KR20000076361A

KR20000076361A - 알데히드 및 케톤의 선택적 효소 하이드록실화방법

Info

Publication number: KR20000076361A
Application number: KR1019997008463A
Authority: KR
Inventors: 스튀츠-데라아드트안나; 그리엔글헤르프리에트; 코퍼이레네; 클링글러마르쿠스; 브라운에그게르하르트
Original assignee: 하르트만 미카엘, 도브라미슬 빌헬름; 데에스엠 피네 케미칼스 오스트리아 게엠베하
Priority date: 1997-03-18
Filing date: 1998-03-13
Publication date: 2000-12-26
Also published as: WO1998041647A1; CA2284256A1; EP0970235A1; US6287829B1; AT406960B; ATA46897A; AU6921498A; JP2001515357A

Abstract

본 발명은 키랄 앵커/보호 그룹을 사용하는, 알데히드 및 케톤의 선택적 효소 하이드록실화방법에 관한 것이다.

Description

알데히드 및 케톤의 선택적 효소 하이드록실화방법{Process for the selective enzymatic hydroxylation of aldehydes and ketones}

본 발명은 효소 또는 미생물을 사용하여 알데히드 및 케톤을 선택적으로 하이드록실화시키는 방법에 관한 것이다.

기술적 배경

하이드록실화 알데히드 및 케톤은 합성 중간체로서 공업적으로 매우 중요하다. 따라서, 독일 특허 제36 22 839호에는 하이드록실화 케톤을 사용하여 심장병 활성을 갖는 화합물을 합성하는 것이 기재되어 있다.

WO 제86/07611호에는 4-하이드록시사이클로펜트-2-엔-1-온 및 3-하이드록시사이클로펜타논의 합성이 기재되어 있다. 이들 화합물은 프로스타글란딘을 제조하는데 사용된다.

추가의 적용 분야는 액정 조성물용 화합물을 제조하는 것이다[참조 문헌: F. Hoffman-La Roche, CA 113:58558, Jpn. Kokai Tokkyo Koho JP 02 25, 451(90.25,451)].

비활성화 탄소원자에 하이드록실 그룹을 결합시키는 것은, 단지 "통상적인" 화학적 방법만이 이에 사용되는 경우에 매우 어렵다. Gif 시스템으로 언급되는 시스템을 사용하는 최근 발표된 결과[참조 문헌: D.H.R. Barton and W. Chavasiri; Tetrahedron., 1994, 50, 19; D.H.R. Barton and R.D. Doller, Acc. Chem. Res., 1992, 25, 504]와는 별도로, 비활성화 탄소원자를 하이드록실화시키는, 순수하게 화학적으로 레지오선택적인(regioselective) 방법은 없다. 그러나, 상기한 Gif 시스템을 사용하면, 또한 에난티오선택적으로(enantioselectively) 하이드록실화를 수행할 수 없다. 또한, 이들 공정은 수율이 너무 낮아서 공업적인 수행에 유용하지 못하다.

하이드록실 그룹을 카보닐 그룹과 관련된 특정 탄소원자상에 레지오선택적으로 위치시키는 것만이 중요한 것은 아니다. 일반적으로 하이드록실화 과정에서는 신규한 키랄 중심이 형성된다. 특히, 약제분야 뿐만 아니라 농화학 및 화장품 분야에 대한 중간체로서, 바람직하게는 에난티오머(enantiomer) 또는 디아스테레오머 (diastereomer) 둘중 하나가 형성되는 것이 중요하다.

에난티오선택적 하이드록실화를 위한 화학적 방법은 α-탄소원자에 대해서만 이용할 수 있다. 이는 바람직하게는 키랄 보조제를 사용하는 적합한 착화를 통해 특정 에난티오선택성이 성취되는, 상응하는 에놀레이트를 경유하는 반응이다. 그러나, 이러한 에난티오머가 풍부한 α-하이드록시카보닐 화합물을 사용하는 경우에는 α-탄소에서 라세미화(racemization)가 용이하게 발생한다는 단점이 있다.

따라서, 효소적 하이드록실화만이 알데히드 및 케톤의 에난티오선택적 하이드록실화라는 소정의 목적을 해결하기 위한 방법이다. 이러한 경우에 있어서, 특히 스테로이드의 하이드록실화의 수많은 예들이 공지되어 있으며, 적합한 효소 또는 미생물의 선택과 함께 견고한 분자 구조의 결과로서, 우수한 레지오선택성 및 우수한 스테레오선택성(stereoselectivity) 둘다가 성취된다. 이러한 반응은 약제학적으로 활성인 중간체의 합성을 위해 공업적으로 사용된다.

그러나, 알데히드 및 케톤의 효소 하이드록실화를 위한 일반적인 방법은 없다. 이의 이유중 하나는 모든 미생물에 존재하는 옥시도리덕타제로 인해, 카보닐 그룹 자체가 더 이상의 하이드록실화가 빈번히 발생하지 않도록 환원되기 때문이다.

가역적 앵커/보호 그룹의 개념을 사용하여, 레지오선택적 하이드록실화를 70% 이하의 화학적 수율로 수행할 수 있다. 이러한 개념은 옥시도리덕타제로 인한 생형질전환(biotransformation)으로부터 보호되는 결과인 카보닐 그룹의 유도체화를 기본으로 한다. 또한, 이러한 보호 그룹을 통해 기질의 화학적 및 물리적 특성을 설정하고, 따라서 예를 들어 몇몇 공정을 방해하는 휘발성을 감소시키거나 몇몇 크로마토그래피적 분리에 필수적인 발색단을 도입할 수 있다.

적합한 앵커/보호 그룹은, 특히 아세탈, 아미노아세탈, 머캅탈 또는 아미날이다. 효소적 하이드록실화를 수행한 다음, 온화한 조건하에 이들 보호/앵커 그룹을 다시 제거한다.

지금까지는, 단지 비키랄 보호/앵커 그룹만이 사용되어왔다. 높은 화학적 수율이 성취되더라도, 에난티오머적 과량은 최대 40%이다[광학 활성인 3-치환된 사이클로펜타논 유도체의 합성에서의 중요 단계로서 생하이드록실화; 참조 문헌: G. Braunegg, A. de Raadt et al., BIOTRANS '95, University of Warwick, Coventry, September 5-8, 1995, UK].

광학적으로 순수한 하이드록실화 옥소 화합물에 대한 요구가 지속적으로 증가되기 때문에 이러한 화합물을 높은 광학 수율로 제조하기에 적합한 방법을 제공하는 것이 바람직하다.

놀랍게도 본 발명에 이르러, 키랄 보호/앵커 그룹을 사용하는 경우, 화학적 수율과 또한 에난티오머적 과량 둘다를 상당히 증가시킬 수 있음을 밝혀내었다.

따라서, 본 발명은 화학식 Ⅲ 또는 Ⅳ의 화합물을 적합한 키랄 앵커/보호 그룹으로 보호시키고, 이러한 방법으로 보호된 화합물을 효소 레지오선택적 및 스테레오선택적으로 하이드록실화시키고, 하이드록실 그룹을 적합한 화합물로 임의로 보호시키며 앵커/보호 그룹을 제거하는 것을 포함하는, 화학식 Ⅰ 또는 Ⅱ의 화합물의 제조방법에 관한 것이다.

상기식에서,

A는또는이고,

A'는또는이고,

X 및 Y는 또는이고, 단 상기 화학식 Ⅱ에서는 라디칼 X 및 Y 중의 하나는 수소이고,

n은 0, 1, 2 또는 3의 정수 중의 하나이고, 단 화학식 Ⅰ의 화합물은 환에서 이중결합을 포함할 수 있고,

m은 0 또는 1의 수 중의 하나이고,

Z₁및 Z₂는 각각 서로 독립적으로 치환되지 않거나 C₁- 내지 C₄-알킬로 치환될 수 있고/있거나 불포화되지 않거나 불포화될 수 있는 C₁- 내지 C₈-알킬렌 라디칼이고,

R₁및 R₂는 각각 서로 독립적으로 수소이거나 직쇄 또는 측쇄 또는 사이클릭 C_1-4알킬이거나

R₁및 R₂는 그룹 A를 포함하는 환과 함께 치환되지 않거나 C₁-C₄-알킬로 치환될 수 있고/있거나 불포화되지 않거나 불포화될 수 있는 구조의 비사이클로[a, b, c] 헵탄 내지 데칸의 비사이클릭 화합물(여기서, a, b 및 c는 0, 1, 2, 3 또는 4이다)을 형성하며,

R₃및 R₄는 수소이거나 직쇄, 측쇄 또는 사이클릭 C₁-C₈-알킬일 수 있다.

화학식 Ⅲ 또는 Ⅳ의 화합물은 예를 들어 다음 중의 하나일 수 있다:

화학식 Ⅲ 또는 Ⅳ의 다른 적합한 화합물은 예를 들어 다음과 같다:

비사이클로[2.2.1]헵탄-2-온;

(1R) 및 (1S)-1,7,7-트리메틸비사이클로[2.2.1]헵탄-2-온;

트랜스-1-데칼론;

2-데칼론;

(1S) 및 (1R)-1,3,3-트리메틸비사이클로[2.2.1]헵탄-2-온

비사이클로[3.3.0]옥탄-3,7-디온;

비사이클로[3.3.0]옥탄-3-온;

비사이클로[3.3.0]옥트-7-엔-2-온;

비사이클로[3.3.0]옥트-6-엔-2-온;

비사이클로[4.2.0]옥트-2-엔-7-온;

비사이클로[3.2.0]헵트-2-엔-7-온 및

비사이클로[3.2.0]헵트-2-엔-6-온.

사용될 수 있는 보호/앵커 그룹은, 특히 키랄 아세탈, 아미노아세칼, 머캅탈 또는 아미날이다. 이들은 사이클릭이거나 사이클릭이 아닐 수 있다. 바람직하게는, 이들은 1,2- 및 1,3-디올, 아미노 알콜, 디티올 및 아미노디올, 및 또한 1,2- 및 1,3-디아민이다. 이들은 하나 이상의 키랄 중심을 가져야만 한다. 이들 화합물은 지방족, 지환족 또는 헤테로사이클릭일 수 있다. 또한, 이들 보호/앵커 그룹은, 기질 분자(substrate molecule)에 고정되는데 요구되는 상기한 그룹 이외에 다른 관능 그룹을 포함할 수 있다.

바람직한 앵커/보호 그룹은 하기 화학식 Ⅴ 또는 Ⅵ의 화합물이고, 예를 들어 (R)-2-아미노-1-프로판올, (S)-2-아미노-1-프로판올, (R)-1-아미노-2-프로판올, (S)-1-아미노-2-프로판올, (R)-2-아미노-1-부탄올, (S)-2-아미노-1-부탄올, (R)-1-아미노-2-부탄올 또는 (S)-1-아미노-2-부탄올의 N-벤조일 유도체가 있다.

상기식에서,

R'는 직쇄 또는 측쇄 C_1-4-알킬이다.

효소 하이드록실화를 수행한 후, 이들 보호/앵커 그룹은 온화한 조건하에 다시 제거한다. 분열은 표준 화학법[참조 문헌: T.W. Greene P.G.M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley ＆ Sons, Inc. 1991], 예를 들어 산 촉매반응된 가수분해, 전기분해 또는 금속염을 사용함으로써 수행할 수 있다.

하이드록실화에 사용할 수 있는 미생물은, 바람직하게는 다음의 종을 포함한다:

아스퍼길러스 오크라세우스(Aspergillus ochraceus) ATCC 18500, 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) CCM 2037, 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) DSM 32, 비우베리아 바시아나(Beauveria bassiana) ATCC 7159, 칼로넥트리아 데코라(Calonectria decora) DSM 879, 카에토뮴 코클리오이데스(Chaetomium cochlioides) DSM 831, 카에토뮴 글로보숨(Chaetomium globosum) DSM 1962, 코르니에스포라 카시이콜라(Cornyespora cassiicola) DSM 62474, 코르티큠 사사키(Corticum sasakii) NRRL 2705, 쿠닝하멜라 블라케슬리아나(Cunninghamella blakesleeana) DSM 1906, 쿠닝하멜라 에치눌라타(Cunninghamella echinulata) DSM 1905, 쿠닝하멜라 엘레간스(Cunninghamella elegans) DSM 1908, 디플로디아 고시피나(Diplodia gossypina) ATCC 10936, 푸사리움 솔라니(Fusarium solani) DSM 62416, 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina) ATCC 8979, 무코르 플룸베우스(Mucor plumbeus) CBS 110.16, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) ATCC 29607, 펠리쿨라리아 필라멘토사(Pellicularia filamentosa) IFO 6298, 페니실리움 라스트릭키(Penicillium rastrickii) ATCC 10490, 폴리포루스 오스트레이포르미스(Polyporus ostreiformis) CBS 36234, 스타우로포마(Staurophoma) 종 DSM 858 및 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) ATCC 13273.

본 발명의 방법에 적합한 몇몇 미생물은, 예를 들어 문헌[참조 문헌: S.C. Long, J.M. Birminghan, G. Ma, "ATCC Names of Industrial Fungi", American Type Culture Collection, USA, 1994]에 열거되어 있는 바와 같이 각종 이명하에 공지되어 있다.

그러나, 동일한 방법으로 선별을 통해 추가의 미생물을 발견하거나 천연 원료(예: 토양 샘플, 폐기물 또는 폐수)로부터 부유물 방법 또는 선택법을 통해 추가로 미생물을 분리할 수 있다.

본 발명에 따라 사용되는 효소 제제는 순도 등에 관해서는 제한이 없으며, 예를 들어 순수하지 않은 효소 용액으로서 사용할 수 있다.

그러나, 이들은 또한 목적하는 활성을 갖는 임의의 고정된 세포 또는 목적하는 활성을 갖는 세포 균질물로 이루질 수도 있다.

본 발명은 효소가 사용되는 형태에 따른 어떠한 방법에서도 제한받지 않는다. 본 발명에서는, 또한 돌연변이 또는 유전적으로 개질된 미생물로부터 유도된 효소를 사용할 수 있다.

실시예 1 : (R)-3-벤질옥시사이클로펜타논

(3R)-4-벤조일-3-메틸-1-옥사-4-아자스피로[4.4]노난(Saaverda, J. Org. Chem., 1985, 50, 2379)

사이클로펜타논(1.80g, 0.021mol) 및 (R)-2-아미노-1-프로판올(1.07g, 0.014mol)을 CH₂Cl₂(10㎖)중의 K₂CO₃(3.94g, 0.029mol) 현탁액에 가하고, 실온에서 48시간 동안 교반한다. 벤조일 클로라이드(2.01g, 0.014mol)을 반응 혼합물에 가하고 추가로 48시간 동안 교반한다. 혼합물을 여과시키고, 여액을 5% 수성 HCl, 포화 Na₂CO₃및 H₂0 100㎖로 각각 연속적으로 세척한다. 유기 상은 Na₂SO₄상에서 건조시키고 회전 증발기상에서 농축시킨다.

칼럼 크로마토그래피와 에틸 아세테이트/석유 에테르로부터 재결정화한 후에, (3R)-4-벤조일-3-메틸-1-옥사-4-아자스피로[4.4]노난을 담황색 고체로서 수득한다(수율: 75%).

ee: 98%(HPLC, CHIRALCEL OD-H, n-헵탄: IPA; 7:3, p=38bar, 유량=0.5㎖/분)

융점: 65.5 내지 67.5℃

[α]_D ²⁰= -79.8°(c 2.1, CH₂Cl₂)

¹H NMR: δ 0.96(d, J_3.Me=6.5㎐, 3H, Me), 1.64-1.98, 2.37-2.71(2×m, 6H ＆ 2H, H6, 7, 8, 9), 3.60(m, 1H, H2), 4.00(m, 2H, H2.3), 7.40(s, 5H, 벤조일).

¹³C NMR: δ 20.1(Me), 24.7, 24.8(C7.8), 35.0, 36.5(C6.9), 54.1(C3), 70.0(C2), 105.0(C5), 126.2, 128.4, 128.5, 129.4, 138.2, 168.1(벤조일).

(3R,5S,7R)-4-벤조일-3-메틸-1-옥사-4-아자스피로[4.4]노난-7-올

균류 비우베리아 바시아나 ATCC 7159를 1주일 동안 페트리 접시중의 배지 E[아가 15g/ℓ, 글루코스 10g/ℓ, 펩톤 5g/ℓ, 맥아 추출물(malt extract) 5g/ℓ, 효모 추출물(yeast extract) 2g/ℓ 및 KH₂PO₄2g/ℓ]에서 성장시킨다. 이의 1㎠를 사용하여 예비 배양물(70㎖, 배지 E, 30℃, 120rpm)을 접종한다. 72시간 후, 주 배양물은 10% 용적의 예비 배양물을 사용하여 발효기에서 접종한다(발효기 조건: 실시 용적 1.6ℓ; pH=6.6 내지 7; T=28℃; 폭기: 1.6L(S.T.P.)/분; 400rpm; 배지 E; 소포제로서 PPG 2000 0.25㎖).

주 배양물을 24시간 동안 성장시킨 후, EtOH(용액, 20%w/v)에 용해되어 있는 (3R)-4-벤조일-3-메틸-1-옥사-4-아자스피로[4.4]노난 0.16g을 가한다. 기질의 주부분(0.64g)은 추가로 12시간 후에 가한다.

하이드록실화가 진행된 후에 GC(HP 5890, series II, 칼럼 HP5, 25m, FID) 및 TLC(Merck 5642.001)에 의해 기질이 더이상 검출되지 않자마자 발효를 종결시킨다. 배양물은 에틸 아세테이트를 사용하여 2회 추출하고, 유기 상은 Na₂SO₄상에서 건조시키고 여과시키고, 여액은 회전 증발기상에서 농축시킨다. 칼럼 크로마토그래피[머크 실리카 겔(Merck silica gel) 60, 평균 입자 크기: 70 내지 230]에 의해 하이드록실화 생성물 (3R,5S,7R)-4-벤조일-3-메틸-1-옥사-4-아자스피로[4.4]-노난-7-올을 분리한다(0.72g, 84%).

디아스테레오머 과량은 처음에는 11:1로 측정되고(HPLC, CHIRALCEL OD-H, n-헵탄: IPA; 7.3; P=37bar; 유량=0.50㎖/분-칼럼 크로마토그래피 전), 두번째는 20:1로 측정되었다(HPLC, 칼럼 크로마토그래피 후).

[α]_D ²⁰= -79.6°(c 1.5, CH₂Cl₂)

융점: 106 내지 108℃

¹H NMR: δ 0.93(d, J_3,Me=5.7㎐. 3H, Me); 1.73-2.41(m, 4H, H6, 8, 9, 9), 2.57-2.69(m, 2H, H8, OH), 2.75, 2.94(2×dd; J_6.7=5.7㎐, J_6.6'=14.0㎐, 비: 20:1, H6), 3.63(dd, J_2.3=5.1㎐, J_2.2=11.3㎐, 1H, H2), 3.98(m, 2H, H2, H3), 4.42(br s, 1H, H7), 7.37(s, 5H, 벤조일).

¹³C NMR: δ 20.1(Me), 34.7, 34.8(C8, 9), 43.2(C6), 54.0(C3), 70.3(C2), 72.7(C7), 104.0(C5). 126.2, 128.6, 129.6, 137.7, 168.2(벤조일).

(3R,5S,7R)-4-벤조일-7-벤질옥시-3-메틸-1-옥사-4-아자스피로[4.4]노난

보호 그룹을 제거하기 전에, (3R,5S,7R)-4-벤조일-3-메틸-1-옥사-4-아자스피로[4.4]노난-7-올을 유도한다(NaH, 벤질 브로마이드, THF, DMF, 실온). 칼럼 크로마토그래피를 수행한 후, (3R,5S,7R)-4-벤조일-7-벤질옥시-3-메틸-1-옥사-4-아자스피로[4.4]노난을 85%의 수율로 미세한 침상으로 수득한다.

de: 89%(NMR)

[α]_D ²⁰= -75.2°(c 3.0, CH₂Cl₂)

융점: 85 내지 86℃(CH₂Cl₂/석유 에테르)

¹H NMR: δ (진하게 나타낸 경우 부 이성체) 0.95(d, J_3.Me=6.6㎐. 3H, Me), 1.83-2.67(m, 5H, H6, 8, 9), 2.77, 2.96(2×dd; J_6.7=6.7㎐, J_6.6=14.4㎐, 1H, 비: 18:1, H6), 3.64(m, 1H, H2), 4.03(m, 2H, H2, H3). 4.33(br, s, 1H, H7), 4.54(s, 2H, CH₂Ph), 7.34(m, 10H, COPh, CH₂Ph).

¹³C NMR: δ 20.1(Me), 31.7, 35.3(C8, 9), 41.9(C6), 54.0(C3), 70.4(C2), 70.9(CH₂Ph), 79.2(C7), 103.3(C5), 126.3, 127.5, 127.7, 128.4, 128.4, 128.6, 129.7, 137.9, 138.9(COPh, CH₂Ph), 168.2(COPh).

(R)-3-벤질옥시사이클로펜타논

(3R,5S,7R)-4-벤조일-7-벤질옥시-3-메틸-1-옥사-4-아자스피로[4.4]노난(250㎎, 0.7mmol)을 CH₃CN 5㎖에 용해시킨다. IR 120[H⁺](메탄올로 2회 및 H₂O로 1회 세척)을 가하여 pH를 5 내지 6으로 조절한다. 혼합물은 출발 물질이 더 이상 검출되지 않을 때까지 실온에서 교반한다. 반응 혼합물을 여과시키고, 여액은 회전 증발기상에서 농축시킨다. 칼럼 크로마토그래피를 수행한 후, (R)-3-벤질옥시사이클로펜타논(81㎎, 0.4mmol)을 수득한다.

ee: 84%(키랄 GC; Macherey-Nagel, Lipodex E)

수율: 61%

[α]_D ²⁰= -43.0°(c 1.0, CH₂Cl₂)

융점: 시럽

¹H NMR 및¹³C NMR은 문헌의 값과 동일하다[참조 문헌: T.H. Eberlein, F.G. West, R.W. Tester, J. Org. Chem., 1992, 57, 3479-3482].

실시예 2 내지 7은 다른 알데히드/케톤 및 앵커/보호 그룹을 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 1에서 기술한 방법으로 수행한다.

실시예 2 : (R)-3-벤질옥시사이클로펜타논

(3R)-4-벤조일-3-에틸-1-옥사-4-아자스피로[4,4]노난

ee: 90%(HPLC, CHIRALCEL OD-H, n-헵탄: IPA; 7:3; P=40bar, 유량=0.50㎖/분)

수율: 57%

[α]_D ²⁰= -59.4°(c 3.9, CH₂Cl₂)

융점: 납상

¹H NMR: δ 0.61(t, J=7.3㎐. 3H, CH₂CH₃), 1.31(m, 2H, CH₂CH₃), 1.58-2.03, 2.31-2.72(2×m, 6H ＆ 2H, H6, 7, 8, 9), 3.68-3.99(m, 3H, H2.3), 7.37(s, 5H, 벤조일).

¹³C NMR: δ 9.9(CH₂CH₃), 24.8, 24.8, 26.4(C7, 8, CH₂CH₃), 35.0, 36.3(C6, 9), 59.6(C3), 67.3(C2), 104.9(C5), 126.3, 128.4, 129.4, 138.2, 168.1(벤조일).

(3R,7R)-4-벤조일-3-에틸-1-옥사-4-아자스피로[4.4]노난-7-올

de: 7:1(75%)(칼럼 크로마토그래피 후)

수율: 82%

융점: 시럽

¹H NMR: δ (진하게 나타낸 경우 부 이성체), 0.60(t, J=7.4㎐. 3H, CH₂CH₃), 1.11-1.43(br, m, 2H, CH₂CH₃), 1.69-2.62(m, 6H, H6, 8, 9, OH), 2.69, 2.90(2×dd, J_6.7=5.7㎐, J_6.6=13.7㎐, 1H, 비: 7:1, H6), 3.70-3.99(m, 3H, H2.3), 4.4.1(br, s, 1H, H7), 7.36(s, 5H, 벤조일).

¹³C NMR: δ (진하게 나타낸 경우 부 이성체), 9.9(CH₂CH₃), 26.3, 26.4(CH₂CH₃), 33.6, 34.5, 43.1, 44.7(C6, 8, 9), 59.4,(C3), 67.5, 67.6(C2), 72.7, 72.8(C7), 103.9(C5), 126.2, 128.4, 128.4, 128.5, 129.7, 137.7, 168.3(벤조일).

(3R,7R)-4-벤조일-7-벤질옥시-3-에틸-1-옥사-4-아자스피로[4.4]노난

de: 7:1(75%)(NMR)

수율: 75%

융점: 시럽

¹H NMR: δ (진하게 나타낸 경우 부 이성체), 0.64(t, J=7.4㎐. 3H, CH₂CH₃), 1.20-1.43(br, m, 2H, CH₂CH₃), 1.84-2.09 ＆ 2.20-2.65(2×m, 5H, H6, 8, 9), 2.76, 2.98(2×dd, J_6.7=6.9㎐, J_6.6=14.1㎐, 1H, 비: 7:1, H6), 3.76-4.03(m, 3H, H2.3), 4.33(br, s, 1H, H7), 4.55(m, 2H, CH₂Ph), 7.22-7.47(m ,10H, CH₂Ph, COPh).

¹³C NMR: δ (진하게 나타낸 경우 부 이성체), 9.9(CH₂CH₃), 26.5, 31.8, 34.0, 35.3(C8, 9, CH₂CH₃), 42.1, 43.0, (C6), 59.6, 59.7(C3), 67.8, 67.9(C2), 71.0, 71.3, (CH₂Ph), 79.3, 79.6, (C7), 103.5(C5), 126.5, 127.6, 127.8, 128.5, 128.7, 129.7, 129.8, 138.2, 139.2(CH₂Ph, COPh), 168.4(COPh).

(R)-3-벤질옥시사이클로펜타논

ee: 76%(키랄 GC; Macherey-Nagel, Lipodex E)

수율: 77%

융점: 시럽

실시예 3 : (R)-3-벤질옥시사이클로펜타논

(2S)-4-벤조일-2-메틸-1-옥사-4-아자스피로[4.4]노난

ee: 99%

수율: 50%

[α]_D ²⁰= +120.6(c 2.2, CH₂Cl₂)

융점: 시럽

¹H NMR: δ 1.27(d, J_{2 Me}=5.9㎐. 3H, Me); 1.59-2.03 ＆ 2.35-2.75(2×m, 6H, 2H, H6, 7, 8, 9); 3.19(dd, J_2.3#=J_3.3#=9.5㎐, 1H, H3^#); 3.45(dd, J_2.3=5.2㎐, 1H, H3), 4.04(m, 1H, H2); 7.33-7.51(m, 5H, 벤조일).

¹³C NMR: δ 17.5(Me), 24.5, 25.2(C7, 8), 35.2, 36.1(C6, 9), 55.6(C3), 70.8(C2), 105.0(C5), 126.6, 128.4, 129.8, 137.9, 167.4(벤조일).

(2S,7R)-4-벤조일-2-메틸-1-옥사-4-아자스피로[4.4]노난-7-올

de: 11:1(HPLC, CHIRALCEL OD-H-n-헵탄: IPA; 7:3, P=38bar, 유량=0.50㎖/분-크로마토그래피 후)

수율: 77%

[α]_D ²⁰= +87.8˚(c 1.6, CH₂Cl₂)

융점: 시럽

¹H NMR: δ(진하게 나타낸 경우 부 이성체) 1.26(d, J_2.Me=6.0㎐. 3H, Me), 1.69-2.37 ＆ 2.53-2.69(m, 5H, H6, 8, 9), 2.76, 2.93(2×dd; J_6#7=5.9㎐, J_6.6#=13.9㎐, 1H, 비: 11:1, H6) 3.19(dd, J_2.3#=J_3.3#=9.6㎐, 1H, H3^#), 3.45(dd, J_2.3=5.3㎐, 1H, H3), 4.06(m, 1H, H2), 4.46(m, 1H, H7), 5.15(br, s, 1H, OH), 7.42(m, 5H, 벤조일).

¹³C NMR: δ 17.4(Me), 34.2, 43.3(C6, 8, 9), 55.3(C3), 71.4(C2), 73.3(C7), 104.0(C5), 126.6, 128.4, 130.1, 137.3, 167.7(벤조일).

(2S,7R)-4-벤조일-7-벤질옥시-2-메틸-1-옥사-4-아자스피로[4.4]노난

de: 18:1(NMR)

수율: 43%

[α]_D ²⁰= +62.7˚(c 2.7, CH₂Cl₂)

융점: 시럽

¹H NMR: δ (진하게 나타낸 경우 부 이성체) 1.31(d, J_2.Me=5.9㎐. 3H, Me), 1.84-2.39 ＆ 2.52-2.73(m, 5H, H6, 8, 9), 2.81, 2.96(2×dd; J_6#7=7.0㎐, J_6.6#=13.8㎐, 1H, 비: 18:1, H6), 3.22(dd, J_2.3#=J_3.3#=9.6㎐, 1H, H3^#), 3.47(dd, J_2.3=5.2㎐, 1H, H3), 4.06(m, 1H, H2), 4.38(m, 1H, H7), 4.55(s, 2H, CH₂Ph), 7.21-7.57(m, 10H, CH₂Ph, COPh).

¹³C NMR: δ 17.6(Me), 31.5, 34.9(C8, 9), 42.3(C6), 55.5(C3), 70.9, 71.1(C2, CH₂Ph), 79.8(C7), 103.2(C5), 126.8, 127.0, 127.5, 127.8, 128.4, 128.4, 128.8, 130.1, 137.6, 139.0(CH₂Ph, COPh), 167.6(COPh).

(R)-3-벤질옥시사이클로펜타논

ee: 91%(키랄 GC)

수율: 82%

융점: 시럽

실시예 4 : (3S,4S)-4-하이드록시-3-메틸사이클로헥사논

(3R,5R/S,7R)-4-벤조일-3,7-디메틸-1-옥사-4-아자스피로[4.4]데칸

ee: 5R:5S; 4.4:1(HPLC, CHIRALCEL OD-H-n-헵탄: IPA; 4:1, P=34bar, 유량=0.5㎖/분)

출발 물질(알드리흐; Aldrich)의 순도:

(R)-(+)-3-메틸사이클로헥사논(98% ee)

(R)-(-)-2-아미노-1-프로판올(98% ee)

수율: 76%

[α]_D ²⁰= -45.4˚(c 1.4, CH₂Cl₂)

융점: 62 내지 72℃

¹H NMR: δ 0.82-1.16(m, 6H, 2×Me), 1.43-2.87(m, 9H, H6, 7, 8, 9, 10), 3.60(m, 1H, H2), 4.01(m, 2H, H2, 3), 7.38(s, 5H, 벤조일).

¹³C NMR: δ (진하게 나타낸 경우 부 이성체) 19.9, 20.7, 20.8, 22.4(Me), 22.8(C9), 28.2, 29.9(C7), 30.1, 30.2(C8), 33.3, 34.8(C10), 43.4(C6), 54.2, 54.5(C3), 69.3, 69.4(C2), 97.4(C5), 126.1, 128.5, 129.2. 138.6, 168.4(벤조일).

(3R,5R,7S,8S)-4-벤조일-3,7-디메틸-1-옥사-4-아자스피로[4.4]데칸-8-올

de: 95% HPLC(CHIRALCEL OD-H, n-헵탄: IPA; 7:3; P=40bar, 유량=0.50㎖/분)

수율: 40%

[α]_D ²⁰= -33.2˚(c 0.5, CH₂Cl₂)

융점: 215 내지 218℃

¹H NMR: δ 0.98 ＆ 1.03(2×d, J=6.7 ＆ 6.4㎐, 6H, 2×Me), 1.54-1.95 ＆ 2.63(m ＆ br m, 6H ＆ 2H, H6, 7, 9, 10, OH), 3.31(ddd, J_8.9ax=J_8.7ax=10.8㎐, J_8.9eq=4.2㎐. 1H, H8), 3.63(m, 1H, H2), 4.02(m, 2H, H2, 3), 7.37(s, 5H, 벤조일).

¹³C NMR: δ 18.2, 20.6(Me), 29.2(C9), 31.8(C10), 36.7(C7), 41.1(C6), 54.6(C3), 69.4(C2), 74.8(C8), 96.3(C5), 126.1, 128.5, 129.3, 138.3, 168.5(벤조일).

(3S,4S)-4-하이드록시-3-메틸사이클로헥사논

de: 1개의 디아스테레오머

수율: 81%

[α]_D ²⁰= +22.0˚(c 0.6, CH₂Cl₂)

융점: 시럽

¹H NMR: δ 1.05(d, J=6.1㎐, 3H, Me), 1.68-2.59(m, 8H, H2, 3. 5, 6, OH), 3.69(ddd, J_4.5ax=J_4.3ax=8.1㎐, J_4.5eq=3.7㎐, 1H, H4).

¹³C NMR: δ 18.6(Me), 32.4, 38.4, 39.5(C2, 5, 6), 45.7(C3), 72.8(C4), 210.5(C1).

실시예 5 : 3-아세톡시사이클로펜탄카복스알데히드

(4R)-N-벤조일-2-사이클로펜틸-4-메틸옥사졸리딘

de: 1개의 디아스테레오머(NMR)

수율: 28%

[α]_D ²⁰= +107.5˚(c 1.1, CH₂Cl₂)

융점: 담황색 오일

¹H NMR: δ 1.13-1.85(br m, 11H, H2', 3', 4', 5', Me), 2.29(br s, 1H, H1'), 3.54-4.03(m, 3H, H4, 5), 5.46(d, J_2.1'=5.7㎐, 1H, H2), 7.38(m, 5H, 벤조일).

¹³C NMR: δ 20.9(Me), 25.3, 27.3, 28.4(C2', 3', 4', 5'), 44.1(C1'), 54.3(C4), 71.9(C5), 92.5(C2), 126.6, 128.5, 130.0, 137.4, 170.5(벤조일).

(4R)-N-벤조일-2-(3'-하이드록시사이클로펜틸)-4-메틸옥사졸리딘

수율: 30%

[α]_D ²⁰=+104.9˚(c 3.9, CH₂Cl₂)

융점: 83 내지 85℃

¹H NMR: δ (진하게 나타낸 경우 부 이성체) 1.14-2.22(4×br m, 10H, H2', 4', 5', Me, OH), 2.64(br s, 1H, H1'), 3.64-3.99(m, 3H, H4, 5), 4.21, 4.33(2×br s, 1H, 비: 1:3.5, H3'), 5.42(m, 1H, H2), 7.43(m, 5H, 벤조일).

¹³C NMR: δ 20.9, 21.1(Me), 25.3, 25.4, 26.0(C5'), 35.0, 35.1, 35.7, 35.7, 37.1, 38.2, 40.1(C2', 4'), 41.5, 41.9(C1'), 54.3, 54.5(C4), 71.6, 71.9, 72.0(C5), 73.1, 73.3, 73.3, 73.4(C3'), 92.2, 92.4, 92.5(C2), 126.4, 126.5, 126.6, 126.9, 127.0, 127.1, 127.1, 128.4, 128.5, 128.9, 130.1, 137.1, 137.2, 171.2(벤조일).

(4R)-N-벤조일-2-(3'-아세톡시사이클로펜틸)-4-메틸옥사졸리딘

수율: 83%

융점: 시럽

¹H NMR: δ (진하게 나타낸 경우 부 이성체) 1.29(d, J_4.Me=6.4㎐, 3H, Me), 1.54-2.26(3×m, s, 9H, H2', 4', 5', COCH₃), 2.40, 2.66(2×br s, 1H, 비: 1:3.5, H1'), 3.65-3.98(m, 3H, H4, 5), 5.03, 5.24(2×br s, 1H, H3'), 5.42, 5.49(2×d, J_2.1=5.1 ＆ 5.7, 비: 3:1, 1H, H2), 7.42(m, 5H, 벤조일).

¹³C NMR: δ (진하게 나타낸 경우 부 이성체) 21.0, 21.4(2×Me), 24.9, 26.1, 26.1(C5'), 32.1, 32.2, 33.7, 35.2(C2', 4'), 41.2, 41.6, 42.5(C1'), 54.4(C4), 72.0(C5), 75.9, 76.7(C3'), 91.8, 92.0, 92.0(C2), 126.6, 128.5, 130.1, 137.2, 170.8(벤조일).

실시예 6 : (R)-3-벤질옥시사이클로펜타논

(2R)-4-벤조일-2-메틸-1-옥사-4-아자스피로[4.4]노난

ee: 98%

수율: 39%

[α]_D ²⁰= -123.5˚(c 2.3, CH₂Cl₂)

융점: 시럽

¹H NMR: δ 1.27(d, J_2.Me=6.1㎐, 3H, Me); 1.56-2.05 ＆ 2.36-2.75(2×m, 6H, 2H, H6, 7, 8, 9); 3.20(dd, J_2.3#=J_3.3#=9.5㎐, 1H, H3^#); 3.45(dd, J_2.3=5.1㎐, 1H, H3), 4.03(m, 1H, H2); 7.33-7.51(m, 5H, 벤조일).

(2R,7R)-4-벤조일-2-메틸-1-옥사-4-아자스피로[4.4]노난-7-올

de: 1:6(71%, NMR, 크로마토그래피 후)

수율: 28%

[α]_D ²⁰= 낮은 de로 인해 측정되지 않음

융점: 시럽

¹H NMR: δ (진하게 나타낸 경우 부 이성체) 1.23(d, J_2.Me=5.9㎐, 3H, Me), 1.68-2.56(m, 5H, H6, 8, 9), 2.73, 2.90(2×dd; J_6#.7=6.3㎐, J_6.6#=14.0㎐, 1H, 비: 6:1, H6), 3.17(dd, J_2.3#=J_3.3#=9.7㎐, 1H, H3^#), 3.43(dd, J_2.3=5.3㎐, 1H, H3), 4.03(m, 1H, H2), 4.46(m, 1H, H7), 5.04(br s, 1H, OH), 7.39(m, 5H, 벤조일).

¹³C NMR: δ (진하게 나타낸 경우 부 이성체) 17.4(Me), 33.8, 34.6, 43.2, 44.5(C6, 8, 9), 55.3(C3), 71.4(C2), 72.2, 73.3(C7), 103.58, 104.0(C5), 126.6, 128.4, 130.2, 137.2, 167.8(벤조일).

(2R,7R)-4-벤조일-7-벤질옥시-2-메틸-1-옥사-4-아자스피로[4.4]노난

de: 6:1(71%, NMR)

수율: 56%

[α]_D ²⁰= 낮은 de로 인해 측정되지 않음

융점: 시럽

H NMR: δ (진하게 나타낸 경우 부 이성체) 1.31(d, J_2.Me=6.0㎐, 3H, Me), 1.77-2.70(m, 5H, H6, 8, 9), 2.81, 2.94(2×dd; J_6#.7=7.7㎐, J_6.6#=14.1㎐, 1H, 비: 6:1, H6), 3.22(dd, J_2.3#=J_3.3#=9.5㎐, 1H, H3^#), 3.48(dd, J_2.3=5.2㎐, 1H, H3), 4.08(m, 1H, H2), 4.40(m, 1H, H7), 4.54(s, 2H, CH₂Ph), 7.21-7.57(m, 10H, CH₂Ph, COPh).

¹³C NMR: δ 17.5(Me), 32.1, 33.9(C8, 9), 42.8(C6), 55.3(C3), 71.3, 71.3(C2, CH₂Ph), 78.8(C7), 102.7(C5), 126.7, 126.7, 127.4, 127.8, 128.4, 128.4, 130.1, 137.5, 139.0(CH₂Ph, COPh), 167.5(COPh).

(R)-3-벤질옥시사이클로펜타논

ee: 71%(키랄 GC; Macherey-Nagel, Lipodex E)

수율: 77%

[α]_D ²⁰= -

융점: 시럽

¹H NMR 및¹³C NMR은 문헌의 값과 동일하다[참고 문헌: T.H. Eberlein, F.G. West, R.W. Tester, J. Org. Chem., 1992, 57, 3479-3482].

실시예 7 : (R)-3-벤질옥시사이클로펜타논

(3S)-4-벤조일-3-메틸-1-옥사-4-아자스피로[4.4]노난

ee: 98%

수율: 89%

[α]_D ²⁰= +76.4°(c 2.7, CH₂Cl₂)

융점: 65.5 내지 67.5℃(EtOAc/석유 에테르) 담황색 고체

¹H NMR: δ 0.93(m, 3H, Me), 1.57-2.03, 2.32-2.71(2×m, 6H ＆ 2H, H6, 7, 8, 9), 3.57(m, 1H, H2), 3.98(m, 2H, H2, 3), 7.38(s, 5H, 벤조일).

¹³C NMR: δ 20.1(Me), 24.7, 24.8(C7, 8), 35.0, 36.5(C6, 9), 54.1(C3), 70.0(C2), 105.0(C5), 126.2, 128.4, 128.5, 129.4, 138.2, 168.0(벤조일).

(3S,7R)-4-벤조일-3-메틸-1-옥사-4-아자스피로[4.4]노난-7-올

de: 1:3(50%), NMR, 크로마토그래피 후

수율: 35%

[α]_D ²⁰= 낮은 de로 인해 측정되지 않음

융점: 시럽

¹H NMR: δ (진하게 나타낸 경우 부 이성체) 0.94(m, 3H, Me); 1.74-2.70(m, 6H, H6, 8, 9, OH), 2.76, 3.01(2×dd; J_6.7=5.9㎐, J_6.6=14.0㎐, 1H, 비: 3:1, H6), 3.63(m, 1H, H2), 4.02(m, 2H, H2, H3), 4.47(br s, 1H, H7), 7.38(s, 5H, 벤조일).

¹³C NMR: δ (진하게 나타낸 경우 부 이성체) 20.1, 20.3(Me), 33.8, 34.6, 34.7, 34.9(C8, 9), 43.4, 45.0(C6), 54.2(C3), 70.5(C2), 73.0(C7), 104.0, 104.2(C5), 126.4, 128.7, 129.8, 138.1, 168.5(벤조일).

(3S,7R)-4-벤조일-7-벤질옥시-3-메틸-1-옥사-4-아자스피로[4.4]노난

de: 1:2(33%, NMR)

수율: 78%

[α]_D ²⁰= 낮은 de로 인해 측정되지 않음

융점: 시럽

¹H NMR: δ (진하게 나타낸 경우 부 이성체) 0.96(m, 3H, Me); 1.79-2.66(m, 5H, H6, 8, 9), 2.78, 2.96(2×dd; J_6.7=7.3㎐, J_6.6=14.4㎐, 1H, 비: 2:1, H6), 3.56(m, 1H, H2), 4.03(m, 2H, H2, H3), 4.33(br s, 1H, H7), 4.54(m, 1H, CH₂Ph), 7.34(m, 10H, 벤조일, 벤질).

¹³C NMR: δ (진하게 나타낸 경우 부 이성체) 20.1(Me), 31.5, 31.7, 33.9, 34.1(C8, 9), 41.9, 43.0(C6), 54.0. 54.1(C3), 70.3, 70.4(C2), 70.9, 71.1(CH₂Ph), 79.1, 79.2(C7), 103.0(C5), 126.2, 126.2, 127.4, 127.8, 128.3, 128.5, 129.6, 129.7, 138.0, 138.8, 168.3(벤조일, 벤질).

(R)-3-벤질옥시사이클로펜타논

ee: 29%(키랄 GC; Macherey-Nagel, Lipodex E)

수율: 74%

[α]_D ²⁰= -

융점: 시럽

Claims

화학식 Ⅲ 또는 Ⅳ의 화합물을 적합한 키랄 앵커/보호 그룹으로 보호시키고, 이러한 방법으로 보호된 화합물을 효소 레지오선택적 및 스테레오선택적으로 하이드록실화시키고, 하이드록실 그룹을 적합한 화합물로 임의로 보호시키며 앵커/보호 그룹을 제거하는 것을 포함하는, 화학식 Ⅰ 또는 Ⅱ의 화합물의 제조방법.

화학식 Ⅰ

화학식 Ⅱ

화학식 Ⅲ

화학식 Ⅳ

상기식에서,

A는또는이고,

A'는또는이고,

X 및 Y는 또는이고, 단 상기 화학식 Ⅱ에서는 라디칼 X 및 Y 중의 하나는 수소이고,

n은 0, 1, 2 또는 3의 정수 중의 하나이고, 단 화학식 Ⅰ의 화합물은 환에서 이중결합을 포함할 수 있고,

m은 0 또는 1의 수 중의 하나이고,

Z₁및 Z₂는 각각 서로 독립적으로 치환되지 않거나 C₁- 내지 C₄-알킬로 치환될 수 있고/있거나 불포화되지 않거나 불포화될 수 있는 C₁- 내지 C₈-알킬렌 라디칼이고,

R₁및 R₂는 각각 서로 독립적으로 수소이거나 직쇄 또는 측쇄 또는 사이클릭 C_1-4알킬이거나

R₁및 R₂는 그룹 A를 포함하는 환과 함께 치환되지 않거나 C₁-C₄-알킬로 치환될 수 있고/있거나 불포화되지 않거나 불포화될 수 있는 구조의 비사이클로[a, b, c] 헵탄 내지 데칸의 비사이클릭 화합물(여기서, a, b 및 c는 0, 1, 2, 3 또는 4이다)을 형성하며,

R₃및 R₄는 수소이거나 직쇄, 측쇄 또는 사이클릭 C₁-C₈-알킬일 수 있다.
제1항에 있어서, 사용되는 화학식 Ⅲ 또는 Ⅳ의 화합물이 화합물, 또는 비사이클로[2.2.1]헵탄-2-온, (1R) 및 (1S)-1,7,7-트리메틸비사이클로[2.2.1]헵탄-2-온, 트랜스-1-데칼론, 2-데칼론, (1S) 및 (1R)-1,3,3-트리메틸비사이클로[2.2.1]헵탄-2-온, 비사이클로[3.3.0]옥탄-3,7-디온, 비사이클로[3.3.0]옥탄-3-온, 비사이클로[3.3.0]옥트-7-엔-2-온, 비사이클로[3.3.0]옥트-6-엔-2-온, 비사이클로-[4.2.0]옥트-2-엔-7-온, 비사이클로[3.2.0]헵트-2-엔-7-온 및 비사이클로[3.2.0]헵트-2-엔-6-온 중의 하나인 방법.
제1항에 있어서, 사용되는 화학식 Ⅲ 또는 Ⅳ의 화합물이 화합물중의 하나인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 사용되는 앵커/보호 그룹이 화학식 Ⅴ 또는 Ⅵ의 화합물인 방법.

화학식 Ⅴ

화학식 Ⅵ

상기식에서,

R'는 직쇄 또는 측쇄 C_1-4-알킬이다.
제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 사용되는 앵커/보호 그룹이 (R)-2-아미노-1-프로판올, (S)-2-아미노-1-프로판올, (R)-1-아미노-2-프로판올, (S)-1-아미노-2-프로판올, (R)-2-아미노-1-부탄올, (S)-2-아미노-1-부탄올, (R)-1-아미노-2-부탄올 또는 (S)-1-아미노-2-부탄올 중의 하나의 N-벤조일 유도체인 방법.
제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 효소적 하이드록실화가 아스퍼길러스 오크라세우스(Aspergillus ochraceus) ATCC 18500, 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) CCM 2037, 바실러스 메가테리움 DSM 32, 비우베리아 바시아나(Beauveria bassiana) ATCC 7159, 칼로넥트리아 데코라(Calonectria decora) DSM 879, 카에토뮴 코클리오이데스(Chaetomium cochlioides) DSM 831, 카에토뮴 글로보숨(Chaetomium globosum) DSM 1962, 코르니에스포라 카시이콜라(Cornyespora cassiicola) DSM 62474, 코르티큠 사사키(Corticum sasakii) NRRL 2705, 쿠닝하멜라 블라케슬리아나(Cunninghamella blakesleeana) DSM 1906, 쿠닝하멜라 에치눌라타(Cunninghamella echinulata) DSM 1905, 쿠닝하멜라 엘레간스(Cunninghamella elegans) DSM 1908, 디플로디아 고시피나(Diplodia gossypina) ATCC 10936, 푸사리움 솔라니(Fusarium solani) DSM 62416, 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina) ATCC 8979, 무코르 플룸베우스(Mucor plumbeus) CBS 110.16, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) ATCC 29607, 펠리쿨라리아 필라멘토사(Pellicularia filamentosa) IFO 6298, 페니실리움 라스트릭키(Penicillium rastrickii) ATCC 10490, 폴리포루스 오스트레이포르미스(Polyporus ostreiformis) CBS 36234, 스타우로포마(Staurophoma) 종 DSM 858 및 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) ATCC 13273의 미생물 중의 하나를 사용하여 수행되는 방법.
제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 비우베리아 바시아나 ATCC 7159 또는 쿠닝하멜라 블라케슬리아나 DSM 1906 종 중의 하나의 미생물이 사용되는 방법.