KR20000070545A - 질병 치료에 유용한 세포 표면막 수용체 조절제의 확인 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 불활성 상태와 활성 상태 사이에서 평형 상태로 존재하는 세포 표면 수용체에 관한 것이다. 현재까지, 선행 기술은 수용체 기능을 연구하고, 수용체(또는 합성 대체물)에 대한 내생 리간드를 우선 확인한 다음 불활성 구조 형태로 존재하는 수용체에 대한 길항제를 확인하기에 집중된 신규한 약물에 대한 수용체를 스크리닝하기 위해 접근하여 왔다. 이제, 수용체에 의해 야기된 질병의 치료와 관련된 상당한 가변성인 정보가, 구성적으로 활성화된 형태의 수용체에 대한 역 아고니스트로서 작용하는 화합물; 즉, 평형 상태가 활성 상태를 향해 이동한 화합물을 확인함으로써 직접 수득될 수 있다는 것이 인지되었다. 수용체를 구성적으로 활성화시키는 방법을 이용하여, 수용체에 대한 유전자 정보 코딩을 구체화시킨 다음 적절한 발현 시스템으로 발현높은 처리량. 수용체 상에서 작용하는 화합물에 의해 유도된 세포 반응을 측정하는 분석은 수용체의 역 아고니스트 및 아고니스트 둘다를 확인할 수 있다. 높은 처리량 스크리닝을 이용하여 상기 화합물을 신속하게 확인할 수 있다. 특히 관련있는 특징은 수용체 작용의 조절제가 내생 리간드 또는 수용체 기능에 관한 선행 지식없이도 확인될 수 있다는 것이다. 본 발명의 방법은 특히 희귀 수용체에 대해 적용할 수 있다.

Description

질병 치료에 유용한 세포 표면막 수용체 조절제의 확인 방법{A Method of Identifying Modulators of Cell Surface Membrane Receptors Useful in the Treatment of Disease}

<세포 표면 수용체>

세포는 단리시 존재하지 않는다. 특히 조직들이 분화된 다세포 유기체에서, 세포들 간의 교통은 전체 유기체의 동화 및 기능화를 조화시킬 필요가 있다. 통상, 상기 교통은 상당한 거리에 걸쳐 발생해야 한다. 세포들 간의 정보 이동 기능은 어떠한 정보 시스템의 경우에서라도 2가지의 일반적 기준을 만족시켜야 하는데, 즉 1) 정보는 그의 목적하는 불변의 용도에 도달할 수 있어야 하며; 2) 정보는 정보화 동안 작용할 수용자에게 전달하여야 하며 그에 의해서만 감지 검출되어야 한다. 상기 2가지 조건 중 어느 것의 실패라도 시스템으로 도입되는 무의미한 소음이 되고 만다. 1905년 만큼 초기에는, Langley가 화학적 화합물 신호를 합성 및 방출함으로써 세포를 교통시키고, 이들은 상기 신호 바로 전에 반응하도록 특별히 고안된 수용 세포 상에 배치된 분자에 의해 검출된다는 이론 개념을 도입하였다.

동물에서는 신호화 세포와 수용 세포간에 포함된 거리를 근거로 하여 3가지 신호 유형으로 구분 구별된다. 세포의 개별 군에 도달하기 위해서는, 내분비 신호화가 호르몬의 내분비 기관에 의해, 통상적으로는 혈류로의 방출을 수반한다. 또한, 면역 체계는 다소의 거리를 두고 배치된 기타 세포에 대한 신호로서 기능할 수 있는 항체를 생성시킨다. 표적 세포가 신호화 세포에 보다 가까운 경우, 파라크린(paracrine) 신호화는 신경 전달 또는 신경 근육 전달에서와 같이, 인접 세포에만 영향을 주는 신호화 물질을 수반한다. 최종적으로, 일부 세포는 방출되는 화합물에 반응한다. 상기 자체 신호화를 오토크린(autocrine) 신호화로 명명한다.

다세포 유기체에 의해 사용된 신호 분자(호르몬, 이온, 신경 전달제, 면역 분자)가 다양하지만, 각각 방출된 세포 신호 수용 장치는 구성 및 작동 둘다에 있어서 현저하게 유사하다. 신호화 분자는 각각 대 거대 분자 단백질 또는 내부 임베딩된(embedded) 단백질 어셈블리로 구성되며 수용 세포 혈장막을 스패닝하는(spanning) 특이 수용체에 의해 인지된다. 신호화 분자를 인지하는 수용체의 일부는 세포의 세포외 표면 상에 존재한다. 막 내에 임베딩된 단백질 수용체의 일부는 통상적으로, 소수성 측기를 갖는 아미노산으로 구성된다. 최종적으로, 세포 화학에 접근하는 수용체의 일부는 세포내 공간으로 연장된다.

수용체는 특이 세포외 신호를 수용하여 그의 존재를 세포막을 횡단하여 전사시켜 세포내 생화학적 반응을 활성화시킨다. 상기 정보를 세포막을 횡단하여 전달하는 정확한 방법이 아직까지 명확하게 이해되지는 않는다. 그러나, 축적되는 증거를 근거로 하여, 신호 분자가 상이한 제3원 형상(형태)의 수용체를 안정시키는 것으로 믿어지며, 이 형태 차이는 또한 세포내 부분이 변환 단백질과 상호 작용한 다음 이 단백질이 추가의 세포내 생화학적 활성에 참여하도록 한다. 이러한 추가의 활성은 "제2 메신저" 시스템으로 명명되며 전형적으로, 3'5'-환식 AMP(CANP), 3'5'-환식 GMP(CGMP), 1,2-디아실글리세롤, 이노시톨 1,4,5-트리포스페이트 및 Ca²⁺이 포함된다. 이들 제2 메신저는 또한, 하나 이상의 효소 시스템을 활성화시킨다.

상기 세포내 상호 작용에 대한 정확한 설명은 수용체 유형에 따라 변화한다. 상이한 세포 상에 존재하는 동일한 수용체는 상이한 변환 단백질과 연결되어 상이한 효과를 생성시킬 수 있다. 따라서, 동일 세포 상의 상이한 수용체는 동일한 세포 반응을 생성시킬 수 있다. 신호화 물질이 수용체 상의 특별 부위와 결합하여 형태 변화를 유도하기 때문에, 이들 물질은 통상적으로 리간드로서 언급된다.

다수의 수용체 종류는 포유류에서 존재하는 것으로 공지되어 있으며 이들 종류는 이들의 유전적 및 화학적 구조, 및 이들이 상호 작용하는 제2 메신저 경로를 근거로 하여 분화된다. 이들 종류는 4가지 중요한 수용체 군, 즉 1) G 단백질 커플링된 수용체; 2) 티로신 키나제 수용체; 3) 리간드 게이티드(gated) 이온 채널; 및 4) 면역 인지 수용체이다. 이들 군은 또한, 이들의 적합한 리간드에 노출될 때의 이들 반응의 신속도를 기준하여 2가지 종류로 구분할 수 있다. 리간드 게이티드 이온 채널은 활성화될 때 밀리초로 반응한다. 나머지 군에 포함되는 수용체는 추가의 제2 메신저 경로가 활성화되어야 하기 때문에 보다 느린 반응을 매개한다.

연구 중의 수용체의 전통적 생화학적 방법은 우선, 수용체를 활성화하는 내생 또는 천연 리간드를 확인하려는 시도 경로를 가지며 여전히 그를 따른다. 종종, 내생 리간드는 공지되어 왔거나, 또는 신경 전달 경우에서와 같이 용이하게 추론되었다. 평소, 다양한 조직에서의 수용체 생리학적 분포를 근거로 하여, 현재까지 수용체를 연구하기 위한 이미 공개된 모든 접근법은 하나의 예외가 있지만 내생 리간드의 초기 확인에 의존한다. 유일한 예외란 화합물이 모르핀과 같은 수용체와 결합하여 방사성 동위 원소에 의해 라벨링된 다음 수용체의 연구에 사용되는 것으로 공지되는 때이다. 이는 내생 리간드, 예를 들면 엔케팔린, 엔도르핀, 또는 오피에이트 수용체에 대한 다이노르핀 펩티드없이도 수행될 수 있다. 이 경우, 방사성 화합물은 수용체를 확인하여 내생 리간드(들)의 발견 및 확인에서 돕기 위해 사용될 수 있다.

내생 리간드가 일단 확인되면, 수용체의 거동을 조사 또는 개질하기 위해 사용될 수 있는 화합물(약물)에 대한 연구는 전형적으로 수행된다. 이들 연구, 즉 G 단백질 커플링된 약물 후보(및 기타 유형의 수용체)를 확인하기 위한 화학적 라이브러리 스크리닝 방법은 리간드 기재의 분석에 따르며, 여기서 리간드는 우선 일부 방식으로 (예를 들면, 방사성 동위 원소로) 라벨링하여 검출한 다음 시험관내 발현 시스템 중의 표적 수용체를 "결합"하기 위해 사용된다. 이어서, 화학적 화합물은 표적 수용체를 횡단하여 스크리닝하여, 라벨링된 리간드를 수용체 부위로부터 대체시키는 분자를 확인한다. 라벨링된 리간드를 대체하는 분자는 잠재적 아고니스트 또는 길합제(즉, 수용체 자극제 또는 억제제)이며 약물 회수를 위한 화학적 출발 지점으로서 작용한다. 부록 "A"에는 약물, 및 분석을 스크리닝하는 리간드 기재의 수용체를 사용하여 밝혀진 기타 비 펩티드 화합물의 예가 기재된다. 중요한 시중의 기업체가 스크리닝 서비스를 제공하는 중에 형성된 리간드 기재의 스크리닝 분석 범례는 꽤 잘 설정되어 있다. 한 회사로부터만 입수가능한 분석의 광범위한 레퍼토리는 부록 "B"에 나타낸다.

그러나, 현재까지 집중적인 노력에도 불구하고, 분자 클로닝에 의해 확인된 신규의 수용체에 대한 내생 리간드의 확인은 상당히 시간 소모적이며, 대부분의 경우, 비성공적으로 노력만 드는 것으로 증명되었다. 내생 리간드가 공지되지 않은 채인 상기 수용체는 계통적으로 "희귀(orphan) 수용체"로서 분류된다. 희귀 수용체란 수용체를 연구하기 위해 사용할 수 있는 비공지의 리간드를 갖는다는 의미이다. 이러한 이유 때문에, 리간드 기재의 스크리닝 분석 및 상기 수용체에 대한 화학적 라이브러리의 연이은 스크리닝은 발전할 수 없었다. 이는 상기의 중요한 수용체 종류를 위한 소 분자 약물의 발견을 극도로 방해하였다. 인간 게놈 프로젝트(Human Gnome Project)가 진행될 때, 추가의 수용체의 유전적 서열이 가까운 장래에 확인될 것이며, 그러한 지식이 인간 질병의 원인이 되는 추가의 수용체의 발견을 유도할 것이라고 기대되었다. 또한, 이들 수용체가 또한, 상기 수용체에 대한 내생 리간드에 관해 공지된 것인 것같지 않기 때문에, 질병 상태와 직접 연관되는 것처럼 보이는 경우에서조차 희귀 수용체로서 분류될 것처럼 거의 보였다. 명백하게는, 내생 리간드에 관한 지식이 없어도 (질병의 환경에 의존하여 활성 또는 불활성시키기 위한) 상기 수용체의 상태를 개질할 화합물을 확인하기 위한 일부 방법을 발견하는 것은 결정적으로 중요하다. 그러나, 그러한 방법 중 어떠한 것도 선행 기술에서는 공지되어 있지 않다.

<G 단백질 커플링된 수용체>

상기에서 언급한 4가지 수용체 군 중에서, G 단백질 커플링된 수용체는 가장 많다. G 단백질 커플링된 수용체는 수용체가 활성화되는 세포내 단백질 세그먼트가 GDP(구아노신 디포스페이트)를 결합한다는 사실에 의해 구별된다. G 단백질이 수용체에 의해 활성화된 후, 결합된 GDP는 GTP(구아노신 트리포스페이트)로 전환되며 G 단백질은 추가로 효소 활성을 매개한다. 상이한 G 단백질은 상이한 세포내 활성화를 매개한다. 이들 활성화 리간드, 제2 메신저 G 단백질 시스템 및 아미노산 서열에서의 차이에도 불구하고, G 단백질 커플링 수용체는 일반적인 구조 모티프를 공유한다. 이들 수용체는 모두 7개의 알파("α") 나선을 형성하는 22 내지 24개의 소수성 아미노산의 7개 서열을 가지며, 이들은 각각 막을 스패닝한다. 막내외(transmembrane) 나선은 아미노산의 스트랜드에 의해, 막의 세포외 측면 상의 제4 및 제5 막내외 나선 사이의 보다 큰 루프(loop)와 연결된다. 주로 친수성 아미노산으로 구성된 또다른 보다 큰 루프는 막의 세포내 측면 상의 제5 및 제6 막내외 나선을 연결한다. 수용체의 카르복시 말단은 세포외 공간에서 아미노 말단을 갖는 세포 내에 존재한다. 제5 및 제6선을 연결하는 루프는 물론 카르복시 말단도 G 단백질과 상호 작용하는 것으로 고려된다. G 단백질 커플링된 수용체의 일반적 구조는 도 1에 도시된다.

인간 게놈 내에서, 총 추정 2,000개 유전자는 상기 한 종류의 수용체를 코딩하는 것으로 믿어진다. 현재까지, 활성화 리간드가 공지되어 있는 약 100개 G 단백질 커플링된 수용체만에 대한 유전자 서열이 확인되어 있다. 그러나, 활성화 리간드가 공지되지 않은 약 100개의 기타 G 단백질 커플링된 수용체에 대한 서열은 확인 및 크로닝되어 있다. 이들은 희귀 G 단백질 커플링된 수용체를 나타낸다.

생리적 조건 하에, G 단백질 커플링된 수용체는 세포 막에서 2가지 상이한 상태 또는 형태 사이의 평형 상태, 즉 "불활성" 상태 및 "활성" 상태로 존재한다. 도 2에 도시되어 있는 바와 같이, 불화성 상태에서 수용체는 세포내 변환(제2 메신저) 경로와 연결할 수 없으며 생물학적 반응이 생성되지 않는다. 활성 상태로의 수용체 형태 변화는 변환 경로와의 연결을 허용하여 세포에서의 생물학적 반응을 결과한다. 수용체에 특이한 아고니스트 리간드는 수용체를 활성 상태에서 안정화시킴으로써 변환 경로에의 연결을 촉진시킬 수 있다.

하기에서 보다 상세히 논의될 바와 같이, 과저 수년에 걸친 최근 발견 결과, 수용체가 역시, 내생 리간드 또는 외인성 아고니스트 리간드와 결합하는 것이 아닌 수단에 의해 활성 형태에서 안정활될 수 있다는 것이 알려졌다. 그러한 기타 수단으로는 수용체의 아미노산 서열에 대한 개질법이 포함되지만 이들로만 한정되는 것은 아니다. 이들 기타 수단은 수용체와의 리간드 결합의 안정화 효과를 (리간드의 부재 하에) 효과적으로 자극시켜 수용체를 활성 상태에서 유지시킨다. 상기 리간드 독립적 수단에 의한 안정화는 "구성적 수용체 활성화"로 명명된다. 예를 들면, G_q포스포리파제 G 단백질 커플링된 α_1β아드레노셉터 및 G₃아데닐 시클라제 커플링된 β₂아드레날린성 수용체의 제3 세포질 루프의 카르복시 말단 중의 아미노산의 단 균질 서열의 내부 변화가 완전히 아고니스트 자극된 천연 수용체와 비교할 때, 세포내 활성화 수준을 촉진하는 수용체를 둘다 결과하였다. 동등하게 중요한 구성적으로 활성화된 수용체는 정상 아고니스트에 대한 친화성이 길항제에 대한 친화성이 증가되지 않았을 때의 천연 수용체의 것보다 훨씬 컸다. 사실, (천연 수용체에 관한) 활성을 변화시키는 수개의 공지된 아고니스트를 실험할 때, 아고니스트의 초기 활성이 클수록 구성적으로 활성화된 수용체에 대한 그의 친화성 증가가 커졌다는 것이 밝혀졌다.

수용체의 구성적 활성화를 결과하는 4가지 원칙적 방법이 확인되었다. 제1 방법은 특이 위치에서의 수용체 아미노산 서열의 분자 변질을 수반한다. 상기 변화는 수용체 중의 형태 변화를 유도하여 구성적 활성화를 결과한다. 제2 방법은 수용체를 수용체 일부에 대한 항 펩티드 항체로 자극시켜 세포외 공간으로 연장시키는 것을 수반한다. 항체는 리간드 결합을 관능적으로 자극시켜 구성적 활성화를 유도하는 것처럼 보인다. 제3 방법은 시험관내 시스템에서 수용체의 과다 발현(over-expression)을 수반한다. 그러한 시스템에서, 보다 많은 수용체는 어떠한 시점에서라도 활성 상태에 있다. 최종적으로, 제4 방법은 수용체의 활성 상태와 커플링시키기 위한 G 단백질(들)의 과다 발현을 수반한다. 변환 G 단백질의 보다 높은 농도의 존재는 수용체 평형 상태를 활성 상태로 이동시키는 작용을 한다.

수용체의 구성적 활성화의 중요성은 또한, 유의한 수의 인간 질병 및 심각한 의료 상태가 유전적 돌연변이의 결과로서 천연적으로 발생하는 구성적으로 활성화된 수용체와 관련있다는 최근 발견에 의해 주목받았다. 질병과 관련된 구성적으로 활성화된 수용체에 더하여, 소수의 추가 구성적으로 활성화된 수용체가 질병과 무관한 것으로 공지되었다. 도 3의 차트는 일부의 공지된 구성적으로 활성화된 수용체를 기재하며 1) 관련 질병; 2) 구성적 활성화 성질(서열 개질, 항체, 과다 발현); 3) 활성화 개질의 위치; 4) 활성화 개질의 성질; 및 5) 참조된 인용 문헌을 나타낸다. 도 3에 도시된 수용체 각각에 대한 참조 문헌은 부록 "C"에 제공한다.

도 3에 도시된 구성적으로 활성화된 수용체 및 수용체 중에서 확인된 분자 변화의 개요는 구성적 활성화의 기본 요건 일부를 명확하게 나타낸다. 하기에 설명된 바와 같이, 이들 구성적 활성화 형태 일부는 질병 상태에서 자연적으로 발생하지만, 기타 형태는 실험실에서만 관찰된다.

갑상선 기능 항진증(그레이브스병): 그레이브스병은 갑상선 티로트로핀 자극 호르몬(TSH) 수용체의 구성적 활성화와 관련있어, 갑상선 호르몬의 순환 수준이 상당히 증가되어 갑상선 중독증(thyrotoxicosis)을 유도하는 것으로 공지되어 있다. 대부분의 경우, 상기 구성적 활성화는 티로트로핀 수용체에 대한 천연 자가 항체의 자극 작용으로부터 결과되지만, 일부의 경우 수용체 중의 천연 유전적 변경도 역시 구성적 활성화를 유도할 수 있다(Parma 등 1993; Duprez 등 1994). 전통적인 그레이브스병 치료법은 외과적 적출 또는 방사성 요오드를 사용하는 갑상선의 파괴, 또는 항 갑상선 약물(원칙적으로 메티마졸)을 사용하는 갑상선 호르몬 합성의 억제에 의존하였다. 치료법 둘다는 이상적인 것보다 못한 것으로 판명되었으며; 외과적 또는 방사성 요오드 치료법 환자가 연속적 갑상선 호르몬 대체 요법 후에, 항 갑상선으로 치료받는 동안 약물은 1 또는 2년 치료 후의 50 내지 70%의 relapse 율률과 관련있다.

남성 조발 청춘기: 이것은 통상적으로, 상염색체(autosomal) 우성 유전적 장애이지만, 또한 산발적으로 발생할 수 있다(Kosugi 등 1995). 감염된 남성은 종종 4세에 의해 남성화 증후를 나타내서 결국은 짧게 성장한다. 이 질병에서 저혈청 생식선 자극 호르몬(gonadotropin)은 생식선 기능항진을 함축하며, 이는 황체 호르몬(LH) 수용체의 과다 활성을 제안한다. 수대의 친족의 감염된 구성원들의 유전적 분석 결과, 아스파르테이트 578의 글리신 또는 티로신으로의 천연 돌연변이가 구성적 활성 LH 수용체를 생성시키는 것으로 밝혀졌다. 흥미롭게도, 티로신 돌연변이는 1세에 의해 조발 청춘기 환자에서 확인되었고 글리신 돌연변이보다 큰 구성적 활성화을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 이는 조발 청춘기의 심각도가 구성적 LH 수용체 활성 정도와 직접 관련있다는 것을 제안한다.

얀센병: 얀센형 골간단 연골 이형성증(metaphyseal chondroplasia)은 비정상 골 형성에 의해 초래되며 부갑상선 비의존성 고칼슘혈증 및 저인산염혈증과 관련된 인간 난장이 유형이다. 활성화 돌연변이(아르기닌으로 돌연변이된 223에서의 히스티딘)은 감염된 검체에서 부갑상선 수용체의 구성적 활성화를 초래하는 것으로 밝혀졌다. 이 리간드 독립적 활성화는 질병에서 비정상 엔도콘드랄 골 형성을 유도하며 부갑상선 수용체가 성장-판 연골 세포의 정상 증식 및 분화에서 중요한 역할을 한다는 것을 제안한다(Parfitt 등 1996).

색소성 망막염: 인간 눈에서 4가지 가시적 안료, 즉 로돕신(간균 광수용체) 및 청색, 녹색 및 적색 원뿔형 옵신(opsin)은 모두 구조에서 관련있다. 모든 G 단백질 커플링된 수용체와 유사하게, 이들은 막내외 도메인 7에서 공유 결합된 레티날을 갖는 7개의 막내외 도메인을 갖는다. 색소성 망막염(RP)은 진행성 광수용체 분해 및 실명을 특징으로 한다. 리신 296(레티날 부착 부위)이 글루타메이트 또는 메티오닌으로 변화하는 미센스(missense) 돌연변이는 구성적 로돕신 활성화 때문인 것으로 고려되는 RP 형태를 갖는 개체에서 확인되었다. 레티날 결합의 손실은 로돕신의 막내외 나선에서의 억제를 경감시키고 광 독립적 활성화를 유도하는 것으로 고려된다(Spiegel 등 1995).

부갑상선 기능 감퇴증: 칼슘 감지(sensing)(CaS) 수용체는 주로 부갑상선 조직에서 발견되지만 신장, 뇌 및 수개의 기타 기관에서도 발견된다. 부갑상선 세포 중의 CaS 수용체의 활성화는 부갑상선 호르몬 분비를 억제하며, 세뇨관에서는 수용체 활성화가 칼슘 재흡수를 억제한다. 상기 수용체에서 구성적 활성화 돌연변이는 상염색체 우성 부갑상선 기능 감퇴증의 형태와 관련있다(Lavlie 등 1996). 이는 고칼슘혈증 및 비교적 낮은 부갑상선 호르몬 수준을 특징으로 한다. 돌연변이된 수용체 형태는 정상 수용체와 비교하여 세포외 칼슘에 대해 높은 민감성을 나타내며, 이는 정상 이하 세포외 칼슘 농도에서 부갑상선 호르몬 분비를 억제하도록 한다.

카포시 육종: 카포시 육종은 통상적으로 인간 면역 결핍 바이러스(HIV)(감염된 개체 및 덜 흔하게는 HIV에서) 비감염된 개체에서 발생하는 암이다. 이 질병이 감염 성분에 의해 초래되었다는 것이 오랫동안 의심되어 왔지만, 최근 수개월 내에는 그 성분이 인간 감마헤르페스바이러스로서 단리 및 확인되었다. 이 바이러스는 암성 세포 증식을 유도하여 카포시 육종 및 일부 림프종 내에서 고수준으로 발견되는 구성적 활성 G 단백질 수용체를 생성시키는 것으로 나타났다(Arvanitikis 등 1997). 상기 바이러스 관련된 G 단백질 커플링된 수용체의 구성적 활성화가 종양 발병과 직접 관련있는 것 같다.

신경 정신병(neuropsychiatric) : G 단백질 커플링된 수용체의 허용된 약물학적 특징은 임의 부위에서의 수용체의 과다 생성이 구성적 활성화를 유도할 수 있다는 것이다. 상기 효과의 기전은 완전히 이해되지 않지만 세포 막에서 "활성" 형태로 존재하는 수용체의 정상 비율보다 높은 비율과 관련있을 수 있다.

정신 분열증: 정신 분열증의 생물학적 기초가 공지되지 않았지만, 뇌 중의 도파민의 효과를 차단할 수 있는 효과적인 항정신병제의 능력은 도파민 시스템의 과다 활성이 함축된다는 것을 제안한다. 이와 관련하여, 1개의 도파민 수용체, 즉 D4는 정신 분열증 환자의 뇌 중의 정상 수준을 600%까지 상승시킬 수 있는 것을 밝혀졌다. 이는 D4 수용체가 질병에서 구성적 활성일 수 있었다는 것을 제안한다. 클로자핀(clozapine)과 같은 도파민 D4 수용체의 리간드 길항제는 임상적으로 효과적인 항정신제이다.

주요 우울: 세로토닌성 기능을 조절하여 울증을 임상적으로 경감시킬 수 있는 약물 능력은 질병의 병변에서 세로토닌 시스템을 함축하였다. 대부분의 울병 환자에서, 5-HT_2A수용체는 전두 피질, 즉 기분(mood) 조절에 수반되는 것으로 공지된 뇌의 영역에서 과다 생성되는 것으로 밝혀졌다. 수용체의 상기 과다 생성의 원인이 뇌의 상기 영역에서의 구성적 활성화에 있으며 질병의 병태 생리에 대해 기여할 수 있는 것처럼 보인다. 상기 수용체의 병태 생리적 연관성은 최근 항우울제에 반응하는 울증 환자가 약물 치료 후에 감소된 5-HT_2A수용체 수를 나타내는 임상 데이터에 의해 추가로 강조된다. 약물 치료에 반응하지 않았던 환자들은 5-HT_2A수용체 수가 변화하지 않았다.

티로신 키나제 수용체: 모두가 7개의 막내외 모티프를 공유하는 G 단백질 커플링된 수용체와는 상이하게, 티로신 키나제 수용체가 유사성이 거의 없는 광범위한 구조를 나타낸다. G 단백질 커플링된 수용체를 사용할 때, 리간드 결합 부위는 세포외 공간으로 연장되어 막내외 부분과 연결되어 세포내 공간으로 연장된다. 연장된 1개의 단백질 분자로 구성되기보다는, 티로신 키나제 수용체는 전형적으로, 수개의 독립적 서브유니트(subunit)로 구성되며, 이때 리간드 결합 서브유니트는 막내외 서브유니트로부터 분리된다. 수용체의 티로신 키나제 상과(superfamily)는 종류 I, II, III 및 IV로서 확인된 4가지 수용체 아군으로 구분된다. 아류의 특징적 구성적 특징으로는 단량체성 아류 I 수용체, 아류 II 수용체 중의 시스테인이 풍부한 서열이 유사한 디술파이드 연결된 이형사량체성(hetrotetrameric) α2β2 구조, 및 아류 III 및 IV 수용체 각각의 세포외 도메인 중의 5개 또는 3개의 면역 글로불린 유사한 반복물의 세포외 도메인 중에서 2개의 시스테인이 풍부한 반복 서열이 포함된다. 이들 수용체의 작용 양태는 또한, G 단백질 커플링된 수용체와는 상당히 상이하다. 활성화된 상태에서는 수용체 자체(또는 적어도 세포내 연장부)가 효소적으로 활성이다. 활성화된 수용체는 우선, 세포내 공간으로 연장하는 수용체 부위 상에 배치된 그 자체의 티로신 잔기의 자가 포스포릴레이트 일부일 수 있다. 이어서, 상기 자가 포스포릴화는 표적 세포내 단백질 중의 티로신 잔기를 포스포릴화시킬 수 있는 수용체/효소의 능력을 향상시킨다. G 단백질과 같은 특별 단백질 종류는 포스포릴화에 대해 표적으로서 작용하지 않는다. 이들 차이에도 불구하고, 티로신 키나제 수용체는 또한 불활성 및 활성 상태로 존재하는 것으로 발겨졌으며, 이는 리간드도 역시 활성 상태의 티로신 키나제 수용체를 안정화시키는 것처럼 보인다. 활성 상태에서만, 상기 수용체가 효소적으로 된다. 티로신 키나제 수용체의 구성적 활성 형태도 역시 확인되었다. G 단백질 커플링된 수용체와 유사한 다수의 질병이 이제, 티로신 키나제 수용체의 구성적 활성화로부터 결과된 것으로 나타났다.

2가지 이상의, 즉 하나는 불활성이며 나머지 하나는 활성이며 변환 경로와 커플링된 상태의 존재는 수용체에 대해 일반적인 기관화 원리인 것처럼 보인다. 변이 만이, 활성 상태가 변환 경로와 커플링되지 않은 이온 채널 수용체에 의해 나타나지만 관련 이온의 통과에 대한 개방 세공을 나타낸다. 티로신 키나제 수용체 및 이온 채널 수용체의 구성적 활성 형태와 관련된 질병은 하기 표 2에 기재한다:

질병	수용체	수용체 유형
크루종(Crouzon) 증상	섬유아세포 성장 인자 2	티로신 키나제
연골 발육 부전증	섬유아세포 성장 인자 3	티로신 키나제
거대 세포 종양	c-키트	티로신 키나제
암	Met 유전자(HGF)	티로신 키나제
암	에리트로포이에틴(EPO-R)	티로신 키나제
암	Erb-2	티로신 키나제
암	Erb-3	티로신 키나제
요정증/인슐린 탈감작	인슐린	티로신 키나제
종양 형성	c-Mpl 트롬보포에틴	티로신 키나제
종양 형성	표피 성장 인자	티로신 키나제
침입 특성	론(RON)	티로신 키나제
만성 골수성 백혈병(CML)	스태트(STAT) 5	신호 변환제
리들(Liddle) 병(염 민감성 고혈압)	상피성 나트륨 채널	이온 채널

섬유아세포 성장 인자 2: 섬유아세포 성장 인자 수용체(FGFR)는 리간드 활성화된 막 스패닝되는 티로신 키나제의 일족이다. 수개의 인간 FGFR 유전자 중의 돌연변이는 골 성장 및 발전의 특정 장애에서 역할하는 것으로서 확인되었다. 인간 FGFR에서 발견된 바와 같이 시스테인 332가 티로신 돌연변이하여 수용체의 리간드 비의존성 구성적 활성화를 결과하며 크루종 증후군(Neilson 등 1995)을 유도하는 것이 보고되었다. 크세노푸스 난모세포(Xenopus oocytes)에서 발현된 돌연변이 수용체 단백질의 분석 결과, 이것이 공유 단일이량체를 형성하고, FGF를 결합하지 않으며, 티로신 포스포릴화를 증가시키는 것으로 나타난다. 이들 결과는 돌연변이된 수용체(FGFR-2CS)가 분자내 디술파이드 결합을 형성하여 수용체 이량체화, 및 크루종 증후군의 etiology 에서 역할하는 리간드 독립적 활성화를 결과하는 것을 나타낸다.

섬유아세포 성장 인자 3: 연골 발육 부전증은 장골의 연골 성장판의 돌연변이에서 결함을 결과하는 자가 상염색체 우성 형질인 가장 흔한 난장이 형태이다. 이는 리간드 독립적 구성적 활성화를 결과하는 FGF-3 수용체의 막내외 도메인에서 글리신이 아르기닌 치환으로 되기 때문인 것으로 보였다(Webster & Donoghue, 1996). 상기 도메인의 서열은 하기와 같다:

G 내지 R 치환은 FGF-3 수용체의 막내외 도메인에서 외곽에 나타낸다.

c-키트 수용체: c-키트 원종양 유전자(proto-oncogene)는 혈소판 유도된 성장 인자(PDGF) 및 콜로니 자극 인자(CSF-1)와 동일한 다수의 수용체 티로신 키나제 족인 수용체를 코딩한다. c-키트에 대한 리간드는 계통적으로, 마우스 염색체 10 상의 강(S1) 위치로 지도로 그리며 간세포 인자(SCF), 비만 세포 성장 인자, 키트 리간드 또는 강 인자로서 다양하게 명명된다. 다양한 유형의 시험된(Kuriu 등, 1991; Ikeda 등, 1991; Furitsu 등, 1993) 백혈구 세포 중에서, 키트를 HMC-1 인간 비만 세포 계(line)에서 리간드 비의존성 방식으로 구성적 활성화시켰다(Furitsu 등, 1993). HMC-1 세포 중의 c-키트 유전자의 다발성 기형(sequencing) 분석 결과, 2가지 돌연변이, 즉 막근접(juxtamembrane) 도메인 중의 V560 내지 G 560, 및 포스포트랜스퍼라제 도메인 중의 D816 내지 V816 돌연변이 지점을 나타내었다. 또한, 고유의 돌연변이는 FMA3 세포에서의 구성적 활성화를 유도하는 c-키트 수용체에서 보고되었다(Tsujimura 등, 1996). 이 돌연변이는 코돈 573 내지 579에서 막근접 도메인에서 TQLPYDH를 코딩하는 21개의 염기쌍이 인 프레임(in-frame) 결실되었다.

메트 유전자(HGF): 인간 MET 원종양 유전자는 간세포 성장 인자/산란 인자에 대한 티로신 키나제 수용체를 코딩한다. MET는 원래, 세포 계를 화학적 발암 물질로 조작한 후 시험관내에서 활성화된 인간 종양원으로서 기술하였다(Cooper 등, 1994). 이어서, MET 원종양 유전자는 상피성 원의 유의한 수의 인간 종양에서 증폭 및(또는) 과다 발현된 것으로 밝혀졌다(Di Renzo 등, 1991 & 1992; Prat 등, 1991; Liu 등, 1992; Natali 등, 1993). 또한, 완전한 크기의 MET cDNA의 트랜스펙션이 오토크린 회로의 설정시 트랜스펙션을 유도할 수 있다는 것이 보고되었다(Rong 등, 1993). 상기 수용체의 구성적 활성화를 위한 구조 요건은 보고되어 있다(Zhen 등, 1994).

에리티로포이에틴 수용체(EPO-R): 에리티로포이에틴 수용체(EPO-R)는 다수의 사이토킨 수용체 상과이다. 구성적 활성 형태의 EPO-R은 외형질 도메인에서 단일 아미노산이 변화하여 아르기닌 129를 시스테인(R129C)으로 전환시키는 것으로 확인되었다. 상기 시스테인 치환이 디술파이드 연결된 이량체화를 향상시켜 리간드 독립적 활성화를 유도하는 것으로 고려된다(Watowich 등, 1992). 또한, EPO 이외에도, EPO-R이 역시 Friend 비장 촛점 형성하는 바이러스(SFFV)에 의해 활성화될 수 있는 것으로 나타났다. 따라서, EPO-R은 다수의 성장 인자 및 종양원에 대한 반응에서 활성화된다(Showers 등, 1992).

erb-2 유전자 생성물: erb-2/neu 유전자의 과다 발현은 종종, 인간 암에서 검출된다. NIH 3T3 세포에서 과다 발현될 때, 정상 erb-2 생성물, 즉 gp185erb-2는 외인적으로 첨가된 리간드의 부재 하에 잠재적 형질 변형능은 물론, 구성적 상승된 티로신 키나제 활성 수준도 나타낸다(Lonardo 등, 1990). erb-2 유전자는 상피성 성장 인자 수용체(EGFR)와 동질의 서열을 갖는다. erb-2 유전자 및 EGFR의 발현은 인간 암의 병인론에서 함축하였다. 이들의 증폭 또는 과다 발현은 포유류 및 난소 선암(adenocarcinomas)(Slamon 등, 1987, 1989)에서 및 인상(squamous) 세포 암종 및 신경교아종(glioblastomas)(Xu 등, 1984; Hendler & Ozanne, 1985; Libermann 등, 1985)에서 높은 빈도로 검출되었다.

erbB-3 유전자 생성물: 예상된 인간 erbB-3 유전자 생성물은 상피성 성장 인자(EGFR) 및 erb-2와 밀접하게 관련있으며, 이는 모델 시스템 및 인간 신형성(neoplasia)에서 종양원으로서 함축되었다. gp180erbB-3의 고유 접촉 기능은 시험관내에서 자가 포스포릴화할 수 있는 능력에 의해 나타내었다(Kraus 등, 1993). 4 내지 12개의 인간 포유류 종양 세포주에서의 gp180erbB-3의 검출과 조합된 이들 발견은 일부 인간 악성 종양(malignancies)의 병인에서 구성적 활성 erbB-3 생성물을 함축한다.

인슐린 수용체: 인슐린 수용체의 구조 및 기능은 요정증을 갖는 자매 2명에서 연구하였다. 모계 대립인자(maternal allele)는 엑손 3에서 3개의 염기쌍을 결실하여 α-서브단위에서 N281을 손실시켰다(Desbios-Mouthon 등, 1996). 상기 돌연변이된 수용체는 인슐린 결합이 손상되었으며 자가 포스포릴화 및 티로신 키나제 활성의 생체내 및 시험관내 구성적 활성화를 나타내었다. 상기 인슐린 수용체 예비 활성화된 상태의 결과로서, 세포는 글리코겐의 인슐린 자극 및 DNA 합성에 대해 탈감작되었다. 이들 발견은 인슐린 수용체 α-서브단위의 N281이 세포외 α-서브단위에 의해 발휘된 억제시 세포내 키나제 활성보다 결정적인 역할하는 것을 강력하게 제안한다.

c-Mpl 트롬보포에틴 수용체: c-Mpl, 즉 트롬보포에틴에 대한 수용체는 헤모포이에틴/사이토킨 수용체 상과에 속한다. c-Mpl 수용체의 이량체 계면에서 특이 아미노산에 대한 시스테인 잔기의 치환이 구성적 활성화를 유도한다는 것이 밝혀졌다(Alexander 등, 1995). 헤모포이에틴 수용체의 활성화에 대한 재발 기전은 수용체 서브단위 올리고머화에 의한 관능적 착물의 형성이다. 성장 호르몬 수용체 내에서, 세포외 아미노산의 클러스터(cluster)는 리간드 유도된 단일 이량체를 안정화시키는 이량체 계면 도메인을 형성한다.

이 도메인은 에리트로포이에틴(EPO) 수용체에서 관능적으로 보존되는 것처럼 보이는데, 그 이유는 유사 영역 중의 잔기에 대한 시스테인의 치환이 디술파이드 연결된 단일 이량체화를 통한 EPO 독립적 수용체 활성화를 초래하기 때문이다. c-Mpl 수용체에서의 치환은 다수의 동질 수용체에서 발견된 동일 이량체 계면 도메인에서 수행되었다. 이들 결과는 TPO 자극된 Mpl 활성화의 정상 방법이 수용체 단일 이량체화를 통해 발생한다는 것을 함축한다. 돌연변이 Mpl 수용체를 발현하는 세포는 형질 변형된 마우스에서 종양 형성성이었다. 따라서, v-mpl과 유사하게, 그의 바이러스성 대응물, 즉 mpl 유전자의 변형된 형태는 종양원성이다.

론(RON) 유전자 생성물: 론(Ron) 티로신 키나제는 이들의 상과(Met 및 Sea)의 성분들과 세포 해리, 운동성, 및 세포외 매트릭스의 침입(산란)을 공유한다. 메트는 간세포 성장 인자 수용체이며 론과 유사성을 공유한다. 론은 마크로파지 자극형 단백질(MSP)에 대한 인간 수용체이다. 인간 위암 세포주(KATO-III)에서, 165 kDa의 비분할된 단일쇄 단백질(δ-론)의 비정상 축적이 발견되었다. 이 분자는 완전한 길이의 론 mRNA와는 상이한 전사에 의해 베타("β") 쇄 세포외 도메인 중의 49개의 아미노산의 인프레임 결실에 의해 코딩된다(Collesi 등, 1996). 돌연변이된 수용체는 디술파이드 연결된 세포내 올리고머화에 의해 구성적 활성화되는데, 그 이유는 그것이 홀수의 시스테인 잔기를 함유하기 때문이다. 완전한 크기의 론의 올리고머화 및 구성적 티로신 포스포릴화는 천연적으로 돌연변이된 이소 형태로 생성되는 것을 모방하는, 카세트 엑손에 의해 코딩된 영역에서 단일 시스테인 잔기의 부위 배향된 돌연변이 생성에 의해 수득되었다. 이어서, 론의 세포내 활성화는 시험관내 침입 특성의 획득되며, 이는 악성 종양을 향한 진행에서의 구성적 활성 론 수용체에 대한 역할을 제안한다.

스태트(STAT) 5: 스태트-5는 신호 변환제 및 전사의 활성화제이다. 정상 골수성 세포에서 GM-CSF(과립구-대식세포 콜로니 자극형 인자)와 같은 사이토킨에 의해 일시적으로 활성화된 스태트-5 단백질은 만성 골수성 백혈구를 갖는 환자로부터 유도된 세포주에서 구성적 활성화되었다(Weber-Nordt 등, 1996). 스태트-5는 또한, CML-특이 BCR-ABL 종양원에 의해 정확하게 형질 변형된 제1 마우스 골수 세포에서 활성화되었지만, 세린 키나제 종양원 v-MOS에 의해서는 활성화되지 않았다. 상기 발견은 BCR-ABL에 의한 헤마토포이에틱 성 형질 변형에서의 스태트-5에 대한 역할을 제안한다(Gouilleux-Gruart 등, 1996).

상피성 나트륨 채널: 상피성 나트륨 채널의 돌연변이는 염 민감성 고혈압, 즉 리들병의 유전성 형태를 초래한다(Schild 등, 1995; Hansson 등, 1996). 이 돌연변이는 채널 β 서브유니트에서 조숙 중지 코돈을 도입시켜, 코딩된 단백질의 거의 모든 C 말단이 결실된다. 제로푸스 무모 난모세포(Xenopus laevis oocyte) 중의 야생형 α 및 γ 서브유니트에 의한 돌연변이 β-서브유니트의 동시 발현은 야생형 채널과 비교하여, 육안적 아밀로라이드(amiloride) 민감성 나트륨 흐름이 약 3배 증가시켰다.

바이러스성 종양원:

c-키트 수용체: 다수의 기타 수용체 티로신 키나제와 유사하게, c-키트 원종양 유전자를 우선, HZT 고양이 육종 바이러스의 게놈 중에 존재하는 레트로바이러스성 종양원(v-키트)로서 확인하였으며, 이는 키트가 특히, 구조 변경에 의해 종양원성 단백질로서 주요 기능할 수 있다는 것을 제안한다(Besmer 등, 1986).

C-Mpl 트롬보포에틴 수용체: 상기 문단에는 c-Mpl TPO 수용체에 대한 바이러스 대응물이 존재한다는 것을 기술하고 있다.

<정의>

수용체 근처에서 수반된 과학 문헌은 수용체에 대한 효과가 다양한 리간드를 언급하기 위해 다수의 용어를 채택하였다. 명확하고 일관되게 하기 위해, 하기 정의를 본 특허 서류를 통해 사용할 것이다. 이들 정의가 이들 용어에 대한 기타 정의와 상충하는 정도까지, 하기 정의는 조절될 것이다:

아고니스트란 이들이 수용체와 결합할 때 세포내 반응을 활성화시키거나, 또는 막과 결합하는 GTP를 향상시키는 리간드를 의미할 것이다.

본원에서 사용된 아미노산 약어는 부록 "D"에 기재한다.

부분 아고니스트란 아고니스트보다 작은 정도까지 수용체와 결합할 때 세포내 반응을 활성화시키거나, 또는 막과의 GTP 결합을 아고니스트보다 작은 정도까지 향상시키는 리간드를 의미할 것이다.

길항제란 아고니스트와 동일한 부위에서 수용체와 경쟁적으로 결합하지만 수용체의 활성 형태에 의해 개시된 세포내 반응을 활성화시키지 않음으로써, 아고니스트 또는 부분 아고니스트에 의한 세포내 반응을 억제할 수 있는 리간드를 의미할 것이다. 길항제는 아고니스트 또는 부분 아고니스트의 부재 하에 기준선 세포내 반응을 감소시키지 않는다.

후보 화합물이란 스크리닝 기술을 위해 보정가능한 분자(예를 들면, 화학적 화합물이지만, 한정되지 않음)를 의미할 것이다. 바람직하게는, 발현 "후보 화합물"은 직접적 확인 공정에 의해 이미 결정된 바와 같은 ("직접적으로 확인된 화합물") 역 아고니스트, 아고니스트 또는 수용체에 대한 길항제로 이루어지는 군으로부터 선택된 화합물인 것으로 대중에 공지된 화합물을 포함하지 않으며; 보다 바람직하게는, 1종 이상의 포유류에서 치료 효능을 갖는 것으로 이미 결정된 직접적으로 확인된 화합물을 포함하지 않으며; 가장 바람직하게는, 인간에서 치료 용도를 갖는 것으로 이미 결정된 직접적으로 확인된 화합물을 포함하지 않는다.

화합물 효능이란 수용체 결합 친화성에 반대하여, 수용체 관능성을 억제 또는 자극할 수 있는 화합물의 능력의 측정을 의미할 것이다. 화합물 효능을 검출하기에 가장 바람직한 의미는 본 특허 서류의 실시예 부분에서 추가로 기재한 바와 같이, [³⁵S]GTP_γS 결합의 측정을 통하는 것이다.

구성적으로 활성화된 수용체란 구성적 수용체 활성화된 수용체 검체를 의미할 것이다. 구성적으로 활성화된 수용체는 내생 또는 비-내생일 수 있다.

구성적 수용체 활성화란 내생 리간드 또는 그의 화학적 등가물에 의한 수용체의 결합이 아닌 수단에 의한 활성 상태의 수용체의 안정화를 의미할 것이다.

접촉 또는 접촉화란 시험관내 시스템 또는 생체내 시스템에서 2개 이상의 부분을 함께 이동시시키는 것을 의미할 것이다.

발현 "후보 화합물"과 관련하여, 직접적인 확인화 또는 직접 확인된이란 구성적으로 활성화된 수용체, 구성적으로 활성화된 희귀 수용체, 가장 바람직하게는 구성적으로 활성화된 G 단백질 커플링된 세포 표면 희귀 수용체에 대한 후보 화합물의 스크리닝, 및 상기 화합물의 화합물 효능의 평가를 의미할 것이다. 이 발현은 어떠한 환경 하에서도, 발현 "직접적 확인화" 또는 "직접적으로 확인된"에 의해 포함될 것으로 또는 그를 포함하는 것으로 이해되지 않을 것이다.

내생이란 포유류 천연적으로 생성되는 물질을 의미할 것이다.

용어 "수용체"를 참조하여, 예시일 뿐 한정하지 않는 내생이란 포유류(예를 들면, 인간이며 한정되지 않음) 또는 바이러스에 의해 천연적으로 생성되는 것을 의미할 것이다. 대조적으로, 상기 문잔에서 용어 비-내생이란 포유류(예를 들면, 인간이며 한정되지 않음) 또는 바이러스에 의해 천연적으로 생성되지 않는 것을 의미할 것이다. 예를 들면, 그의 내생 형태로 구성적 활성이지 않지만, 조작될 때 구성적 활성이 되는 수용체가 가장 바람직하게는 본 발명에서 "비-내생, 구성적으로 활성화된 수용체"로서 언급되지만 한정되지는 않는다. 용어 둘다 "생체내" 및 "시험관내" 시스템 둘다를 설명하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 스크리닝 접근법에서 내생 또는 비-내생 수용체가 시험관내 스크리닝 시스템을 참조하여 존재할 수 있지만 한정되지는 않는다. 추가이지만 비한정적인 예로서, 포유류의 게놈이 매니풀레이티드되어 비-내생 구성적으로 활성화된 수용체를 포함하는 경우, 생체내 시스템에 의해 후보 화합물의 스크리닝할 수 있다.

간접적 확인화 또는 간접적으로 확인된이란 내생 수용체에 대해 특이한 내생 리간드의 확인, 리간드-수용체 상호 작용에 의한 간섭 및(또는) 그에 의해 완성되는 화합물들의 결정을 위한 수용체에 대한 후보 화합물의 스크리닝, 및 활성된 수용체와 관련된 제2 메신저 경로 둘 이상에 영향주기 위한 화합물의 효능의 평가를 포함하는 약물 발견 공정에 대한 전통적 접근법을 의미한다.

용어 "반응"과 관련하여 억제 또는 억제하기란 화합물의 부재 하에 대치한 바와 같은 화합물의 존재 하에 감소 또는 방지되는 것을 의미할 것이다.

역 아고니스트란 수용체의 내생 형태 또는 수용체의 구성적으로 활성화된 형태와 결합하며, 아고니스트 또는 부분 아고니스트의 부재 하에 관찰되는 활성의 정상 기준 수준 이하의 수용체의 활성 형태에 의해 개시된 기준선 세포내 반응을 억제하거나, 막에 대한 GTP 결합을 감소시키는 리간드를 의미할 것이다. 바람직하게는, 기준선 세포내 반응이 역 아고니스트의 존재 하에, 역 아고니스트의 부재 하의 기준선 반응과 비교하여, 30% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 가장 바람직하게는 75% 이상까지 억제된다.

리간드란 내생 천연 수용체에 대해 특이한 내생, 천연 분자를 의미할 것이다.

희귀 수용체란 특이한 내생 리간드가 확인되지 않았거나 공지되지 않은 내생 수용체를 의미할 것이다.

제약 조성물이란 하나 이상의 활성 성분을 포함함으로써, 조성물이 포유류(예를 들면, 인간이지만 한정되지 않음)에서 구체화된 효과적인 결과에 대한 조사를 위해 보정가능한 조성물을 의미할 것이다. 당업계의 통상적인 기술자들은 활성 성분이 기술자의 수요에 근거한 목적하는 효과적인 결과를 갖는지 여부를 결정하기에 적절한 기술이 이해할 것이다.

비 희귀 수용체란 수용체에 대한 리간드의 결합이 세포내 신호화 경로를 활성화시키는 내생 천연 리간드에 대해 특이한 내생 천연 분자를 의미할 것이다.

용어 "반응"과 관련하여 자극 또는 자극화란 화합물의 부재 하에 반하여 반응이 화합물의 존재 하에 증가되는 것을 의미할 것이다.

<참조>

Alla, S. A. 등(1996). Extracellular domains of the bradykinin B2 receptor involved in ligand binding and agonist sensing defined by anti-peptide antibodies. J. Biol. Chem., 271, 1748-1755.

Alexander, W.S. 등(1995). Point mutations within the dimer interface homology domain of c-Mpl induce constitutive receptor activity and tumorigenicity. EMBO J., 14, 5569-78.

Arvanitikis, L. 등(1997). Human herpesvirus KSHV encodes a constitutively active G-protein-coupled receptor linked to cell proliferation. Nature, 385, 347-349.

Barker, E.L. 등(1994). Constitutively active 5-hydroxytryptamine 2C receptors reveal novel inverse agonist activity of receptor ligands. J. Biol. Chem., 269:16, 11687-11690.

Besmer, P. 등(1986). A new acute transforming feline retrovirus and relationship of its oncogene v-kit with the protein kinase gene family. Nature, 320, 415.

Blin, N. 등(1995). Mapping of single amino acid residues required for selective activation of Gq/11 by the m3 muscarinic acetylcholine receptor, J. Biol. Chem., 270, 17741-17748.

Burstein, E.S. 등(1995). Constitutive activation of muscarinic receptors by the G-protein Gq. FEBS Lett., 363:3, 261-3.

Casey, C. 등(1996). Constitutively active mutant 5-HT_2Aserotonin receptors: inverse agonist activity of classical 5HT_2Aantagonists. Soc.Neurosci. Abstracts # 699.10.

Chen, W. 등(1995). A colorimetric assay for measuring activation of G_s- and G_q- coupled signalling pathways. Anal. Biochem., 226:2, 349-354.

Chidiac, P. 등(1994). Inverse agonist activity of beta-adrenergic antagonists. J. Pharm. Expt. Ther., 45, 490-499.

Cheatham, B. 등(1993). Substitution of the erb-2 oncoprotein transmembrane domain activates the insulin receptor and modulates the action of insulin-receptor substrate. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 90, 7336-73340.

Collesi, C. 등(1996). A splicing variant of the RON transcript induces constitutive tyrosine kinase activity and an invasive phenotype. Mol. & Cellular Biol., 16, 5518-5526.

Cooper, C.S. 등(1984). Molecular cloning of a new transforming gene from a chemically transformed human cell line. Nature, 311, 29-33.

Desbios-mouthon, C. 등(1996). Deletion of Asn281 in the α-subunit of the human insulin receptor causes constitutive activation of the receptor and insulin desensitization. J. Clin. endocrinol. Metab., 81, 719-727.

Di Renzo, M.F. 등(1991). Expression of the Met/HGF receptor in normal and neoplastic human. Oncogene, 6:11, 1997-2003.

Di Renzo, M.F. 등(1992). Overexpression of the c-Met/HGF receptor gene in human thyroid carcinomas. Oncogene, 7, 2549-2553.

Duprez, L. 등(1994). Germline mutations in the thyrotropin receptor gene cause non-autoimmune autosomal dominant hyperthyroidism. Nature Genetics, 7, 396-401.

Eggerick, D. 등(1995). Molecular cloning of an orphan G-protein-coupled receptor that constitutively activates adenylate cyclase. Biochem. J., 389, 837-843.

Furitsu, T. 등(1993). Identification of mutations in the coding sequence of the proto-oncogene c-kit in a human mast cell leukemia cell line causing ligand-independent activation of c-kit product. J. Clin. Invest., 92, 1736.

Gouilleux-Gruart, V., (1996). STAT-related transcription factors are constitutively activated in peripheral blood cells from acute leukemia patients. Blood, 87:5, 1692-7.

Hansson, J.H. 등(1995). Hypertension caused by a truncated epithelial sodium channel gamma subunit: genetic heterogeneity of Liddle syndrome. Nat. Genet., 11:1, 76-82.

Hasegawa, H. 등(1996). Two isoforms of the prostaglandin E receptor EP3 subtype different in agonist-independent constitutive activity. J. Biol. Chem., 271:4, 1857-1860.

Hendler, A.M. & Ozanne, B.W.(1984). Human squamous cell lung cancers express increased epidermal growth factor receptors. J. Clin. Invest., 74, 647-651.

Herrick-Davis, K. 등(1996). Constitutively active 5HT_2Cserotonin receptor created by site directed mutagenesis. Soc. Neuroscience abstract #699.18.

Hogger, P. 등(1995). Activating and inactivating mutations in the N- and C-terminal I3 loop junctions of muscarinic acetylcholine Hml receptors. J. Biol. Chem., 270, 7405-7410.

Ikeda, H. 등(1991). Expression and functional role of the proto-oncogen c-kit in acute myeloblastic leukemia cells. Blood, 78, 2962.

Kjelsberg, M.A. 등(1992). Constitutive activation of the alpha 1B-adrenergic receptor by all amino acid substitutions at a single site. J. Biol. Chem., 267, 1430-1433.

Kosugi, S. 등(1995). Characterization of heterogenous mutations causing constitutive activation of the luteinizing hormone receptor in familial male precocious puberty. Human Molecular Genetics, 4:2, 183-188.

Kraus, M.H. 등(1993). Demonstration of ligand-independent signalling by the erbB-3 tyrosine kinase and its constitutive activation in human breast tumor cells. Proc., Natl. Acad. Sci. (USA), 90, 2900-4.

Kuriu, A. 등(1991). Proliferation of human myeloid leukemia cell line associated with the tyrosine phosphorylation and activation of the proto-oncogene c-kit product. Blood, 78, 2834.

Latronico, A.C. 등(1995). A novel mutation of the luteinizing hormone receptor gene causing male gonadotropin-independent precocious puberty. J. Clin. Endocrinol. Metab., 80, 2490-2494.

Laue, L. 등(1995). Genetic heterogeneity of constitutively activating mutations of the human luteinizing hormone receptor in familial male-limited precocious puberty. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 92, 1906-1910.

Lavlie, R. 등(1996). The Ca(2+)-sensing receptor gene(PCAR1) mutation T151M in isolated autosomal dominant hypoparathyroidism. Hum. Genet., 98:2, 129-33.

Lefkowitz, R. 등(1993). Constitutive activity of receptors coupled to guanine nucleotide regulatory proteins. Trends Pharmacol. Sci., 14, 300-307.

Libermann, T.A. 등(1985). Amplification, enhanced expression and possible rearrangement of EGF receptor gene in primary human brain tumors of glial origin. Nature, 313, 144-147.

Liu, C. 등(1992). Overexpression of c-met proto-oncogene but not epidermal growth factor receptor or c-erbB-2 in primary human colorectal carcinomas. Oncogene, 7:1, 181-185.

Liu, J. 등(1996). Molecular mechanisms involved in muscarinic acetylcholine receptor-mediated G protein activation studied by insertion mutagenesis. The J. Biol. Chem., 271:11, 6172-6178.

Lonardo, F. 등(1990). The normal erb-2 product is an atypical receptor-like tyrosine kinase with constitutive activity in the absence of ligand. The new Biologist, 2:11, 992-1003.

Maenhault, C. 등(1990). RCD8 codes for an adenosine A2 receptor with physiological constitutive activity. Biochem. Biophys. Res. Com., 173:3, 1169-1178.

Myles, G.M. 등(1994). Tyrosine 569 in the c-fms juxtamembrane domain is essential for kinase activity and macrophage colony-stimulating factor-dependent internalization. Mol. Cell. Biol., 14, 4843.

Natali, P.G. 등(1993). Expression of the c-Met/HGF receptor in human melanocytic neoplasms: demonstration of the relationship to malignant melanoma tumor progression. Br. J. Cancer, 68:4, 746-750.

Neilson, K.M. 등(1995). Constitutive activation of fibroblast growth factor receptor-2 by a point mutation associated with Crouzon syndrome. J. Biol. Chem., 270:44, 26037-26040.

O'Dowd, B.F. 등(1988). Site-directed mutagenesis of the cytoplasmic domains of the human BETA₂-adrenergic receptor. J. Biol. Chem., 263, 15985-15992.

Parent, J. 등(1996). Mutations of two adjacent amino acids generate inactive and constitutively active forms of the human platelet-activating factor receptor. J. Biol. Chem., 271:14, 7949-7955.

Parfitt, A.M. 등(1996). Hypercalcemia due to constitutive activity of the parathyroid hormone(PTH)/PTH-related peptide receptor: comparison with primary hyperparathyroidism. J. Clin. Endocr. Metab., 81, 3584-3588.

Parma, J. 등(1993), Somatic mutations in the thyrotropin receptor gene cause hyperfunctioning thyroid adenomas. Nature, 365, 649-651.

Pei, G. 등(1994). A constitutive active mutant BETA₂-adrenergic receptor is constitutively desensitized and phosphorylated. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 91, 2699-2702.

Prat, M.P. 등(1991). The receptor encoded by the human C-MET oncogene is expressed in hepatocytes, epithelial cells and solid tumors. Int. J. Cancer, 49, 323-328.

Prezeau, L. 등(1996). Changes in the carboxy-terminal domain of metabotropic glutamate receptor 1 by alternate splicing generate receptors with differing agonist-independent activity. Mol. Pharmacol., 49, 422-429.

Ren, Q. 등(1993). Constitutive active mutants of the ALPHA₂-adrenergic receptor. J. Biol. Chem., 268, 16483-16487.

Rong, S. 등(1993). Met expression and sarcoma tumorigenicity. Cancer Res., 53:22, 5355-60.

Scheer, A. 등(1997). The activation process of the α1B-adrenergic receptor: potential role of protonation and hydrophobicity of a highly conserved aspartate. Proc. Natl. Acad. Sci.(USA)., 94, 808-813.

Schwinin, D.A. 등(1995). Cloning and pharmacological characterization of human Alpha-1 adrenergic receptors: sequence corrections and direct comparision with other species homologues. The J. Pharmacol., 272, 134-142.

Schild, L. 등(1995). A mutation in the epithelial sodium channel causing Liddle disease increases channel activity in the Xenopus laevis oocyte expression system. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 92, 5699-703.

Sharif, M. 등(1994). Malignant transformation by G protein-coupled hormone receptors. Molecular & Cellular Endocrinology, 100, 115-119.

Showers, M.O. 등(1992). Activation of the erythropoietin receptor by the Friend spleen focus-forming virus gp55 glycoprotein induces constitutive protein tyrosine phosphorylation. Blood, 80, 3070-8.

Skinner, R.H. 등(1994). Direct measurement of the binding of Ras to neurofibromin using scintillation proximity assay. Anal. Biochem., 223, 259-265.

Slamon, D.J. 등(1987). Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2 neu oncogene. Science, 235, 177-182.

Slamon, D.J. 등(1989). Studies of the HER-2/neu proto-oncogene in human breast and ovarian cancer. Science, 244, 707-712.

Solomon, Y. 등(1974). A highly sensitive adenylate cyclase assay. Anal. Biochem., 58, 541-548.

Spiegel, A.M. 등(1995). Defects in G protein-coupled signal transduction in human disease, Ann. Rev. Physiol, 58, 143-170.

Ter Lack, A. 등(1995). Modelling and mutation studies on the histamine H1-receptor agonist binding site reveal different binding modes for H1-agonists: Asp116(TM3) has a constitutive role in receptor stimulation. J. Computer-aided molecular design, 9, 319-330.

Tsujimura, T. 등(1996). Constitutive activation of c-kit in FMA3 murine mastocytoma cells caused by a deletion of seven amino acids at the juxtamembrane domain. Blood, 87, 273-283.

Watowich, S.S. 등(1992). Homodimerization and constitutive activation of the erythropoietin receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 89, 2140-4.

Weber-Nordt, R.M. 등(1996). Constitutive activation of STAT proteins in primary lymphoid and myeloid leukemia cells and in Epstein-Barr virus(EBV)-related lymphoma cell lines. Blood, 88:3, 809-16.

Webster, K. & Donoghue, J. (1996). Constitutive activation of fibroblast growth factor receptor 3 by the transmembrane point mutation found in achondroplasia. The EMBO J., 15, 520-527.

Xu, Y.H. 등(1984). Characterization of epidermal growth factor receptor gene expression in malignant and normal human cell lines. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)., 81, 7308-7312.

Yamada, K. 등(1992). Substitution of the insulin receptor transmembrane domain with the c-neu/erb2 transmembrane domain constitutively activates the insulin receptor tyrosine kinase in vitro. J. Biol. Chem., 267, 12452-12461.

Zhen, Z. 등(1994). Structural and functional domains critical for constitutive activation of the HGF-receptor (Met). Oncogene, 9, 1691-1697.

<발명의 간단한 개요>

본원에는 후보 화합물을 구성적으로 활성화된 희귀 수용체, 보다 바람직하게는 구성적으로 활성화된 G 단백질 커플링된 세포 표면 희귀 수용체에 대한 역 아고니스트, 부분 아고니스트 또는 아고니스트(가장 바람직하게는 역 아고니스트)로서 직접적으로 확인하는 방법이 기재되어 있다. 이들 수용체는 내생 또는 비-내생일 수 있다. 기재된 방법은 상기 수용체에 대해 특이한 내생 리간드의 선행 지식없이도 수용체에 대한 역 아고니스트, 부분 아고니스트 또는 아고니스트(가장 바람직하게는 역 아고니스트)로서 후보 화합물의 직접적 확인에 이용하는 것이다. 기재된 방법은 또한, 직접적으로 확인된 상기 후보 화합물을 포함하는 제약 조성물의 발전을 위해 이용한다.

본원에 기재된 본 발명의 추가 이해는 하기 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.

본 발명은 다세포(multicellular) 유기체에서의 세포내 교통 및 세포 기능의 조절에 관한 것이며, 보다 구체적으로는 유전 돌연변이, 번역후 개질 또는 일부 기타 방법의 결과로서 구성적으로 활성화되는 막 수용체의 조절에 관한 것이다.

도 1은 막내외 나선, 세포내 루프 및 세포외 루프에 부여된 번호를 갖는 G 단백질 커플링된 수용체의 일반적 구조를 도시한다.

도 2는 전형적 G 단백질 커플링된 수용체 및 제2 메신저 변환 경로에의 활성 상태의 연결을 위한 2가지 상태, 즉 활성 및 불활성을 개략적으로 도시한다.

도 3은 1) 임의의 관련된 질병; 2) 구성적 활성화의 성질(서열 개질, 항체, 과다 발현); 3) 활성화 개질의 위치; 4) 활성화 개질의 성질; 및 5) 참조 인용 문헌에 따른 공지의 구성적으로 활성화된 수용체 일부를 도시한다.

도 4는 천연 및 구성적 활성 세로토닌 5-HT_2C수용체에 대한³H-LSD 결합과 경쟁할 수 있는 향상된 능력에 의해 증가된, 세로토닌에 대한 구성적 활성 인간 5-HT_2C수용체의 친화성을 도시한다.

도 5는 (비-내생) 인간 5-HT_2C(S310K) 돌연변이 수용체가 내생 5-HT_2C수용체에 대해 COS 세포 중의 이노시톨 트리스 포스페이트의 향상된 세포내 축적을 도시하며 대조군 단독에 의해 트랜스펙션된 세포를 도시한다. 내생 수용체도 역시 높은 천연 구성적 활성 정도를 도시한다.

도 6은 75 ㎍/웰 막 단백질의 대조군 벡터 단독에 의해 감염된 것과 비교하여, 내생 및 비-내생(S310K) 5-HT_2C수용체에 의해 감염된 293T 세포로부터 제조된 막에 대한 [³⁵S]GTP_γS의 향상된 결합을 도시한다. [³⁵S]GTP_γS의 방사성 라벨링된 농도를 1.2 nM으로 일정하게 유지시켰고 GDP 농도는 1 μM로 일정하게 유지시켰다. 분석은 Wallac 신티스트립(scintistrip)에서 96개 웰 포맷에서 수행하였다.

도 7은 세로토닌에 대한 반응에서 내생 5-HT_2C수용체를 발현하는 COS 세포로부터 제조된 막에 대해 향상된 [³⁵S]GTP_γS 결합 및 맥아 응집소 섬광 근위 비드를 사용하는 미안세린(mianserin)에 의한 억제를 도시한다. [³⁵S]GTP_γS의 농도는 0.3 nM으로 일정하게 유지시켰고, GDP의 농도는 1 μM으로 유지시켰다. 막 단백질의 농도는 12.5 ㎍이었다.

도 8은 293T 세포 중의 비-내생(S310K) 구성적 활성 5-HT_2C수용체를 발현하는 막에 대한 [³⁵S]GTP_γS 결합의 세로토닌 자극 및 Wallac 신티스트립 상의 30 μM 미안세린에 의한 억제를 도시한다.

도 9는 10 μM 세로토닌의 부재(A) 및 존재(B) 항에 대조군 벡터 단독에 의해 감염된 세포와 비교하여, 내생 및 비-내생(S310K) 5-HT_2C수용체에 의해 감염된 293T 세포로부터 제조된 막에서의 [³⁵S]GTP_γS 결합에 대한 단백질 농도의 효과를 도시한다. [³⁵S]GTP_γS의 방사성 라벨링된 농도는 0.3 nM으로 일정하게 유지시켰고 GDP 농도는 1 μM으로 일정하게 유지시켰다. 분석은 Wallac 신티스트립에서 96-웰 포맷 상에서 수행하였다.

도 10은 75 ㎍/웰 막 단백질의 대조군 벡터 단독에 의해 감염된 것과 비교하여, 희귀 수용체 GPR3에 의해 감염된 293T 세포로부터 제조된 막에 대한 [³⁵S]GTP_γS의 향상된 결합을 도시한다.

도 11은 내생 5-HT_2C수용체, 비-내생 구성적 활성 5-HT_2C수용체, 희귀 수용체 GPR3, 및 37.5(A) 및 75(B) ㎍/웰의 막 단백질의 대조군 벡터 단독에 의해 감염된 293T 세포로부터 제조된 막에서의 결합에 대한 [³⁵S]GTP_γS 농도의 효과를 도시한다. GPD 농도는 1 μM으로 일정하게 유지시켰다. 분석은 Wallac 신티스트립에서 96-웰 포맷 상에서 수행하였다.

도 12는 희귀 수용체 GPR3, GPR6 및 GPR12의 아미노산 배열을 도시한다.

도 13은 희귀 수용체 GPR3, GPR6 및 GPR12가, Konig의 절차(참조: 실시예 3)를 따른 VIP 세포 중의 CRE 유도된 리포터 시스템으로부터 β-갈락토시다제의 발현을 유도할 수 있는 향상된 능력에 의해 구성적 활성인 것으로 확인되는 것을 도시한다.

도 14는 GPR3(A), GPR6(B) 및 GPR12(C) 희귀 수용체의 발현의 상대적 분포가 RT-PCR로 측정할 때 수개의 정상 인간 조직을 횡단하는 것을 도시한다. 약어: Ocx = 후두; Hypoth = 시상하부; Tex = 측두 피질; Fcx = 전두 피질.

도 15는 RT-PCR에 의해 실험할 때 정상 및 간질성 인간 뇌 조직에서의 GPR3 수용체 발현을 도시한다. 대조군 시료는 좌측 상에 있으며 간질성 시료는 우측 상에 있다.

도 16은 후보 화합물을 희귀 G 단백질 커플링된 수용체, 즉 GPR3에서 스크리닝한 후의 판 프로필을 도시한다. 웰 P44 및 P45에서 화합물은 역 아고니스트이다.

도 17은 후보 화합물을 희귀 G 단백질 커플링된 수용체, 즉 GPR6에서 스크리닝한 후의 판 프로필을 도시한다. 웰 P3, P13, P15, P18, P20, P32, P33, P36, P55, P66, P67, P69 및 P70 중의 화합물은 역 아고니스트이다.

<바람직한 양태의 설명>

현대 분자 생물학에서, 개체가 물체를 관찰하는 전통적으로 허용된 방식의 외부로 밟아와 신규한 시각으로부터 다시 취한 상황을 실험할 때 종종 중요하게 진보하였다. 전형적으로, 그러한 환경이 발생할 때, 통찰을 추론하는 모든 정보가 존재하였지만, 특별한 사람에 의해 비적절하게 기대되어 왔다. 상기 현상의 2가지 우세한 예는 RNA로부터 DNA로의 역 정보 흐름의 발견 및 PCR로서 공지된 DNA 증폭의 기술이다. DNA로부터 RNA로의 유전 정보의 전달의 원초적 발견에서 어느 것도 RNA로부터 DNA로의 유전 정보의 전달을 금지하지 않았다. 그러나, DNA로부터 RNA 패턴이 정착된 모델으로 되는 DNA로부터의 정보 흐름을 따른 결과는 상당히 세련되고 성공적이었으며, 누군가가 전통적 모델 외부를 밟아, 바이러스를 이동시키는 RNA가 동화 유전 정보를 감염 세포의 DNA로 이동시킬 수 있었다는 것을 인지할 때까지는 그렇지 않았다. 본 특허 서류에 기재된 본 발명은 바로 그러한 독특한 시각적 이동으로부터 발생한다.

상기에 언급한 유일한 예외의 경우, 수용체에 관한 전통적 연구는 항상, 내생 리간드가 우선 확인된 후 길항제, 및 수용체에 영향을 줄 수 있는 기타 분자를 발견하기 위한 발견을 진행할 수 있어야 한다는 (역사적 근거의) 선행 추정으로부터 진행되어 왔다. 길항제가 우선 공지될 수 있었던 경우에서조차 천연 아고니스트에 대한 조사는 즉시 연장되었다. 이러한 사고 양태는 구성적으로 활성화된 수용체를 발견한 후에야 수용체 조사에서 주장되었다. 이전까지는 수용체의 아고니스트, 부분 아고니스트 및 역 아고니스트를 발견하기에 가장 유용한 수용체의 활성 상태가 인지되지 않았다. 과도하게 활성인 수용체로부터 결과되며 상기에 개요된 모든 것을 포함하는 질병의 경우, 치료제에서 목적으로 하는 것은 수용체의 활성 상태를 감소시키도록 작용하는 화합물이지만 정상 리간드에 대한 길항제인 약물이 필연적인 것은 아니다. 그 이유는 활성 수용체 상태의 활성을 감소시키는 화합물(약물)이 내생 리간드와 동일한 부위에서 결합할 필요가 없기 때문이다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해 교시된 바와 같이, 치료 화합물에 대한 어떠한 조사도 화합물을 리간드 독립적 활성 상태에 대해 스크리닝함으로써 개시해야 한다. 이어서, 활성 상태 수용체에 대한 역 아고니스트에 대해 조사한다. 따라서, 구성적 활성 수용체는 가장 바람직하다. 본 발명의 접근법에서 추가의 특징은 내생 수용체에 대한 역 아고니스트가 직접 확인될 수 있다는 것이다.

내생 또는 비-내생 구성적으로 활성화된 수용체에 대한 후보 화합물을 스크리닝함으로써 희귀 또는 공지의 세포 표면 수용체에서 어떠한 선행 지식 또는 수용체 리간드의 사용을 필요로 하지 않으면서 작용하는 후보 화합물의 직접적 확인을 허용한다. 본 발명의 방법의 상기 특징은 인간 게놈 프로젝트에 의해 확인되는 희귀 수용체에는 특히 지극히 중요하다. 그 자체로, 상기 방법은 약물 발견을 광범위한 희귀 수용체에서 촉진시키기 위해 유용하다. 2%의 인간 게놈이 G 단백질 커플링된 수용체(약 2,000 개별 단백질)를 코딩하는 것으로 추정되었으며, 이의 상당히 큰 부분은 희귀 수용체이다. 본 발명의 방법은 상기 큰 족의 수용체에서 뿐만 아니라, 본원에 기재된 기타 유형의 수용체에서도 작용하는 신규의 약물을 확인하기 위한, 이전에 기재되지 않은 수단을 제공한다.

희귀 수용체에 관한 존재 및 신흥 유전 정보 상에서 이용할 수 있는 본 발명의 능력에 더하여, 본원에 기재된 방법을 공지의 수용체에서 이용하여 개발된 약물은 전통적 스크린을 사용하여 개발된 약물보다 명백한 치료적 장점도 갖는다. 리간드 기재의 스크린은 수용체 상의 리간드의 작용을 "길항"하도록 작용하는 화합물을 확인하기만 함으로써 리간드 유도된 수용체 활성화를 방지한다. 그러한 화합물 또는 길항제는 리간드 독립적 수용체 활성화 및 이후의 세포 반응을 차단하지 않는다. 한편, 본 발명의 방법을 이용항 개발된 약물은 리간드 의존성 및 리간드 독립적 수용체 활성화를 둘다 가장 바람직하게 차단한다. 본 발명의 방법에 의해 확인된 약물의 상기 특성은 구성적 활성 G 단백질 커플링된 수용체와 연결된 질병의 성장 수와 상당히 관련있는데(도 3), 그 이유는 전통적 길항제가 통상적으로 그러한 활성을 차단하지 않을 것이기 때문이다.

본 발명의 기초가 되는 기초적 통찰은 그것이 수용체 활성에 영향주는 납 화합물을 직접 확인하기 위해 사용될 수 있는 수용체의 구성적으로 활성화된 형태라는 인지이다. 구성적으로 활성화된 수용체에 의해 야기된 질병의 경우, 구성적으로 활성화된 수용체에 대한 소분자 역 아고니스트는 그 자체가 잠재적 치료제이다. 임의의 수용체, 특히 희귀 수용체의 경우, 추가의 아고니스트 및 내생 리간드의 발견의 유사성은 구성적으로 활성화된 수용체를 사용하여 유의하게 증가되는데 그 이유는 수용체가 그러한 아고니스트에 대해 향상된 반응을 나타내기 때문이다. 또한, 희귀 수용체에 대한 역 아고니스트는 직접 확인될 수 있다. 희귀 수용체의 생물학적 기능에 대한 조사는 희귀 수용체에 대한 아고니스트 및 역 아고니스트 둘다가 유용할 때 상당히 간단해질 것이다. 필수적으로, 본 발명의 방법은 수용체 기능의 조절제를 내생 리간드에 대한 어떠한 지식도 필요없이 발견하기 위한 수단을 제공한다. 상기 능력은 선행 기술에서 대응물이 없다.

본원에 개시된 본 발명의 이용은 구성적으로 활성화된 수용체를 얻거나 제조하는데에 따라 좌우된다. 지난 몇년에 걸쳐 발생한 유전 조작 및 공학 과학에서의 대단한 향상은 종전에만 해도 기술에 고도의 숙련자를 필요로 했던 유전 감식, 구성 및 발현의 통상적인 기초 기술에 유용하게 되었다. 통상의 방법은 목적하는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 제조하도록 세포를 지정할 DNA의 유전 서열을 변경시키는 유전 기술의 숙련가에게 잘 알려져 있다. 변경된 DNA를 세포로 도입시키고, 세포가 변경된 DNA에 의해 특정화되고 변경된 단백질을 발현하도록 유도하는 방법도 또한 잘 성립되어 있다. 이러한 기술을 기재하는 성립된 참고로는 문헌 [Sambrook Fritsch and Maniatis, 1984, Molecular Cloning, A Laboratory Manual]이 있다.

상기 제시된 바와 같이 몇몇의 질병과 관련된 구성적으로 활성화된 수용체의 서열은 알려져 있고 다수의 상기 서열를 코딩시키는 유전 물질이 유용하다. 유전 물질이 유용하지 않은 경우 질병 형태와 동일한 구성적으로 활성화된 수용체가 야생형 구성적으로 활성화된 수용체에서 발견되는 바와 동일한 구성적으로 활성화된 변형체를 도입시킴으로써 제조될 수 있다. 그러나, 다수의 보다 알려진 수용체는 아직 질병 상태 및 고아 수용체와 연관되어 있지 않으므로, 공지된 기능이 없다. 상기 수용체에 대하여 먼저 구성적 활성화를 유도하는 것이 필요하다. 하기에 설정된 섹션 "A"에서 구성적으로 활성화된 수용체로의 다수의 접근법이 기재되어 있다. 상기 접근법은 관찰된 자연 발생 활성화 패턴의 상세한 분석 및 합성을 기본으로 한다. 단일 접근법은 임의의 소정의 수용체에 대한 가장 바람직한 접근법이 아니며, 즉 본 발명의 개시를 기본으로 하여 이러한 접근법은 숙련가의 필요에 따라 예상되는 불필요한 실험 없이 소정의 수용체의 구성적으로 활성화된 형태를 유도할 하나 이상의 접근법을 선택하는 기회를 당업자에게 제공한다.

하기 기재된 섹션 "B"에서 적절한 실험관내 발현계 (포유류 또는 비포유류)로 구성적으로 활성화된 수용체를 감염시키는 것이 개시되어 있다. 상기 기재된 바와 같이 표준 감염 기술은 상기 단계를 수행하는 기술에 잘 알려져 있다 (Chidiac 등, 1994). 구성적으로 활성화된 수용체의 성공적인 감염은 항상 적절한 시험에 의해 항상 확인되어야 하고 이러한 시험 하나가 설정되어 있다.

하기 기재된 섹션 "C"에서 발현계내의 감염 수용체의 구성적 활성의 확인이 개시되어 있다. 다양한 제2 메신저 스크린 분석법을 수용체 매개된 세포 반응을 검출하는데 사용할 수 있다. 주로 선택되는 분석법은 수용체의 유형, 및 활성화시키는 제2 경로에 따라 좌우된다. 예를 들면 몇몇의 G 단백질 커플링된 수용체에 대하여 아데닐 시클라제 활성화계는 적절한 분석법을 제공할 것이다. 다른 G 단백질 커플링된 수용체에 대하여 포스포리파아제 C 결합 분석법이 적절할 것이다. 티로신 키나제 및 기타 수용체에 대한 적절한 분석법이 유용하며 당업자들에게 공지되어 있다. 바람직한 분석법은 후술에 요약되어 있다. 구성적으로 활성화된 수용체 활성의 분석법은 수용체 활성의 기능화를 제시할 뿐만 아니라, 또한 활성의 정도가 감소되고 증가되는 시기를 직접적으로 측정하는 수단을 제공한다. 따라서, 역 아고니스트인 화합물은 활성의 관찰된 기초 수준을 감소시키는 것으로 예상되는 반면, 아고니스트인 화합물은 활성 수준의 상기 기준선을 증가시키는 것으로 예상된다.

따라서, 시험관내 발현계에서 구성적으로 활성화된 수용체는 후보 화합물이 직접적으로 식별될 수 있는 스크린 분석법의 기초를 형성할 수 있다. 발현된 구성적으로 활성화된 수용체계를 시약으로 사용하여 후보 화합물은 구성적으로 활성화된 수용체에 대해 작용하는 화합물을 직접적으로 식별하는데 사용되는 시약계 및 분석계에 적용될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 수용체에 대한 내재적 발생 리간드에 관한 임의의 종래 지식 없이도 수용체 활성의 조절에 약리학적으로 유효한 화합물을 발견하는 문제점을 해결한다.

1) 희귀 수용체에 대한 역 아고니스트가 본 발명의 방법론에 의해 식별될 수 있고, 2) 이러한 역 아고니스트는 수용체에 관련된 질병을 치료하는 약물 발견 프로그램에 화합물을 유도하는 이상적인 후보임을 인지하면, 종래 기술에서는 불가능한 질병에 대한 치료 연구가 상기 지식에 의해 가능해진다. 예를 들면 수용체를 대표하여 질병에 걸린 조직 샘플 및 정상 조직 샘플을 스캐닝하는 것은 학계의 실습이 되거나, 내재적 발생 리간드를 식별하는 경로로 추구되고 있다. 정의상으로는 희귀 수용체에 대한 내생 리간드는 알려져 있지 않기 때문에 조직 스캔은 광범위한 범위의 건강한 조직 및 질병에 걸린 조직에 대해 수행될 수 있다. 이러한 조직 스캔은 조절 화합물이 알려져 있는 특정 수용체를 질병에 연관시키는 바람직한 제1 단계를 제공한다. 수용체의 DNA 서열은 조직 샘플내에 수용체 발현의 RT-PCR 식별을 위한 프로브를 제조하는데 사용될 수 있다. 질병에 걸린 조직내에 수용체의 존재, 또는 정상 조직에 강력하게 비하여 질병에 걸린 조직에서의 상승된 농도에서 수용체의 존재는 질병과의 상호관련을 식별하는데 바람직하게 이용될 수 있다. 수용체는 상기 기술에 의해 기관의 영역에 균등하게 국부화될 수 있다. 수용체가 국부화되는 특정 조직의 공지된 기능을 기본으로 하여 수용체의 추정의 기능적 역할이 연역될 수 있다.

본 발명의 방법론의 지식으로 착수될 수 있는 유리한 연구의 유형의 추가되는 예는 DNA 상동에 의해 식별되는 수용체류의 질병과 특정 수용체를 식별하고 연관시키는 것이다. 제1 수용체내에 활성화를 발생시키는 돌연변이가 또한 동족 수용체에 활성화를 유발할 수 있다. 따라서 바람직하게는 공지된 컴퓨터화 데이타베이스를 사용하여 공지된 수용체의 서열을 관련 수용체 족을 얻는데 효율적으로 이용될 수 있다. 정상 조직 샘플 및 질병에 걸린 조직 샘플은 상기 수용체 동족의 위치를 이해하기 위해 스크린될 수 있다. 또한 역 아고니스트는 동족 수용체에 대해 본 발명의 방법론으로 식별될 수 있으므로 조직 유형에서 이의 식별 및 분포는 신규 약물을 개발시키는 또따른 방법을 제공한다. 상기 접근법은 내생 리간드가 알려진 수용체 및 희귀 수용체에 의해 사용될 수 있으나, 본 발명의 방법론에 의해 가능한 기술 상태에서의 주요 향상은 희귀 수용체와 관련된 질병에 대한 후보 화합물을 직접적으로 식별하는 성능이다. 상기 성능에 의해 약물 발견에 대한 새로운 파라다임을 형성한다.

상기 요약된 단계는 당업자가 본 발명의 방법을 수행하는데 충분히 상세하게 강조될 것이다. 예시의 목적상 후술하는 설명은 수용체의 2개의 주족, G 단백질 커플링된 수용체 및 티로신 키나제 수용체에 관한 것이나, 본 발병의 접근법 및 방법은 수용체의 다른 부류에 동등하게 사용될 수 있음을 인지하여야 한다.

후술은 바람직한 접근법을 명확히 하려는 것이며, 본원에 개시된 본 발명을 제한하려는 것은 아님을 이해하여야 한다. 후술되는 단계의 순서는 예시의 유효성을 위한 것이고, 예를 들면 통상의 당업자가 목적할 수 있는 본 특허의 개시에 따라 편의상 상이한 순서로 단계를 조절하는 것을 수행하고자 하는 단계에 의한 방식으로 제한하려는 것은 아니다.

I. 표적 수용체의 비내생 구성적으로 활성화된 형태의 제조

A. 표적 수용체의 분자 변경

1. 비내생 구성적으로 활성화된 G 단백질 커플링된 수용체

구성적으로 활성화된 수용체는 표적 수용체내의 단일 아미노산을 돌연변이화시킴으로써, 또는 수용체내에 "돌연변이성 카세트"라 부르는 아미노산의 선택된 스트레치를 치환함으로써 제조될 수 있다. 이점에 관하여 G 단백질 커플링된 수용체 (GPCR)내에 특정 식별된 영역 (및 단일 아미노산 위치)이 존재하며, 본원에 제시된 데이타와 같이 수용체의 구성적으로 활성화된 형태를 제조한다.

a. 돌연변이성 카세트

(1) 제1 세포외 (E2) 및 제3 세포내 (I3) 루프의 카세트

다수의 G 단백질 커플링된 수용체는 아미노산 돌연변이가 발생하거나 수용체 서열로 엔지니어링된 후에 구성적 활성화되는 것으로 보고되어 있다. 상기 돌연변이를 위한 중요한 위치는 제2 세포외 및 제3 세포내 루프이다. 구성적 활성화를 고아 G 단백질 커플링된 수용체로 엔지니어링시키는데 사용될 관찰된 돌연변이를 기재로 하는 아미노산의 짧은 세그먼트를 구성하는 몇몇의 돌연변이성 카세트가 후술된다. 각각의 카세트는 구별되어지는 수용체/수용체들과 관련된다.

(a) β-아드레날린성 수용체

G 단백질 커플링된 수용체의 아드레노 수용체류에 속하는 것으로 알려진 수용체는 제3 시토플라스마 루프 (아미노산 264-272)의 C 말단 부분을 보호하는 짧은 돌연변이성 카세트에 의해 구성적 활성화될 수 있다. 이러한 카세트의 치환은 Gs- 및 Gi 커플링된 아데닐레이트 시클라아제 결합된 수용체 및 Gq 커플링된 포스포이노시톨 결합된 수용체를 구성적 활성화시킬 수 있다 (Lefkowitz 등, 1993 참고). 상기 돌연변이성 카세트는 고아 G 단백질 커플링된 수용체의 범위를 활성화하는데 사용될 것이다.

활성화 돌연변이성 카세트: (264-272) FCSREKKAA

전체 제3 세포내 루프에 대한 활성화 돌연변이성 카세트:

짧은 카세트 뿐만 아니라 아미노산 264-272에 상응하는 상기 수용체 (상기 도시됨)의 보다 짧은 카세트를 함유하는 전체 제3 세포내 루프는 또한 본 발명을 수행하는데 사용될 것이다. 따라서, 본 발명의 하나의 실시태양에서 상기 카세트에 상응하는, 보다 짧거나 보다 긴 cDNA 서열은 G 단백질 커플링된 수용체의 제3 세포내 루프내로 엔지니어링될 것이다.

(b) α1B 아드레날린성 수용체

α1B 아드레날린성 수용체의 세포내 영역에서의 돌연변이는 아고니스트의 분재하에 G 단백질 커플링을 유발시키는 수용체를 구성적 활성화시키는 것으로 나타나 있다.

돌연변이성 카세트: SREKKATL (여기서,는 A 이외의 아미노산임). 가장 바람직하게는는 E로를 치환하는 경우 최대 구성적 활성화가 얻어지므로 E이다.

(Kjelsberg 등, 1992 참고)

전체 제3 세포내 루프에 대한 돌연변이성 카세트:

(여기서,는 A 이외의 아미노산임). 가장 바람직하게는는 E로를 치환하는 경우 최대 구성적 활성화가 얻어지므로 경우 E이다.

따라서, 본 발명의 또다른 실시태양에서 본 카세트에 상응하는 cDNA 서열은 (에 변형체가 있음) G 단백질 커플링된 수용체의 제3 세포내 루프로 엔지니어링될 것이다 (제3 세포내 루프의 서열에 관함, Schwinin 등, 1995).

(c) ACCA (아데닐레이트 시클라아제 구성적으로 활성화된제)

최근에는 ACCA 또는 아데니실 시클라아제 구성적 활성화제라 부르는 아데닐레이트 시클라아제를 구성적 활성화하는 고아 G 단백질 커플링된 수용체의 분자 클로닝에 대해 보고되어 있다 (Eggerick 등, 1995). 풍부한 전사가 뇌에서 발견되는 반면 소량이 정소, 난소 및 눈에서 검출된다. 본 발명의 방법은 상기 수용체에 작용하는 역 아고니스트를 발견하는데 이용될 수 있다. 또한, 상기 수용체의 제2 세포외 또는 제3 세포내 루프에 상응하는 돌연변이성 카세트는 본 발명의 수행에서 다른 희귀 수용체를 구성적 활성화하는데 사용된다. 이러한 2개의 카세트는 다음과 같다:

제2 세포외 루프 돌연변이성 카세트: CLDGLTTCGVVYPLSKNHLVVL

전체 제3 세포내 루프 서열: CRIVCRHAQQIALQRHLLPASHYVATRKG

상기 아미노산 서열에 상응하는 cDNA가 본 발명의 또다른 실시태양에서 이를 구성적 활성화하는 다양한 희귀 수용체의 제2 세포외 및 제3 세포내 루프를 치환하는데 사용될 것이다. 상기 수용체의 막내외 세그먼트에 상응하는 막내외 돌연변이성 카세트가 또한 본 발명의 수행에 사용될 것이다.

(d) 세로토닌 수용체

세로토닌 5-HT_2A수용체에서 K, E 또는 R에 대한 시스테인 322의 돌연변이는 구성적으로 활성화된이 된다. 또한, 5-HT_2c수용체에서 F 또는 K에 대한 S312 돌연변이는 구성적 활성화를 유도한다.

(e) 티로트로핀 수용체

티로트로핀 수용체 유전자의 제3 세포내 루프에서 생식선 돌연변이는 수용체의 구성적으로 활성화된에 의해 독성 아데노마스를 유발시킨다 (Duprez 등, 1994). 상기 돌연변이 기재의 카세트는 다음과 같다.

또한, 파르마 (Parma) 등은 돌연변이화 D 내지 C를 제외한 동일한 위치에 있는 제3 루프내에 또다른 활성화 돌연변이를 기재하고 있다 (Parma 등, 1993). 상기 돌연변이 기재의 카세트는 다음과 같다.

따라서, 본 발명의 또다른 실시태양에서 상기 카세트는 기타 G 단백질 커플링된 수용체를 활성화하는데 사용될 것이다.

(f) RDC8 아데노신 A2 수용체

RDC8 수용체는 아데노신 A2 수용체의 구성적으로 활성화된 형태를 코드화한다 (Maenhaut 등, 1990). 상기 수용체의 제2 세포외 및 제3 세포내 루프에 상응하는 돌연변이성 카세트는 기타 수용체에 도입되어 본 발명의 수행을 위한 구성적으로 활성화된 수용체를 제공할 것이다.

(g) 파라티로이드 호르몬 (PTH) 수용체

PTH 수용체의 구성적으로 활성화된 형태는 얀센병인 단지절 왜소발육증의 희귀 형태를 유발시키는 것으로 나타나 있다 (Parfitt 등, 1996).

구성적으로 활성화된 형태는 T410P의 돌연변이를 갖는다. 또한, 또다른 돌연변이 H223R은 질병을 유발하는 것으로 나타나 있다. 따라서, 상기 돌연변이를 함유하는 돌연변이성 카세트는 본 발명의 추가되는 실시태양에 기타 수용체를 활성화하는데 사용될 것이다.

(h) 무스카린성 수용체

m2 무스카린성 수용체 (V385, T386, I389 및 L390에 상응함)에 대한 4개의 아미노산 모티브 (VTIL)가 G_i/o커플링 특이성 및 G_i/o활성화에 필수적임이 기재되어 있다. 상기 영역에서의 구성 변화가 세포질로의 막내외 VI의 상개적 이동을 포함하는 가정을 시험하기 위하여 돌연변이 m2 무스카린성 수용체를 류 (Liu) 등에 의해 1 내지 4개의 과잉 알리닌 잔기를 L390 직후에 막내외 VI로 삽입하도록 하였다 (Liu 등, 1996). 가정과 일치하게 C 말단으로부터 L390 잔기로의 과잉 알라닌 돌연변이를 함유하는 모든 돌연변이 m2 수용체는 구성적으로 활성화되었다.

제3 세포내 루프의 m2 카르복시 말단 영역은 다음과 같다.

390 후에 1, 2, 3 또는 4개의 알라닌 잔기의 삽입은 구성적으로 활성화된이 된다.

따라서, 본 발명의 추가의 실시태양에서 G 단백질 커플링된 수용체에 의해 서열 배치에 의해 상기 부위에서의 알라닌 삽입은 G 단백질 커플링된 수용체를 구성적 활성화하는데 사용될 것이다.

(2) 막내외 카세트

(a) 티로프로핀 자극 호르몬 (TSH) 수용체

티로티로핀 (TSH) 수용체에서의 생식선 돌연변이는 비 자가 면역 상염색체 우세 갑상선기능항진증을 유발한다 (Duprez 등, 1994). 비 자가 면역 상염색체 우세 갑상선기능항진증 (독성 갑상선 비후)가 있는 2개의 대혈통의 영향을 받은 군의 TSH 수용체 유전자에서 2개의 상이한 돌연변이가 제3 (V509A) 및 제7 (C672Y) 막내외 세그먼트내에 잔기를 포함함이 기재되어 있다. 따라서, 본 발명의 추가되는 실시태양에서 후술되는 티로트로핀 수용체의 상기 돌연변이를 함유하는 제3 및 제7 막내외 영역에 상응하는 돌연변이 카세트가 구성적 활성화를 위한 기타 수용체의 제3 및 제7 막내외를 치환하는데 사용될 것이다.

제3 막내외 돌연변이성 카세트:

제7 막내외 돌연변이성 카세트:

(b) 히스타민 H1-수용체

히스타민 H1 수용체에서 막내외 3 중에 D116이 구성적 활성화에 중요함이 기재되어 있다 (Ter lack 등, 1995). 아미날린성 (aminergic) G 단백질 커플링된 수용체에 상당히 보존되는 D116은 일반적으로 아고니스트 및 길항제 결합에 주요 정착점으로서 나타난다. 본 발명의 또다른 실시태양에서 상기 부위에서의 점돌연변이는 기타 수용체에 구성적 활성화를 유도하는데 사용될 것이다.

(c) 황체화 호르몬 수용체

황체화 호르몬 (LH) 수용체에서의 다수의 자연 돌연변이는 가계의 남성 조발 청춘기를 유발하는 것으로 나타나고 있다 (Kosugi 등, 1995). 하나의 돌연변이는 막내외 나선 6을 D578로 치환하는 것을 포함한다. 따라서, LH 수용체의 G 치환 막내외 나선 6은 구성적 활성화시키기 위하여 기타 수용체의 막내외 6을 치환하는데 유용한 것으로 여겨진다. 막내외 나선 6의 세포질 말단에서의 I에 대한 M571, 및 I에 대한 T577에 사용하는 기타 돌연변이는 또한 구성적 활성화를 유발한다. 상기 돌연변이성 카세트 모두 G 단백질 커플링된 수용체를 구성적 활성화시키는 본 발명의 추가되는 실시태양에서 사용될 것이다.

(d) 바이러스성 종양원 - 인간 헤르페스바이러스 GPCR

인간 헤르페스바이러스 8은 구성적으로 활성화된 G 단백질 커플링된 수용체를 코딩시키는 것으로 나타나며, 이는 하카포시육종, 임파종 및 기타 악성종양을 진전시키는 것으로 여겨진다 (Arvanitikis 등, 1997). 본 발명의 추가되는 실시태양에서 제2 세포외, 제2 세포내 또는 제3 세포내 루프에 상응하는 상기 수용체로부터의 돌연변이성 카세트는 G 단백질 커플링된 수용체를 활성화하는 유용한 수단을 제공한다. 상기 수용체의 막내외 세그먼트가 또한 유용할 것이다.

b. 카르복시 말단 꼬리의 절단

자연 발생하며 다르게 분열된 형태의 다수의 프로프타글란딘 E 수용체 EP3 아형 (subtype)은 C 말단 꼬리의 절단에 의해 구성적으로 활성화된다 (Hasegawa 등, 1996). 상기 절단된 수용체는 리간드의 부재하에 Gi를 구성적 활성화시킨다.

또한, 대사영양성 (metabotropic) 글루타메이트 수용체 (mGluRs) 는 동족체를 갖고 있지 않고 대부분의 기타 G 단백질 커플링된 수용체에 비하여 상이한 구성 특성을 나타낸다. 특히, 포스포리파아제 C (PLC) 커플링된 mGluRs의 몇몇의 이소폼은 (mGluR1a, mGluR5a 및 mGluR5b) 놀랍게도 긴 카르복시 말단 세포내 영역을 갖는 반면, mGluR1b 및 mGluR1c의 분열 변형체는 훨씬 짧은 카르복시 말단을 갖는다. mGluR1b 및 mGluR1c의 짧은 형태의 발현은 기저 이노시톨 포스페이트 제조를 개질하지 않았다 (Prezeau 등, 1996 참고). 대조적으로, mGluR1a의 유사 수준의 발현은 기저 이노시톨 포스페이트 형성에서 2배의 증가를 나타내었다. 상기 데이타는 대사영양성 글루타메이트 수용체의 경우에 긴 카르복시 말단 영역이 G 단백질에 대한 커플링에 유리함을 제시한다. 따라서, 본 발명의 또다른 실시태양에서 G 단백질 커플링된 수용체는 카르복시 말단 영역의 적절한 개질 (절단 또는 연장)에 의해 구성적 활성화될 것이다.

c. 점돌연변이

상기 기재된 다수의 돌연변이성 카세트에서 단일 아미노산에서의 변화는 구성적 활성화되게 한다. 따라서, 제2 세포외, 제2 세포내 및 제3 세포내 루프, 및 제7 막내외 G 단백질 커플링된 수용체의 막내외 영역에서의 점돌연변이는 또한 상기 수용체를 구성적 활성화하는데 사용될 것이다.

정량적 접근법이 α1B-아드레날린성 수용체의 활성화 공정에서 상당히 보존되는RY (는 통상적으로 E 또는 D임)에 속하는 D142의 역할을 연구하는데 사용되었다. 활성화 공정은 D142의 양성자화 상태에 따라 좌우되었다. α1B-아드레날린성 수용체의 D142는 모든 19개의 가능한 아미노산으로 돌연변이화 되었고 수용체 돌연변이 구성적 활성화를 유도하는 이의 성능에 대하여 시험하였다. D142의 모든 19개의 치환은 최고 수준을 형성하는 D142T 돌연변이가 있는 구성적 활성의 상이한 수준을 나타내는 α1B-아드레날린성 돌연변이를 유도하였디 (Scheer 등, 1997). 따라서, 제2 세포내 로프에서 상당히 보전되는RY의 모든 아미노산을 사용하는에 대한 점돌연변이는 본 발명의 추가되는 실시태양에서 G 단백질 커플링된 수용체를 활성화하는데 사용될 보편 카세트 돌연변이이다.

d. 보편 돌연변이성 선열

막내외 섹션 6에 인접하는 제3 세포내 루프의 C 말단 영역은 G 단백질 커플링에 중요한 것으로 나타나고 있다. α1β 아드레날린성 수용체에서 알리닌 293을 임의의 기타 19 아미노산의 치환에 의해 구성적 활성화하였다. 글루타민산 또는 리신의 치환은 구성적 활성의 최고 수준이 되었다. 카세트는 다음과 같다.

(293 위치에서의는 α1β-아드레날린성 수용체에서 치환됨)

상기 위치의 중요성은 상기 부위에서 수행되고 구성적 활성화를 유도하는 모든 돌연변이의 아미노산 서열 선열의 돌연변이성 데이타베이스의 분석에 의해 유지된다.

수용체의 구성적 활성화를 유도하는 α1β-아드레날린성 수용체 293 위치에 상응하는 아미노산 치환기 목록은 다음과 같다.

(1) α1β-아드레날린성 수용체 A293[여기서는 모든 남아 있는 아미노산임](Kjelsberg 등, 1992).

(2) 알파 2A-아드레날린성 수용체 T373 (A, C, E, K, F) (Ren 등, 1993).

(3) 베타 2A-아드레날린성 수용체 L272 (A, I, T) (Pei 등, 1994).

(4) LH/CG 수용체 A568V (Latronico 등, 1995).

(5) TSH 수용체 A623I (Parma 등, 1993).

(6) 세로토닌 5HT2A C322K (Casey 등, 1996).

(7) 세로토닌 5-HT2C S312K/F (Barker 등, 1994; Herrick-Davis, 1996).

(8) 혈소판-활성화 인자 수용체 L231R (Parent 등, 1996).

(9) 무스카린성 m2 수용체 (T386A) (Blin 등, 1995).

따라서, 임의의 기타 아미노산에 대한 상기 위치에서의 변화는 구성적 활성화에 유리하지만, 바람직하게는 변화는 염기성 또는 산성 아미노산, 또는 상이한 측쇄를 갖는 또다른 소수성 아미노산에 대한 것으로 나타난다.

4 아미노산 α1β-아드레날린성 수용체 서열이 연구되는 경우 또다른 중요 위치는 이중 염기성 잔기 전에 산성 글루타민산 잔기인 것으로 나타난다.

상기 위치로 선열되는 아미노산의 돌연변이는 하기 열거되는 다수의 수용체 유형에 따라 구성적으로 활성화된다:

(1) 베타2-아드레날린성 수용체 E268G (O'Dowd 등, 1998).

(2) 무스카린성 M1 수용체 E360A (Hogger 등, 1995).

(3) LH/CGR 수용체 D564G (Laue 등, 1995).

(4) TSH 수용체 D619 (G) (Parma 등, 1993).

EKKAA에 의해 나타나는 아미노산 모티브는 실질적으로 모든 G 단백질 커플링된 수용체에 어느 정도 보존된다. 예를 들면, 이중 염기성 KK는K 또는 RR 또는 KR 또는 RK에 의해 치환될 수 있다 (= 임의의 기타 아미노산).

G 단백질 커플링된 수용체의 다양한 상이한 부류에 따른 선열 관찰을 기본으로 하여 전체 돌연변이성 삽입 카세트가 G 단백질 커플링된 수용체를 구성적 활성화는 일반적 유용성을 가질 것으로 개시되어 있다. 상이한 G 단백질 커플링된 수용체의 길이 차이로 인하여 카세트 삽입에 대한 번호 위치 (아미노산 번호)가 변화될 것이다. 그러나, 삽입점은 "위치적"이며, 즉 삽입점은 제3 세포내 루프 및 막내외 섹션 6의 연결에 존재한다.

상기 카세트는 X₁BBHyX₂이다

(여기서, X₁은 아미노산, 바람직하게는 G, A 또는 K일 수 있고; Hy는 소수성 아미노산, 바람직하게는 A이고; X₂는 임의의 아미노산, 바람직하게는 K, R, E 또는 상기 위치에 본래 소수성 아미노산에 상이한 측쇄를 갖는 소수성 아미노산임). 본 발명의 추가되는 실시태양에서 상기 보편 돌연변이성 카세트는 가장 바람직하게는 G 단백질 커플링된 수용체를 구성적 활성화하기 위하여 제3 세포내 루프 및 막내외 섹션 6의 연결에서 이용된다.

2. 티로신 키나제 수용체

a. 일반적인 방법

후술되는 다수의 방법은 본 발명의 추가되는 실시태양에서 티로신 키나제 수용체를 구성적 활성화하는데 사용될 것이다. 내생 종양원에 의한 세포의 전환 (예, src 유전자 생성)은 IGF-I 수용체의 세포내 포스포릴화 및 활성화를 증가시켰다. 또한, 상기 수용체에서의 키나제 영역에서의 점돌연변이는 구성적 활성화를 유도하였다. 따라서, 티로신 키나제 수용체로부터 활성이 아닌 수용체로의 구성적으로 활성화된 키나제 영역의 전환에 의하여 상기 수용체의 구성적 활성화가 유도될 것으로 여겨진다.

다수의 티로신 키나제 수용체는 활성이 되는 이합체화를 필요로 한다. 상기 수용체의 막내외 주위의 점돌연변이는 리간드 비의존 이합체화 및 세포 활성화를 유도하는 것으로 나타나고 있다. 이는 특히 그루종 증후군을 유발하는 세포간 이황화물 결합 (Neilson 등, 1995)의 형성에 의한 수용체 이합체화를 증가시킨, Y에 대한 C332의 돌연변이에 의한 섬유아세포 성장 인자 2 수용체의 구성적 활성과 연관된다. 따라서, 상기 영역, 특히 시스테인 잔기에서의 티로신 키나제 수용체의 돌연변이는 기타 수용체의 구성적 활성화를 유발할 것이고, 이러한 돌연변이는 본 발명의 추가되는 실시태양으로서 사용될 것이다.

돌연변이성 결실의 분석으로부터 인슐린 수용체의 세포외 α-부단위가 세포내 키나제 활성에 억제 효과를 부여하는 것으로 여겨진다. 인슐린 수용체 α-부단위에서의 N281의 결실은 세포내 키나제 활성에 대한 α-부단위의 억제 효과의 결실에 인한 것으로 여겨지는 구성적 활성화를 유발하였다 (Desbois 등, 1996). 인슐린과 유사 구조를 갖는 티로신 키나제 수용체에서의 유사 결실은 본 발명의 추가되는 실시태양에서 사용될 것이다.

간세포 성장 인자에 대한 티로신 키나제 수용체를 코딩시키는 후생 유전자는 인간 암의 중요한 부분에 발현되는 잠재성 유해 종양원이다. 막내외 영역 바로 아래에 절단된 세포질 영역은 구성적 활성화를 얻는 것으로 나타난다 (Zhen 등, 1994). 따라서, 이러한 수용체 키나제의 세포외 영역은 활성화되는 세포내 키나제의 성능에 대한 억제 효과를 유지시키는 것으로 나타난다. 따라서, 상기 수용체의 세포외 영역에서의 점돌연변이는 상기 인슐린 수용체에서 나타난 바와 같이 세포내 키나제 영역에 대한 억제 효과를 제거하는 본 발명의 또다른 실시태양에 사용될 것이다.

또한, 론 티로신 키나제의 자연 발생 분열 변형체는 구성적 활성화를 유도하는 것으로 나타나 있다 (Collesi 등, 1996). 상기 전사는 β쇄 세포외 영역에서 49 아미노산의 인프레임 결실에 의해 전체 길이의 단백질과는 상이하다. 따라서, 관련된 티로신 키나제 수용체에서의 유사 크기의 결실은 이러한 수용체를 구성적 활성화시키는 방법으로서 본 발명의 다른 실시태양에서 사용될 것이다. 유사하게는 c-키트 수용체에서의 자연 발생 점돌연변이는 구성적 활성화가 되는 근접막 영역에서의 7개의 아미노산을 결실시켰다 (Tsujimura 등, 1996). 또한 TQLPYDH의 근접막 서열은 마우스 CSF-1 수용체 및 α-PDGF 수용체에 존재하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 상기 수용체 및 기타 동족 수용체에서의 서열의 결실은 본 발명의 수행에서 상기 티로신 키나제를 구성적 활성화하는데 사용될 것이다.

b. 세포외 결합 영역

수용체 올리고머화는 성장 인자 수용체 중에서 보편적인 형상이다. 수용체-수용체 상호작용에서 배좌 변화를 유도하는 EGF와 같은 단량체 리간드, 또는 이웃 수용체의 이합체화를 매개하는 PDGF 및 CSF-1과 같은 2자리 리간드에 의해 유도될 수 있다. 올리고머화 성장 인자 수용체는 상승된 단백질 티로신 키나제 활성 및 개선된 리간드 결합 친화력을 갖는다. 따라서, 티로신 키나제 수용체와의 세포외 영역은 올리고머화를 개선함으로써 구성적 활성화의 목적을 위하여 본 발명의 추가되는 실시태양에서 연구될 것이다. 기수의 시스테인을 남겨 올리고머화 및 수용체 활성화시키는 분자간 이황화 결합을 형성할 세포외 영역으로부터 하나 이상의 시스테인 잔기를 결실시킬 결실성 카세트를 사용함으로써 달성될 수 있다. 상기 메카니즘의 효율성은 론 수용체에 의해 예시된다. 론 유전자 프로덕트의 돌연변이 형태는 β쇄 세포외 영역에서 49개의 아미노산의 인프레임 결실에 의해 전체 길이의 론 mRNA와 상이한 전사에 의해 코드화된다 (Collese 등, 1996). 돌연변이 수용체는 기수의 시스테인 잔기를 함유하기 때문에 이황화물 결합 세포내 올리고머화에 의해 구성적으로 활성화된다. 돌연변이 론 수용체는 막내외 영역의 짧은 세그먼트를 코딩시키는 174 bp의 참 카세트 엑손의 또다른 분할에 의해 형성된다. 이에 의해 3개의 시스테인 잔기가 손실되며 이황화물 교환에 의해 균일이합화될 수 있는 기수를 남긴다.

c. 막내외 영역 및 돌연변이성 카세트

수용체 티로신 키나제과의 모든 군은 단일 간격 막내외 영역을 갖는다. 상기 과의 공통점은 수용체를 구성적 활성화하는데 이용될 수 있다는 것이다. 이러한 접근법의 효율성의 예는 활성화 Neu (E664)에 의한 인슐린 수용체 막내외 영역의 치환이 인슐린 비의존 수용체 이합체화 및 활성화를 유발한다는 관찰에 의해 제공된다 (Yamada 등, 1992; Cheatham 등, 1993). 따라서, 본 발명의 또다른 실시태양에서 돌연변이 막내외 카세트는 기타 부류의 수용체들을 활성화하기 위하여 수용체의 티로신 키나제 상과의 부류에 따라 전환될 것이다.

또한, 섬유아세포 성장 인자 3 수용체 (FGFR3)의 막내외 영역에서 점돌연변이는 구성적 활성화시킨다. 태성연골이영양이 가장 통상적인 왜소발육증의 유전 형태이다. 섬유아세포 성장 인자 3 수용체의 막내외 영역에서 G로부터 R로의 치환을 나타내었다. 보다 중요하게는 야생형 및 돌연변이 FGFR3의 막내외 영역에 의한 Neu 수용체 티로신 키나제의 막내외 영역을 치환함으로써 FGHFR3에서의 R380 돌연변이는 키메라 수용체의 키나제 및 전환 활성을 활성화시키는 것으로 나타나 있다. E 및 D, 보다 적은 양의 Q, H 및 K를 포함하여 수소 결합 형성에 참여할 수 있는 측쇄가 있는 잔기는 활성화 R280 돌연변이를 치환할 수 있었다.

돌연변이성 막내외 카세트 (FGF3R; G380R)는 다음과 같다.

또는,

또한, E에 대한 V664의 돌연변이가 Neu 수용체 티로신 키나제의 종양원성 활성화를 제공하는 것으로 나타나 있다.

추가되는 돌연변이성 막내외 카세트 (Neu/erb-2 수용체)는 다음과 같다.

VTFIIATVEGVLLFLILVVVVGILI

밑줄친 서열은 다수의 수용체 티로신 키나제 막내외 영역에서 발견되는 모티브이다 (Sternberg 등, 1990). 상기 돌연변이가 수용체의 이합체화를 매개할 수 있는 것으로 여겨진다. 활성화 Neu (E664)에 의한 인슐린 수용체 막내외 영역의 치환이 인슐린 독립 수용체 이합체화 및 활성화를 유발시킴을 관찰하는 것은 막내외-매개 이합체화의 상기 모델과 일치한다 (Yamada 등, 1992; Cheatham 등, 1993). 본 발명의 추가되는 실시태양과 같이 추가되는 실시태양에 의해 제시되는 바와 같이 기타 티로신 키나제 수용체를 활성화하기 위하여 막내외 돌연변이성 카세트를 도입할 것이다.

d. 근접막 영역

수용체 티로신 키나제의 막내외 영역은 수용체 부류사이에서는 상리하지만 동일 부류의 군 사이에서는 보존되는 근접막 서열에 의해 세포질 촉매 영역과 분리된다. 이러한 영역이 수용체 트랜스모듈레이션이라 부르는 공정인 이종 자극에 의해 수용체 기능의 조절에 포함됨이 입증되었다. 예를 들면, 개별적인 리간드에 의한 PDGF 또는 봄베신의 활성화가 단세포내에 고친화력 EGF 결합 부위의 결실을 유도한다. 이러한 효과는 근접막 영역에서 잔기의 포스포릴화에 의해 자극된다. 따라서, 티로신 키나제 수용체는 근접막 영역에서 잔기의 포스포릴화에 의해 소극적으로 조절하는 것으로 나타난다. 상기 영역의 중요성은 근접막 영역에서 7개의 아미노산의 결실에 의해 c-키트 수용체를 구성적 활성화하는 성능에 의해 추가로 예시된다 (Tsujimura 등, 1996). 결실된 세그먼트는 TQLPYDH (코돈 573 내지 579)에 상응하였다. 흥미롭게는, 7 아미노산 서열은 모든, 마우스, 래트, 고양이, 소, 인간 및 닭 키트에 광범위하게 보존된다. 또한, 7 아미노산 서열내에 4 아미노산 서열 QLPY는 키트 및 PDGF와 같은 II형 티로신 키나제 수용체에 완전히 보존된다. 따라서, 키트의 결실된 영역은 III형 수용체 티로신 키나제의 구조 및 기능에서 중요한 역할을 가질 가능성이 있다. 상기 영역, 특히 Y569는 또한 리간드 유도 수용체 내부화에 포함될 수 있다 (Myles 등, 1994). 따라서, 본 발명의 추가되는 실시태양에서 상기 인접에서 근접막 영역의 결실성 돌연변이는 다양하게 공지된 희귀 수용체 티로신 키나제를 구성적 활성화시키기 위하여 상기 영역의 소극적 효과를 결실시키는데 이용될 것이다.

e. 카르복시 말단 꼬리

카르복시 말단 꼬리 서열은 모든 공지된 수용체 티로신 키나제 사이에 가장 상리된 것이다. EGF 수용체의 카르복시 말단 꼬리는 단백질 티로신 키나제 영역의 기질 결합 부위와 작용하기에 충분한 길이 및 가용성을 포함할 수 있고, 외생 기질과 작용하는 성능을 조절할 수 있다.

상기 모델과 일치하여 변경된 자동포스포릴화 부위를 갖는 돌연변이 EGF 수용체를 발현하는 세포는 야생형 수용체의 유사 수준을 발현하는 세포보다 낮은 EGF 투여량에 유사분열촉진적으로 반응한다. 카르복시 말단 꼬리에서의 결실은 전환에 대해 유사 효과를 가졌다: 이는 종양원성 성능의 효력을 능가시키고 숙주 범위를 증가시켰으나 주요 종양원성 병변을 제공하지 않았다. CSF-1과 같은 기타 수용체가 있는 기타 세포계에서의 유사 실험은 카르복시 말단 꼬리 서열이 수용체 키나제 신호 기능에 대한 음성적 조절을 부여한다는 사실을 제공한다. 따라서, 카르복시 말단 결실 카세트는 본 발명의 추가되는 실시태양에서 티로신 키나제 수용체를 구성적 활성화시키는데 사용될 것이다.

B. 표적 수용체의 항펩티드 항체 자극

1. G 단백질 커플링된 수용체

G 단백질 커플링된 수용체의 세포외 루프에서의 특정 부위에 대해 반향인 항체는 가능하게는 리간드 결합을 기능적으로 자극하는 이의 성능에 의해 구성적 활성화를 유도하는 것으로 나타나 있다. 알라 및 그의 동료는 리간드의 부재하에 세포내 반응을 증가시키는 브래디키닌 B2 수용체의 세포외 루프의 N 말단 부분에 대해 반향인 항체의 성능을 기재하고 있다 (Alla 등, 1996). 따라서, 세포외 루프의 N 말단 부분에 대해 반향인 합성 펩티드 서열에 대한 항체는 G 단백질 커플링된 수용체를 구성적 활성화하는데 사용될 것이다. 상기 항체는 예를 들면 표준 기술을 사용하여 래빗에게서 양성되고 친화력 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.

2. 티로신 키나제 수용체

erB2/Her2 수용체의 세포외 영역에 대해 발생한 항체는 유방암 세포의 표면에 발현되는 경우 Her2, Her3, 및 Her4 수용체를 비롯하여 180-185 kDa 단백질의 티로신 포스포릴화를 유도한다. 흥미롭게는, 항체는 Her3 또는 Her4와 교차 반응하지 않는다. 따라서, 티로신 키나제 수용체의 상기 부분에 대해 양성된 항체는 본 발명의 추가되는 실시태양과 같이 구성적으로 활성화된 수용체를 추가로 생성하는데 사용될 것이다.

C. 수용체 및 G 단백질의 과다발현

1. G 단백질 커플링된 수용체

7개의 막내외 G 단백질 커플링된 수용체의 과다발현은 구성적 활성화를 유도하는 것으로 나타나 있다. 인간 β2-아드레날린성 수용체의 아고니스트-유도 특성은 Sf9 세포에서의 바쿨로바이러스에서 연구되고 있다 (Chidiac 등, 1994). cAMP 생성의 증가는 발현된 수용체 수에 비례한다. 따라서, 바쿨로바이러스에서의 상기 수용체 과다발현은 구성적 활성화를 유도한다. 따라서, 본 발명의 추가되는 실시태양과 같이 G 단백질 커플링된 수용체를 구성적 활성화하는 하나의 방법은 포유류 및 곤충 세포에서 과량의 수용체를 발현시키는 것일 것이다.

2. G 단백질

상기 언급한 바와 같이 G 단백질 커플링된 수용체는 불활성 상태 및 G 단백질 매개 트랜스덕션 경로에 커플링하는 활성 상태 사이에 평형으로 존재한다. 2개의 상태 상이에 전이는 조금 알려져 있는 배좌 변화를 포함하지만, 수용체에 대한 외생 리간드 (아고니스트)는 활성 배좌를 안정화하여 활성 상태 쪽으로 평형을 이동시킨다. 임의의 평형계에서와 같이 평형은 평형 성분의 하나를 공급하거나 결실시키는 외부 인자에 의해 하나의 측면 또는 다른면을 위하여 이동될 수 있다. G 단백질 커플링된 수용체에 대하여 평형은 평형에 참여하기에 유용한 수용체의 활성 및 비 G 단백질 결합 형태의 농도를 감소시킴으로써 활성 상태 쪽으로 이동될 수 있다. 상기 효과는 m1, m3 및 m5 무스카린성 수용체를 위하여 제시되어 있다 (Bursteun 등, 1995). 수용체가 결합되는 G 단백질의 농도의 증가는 불활성 상태의 수용체의 비율을 증가시키기 위하여 평형을 이동시킨다. G 단백질은 바람직하게는 혼합된 G 단백질이다. 즉, 광범위한 범위의 수용체 류와 커플링한다 (예, G_α15). 구성적 활성의 상기 형태는 본 발명의 추가되는 실시태양과 같이 구성적으로 활성화된 수용체를 생성하는 G 단백질 커플링된 수용체를 상리시키는데 사용될 것이다.

3. 티로신 키나제 수용체

erb-2 프로덕트의 과다발현이 구성적 활성화되었다 (Lonardo 등, 1990). 따라서, 본 발명의 추가되는 실시태양에서 티로신 키나제 수용체의 과다발현은 또한 상기 수용체를 구성적으로 활성화시키는 방법으로서 사용될 것이다.

II. 시험관내 발현계 중으로 구성적 활성 수용체의 트랜스펙션

앞서 언급한 바와 같이, 내생의 구성적으로 활성화된 수용체를 이용할 수 없는 상황에서, 일단 수용체에 대한 유전자 서열 코딩의 조작을 통하여 수용체의 구성적 활성 형태가 조성되면, 본 발명의 방법에서 다음 단계는 특정 수용체 단백질을 생성할 발현계내에 코딩 서열을 위치시키는 것이다. 성공적인 발현계에 대한 시험으로서 또한 세포 매개 수용체 효과를 보기 전에 수용체가 적절하게 발현되는지 확인하는 것이 바람직하다.

A. 표준 기술

인산칼슘 또는 DEAE-덱스트란 매개된 트랜스펙션, 폴리브렌 트랜스펙션, 원형질 융합, 전기영동, 리포솜 및 세포 핵으로의 직접 주입을 포함하여, 배양된 포유 동물 세포 중에 수용체 cDNA를 도입하는 수많은 방법이 당업자들에게 공지되어 있고 이용가능하다. 가장 널리 사용되는 방법은 인산칼슘을 사용하는 트랜스펙션으로, 이는 높은 효율성을 갖는다.

간단하게, 상기 방법은 트립신화에 의해서 배수기의 성장 세포를 수확하는 단계; 이들을 적당한 혈청 함유 배지내에 1 x 10⁵- 2 x 10⁵세포/배양접시의 밀도로 재플래이팅하는 단계를 포함한다. NIH-3T3, HeLa S3, COS 및 CHO 등을 포함하여, 수많은 세포 타입을 사용할 수 있다. 그 후, 배양액을 5-7% C0₂의 대기압, 370 ℃에서 20 내지 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 각 세포의 단일층을 위하여 인산칼슘-DNA 동시침전물을 준비하고; 수용체 cDNA를 약 40 ㎍/ml의 농도로 0.1 M Tris EDTA 완충액 중에 용해시키고, 이 혼합물 220 ㎕를 살균 플라스틱 튜브(예를 들어, Falcon 2509) 튜브내 2 X HEPES 완충된 염수 250 ㎕와 합하고, 2M 염화칼슘 총 31 ㎕를 30 초에 걸쳐서 가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 30 분 동안 인큐베이션한 후, 세포 단일층 위의 배지로 전달하였다. 그 후, 트랜스펙션된 세포를 5-7% C0₂의 대기압, 370 ℃에서 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 상기 배지 및 침전물을 흡출에 의해서 제거하고, 세포층을 인산염 완충된 염수로 1 회 세척하고, 세포를 37 ℃에서 24 시간 동안 더 인큐베이팅하기 전에 예열시킨 완전 성장 배지 5ml을 가한다. 그 후, 안정한 형질변환체를 분리하기 위하여 상기 세포를 적당한 선택 배지에 재플레이팅한다. 본 기술의 표준 참고 문헌[Molecular Cloning, A Laboratory Manual: Vol 3, 16.30, Editors Sambrook, Fritsch and Maniatis, 1989]에 이에 대한 상세한 설명 및 트랜스펙션의 다른 방법을 기재하고 있다.

B. 포스포릴화 분석을 사용한 구성적 활성 수용체의 확인

활성화된 수용체만이 단지 수용체 키나제에 대한 기질이므로 발현계내 구성적 활성을 측정하는 제1의 방법으로서 수용체 포스포릴화를 사용할 것이다. β-아드레날린성 수용체의 활성 상태를 측정하는데 상기 방법을 사용해왔다(문헌[Samama 등, 1993]). 간단하게, 관련 약물의 존재 또는 부재하에 20 mm Tris.HCI, pH 8.0, 2 mM EDTA, 10 mM MgCl, 1 mM 디티오트레이톨, 100 μM [γ-³²P]ATP (~2000 cpm/pmol) 중에서 β-아드레날린성 수용체(30 nM)와 함께 30 ℃에서 20 분 동안 정제된 수용체 제조물을 인큐베이션한다(희귀 수용체에 대해서는 구성적 활성 수용체 및 불활성 수용체간의 기본 포스포릴화 수준에 있어서의 차이를 사용할 것임). 적당한 시기에 동량의 2 X SDS 시료-적가 완충액(8% SDS, 25 mm Tris.HCI, pH 6.5, 10%- 글리세롤, 5% 메르캅토에탄올 및 0.005% 브로모페놀 블루)를 가하여 반응을 중단시킨 후, 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동시킨다. 포스포이메이저(phospoImager)를 사용하여 수용체 결합을 절단하고 계수함으로써 포스포릴화 화학적 정량을 측정하였다.

III. 화합물 효능을 검출하는 제2 메신저(messenger) 분석의 사용

일단 구성적 활성 수용체의 발현 및 활성이 확인되면, 상기 수용체에 대한 유력한 화합물의 화합물 효능을 조사하기 위해서, 상기 수용체 지시된 세포 반응을 검출하는 방법이 가장 바람직하다. 당업자에게 널리 알려진 몇몇 분석법을 약간 변형시켜 사용할 수도 있다. 명세서에 기재된 본 발명은 당업자로 하여금 구성적 활성 수용체에 대한 수많은 유력한 화합물(예를 들어, 화학적 라이브러리)을 스크리닝하게 하므로, 높은 처리량 스크리닝을 수행하는 분석법이 특히 유리하다. 사용할 수 있는 기타 분석법의 예를 하기에 제시한다. 이들 예는 본 방법에서 사용할 수 있는 분석 형태를 제한하는 것이 아니라 예시적인 것으로 생각되어야 한다. 다른 수용체 타입은 다른 분석법을 요구하고, 임의의 일정 수용체에 대해서는 특정 분석법이 다른 분석법보다 더 적당할 수도 있다. 이러한 선택은 불필요한 실험없이 보다 쉽게 결정되고, 당업자가 잘 이해하고 있다.

A. G 단백질 커플링된 수용체

1. GTP 막 결합 & GTP아제 활성

리간드의 존재 및 부재하에 막에 대한 G 단백질 커플링을 모니터하는데 [³⁵S]GTPγS를 사용할 수 있다고 보고되어 있다(문헌[Traynor and Nahorski, 1995]). 상기 분석은 발현 수용체를 갖는 막 위에서 수행한다. 간단하게, 막(단백질 100-200 μg)을 [³⁵S]GTP-γS (80 pM), GDP (3 μM) 및 소분자 약물(10-20 μM)을 함유하는 결합 완충액 (20 mM HEPES, pH 7.4, 100 mM NaCl 및 10 mM MgCI.6H₂0)과 함께 인큐베이션하였다. 상기 분석 수행에 대하여 보고된 용량은 1 ml이지만, O.3-1 ml의 용량이 유용하다. 이를 60 분 동안 30 ℃에서 인큐베이션시킨다. 그 후, 결합된 유리 [³⁵S]GTP-γS를 GF/B 필터를 통하여 진공 여과에 의해서 분리하고, 액체 신틸레이션 계수법에 의해서 정량화할 수 있다. 신틸레이션 신호를 감소시키는 이들의 능력에 의해서 역 아고니스트가 검출된다.

a. 신틸레이션 근접 분석을 위한 GTP 막결합

신틸레이션 근접 분석을 사용하여 수용체에 대한 GTP 결합을 측정하는데 고처리량 스크리닝 분석을 사용할 수 있다. 웰 상에 섬광체 코팅된 플래쉬 플레이트 또는 신티스트립을 사용할 수 있다. 상기 기재된 바과 같이, 결합 분석을 수행할 수 있다. 그러나, 막을 웰의 바닥으로 원심분리시킬 때, 신호를 나타내게 될, 제3 세포내 루프상에 결합된 [³⁵S]GTP-γS가 섬광체와 매우 근접하여 신호를 생성하므로, 바람직하게는 결합된 유리 [³⁵S]GTP-γS를 분리시킬 필요가 있다. 상기 분석을 수행하는 또다른 방법은 플래쉬 플레이트상에 발현 수용체를 함유하는 막을 고정시키는 것이다. 간단하게는, 상기 플레이트를 폴리리신으로 코팅한다. 양으로 하전된 폴리리신은 음으로 하전된 인산기에 결합하여 막을 고정시킨다. 그 후, 임의의 결합된 [³⁵S]GTPγS는 섬광체에 매우 근접해있고 섬광체를 활성화시켜 신호를 생성한다. 또한, 상기 분석을 이러한 신호를 억제하는 화합물(역 아고니스트)을 검출하는데 사용할 수 있다.

분석을 수행하는 또다른 방법은 Con A를 사용하여 막을 고정시키는 것이다. 7 개 막투과 수용체 대부분은 수용체의 세포외 부위상에 발현된 슈가군을 포함한다. Con A는 막의 세포외 측면상에 발현된 슈가군에 결합하여 막을 고정시킬 것이다. 이 때, 상기한 바의 신틸레이션 근접 분석에 의해서 결합된 [³⁵S]GTPγS를 검출할 수 있다.

b. GTP아제 활성

[γ³²]GTP를 갖는 발현 수용체 함유 막을 인큐베이팅함으로써 GTP아제 활성을 측정할 수 있다. 그 후, 신틸레이션 계수법에 의해서 상등액 중에서 유리 [γ³²]GTP가 검출된다(문헌[Hasegawa 등, 1996]). 신호를 감소시키는 이들의 능력에 의해서 역 아고니스트가 검출되고, 신호를 증가시키는 이들의 능력에 의해서 아고니스트가 검출된다.

2. 아데닐레이트 시클라제 및 시클릭 AMP (cAMP) 분석

구성적 활성 수용체와 상호작용하는 약물의 효능을 평가하기 위해서 아데닐레이트 시클라제 분석을 사용할 수 있다. 간단하게, 반응 매질은 포스포크레아틴 5 mM; 크라아틴 키나제 10 U/ml; BSA 0.04%; Tris HCI 50 mM pH 7.4; MgCl₂5 mM; EDTA 0.25 mM; R020-1724 0.12 mM; ATP 0.1 mM; GTP 0.1 mM; 1.5 내지 2.5 μCi/튜브의 [α-³²P]ATP; 슈가 최종 농도 65 mM을 포함한다. 막 현탁액(~50 내지 75 μg 단백질/튜브)을 가함으로써 분석을 개시하고, 상기 분석 혼합물을 31 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션한다(문헌[Maenhaut 등, 1990 & Salamon et al 1974] 참고). 표준 기술 방법에 따라서 표준 cAMP 방사면역분석법 또는 cAMP 결합 단백질을 사용하여 세포내 및 세포외 cAMP를 측정할 수 있다.

3. 전세포(whole cell) 제2 메신저 리포터 시스템

유전자상의 프로모터는 특정 유전자가 코딩하는 단백질의 발현을 유도한다. 시클릭 AMP는 cAMP-반응 DNA 결합 단백질 또는 전사 인자(CREB)의 결합을 촉진시킴으로써 유전자 발현을 유도하고, cAMP 반응 요소라고 불리는 특정 부위의 프로모터에 결합하여 유전자의 발현을 유도한다. 예를 들어, β-갈락토시다제 또는 루시퍼라제일 수 있는 리포터 유전자 앞에 다중 cAMP 반응 요소를 포함하는 프로모터를 갖는 리포터 시스템이 제작될 것이다. 따라서, 활성 수용체는 cAMP의 축적(자극성 G 단백질에 커플링될 경우)을 유발한 후, 리포터 단백질의 유전자 및 발현을 활성화시킨다. 이 때, 표준 생화학적 분석법을 사용하여 β-갈락토시다제 또는 루시퍼라제와 같은 리포터 단백질을 검출할 수 있다(문헌[Chen 등, 1995]). 따라서, cAMP-리포터 작제물을 갖는 안정한 세포계를 제작할 수 있다. 이 후, 활성 수용체 를 상기 세포계 중으로 트랜스펙션시켜 리포터 유전자 발현을 활성화시킬 것이다. 화학 라이브러리로부터 소분자 존재하에 상기 분석을 사용하여, 수용체와 상호작용함으로써 리포터 유전자 발현을 억제하는 화합물을 알아낼 것이고; 이러한 억제제는 본 발명의 방법에 의해서 확인된 역 아고니스트가다.

4. 칼슘 민감성 염료를 사용하는 세포내 칼슘 검출

세포 표면상의 수용체 활성화는 종종 세포내 '유리' 칼슘 수준을 증가시킨다. 세포내의 이러한 칼슘 증가는 푸라(fura) 2와 같은 칼슘 민감성 염료를 사용하는 전세포 분석에서 검출될 수 있다. 임의의 화합물에 의해 유발되는 이러한 신호의 감소는 역 아고니스트 활성을 나타낸다.

5. 즉발성 초기 유전자 유도

초기 유전자 유도 및 발현은 수용체 활성화의 하류 사건이다. c-fos 및 CREB와 같은 전사 인자의 활성화 및 발현은 수용체 활성화 및 약물에 의한 억제를 모니터하는 수단으로서 사용될 것이다. 발현된 CREB 및 c-fos는 항 CREB 및 c-fos 항체에 의해서 검출할 수 있다. 표준 방법에 의해서 이러한 항체를 추가 검출할 수 있으며(예를 들어, 통상적인 퍼옥시다제 검출법을 사용한 항 래빗 양고추냉이 퍼옥시다제 항체), 임의의 화합물에 의해서 유발되는 신호가 감소하는 것은 역 아고니스트 활성을 나타낸다.

6. 세포 증식

G 단백질 커플링된 수용체 및 티로신 키나제의 활성화는 종종 세포를 증식시킨다. [³H] 티미딘의 DNA으로의 흡입력에 의해 세포 증식력을 측정할 수 있다. 이 때, 티미딘 도입의 감소에 의해서 이러한 증식을 차단하는 화합물을 검출할 수 있다. 또한, 세포 증식 및 수용체 활성화의 측정으로서 브로모-데옥시우리딘(BRDU)의 DNA으로의 도입을 또한 사용할 수 있다. 화합물-유도 효과를 측정하는 널리 공지된 방법에 따라서, 신틸레이션 계수법 또는 항-BRDU 항체에 의해서 도입된 BRDU를 검출할 수 있다.

B. 티로신 키나제-수용체

상기 C. I.c., C. l.d. 및 C. I.e. 섹션에서 서술된 바와 같은, 전세포 제2 메신저 리포터 시스템 및 칼슘 민감성 염료를 사용하는 세포내 칼슘 검출을 또한 사용하여 티로신 키나제 활성을 분석할 수 있다.

IV. 구성적 활성 수용체계와 유력한 화합물의 스크리닝

본 발명의 방법은 가장 바람직하게는, 거대한 화학 라이브러리의 고처리량 스크리닝 (HTS)의 현대적 기술로 잘 고안되어 있다. 일반적으로 유력한 약물 후보를 조사할 때 바람직한 것은 높은 생물이용성을 갖는 화합물이다. 최근 조합적 화학 합성법의 발전으로, 생물이용성의 요구를 충족시키는 잠재력을 갖는 작은 유기 화합물의 거대한 라이브러리를 생성하였다. 그러므로, 일단 본 발명의 방법이 알려지고 인식되면, 상기 기술은 수많은 구성적 활성 수용체 발현계를 생산하고 분석하기 위하여 존재하고, 예를 들어, 화학 라이브러리 또는 펩티드 라이브러리(예를 들어, 96 웰 플레이트 포맷)와 같은 고처리량 스크리닝은 간단하다. 그러므로, 본 발명의 방법의 사용은 유용한 치료 화합물을 발견하는 직접적인 방법으로서 매우 유용하다. 이러한 분석 및 스크리닝 수행 방법 중 몇몇 실시예로써 일반적인 접근을 예시하고 있지만, 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.

A. cAMP에 대한 신틸레이션 근접 분석 (SPA)

신틸레이션 근접 분석에 의해 cAMP 생성을 측정함으로써 고처리량 방식으로 구성적 활성 G 단백질 커플링된 수용체를 스크리닝할 것이다. 이를 달성하기 위한 하나의 방법은 항-CAMP 항체를 섬광체로 코팅된 신틸레이션 근접 비드에 결합시키는 것이다. 따라서, 방사표지된 CAMP가 비드에 부착된 항-cAMP 항체에 의해서 결합되었을 때, 이는 섬광체와 매우 근접하게 되고, 이는 활성화된다. 통상적인 결합 분석법과는 달리, 상기 분석법은 용액내 분자들의 근접에 의해서 신호가 순수하게 검출되는 것과 같이, 결합된 "유리" cAMP의 어떠한 분리도 필요로 하지 않는다. 이와 같이, 상기 분석법은 구성적 활성 G 단백질 커플링된 수용체에 대한 소분자 역 아고니스트용 고처리량 약물 스크리닝을 위한 수단을 제공한다.

상기 분석을 수행하는 방법 중 하나의 예는 하기와 같다; 간단하게는, 관심의 수용체를 발현하는 막(총 단백질 5-10 ㎍)을 총 용량 50-300 ul 중, 0.12 mM ATP, [α-³²P]ATP 1-2 x 1O⁶cpm/분석 튜브, 0.10 mM cAMP, 53 μM GTP, 2.7 mM 포스포(에놀)피루베이트, 미오키나제 1.0 IU, 피루베이트 키나제 0.2 IU, 벤즈아미딘 4 ug/ml, 대두 트립신 억제제 2 μg/ml, 류펩틴 2 μg/ml 및 시험 화합물의 다양한농도와 함께 인큐베이션시킨다. 그 후, 시료를 37 ℃에서 15 내지 30 분 동안 인큐베이션시키고, 0.3 mM cAMP, [³H]cAMP 20,000 cpm 및 ATP 0.4 mM를 함유하는 0.5-1 ml의 냉각 용액을 가함으로써 반응을 종결시킨다(문헌[Chidiac 등, 1994]). 구성적 활성 수용체는 [³²P]cAMP의 생성을 촉진시키고, 신틸레이션 비드에 결합된 항-cAMP 항체에 의하여 특이적으로 포획된다. 이는 신틸레이션 계수 후 신호를 나타낸다. 수용체에서 역 아고니스트 활성을 갖는 임의의 시험 화합물은 생성된 [³²P]cAMP의 양을 감소시킬 것이고, 신틸레이션 계수 후 신호의 감소로서 측정될 것이다. 전통적으로, 도웩스(Dowex) 겔 크로마토그래피에 의한 측정을 위하여 [³²P]cAMP를 까다롭게 분리하였다. 신틸레이션 근접 분석은 이전의 분리 기술에 대한 필요없이 cAMP의 신속한 검출을 가능하게 하고, 공지된 구성적 활성 수용체 및 희귀 G 단백질 커플링된 수용체에 대한 역 아고니스트를 위한 화합물 라이브러리의 고처리량 스크리닝을 위하여 이러한 분석을 사용할 수 있다.

이러한 분석법의 또다른 적용은 항 cAMP 항체 대신 cAMP 의존성 결합 단백질에 의해 [³²P]cAMP를 포획하는 것이다. cAMP 의존성 단백질 키나제는 시그마 케미칼사(Sigma Chemical Co.)(St. Louis, MO)로부터 입수할 수 있다. 간단하게는, 돼지 심장으로부터 정제된 cAMP 의존성 단백질 키나제를 신틸레이션 비드에 커플링시킬 것이다. 그 후, 생성되는 [³²P]cAMP는 SPA 비드에 커플링되는 cAMP 의존성 단백질 키나제에 의해서 포획될 것이다. 아머샴(Amersham)은 본 발명의 실시에서 사용될 수 있는 신틸레이션 근접(문헌[Hortaon & Baxendale, 1995])에 의해서 cAMP 측정 시판용 키트를 제조한다.

상기 방법들에 대한 또다른 대안은, 수용체계에 의해 생성되는 표지되지 않은 cAMP의 양을 측정하는 경쟁 결합분석으로서 신틸레이션 근접 분석을 사용하는 것이다. 간단하게는, 상기 조건은 표지된 [³²P]cAMP가 포함되지 않는다는 것을 제외하고는 유사할 것이다. 구성적 활성 수용체는 cAMP를 생성할 것이다. 이러한 cAMP는 방사표지된 cAMP의 극소량 존재하에 cAMP 신틸레이션 근접 분석에 의해서 측정될 수 있다. 따라서, 시료내 cAMP가 많이 존재하면 할수록, 표지되지 않은 cAMP가 신틸레이션 비드상의 cAMP 결합 단백질 또는 항체에 의해서 보다 많이 결합될 것이고, 방사 표지된 cAMP가 적으면 적을수록 비드에 근점하여 신호를 생성할 것이다. 이 후, cAMP 표준 곡선에 대하여 시료를 해석하여 얼마나 많은 cAMP가 생성되었는지 평가할 수 있다.

B. 효소 결합 면역 분석에 의한 cAMP의 측정

구성적 활성 수용체에 의해서 생성된 유리 cAMP는 또한 효소-결합 면역분석법에 의해서 검출될 수 있다(문헌[Horton & Baxendale, 1995)].

C. cAMP 의존성 단백질 키나제 A에 의한 cAMP 측정

단백질 키나제 A는 포스포릴레이트 기질에 대한 보조 인자로서 cAMP를 이용한다. 따라서, cAMP 생성은 또한, 카제인과 같은 포스포릴레이트 기질에 대한 cAMP 의존성 단백질 키나제 A 능력을 모니터함으로써 검출될 것이다.

[γ-³²P]ATP + 카제인은 단백질 키나제 A 및 cAMP의 존재하에 [³²P]카제인 및 ADP로 전환될 것이다. 포스포릴화된 카제인은 필터 디스크상에서 분리할 수 있고, 단백질 결합³²P가 측정된다. 단백질 키나제 A 효소는 존재하는 cAMP가 많을 수록 보다 활성이 되어 기질 카제인의 포스포릴화 정도를 보다 크게 한다. 생성되는 cAMP의 양은 공지된 cAMP 농도의 표준 곡선과 비교하여 평가할 수 있다. 또한, 상기 분석은 카제인과 같은 기질을 SPA 비드에 결합시킴으로써 신틸레이션 근접에 적용될 것이다. 따라서, [³²P]카제인이 많이 생성될수록, 이는 비드에 대한 근접에 의해서 보다 많은 신호가 검출될 것이며, 표준 곡선에 대하여 cAMP의 농도를 계산하는데 사용될 수 있다.

D. RAS 신틸레이션 근접 분석

Ras 종양형성유전자는 MW 21,000의 구아닌 뉴클레오티드 결합 단백질을 코딩한다. 상기 단백질은 신호 전달 경로에서 분자 스위치로서 작용한다. 이는 GDP 형태에서는 불활성인 반면, GTP 형태에서는 하나 이상의 작동 분자와 상호작용하여 신호를 보낸다. Ras 종양형성유전자는 많은 사람의 암에 포함되어 있다. 또한, 티로신 키나제 수용체 및 G 단백질 커플링된 수용체 모두가 Ras 신호화 경로를 이용하는 것으로 나타났다(문헌[Sharif 등, 1994]). 상기 분석은 신틸레이션 근접 분석법을 사용하여, Ras와 또다른 작동 분자, 즉, 네로피브로민(nerofibromin)(NF 1)과의 상호작용을 측정하는 것으로 서술되어 있다(문헌[Skinner 등, 1994]). 따라서, 발현된 티로신 키나제 및 G 단백질 커플링된 수용체 모두를 갖는 막 추출물이 시스템내 재조합 Ras 단백질을 활성화시키는데 사용될 것이다. Ras는 GTP-재생계 존재하에 교환된 뉴클레오티드에 의해서 생성될 수 있는 방사표지된 [³H]-GTP와 결합할 때 활성화된다. 이 후, 방사표지된 Ras를 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST), 융합된 NF1와 항GST 및 단백질 A-코팅된 SPA 비드와 혼합할 때, SPA 신호가 얻어진다. 따라서, Ras가 구성적 활성 수용체에 의해서 활성화되면, 보다 많은 [³H] GTP가 Ras에 결합되고, 그만큼 많은 Ras가 NF1와 복합되어 SPA 신호를 생성할 것이다. 따라서, 본 방법에 따라 소분자의 역 아고니스트는 이러한 신호의 감소에 의해서 검출될 것이다.

종양형성 Ras 단백질, 예를 들어, L-61 Ras는 Ras GAP (또다른 작동 분자)에 결합하지만, 이들의 GTP아제 활성은 촉진되지 않는다(통상적으로, GAP에 결합시, GTP는 GDP로 가수분해됨). 이는 명백하게, 구성적 유사분열촉진 신호 또는 형질변형 신호를 생성한다. 따라서, GTP 농도를 측정하기 위하여 종양형성 Ras가 높은 친화성 GTP 결합 단백질로서 사용될 것이다. 예를 들어, 구성적 활성 수용체에 커플링된 G 단백질에 의해서 가수분해되는 GTP 양은 Ras 결합에 의해서 측정될 것이다. 이를 수행하는 방법 중 하나의 예는 Ras의 종양형성 형태를 SPA 비드에 커플링시키는 것이다. 구성적 활성 수용체에 의해서 가수분해된 방사표지된 GTP가 많으면 많을 수록, SPA 비드에 커플링된 Ras에 의해서 보다 적게 결합될 것이다. 따라서, 구성적 활성 수용체가 많으면 많을수록 SPA 신호는 보다 적게 검출된다. 이와 같이, 이러한 시스템에서 소분자의 역 아고니스트는 G 단백질 커플링된 수용체계의 GTP아제 활성을 저해하기 때문에, SPA 신호의 증가에 의해서 검출된다. 따라서, G 단백질 커플링된 수용체에 의한 GTP 가수분해 지수를 측정하기 위하여, 종양형성 Ras 결합 단백질을 이용하는 신틸레이션 근접 분석을 사용할 것이고, 이는 소분자의 역 아고니스트의 고처리량 스크리닝을 위한 방법을 제공한다.

V. 본 발명의 바람직한 용도

본 발명은 사람 질병 치료에서 매우 중요한 치료학적 분자의 발견을 크게 촉진시킨다. 본 발명의 가장 큰 특징은 수용체에 대한 내생 또는 합성 리간드의 임의의 사전 지식없이도 수용체 기능 조절자를 확인할 수 있다는 것이다. 이는 특히 희귀 수용체에서 중요하고, 본 발명의 방법은 특히 희귀 수용체과 함께 사용하도록 고안되어 있다. 희귀 수용체에 대한 내생 리간드가 알려져 있지 않을 뿐 아니라 통상적으로 구성적 활성 변이도 확인되지 않았다. 화합물 라이브러리의 적당한 고처리량 스크리닝은 수용체 아고니스트 및 역 아고니스트 모두를 확인하게 할 것이다.

본 발명의 방법에서 희귀 수용체에 대한 현재 나타나는 유전적 정보에 대하여 캐피탈화(capitalization)하는 능력에 더하여, 공지된 수용체에서 이러한 기술을 사용하여 개발된 약물은 전통적인 리간드 기재 스크린을 사용하여 개발된 약물에 비해 뚜렷한 치료학적 잇점을 갖는 것으로 의도된다. 리간드 기재 스크린은 단지 수용체 상의 리간드의 작용을 "길항하는" 화합물을 확인함으로써 리간드-유도 수용체 활성화를 억제한다.

그러한 화합물 또는 길항물질은 리간드 의존성 수용체 활성화 및 후속되는 세포 반응을 차단하지 않는다. 한편, 본 발명을 사용하여 확인된, 구성적 활성 수용체에 작용하는 역 아고니스트 약물은 리간드 의존성 및 리간드 독립성 수용체 활성화 모두를 차단한다. 본 발명의 방법에 의해서 확인된 화합물(약물)의 이러한 특성은 구성적 활성 G 단백질 커플링된 수용체와 연관된 질병에 크게 적합한데(표 1), 이는 전통적인 길항물질이 이러한 활성을 차단하지 않기 때문이다.

아는 바와 같이, 본 발명의 방법을 사용하여 발견된 역 아고니스트는 수용체의 구성적 활성화를 특징으로 하는 다양한 질병 및 장애 치료를 위한 치료제로서 유용성을 갖는다. 본 명세서에 기재된 방법의 일반적인 적용은, 당업자로 하여금 불필요한 실험없이 예를 들어, 당업자에게 공지된 방법에 의해서 작제된 화학적으로 다양한 화합물 라이브러리의 통상적인 고처리량 스크리닝을 이용함으로써 가장 바람직하게는 필요한 역 아고니스트 활성을 갖는 유력한 화합물들을 직접 확인할 수 있게 한다. 따라서, 이러한 역 아고니스트는 본 명세서에 기재된 방법을 직접 사용함으로써 직접 확인되지만, 예를 들어, 내생 리간드의 확인을 먼저 요구하는 통상적인 방법과 같이 다른 방법에 의해서는 쉽게 확인될 수 없다. 이러한 직접 확인된 역 아고니스트는 수용체의 구성적 활성화를 특징으로 하는 질병 및 장애 치료에 유용하다. 1 회 투여량 및 제제화를 포함하여, 약제학적 조성물로서 본 발명의 화합물을 투여하는 적당한 방법은 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 약제학적 조성물의 투여 방법은, 치료되어야 할 의학적 질병 뿐 아니라 환자의 일반적 건강 상태에 따라 다를 것이며, 이러한 인자들은 당업자의 범위에 속한다.

예를 들어, 그레이브스병에 있어서, 갑상선내 구성적 활성 TSH 수용체를 직접 차단하는 것들을 확인하는 유력한 화합물을 본 발명으로 직접 확인할 수 있고, 따라서 외과 제거술 또는 방사성 요오드 붕괴에 대한 필요를 없애거나 줄인다. 따라서, 보다 새롭고 보다 효과적인 치료법에 대한 기초를 제공한다. 남자의 숙성된 발정에서 발정의 심도는 구성적 LH 수용체 활성도와 직접 관련되는 것으로 보인다. 본 발명의 방법은 구성적 활성 LH 수용체에 대한 역 아고니스트의 직접 확인에 직접 사용될 수 있다. 본 발명은 본 명세서에서 앞서 논의된 구성적 활성 수용체 질병의 치료를 위한 역 아고니스트인 화합물을 직접 확인하기 위한 유사법을 제공한다.

본 발명의 또다른 중요한 용도는 카포시(Kaposi) 육종에서 암세포 성장을 유발시키고 HIV 감염된 개인에게서 자주 발견되는 감마 헤르페스 바이러스 감염된 구성적 활성 G 단백질 커플링된 수용체에 대한 역 아고니스트를 확인하는 것이다. 감염된 수용체에 대한 내생 리간드는 알려져 있지 않기 때문에, 희귀 수용체에 대한 역 아고니스트를 확인하는 방법을 제공하는 것이 본 발명의 유용성 중 하나의 예이다. 카포시 육종은 아고니스트 또는 길항물질조차도 암유발 활성 수용체를 역전시킬 화합물을 생성하지 않는다고 알려진 좋은 본보기를 제공한다. 그러나, 본 발명의 방법은 꼭 필요한 화합물, 역 아고니스트를 스크리닝하도록 고안되어 있다.

구성적 활성 수용체와 관련된 두 개의 주목할만한 정신병은 정신분열증(도파민 D4 수용체의 과다 발현) 및 우울증(세로토닌 5-HT2A 수용체의 과다 발현)이다. 활성 수용체에 대한 역 아고니스트는 유익한 치료제가 될 것이다. 구성적 활성 티로신 키나제 질병 관련 수용체 뿐 아니라 다른 타입의 수용체에도 본 발명의 방법과 함께 역 아고니스트를 확인하는 동일한 방법을 사용할 것이다. 또한, 보다 많은 희귀 수용체의 기능이 알려질수록 이러한 수용체의 구성적 활성 형태와 관련된 보다 많은 사람의 질병이 인식될 것으로 기대된다.

또한, 본 발명의 방법은 공지된 희귀 수용체에 대한 역 아고니스트로서 활성을 나타내는 지를 결정하는 공지된 약물 스크리닝에 유용한 것이 명백하다. 또한, 상기 구성적 활성 수용체에 대한 방법은, 구성적 활성 수용체를 발현하는 형질생성 및(또는) 유전자-표적 동물을 생산하는데 사용하기 위한 수용체를 활성화시키는데 사용될 것이다. 이러한 비-사람 동물을 사용하여, 수용체(희귀 수용체의 경우)의 생리학적 기능을 결정하고, 또한 수용체에 작용하는 임의의 화합물의 생리학적 효과를 발견하거나 특성화하는 변형 수용체 기능의 생리학적 효과를 측정할 것이다. 본 발명의 설명의 부가적인 용도는 본 발명의 기술 및 범위내에 속하는 것으로 생각된다.

본 발명의 상이한 실시태양은 다른 구성적 활성 수용체, 다른 발현계 및 다른 분석법으로 이루어질 것이다. 당업자는 어떠 수용체를 어떤 발현계와 분석법을 사용할 것인지 이해할 것이다. 이들 모든 것이 본 발명의 교시의 범위에 속하는 것으로 생각된다. 또한, 당업자는 본 발명의 취지에서 벗어나지 않으며서, 본 명세서에 제시한 예시적인 실시예에 다양한 변형, 부가, 치환 및 변화를 줄 수 있고, 이들은 본 발명의 범위내에 속한다는 것을 알고 있을 것이다.

<실시예 1>

선 및 점 변이에 의한 비-내생 구성적 활성 사람

세로토닌 5-HT_2CG 단백질 커플링된 수용체

1990년 코테키아(Cotecchia) 등은 막투과 도메인에 인접한 제3의 세포내 루프에 있는 아미노산 293 개의 변이에 의해서 햄스터 α_1B-아드레날린성 수용체가 구성적으로 활성될 수 있다는 것을 입증하였다. 후속해서, 앞서 알 수 있는 바와 같이, 키엘스버그(Kjelsberg) 등은 293 개 위치에서 가능한 19 개 아미노산 치환 결과, 다양하게 구성적 활성을 부여한다는 것을 입증하였다. 최근, 테이틀러(Teitler) 등은 α_1B-아드레날린성 수용체의 293 위치와 유사한 수용체의 아미노산 위치가 변이되는 경우(5HT_2A에서는 322 및 5-HT_2C에서는 312), 래트 세로토닌 5-HT_2A및 5-HT_2C수용체가 구성적 활성될 수 있다는 것을 입증하였다. 사람 세로토닌 5-HT_2A및 5-HT_2C수용체에 대한 서열이 공지되어 있지만, 지금까지 사람 수용체가 구성적으로 활성될 수 있다는 것을 나타내는 증거는 없다.

사람 5-HT_2A및 5-HT_2C세로토닌 수용체는 세린에서 리신까지 사람 5-HT_2C수용체(S310K)의 유사 위치(310)에서 아미노산을 변이시킴으로써 구성적으로 활성화되어 왔다. 사람 5-HT_2C수용체의 구성적 활성화를 입증하기 위하여 몇몇 방법을 사용하였다. 구성적 활성화의 하나의 표시는 구성적 활성 수용체가 고유 수용체 보다 내생 리간드에 대하여 보다 더 높은 친화성을 갖는다는 것이다. 도 4는 변이된 사람 5-HT_2C수용체가 고유 수용체의 친화성에 비하여 세로토닌에 대해 보다 증가된 친화성을 는 것을 나타낸다. 구성적 활성화의 또다른 표시는 내생 리간드의 부재하에 제2 메신저 경로에서 관찰되는 증가된 활성이다. 도 5는 변이된 수용체가 내생 수용체에 관하여 이노시톨 트리포스페이트의 증가된 세포내 축적을 생성한다는 것을 나타낸다. 마지막으로, 도 6에서 5-HT_2C수용체의 구성적 활성화는 변이된 수용체의 증가된 [³⁵S]GTPγS의 결합에 의해서 나타내진다.

<실시예 2>

GTP 막 결합 신틸레이션 근접 분석

및 구성적 활성 수용체를 확인하는데 있어서 이의 용도

G 단백질 커플링된 수용체가 활성 상태에 있을 때, 리간드 결합 또는 구성적 활성화 중의 하나의 결과로서, 수용체는 막 단백질 (G 단백질이라고 부름)에 결합하고, GTP의 G 단백질에의 결합을 촉진시킨다. 삼량체인 G 단백질-수용체 복합물질은 GTP아제로서 작용하고, GTP를 GDP로 서서히 가수분해시키고, 이 때 통상적으로 수용체는 불활성화된다. 그러나, 구성적 활성 수용체는 GDP를 GTP로 계속 교환시킨다. 구성적 활성 수용체를 발현시키는 막에 대한 [³⁵S]GTPγS의 증가된 결합을 비가수분해성 GTP 동족체, [³⁵S]GTPγS를 이용하여 입증할 수 있다. [³⁵S]GTPγS 결합을 측정하는 분석은 변이된 사람 세로토닌 5-HT_2C수용체의 구성적 활성화를 확인하는 것으로 나타내진다. 구성적 활성화를 측정하는데 [³⁵S]GTPγS 결합을 이용하는 것의 장점은 (a) 일반적으로, 모든 G 단백질 커플링된 수용체에 적용가능하다는 것; (b) 세포내 캐스캐이드에 영향을 주는 분자를 보다 덜 픽업(pick-up)하도록 막 표면에서 근접하다는 것이다.

상기 분석은 관련 수용체를 발현하는 막에 대한 [³⁵S]GTPγS 결합을 자극하는 G 단백질 커플링된 수용체의 능력을 이용한다. 그러므로, 상기 분석은 공지된 희귀 및 구성적 활성 G 단백질 커플링된 수용체에 대한 유력한 화합물을 스크리닝하는 직접 확인 방법에 사용될 수 있다. 상기 분석은 일반적이며, 모든 G 단백질 커플링된 수용체에서 약물 발견에 사용된다.

도 7은 COS 세포에서 발현된 천연 사람 5-HT_2c수용체를 발현하는 막에 대한 [³⁵S]GTPγS 결합을 모니터하는 신틸레이션 근접 분석의 유용성을 입증한다. 간단하게, 상기 분석은 20 mM의 HEPES pH 7.4 결합 완충액, 0.3 nM [³⁵S]GTPγS 및 12.5 ㎍의 막 단백질 및 1 μM GDP 중에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 이 후, 맥아 응집소 비드(25 μl; Amersham)를 가하고, 상기 혼합물을 실온에서 30 분 동안 더 인큐베이션하였다. 튜브를 실온에서 5 분 동안 @ 1500 X g에서 원심분리시키고, 신틸레이션 계수기에서 계수하였다. 도 7에서 볼 수 있는 바와 같이, 내생 리간드로서 5-HT_2A수용체를 활성화시키는 세로토닌은 농도 의존 방식으로 막에 대한 [³⁵S]GTPγS 결합을 자극하였다. 5-HT_2A길항물질로 분류되지만 또한 역 아고니스트로 알려져 있는 30 μM 미안세린(mianserin)에 의해서 자극된 결합이 억제되었다. 상기 분석은 막에 대한 아고니스트 유도된 [³⁵S]GTPγS의 결합을 측정하지만, 통상적으로는, 수용체의 구성적 활성을 측정하는데 사용할 수 있다. 그러나, 현재 맥아 응집소 비드의 가격이 엄청나게 비싸다.

보다 덜 비싸지만 동일하게 사용할 수 있는 대안법을 찾았고, 이는 대규모 스크리닝의 필요를 만족시킨다. 플래쉬 플레이트 및 왈랙(Wallac)(상표명) 신티스트립을 사용하여 고처리량 [³⁵S]GTPγS 결합 분석을 포맷할 수 있다. 또한, 이러한 기술을 사용하여, [³⁵S]GTPγS 결합을 통한 효능을 모니터하는 것과 동시에 수용체에 대한 트리튬화된 리간드 결합을 모니터하는데 상기 분석을 이용할 수 있다. 왈랙 베타 계수기가 트리튬 및³⁵S 표지된 프로브 모두를 보는 에너지 윈도우를 스위치할 수 있기 때문에 이것이 가능하다. 또한, 상기 분석은 수용체를 활성화시키는 다른 타입의 막 활성화를 검출하는데 사용할 수 있다. 예를 들어, 다양한 수용체(커플링된 G 단백질 및 티로신 키나제 수용체 모두)의³²P 포스포릴화를 모니터하는데 사용할 수 있다. 막을 웰 바닥으로 원심분리시킬 때, 결합된 [³⁵S]GTPγS 또는³²P 포스포릴화 수용체는 웰에 코팅된 섬광체를 활성화시킬 것이다. 이러한 원리를 입증하는데 신티스트립(왈랙)을 사용해왔다. 또한, 상기 분석은 방사활성 표지된 리간드를 사용하여 수용체에 대한 리간드 결합을 측정하는데 사용한다. 유사한 방식으로, 방사표지된 결합 리간드를 웰의 바닥으로 원심분리시킬 때 신티스트립 라벨은 방사표지된 리간드와 근접하게 되어 활성화되며 검출된다.

[³⁵S]GTPγS 분석 결과는 수용체의 전통적인 제2 메신저 분석에서 얻어진 결과와 유사하다. 도 8에서 볼 수 있는 바와 같이, 세로토닌은 사람 5-HT_2C수용체에 대한 [³⁵S]GTPγS 결합을 자극한다. 예상되는 바와 같이, GDP의 부재하에서 아고니스트 반응은 없으며, 그 이유는 [³⁵S]GTPγS(데이타를 도시하지 않음)에 대하여 교환하기 위해서 존재하는 GDP가 없기 때문이다. 이러한 분석 시스템은 천연 5-HT_2C수용체의 반응을 입증하는데 효과적일 뿐 아니라, 또한, 다른 수용체의 구성적 활성화를 측정하는데 효과적이다. 도 9는 단독 조절 벡터, 천연 사람 5-HT_2C수용체 또는 S310K 구성적 활성 돌연변이 사람 5-HT_2C수용체를 발현하는 293T 세포로부터 제조된 막에 대한 [³⁵S]GTPγS의 증가된 결합을 입증한다. 상기 분석에서 사용되는 총 단백질 농도는 각 수용체에 대한 [³⁵S]GTPγS 결합 총량에 영향을 준다. 도 9에서 볼 수 있는 바와 같이, CMV 트랜스펙션된 수용체와 구성적 활성 돌연변이 수용체 간의 c.p.m. 차이는 10 μg/웰에서 약 1000 c.p.m 내지 75 μg/웰에서 약 6000-8000 c.p.m.의 단백질 농도를 증가시켰다. S310K 돌연변이 수용체는 가장 높은 수준의 구성적 활성화가 기준 이상의 [³⁵S]GTPγS 결합 증가를 나타내는 야생 타입 수용체에 의해서 수행되었음 보여주었다. 이러한 예시는 5-HT 자극의 부재하에 세포내 IP₃를 축적하는 천연 사람 5-HT_2c수용체의 능력과 일치하고, 또한 천연 사람 5-HT_2c수용체는 높은 고유의 기초 활성을 갖는다고 주장하는 보고 데이타와 일치한다. 따라서, 사람 5-HT_2c수용체의 S310K 변이는 막 경계면에서 근접 [³⁵S]GTPγS 결합 사건에 의해 구성적 활성을 측정할 수도 있음을 명백하게 예시한다. 세로토닌 자극시, 내생 및 비내생(S310K) 수용체 모두가 자극되어 보다 많은 [³⁵S]GTPγS를 결합한다.

<실시예 3>

LVIP2.OZc 세포에서 Gal4 수용체 분석 및

활성 수용체를 확인하는데 있어서 이의 용도

다중 Gal4 결합 부위를 함유하는 β-갈락토시다제 리포터를 생성하기 위해서, Bgl II/ HindIII 단편을 소마토스타틴 프로모터-함유 플라스미드 1.4(5xGal)CAT([문헌[Leonard, J. et al (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:6247-6251]로부터 떼내고, pβgal-Basic(Promega)중에 클로닝하였다. Bgl II/ HindIII 단편은 cAMP 반응 요소의 코어 4bp(-46 내지 -43)를 효모 전자 인자 Gal4에 대한 인식 서열 5 코피로 대체시키는 최소 소마토스타틴 프로모터(전사 출발 부위에 대하여 -71 bp 내지 +50 bp)의 변이체를 함유한다. 상기 리포터가 Gal4-CREB 융합 단백질을 코딩하는 발현 플라스미드로 동시 트랜스펙션되는 경우, cAMP 신호화 경로를 증가시키는 제제에 대하여 매우 반응적이다.

VIP2.OZc는 cAMP 반응 VIP 프로모터 조절하에 리포터 유전자 β-갈락토시다제로 안정하게 트랜스펙션된 세포계이다(문헌[Konig 등, Molecular 및 Cellular Neurosciences 1991, 2, 331-337]). 상기 세포계는 세포내 cAMP 축적을 간접적으로 측정하는데 사용된다. 트랜스펙션 전날, 약 2 밀리온 세포를 6 cm 플레이트내에 플레이팅하였다. 각 리포터 당 DNA (5 μg)를 2.5 ml의 무혈청 DMEM 함유 200 μg/ml DEAE 덱스트란 및 100 μM 클로로퀸과 혼합하고, 린스시킨 세포 단일층에 가하였다. C0₂인큐베이터 내에서 90 분 동안 인큐베이션한 후, 트랜스펙션 배지를 제거하였다. 세포를 무혈청 배지로 세척하고, 신선한 완전 배지로 보충하였다. 트랜스펙션 24 시간 후 세포를 웰 당 50 - 100 K의 밀도로 96 웰 플레이트에 재플레이팅하고, 트랜스펙션 48 내지 72 시간 후 β-갈락토시다제 활성을 분석하였다. 밤새 세포에 노출 후 화합물을 시험하였다.

분석 완충액은 100 mM 인산나트륨, 2 mM MgSO₄0.1 mM MnCl₂, pH 8.0를 함유하였다. 상기 세포를 PBS로 세척하고, 0.1 X 분석 완충액으로 이루어진 저장성의 분해 완충액 25 μl/웰을 가하였다. 10 분 후, 0.5 % 트리톤(Triton) X-100 및 40 mM β-메르캅토에탄올을 함유하는 분석 완충액 100 μl을 각 웰에 가하고, 실온에서 10 분 동안 계속 인큐베이션하였다. 분석 완충액 중 5 mg/ml의 클로로페놀 레드-β-갈락토피라노시드(CPRG) 기질 용액을 25 μl/웰로 가하고, 상기 플레이트를 37 ℃에서 30 분 동안 인큐베이션한 후, 플레이트 리더를 사용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하였다.

<실시예 4>

내생, 구성적 활성 희귀 수용체, 그의 동족체,

조직 분포, 및 역 아고니스트의 직접 확인

본 명세서에 기재된 방법학적 능력을 하기 GPR3를 사용하여 입증하였다. GPR3는 그의 내생 형태에서 구성적 활성인 것으로 공지된 G 단백질 커플링된 희귀 수용체이다(문헌[Eggerickx, D. 등, (1995)]).

도 10을 보면, 실시예 2의 [³⁵S]GTPγS 결합 분석계를 사용하여, 대조구와 비교하여 GPR3 수용체는 증가된 활성을 갖는 것으로 측정되었고, 상기 테이타가 전 세포 제조물과는 반대되는 막 제조물로부터 얻어졌다는 점에서 이러한 높은 활성은 오토크린 자극의 결과는 아니다. [³⁵S]GTPγS 결합 분석계(막 단백질 75 μg/웰[즉, GPR3을 발현하는 293T 세포]를 1 시간 동안 12 nM [³⁵S]GTPγS 및 1 μM GDP와 함께 인큐베이션시킴)사용하는 도 11에 나타낸 바와 같이, 구성적 활성 수용체 GPR3 뿐 아니라 그의 활성 수준은 변이된 사람 5-HT_2A수용체에 필적할 만하다.

GPR3이 구성적 활성 수용체임을 확인한 후, "도그마" 접근에서 약물 확인까지 제1의 큰 분기(divergence)를 사용하였고, 이러한 분기는 단지 본 발명의 결과로서 가능하다. 이용가능한 G 단백질 커플링된 데이타 은행(유전자 은행)의 상동성 연구는 시판 프로그램 DNA 스타(Star)를 사용하여 2 개의 높은 상동성의 수용체, 즉 GPR6 및 GPRI2를 확인하였다(도 2 참조). 이러한 두 수용체는 희귀 수용체이다. 이러한 수용체의 서열은 이전에 "공지된" 것이고(즉, 이들은 데이타베이스상에서 이용할 수 있음), 이러한 2 개 수용체는 이들의 내생 형태에서 구성적 활성인 것이 알려져 있지 않았다(도 13). 더우기, 리간드가 알려져 있지 않다라는 점에서 약물 발견 프로그램에서 사용하기 위한 이러한 수용체에 대하여 연구할 근거가 없었다. 이와 같이, 약물 발견에 대한 도그마 접근은 기껏해야 적은 관심의 또는 거의 관련없는 GPR3, GPR6 및 GPR12 사이의 상동성을 발견할 것이다.

GPR3, 즉, GPR6 및 GPR12 2 개의 희귀 동족체의 발견 후, 도그마 접근에서 약물 발견까지 제2의 큰 분기를 다시 사용하였고, 이러한 분기는 본 발명의 결과로서 유일하게 가능하다. 하기 프라이머를 사용하여, 상대적인 RT-PCR에 의한 이러한 희귀 수용체의 발현을 위한 조직 시료를 조사하였다:

GPR3:

5'-CTGGTCCTGCACMGCTGC-3'

5'-AGCATCACATAGGTCCGTGTCAC-3'

이러한 프라이머는 194bp 단편을 증폭시킨다.

GPR6:

5'-ACCAGAAAGGGTGTGGGTACACTG-3'

5'-GGAACGAAAGGGCACTTTGG-3'

이러한 프라이머는 249bp 단편을 증폭시킨다.

GPRI2:

5'-GCTGCCTCGGGATTATTrAG-3'

5'-GCCTATrAGCAGGAACATGGGTG-3'

이러한 프라이머는 220bp 단편을 증폭시킨다.

이러한 앰플리콘(amplicon)은 오버랩핑되지 않도록 즉, 이들 사이에 유사한 서열이 없고, 유사한 Tm을 가지도록 고안되어, 각 프라이머쌍은 동일한 최적 어닐링 온도에서 그의 각 표적을 증폭시킨다. 이는 복합 반응에서 하나의 프라이머쌍으로부터의 앰플리콘이 다른 프라이머에 대하여 어닐링 표적으로서 작용할 기회를 줄이므로 다른 프라이머쌍과의 간섭의 기회가 감소한다.

제조업자의 지시에 따라서, TRIzol(상표명) 시약 (Gibco/BRL)을 사용하여 총 RNA를 조직 시료(사람)로부터 추출하였다. 총 RNA 2 mg 및 퍼스트-스트랜드(First-Strand)(상표명) cDNA 합성 키트(Pharmacia)를 사용하여 cDNA를 제조하였다. 그 후, cDNA 시료를 물 중에서 1:3으로 희석하고, 상대적인 PCR를 [³²P]dCTP 존재하에 기재된 바와 같이 수행하였다 (문헌[Jensen, J. 등, (1996) J. Biol. Chem. 271:187490]). 모든 반응은 300bp 단편을 증폭시키는 SP1-특정 프라이머를 포함하였고, 이는 내부 조절로서의 역할을 한다. 상기 기재한 프라이머를 사용하여, 정의된 PCR 조건 하에서 (1 cycle: 95 ℃, 5 분; 23 사이클: 95 ℃, 30 초, 58 ℃, 30 초, 72 ℃, 1 분; 1 사이클: 72 ℃, 10 분) 신뢰할 만하고, 정량적으로 정확한 결과를 얻었다. 또한, 선택된 프라이머쌍은 복합시 서로간에 간섭하지 않았음을 확인하였다. 겔 전기영동(7M 우레아, 5% 폴리아크릴아미드(Long Ranger(상표명) Solution, AT Biochemial, 0.6 XTBE)을 변성시키고 후속해서 방사능사진에 의해서 PCR 생성물을 시각화하였다.

도 14A, 14B, 및 14C는 사람 조직의 GPR3, GPR6 및 GPR12의 분포를 나타낸다. 상기 정보는 이러한 조직과 관련된 질병 상태를 조사하는 것 뿐 아니라 이러한 발현이 우세한 상기 조직내 특정 영역을 결정하는 것을 가능하게 하여 상기 수용체 발현과 특정 질병 상태의 상호관계를 나타낸다. 이는 상기 수용체에 대한 내생 리간드를 이해하거나 알 필요없이 수용체에 영향을 주는 화합물의 직접 확인을 가능하게 한다. 또한, 스크리닝 결과, RT-PCR 분석에서 입증된 바와 같이 대조구와 비교하여 조직 시료(조직원: 측두골 피질)에서 보다 높은 수준으로 발현되는 것이 밝혀졌다(도 15). 다시, 도그마 접근하에, 본 발명, 이러한 정보가 기껏해야 아마도 중요하지만 관련없는 데이타로서 생각될 때까지라는 점에서 이와 같은 실험을 수행하는 것이 그리 합리적이지는 않을 것이다.

따라서, 3 개의 내생의 구성적 활성 수용체 내생 리간드의 지식없이도, 본 발명은 가장 바람직하게는 이들 희귀 수용체에 대한 역 아고니스트를 직접 확인하는 유력한 화합물의 스크리닝을 위한 합리적인 근거를 제공한다.

β-갈락토시다제계를 사용하여, 720개의 유력한 화합물(Tripos, Inc.)을 GPR6 수용체에 대하여 스크리닝하고, 74 개의 유력한 화합물을 GPR3 수용체에 대하여 스크리닝하였다. 이들 화합물을 세포상에서 밤새 인큐베이션하였다. 이들 중, 2 개의 화합물은 GPR3 수용체에 대한 역 아고니스트인 것으로서 직접 확인되었고(P44 및 P45, 도 16), 13은 GPR6 수용체에 대한 역 아고니스트인 것으로 확인되었다(P3, P13, P15, P18, P20, P32, P33, P36, P55, P66, P67, P69 및 P70, 도 17).

상기 데이타는 본 발명이 내생 리간드가 알려지지 않은 수용체에 대하여 효과적으로 또한 효율적으로 역 아고니스트를 직접 확인한다는 것을 뒷받침하였다. 이러한 기술, 특정 조직에서의 희귀 수용체의 분포의 상관성 및(또는) 특정 질병과 상기 수용체 존재와의 상관성은 상기 질병을 위한 약제학적 조성물의 개발에 대한 합리적인 접근을 가능하게 한다.

A-1

부록 "A"

리간드 기재의 수용체 스크린에 의해서 발견된 약물 및 비-펩티드의 예

약물/비-펩티드	스크리닝용 방사표지	참고문헌	표적 수용체
잔탁	[3H]-히스타민	1	히스타민 H2
타가멧	[3H]-히스타민	1	히스타민 H2
셀단	[3H]-히스타민	1	히스타민 H1
벤톨린	[3H]-노르아드레날린	2	아드레날린성 β2
아테놀올/테네르민	[3H]-아드레날린	2	아드레날린성 β1
프로파놀올/인데랄	[3H]-노르아드레날린	2	아드레날린성 β1/β2
프라조신	[3H]-아드레날린	3	아드레날린성 α2B/2C
이소프로테레놀/이소르딜	[3H]-노르아드레날린	2	아드레날린성 β1/β2
노레피네프린/레보페드	[3H]-아드레날린	2	아드레날린성 α1/2, β1/2/3
이미트렉스	[3H]-5HT	4	세로토닌 5HT-1D
부스파르	[3H]-5HT	4	세로토닌 5HT-1A
네파조돈	[3H]-케탄세린	5	세로토닌 5HT-2A
토라진	[3H]-도파민	6	도파민 D2
클로자핀	[3H]-도파민	6	도파민 D2
코데인	[3H]-β엔돌핀	7	오피오이드 수용체
모르핀	[3H]-β엔돌핀	7	오피오이드 수용체
메타돈	[3H]-β엔돌핀	7	오피오이드 수용체

A-2

<참고 문헌>

A-3

A-4

B-1

부록 "B"

판랩스(PANLABS) 리간드 수용체 분석 목록:

판랩스 및 노바스크린(Novascreen)과 같은 약물 스크리닝 실험실은 상이한 수용체 표적을 나타내는 약물 특이성을 조사하는 서비스를 제공한다. 방사 리간드 수용체 결합 분석법의 목록을 하기에 제시한다. 이러한 정보는 http://www.panlabs.com/prod/a-pharm-asy-1stO.html의 월드 와이드 웹상에서 발견할 수 있다.

방사 리간드 결합 분석

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이 섹션을 숙지하십시오

우리의 표준 방법은 초기 추천한 농도에서 2 개의 동일 시료로 분석하는 것이고; 활성(50 %)이면, IC50 ± SEM... (n=34 튜브)을 결정하기 위하여 농도 반응을 수행한다. 다른 시험 선택을 하기에 기록한다.

1) 주요 스크리닝 및 정량 분석(활성 화합물만):

방사리간드 결합 분석에서 IC50 ± SEM, Ki, nH; 효소 분석에서 IC50 ± SEM, 분석당 n=34 튜브

2) 주요 스크리닝 및 정량 분석: (10-5 M 및 확인;10-6, 10-7, 10-8 M), 분석당 n=10 튜브

3) 3점 주요 스크린: (10-5, 10-7, 10-9 M), 분석당 n=6 튜브

4) 주요 스크린 단독: (10-5 M), 분석당 n=2 튜브

$/튜브

아데노신

A1 (래트) $30

A2 (래트) $30

A3 (사람) $50

흡입 트랜스포터 (귀니아 피스) $40

아드레날린

알파1A (사람) $50

알파2B (래트) $30

알파1, 비선택적(래트) $30

알파2A (사람) $50

B-2

알파2B (래트) $30

알파2C (사람) $50

알파2, 비선택적 (래트) $30

베타1 (사람) $50

베타2 (사람) $50

베타3 (사람) $50

베타, 비선택적 (래트) $30

노레피네프린 트랜스포터 (래트) $40

안지오텐신

AT1 (래빗) $40

AT2 (래빗) $40

심방 나트륨배설증가 인자 (귀니아 피그) $30

봄베신 (래트) $40

브라디키닌

B1 (사람) $50

B2 (귀니아 피그) $40

칼시토닌 (사람) $40

칼시토닌 유전저 관련 펩티드 (래트) $40

Ca2 + 채널

타입 L, 벤조티아제핀 (래트) $30

타입 L, 디히드로피리딘 (래트) $30

타입 L, 페닐알킬아민 (래트) $30

타입 N (래트) $40

칸나비노이드(Cannabinoid)

CB1 (사람) $50

CB2 (사람) $50

콜레시스토키닌(Cholecystokinin)

CCKA (사람) $50

CCKB (사람) $50

콜린 트랜스포터 (래트) $40

도파민

D1 (사람) $50

D2S (사람) $50

B-3

D3 (사람) $50

D4.2 (사람) $50

D4.4 (사람) $50

D4.7 (사람) $50

D5 (사람) $50

트랜스포터 (래트) $40

엔도텔린

ETA (래트) $40

ETB (사람) $50

표피 성장 인자 (사람) $40

에스트로겐 (소) $40

GABA 트랜스포터 (래트) $40

GABAA

아고니스트 부위 (래트) $30

벤조디아제핀, 중심 (래트) $30

벤조디아제핀, 주변 (래트) $30

클로라이드 채널, TBOB (래트) $40

GABAB (래트) $30

갈라닌 (래트) $40

글루코코르티코이드 (사람) $40

글루타메이트

AMPA (래트) $30

카이네이트(Kainate) (래트) $30

NMDA, 아고니스트 부위 (래트) $30

NMDA, 글리신 부위 (래트) $30

NMDA, 펜시클리딘(Phencyclidine) 부위 (래트) $30

글루타메이트, NMDA, 폴리아민 부위 (래트) $30

비선택적 (래트) $30

글리신, 스트리크닌(Strychnine) 민감성 (래트) $30

히스타민

H1, 중심 (귀니아 피그) $30

H1, 주변 (귀니아 피그) $30

H2 (귀니아 피그) $30

B-4

H3 (래트) $30

이미다졸린

I2, 중심 (래트) $30

I2, 주변 (래트) $30

이노시톨 트리스인산, IP3 (래트) $40

인슐린 (래트) $40

인터페론 감마 (사람) $50

인터류킨

IL-1알파 (마우스) $40

IL-2 (마우스) $75

IL-6 (사람) $40

IL-8 (사람) $40

류코트리엔

B4 (사람) $40

D4 (귀니아 피그) $40

멜라토닌, ML1 (치킨) $40

모노아민 트랜스포터 (래빗) $40

무스카린성

M1 (사람) $50

M2 (사람) $50

M3 (사람) $50

M4 (사람) $50

M5 (사람) $50

비선택적, 중심 (래트) $30

옥소트레모린-M (래트) $30

뉴로키닌

NK1 (사람) $50

NK2 (사람) $50

뉴로펩티드 Y

Y1 (사람) $40

Y2 (래빗) $40

뉴로텐신 (마우스) $40

니코틴성 아세틸콜린, 중심 (래트) $30

B-5

오피에이트(Opiate)

델타 (귀니아 피그) $30

카파(귀니아 피그) $30

무(mu) (귀니아 피그) $30

비선택적 (래트) $30

포르볼 에스테르 (마우스) $30

혈소판 활성 인자 (래빗) $30

혈소판 유도 성장 인자 (마우스) $50

칼슘 채널

[KA] (래트) $30

[KATP] (햄스터) $30

[KV] (래트) $40

[SKCa] (래트) $40

프로게스테론 (소) $40

푸린작용성(Purinergic) P2X (래빗) $30

세로토닌

5-HT1 (래트) $30

5-HT1A (사람) $50

5-HT2 (래트) $30

5-HT3 (래빗) $30

5-HT4 (귀니아 피그) $30

5-HT6 (사람) $50

5-HT7 (사람) $50

트랜스포터 (래트) $40

시그마(Sigma)

시그마 1 (귀니아 피그) $30

시그마 2 (래트) $30

비선택적 (귀니아 피그) $30

나트륨 채널, 부위 2 (래트) $40

소마토스타틴(Somatostatin) (마우스) $40

테스토스테론(Testosterone) (래트) $40

트롬복산(Thromboxane) A2 (래빗) $30

티로트로핀 방출 호르몬 (래트) $40

B-6

형질변형 성장 인자 - 베타 (마우스) $40

종양 괴사 인자 TNF-알파 (사람) $40

바소(Vaso)활성 장 펩티드 VIP1 (사람) $50

바소프레신 V1 (래트) $40

C-1

부록 "C"

C-2

C-

C-3

D-1

부록 "D"

3 개 및 1 개 문자 아미노산 약어

Claims (47)

1. (a) 후보 화합물을 구성적으로 활성화된 희귀 수용체와 접촉시키는 단계; 및

   (b) 상기 접촉된 수용체에서의 화합물 효능을 측정함으로써 상기 화합물이 상기 수용체의 역 아고니스트인지, 부분 아고니스트인지 또는 아고니스트인지를 결정하는 단계

   를 포함하는, 후보 화합물이 희귀 수용체에 대한 역 아고니스트, 부분 아고니스트 및 아고니스트로 구성된 군으로부터 선택된 어느 화합물인지를 직접 확인하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 화합물이 상기 수용체에 대한 역 아고니스트인 것으로 결정되는 방법.
3. 제1항에 있어서, 희귀 수용체가 구성적으로 활성화된 내생 희귀 수용체인 방법.
4. 제1항에 있어서, 희귀 수용체가 구성적으로 활성화된 비-내생 희귀 수용체인 방법.
5. 제1항에 있어서, 희귀 수용체가 G 단백질 커플링된 세포 표면 희귀 수용체인 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 희귀 수용체의 제3 세포내 루프가 하기 서열을 포함하는 방법.

   X1BBHyX2

   상기 식에서,

   X1은 아미노산이며;

   B는 염기성 아미노산이며;

   Hy는 소수성 아미노산이며;

   X2는 아미노산이다.
7. 제6항에 있어서, X1이 글리신인 방법.
8. 제6항에 있어서, X1이 알라닌인 방법.
9. 제6항에 있어서, X1이 리신인 방법.
10. 제6항에 있어서, Hy가 알라닌인 방법.
11. 제6항에 있어서, X2가 리신인 방법.
12. 제6항에 있어서, X2가 아르기닌인 방법.
13. 제6항에 있어서, X2가 글루탐산인 방법.
14. 제5항에 있어서, 상기 희귀 수용체의 제2 세포내 루프가 하기 서열을 포함하는 방법.

    XRY

    상기 식에서,

    X는 D가 아닌 임의의 아미노산일 수 있다.
15. 제6항에 있어서, 상기 서열 X1BBHyX2가 내생 서열인 방법.
16. 제6항에 있어서, 상기 서열 X1BBHyX2가 비-내생 서열인 방법.
17. 제14항에 있어서, 상기 서열 XRY가 내생 서열인 방법.
18. 제14항에 있어서, 상기 서열 XRY가 비-내생 서열인 방법.
19. 제1항 기재의 방법에 의해 직접 확인된 화합물.
20. 제2항 기재의 방법에 의해 직접 확인된 화합물.
21. 제3항 기재의 방법에 의해 직접 확인된 화합물.
22. 제4항 기재의 방법에 의해 직접 확인된 화합물.
23. 제5항 기재의 방법에 의해 직접 확인된 화합물.
24. 제6항 기재의 방법에 의해 직접 확인된 화합물.
25. 제14항 기재의 방법에 의해 직접 확인된 화합물.
26. 제19항 기재의 화합물을 포함하는 제약 조성물.
27. 제20항 기재의 화합물을 포함하는 제약 조성물.
28. 제21항 기재의 화합물을 포함하는 제약 조성물.
29. 제22항 기재의 화합물을 포함하는 제약 조성물.
30. 제23항 기재의 화합물을 포함하는 제약 조성물.
31. 제24항 기재의 화합물을 포함하는 제약 조성물.
32. 제25항 기재의 화합물을 포함하는 제약 조성물.
33. (a) 후보 화합물을 구성적으로 활성화된 비-내생 G 단백질 커플링된 세포 표면 희귀 수용체와 접촉시키는 단계; 및

    (b) 상기 접촉된 수용체에서의 화합물 효능을 측정함으로써 상기 화합물이 상기 수용체의 역 아고니스트인지, 부분 아고니스트인지 또는 아고니스트인지를 결정하는 단계

    를 포함하는, 후보 화합물이 구성적으로 활성화된 비-내생 G 단백질 커플링된 세포 표면 희귀 수용체에 대한 역 아고니스트, 부분 아고니스트 및 아고니스트로 구성된 군으로부터 선택된 어느 화합물인지를 직접 확인하는 방법.
34. 제33항에 있어서, 화합물이 상기 수용체에 대한 역 아고니스트인 것으로 결정되는 방법.
35. 제33항 기재의 방법에 의해 직접 확인된 화합물.
36. 제34항 기재의 방법에 의해 직접 확인된 화합물.
37. 제35항 기재의 화합물을 포함하는 제약 조성물.
38. 제36항 기재의 화합물을 포함하는 제약 조성물.
39. (a) 후보 화합물을 구성적으로 활성화된 내생 G 단백질 커플링된 세포 표면 희귀 수용체와 접촉시키는 단계; 및

    (b) 상기 접촉된 수용체에서의 화합물 효능을 측정함으로써 상기 화합물이 상기 수용체의 역 아고니스트인지, 부분 아고니스트인지 또는 아고니스트인지를 결정하는 단계

    를 포함하는, 후보 화합물이 구성적으로 활성화된 내생 G 단백질 커플링된 세포 표면 희귀 수용체에 대한 역 아고니스트, 부분 아고니스트 및 아고니스트로 구성된 군으로부터 선택된 어느 화합물인지를 직접 확인하는 방법.
40. 제39항에 있어서, 화합물이 상기 수용체에 대한 역 아고니스트인 것으로 결정되는 방법.
41. 제39항 기재의 방법에 의해 직접 확인된 화합물.
42. 제40항 기재의 방법에 의해 직접 확인된 화합물.
43. 제41항 기재의 화합물을 포함하는 제약 조성물.
44. 제42항 기재의 화합물을 포함하는 제약 조성물.
45. 명세서에 기술 및 설명된 바와 같은 발명의 방법.
46. 명세서에 기술 및 설명된 바와 같은 발명의 화합물.
47. 명세서에 기술 및 설명된 바와 같은 발명의 제약 조성물.