KR20010006045A - 복합 바이러스 조성물의 적정방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 살아있는 바이러스의 여러 종을 포함하는 조성물에 있어서, 바이러스형 또는 바이러스 종 각각의 양을 결정하고 다음 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다; 바이러스를 허용하나 바이러스 방해를 유도하지 않는 세포에 대해 각각의 바이러스형 또는 바이러스 종의 증식; 특정한 단클론항체를 사용하는 바이러스형 또는 바이러스 종의 분석.

Description

복합 바이러스 조성물의 적정방법{Titration method for a complex viral composition}
바이러스 조성물에서 각각의 바이러스 종 또는 각각의 바이러스형의 양을 분석하는 방법은 종래 기술에서 밝혀졌다. 보통 사용되는 방법은 필요없는 바이러스를 중화시키는 다클론항체를 사용하여 남아있는 바이러스의 양을 결정하는 것이다. 특히, 상기 방법은 폴리오에 대한 백신 조성물에서 I, II 및 III 타입의 경우에, 존재하는 독성약화된 살아있는 바이러스의 양을 결정할 필요가 있을 때 사용된다. 그러나, 분석할 바이러스를 방해하지 않고 조성물에 존재하는 바이러스의 성분을 불가능하지 않다면 중화시키거나, 특히, 뎅기열(dengue) 바이러스와 같은 특정한 바이러스의 여러 항원형을 포함하는 백신 조성물을 적정화하는 것이 어렵기 때문에 때때로 이러한 방법을 사용하는 것이 항상 가능한 것은 아니다. 이것은 타입-특정한 다클론항체가 없기 때문이다; 주어진 타입을 특정하게 인식할 수 있는 단클론항체는 자주 충분하게 중성화되지 않고; 알려진 중성화 단클론항체가 없는 경우도 있다. 그러나, 특히 백신 산업의 경우에, 완벽하게 제한한 부분인 다양한 바이러스 종 또는 바이러스 종의 다양한 항원형을 포함하는 바이러스 조성물을 생산하는 것이 필요하다. 더구나, 약제학적으로 신뢰할만한 방법으로 합성가공한 생산물의 조성을 양적으로 조절할 수 있어야 한다.
따라서, 복합 바이러스 조성물이 변경되지 않고 적정될 수 있는 이용가능한 방법을 가지는 것이 바람직하다.
본 발명은 바이러스 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 바이러스 종(species)의 각각의 양, 또는 더욱 상세하게는 살아있는 바이러스의 다양한 종(species) 또는 바이러스형을 포함하는 조성물에서 주어진 바이러스 종의 항원형 (serotype)각각의 양을 결정하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 살아있는 바이러스의 다양한 종(species) 또는 바이러스형을 포함하는 조성물에 있어서, 바이러스형 또는 바이러스 종 각각의 바이러스 양을 결정하고 다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다:
- 바이러스를 허용하나 바이러스 방해를 유도하지 않는 세포에 대해 각 타입 또는 종의 바이러스 증식,
- 특정한 단클론 항체를 사용하는 각각의 바이러스형 또는 종의 분석.
본 발명의 방법은 하나 또는 같은 종 안에 여러개의 다양한 바이러스 종 및/또는 여러개의 항원형을 포함하는 조성물에 적용된다. 특히, 적용되는 바이러스는 척수성소아마비, 풍진, 유행성이하선염, 풍진 또는 뎅그열에 관여하는 바이러스, 또는 그 밖의 로타바이러스가 있다. 상기 바이러스를 포함하는 조성물은 약화된 독성을 가질지라도, 바이러스가 살아있는 상태로 유지되는 백신 조성물이 될 수 있다. 따라서, 예를 들면 상기 조성물은 폴리오바이러스의 3가지 항원형을 포함하는 백신 조성물 또는 뎅그열 바이러스의 4가지 항원형을 포함하는 조성물이 될 수 있다. 본 발명에 따른 방법은 바이러스가 항원적으로 매우 가깝게 관련되어 있어 하나의 항원형의 중화는 교차반응에 의해 다른 항원형을 중화시키는 분야에 특정한 관심을 갖는다.
본 발명에서, 시험되는 조성물에 존재하는 바이러스는 다양하게 희석되어 바이러스를 허용하나 바이러스 방해를 유도하지 않는 세포에서 증식되었다. 따라서 베로(vero) 세포를 사용하는 것이 가능하다.
상기 세포를 세포 배양에 적합한 플레이트의 웰에 배열한 다음, 세포를 바이러스 현탁액을 접종시킨다.
바이러스 증식을 위해 사용된 배양 배지는 통상적으로 사용된 세포 및 적정을 위한 바이러스의 특성에 따라서 조절된 배양 배지를 사용한다. CO2대기하에 바이러스 성장을 위한 최적온도에서, 바이러스에 따라 다양한 시간(예를 들면 뎅그열 바이러스의 경우 1주)동안 배양한 후에, 배양 세포의 상청액을 제거하고, 세포를 차가운 아세톤을 사용하여 고정시킨다.
그런 다음, 적정 수행에 따른 종(species) 또는 항원형에 대해 특이성이 있는 단클론항체를 이용하여, 각 희석액에 대한 바이러스의 존재량을 결정한다.
반응은 엘라이자(ELISA) 시험에 적합한 형광-라벨된 항-종(anti-species) 항체 또는 기질을 사용하여 해석한다. 바이러스 적정은 스피어맨(Spearman)과 카버(Karber) 법에 의해 결정하고, 배양 세포의 50%가 감염된 양(CCID50)으로 나타낸다.
바이러스 조성물에 요구되는 적정을 수행한 상기 종(species) 또는 바이러스형에 대하여 특이성이 있는 각 단클론항체를 사용하여 상기 동일한 과정을 수행한다.
따라서, 그 밖의 종류에 관하여 주된 항원형 중의 하나가 없는 바이러스 조성물에 존재하는 각 항원형을 적정하기 위해, 놀랍게도 상기 방법을 사용하는 것이 가능해진다.
실시예
네 개의 일가(monovalent) 백신 조성물의 적정은 각 뎅그열 바이러스의 항원형을 포함하며, 각 조성물은 시험된 네 개의 일가(monovalent) 조성물의 당량 혼합에 의해 분석시간에서 제조되었다.
적정은 다음과 같은 방법의 96-웰 마이크로플레이트에서 수행되었다:
- 각 조성물의 연속되는 희석액은 5% 소 태아 혈청 및 소듐 바이카보네이트 2 g/ℓ이 함유된 MEM 배양 배지를 이용하여 제조하였다.
- 상기에서 얻은 바이러스 현탁액을 1일 동안 안정시켜 생긴 층의 베로(Vero) 세포[참고 ATCC:CCL81VERO]에 희석액당 10 웰의 비율로 접종하였다. 각 일가 현탁액 및 4가 조성물의 원자가를 적어도 하나의 96-웰 플레이트에서 적정하였다.
- 플레이트를 5% CO2하에서 1주 동안 36 ℃에서 배양하였다.
- 배양 세포의 상청액을 제거하고, 세포를 -20 ℃ 이하로 냉각된 아세톤을 사용한 플레이트 상에 고정시켰다.
- 백신 조성물에서 존재하는 항원형에 대한 특이성이 있는 단클론항체를 이용하여 바이러스 존재를 검출하였다.
사용된 항체들은 CDC(Center of Diease Control, Atlanta, USA)에 의해 공급된 하이브리도마(hybridomas)로부터 유래되었다.
국제의 제 1 항원형은 하이브리도마 D2-1F1-3으로부터 유래된 항체를 사용하여 라벨하였다.
국제의 제 2 항원형은 하이브리도마 3H5-1-12로부터 유래된 항체를 사용하여 라벨하였다.
국제의 제 3 항원형은 하이브리도마 5D4-11-24로부터 유래된 항체를 사용하여 라벨하였다.
국제의 제 4 항원형은 하이브리도마 1H10-6-7로부터 유래된 항체를 사용하여 라벨하였다.
- 반응은 형광-라벨된 항체를 가진 쥐의 IGF 항체를 이용하여 밝혀진다.
상기 결과는 형광 현미경을 사용하여 해석하였다. 감염된(형광성의) 세포 중 1종 이상으로 존재하는 웰의 수는 각 희석액에 관하여 계산하였다.
생산물의 적정농도가 영향을 미치는 세포 쉬트(sheet)의 50%(웰의 50%이다)인 희석액에 일치시키고, 스피어맨(Spearman)과 카버(Karber) 법에 의해 계산하였다. 이는 CCID50의 log10으로 나타내었다.
각 분석은 반복 수행하여 그 결과를 다음 표에 나타내었다.
상기 결과에서 적정농도의 차이는 약 0.5 log10CCID50에 의해 변이된 4가 혼합물에 있는 바이러스의 각 형태에 대하여 측정되고, 혼합물이 제조될 경우 각 항원형은 희석액의 1/4에 일치되는 기대된 결과에 따라 얻어짐을 알 수 있다.
따라서, 본 발명에서는 다른 항원형 사이에 임의의 방해없이, 바이러스 조성물에 존재하는 각 항원형을 분석하기 위해서 비-중화된 단클론항체를 사용하는 것이 가능하다.

Claims (6)

  1. 살아있는 바이러스의 다양한 종(species) 또는 바이러스형을 포함하는 조성물에 있어서, 바이러스형 또는 바이러스 종 각각의 바이러스 양을 결정하고 다음 단계를 포함하는 것임을 특징으로 하는 방법:
    - 바이러스를 허용하나 바이러스 방해를 유도하지 않는 세포에 대해 각 타입 또는 종의 바이러스 증식,
    - 특정한 단클론 항체를 사용하는 바이러스 각 타입 또는 종의 분석
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 증식이 베로(vero) 세포에 영향을 주는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 살아있는 바이러스의 다양한 종 또는 바이러스형을 포함하는 조성물이 백신 조성물임을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항, 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 살아있는 바이러스의 다양한 종 또는 바이러스형을 포함하는 조성물은 살아있는 독성약화된 뎅기열(dengue) 바이러스의 4가지 항원형(serotype)을 포함하는 조성물임을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항, 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 살아있는 바이러스의 다양한 종 또는 바이러스형을 포함하는 조성물은 살아있는 독성약화된 폴리오(polio) 바이러스의 3가지 항원형(serotype)을 포함하는 조성물임을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항, 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 살아있는 바이러스의 다양한 종 또는 바이러스형을 포함하는 조성물은 로타바이러스의 다양한 타입을 포함하는 조성물임을 특징으로 하는 방법.
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