KR20010027436A

KR20010027436A - 유기용매를 이용하여 봉출 중 항암성분을 추출하는 방법

Info

Publication number: KR20010027436A
Application number: KR1019990039175A
Authority: KR
Inventors: 이용규
Original assignee: 이용규
Priority date: 1999-09-14
Filing date: 1999-09-14
Publication date: 2001-04-06

Abstract

본 발명은 봉출(Curcuma zedoaria)의 항암 작용을 나타내는 약학 조성물로 더욱 상세하게는 위암 세포 증식 억제 작용을 나타내는 헥산 분획과 클로르포름 분획에 관하여 간암 세포 증식 억제 작용을 나타내는 헥산 분획, 에틸아세테이트 분획, 클로르포름 분획의 제조 방법 및 약리 효과를 나타내는 조성물에 관한 것이다.

Description

유기용매를 이용하여 봉출 중 항암성분을 추출하는 방법 {Extraction method of anticancer material with organic solvent from Curcuma zedoaria}

본 발명은 봉출 중 항암 활성을 나타내는 분획의 추출방법 및 약학조성물에 관한 것이다. 봉출의 메타놀 추출물 중 헥산분획, 클로르포름 분획, 에틸아세테이트분획을 생약 분획물의 일반적인 제조법에 따라 분획을 제조하였고, 항암활성 검색은 Mossmann에 의한 MTT assay에 의해 암세포 성장 억제율을 측정 하였다. 항암 효능이 있는 천연물 성분을 검색하고자 하는 시도는 여러 곳에서 행하여 졌지만 극소수의 천연물에서만 항암 효능이 입증되어 현재 구조 분석 추출 기술 개발 혹은 의약품 개발화로 연구가 진행되고 있다. 모든 천연물이 다 완벽하게 검색된 것이 아니므로 현재에도 이와 유사한 연구가 진행되고 있으며, 본 발명은 항암 효능을 나타내는 봉출의 추출 방법 및 약학 조성물을 나타내었다.

본 발명을 천연물 중 항암 효능을 나타내는 물질을 찾기 위하여 여러 생약을 검색하여 봉출의 헥산층, 에틸아세테이트층, 클로르포름층에서는 간암세포 억제 작용을 헥산과 에틸아세테이트층에서는 위암세포 억제 작용을 입증하여 봉출 중 항암 성분 검색 및 분리 방법을 제공하는데 목적을 두고 있다.

도1은 봉출의 메타놀 추출물에서 항암효능을 나타내는 헥산분획, 클로르포름 분획, 에틸 아세테이트 분획의 제조방법

도2는 봉출의 각 추출물을 200ug/ml의 농도로 각 암세포에 투여하였을때 나타난 성장률

＜각 암세포의 명칭＞

HepG2 : 간암세포

SNU-1 : 위암세포

SW480 : 직장암세포

도3은 도2에 나타난 결과를 그래프화 한 것

1. 본 발명은 봉출 중 항암 성분을 나타내는 분획의 추출 방법에 관한 것으로 방법은 도1에 상세히 설명하였다. 더욱 상세하게는 봉출의 메타놀추출물 중 헥산 분획, 에틸아세테이트 분획, 클로르포름 분획을 각기 200㎍/ml의 농도로 간암 세포주인 HepG2에 처리하여 Mossmann의 방법에 의해 MTT assay하였을 때 도2에서와 같이 간암 세포주의 성장률이 25%, 22%, 25%로 나타났으므로 봉출 분획물은 간암세포의 성장을 75%, 78%, 75%억제시켰다. 한편 봉출의 헥산 분획, 에틸아세테이트 분획은 각기 200㎍/ml의 농도로 위암 세포주인 SNU-1에 처리하여 위와 동일한 방법으로 성장률을 측정시 45%, 46%로 나타났으므로 봉출의 헥산 및 에틸아세테이트 분획은 위암 세포의 성장을 55%, 54%억제시켰다.

2. 이 항암 성분을 추출하는 방법은 도1과 같다. 이 추출법은 새로운 것이 아니다. 이 추출물중 특정 분획에 대한 항암 효능을 증거하는 자료는 본 발명 이전에는 없었다. 한편 이들 분획의 항암 효능(암세포 성장 억제기능)을 증명하기 위한 MTT assay법은 아래와 같다.

MTT 검색법 -- 실험에 사용한 적정세포수는 약물처리하지 않은 대조군에서 세포 접종 당시와 4일 후 MTT실험 종료시에 모두 세포가 지수 함수적으로 활발히 증식하면서, MTT 처리 후의 OD540값이 0.6∼0.7에 이를 수 있는 세포수로 정하였다. 적정수의 세포를 180㎕의 배지에 부유시켜 96-well plate의 12개 컬럼 중 10개 의 컬럼에 접종하였다. 난용성 시료는 0.02%DMSO(dimethyl sulfoxide)에 용해시키고, 수용성 시료는 PBS(phosphate buffered saline)에 용해시킨 후 20㎕씩 각 well에 가하여 시료의 최종 농도는 well당 각각 200ug/ml이 되도록 하였다. 한가지 농도군이 대해서는 1컬럼(8wells)을 동일한 조건으로 사용하며, 나머지 한 컬럼에는 약물 대신 PBS(혹은 DMSO)만을 20㎕첨가하여 100% 생존군(control survival)으로 삼았다. 흡광도 측정시 사용할 blank에는 세포없는 배지만을 180㎕가하고 PBS또는 약물을 20㎕첨가하였다. 암세포와 약물이 접종된 plate를 37℃, 5%CO2하에서 4일간 배양 한 후 0.1mg의 MTT(3-[4,5-dimethyl thiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide; Sigma M2128)를 모든 well에 가해주고 다시 37℃에서 4시간 더 배양한다. 배양 종료시 plate를 450×g에서 5분간 원심분리한 후 배지를 30㎕정도만 남기고 모두 빨아낸다.(이때 각 well의 바닥에 형성된 formazan결정이 흐트러지지 않도록 주의한다). 배지가 제거된 각 well에 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 150㎕씩 가한 후에 formazan결정이 녹을 때까지 약 10분간 가볍게 진탕해 주고 바로 microplate reader (scanning multiwell spectrophotometer)로 540nm에서의 흡광도를 측정한다. 이 흡광도는 MTT가 세포에 의해 formazan(blue)으로 분해된 양을 나타내며, 따라서 각 well에 살아있는 세포(viable cells)수와 비례한다.

한국인 위암, 간암 및 대장암등 3종류 암세포의 IC50(암세포 성장 50% 억제시의 농도)의 값이 230㎍/ml이상으로 나타난 추출물에 대하여는 항암 활성이 없거나 미약한 것으로 간주할 경우* 본 연구는 200㎍/ml에서도 50%이상의 암세포 성장 억제률을 나타내었으므로 항암 활성이 뚜렷한 것으로 간주된다.

* Hey,R.J., Park,J-G. and Gazdar, A.(eds):Academic press, San Diego(1994)

3. 독성 실험 예

급성 독성 : 위에서 얻은 분획을 스프라그도우리계 수컷 마우스에 (1군=10마리, 중량 18-22g) 경구투여 하였다. 헥산 분획, 에틸아세테이트 분획, 클로르포름 분획을 각기 30g/kg투여한 후 7일간 관찰한 결과 치사는 없었다. 이 결과로부터 마우스에 대한 LD50은 30g/kg이상이었다.

4. 의약품 사용시의 용량

경구투여시 10g/kg∼20g/kg

이상에서 상술한 바와 같이 본 발명은 항암 효능을 나타내는 천연물을 봉출의 메탄올 추출물에서 얻었다. 위암 세포 성장 억제능은 메타놀 추출물 중 헥산 분획과 클로르포름 분획에서 입증되었고, 간암 세포 성장 억제능은 메타놀 추출물 중 헥산 분획, 에틸아세테이트 분획, 클로르포름분획에서 입증하여 이 분획을 항암 효능을 나타내는 약학 조성물로 이용할 수 있는 것이다.

Claims

봉출을 주원료로 하여 메타놀, 헥산, 에틸아세테이트, 클로르포름 등의 유기 용매를 사용하여 암세포 사멸효과 성분을 추출하여 약학조성물로 이용하는 방법.