에 따른 식물 세포, 식물 일부 또는 식물은 예를 들어, 화학적 또는 UV광이 변이유발제로서 사용되고 필요한 활성을 갖는 알도오스 환원효소 수퍼패밀리 효소를 과잉생산하는 식물의 선택이 하기 기술된 바와 같은 검정법을 사용하여 수행되는 통상적인 비생물학적 변이-선택 방법에 의해 또한 생성될 수 있다. 알도오스 환원효소 발현의 수준은 하이브리드화(노던 또는 웨스턴 블롯 기법을 사용하는; 실시예 2 참조) 또는 효소 활성, 특히 하기 기술된 바와 같은 HNE 및/또는 DL-글리세르알데히드에 대한 활성의 검출에 의해 결정될 수 있다.Plant cells of the invention are advantageously transformed and transformed by inserting a nucleic acid molecule capable of expressing an aldose reductase homologous protein. However, the plant cells, plant parts or plants according to the present invention are for example selected from plants in which chemical or UV light is used as mutagenesis and overproduce the aldose reductase superfamily enzyme having the required activity as described below. It can also be produced by conventional abiotic variant-selection methods performed using the same assay. Levels of aldose reductase expression may be used for hybridization (using Northern or Western blot techniques; see Example 2) or for the detection of enzyme activity, in particular for HNE and / or DL-glyceraldehyde as described below. Can be determined.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 식물 세포를 포함하는 식물 및 식물 일부에 관한 것이다. 본 발명에 따른 식물 및 식물 일부은 유리하게는 자유라디칼의 생성을 수반하는 스트레스 조건, 더욱 상세하게는 예를 들어 제초제 및/또는 중극속 및/또는 생성중인 과산화수소에 의한 처리 및/또는 NaCl에 의한 처리; 및/또는 바이러스 및/또는 박테리아 및/또는 진균에 의한 감염; 및/또는 한발에 대해 증가된 수준의 내성을 갖는다.The invention also relates to plants and plant parts comprising plant cells according to the invention. The plants and plant parts according to the invention are advantageously treated with stress conditions involving the production of free radicals, more particularly for example with herbicides and / or mesoporous and / or hydrogen peroxide being produced and / or with NaCl. ; And / or infection by viruses and / or bacteria and / or fungi; And / or increased levels of tolerance to drought.
본 발명의 두 번째 일면에서, 본 발명에 사용되는 알도오스 환원효소 상동 단백질을 코드화하는 핵산 서열 뿐만 아니라 이러한 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자가 제공된다. 특히, 이러한 핵산은 재조합되거나, 단리되거나, 인리칭되고/되거나 세포 유리되며, 서열번호 1 또는 3과 상기 상동성을 갖는 전술된 단백질을 코드화한다. 이것은 특히 본 발명에 사용되는 알도오스 환원효소 상동 단백질을 코딩하는 핵산 서열 및 본 발명에 따른 식물 및 식물 일부을 생성시키는데 사용되는 본 발명의 식물 세포를 제공한다.In a second aspect of the invention, a nucleic acid sequence encoding an aldose reductase homologous protein for use in the present invention as well as a recombinant nucleic acid molecule comprising such sequence is provided. In particular, such nucleic acids are recombinant, isolated, enriched and / or cell free, and encode the aforementioned proteins having the homology with SEQ ID NO: 1 or 3. This provides in particular the nucleic acid sequences encoding the aldose reductase homologous proteins used in the invention and the plant cells of the invention for use in producing plants and plant parts according to the invention.
SDM과 같은 변이유발 기법을 사용함으로써, 본 발명의 핵산은 본 발명의 환원효소 단백질의 작용성 변형체를 코드화하도록 설계될 수 있다. 또한, 올리고누클레오티드 및 폴리누클레오티드는, 예를 들어 서던 또는 노던 블롯팅을 사용하여 천연 환원효소 단백질 또는 합성 환원효소 단백질을 추가로 확인하기 위해 프로브 및 프라이머로서 사용될 수 있다.By using mutagenesis techniques such as SDM, the nucleic acids of the invention can be designed to encode functional variants of the reductase proteins of the invention. In addition, oligonucleotides and polynucleotides can be used as probes and primers to further identify natural reductase proteins or synthetic reductase proteins, for example using Southern or Northern blotting.
바람직하게는, 핵산은 DNA 또는 RNA, 특히 cDNA 또는 cRNA이고, 더욱 바람직하게는, 이것이 DNA인 경우에는 이것은 본원의 서열목록에 기재된 서열번호 2와 80% 이상의 동일성을 갖는 누클레오티드 서열을 포함하는 폴리누클레오티드이거나 이러한 서열중의 코돈 누클레오티드의 축중 치환을 갖는 서열이며, 이것이 RNA인 경우에는 이것은 T가 U로 치환된 상보적 서열을 가짐을 특징으로 한다. 바람직하게는, 동일성은 90% 이상이고, 더욱 바람직하게는 95% 이상이고, 가장 바람직하게는 100% 이다. 바람직하게는, 서열의 비동일성 부분은 축중 치환을 포함한다.Preferably, the nucleic acid is DNA or RNA, in particular cDNA or cRNA, more preferably if it is a DNA it comprises a nucleotide comprising a nucleotide sequence having at least 80% identity with SEQ ID NO: 2 as set forth in the sequence listings herein. Or a degenerate substitution of a codon nucleotide in such a sequence, where it is RNA, characterized in that T has a complementary sequence substituted with U. Preferably, the identity is at least 90%, more preferably at least 95%, most preferably 100%. Preferably, the non-identical portion of the sequence includes degenerate substitutions.
가장 바람직한 DNA 또는 RNA는, 고도의 엄격 조건하에 다른 수퍼패밀리 효소를 코드화하는 핵산에 대해 서열의 특징 영역으로부터 선택된, 서열번호 2, 및 연속 염기가 15개 이상, 바람직하게는 30개 이상, 더욱 바람직하게는 100개 이상인 이것의 폴리누클레오티드 및 올리고누클레오티드 단편의 핵산의 하나 또는 둘 모두의 가닥과 하이브리드화할 수 있는 서열, 더욱 바람직하게는 이들 폴리누클레오티드 또는 올리고누클레오티드중 2개 이상과 하이브리드화할 수 있는 서열이다. 이들 하이브리드화를 수행하는 서열의 가장 적당한 선택은 수퍼패밀리의 다른 일원에 대해 비보존되는 부분을 코딩하는 서열번호 2의 코딩 영역으로부터 선택될 것이다.Most preferred DNAs or RNAs have at least 15, preferably at least 30, more preferably, SEQ ID NO: 2, and consecutive bases selected from feature regions of the sequence for nucleic acids encoding other superfamily enzymes under high stringency conditions. Preferably a sequence capable of hybridizing with strands of one or both nucleic acids of at least 100 polynucleotides and oligonucleotide fragments thereof, more preferably a sequence capable of hybridizing with two or more of these polynucleotides or oligonucleotides. . The most appropriate choice of sequences to perform these hybridizations will be selected from the coding region of SEQ ID NO: 2, which encodes the non-conserved portions for other members of the superfamily.
하기 도 1을 참조하면, 아미노산 41 내지 49 및 250 내지 256은 수퍼패밀리내에서 보존되는 경향이 있고, 이로써, 이들 서열은 수퍼패밀리 일원을 일반적으로 스크린하는데 이외에 알팔파 타입의 바람직한 동족체를 선택하기 위한 하이브리드화 서열을 선택하는데 사용하기에는 그 자체로 부적합하다.Referring to FIG. 1 below, amino acids 41-49 and 250-256 tend to be conserved in the superfamily, whereby these sequences generally screen superfamily members, in addition to hybrids for selecting a preferred alfalfa type homologues. It is in itself unsuitable for use in the selection of the sequence.
본 발명의 세 번째 일면에서, 벡터 또는 구성물 형태의 알도오스 환원효소 상동 단백질 수퍼패밀리 일원을 코드화하는 핵산이, 식물에서의 이것의 이소적 발현을, 예를 들어 영양조직 또는 근조직에서, 구성적으로 또는 국소적으로 촉진시킬 수 있는 활성화 또는 조절 서열인 프로모터와 프레임적으로 결합된 형태로 제공된다. 편리하게는, 이러하 발현은 식물 조직이 자유 라디칼의 손상 효과, 예를 들어 HNE의 생성으로부터 항상 보호되도록 비시간적이며, 즉, 로카라티(Rocarati) 등의 프로모터와는 다르다.In a third aspect of the invention, a nucleic acid encoding a member of the aldose reductase homologous protein superfamily member in the form of a vector or constituent is constitutively expressed in its ectopic expression in plants, for example in trophic or muscular tissues. Or in a frame bound form with a promoter that is an activating or regulatory sequence that can be locally promoted. Conveniently, this expression is non-temporal so that plant tissues are always protected from the damaging effects of free radicals, for example the production of HNE, ie, unlike promoters such as Rocarati.
조직 특이적 조절 영역, 예를 들어 조직 특이적 프로모터가 특정 조직이 스트레스 관련된 독소로부터의 보호 및/또는 삼투조절을 필요로 하는 경우에 사용될 수 있음을 당업자라면 인식할 것이다. 조직 특이적 프로모터의 예는 당업자에게 공지되어 있을 것이지만, 뿌리 특이적 프로모터를 교시하는 WO 97/20057호 (본원에 참고문헌으로 인용되어 있음)의 프로모터 및 배 및 종자 특이적인 로카라티 등의 문헌에 기재된 프로모터에 의해 예시될 수 있다. 영양조직을 보호하는 경우, 조직 특이적 프로모터가 사용될 수 있지만, CaMv35S 및 알팔파(MsH3g1)와 같은 구성 프로모터(본원에 참고문헌으로 인용되어 있는 WO 97/20058호 참조)는 유용한 응용을 가질 것이다.Those skilled in the art will recognize that tissue specific regulatory regions, such as tissue specific promoters, can be used when certain tissues require protection and / or osmoregulation from stress related toxins. Examples of tissue specific promoters will be known to those skilled in the art, but are described in the literature of promoters of WO 97/20057 (referenced herein) and in embryo and seed specific locarati, which teach root-specific promoters. Illustrated by the described promoters. Tissue specific promoters may be used when protecting trophic tissues, but constitutive promoters such as CaMv35S and alfalfa (MsH3g1) (see WO 97/20058, which is incorporated herein by reference) will have useful applications.
본 발명의 네 번째 일면에서, 알도오스 환원효소 상동 단배질을 과잉생산하는 식물 세포를 생성시키는 방법으로서, 식물 세포를 본 발명에 따른 핵산 분자로 형질전환시키는 것을 포함하는 방법이 제공된다.In a fourth aspect of the present invention, there is provided a method of producing plant cells overproducing an aldose reductase homologous protein, the method comprising transforming the plant cells with a nucleic acid molecule according to the present invention.
본 발명의 다섯 번째 일면에서, 상기 기재된 재조합 핵산, 벡터 또는 구성물을 포함하는 형질전환된 식물 또는 이것의 부분이 제공된다. 다섯 번째 일면의 바람직한 식물은 활성화 또는 조절 서열인 프로모터와 작동적으로 결합된 구성물에 본 발명의 핵산을 포함할 수 있다. 바람직한 프로모터는 단백질의 생성된 발현, 이로써 이것의 효과가 원하는 조직에 국한되도록 조직 특이적일 수 있다. 조직 특이성의 정도를 갖는 프로모터는 식물 분자생물학의 당업자에게 공지되어 있을 것이다.In a fifth aspect of the invention, a transformed plant or portion thereof is provided comprising the recombinant nucleic acid, vector or construct described above. Preferred plants of the fifth aspect may comprise a nucleic acid of the invention in a construct operably linked to a promoter that is an activating or regulatory sequence. Preferred promoters may be tissue specific such that the resulting expression of the protein, thereby effect thereof, is localized to the desired tissue. Promoters with a degree of tissue specificity will be known to those skilled in plant molecular biology.
본 발명에 사용될 수 있는 벡터 및 구성물을 생성시키는 방법은 통상적인 분자생물학 기법에 비추어 당업자가 생각해낼 것이다. DNA, RNA 및 이들을 함유하거나 코드화하는 벡터는 식물 세포 형질전환의 분야에 공지된 방식으로 표적 세포내로 도입될 수 있다. 특히 바람직한 것은 일렉트로포레이션 또는 유전자 건(gun) 기술과 같은 기법을 사용하여 DNA 또는 RNA를 세포, 더욱 특히 화분 세포내로 도입시키는 방법이다.Methods of generating vectors and constructs that can be used in the present invention will be conceived by those skilled in the art in light of conventional molecular biology techniques. DNA, RNA and vectors containing or encoding them can be introduced into target cells in a manner known in the art of plant cell transformation. Especially preferred are methods for introducing DNA or RNA into cells, more particularly pollen cells, using techniques such as electroporation or gene gun techniques.
본 발명의 DNA 또는 RNA를 식물을 통해 발현시키는 것이 바람직할 수 있지만, 조직 특이적 효과가 사용되는 경우, 조직 특이적 프로모터, 인핸서 또는 그 밖의 액티베이터가 DNA와 작동적 관계로 사용되는 형질전환된 세포내로 삽입되어야 한다는 것을 당업자라면 이해할 것이다.It may be desirable to express the DNA or RNA of the invention through plants, but where tissue specific effects are used, transformed cells in which tissue specific promoters, enhancers or other activators are used in an operative relationship with DNA. Those skilled in the art will understand that they must be inserted into.
형질전환된 식물 및 식물 세포를 적당한 조절 서열과 함께 cDNA를 삽입시킴으로써 생성시키는 방법의 다수의 특정 예들이 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 식물 형질전환 벡터는 데넥케(Denecke) 등의 문헌[(1992) EMBO J. 11, 2345-2355]에 기재되어 있고, 트레할로오스를 생성시키는 형질전환된 식물을 생성시키는 이들을 추가 사용하는 것은 미국 특허 출원 제 08/290,301호에 기재되어 있다. EP 0339009 B1 및 US 5250515에는 이종 유전자를 식물내로 삽입시키는 방법이 기재되어 있다 (US 5250515의 칼럼 8 내지 26 참조). 형질전환된 외떡잎식물 및 쌍떡잎식물 둘 모두를 생성시키기 위한 화분의 일렉트로포레션은 US 5629183, US 7530485 및 US 7350356에 기재되어 있다. 또 다른 상세한 사항은 문헌[Recombinant Gene Expression Protocols. (1997) Edit Rocky S. Tuan. Humana Press. ISBN 0-89603-333-3; 0-89603-480-1](이들은 모두 본원에 참고문헌으로 인용되어 있음)에서 발견될 수 있다. 제공되는 형질전환된 식물 세포 또는 식물의 타입에 대한 특정 제한이 관찰되지 않는다는 것이 인식될 것이고; 모든 종류의 식물, 즉, 외떡잎식물 또는 쌍떡잎식물이, 식물에서의 알데히드, 특히 HNE 환원 활성이 구성적으로 또는 이소적으로 변화되도록 본 발명의 핵산이 삽입된 형질전환된 형태로 생성될 수 있다.Numerous specific examples of methods for generating transformed plants and plant cells by inserting cDNAs with appropriate regulatory sequences will be known to those skilled in the art. Plant transformation vectors are described in Denecke et al. (1992 1992 EMBO J. 11, 2345-2355), and further use of these to produce transformed plants that produce trehalose is described. US patent application Ser. No. 08 / 290,301. EP 0339009 B1 and US 5250515 describe methods for inserting heterologous genes into plants (see columns 8 to 26 of US 5250515). The electroporation of pollen for producing both transformed monocotyledonous and dicotyledonous plants is described in US Pat. No. 5,029,183, US Pat. No. 7,530,485 and US Pat. No. 7,350,356. Further details are given in Recombinant Gene Expression Protocols. (1997) Edit Rocky S. Tuan. Humana Press. ISBN 0-89603-333-3; 0-89603-480-1, all of which are incorporated herein by reference. It will be appreciated that no specific restriction on the type of transformed plant cell or plant provided is observed; All kinds of plants, ie monocotyledonous or dicotyledonous plants, can be produced in a transformed form into which the nucleic acid of the present invention is inserted such that the aldehydes in the plant, in particular the HNE reducing activity, are constitutively or isotropically changed.
본 발명의 또 다른 일면은 알팔파 상동 단백질 및 이에 대해 유도된 항체를 제공한다.Another aspect of the invention provides alfalfa homologous proteins and antibodies directed thereto.
하기 규정된 용어는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 의미와 약간 다르다고 하더라도 전체 명세서 및 청구의 범위에서는 하기 규정된 의미로 사용될 것이다.The terms defined below will be used in the meanings defined below in the entire specification and claims, although they differ slightly from the meanings generally used in the art.
″알도오스 환원효소 상동 단백질″은 알도-케토 환원효소 수퍼패밀리의 일원 및 유사하게는 NADPH 조인자의 존재하에 광범위한 기질의 알데히드기를 환원시킬 수 있는 이러한 패밀리의 다른 일원인 효소로서 본 설명에서 규정된다. 또한, 본원에 사용된 용어 ″알도오스 환원효소 상동 단백질″은 상기 단백질의 작용성 변형체 및 유도체를 포함한다."Aldose Reductase Homologous Protein" is defined herein as an enzyme that is a member of the aldo-keto reductase superfamily and similarly another member of this family capable of reducing aldehyde groups of a wide range of substrates in the presence of NADPH cofactors. In addition, the term ″ aldose reductase homologous protein ″ as used herein includes functional variants and derivatives of such proteins.
단백질의 ″작용성 변형체″ 또는 ″작용성 유도체″는 아미노산 서열이, 아미노산 서열의 변화에도 불구하고 당업자에게 검출될 수 있는 본래의 단백질의 생물학적 활성중 하나 이상의 활성의 일부 또는 전부를 보유하도록 하는 방식으로, 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환, 결실 및/또는 첨가에 의해 본래의 단백질의 아미노산 서열로부터 유도될 수 있는 단백질이다. 작용성 변형체는 이것이 유도될 수 잇는 단백질과 일반적으로 50% 이상 상동이고 (바람직하게는 아미노산 서열이 50% 이상 동일함), 유리하게는 70% 이상 상동이고, 더욱더 유리하게는 90% 이상 상동이다. 또한, 작용성 유도체는 단백질의 임의의 작용성 부분일 수 있으며; 본원에서의 기능은 특히 알데히드 환원이지만 이에 제한되지 않는다.A ″ functional variant ″ or ″ functional derivative ″ of a protein ensures that the amino acid sequence retains some or all of one or more of the biological activities of the original protein that can be detected by one of ordinary skill in the art despite changes in the amino acid sequence. , A protein that can be derived from the amino acid sequence of the original protein by substitution, deletion and / or addition of one or more amino acid residues. Functional variants are generally at least 50% homologous to the protein from which they can be derived (preferably at least 50% identical in amino acid sequence), advantageously at least 70% homologous and even more advantageously at least 90% homologous . In addition, the functional derivative may be any functional part of the protein; The function here is in particular but not limited to aldehyde reduction.
바람직하게는, 아미노산 서열은 서열번호 1 또는 서열번호 3과 대부분 다르거나 보존적 치환만 다르다. 더욱 바람직하게는, 단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 3과 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 가지며, 최적으로는 이들 서열과 100% 동일성을 갖는다.Preferably, the amino acid sequence is mostly different from SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 or only conservative substitutions. More preferably, the protein has at least 90% sequence identity with SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, more preferably at least 95%, and optimally has 100% identity with these sequences.
서열 상동성 또는 동일성을 비교하고 계산하기 위해 서열을 정렬하는데 사용하기에 적합한 알고리즘 및 소프트웨어는 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 이러한 도구의 중요한 예로는 프로그램(Pearson and Lipman search based FAST and BLAST program)이 있다. 이들의 상세한 사항은 알트슐(Altschul) 등의 문헌[(1990), J. Mol. Biol. 215: 403-10; Lipman D J and Pearson W R (1985) Science 227, p1435-41]에서 발견될 수 있다. BLAST의 공개적으로 입수가능한 상세한 사항은 인터넷의 ″http://www.ncbi. nlm.nih.gov/BLAST/blast-help.html″에서 발견될 수 있다. 따라서, 이러한 상동성 및 동일성 비율은 예를 들어 FASTA 및 BLASTn 소프트웨어를 통합시킨 시판되거나 공개 입수가능한 소프트웨어 패키지를 사용하거나 인터넷상의 컴퓨터 서버에 의해 확인될 수 있다. 전자의 한 예로는 GCG 위스콘신 소프트웨어(Wisconsin Software) 패키지가 있고, 젠뱅크(Genbank) (참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) 및 EMBL: (참조: http://www.embl-heidelberg.de/Blast2) 둘 모두는 인터넷 서비스를 제공한다.Algorithms and software suitable for use in aligning sequences to compare and calculate sequence homology or identity will be known to those skilled in the art. An important example of such a tool is the program (Pearson and Lipman search based FAST and BLAST program). These details are described in Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215: 403-10; Lipman D J and Pearson W R (1985) Science 227, p1435-41. Publicly available details of BLAST can be found on the Internet at http: //www.ncbi. nlm.nih.gov/BLAST/blast-help.html ″. Thus, such homology and identity ratios can be confirmed, for example, using commercially available or publicly available software packages incorporating FASTA and BLASTn software or by computer servers on the Internet. One example of the former is the GCG Wisconsin Software package, Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) and EMBL: (see http: // www.embl-heidelberg.de/Blast2) Both offer Internet services.
동일성이란 용어는 청구된 아미노산 서열 또는 염기 서열의 지정된 비율이, 서열이 아미노산 또는 염기를 최대 비율로 정렬시키기 위해 갭의 도입을 필요로 하는 특정 위치에서 결실되거나 첨가될 수 있다는 사실에도 불구하고, 서열이 최적 정렬되는 경우에 동일한 상대적 위치에 있는 기준 서열에서 발견됨을 의미한다. 바람직하게는, 서열은 10개 이하의 갭에 의해 정렬되며, 즉, 함께 첨가되는 경우에 두 서열내로 도입되는 갭의 전체 개수는 10개 이하이다. 이러한 갭의 길이는 알데히드 환원 활성이 유지되기만 한다면 특히 중요하지는 않지만, 10개 이하의 아미노산, 바람직하게는 5개 이하의 아미노산이거나, 30개 염기 또는 바람직하게는 15개 이하의 염기일 것이다.The term identity refers to a sequence, despite the fact that a specified proportion of the claimed amino acid sequence or nucleotide sequence may be deleted or added at a particular position where the sequence requires the introduction of a gap to align the amino acid or base at the maximum ratio Means that it is found in the reference sequence at the same relative position when it is optimally aligned. Preferably, the sequences are aligned by up to 10 gaps, that is, when added together, the total number of gaps introduced into the two sequences is 10 or less. The length of this gap is not particularly important as long as the aldehyde reducing activity is maintained, but it may be up to 10 amino acids, preferably up to 5 amino acids, or up to 30 bases or preferably up to 15 bases.
BLAST 서치에 대한 바람직한 파라미터는 디폴트(default) 값이다 (즉, EMBL 어드밴스드(Advanced) Blast2의 경우: Blastp Matrix BLOSUMS, Filter default, Echofilter X, Expect 10, Cutoff default, Strand both, Descriptions 50, Alignments 50). BLASTn의 경우, 디폴트가 재사용되는 것이 바람직하다. GCG 위스콘신 패키지 디폴트는 갭 웨이트(Gap Weight) 12, 렝쓰 웨이트(Length weight) 4 이다. 상동성 계산을 위한 또 다른 바람직한 방법에 사용되는 FASTDB 파라미터는 미스매치 패널티 = 1.00, 갭 패널티 = 1.00, 갭 크기 패널티 = 0.33 및 조이닝(joining) 패널티 = 30.0 이다.Preferred parameters for BLAST search are default values (i.e. for EMBL Advanced Blast2: Blastp Matrix BLOSUMS, Filter default, Echofilter X, Expect 10, Cutoff default, Strand both, Descriptions 50, Alignments 50) . In the case of BLASTn, the default is preferably reused. GCG Wisconsin package defaults are Gap Weight 12 and Length Weight 4. The FASTDB parameters used in another preferred method for homology calculations are mismatch penalty = 1.00, gap penalty = 1.00, gap size penalty = 0.33 and joining penalty = 30.0.
표현 ″고도의 엄격 조건″은 당업자에 의해 이해될 것이지만, 본원에 참고문헌으로 인용되어 있는 US 5202257 (Col 9-Col 10)에 편리하게 예시되어 있다.The expression ″ high stringency conditions ″ will be understood by those skilled in the art, but is conveniently illustrated in US 5202257 (Col 9-Col 10), which is incorporated herein by reference.
표현 ″축중 치환″은 동일한 아미노산을 코드화하는 코돈을 생성시키는 치환에 의한 누클레오티드의 치환을 나타내며; 이러한 축중 치환은 단백질을 발현하는 세포 또는 벡터가 DNA 공급원 생물체 세포와 다른 타입을 가져서, 이것이 cDNA 공급원 세포의 코돈 선택성과 다른 전사/번역에 대한 코돈 선택성을 가지도록 하는 경우에 유리하다.The expression ″ substitution substitution ″ refers to the substitution of a nucleotide by a substitution which results in a codon encoding the same amino acid; This degeneracy substitution is advantageous when the cell or vector expressing the protein has a different type than the DNA source organism cell, such that it has codon selectivity of cDNA source cells and codon selectivity for other transcription / translation.
아미노산에 대해 사용된 표현 ″보존적 치환″은 주어진 아미노산이 동일한 종류의 물리화학적 특성을 갖는 아미노산에 의해 치환되는 것을 나타낸다. 따라서, 서열번호 1 또는 서열번호 3의 아미노산이 소수성 특징화 그룹을 갖는 경우, 보존적 치환은 이것을 소수성 특징화 그룹을 또한 갖는 또 다른 아미노산에 의해 치환시킨다; 다른 이러한 종류는 특징화 그룹이 친수성, 양이온성, 음이온성이거나, 티올 또는 티오에테르를 함유하는 종류이다. 이러한 치환은 당업자에게 널리 공지되어 있고 (참조: 본원에 참고문헌으로 인용된 US 5380712), 생성된 단백질이 알데히드 환원효소와 같은 활성을 갖는 경우, 특히, 예를 들어 NADPH의 존재하에 HNE에 대해 작용하는 경우에만 고려된다.The expression ″ conservative substitutions ″ used for amino acids indicates that a given amino acid is substituted by an amino acid having the same kind of physicochemical properties. Thus, if the amino acid of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 has a hydrophobic characterizing group, conservative substitutions are substituted by another amino acid which also has a hydrophobic characterizing group; Another such class is those in which the characterizing group is hydrophilic, cationic, anionic, or contains thiols or thioethers. Such substitutions are well known to those skilled in the art (see US Pat. No. 5,380,712, incorporated herein by reference), and when the resulting proteins have activity such as aldehyde reductase, in particular, they act on HNE, for example in the presence of NADPH. Only considered.
단백질 또는 RNA는, 단백질이 생성되는 세포내에서의 상기 단백질의 농도가 본래의 세포내의 농도 보다 20% 이상 높은 경우, 즉, 본래의 식물 계통의 세포가 형질전환된 경우에 ″증가된 수준으로 생성된다″ 또는 ″과잉생산된다″라고 일컬어진다. 유사하게는, 식물, 식물 조직 또는 식물 세포는, 이것이 본래의 식물, 식물 조직 또는 식물 세포 보다, 검출성 손상 없이 동일한 유해한 조건의 20% 증가된 효과를 견뎌낼 수 있는 경우에 ″증가된 수준의 내성″을 갖는 것으로 규정된다. 세포내에서의 분자의 과잉생산은 통상적인 변이/선택 기법 및 유전자 조작 방법 둘 모두를 통해 달성될 수 있다.Proteins or RNA are produced at increased levels when the concentration of the protein in the cell from which the protein is produced is at least 20% higher than the concentration in the original cell, ie when cells of the original plant line are transformed. Or ″ overproduction ″. Similarly, a plant, plant tissue or plant cell may have an increased level of ″ increased levels if the plant, plant tissue or plant cell, can withstand a 20% increased effect of the same deleterious conditions without detectable damage than the original plant, plant tissue or plant cell. It is defined as having resistance. Overproduction of molecules in cells can be achieved through both conventional mutation / selection techniques and genetic engineering methods.
용어 ″이소적 발현″은, 예를 들어 이소적으로 발현된 단백질이 원래는 전혀(또는 검출가능하게) 발현되지 않는 식물의 공간적 지점에서 생성된다는, 즉, 상기 단백질이 상기 지점에서 과잉생산된다는 점에서 과잉생산의 특수한 실현을 나타내는 것으로 본원에서 사용된다. 이소적 발현의 특정 타입은 예를 들어 식물의 영양 조직 또는 뿌리내의 알도-케토 환원효소 단백질의 발현을 포함할 것지만, 정상적으로는 이것은 배 및/또는 화분내의 전사체를 통해 단지 임시적으로 발현되는 것으로 발견될 수 있다 [참조: Roncarati et al].The term "isotopic expression" means that, for example, an isotopically expressed protein is produced at a spatial point in a plant where it is not originally expressed at all (or detectably), that is, the protein is overproduced at that point. As used herein, it represents a special realization of overproduction. Certain types of ectopic expression will include, for example, the expression of aldo-keto reductase proteins in the vegetative tissue or roots, but normally it is only temporarily expressed through transcripts in the embryo and / or pollen. Can be found in Roncarati et al.
본 발명은 단지 하기 비제한적 실시예, 도면 및 서열 목록을 참조로 하여 예시에 의해 추가로 설명될 것이다. 본 발명의 범위에 속하는 또 다른 실시예는 본원의 기재에 비추어 당업자가 생각해 낼 것이다.The invention will be further illustrated by way of example only with reference to the following non-limiting examples, figures and sequence listings. Still other embodiments falling within the scope of the invention will come to mind to one skilled in the art in light of the description herein.
서열 목록:Sequence listing:
본원에 첨부된 서열 목록의 서열은 다음과 같다:The sequences in the Sequence Listing attached herein are as follows:
서열번호 1: 본 발명에 사용된 효소의 상동성이 관련된 바람직한 알도오스 환원효소 상동 효소에 의해 공유된 아미노산 서열.SEQ ID NO: 1 amino acid sequence shared by a preferred aldose reductase homologous enzyme in which the homology of the enzymes used in the present invention is related.
서열번호 2: 본 발명에 사용된 알팔파(Medicago satvia) 알도오스 환원효소 상동 효소를 코드화하는 cDNA를 포함하는 DNA.SEQ ID NO: 2: DNA comprising cDNA encoding the alfalfa (Medicago satvia) aldose reductase homologous enzyme used in the present invention.
서열번호 3: 본 발명에 사용되는 알팔파(Medicago satvia) 알도오스 환원효소 상동 효소의 아미노산 서열.SEQ ID NO: 3: Amino acid sequence of Alfalfa (Medicago satvia) aldose reductase homologous enzyme used in the present invention.
서열번호 4 및 5는 실시예 3에 언급된 프라이머의 서열이다.SEQ ID NOs: 4 and 5 are the sequences of the primers mentioned in Example 3.
도면drawing
도 1은 사람, 동물 및 식물 알도오스 및 알데히드 환원효소 단백질에 대한 알팔파 MsALRh의 아미노산 서열을 비교한 도면이다.1 is a comparison of the amino acid sequences of alfalfa MsALRh against human, animal and plant aldose and aldehyde reductase proteins.
도 2는 알팔파로부터 단리된 게놈 DNA의 서던 하이브리드화의 결과를 도시한다. 게놈 DNA 20㎍은 하기 도면에 나타난 제한 효소로 각각의 레인에서 분해되었다. 제한 단편은 1% 아가로오스겔상에 분리되었고, 하이본드-N 막상으로 블롯팅되었다. MsALRh cDNA의 P-32 표지화된 코딩 영역은 하이브리드화 프로브로서 사용되었다.2 shows the results of Southern hybridization of genomic DNA isolated from alfalfa. 20 μg of genomic DNA was digested in each lane with the restriction enzyme shown in the figure below. Restriction fragments were separated on 1% agarose gel and blotted onto a highbond-N membrane. The P-32 labeled coding region of MsALRh cDNA was used as the hybridization probe.
도 3은 MsALRh cDNA를 사용하는 노던 하이브리드화 실험의 결과를 도시한다. 전체 RNA는 150μM ABA(앱시스산) 호르몬(3a), 10% 폴리에틸렌 글리콜(PEG 4000, 3b) 및 염화카드뮴(3c)로 처리한 알팔파 A2 세포 현탁액으로부터 단리되었고, 전체 RNA 20㎍은 1% 포름알데히드-아가로오스겔상에서 전기영동되고, 하이본드-N 막상으로 전달된 후, MsALRh cDNA 단편의 P-32 표지된 코딩 영역으로 프로빙되었다. 각각의 경우에서 C는 비처리된 대조표준이다.3 shows the results of a northern hybridization experiment using MsALRh cDNA. Total RNA was isolated from alfalfa A2 cell suspensions treated with 150 μM ABA hormone (3a), 10% polyethylene glycol (PEG 4000, 3b) and cadmium chloride (3c), with 20 μg total RNA of 1% formaldehyde. Electrophoresed on agarose gels, transferred onto high-bond-N membranes, and then probed into P-32 labeled coding regions of MsALRh cDNA fragments. In each case C is an untreated control.
도 4는 MsALRh 유전자 발현의 웨스턴 하이브리드화 분석을 도시한다. 4a는 긴 발현시간(상부) 및 짧은 발현시간에 따른 상이한 알팔파 조직에서의 단백질의 수준을 도시한다. 4b는 10% PEG, 250μM 염화카드뮴 및 1mM 과산화수소 처리 도중의 단백질의 수준의 변화를 도시한다.4 depicts Western hybridization analysis of MsALRh gene expression. 4a shows the level of protein in different alfalfa tissues with long expression time (top) and short expression time. 4b depicts changes in protein levels during 10% PEG, 250 μM cadmium chloride and 1 mM hydrogen peroxide treatment.
도 5는 효소를 코드화하는 cDNA를 발현시키기에 적합한 pGEX 기원의 벡터(pGEX-5X-3)의 맵을 도시한다. 벡터는 효소를 대장균 세포에서 글루타티온-S-트랜스페라제 융합 단백질로서 발현시킨다.5 shows a map of a vector of pGEX origin (pGEX-5X-3) suitable for expressing cDNA encoding an enzyme. The vector expresses the enzyme as a glutathione-S-transferase fusion protein in E. coli cells.
도 6은 글루타티온-세파로오스상에서의 MsALRh-GST 융합 단백질의 정제를 도시한다.6 shows purification of MsALRh-GST fusion protein on glutathione-sepharose.
도 7은 MsALRH-GST의 활성에 대한 황산암모늄 처리의 효과를 도시한다. 10mM DL-글리세르알데히드 기질에 대한 효소 활성은 340nm에서 NADPH 산화의 측정치를 결정함으로써 분광광도적으로 측정되었다. 표준 반응 혼합물은 5㎍ 효소와 0.15mM NADPH를 포함하였다. 활성 측정을 개시하기 전에, 효소는 황산암모늄과 3분간 예비인큐베이션되었다.7 shows the effect of ammonium sulfate treatment on the activity of MsALRH-GST. Enzyme activity on the 10 mM DL-glyceraldehyde substrate was determined spectrophotometrically by determining measurements of NADPH oxidation at 340 nm. The standard reaction mixture contained 5 μg enzyme and 0.15 mM NADPH. Prior to initiating activity measurements, enzymes were preincubated with ammonium sulfate for 3 minutes.
도 8은 형질전환된 담배 식물의 잎으로부터 단리된 세포 추출물에서 알도오스 환원효소 상동 단백질을 웨스턴 하이브리드화 검출하는 것으로 도시한다.8 depicts Western hybridization detection of aldose reductase homologous protein in cell extracts isolated from the leaves of transformed tobacco plants.
도 9a 및 9b는 20μM 파라큇(paraquat)(9a) 및 250μM 염화카드뮴(9b) 처리 도중의 대조 식물 및 형질전환된 식물 잎 화반(disc)의 광 유도된 형광성 측정의 결과를 도시한다.9A and 9B show the results of light induced fluorescence measurements of control plants and transformed plant leaf discs during 20 μM paraquat 9a and 250 μM cadmium chloride (9b) treatment.
도 10a, 10b, 10c 및 10d는 대조조건(10a), 15mM 과산화수소(10b)의 존재, 150μM 염화카드뮴(10c) 및 250mM 염화나트륨(10d)하의 대조 식물(SR1) 및 형질전환된 식물(1/1, 1/5, 1/9)의 발아 시험의 결과를 도시한다.10A, 10B, 10C and 10D are contrasts Conditions (10a), presence of 15 mM hydrogen peroxide (10b), control plants (SR1) and transformed plants (1/1, 1/5, 1/9) under 150 μM cadmium chloride (10c) and 250 mM sodium chloride (10d) The results of the germination test are shown.
도 11은 대조 식물(SR1) 및 형질전환된 식물(TR1/4, 1/7, 1/1, 1/5 및 1/9)의 수분 결핍 성장 도중의 광 유도된 형광성 측정의 결과를 도시한다.FIG. 11 shows the results of light induced fluorescence measurements during moisture deficient growth of control plants (SR1) and transformed plants (TR1 / 4, 1/7, 1/1, 1/5 and 1/9). .
도 12a는 35일 심각한 한발 처리 후 10일간의 재수화 후의 대조 식물 및 형질전환된 식물의 사진을 도시한다. 12b는 상기 한발 내성 실험 후 12a에 도시된 대조 식물 및 형질전환된 식물의 잎으로부터 생성된 세포 추출물에서의 알도오스 환원효소 상동 단백질의 검출을 도시한다.12A shows pictures of control and transformed plants after 10 days of rehydration after 35 days of drought treatment. 12b depicts the detection of aldose reductase homologous protein in cell extracts generated from the leaves of the control and transformed plants shown in 12a after the drought resistance experiment.
도 13은 UV-B 조사 전(1일), 조사 도중(2일 내지 4일) 및 조사 후(8일 및 15일)에 담배잎에서의 엽록소 형광성의 젠트리(Gentry)-파라미터로서 측정된 광합성 효율을 도시한다. 흑색 원은 식물 1/1, 1/5, 1/8, 1/9 및 1/10에 대한 평균 데이터를 나타낸다. 빈 원은 식물 1/4 1/7 및 대조 SR1으로부터의 데이터를 나타낸다.FIG. 13 shows photosynthesis measured as chlorophyll fluorescent gentry-parameters in tobacco leaves before (1 day), during (2-4 days) and after (8 and 15) irradiation. Shows the efficiency. Black circles represent mean data for plants 1/1, 1/5, 1/8, 1/9 and 1/10. Empty circles represent data from plant 1/4 1/7 and control SR1.
실험Experiment
하기 실험 실시예에서, 본 발명자들은 알팔파(Medicago sativa) 알도오스 환원효소 상동 단백질을 코드화하는 유전자를 cDNA 형태로 단리시키는 것을 입증한다. 이것의 누클레오티드 서열 및 추론된 아미노산 서열은 단리된 cDNA가 현재까지 확인되지 않은 신규한 식물 알도오스 환원효소 상동 단백질을 코딩한다는 것을 입증하였다. 단리된 알도오스 환원효소 cDNA는 식물 발현 벡터내로 클로닝되었고, 일반적으로 사용되는 유전자 도입 방법에 의해, 형질전환된 담배 식물이 생성되었다. 형질전환된 담배 식물의 분자 생물학적 특징 이외에, 상이한 스트레스 조건에 대한 이들의 증가된 내성이 또한 밝혀졌다.In the experimental examples below, we demonstrate the isolation of the gene encoding the Medicago sativa aldose reductase homologous protein into cDNA form. Its nucleotide sequence and inferred amino acid sequence demonstrated that the isolated cDNA encodes a novel plant aldose reductase homologous protein that has not been identified to date. Isolated aldose reductase cDNA was cloned into a plant expression vector and transformed tobacco plants were produced by commonly used gene transduction methods. In addition to the molecular biological characteristics of the transformed tobacco plants, their increased resistance to different stress conditions has also been found.
실시예 1.Example 1.
유전자 뱅크로부터의 알팔파 알도오스 환원효소 상동 cDNA (MsALRh)의 단리 및 코드화된 아미노산 서열의 예측Isolation of Alfalfa Aldose Reductase Homologous cDNA (MsALRh) from Gene Bank and Prediction of Encoded Amino Acid Sequences
알팔파 cDNA 라이브러리를 제조하고, 알도오스 환원효소 상동 cDNA을 확인하기 위해, 광범위하게 사용된 분자 생물학적 방법이 샘브룩, 제이.(Sambrook, J.) 등의 프로토콜[참조: Sambrook, J. et al.: Molecular cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbour N.Y., 1989; 본원에 참고문헌으로 인용되어 있음]에 따라 사용되었다. 방법의 상세한 사항은 다음과 같이 요약될 수 있다:To prepare alfalfa cDNA libraries and to identify aldose reductase homologous cDNAs, the widely used molecular biological methods are described in Sambrook, J. et al. Molecular cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor NY, 1989; Incorporated herein by reference. Details of the method can be summarized as follows:
알팔파 cDNA 라이브러리는 다음과 같이 생성되었다.Alfalfa cDNA libraries were generated as follows.
전체 세포 RNA를, 분화된 캘러스(callus) 조직 및 다수의 체세포 배를 함유하는 생체외에서 배양된 옥신 쇽 활성화된 알팔파 조직으로부터 단리시켰다. 스트레스 활성화(옥시 쇽)를, 스트레스 유도된 mRNA의 농도를 증가시키는 것으로 당 분야에 공지된 방법을 사용하여 2,4-디클로로-페녹시아세트산(옥시 유사체)를 사용함으로써 수행하였다. 적용된 mRNA 단리 방법은 본원에 참고문헌으로 인용된 카탈라(Cathala) 등의 문헌[1983 DNA 2: 329-335]에 상세히 기재되어 있다.Whole cell RNA was isolated from in vitro cultured auxin 쇽 activated alfalfa tissue containing differentiated callus tissue and multiple somatic embryos. Stress activation (oxy shock) was performed by using 2,4-dichloro-phenoxyacetic acid (oxy analog) using methods known in the art to increase the concentration of stress induced mRNA. Applied mRNA isolation methods are described in detail in Catala et al., 1983 DNA 2: 329-335, incorporated herein by reference.
그 후, mRNA 분자를, 본원에 참고문헌으로 인용된 아비브, 에이치.(Aviv, H.) 및 레더, 피.(Leder, P.)의 방법[참조: 1972 Proc Natl. Acad. Sci. USA 69: 1408-1412]에 따라 올리고-dT 셀룰로오스 크로마토그래피에 의해 전체 RNA로부터 분리시켰다.MRNA molecules are then referred to by Aviv, H. and Leather, P., 1972 Proc Natl. Acad. Sci. USA 69: 1408-1412] was isolated from total RNA by oligo-dT cellulose chromatography.
그 후, 첫 번째 cDNA 가닥을 단리된 폴리-A+(mRNA) 분획상에서 AMV 역전사효소를 사용하여 올리고-dT 프라이머로 합성하였다. 두 번째 DNA 가닥의 합성은 DNA 중합효소 I을 사용하여 수행하였고, 과량의 주형 mRNA의 분리는 RNase H 처리에 의해 수행하였다. 합성된 cDNA의 말단에 대한 폴리-dC 테일 및 PstI 분해된 pGEM2 벡터(Promega) 말단에 대한 폴리-dG 테일의 합성을 말단 트랜스페라제 효소를 사용하여 수행하였다. 어닐링하고 T4 DNA 리가아제를 사용하여 연결시킨 후, 구성물을 MC1061 대장균 균주내로 형질전환시키고, 형질전환 혼합물을 100 ㎎/ℓ 암피실린 함유 선택 LB-플레이트상으로 플레이팅시켰다. 25㎍ DNA를 사용하여, 2.5X1051차 형질전환체 콜로니를 수득하였다. 콜로니의 약 96%가 검출가능한 크기의 삽입체를 함유하는 것으로 나타났다. 광범위하게 사용되는 통상적인 프로토콜을 이용하는 cDNA 라이브러리의 제조 과정은 본원에 참고문헌으로 인용된 데 루세(De Loose) 등의 문헌[1988 Gene 70: 13-23]을 특히 기초로 하였다.The first cDNA strand was then synthesized with oligo-dT primers using AMV reverse transcriptase on the isolated poly-A + (mRNA) fraction. The synthesis of the second DNA strand was performed using DNA polymerase I, and the isolation of excess template mRNA was performed by RNase H treatment. Synthesis of poly-dC tail to the ends of the synthesized cDNA and poly-dG tails to the PstI digested pGEM2 vector (Promega) ends was performed using terminal transferase enzymes. After annealing and ligation using T4 DNA ligase, constructs were transformed into MC1061 Escherichia coli strains and the transform mixture was plated onto 100 mg / L ampicillin containing selective LB-plates. Using 25 μg DNA, 2.5 × 10 5 primary transformant colonies were obtained. About 96% of colonies were found to contain inserts of detectable size. The preparation of cDNA libraries using conventional protocols that are widely used is based in particular on De Loose et al. (1988 Gene 70: 13-23), which is incorporated herein by reference.
이러한 cDNA 라이브러리의 약 1백개의 개별적 클론(즉, 스트레스 유도된 mRNA 단리물로부터 제조된 cDNA 클론)의 누클레오티드 서열을 결정하였다. 서열화 전에, 삽입물을 플라스미드 pUC 19내로 서브클로닝시키고, 서열화 반응을 α-35-S-dATP 표지화를 사용하는 디데옥시 사슬 종결 방법을 사용하여 이중 가닥 DNA상에서 수행하였다. 서열화 반응을 위해, T7 서열화 키트(Pharmacia) 및 시퀀시나아제(Sequenase) 2.0 키트(US Biochem)을 제조업자의 프로토콜에 따라 사용하였다.The nucleotide sequence of about one hundred individual clones of this cDNA library (ie, cDNA clones prepared from stress induced mRNA isolates) was determined. Prior to sequencing, inserts were subcloned into plasmid pUC 19 and sequencing reactions were performed on double stranded DNA using dideoxy chain termination methods using α-35-S-dATP labeling. For sequencing reactions, T7 sequencing kit (Pharmacia) and Sequenase 2.0 kit (US Biochem) were used according to the manufacturer's protocol.
결정된 cDNA 서열을 사용하여, 젠뱅크 및 EMBL 누클레오티드 서열 데이터베이스로 상동성 검색하였다. 그 결과, MsALRh로 나중에 지정된 클론으로부터 유도된 아미노산 서열은 사람, 래트 및 식물 알도-케토 환원효소 단백질 모두와 상동성을 갖는 것으로 밝혀졌다. MsALRh cDNA의 길이는 1231 염기쌍이고, 코딩 영역은 34 내지 975 누클레오티드 사이에 위치할 수 있다 (서열번호 2). 이러한 영역은 313 아미노산 단백질을 코딩한다. 알팔파 알도오스 환원효소 상동 단백질의 아미노산 서열은 공지되고, 최상으로 특징화된 외떡잎식물인 보리 알도오스 환원효소 상동 단백질과 44.3% 동일성을 나타내었고, 이것은 사람 알데히드 환원효소 및 돼지 알도오스 환원효소와 각각 46.2% 및 46.1% 동일성을 갖는다 (도 1). 또한, 이것은 쌍떡잎식물인 대두 NADPH 의존성 산화환원효소와 42% 동일성을 나타내었다. 아미노산 상동성의 관찰된 수준을 기초로 하여, 본 발명자들은 클로닝된 알팔파 cDNA가 알도-케토 환원효소 수퍼패밀리의 신규한 효소를 코딩하는 것으로 결론내렸다.Using the determined cDNA sequences, homology search was performed with Genbank and EMBL nucleotide sequence databases. As a result, amino acid sequences derived from clones later designated as MsALRh were found to be homologous to all human, rat and plant aldo-keto reductase proteins. The length of the MsALRh cDNA is 1231 base pairs, and the coding region may be located between 34 and 975 nucleotides (SEQ ID NO: 2). This region encodes a 313 amino acid protein. The amino acid sequence of the alfalfa aldose reductase homologous protein was 44.3% identical to the known and best characterized monocotyledonous barley aldose reductase homologous protein, which is the same as human aldehyde reductase and porcine aldose reductase, respectively. 46.2% and 46.1% identity (FIG. 1). It was also 42% identical to the dicotyledonous soybean NADPH dependent oxidoreductase. Based on the observed level of amino acid homology, we concluded that the cloned alfalfa cDNA encodes a novel enzyme of the aldo-keto reductase superfamily.
실시예 2.Example 2.
알팔파 알도오스 환원효소 상동 유전자의 분자 생물학적 특징화Molecular Biological Characterization of Alfalfa Aldose Reductase Homologous Genes
본 발명에 따른 알팔파 알도오스 환원효소 상동 유전자의 완전한 분자 생물학적 특징화 결과, 이것의 거동이 공지된 식물 알도오스 환원효소 상동체와 다른 것으로 나타났다. 알팔파 게놈의 유전자의 복제물 개수는 서던 하이브리드화를 사용하여 분석하였다; 유전자의 발현은 mRNA 수준에 대한 노던 하이브리드화 및 단백질 수준에 대한 웨스턴 하이브리드화에 의해 분석하였다.Complete molecular biological characterization of the alfalfa aldose reductase homolog according to the present invention showed that its behavior was different from the known plant aldose reductase homolog. The number of copies of genes of the alfalfa genome was analyzed using Southern hybridization; Gene expression was analyzed by northern hybridization to mRNA levels and western hybridization to protein levels.
게놈 DNA를 알팔파 세포로부터 단리시키고, 정제된 DNA를 제한 엔도누클레아제로 분해시켰다. 온길이 코딩 서열을 함유하는 MsALRh cDNA 단편을, ″무작위 프라이밍″ 방법(참조: Freinberg, A.P. and Vogelstein, B. 1983. Anal. Biochem. 137: 266-267)을 사용한 방사활성 이소토프 표지화 후에 서던 하이브리드화 실험을 위한 프로브로서 사용하였다. 하이브리드화를 라피드(Rapid)-hyb 완충액(Amersham)중에서 65℃엣 수행하였다. 하이브리드화의 결과(도 2)는 알도오스 환원효소 상동 유전자가 적은 복제물 개수를 갖지만, 모든 제한 분해에 존재하는 오토라디오그램상에서의 희미한 추가의 밴드가 알팔파 게놈내의 다른 유전자 상동체의 존재를 나타낼 수 있다는 것을 나타내었다.Genomic DNA was isolated from alfalfa cells and purified DNA was digested with restriction endonucleases. MsALRh cDNA fragments containing a full length coding sequence were Southern hybrids after radioactive isotope labeling using the ″ randomized priming ″ method (Freinberg, AP and Vogelstein, B. 1983. Anal. Biochem. 137: 266-267). It was used as a probe for the sake experiment. Hybridization was performed at 65 ° C. in Rapid-hyb buffer (Amersham). The result of hybridization (FIG. 2) shows that the aldose reductase homologous gene has a small number of copies, but a faint additional band on the autoradiogram present in all restriction digests may indicate the presence of other gene homologs in the alfalfa genome. It was shown that there is.
유전자의 발현을 일반적으로 공지된 방법[참조: Sambrook, J. et al.: ″Molecular cloning, A Laboratory Manual″ (2ndedition, Cold Spring Harbour N.Y., 1989.); 본원에 참고문헌으로 인용되어 있음]을 사용하여 노던 하이브리드화에 의해 분석하였다. 분석은 다음과 같이 상세히 기술될 수 있다:In general, known methods for the expression of the gene [see: Sambrook, J. et al .: " Molecular cloning, A Laboratory Manual" (2 nd edition, Cold Spring Harbour NY, 1989.); Cited herein by reference, by Northern Hybridization. The analysis can be described in detail as follows:
전체 RNA를 본원에 참고문헌으로 인용된 매스(Maes)의 방법[참조: 1992. Nucl. Acids Res. 20: 4374]에 따라 알팔파 A2 세포 현탁액으로부터 정제하였다. 포름알데히드-아가로오스겔상에서 분리시킨 후, RNA를 하이본드-N 막(Armersham)상으로 전달하였다. MsALRh의 온길이 코딩 영역을 ″무작위 프라이밍″ 방법 [참조: Freinberg, A.P. and Vogelstein, B. 1983. Anal. Biochem. 137: 266-267; 본원에 참고문헌으로 인용되어 있음]을 사용하여 방사성 표지시키고, 하이브리드화를 라피드-hyb 하이브리드화 완충액(Amersham)중에서 65℃에서 수행하였다. 조직 특이성 실험 결과, 알팔파 알도오스 환원효소 상동 유전자가, 일시적으로만 및 배에서만 발현되었던 보리 알도오스 환원효소 상동체와는 대조적으로 각각의 조직에서 발현되는 것으로 밝혀졌다. 알팔파 세포 현탁액을 다양한 호르몬 및 스트레스 조건에 노출시켰다. 그 결과, 실험된 유전자가 동종유도되는 것으로 나타났다. 식물 스트레스 호르몬 앱시스산(ABA)로 처리하면 개시한지 4시간 후 RNA 수준이 현저하게 증가되었다 (도 3). 이러한 결과의 중요성은 호르몬 ABA가 한발 및 저온과 같은 환경 스트레스에 대한 적응에서 중요한 역할을 하는 몇몇 유전자를 조절하는데 있어서 중요한 화합물이라는 사실에 있다.The method of Masses, the entire RNA of which is incorporated herein by reference, 1992. Nucl. Acids Res. 20: 4374] from Alfalfa A2 cell suspension. After separation on formaldehyde-agarose gel, RNA was transferred onto a highbond-N membrane (Armersham). ″ Random priming ″ of MsALRh's full-length coding region [Freinberg, A.P. and Vogelstein, B. 1983. Anal. Biochem. 137: 266-267; Radiolabeled, and hybridization was performed at 65 ° C. in rapid-hyb hybridization buffer (Amersham). Tissue specificity experiments revealed that alfalfa aldose reductase homologs are expressed in each tissue as opposed to barley aldose reductase homologues that were expressed only transiently and only in the embryo. Alfalfa cell suspensions were exposed to various hormonal and stress conditions. As a result, the tested genes were found to be homologous. Treatment with the plant stress hormone abstic acid (ABA) significantly increased RNA levels 4 hours after initiation (FIG. 3). The significance of these results lies in the fact that the hormone ABA is an important compound in regulating several genes that play an important role in adaptation to environmental stress such as drought and cold.
폴리에틸렌-글리콜로 처리하면 식물 세포에서 삼투 스트레스를 유도시킨다. MsALRh 유전자의 발현은 이러한 삼투 스트레스 뿐만 아니라 염화카드뮴 처리(중금속 스트레스; 도 3)에 의해 유도될 수 있다. 카드뮴 이온은 이것의 광합성 억제 특성 이외에 산화성 스트레스를 유도시키는 것으로 공지되어 있고, 이들 경우에, 지질 퍼옥시드의 수준이 식물 세포에서 증가한다. 도입 부분에 또한 기재한 바와 같이, 지질 퍼옥시드의 침착 생성물은 해독 반응에서 알도-케토 환원효소의 기질로서 작용할 수 있는 지질 알데히드이다.Treatment with polyethylene-glycol induces osmotic stress in plant cells. Expression of the MsALRh gene can be induced by such osmotic stress as well as cadmium chloride treatment (heavy metal stress; FIG. 3). Cadmium ions are known to induce oxidative stress in addition to their photosynthetic inhibition properties, in which case the level of lipid peroxide is increased in plant cells. As also described in the introduction, the deposition product of lipid peroxides is lipid aldehydes that can act as substrates of aldo-keto reductase in detoxification reactions.
실시예 3.Example 3.
알팔파 알도오스 환원효소 상동 단백질의 생화학적 특징Biochemical Characteristics of Alfalfa Aldose Reductase Homologous Protein
효소의 기질 특이성을 특징화하기 위해, 재조합 단백질을 원핵세포 단백질 발현 시스템에서 생성하고, 정제하였다.To characterize the substrate specificity of the enzyme, recombinant proteins were generated and purified in a prokaryotic protein expression system.
MsALRh의 cDNA를 융합 단백질을 함유하는 pGEX 4T-1 원핵세포 발현 벡터(Pharmacia)내로 클로닝시키고, 여기에서 GST(글루타티온-S-트랜스페라제) 함유 융합 단백질을 생성시키고, 대장균으로부터 정제하였다. 정제된 융합 단백질을 항원으로서 사용하여, 토끼 폴리클로날 항체를 통상적인 기법에 의해 유도시켰다. 이러한 항체를, 웨스턴 하이브리드화에 의해 MsALRh 단백질의 생성에 대한 다수의 스트레스 처리의 효과를 분석하고, 알팔파 식물의 다양한 조직에서 단백질을 검출하기 위해 사용하였다 (도 4).The cDNA of MsALRh was cloned into pGEX 4T-1 prokaryotic expression vector (Pharmacia) containing the fusion protein, where GST (glutathione-S-transferase) containing fusion protein was generated and purified from E. coli. Using the purified fusion protein as antigen, rabbit polyclonal antibodies were induced by conventional techniques. These antibodies were used to analyze the effects of multiple stress treatments on the production of MsALRh protein by western hybridization and to detect proteins in various tissues of alfalfa plants (FIG. 4).
MsALRh cDNA의 코딩 영역(975bp)을, 본원에 참고문헌으로 인용된 물리스(Mullis)와 팔루나(Faloona)의 방법[참조: 1987 Meth. Enzymol. 155:335]에 따라, 상부 프라이머로서 ″프라이머1″(5'-cgaactcgagatggccacagcaatcaagttt-3')을 사용하고 하부 프라이머로서 ″프라이머2″(5'-ccgagctctacttcaccatcccagag-3')로 사용하여(프라이머내의 XhoI 제한 부위는 밑줄그어져 있음) PCR 증폭시켰다. PCT 생성물을 XhoI 제한 엔도누클레아제로 분해시키고, 분해된 단편을 pGEX 4T-1 벡터(Pharmacia)내로 클로닝시켰다. 클로닝된 생성물의 누클레오티드 서열을 PCR 생성된 에러를 방지하기 위해 확인하였다.The coding region (975 bp) of MsALRh cDNA was obtained by the method of Mullis and Faluona, incorporated herein by reference, 1987 Meth. Enzymol. 155: 335, using ″ primer 1 ″ (5'-cgaactcgagatggccacagcaatcaagttt-3 ') as the upper primer and ″ primer 2 ″ (5'-ccgagctctacttcaccatcccagag-3') as the lower primer (XhoI restriction in the primer) The site is underlined) PCR amplification. The PCT product was digested with XhoI restriction endonuclease and the digested fragments were cloned into the pGEX 4T-1 vector (Pharmacia). The nucleotide sequence of the cloned product was confirmed to prevent PCR generated errors.
융합 단백질(MsALRh-GST 단백질, 추후에 지정됨)을 함유하는 N-말단 GST의 생성을 유도하기 위해, 형질전환체 대장균 세포를 25℃에서 3시간 동안 0.5mM 이소프로필-β-D-갈락토피라노시드 (IPTG)로 처리하였다. 융합 단백질을 발현시키는 형질전환체를 본원에 참고문헌으로 인용된 스미스(Smith)와 존슨(Johnson)의 방법[참조: 1988 Gene 67: 31-40]에 따라 확인하였다. MsALRh-GST 융합 단백질을 제조업자의 프로토콜(Pharmacia)의 지시에 따라 글루타티온-S-세파로오스 4B상에서 정제하였다.To induce the production of N-terminal GST containing the fusion protein (MsALRh-GST protein, later designated), transformant Escherichia coli cells were subjected to 0.5 mM isopropyl-β-D-galactopy for 3 hours at 25 ° C. Treated with ranoside (IPTG). Transformants expressing the fusion protein were identified according to Smith and Johnson's method (1988 Gene 67: 31-40), which is incorporated herein by reference. MsALRh-GST fusion protein was purified on glutathione-S-Sepharose 4B according to the manufacturer's protocol (Pharmacia).
생성되고 정제된 MsALRh-GST 융합 단백질(0.5㎖ 중의 100 내지 150㎍)을 동일한 부피의 완전 프로인트 보조제(Sigma)와 완전하게 혼합시키고, 토끼를 이러한 에멀션으로 면역시켰다. 2회의 후속 면역을 항원과 불완전 프로인트 보조제의 에멀션으로 각각 3주 및 6주 후에 수행하였다. 혈액 혈청을 웨스턴 분석으로 검사하였다. MsALRh 단백질에 대한 혈청의 특이성을 경합 실험으로 시험하였다.The resulting and purified MsALRh-GST fusion protein (100-150 μg in 0.5 mL) was mixed thoroughly with the same volume of complete Freund's adjuvant (Sigma) and the rabbits were immunized with this emulsion. Two subsequent immunizations were performed after 3 and 6 weeks with emulsion of antigen and incomplete Freund's adjuvant, respectively. Blood serum was examined by Western analysis. The specificity of the serum for MsALRh protein was tested in a competition experiment.
웨스턴 블롯 분석의 경우, 알팔파 세포 현탁액 추출물의 단백질을 12% SDS-폴리아크릴아미드겔상에서 분리하였다. 분리 후, 단백질을 니트로셀룰로오스 막상으로 전달시켰다. 융합 단백질에 대해 유도된 혈액 혈청을 첫 번째 항체로서 사용하고(1:2000 희석률로); 퍼옥시다아제와 컨쥬게이팅된 항-토끼-IgG 항체를 이들 실험에서 두 번째 항체로서 사용하였다. 항원-항체 복합체를 고민감성 화학발광 검출 방법인 수퍼 시그널(Super SignalRTM) CL-HRP 기질 시스템(Pierce)를 사용하여 검출하였다.For Western blot analysis, proteins of alfalfa cell suspension extracts were separated on 12% SDS-polyacrylamide gels. After separation, the protein was transferred onto nitrocellulose membranes. Blood serum derived against the fusion protein was used as the first antibody (at a 1: 2000 dilution); Anti-rabbit-IgG antibodies conjugated with peroxidase were used as the second antibody in these experiments. Antigen-antibody complexes were detected using the Super Signal RTM CL-HRP Substrate System (Pierce), a highly sensitive chemiluminescent detection method.
알팔파 식물의 다양한 조직 타입내의 MsALRh 단백질의 존재를 검사하였다. 그 결과, 단백질이 각각의 시험된 식물 기관에서 발견될 수 있는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 바텔스, 디.(Bartels, D.) 등의 문헌[1991. The EMBO J. 10: 1037-1043]에 공지된 결과와 전혀 대조적인데, 이는 보리 알도오스 환원효소 상동 단백질이 영양 조직에서 검출가능한 양으로 존재하지 않았기 때문이다. 본 발명자들의 결과는 이미 단리된 식물 알도오스 환원효소로부터의 알팔파 알도오스 환원효소 상동 단백질의 차이를 나타내었고, 또한 이것의 상이한 생리학적 역할을 나타낼 수 있다.The presence of MsALRh protein in various tissue types of alfalfa plants was examined. As a result, it was shown that proteins can be found in each tested plant organ. This result is described by Bartels, D. et al., 1991. The EMBO J. 10: 1037-1043 is in stark contrast to the result, since barley aldose reductase homologous protein was not present in detectable amounts in the trophic tissue. The results of the present inventors showed the difference of the alfalfa aldose reductase homologous protein from the already isolated plant aldose reductase and can also show its different physiological roles.
PEG 처리에 의해 유도된 삼투 스트레스 도중 또는 염화카드뮴 처리에 의해 유도된 중금속 스트레스 도중 뿐만 아니라 과산화수소 처리에 의한 독성 자유 라디칼 생성으로 인한 MsALRh 단백질의 양의 증가를 또한 웨스턴 하이브리드화 기법에 의해 검출하였다 (도 4b). 이들 결과에 의해, 삼투 및 중금속 스트레스 도중의 MsALRh 단백질 수준의 증가가 유전자의 mRNA 수준의 관찰된 증가와 상호관련되어 있고, 산화성 스트레스 유도성 과산화수소 처리가 또한 알팔파 세포에서의 MsALRh 단백질 수준을 증가시키는 것으로 나타났다. 이들 결과는 반응성 자유 라디칼의 독성 효과에 대한 식물 방어 반응에서의 MsALRh 단백질에 대한 역할을 강력하게 지지한다.An increase in the amount of MsALRh protein due to toxic free radical generation by hydrogen peroxide treatment as well as during osmotic stress induced by PEG treatment or heavy metal stress induced by cadmium chloride treatment was also detected by Western hybridization techniques (FIG. 4b). These results indicate that the increase in MsALRh protein levels during osmotic and heavy metal stress correlates with the observed increase in mRNA levels of genes, and that oxidative stress-induced hydrogen peroxide treatment also increases MsALRh protein levels in alfalfa cells. appear. These results strongly support the role for MsALRh protein in plant defense response to the toxic effects of reactive free radicals.
아미노산 상동성 이외에, MsALRh 효소의 기질 특이성 시험은 MsALRh 유전자가 알도케토 환원효소 수퍼패밀리에 속하는 효소를 코딩하고, 동시에, 이것이 현재까지 특징화된 식물 알도오스 환원효소 상동체와 비교하여 다수의 상이한 특징을 또한 갖는다는 것을 입증하였다. 다양한 기질에 대한 MsALRh-GST 융합 단백질의 효소 활성을 광도계 측정하였다: 25℃에서 5분의 반응시간 동안 340nm 파장에서 NADPH 조인자의 농도의 감소를 측정한다. 반응 혼합물 1㎖는 50mM 인산나트륨 완충액(pH=7.0), 조인자로서의 0.1mM NADPH 및 다양한 농도의 기질을 함유하였다. 1 효소 활성 단위는 기질의 존재하에 1분내에 1μmol NADPH를 산화시키기에 필요한 효소량(㎎)으로서 표현된다. 알도오스 당, DL-글리세르알데히드 및 4-히드록시-노네날 (ICN Biochemicals)를 이러한 특이성 측정에서 기질로서 사용하였고, 결과(Km 속도 상수로서)를 하기 표 1 내지 3에 나타내었다. 본 발명자들의 결과에 따르면, 정제된 효소는 NADPH 조인자의 존재하에 알데히드 기질을 환원시킬 수 있다. 높은 효소 활성은 글리세르알데히드(식물 알도오스 환원효소 상동체에 대한 최상의 기질로 알려진) 및 4-히드록시-노네날상에서만 측정될 수 있었다. MsALRh 효소는 활성이 훨씬 작은 D-크실로스를 환원시킬 수 있고, 그 밖의 알도오스 기질(예를 들어, D-글루코오스, D-갈락토오스, D-만노오스 또는 D-리보오스)에 대해서는 매우 높은(400mM) 기질 농도에서도 활성을 나타내지 않았다. 결과(하기 표 1)에 따르면, 알팔파 효소는 동물 알데히드 환원효소와 비교하여 글리세르알데히드 기질에 대해 매우 유사한 활성을 나타내었다. 동시에, 이것은 4-히드록시-노네날의 존재하에 덜 효율적으로 작용한다 (표 2).In addition to amino acid homology, the substrate specificity test of the MsALRh enzyme encodes an enzyme in which the MsALRh gene belongs to the aldoketo reductase superfamily, while at the same time a number of different features compared to the plant aldose reductase homologs that have been characterized so far. It also proved to have. The enzymatic activity of the MsALRh-GST fusion protein on various substrates was measured photometrically: the decrease in the concentration of NADPH cofactor at 340 nm wavelength was measured for 5 min reaction time at 25 ° C. 1 ml of the reaction mixture contained 50 mM sodium phosphate buffer (pH = 7.0), 0.1 mM NADPH as cofactor and various concentrations of substrate. One enzyme active unit is expressed as the amount of enzyme (mg) required to oxidize 1 μmol NADPH in one minute in the presence of a substrate. Aldose sugar, DL-glyceraldehyde and 4-hydroxy-nonenal (ICN Biochemicals) were used as substrates in this specificity measurement and the results (as Km rate constants) are shown in Tables 1 to 3 below. According to the results of the inventors, the purified enzyme can reduce the aldehyde substrate in the presence of the NADPH cofactor. High enzymatic activity could only be measured on glyceraldehyde (known as the best substrate for plant aldose reductase homologues) and on 4-hydroxy-nonenal. MsALRh enzyme can reduce D-xylose with much less activity and is very high (400 mM) for other aldose substrates (eg D-glucose, D-galactose, D-mannose or D-ribose) There was no activity even at the substrate concentration. According to the results (Table 1 below), the alfalfa enzyme showed very similar activity against glyceraldehyde substrate as compared to animal aldehyde reductase. At the same time, this works less efficiently in the presence of 4-hydroxy-nonenal (Table 2).
표 1Table 1
식물 알도오스 환원효소 상동체 및 포유동물 알데히드 환원효소의 DL-글리세르알데히드 기질에 대한 Km 속도 파라미터의 비교Comparison of Km Rate Parameters for DL-glyceraldehyde Substrates of Plant Aldose Reductase Homologs and Mammalian Aldehyde Reductases
표 2TABLE 2
4-히드록시-노네날 기질에 대한 알도오스 환원효소의 Km 속도 파라미터Km Rate Parameters of Aldose Reductase on 4-hydroxy-nonenal Substrates
표 3TABLE 3
0.3M (NH4)2SO4에 의한 처리의 결과로써의 알도오스 및 알데히드 환원효소의 활성의 변화Changes in the activity of aldose and aldehyde reductase as a result of treatment with 0.3M (NH 4 ) 2 SO 4
본 발명자들은 MsALRh 효소가 지질 퍼옥시드의 분해 생성물중의 하나로서 이미 공지된 4-히드록시-노네날(HNE)의 알데히드기를 환원시켜서, 이미 공지된 독성 효과를 제거시킬 수 있는 지를 검사하였다. 본 발명자들의 결과는 HNE가 식물 알도오스 환원효소에 대한 최상의 기질인 것으로 이미 공지된 DL-글리세르알데히드 보다 MsALRh에 대해 보다 우수한 기질이라는 것을 밝혀냈다. HNE에 대한 Km 속도 상수값은 글리세르알데히드에 대해 측정된 값의 약 1/3인 약 700μM 이다. 이러한 측정은 ALRh-GST 융합 단백질을 사용하여 먼저 수행하였지만, 후속 실험에서 측정은 GST-태그가 MsALRh와 GST 부분 사이에 존재하는 트롬빈 인식 부위에서 트롬빈에 의한 분해에 의해 분리되는 단백질로 반복하였다. DL-글리세르알데히드 및 4-히드록시-노네날 둘 모두에 대한 Km 값은 두 경우 모두에서 동일하였으므로, 본 발명자들은 GST 융합 파트너가 MsALRh 효소의 기질 특이성을 변화시키지 않는 것으로 결론내렸다.We examined whether the MsALRh enzyme can reduce the aldehyde group of 4-hydroxy-nonenal (HNE), which is already known as one of the degradation products of lipid peroxides, to eliminate the already known toxic effects. The results of the inventors found that HNE is a better substrate for MsALRh than DL-glyceraldehyde, which is already known to be the best substrate for plant aldose reductase. The Km rate constant value for HNE is about 700 μM, which is about one third of the value measured for glyceraldehyde. This measurement was first performed using the ALRh-GST fusion protein, but in subsequent experiments the measurement was repeated with a protein where the GST-tag was separated by thrombin cleavage at the thrombin recognition site present between the MsALRh and GST moieties. Since the Km values for both DL-glyceraldehyde and 4-hydroxy-nonenal were the same in both cases, we concluded that the GST fusion partner did not change the substrate specificity of the MsALRh enzyme.
SO4 2-이온은 래트 알도오스 및 알데히드 환원효소의 효소 활성을 상이한 방식으로 변화시키는 것으로 공지되어 있다. 본건의 경우, 0.3M 황산암모늄의 존재하의 효소 활성의 생성된 2배 증가는 알도오스 환원효소의 특징이다 (도 7). MsALRh 효소의 중요한 특성은 이것의 활성이 저농도(45mM)의 황산암모늄의 존재하에서도 100% 증가한다는데 있다. 이러한 결과는 효소의 유리한 효과가 황산암모늄 처리에 의한 형질전환된 식물에서 증가할 수 있다는 것을 나타낼 수 있다. 이러한 결과를 기초로 하여, 본 발명자들은 MsALRh 효소 뿐만 아니라 보리 알도오스 환원효소 상동 효소가 동물 알도오스 및 알데히드 환원효소 둘 모두와 유사한 특징을 또한 갖지만 이것은 특정한 상이한 특징을 또한 갖는 것으로 결론내릴 수 있다.SO 4 2- ions are known to change the enzymatic activity of rat aldose and aldehyde reductase in different ways. In this case, the resulting 2-fold increase in enzymatic activity in the presence of 0.3 M ammonium sulfate is characteristic of aldose reductase (FIG. 7). An important property of the MsALRh enzyme is that its activity is increased by 100% even in the presence of low concentrations (45 mM) of ammonium sulfate. These results may indicate that the beneficial effect of the enzyme can be increased in transformed plants by ammonium sulfate treatment. Based on these results, we can conclude that not only MsALRh enzyme but also barley aldose reductase homologous enzyme also have similar characteristics to both animal aldose and aldehyde reductase, but it also has certain different characteristics.
실시예 4.Example 4.
형질전환된 식물의 영양 기관에서 알도오스 환원효소 단백질을 생성시키기 위한 알팔파 알도오스 환원효소 상동 (MsALRh) cDNA의 담배 식물내로의 삽입Insertion of Alfalfa Aldose Reductase Homologous (MsALRh) cDNA into Tobacco Plants to Produce Aldose Reductase Protein in the Nutritional Organs of Transgenic Plants
외래 유전자를, 아그로박테리움 기초 형질전환 시스템(참조: E. et al. ″Plant Cell and Tissue Culture″ 1994. pp. 231-270, ed. Vasil, I.K. and Thorpe, T.A., Kluwer Academic Publisher; 본원에 참고문헌으로 인용되어 있음)에 의해 식물 게놈내로 도입시킬 수 있다. 실험된 cDNA를 본원에 참고문헌으로 인용된 벤페이(Benfey) 등의 문헌[1989, EMBO J. 8: 2195-2202]에 기재된 바이러스 CaMV35S 프로모터에 융합시켰다.Foreign genes are described in the Agrobacterium based transformation system (E. et al. ″ Plant Cell and Tissue Culture ″ 1994. pp. 231-270, ed. Vasil, IK and Thorpe, TA, Kluwer Academic Publisher; Incorporated by reference) into the plant genome. The cDNA tested was fused to the viral CaMV35S promoter described in Benfey et al., 1989, EMBO J. 8: 2195-2202, which is incorporated herein by reference.
생성된 2중 벡터 구성물을 아그로박테리움 균주내로 이동시키고, 담배잎을 스크래칭(scratching)에 의해 감염시키고, 동시배양을 수행하고, 카나마이신 내성 식물을 본원에 참고문헌으로 인용된 클래스(Claes) 등의 문헌[1991. The Plant J. 1: 15-26]에 따라 재생시켰다. 자가 수분시킴으로써 수득한 형질전환체 식물 및 종자를 발아 실험에서 사용하였다.The resulting double vector constructs are transferred into Agrobacterium strains, tobacco leaves are infected by scratching, co-cultures are performed, and kanamycin resistant plants are described in Claes et al., Incorporated herein by reference. [1991. The Plant J. 1: 15-26]. Transformant plants and seeds obtained by self pollination were used in germination experiments.
형질전환된 담배 식물에서의 알팔파 알도오스 환원효소 유전자의 기능은 면역학적 방법에 의해 입증하였다.The function of the alfalfa aldose reductase gene in transformed tobacco plants was demonstrated by immunological methods.
형질전환된 담배 식물에서의 알도오스 환원효소 유전자의 발현을 MsALR-GST 융합 단백질에 대해 유도시킨 폴리클로날 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석에 의해 입증하였다. 10개의 담배 계통을 분석하였다 (도 8). 이들 계통의 잎으로부터 수득한 단백질 추출물을, 단백질 샘플을 10% SDS-폴리아크릴아미드 변성 겔상에서 분리하고, 알칼리 포스파타아제 컨쥬게이팅된 항-IgG 항체를 제 2의 항체로서 사용한다는 것을 제외하고는, 종래에 상세히 기술된 웨스턴 하이브리드화 프로토콜에 따라 시험하였다. 항체-단백질 복합체를 BCIP(5-브로모-4-클로로-3-인돌-포스페이트) 및 NBT(2,2'-디-p-니트로페닐-3,3'-[3,3'-디메톡시4,4'-디페닐렌]-디테트라졸륨-클로라이드) 기질에 의해 검출하였다. MsALRh 단백질의 상당량의 합성을 10개의 검사된 형질전환 계통 중 5개에서 검출할 수 있었고, 그 밖의 형질전환된 계통은 MsALRh 유전자의 발현을 나타내지 않았으며, 대조 야생형(SR1) 식물에서 또한 신호를 검출할 수 없었다.Expression of the aldose reductase gene in transformed tobacco plants was verified by Western blot analysis using polyclonal antibodies directed against the MsALR-GST fusion protein. Ten tobacco lines were analyzed (FIG. 8). Protein extracts obtained from the leaves of these lines were separated except that the protein samples were separated on a 10% SDS-polyacrylamide modified gel and an alkaline phosphatase conjugated anti-IgG antibody was used as the second antibody. The test was carried out according to the Western hybridization protocol described in detail before. Antibody-protein complexes were prepared using BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indole-phosphate) and NBT (2,2'-di-p-nitrophenyl-3,3 '-[3,3'-dimethoxy 4,4'-diphenylene] -ditetrazolium-chloride) substrate. Significant synthesis of the MsALRh protein could be detected in five of the ten tested transgenic lines, other transformed lines did not show expression of the MsALRh gene, and also detected signals in control wild-type (SR1) plants. I could not.
실시예 5.Example 5.
제초제, 중금속, 과산화수소 및 염화나트륨과 같은 다양한 스트레스 처리에 대해 증가된 수준의 내성을 나타내는 알팔파 알도오스 환원효소 상동 단백질을 나타내는 형질전환체 담배 식물Transformed tobacco plants showing alfalfa aldose reductase homologous proteins with increased levels of resistance to various stress treatments such as herbicides, heavy metals, hydrogen peroxide and sodium chloride
본 발명의 개념을 입증하기 위해, 형질전환체의 거동을 파라큇(PQ) 제초제 및 카드뮴(Cd)의 존재하에 시험하였다. 잎 화반을 대조 SR1 및 형질전환체의 잎으로부터 절단하여, 페트리 접시에서 파라큇(20μM) 및 염화카드뮴(250μM) 용액으로 처리하였다. 광합성 장치의 기능적 손상을 바스. 아이.(Vass. I.) 등의 문헌[Biochem. 1996. 35: 8964-8973]에 따른 PAM 형광계를 사용하여 광 유도된 형광성 측정에 의해 모니터하였다. 대조 SR1 식물의 경우의 형광성 세기의 감소는 24시간 후의 현저한 손상을 나타내며, 이러한 효과는 48시간 후에 더욱 두드러졌다. 대조적으로, 세기는 형질전환된 계통의 경우에 훨씬 감소되었고, 이는 광합성 기능의 현저하게 감소된 손실을 나타냈다 (도 9).To demonstrate the concept of the present invention, the behavior of the transformants was tested in the presence of paraq (PQ) herbicide and cadmium (Cd). The leaf discs were cut from the leaves of control SR1 and the transformants and treated with parachet (20 μM) and cadmium chloride (250 μM) solutions in Petri dishes. Bath functional damage of photosynthetic devices. Vas. I. et al. Biochem. 1996. 35: 8964-8973] and monitored by light induced fluorescence measurement using a PAM fluorometer. The decrease in fluorescence intensity for the control SR1 plants showed significant damage after 24 hours, and this effect was more pronounced after 48 hours. In contrast, the intensity was much reduced for the transformed lineage, indicating a markedly reduced loss of photosynthetic function (FIG. 9).
또한, 발아 시험을 형질전환체의 스트레스 내성을 검사하기 위해 사용하였다. 자가 수분 후, 형질전환체로부터의 종자를 각각 15mM 과산화수소, 150μM 염화카드뮴 및 250mM 염화나트륨을 함유하는 배지에서 성장시켰다. 종자를 광의 존재하에 조절된 조건하에 발아시켰다. 도 10에 나타난 바와 같이, 모든 형질전환체 계통은 대조 SR1 담배 식물 보다 적용된 스트레스 처리에 대해 더 내성이다. 발현된 MsALRh 단백질의 보호 효과는, 형질전환된 계통 1/5이 이러한 처리에 대해 가장 내성인 것으로 밝혀졌고, 이 계통이 최고 수준으로 트랜스진을 발현시키므로 명백히 농도 의존성인 것으로 여겨진다.Germination tests were also used to test the stress resistance of the transformants. After self pollination, the seeds from the transformants were grown in medium containing 15 mM hydrogen peroxide, 150 μM cadmium chloride and 250 mM sodium chloride, respectively. Seeds were germinated under controlled conditions in the presence of light. As shown in FIG. 10, all transformant lines are more resistant to applied stress treatment than control SR1 tobacco plants. The protective effect of the expressed MsALRh protein was found to be the most dose dependent since the transformed strain 1/5 was found to be the most resistant to this treatment and this strain expresses the transgene at the highest level.
실시예 6.Example 6.
수분 결핍에 대한 내성을 나타내는 알팔파 알도오스 환원효소 상동 단백질을 생성시키는 형질전환된 담배 계통Transformed Tobacco Lines Produce Alfalfa Aldose Reductase Homologous Proteins Resistant to Water Deficiency
형질전환체 담배 식물을 조절된 온실 조건하에 5주 동안 토양에서 성장시키고, 토양의 수분 함량을 실험의 초기에 측정하였다. 광합성 시스템의 손상을 상기 실험에 상세히 기술된 바와 같이 광 유도된 형광성 측정에 의해 실험 도중에 모니터하였다. 실험 개시 전에, 본 발명자들은 형질전환된 담배 계통으로부터의 유사한 발생 단계에 있는 식물을 선택하였고, 나이가 동일한 SR1 대조 식물 및 잎을 실험 도중에 주어진 시간점에서 수행되는 형광성 측정을 위해 각각의 식물에서 선택하였다.Transformed tobacco plants were grown in soil for 5 weeks under controlled greenhouse conditions, and the moisture content of the soil was measured at the beginning of the experiment. Damage to the photosynthetic system was monitored during the experiment by light induced fluorescence measurements as detailed in the experiment above. Prior to the start of the experiment, we selected plants at similar developmental stages from the transformed tobacco strains, and selected SR1 control plants and leaves of the same age in each plant for fluorescence measurements performed at a given time point during the experiment. It was.
실험의 초기에, 본 발명자들은 시험되는 식물에 수분을 공급하는 것을 중단하였다. 수분 결핍 성장의 32일째 내지 35일째에, 식물을 생존성을 나타내는 Fv/Fm 형광성 값이 SR1 식물 및 계통 1/4 및 1/7의 경우에 현저하게 감소한 반면에(도 11), 계통 1/1, 1/5 및 1/9의 경우에는 현저하게 감소하지 않았다. 실험한지 45일째되는 시험된 식물을 도 12에 나타내었다. 건조 기간 후, 토양의 습도를 결정하였다. 이러한 시점에서, 식물을 10일간 재수화시키고, 예비선택된 잎의 광 유도된 형광성 값을 재측정하였다. 계통 1/1, 1/5 및 1/9의 경우, 이들 값은 45일째의 값과 거의 동일하거나 약간 높았지만, SR1 대조표준 및 비발현성 1/4 및 1/7 계통의 경우에는 Fv/Fm 값이 계속 감소하였다. 재수화 후, 단백질 추출물을 잎으로부터 단리시키고, MsALRh 단백질 수준을 결정하였다 (도 13). 결과는 SR1, 1/4 및 1/7 식물의 경우, 단백질이 검출되지 않는 반면, 1/1, 1/5 및 1/9 계통의 경우, MsALRh 단백질이 존재하는 것으로 나타난다. 따라서, 본 발명자들은 MsALRh 단백질을 발현시킨 식물만이 건조를 견뎌낼 수 있는 것으로 결론내릴 수 있었다.At the beginning of the experiment, we stopped moisturizing the plants tested. From days 32 to 35 of moisture deficient growth, the Fv / Fm fluorescent values indicating viability of plants were significantly reduced for SR1 plants and lines 1/4 and 1/7 (FIG. 11), while line 1 / For 1, 1/5 and 1/9 there was no significant decrease. The tested plants 45 days after the experiment are shown in FIG. 12. After the drying period, the humidity of the soil was determined. At this point, the plants were rehydrated for 10 days and the light induced fluorescent values of the preselected leaves were remeasured. For strains 1/1, 1/5, and 1/9, these values were about the same or slightly higher than those at day 45, but Fv / Fm for the SR1 control and non-expressing 1/4 and 1/7 strains. The value continued to decrease. After rehydration, protein extracts were isolated from the leaves and MsALRh protein levels were determined (FIG. 13). The results show that for SR1, 1/4 and 1/7 plants no protein is detected, for 1/1, 1/5 and 1/9 strains the MsALRh protein is present. Thus, we could conclude that only plants expressing MsALRh protein can withstand drying.
이러한 증가된 한발 내성이 잎의 상이한 수분 저장 능력으로 인한 것이 아님을 입증하기 위해, 탈수 실험을 하나의 잎에 대해 반복하였다. 결과는, 수분 손실의 속도가 MsAlRh 단백질 생성시키는 식물 및 대조 식물 둘 모두에서 거의 동일한 것으로 나타났다.To demonstrate that this increased drought resistance was not due to the leaf's different moisture storage capacity, dehydration experiments were repeated for one leaf. The results showed that the rate of water loss was about the same in both the MsAlRh protein producing plant and the control plant.
실시예 7.Example 7.
UV-B 조사 보호UV-B probe protection
담배 식물을 시험 5일 동안 26℃에서 통기되는 성장 챔버내에 유지시켰다. 광합성적으로 활성인 방사선을 매일 오전 8시 내지 오후 6시 사이에 상부 및 측부로부터 60 내지 80μmol m-2s-2세기로 형광 튜브(텅스턴 40W)로부터 공급하였다. UV-B (280-320nm) 조사를 매일 오전 9시 내지 오후 3시 사이에 상부로부터 7.5μmol m-2s-2전체 UV-B 세기로 UV-B 313 튜브(Q-panel, USA)로부터 공급하였다. 가능한 UV-C (λ〈 280nm) 조사의 효과를 배제시키기 위해, 일층의 셀룰로오스 아세테이트 필터(Courtaulds Chemicals UK)를 식물과 UV-B 공급원 사이에 위치시켰다. 회복 기간 도중에, 식물을 정상 성장 조건하의 온실에 넣었다.Tobacco plants were kept in a ventilated growth chamber at 26 ° C. for 5 days of testing. Photosynthetically active radiation was fed from the fluorescent tube (Tungsten 40W) at 60-80 μmol m −2 s −2 intensity from the top and sides daily between 8 am and 6 pm. UV-B (280-320 nm) irradiation is supplied from UV-B 313 tubes (Q-panel, USA) with 7.5 μmol m -2 s -2 overall UV-B intensity from the top between 9 am and 3 pm daily It was. In order to rule out the effect of possible UV-C (λ <280 nm) irradiation, a layer of cellulose acetate filter (Courtaulds Chemicals UK) was placed between the plant and the UV-B source. During the recovery period, the plants were placed in a greenhouse under normal growth conditions.
엽록소 형광성 측정을 위해, 식물을 실험실로 이동시켰다. 측정을 어두운 조건하에 수행하고, 초기 15분 암적응을 포함하여 약 45분내에 완결하였다. 이러한 식물을 성장 챔버 또는 (회복 기간 도중에) 온실에 다시 이동시켰다. 모든 형광성 측정을 오후 약 3시 내지 5시 사이에 수행하였다.For chlorophyll fluorescence measurements, plants were transferred to the laboratory. Measurements were performed under dark conditions and completed in about 45 minutes including the initial 15 minute dark adaptation. These plants were moved back to the growth chamber or to the greenhouse (during the recovery period). All fluorescence measurements were performed between about 3 pm and 5 pm.
비처리된 식물을 시험 첫날 오후에 측정한 후, 시험 둘째날에 UV-B 조사를 개시하였다. UV-B 조사된 식물을 시험 둘째날 내지 다섯째날에 조사를 중단한지 30분 후에 측정하였다.Untreated plants were measured on the first afternoon of the test and then UV-B irradiation was initiated on the second day of the test. UV-B irradiated plants were measured 30 minutes after the irradiation was stopped on the second to fifth days of the test.
엽록소 형광성을 약한(〈1μmol m-2s-2) 변조된 적색광을 사용하여 PAM 엽록소 형광계(WALZ Company, Germany)로 측정하였다. 정상 상태(Fs) 및 최대(Fm') 형광성 수율을 11.5μmol m-2s-2방사상 적색광에서, 각각 0.5s 포화 백색광 펄스(2500μmol m-2s-2) 적용 전 및 펄스 적용시에 측정하였다. 광합성 전자 수송의 효율을 (Fm-Fs)/Fm으로 계산되는 젠트리-파라미터로 특징화하였다. 2개의 잎을 각각의 식물에 대해 시험하고, 2개의 엽록소 형광성 측정을 각각의 잎에 대해, 향축 측면상에서, 주맥의 양쪽측면에 대해 대칭적으로 수행하였다.Chlorophyll fluorescence was measured with a PAM chlorophyll fluorometer (WALZ Company, Germany) using weak (<1 μmol m -2 s -2 ) modulated red light. Steady state (Fs) and maximal (Fm ') fluorescent yields were measured at 11.5 μmol m −2 s −2 radial red light, prior to and at 0.5 s saturated white light pulse (2500 μmol m −2 s −2 ), respectively. . The efficiency of photosynthetic electron transport was characterized by a gentri-parameter calculated as (Fm-Fs) / Fm. Two leaves were tested for each plant and two chlorophyll fluorescence measurements were performed symmetrically on each side, on both sides of the vein, on the axial side.
결과: 식물 잎은 UV-B 조사한지 2일 후에 시험 세째날로부터, UV-B 손상의 가시적 증상, 즉, 손상 착색을 갖는 반점을 나타냈다. 이는 추가 조사 도중에 더욱 짙어졌고, 회복 기간 도중에도 잎에 남아있었다. 엽록소 형광성은 UV-B 조사 첫째날로부터 광합성 효율의 감소를 나타내었다 (젠트리 파라미터). 식물 1/1, 1/5, 1/8, 1/9 및 1/10의 경우, 이것은 온실에서의 1주일 회복 후에 본래의 약 90%를 회복하였다. 대조 SR1, 1/4 및 1/7 식물의 경우, 현저한 회복은 없었다.Results: The plant leaves showed visible symptoms of UV-B damage, ie, spots with damage pigmentation, from the third day of testing 2 days after UV-B irradiation. It became thicker during further investigations and remained on the leaves during the recovery period. Chlorophyll fluorescence showed a decrease in photosynthetic efficiency from day 1 of UV-B irradiation (Gentry parameter). For plants 1/1, 1/5, 1/8, 1/9 and 1/10, this recovered about 90% of its original after 1 week recovery in the greenhouse. For control SR1, 1/4 and 1/7 plants there was no significant recovery.
광합성 효율은 UV-B 조사 전(1일째), 조사 도중에 (2일째 내지 4일째) 및 조사 후에(8일째 및 15일째) 담배 잎에서의 엽록소 형광성의 젠트리-파라미터로서 측정하였다. 도 13에서, 흑색 원은 식물 1/1, 1/5, 1/8, 1/9 및 1/10을 사용하여 수득한 평균 데이터를 나타낸다. 빈 원은 식물 1/4, 1/7 및 SR1에서 측정한 평균 데이터를 나타낸다.Photosynthetic efficiency was measured as chlorophyll fluorescent gentry-parameters in tobacco leaves before (day 1), during (day 2 to 4) and after irradiation (day 8 and 15) UV-B irradiation. In FIG. 13, black circles represent mean data obtained using plants 1/1, 1/5, 1/8, 1/9 and 1/10. Empty circles represent mean data measured on plants 1/4, 1/7 and SR1.
상기 상술된 실험의 결과를 요약하고, 효소의 생화학적 특징을 고려하여, 본 발명자들은 다음과 같이 결론내릴 수 있다:Summarizing the results of the above-mentioned experiments and taking into account the biochemical characteristics of the enzymes, we can conclude that:
(1) 단리된 알팔파 알도오스 환원효소 상동 유전자는, 독성 지질 알데히드 4-히드록시-노네날과 반응할 수 있는 신규한 특징를 갖는 효소를 코딩한다.(1) The isolated alfalfa aldose reductase homologous gene encodes an enzyme with novel features that can react with toxic lipid aldehyde 4-hydroxy-nonenal.
(2) 알팔파 알도오스 환원효소 상동 유전자를 발현시키는 형질전환된 식물은 효소의 이러한 특징 및 그 밖의 특징을 이용하도록 생성되었고, 생성된 식물은 광범위한 유해한 스트레스 처리에 대해 내성인 것으로 입증되었다.(2) Transformed plants expressing alfalfa aldose reductase homologous genes were generated to take advantage of these and other features of the enzyme, and the resulting plants were proven to be resistant to a wide range of harmful stress treatments.
(3) 기술된 실시예는, 이론적 고려, 즉, 알팔파 알도오스 상동 효소를 과잉생산하는 식물이 기원이 상이한 다수의 스트레스 조건에 대해 증가된 내성을 갖는다는 것에 의해 또한 지지되는 본 발명의 개념의 유용성을 명백히 입증한다.(3) The described embodiments of the inventive concept are also supported by theoretical considerations, ie, plants overproducing alfalfa aldose homologous enzymes have increased resistance to many stress conditions of different origins. The utility is clearly demonstrated.
본 발명의 근본적으로 신규한 방법이 임의의 종 특이적인 본질적 특징을 포함하지 않는다고 하더라도, 당업자라면 임의의 기원의 알도오스 환원효소 상동 단백질을 과잉생산하는 임의의 종의 식물 세포가 다수의 상이한 스트레스 조건에 대해 증가된 내성을 가질 것으로 결론내릴 수 있다. 상기 입증된 결과를 기초로 하여, 알도오스 환원효소 단백질의 일반적 보호 효과가 아마도 기술된 기본 세포 생물학적 프로세스를 주로 기초로 한다는 것을 고려하는 경우, 본 발명의 방법이 또Although the radically novel methods of the present invention do not include any species specific essential features, those skilled in the art will appreciate that plant cells of any species overproducing aldose reductase homologous proteins of any origin may be subjected to many different stress conditions. It can be concluded that it will have increased resistance to. Based on the results demonstrated above, when considering that the general protective effect of the aldose reductase protein is predominantly based on the basic cellular biological processes described, the method of the invention
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