KR20000067074A - 신규 아클라비논 유도체 및 그의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규 아클라비논 유도체와 미생물을 이용한 제조방법, 그리고 상기 화합물의 제조에 이용되는 형질전환체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 스트렙토마이세스 속 균주로부터 분리된 아클라비논 C-11 히드록실라제 유전자를 포함하는 벡터로 생합성 변이주를 형질전환시킨 다음, 그 형질전환체를 배양하여 하기 화학식 1의 신규 아클라비논 유도체인 2,11-디히드록시아클라비논을 제조하는데, 상기 화합물은 새로운 안트라사이클린계 항생물질을 제조하기 위한 전구체로 사용될 수 있으며, 생물전환의 방법으로 얻어지는 안트라사이클린계 항생제는 세포 독성이 낮아 부작용이 적은 효과적인 항생제로 이용될 수 있다.

Description

신규 아클라비논 유도체 및 그의 제조방법{Novel aklavinone derivative and preparation method thereof}

본 발명은 신규 아클라비논 유도체와 미생물을 이용한 제조방법, 그리고 상기 화합물의 제조에 이용되는 형질전환체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 스트렙토마이세스 속 균주로부터 분리된 아클라비논 C-11 히드록실라제 유전자를 포함하는 벡터로 생합성 변이주를 형질전환시킨 다음, 그 형질전환체를 배양하여 제조한 신규 아클라비논 유도체인 2,11-디히드록시아클라비논 및 그 제조방법에 관한 것이다.

안트라사이클린 (anthracycline)계 항생제는 독소루비신 (doxorubicin), 아클라시노마이신 (aklacinomycin), 다우노루비신 (daunorubicin) 등을 포함하며, 탁월한 세포 독성 효과를 나타내므로 항암제로 널리 쓰이고 있다. 이들 안트라사이클린계 항생제는 크게 아클라비논을 전구물질로 하는 아클라시노마이신계와 11-히드록시아클라비논을 전구물질로 하는 다우노루비신계로 나눌 수 있으며, 전구물질의 종류에 따라서 생합성되는 물질이 결정되는 것으로 알려져 있다 (Connors, N.C. et al., J. of General Microbiology 136, 1887-1894 (1990)). 이러한 아클라시노마이신계 항암제, 그 중에서도 특히 다우노루비신계 항생물질인 독소루비신은 신장에 대한 독성이 심하기 때문에 인체 투여량 및 사용 기간에 제한을 받고 있으며, 따라서 부작용이 적은 신규 안트라사이클린계 항생제를 찾고자 하는 노력이 지속되어 왔다. 구체적으로 기존의 다우노루비신계 항생제, 그 중에서도 특히 독소루비신을 변형시킴으로써 급성 및 만성 신장독성을 줄이고 경구투여가 가능한 유도체를 합성하기 위한 연구가 계속되었으며, 그 결과 에피루비신 (epirubicin), 아이다루비신 (idarubicin) 등이 유기합성에 의해 개발되었다. 또한 아클라시노마이신계 항생제를 변형시켜 새로운 유도체를 얻고자 하는 연구도 진행되었는데, 스트렙토마이세스 속 균주로부터 유래된 아클라비논 C-11 히드록실라제를 이용하여 11-히드록시 아클라시노마이신 A, 11-히드록시 아클라시노마이신 B, 11-히드록시 아클라시노마이신 X, 11-히드록시 아클라시노마이신 M, 11-히드록시 아클라시노마이신 G, 11-히드록시 아클라시노마이신 S, 11-히드록시 아클라시노마이신 Y 및 11-히드록시 아클라시노마이신 T가 제조된 바 있다 (대한민국 특허 제145943호, 일본국 특허 제2731367호, 미국 특허 제5843738호). 이처럼 많은 연구자들이 재조합 유전자를 이용하여 세포독성에 의한 부작용이 감소된 신규 안트라사이클린계 물질을 만들고 있다 (Jarmo Niemi et al. Microbiology 140, 1351-1358 (1994)).

한편 다양한 안트라사이클리논을 전구체로 하여 안트라사이클린 생합성 변이주를 이용한 생물전환 방법에 의해 새로운 안트라사이클린을 제조하기 위한 연구가 진행되어 왔으나 (Osamu Johdo et al., J. of Antibiotics 49, 669-675 (1996)), 현재까지는 전구체로 사용되는 안트라사이클리논이 C-2 위치에 히드록시기를 보유한 2-히드록시아클라비논인 경우, 아클라시노마이신계의 생합성 결핍 변이주를 이용한 경우에만 2-히드록시아클라시노마이신 A 등 수종의 배당체로 생물전환된 것이 보고되어 있을 뿐 (Toshikazu Oki et al., J. of Antibiotics 34, 916-918 (1981)), 아직 다우노루비신계의 생합성 결핍 변이주에서는 배당체 (glycoside)로 생물전환되지 않는다고 보고되어 있다 (Akihiro Yoshimoto et al., J. of Antibiotics 33, 1158-1166 (1980)).

이에 본 발명자들은 다우노루비신계 생합성 결핍 변이주에 의해 생물전환되어 새로운 안트라사이클린계 항생제를 만들 수 있는 전구체로서 새로운 아클라비논 유도체 (안트라사이클리논)를 찾고자 노력해 오던 중, 아클라비논 C-11 히드록실라제 유전자를 포함하는 벡터에 의해 형질전환된 스트렙토마이세스 속 균주의 형질전환체를 배양하면 그 배양액으로부터 새로운 아클라비논 유도체를 얻을 수 있으며, 여러 가지 물리화학적 분석을 통하여 상기 유도체가 신규 물질인 2,11-디히드록시아클라비논이라는 것을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 신규 아클라비논 유도체, 그 제조방법 및 이에 이용되는 형질전환체를 제공하는 것이며, 또한 상기 아클라비논 유도체를 생물전환시켜 안트라사이클린계 항생제를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1 은 2,11-디히드록시아클라비논 및 2,11-디히드록시안트라사이클린의 생합성 예상경로를 나타낸 것이고,

도 2 는 2,11-디히드록시아클라비논의 UV 스펙트럼을 나타낸 것이고,

도 3 은 2,11-디히드록시아클라비논의¹H-NMR 스펙트럼과 구조를 나타낸 것이고,

도 4 는 2,11-디히드록시아클라비논의¹³C-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이고,

도 5 는 2,11-디히드록시아클라비논의 ESI-MS 스펙트럼을 나타낸 것이고,

도 6 은 2,11-디히드록시아클라비논을 전구체로 하여 독소루비신 생산 결손 변이주에서 생산된 2,11-디히드록시아클라비논의 글리코시드 (glycoside) 물질인 IDB-G4의 UV 스펙트럼을 나타낸 것이고,

도 7 은 상기 IDB-G4의¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이고,

도 8 은 상기 IDB-G4의 FAB-MS 스펙트럼을 나타낸 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 신규 아클라비논 유도체, 2,11-디히드록시아클라비논 (2,11-dihydroxyaklavinone)을 제공한다.

화학식 1

또한 본 발명은 상기 화합물을 제조하기 위한 형질전환체로서, 아클라비논 C-11 히드록실라제 (aklavinone C-11 hydroxylase)를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 pMC213으로 형질전환된 스트렙토마이세스 갈릴레우스 (Streptomyces galilaeus ATCC 31671/pMC213)를 제공한다. 숙주세포로는 이 외에도 아클라비논 C-11 히드록실라제 활성이 없고 안트라사이클린 (anthracycline)을 생산하는 어떠한 다른 균주도 사용될 수 있다.

아울러 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하여 아클라비논 C-11 히드록실라제를 발현시켜 2,11-디히드록시아클라비논을 생산하는 방법을 제공한다. 용도에 따라 상기 발현산물인 효소를 배양물로부터 분리, 정제하여 사용하거나 또는 세포 내에서 안트라사이클린계 항생제를 생합성하는데 직접 사용하여 2,11-디히드록시아클라비논을 생산할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 화학식 1의 2,11-디히드록시아클라비논을 전구체 (aglycone)로 하여 생합성 결핍 변이주를 이용하는 생물전환 방법으로 안트라사이클린계 항생제를 제조하는 방법을 제공한다. 좀 더 상세하게는 본 발명은 상기 2,11-디히드록시아클라비논을 생합성 결핍 변이주를 이용해 생물전환시켜 2,11-디히드록시안트라사이클린 (2,11-dihydroxyanthracycline)을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 생물전환 과정에 사용되는 생합성 결핍 변이주로는 독소루비신 생산 결손 변이주가 이용될 수 있으며, 특히 스트렙토마이세스 푸세티우스 NU23균주를 사용하는 것이 바람직하다.

또한 본 발명은 상기와 같이 2,11-디히드록시아클라비논을 전구체로 하여 생물전환 방법을 통해 제조되는 안트라사이클린계 항생제인 2,11-디히드록시안트라사이클린을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 이용된 아클라비논 C-11 히드록실라제 유전자는 아클라비논 (aklavinone)에 작용하여 ε-로도마이시논 (ε-rhodomycinone)과 다우노루비신 (daunorubicin)을 합성하는 기작에 관여하는 아클라비논 C-11 히드록실라제를 암호화하며, 스트렙토마이세스 속 균주로부터 클로닝 될 수 있다 (대한민국 특허 제145943호, 미국 특허 제5843738호). 바람직하게는 본 발명의 유전자는 스트렙토마이세스 푸세티우스 (ATCC 27952)로부터 분리된 아클라비논 C-11 히드록실라제 유전자를 포함하며, 상기 유전자의 염기 서열 및 상기 아클라비논 C-11 히드록실라제의 아미노산 서열은 대한민국 특허 제145943호에 기재되어 있는 바와 같다.

본 발명의 아클라비논 C-11 히드록실라제는 상기 유전자에 의해 암호화되며 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터 pMC213으로 숙주세포를 형질전환시키고 그 형질전환체를 배양하여 배양액으로부터 화학식 1의 2,11-디히드록시아클라비논을 얻는다.

숙주세포로는 아클라비논 C-11 히드록실라제 활성이 없고 안트라사이클린을 생산하는 것을 사용한다. 구체적으로는 스트렙토마이세스 리비단스 (Streptomyces lividans), 스트렙토마이세스 푸세티우스, 스트렙토마이세스 갈릴레우스 등을 사용할 수 있고, 그 중에서도 스트렙토마이세스 푸세티우스, 스트렙토마이세스 갈릴레우스 등이 바람직하다. 보다 바람직하게는 스트렙토마이세스 갈리레우스 (Streptomyces galilaeus, ATCC 31671)를 사용하는 것이 좋은데, 상기 균주는 아클라시노마이신 생산균주인 스트렙토마이세스 갈리레우스 (Streptomyces galilaeus, ATCC 31133)의 돌연변이 균주로서, 2-히드록시아클라비논 및 다수의 안트라사이클리논 (anthracyclinone)을 생산하며 (미국 특허 제4373094호, Akihiro Yoshimoto et al., Jpn. J. of Antibiotics 44. 277-286 (1991)), 아클라비논 C-11 히드록실라제 활성이 결여되어 있다 (Oki T. et al., J. of Antibiotics 32, 801-819 (1979)).

숙주세포의 형질전환 방법은 당해 분야에 공지되어 있는 방법을 사용할 수 있으며, 예를 들어 스트렙토마이세스 속 균주의 경우 홉우드 (Hopwood) 등의 방법 (Genetic Manipulations of Streptomyces : A labolatory manual. The John Innes Foundation, Norwich, United Kingdom, 1985)에 따라 형질전환 시킬 수 있다.

형질전환된 숙주세포는 적절한 배양 조건에서 배양함으로써 상기 유전자를 발현시킬 수 있는데, 용도에 따라 발현산물인 효소 (아클라비논 C-11 히드록실라제)를 숙주세포 배양물로부터 분리, 정제하여 사용하거나, 또는 세포 내에서 안트라사이클린계 항생제의 생합성에 직접 관여하게 할 수 있다. 구체적으로 본 발명에서는 후자의 방법을 통해 아클라비논 C-11 히드록실라제의 활성을 나타내지 않고 안트라사이클린계 항생제를 생산하는 미생물로부터, 야생형의 숙주세포에는 존재하지 않던 새로운 안트라사이클린계 항생제를 제조한다.

본 발명에서는 바람직한 실시예로서 아클라비논 C-11 히드록실라제 유전자가 포함된 재조합 벡터 pMC213으로 상기 돌연변이 스트렙토마이세스 갈릴레우스 (Streptomyces galilaeus, ATCC 31671)를 형질전환시키고 형질전환된 스트렙토마이세스 갈릴레우스에서 상기 아클라비논 C-11 히드록실라제 유전자를 발현시켜, 신규 아클라비논 유도체인 2,11-디히드록시아클라비논을 생산한다. 좀더 상세하게는, 상기 효소에 의하여 스트렙토마이세스 갈릴레우스 (ATCC 31671) 내 2-히드록시아클라비논의 C-11 위치가 히드록실화되어 2,11-디히드록시아클라비논을 생산한다.

상기와 같은 방법으로 생산된 2,11-디히드록시아클라비논은 배양된 형질전환체의 균사체를 클로로포름으로 추출한 후 실리카겔 칼럼으로 통과시키고 그 여과액을 메탄올:물:초산=65:35:5인 전개용매를 사용한 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 단계를 거침으로써 분리 및 정제할 수 있는데, 분리된 화합물은 UV 스펙트럼,¹H-NMR,¹³C-NMR 및 ESI-MS 스펙트럼으로 그 이화학적 성질을 밝혔으며, 그 결과 2-히드록시아클라비논의 C-11 위치에 히드록시기가 도입된 신규 안트라사이클린 전구물질인 2,11-디히드록시아클라비논임을 확인하였다 (도 1 참조).

다음으로 분리된 2,11-디히드록시아클라비논을 독소루비신 합성 결손 균주인 스트렙토마이세스 푸세티우스 NU23의 배양액에 첨가하여 이를 생물전환시킴으로써 새로운 안트라사이클린계 항생제인 2,11-디히드록시안트라사이클린을 제조한다.

상기 방법으로 제조된 안트라사이클린 항생제는 기존에 발견된 안트라사이클린 항생제와 다른 특성을 가질 수 있을 것으로 기대되는데, 본 발명에서 상기 2,11-디히드록시아클라비논을 전구물질로 하여 2,11-디히드록시안트라사이클린인 IDB-G4를 생합성하였으며 이 물질이 사람의 암세포에 대해 세포독성을 나타냄을 확인하였다.

본 발명에 의해 제조되는 항생제인 2,11-디히드록시안트라사이클린은 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산 (free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 아황산, 인산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 구연산, 주석산, 초산, 젖산, 말레인산, 후마린산, 글루콘산, 메탄술폰산, 아세트산, 글리콜산, 락트산, 숙신산, 타르타르산, 4-톨루엔술폰산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산, 또는 아스파르트산 등을 사용할 수 있다.

본 발명은 비독성, 불활성, 제약상 적합한 부형제 이외에, 본 발명에 따른 1종 이상의 화합물을 함유하거나, 또는 본 발명에 따른 1종 이상의 유효 화합물로 이루어지는 제약 조성물 및 이 조성물의 제조 방법을 포함한다. 본 발명의 화합물은 임상투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

실제 임상투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

본 발명은 또한 투약 단위의 제형들을 포함한다. 제형은 개별 투약 형태, 예를 들면 정제, 피복 정제, 캡슐제, 환제, 좌약 및 앰플제로 존재하고, 약제 중 유효 화합물의 함량은 개별 투약량의 분율 또는 배수에 해당한다. 투약 단위는, 예를 들면 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배로, 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배를 함유할 수 있다. 개별 투약량은 바람직하기로는 유효 화합물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다.

비독성이고 불활성인 제약상 적합한 부형제는 고상, 준고상 또는 액상 희석제, 충전제 및 모든 유형의 제형 보조물이다.

바람직한 제형으로는 정제, 피복 정제, 캡슐제, 환제, 과립제, 좌약, 액제, 현택액제 및 에멀전제, 페이스트제 (pastes), 연고제, 겔제, 크림제, 로션제, 산제 및 분무제 등이 포함된다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

정제, 피복 정제, 캡슐제, 환제 및 과립제는 통상의 부형제, 예를 들면 (a) 충전제 및 중량제 (예: 전분, 락토오스(lactose), 수크로오스(sucrose), 글루코오스, 만니톨 및 규산), (b) 결합제 (예: 카르복시메틸셀룰로오스, 알긴산염, 젤라틴 및 폴리비닐피롤리돈), (c) 흡습제 (예: 글리세롤), (d) 붕해제 (예: 한천, 탄산칼슘 및 탄산나트륨), (e) 용해 지연제 (예: 파라핀), (f) 흡수 촉진제 (예: 4급 암모늄화합물), (g) 습윤제 (예: 세틸알코올 및 글리세롤 모노스테아레이트), (h) 흡착제 (예: 고령토 및 벤토나이트), 및 (i) 윤활체 (예: 활석, 스테아르산 칼슘, 스테아르산 마그네슘, 마그네슘 스티레이트 탈크 및 고체 폴리에틸렌 글리콜), 또는 상기 (a) 내지 (i)에서 기재한 물질의 혼합물 이외에 유효 화합물 또는 화합물들을 함유할 수 있다.

정제, 피복 정제, 캡슐제, 환제 및 과립제는 임의로 유백제를 함유하는 통상의 피복 및 외피가 제공될 수 있고, 또한 장관의 특정부위에서 유효 화합물만을 또는 유효 화합물을 우선적으로 방출시키도록 하는 조성물로 이루어질 수 있으며, 필요한 경우 중합성 물질 또는 왁스와 같은 봉매제 조성물을 사용하여 서방형으로 제제화할 수 있다.

필요할 경우, 유효 화합물은 또한 1종 이상의 상기 부형제를 사용하여 미세 캡슐 형태로 제제할 수 있다.

좌제는 유효 화합물 이외에 통상의 수용성 또는 수불용성 부형제, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜, 카카오 지방 등의 지방, 고급 에스테르 (예: C₁₆-지방산을 갖는 C₁₄-알코올), 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 라우린지 및 글리세롤 젤라틴 또는 이들 물질의 혼합물을 함유할 수 있다.

비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다.

연고제, 페이스트제, 크림제 및 겔제는 유효 화합물 이외에 통상의 부형제, 예를 들면 동물성 및 식물성 지방, 왁스 파라핀, 전분, 타르가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 규산, 활석 및 산화 아연 또는 이들 물질의 혼합물을 함유할 수 있다.

산제 및 분무제는 유효 화합물 이외에 통상의 부형제, 예를 들면 락토오스, 활석, 규산, 수산화 알루미늄, 규산 칼슘 및 폴리아미드 분제, 또는 이들 물질들의 혼합물을 함유할 수 있다. 분무제는 통상의 포사제, 예를 들면 클로로플루오로히드로카본을 더 함유할 수 있다.

액제 및 에멀젼제는 유효 화합물 이외에 통상의 부형제, 예를 들면 용매, 가용화제 및 유화제, 예를 들면 물, 에틸알코올, 이소프로필알코올, 에틸카보네이트, 에틸아세테이트, 벤질알코올, 벤질벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 디메틸포름아미드, 오일, 특히 면실유, 낙화생유, 옥수수 배종유, 올리브유, 피마자유 및 참깨유, 글리세롤, 글리세롤 포름알코올, 테트라히드로푸르푸릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 또는 이들 물질의 혼합물을 포함할 수 있다.

비경구 투여용 액제 및 에멀젼제는 혈액과 등장성인 멸균 형태로 제제할 수 있다.

현탁제는 유효 화합물 이외에 통상의 부형제, 예를 들면 액상 희석제 (예: 물, 에틸알코올 및 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜), 및 현탁제 (예: 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 및 소르비탄 에스테르), 미세 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 한천 및 트라가칸트, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 또는 이들 물질의 혼합물을 함유할 수 있다.

상기 제형들은 또한 착색제, 방부제 및 냄새나 맛을 개선시키는 첨가제, 예를 들면 박하유, 유칼리유 및 감미제 (예, 사카린)를 함유할 수 있다.

치료학적 유효 화합물은 상기 제약 제형에 있어서 전체 혼합물의 약 0.1 내지 99.5 중량%, 바람직하기로는 0.5 내지 95 중량%의 양으로 함유되어야 한다.

상기 제형은, 본 발명에 의한 화합물 이외에, 다른 제약상 유효한 화합물을 함유할 수 있다.

상기 제형은 공지된 방법, 예를 들면 유효 화합물을 부형제와 혼합하는 통상의 방식으로 제조된다.

상기 제형은 사람 및 동물에, 경구, 직장, 비경구 (정맥내, 근육내 또는 피하), 지망막하조내, 본간내 또는 질내국소 (산제, 연고제, 드롭제)로 투여할 수 있다. 가능한 적합한 제형은 주사액제, 경구 치료용 액제 및 현탁제, 및 겔제, 주입제, 에멀젼제, 연고제 또는 드롭제이다. 안과 및 피부과용제, 즉 은염 및 기타 염류 외에도 삽입용제 (eardrops), 눈 연고, 산제 또는 액제를 국소 치료용으로 사용할 수 있다.

일반적으로 의약 및 수의약품에 있어서, 본 발명에 의한 유효 화합물은 24시간마다 약 0.5 내지 약 500 ㎎/㎏(체중), 적합하기로는 5 내지 300 ㎎/㎏(체중)의 총량으로 투여하는 것이 유리한 것으로 증명되었으며, 필요에 따라서 목적하는 결과를 얻기 위하여 수 개의 개별 투약 형태로 투여하는 것이 유리하다. 개별 투약 형태는 본 발명에 의한 유효 화합물을 약 1 내지 약 100 ㎎/㎏(체중), 특히 3 내지 80 ㎎/㎏(체중)으로 함유하는 것이 적합하다. 그러나, 상기 투약량은 변화시킬 필요가 있으며, 특히 치료할 객체의 체질 특이성 및 체중, 질병의 종류 및 심도, 제형의 성질, 의약품 투여의 성질, 및 투여기간 또는 간격을 고려해서 변화시킬 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다.

단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

＜실시예 1＞ 아클라비논 C-11 히드록실라제 유전자의 클로닝 및 재조합 플라스미드 구축

아클라비논 C-11 히드록실라제 유전자의 클로닝은 다음과 같이 실시하였다.

스트렙토마이세스 푸세티우스 (ATCC 27952)의 염색체 DNA를 분리하여 제한효소 Sau3AI로 부분적으로 절단한 후에 10∼40% 설탕용액 농도 구배에서 원심분리하여 4∼10 kb 정도의 단편을 pIJ702 (KCTC 1167)의 BgI II 자리에 클론하였다. 이들로 스트렙토마이세스 리비단스 1326을 형질전환시켜 치오스트렙톤 (thiostrepton) (50 ㎍/㎖)을 포함한 평판배지에서 내성을 나타내는 균주를 선별한 후, 다시 아드리아마이신 (100 ㎍/㎖)이 포함된 배지에서 최종 선별하였다. 이 내성균주들에서 분리한 플라스미드를 BamHI, SacI, KpnI, PstI 등의 제한효소로 절단하여, 각각의 제한효소에 의한 동일한 크기의 단편을 포함하고 같은 방향으로 삽입된 단편을 가진 pMC1, pMC2, pMC3, pMC4를 찾았다. 이들 염기서열을 컴퓨터 분석한 결과 두 개의 내성유전자 (drrA, drrB) 외에 두 개의 다른 단백질을 코드하는 오픈 리딩 프레임이 존재하는 것을 확인하였다. 그 중 내성 유전자의 상류 부위 오픈 리딩 프레임 (open reading frame) dnrF를 포함하는 유전자, 즉 아클라비논 C-11 히드록실라제 유전자를 대량으로 발현시키기 위해 상기 유전자를 포함하는 DNA 단편을 고복제수 벡터인 pIJ702에 도입하여 고발현 재조합 플라스미드 벡터를 구축하였다. 이를 위해 저항성 유전자를 포함하는 최초의 클론 pMC1을 BamHI으로 부분 분해시켜 아가로스 겔 전기영동으로 회수한 2.2 kb의 DNA 단편을 BalII로 분해한 스트렙토마이세스 전용 벡터 pIJ702에 삽입하여 이를 재조합 플라스미드 pMC213으로 명명하였으며, 이를 함유하는 형질전환체를 생체전환실험에 사용하였다.

＜실시예 2＞ 스트렙토마이세스 균주의 형질전환 및 배양

실시예 1에 의해 얻어진 아클라비논 C-11 히드록실라제 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 pMC213로 다음과 같이 스트렙토마이세스 속 균주들을 형질전환시키고, 그 형질전환체를 배양하였다.

스트렙토마이세스 리비단스 1326의 원형질체는 홉우드 (Hopwood) 등의 방법 (Genetic Manipulation of Streptomyces, The John Innes Foundation, Norwich, England, 1985)을 약간 변형해서 준비하고 이를 하기의 방법으로 형질전환 하였다.

스트렙토마이세스 균주들을 R2YE 배지[설탕 103g, K₂SO₄0.25g, MgCl_2·6H₂O 10g, 카사미노산 0.1g, 효모 추출물 5.0g, TES(N-tris [hydroxymethyl] methyl-2-aminoethane sulfonic acid) 5.73g을 증류수 790 ㎖에 용해하여 멸균하고, 별도로 멸균한 1M NaOH 5 ㎖, 0.5% KH₂PO₄10 ㎖, 1M CaCl₂20 ㎖, 20% 프롤린 15 ㎖, 미량성분 (trace element) 용액 2 ㎖를 첨가하여 사용함. 사용된 미량성분 용액은 ZnCl₂40 ㎎, FeCl₃6H₂O 200 ㎎, CuCl₂2H₂O 10 ㎎, MnCl₂4H₂O 10 ㎎, Na₂B₄O₇10H₂O 10 ㎎, (NH₄)₆Mo₇O₂₄4H₂O 10 ㎎을 증류수 1 ℓ에 용해시켜 제조] 10 ㎖에 접종하여 28 ℃에서 2∼3일 정도 배양한 후, 500 ㎖ 플라스크에서 0.5% 글리신을 포함한 R2YE 배지 100 ㎖에 재접종해서 이차 대사산물 생산이 시작되기 전까지 28 ℃에서 1∼2 일 정도 배양하였다.

균체를 3000 rmp에서 30분간 원심분리하여 라이소자임 (1mg/㎖)을 포함하는 P 완충액 (Hopwood et al,. Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laborative Manual, John Innes Foundation, Norwich, U.K.) 20 ㎖를 넣고 30 ℃에서 15∼60분 정도 처리하면서 반응중간에 원형질체 생성 정도를 현미경으로 확인하였다. 원형질체가 형성되지 않은 균체는 멸균된 목면필터로 여과하여 제거하고, 여과된 것은 P 완충액으로 세척하고 다시 P 완충액에 녹인 후 원형질체가 10^8-9정도 되도록 분주해서 -80 ℃에서 보관하였다. 형질전환시에는 보관된 원형질체를 37 ℃에서 신속히 녹여주고 T 완충액 (Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laborative Manual, John Innes Foundation, Norwich, U.K.)을 1 ㎖ 첨가한 후 즉시 20 ㎕ 재조합 플라스미드 DNA (1㎍)를 섞어준 다음, 1분 후에 5 ㎖의 P 완충액으로 세척해 주고 다시 1 ㎖의 P 완충액으로 녹였다. 이를 330 ㎕씩 분주해서 각 샘플에 0.6% 한천을 첨가한 R2YE 배지 2.5 ㎖를 잘 섞은 후 R2YE 재생배지에 접종하여 배양하였다. 숙주세포로 사용되는 각각의 균주에 따라 그 배양조건을 달리하였는데 구체적으로는 다음과 같다.

(1) 스트렙토마이세스 갈릴레우스 (ATCC 31671)의 배양

상기 R2YE 재생배지에 접종하여 배양한 후, 스트렙토마이세스 갈릴레우스 31671 균주들은 치오스트렙톤 (25㎍/㎖)이 포함된 YS 고체배지[효모추출물 3 g, 용해성전분 10 g, 한천 15 g, pH 7.2]에서 28 ℃에서 80 시간 배양하여 자라난 형질전환체를 분리하였다. 그 형질전환체를 치오스트렙톤 (25㎍/㎖)이 포함된 YS 배지[효모추출물 3 g, 용해성전분 10 g, pH 7.2]에서 28 ℃에서 2 일 전배양한 후 YS 배지에서 중간 배양을 거쳐 이를 SGM 배지 [용해성 전분 15 g, 포도당 10 g, 콩가루 30 g, 효모추출물 1 g, NaCl 1 g, MgSO₄1 g, KH₂PO₄1 g, CuSO₄0.007 g, FeSO₄0.001 g, MnCl₂0.008 g, ZnSO₄0.002 g]에서 28 ℃로 7∼10 일 발효배양하여 대사산물을 분석하였다.

(2) 스트렙토마이세스 리비단스의 배양

악티노로딘 (Actinorhodin) 생산균주인 스트렙토마이세스 리비단스 (Streptomyces lividans, KCTC 9059)를 주요한 클로닝조작을 위한 형질전환 숙주로 사용하였다.

상기 R2YE 재생배지에 접종한 스트렙토마이세스 리비단스를 30 ℃에서 18∼24시간 배양한 다음, 치오스트렙톤 (25㎍/㎖)을 포함한 0.6% 소프트 R2YE 한천배지 3 ㎖를 각 평판배지 위에 깔아주었다. 이를 28 ℃에서 3∼5일 배양하여 자라나는 형질전환체를 선택하여 분석하였다.

＜실시예 3＞ 2,11-디히드록시아클라비논의 추출, 분리 및 분석

(1) 2,11-디히드록시아클라비논의 추출, 분리

상기 실시예 2의 (1)에서 배양된 스트렙토마이세스 갈릴레우스 균액을 7000 rpm으로 30분간 원심분리한 후 균사체를 아세톤으로 2회 반복 추출하고 농축한 다음 클로로포름으로 재추출하였고, 균 여과액은 HP20 레진에 흡착시킨 다음 아세톤으로 용출하고 농축 후 클로로포름으로 재추출하였다. 전개용매로 클로로포름:메탄올=20:1을 사용한 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 실시하여 분획을 얻고, 이를 메탄올을 용매로 세파덱스 LH20 겔 여과를 실시하였다. 그 다음 분취용 HPLC (YMC ODS-A 컬럼 (10 X 290mm))를 수행하여 순수한 2,11-디히드록시아클라비논을 얻었는데, 전개용매로는 메탄올:물:초산=65:35:5를 사용하였다.

(2) 2,11-디히드록시아클라비논의 물리화학적 성질

(1)에서 분리된 대사산물의 확인은 TLC와 HPLC를 이용하였다. TLC 분석의 경우 (Silica gel 60 F-254 plate, Merck사) 전개용매는 클로로포름:메탄올을 15:1로 혼합하여 사용하였다. HPLC (ODS A-320 컬럼, 일본 YMC사)는 전개용매로 아세토니트릴:20 mM 인산용액 (Acetonitrile:20 mM phosphoric acid)을 42:58로 하여 사용하였다.

그 결과 (1)에서 분리된 신규 아클라비논 유도체인 2,11-디히드록시아클라비논은 붉은 자색 분말로서 융점 244∼246 ℃를 나타내었고, 메탄올과 클로로포름에 용해되었다. UV 스펙트럼 (Milton Roy사, 사용한 용매는 메탄올)에서 아클라비논이 230, 281, 483 nm에서 UV 흡수극대를 나타낸 반면, 2,11-디히드록시아클라비논의 경우는 탄소 11번 위치에 히드록시기의 도입으로 인하여 230, 258, 281, 491 nm에서 흡수극대를 나타내는 심색효과 (bathochromic effect)를 나타내었다 (도 2 참조). 또한¹H-NMR 스펙트럼 (CDCl₃용매, Varian UNITY-300 분광기, 300MHz)은 2-히드록시아클라비논과 동일한 양상을 나타내었으나 표 1에서 보듯 H-11에 상응하는 7.65ppm의 단일선이 소실된 것으로 보아 히드록시화의 위치가 11번 탄소 위치라는 것을 확인할 수 있었고 (도 3 참조), 또한¹³C-NMR 스펙트럼 (CDCl₃용매, Virian UNITY-300 분광기, 75.4MHz)에서 11번 탄소가 154.3ppm으로 저자장 이동한 것으로부터 11번 위치의 탄소가 히드록시화된 것을 확인하였다 (도 4 참조). ESI-MS (Platform (VG, UK))에서도 m/z 443 (M-H-)에서 분자 이온피크가 관찰되어 아클라비논에 32 mass unit 만큼 더해진 계산된 2,11-디히드록시아클라비논의 분자량과 일치하는 값인 444라는 분자량이 나오는 것을 확인할 수 있었다 (도 5 참조).

2, 11-디히드록시아클라비논의 NMR 화학적 배치

프로톤	chemical shift(ppm)	탄소	chemical shift(ppm)
1	H	6.95 d	1	CH	104.6
3	H	6.97 d	2	C	155.3
7	H	5.09 br d	3	CH	111.9
8	H	2.10 br d	4	C	166.5
8	Ha	2.02 d	4a	C	109.3
10	H	4.10 s	5	C	188.3
12	Ha	1.65 m	5a	C	112.0
12	Ha	1.43 m	6	C	154.3
	OCH3	3.57 s	6a	C	134.3
			7	CH	61.6
			8	CH2	34.5
			9	C	71.4
			10	CH	52.2
			10a	C	137.1
			11	C	154.3
			11a	C	115.4
			12	C	185.5
			12a	C	130.5
			13	CH2	32.4
			14	CH2	5.6
			15	C	171.3
			16	OCH3	51.17

＜실시예 4＞ 2,11-디히드록시아클라비논의 생물전환

실시예 3에서 분리된 2,11-디히드록시아클라비논을 전구체로 하여, 스트렙토마이세스 푸세티우스 NU23 균주에서 생물전환의 방법을 통해 새로운 골격의 안트라사이클린을 제조하였다. 사용된 스트렙토마이세스 푸세티우스 NU23은 독소루비신 생산균주인 스트렙토마이세스 푸세티우스 (Streptomyces peucetius supsp. caesius, ATCC 27952)의 생합성 결핍 변이주로서, 독소루비신 합성 결손을 보인다.

구체적으로, 2,11-디히드록시아클라비논의 생물전환은 다음과 같은 방법에 의해 실시하였다.

생물전환 숙주로 이용되는 스트렙토마이세스 푸세티우스 NU23 균주는 NDYE 고체배지 (맥아당 45 g, NaNO₃4.3 g, K₂HPO₄0.23 g, HEPES 완충액 5.2 g, MgSO₄0.12 g, 기타 미량성분 용액 2 ㎖, 한천 15 g, pH 7.4)에서 4일간 28℃에서 배양한 후 NDYE 액체배지에 접종하여 28℃에서 250 rpm의 진탕속도로 5일간 배양하고, 여기에 최종농도가 배양액 리터당 30 mg이 되도록 2,11-디히드록시아클라비논을 가하였다. 이후 같은 조건으로 4일간 더 배양하여 2,11-디히드록시아클라비논을 생물전환하였다.

＜실시예 5＞ 2,11-디히드록시아클라비논의 생물전환 물질 분리 및 분석

(1) 2,11-디히드록시아클라비논의 생물전환 물질 분리

생물전환이 종결된 배양액을 7000 rpm으로 30분간 원심분리한 후 균체는 메탄올과 아세톤으로, 배양여액은 클로로포름, 메탄올을 9:1로 혼합한 용매와 HP20 흡착레진 등으로 추출하고 농축한 다음 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 전개용매로서 클로로포름과 메탄올을 20:1에서 2:1로 실시하여 IDB-G 분획을 회수하였다.

박층 크로마토그래피 (TLC : thin layer chromatography)로 확인된 글라이코사이드 물질(IDB-G)을 HPLC (YMC ODS-A 컬럼)를 시행하여 IDB-G1, G2, G3, G4 등 4개의 글라이코사이드 물질이 있음을 확인하였다.

생물전환물질을 분석하기 위하여, 생산배지에서 호기적 조건 (진탕 배양 250∼300 rpm)으로 28 ℃에서 7∼8일간 배양한 배양액에 옥살산 (oxalic acid)을 30 ㎎/㎖의 농도로 첨가하여, 55 ℃에서 45분간 가수분해하고, 10N NaOH를 사용하여 pH 8.5로 조정하였다. 상기 반응액에 클로로포름:메탄올 (9:1) 혼합액을 동량 첨가하여, 잘 혼합시켜 용매층으로 대사산물을 추출하여, 3,000 rpm에서 30분간 원심분리하고 용매층을 회수한 다음, 감압 농축 후 소량의 메탄올로 녹여 TLC 또는 HPLC 분석에 사용하였다. TLC 분석의 경우 (Silica gel 60 F-254 plate, Merck사), 당 (glycoside)이 결합된 상태의 생합성 중간체의 전개용매는 클로로포름:메탄올:포름산 (formic acid) 이 80:20:2의 비율로 혼합한 것을, 당이 없는 중간체인 아글리콘 (aglycone)의 전개용매는 헥산:클로로포름:메탄올이 5:5:1로 혼합된 것을 사용하였다. HPLC (ODS-120T C-18 column, Tosoh사)는 전개 용매로 아세토니트릴:20 mM 인산용액 (42:58)의 혼합용매에 SDS가 최종 10 mM 농도로 첨가된 것을 사용하였다.

이중 최종 대사물로 생각되는 IDB-G4를 분취용 HPLC로 분리하였다

(2) 2,11-디히드록시안트라사이클린 IDB-G4의 물리화학적 성질

(1)에서 분리된 항생제 2,11-디히드록시안트라사이클린 IDB-G4는 붉은 색 분말로서, 메탄올에 녹여 측정한 UV 스펙트럼에서 독소루비신이 230, 254, 495 nm에서 UV 흡수극대를 나타낸 반면 2,11-디히드록시안트라사이클린 IDB-G4 경우는 탄소 2번 위치에 히드록시기가 도입된 것으로 인하여 230, 281, 491 nm에서 흡수극대를 나타내었다 (도 6 참조). 또한¹H-NMR 스펙트럼 (CDCl₃용매, Varian UNITY-300 분광기, 300MHz)은 독소루비신의 경우 2번 탄소에 위치한 프로톤 (proton)이 7.5-7.9 ppm 위치에서 삼중선으로 나타나고 1, 3번 탄소에 위치한 프로톤은 7.6 ppm 위치에서 이중선으로 나타나는데 반하여 IDB-G4의 경우 탄소 2에 위치한 삼중선이 소실되고 1, 3번 탄소의 프로톤이 6.5-7.1 ppm에서 이중선으로 변화되어 나타난 것으로 보아 탄소 2번 위치가 히드록시화 되었음을 알 수 있다 (도 7 참조). 또한 독소루비신의 TLC 전개용매인 클로로포름:메탄올:포름산=80:20:2 조건에서 IDB-G4는 히드록시기가 도입됨에 따라 독소루비신 보다 낮은 R_f치를 나타내었으며 산 가수분해 시 당이 없는 아글리콘의 전개용매인 헥산:클로로포름:메탄올=5:5:1에서 독소루비시논보다 낮은 R_f치를 나타내어 IDB-G4가 배당체 (glycoside)임을 확인할 수 있었다. FAB-MS (JEOL HX-110)에서도 독소루비신에 히드록시화에 의한 16 mass unit 만큼 더해진 것에 해당하는 m/z 560 (M+H+)에서 분자 이온 피크가 관찰되었다 (도 8 참조). 따라서 이상의 결과들로부터 IDB-G4는 독소루비신과 유사한 구조의 안트라사이클린으로서 2,11-디히드록시안트라사이클린 (2,11-dihydroxyanthracycline)인 2-히드록시 독소루비신 (2-hydroxy doxorubicin)이라는 것을 알 수 있다.

＜실험예 1＞ 안트라사이클린 화합물의 항암 활성

실시예 5에서 얻은 항암제 2,11-디히드록시안트라사이클린 IDB-G4에 대하여 축소된 인체 암세포주 판넬을 이용하여 다음과 같은 방법으로 항암활성을 측정하였다.

마우스 및 인체 유래 암세포주를 10%의 소 태아 혈청 (Fetal Calf Serum)이 첨가된 RPMI 1640 배지로 37℃, 5% CO₂배양기에서 배양하였다. 사용한 암세포주는 P388, P388/ADM, L1210 등 마우스 유래 백혈병 세포주들과 위암세포주인 SNU-1, SNU-1/ADM, 대장암세포주인 SNU-C4, 백혈병세포주인 HL60 등의 인체 유래 세포주들이며 2,11-디히드록시안트라사이클린 IDB-G4의 세포독성도를 설포로다민 B (sulforhodamine B)법에 의하여 측정하였다. 대수증식기에 있는 세포를 트립신-EDTA로 처리하여 단일세포 부유액을 만든 후 5∼8×10⁴/㎖ 농도가 되도록 희석하여 96 웰 플레이트 (well plate)에 100 ㎕씩 분주하고 24시간 배양한 후에 시료를 단계적으로 배지에 희석하여 100 ㎕를 가해 주었다. 세포의 생존율을 측정하기 위하여 48시간 배양한 후 배양액에 냉 50% 삼염화초산 용액을 웰 당 50 ㎕씩 가하고 4℃에서 1시간동안 세포를 고정하였다. 고정된 세포는 물로 5회 세척한 후 0.4% 설포로다민 B (1% 초산에 용해) 용액 100 ㎕를 가하여 30분간 염색하고 1% 초산용액으로 수회 세척하고 건조한 후 웰 당 10 mM 트리스 용액 (pH 10.5) 200 ㎕를 가해주고 엘리자 리더 (ELISA reader)에서 540 nm에서의 흡광도를 측정하여 대조군과의 비교치로부터 세포독성을 측정하였다.

상기 실험의 결과를 표 2에 나타내었다.

IDB-G4의 암세포주에 대한 시험관내 세포 독성도

세포주	독소루비신	IDB-G4
백혈병P388	0.02	0.80
백혈병(다제약물내성)P388/ADM	1.00	10.20
백혈병L1210	0.02	0.30
백혈병(다제약물내성)L1210/MDR	1.50	25.00
위암SNU-1	0.20	1.30
위암(다제약물내성)SNU-1/ADM	10.00	25.00
대장암SNU-C4	1.20	12.50
백혈병HL60	0.20	1.40
백혈병(다제약물내성)HL60/ADM	10.40	25.00
단위 IC50: μM

마우스 유래 백혈병 세포주인 P388 및 L1210에 대하여 1차로 대조약물을 독소루비신으로 하여 시험관내 (in vitro) 세포독성도를 실험한 결과 정상 암세포주와 다제약물내성 세포주 모두에서 본 발명의 2,11-디히드록시안트라사이클린은 독소루비신 대비 10∼20배의 낮은 세포독성도를 보였다. 2-히드록시안트라사이클린계 물질이 2-언히드로안트라사이클린계 물질보다 낮은 세포독성도를 나타내는 이 결과는 아키히로 (Akihiro) 등 (일본국 특허 제 125826/81 호)이 2-히드록시아클라시노마이신 A의 세포독성도가 아클라시노마이신 A보다 4∼8배의 독성도 저하를 나타낸다는 보고와 일치한다.

2차로 인체 유래 위암세포주인 SNU-1과 SNU-1/ADM(다제약물내성세포주), 백혈병 세포주인 HL60, 대장암 세포주인 SNU-C4와 SNU-C4/ADM 등을 이용하여 세포독성도를 측정한 결과 마우스 유래 세포주와 동일한 경향으로 세포독성도의 약화가 나타났다.

＜실험예 2＞ 생쥐에 대한 급성 독성실험

한편 본 발명의 2,11-디히드록시안트라사이클린의 급성 독성을 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

6주령의 특정병원부재(SPF) SD계 생쥐를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 2 마리씩의 동물에 상기 2,11-디히드록시안트라사이클린을 각각 0.1% 트윈80이 포함된 생리식염수에 용해한 후 800mg/㎏/0.5㎖의 용량으로 단회 정맥 투여하였다. 시험물질 투여 후 동물의 폐사 여부, 임상증상 및 체중변화 등을 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기 및 신장의 이상여부를 관찰하였다. 시험 결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상은 없었고 폐사된 동물도 없었으며, 또한 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과 실험된 화합물은 모두 생쥐에서 800 mg/㎏까지 독성변화를 나타내지 않으며 정맥 투여 최소치사량은 800 mg/㎏ 이상인 안전한 물질로 판단되었다.

본 발명의 신규 아클라비논 유도체, 2,11-디히드록시아클라비논은 생물전환 과정 등을 통해 다양한 신규 안트라사이클린계 항생제의 제조에 이용할 수 있으며, 상기 화합물을 전구체로 하여 제조된 안트라사이클린계 항생제 2,11-디히드록시안트라사이클린은 세포에 대한 독성이 적어 기존 항암제보다 안전하고 효과적인 항암제로 사용될 수 있다.

Claims (7)

1. 하기 화학식 1의 2,11-디히드록시아클라비논 (2,11-dihydroxyaklavinone).

   화학식 1
2. 아클라비논 C-11 히드록실라제를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 pMC213으로 형질전환된 스트렙토마이세스 갈릴레우스 (Streptomyces galilaeus ATCC 31671/pMC213, 수탁번호 : KCTC 0662BP).
3. 제 2 항의 형질전환체를 배양하여 제 1 항의 화합물을 생산하는 방법.
4. 제 1 항의 2,11-디히드록시아클라비논을 전구체 (aglycone)로 하여 생합성 결핍 변이주를 이용해 생물전환 방법으로 안트라사이클린계 항생제를 제조하는 방법.
5. 제 4 항에 있어서, 생합성 결핍 변이주는 스트렙토마이세스 푸세티우스 NU23인 것을 특징으로 하는 안트라사이클린계 항생제를 제조하는 방법.
6. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 안트라사이클린계 항생제는 2,11-디히드록시안트라사이클린 (2,11-dihydroxyanthracycline)인 것을 특징으로 하는 안트라사이클린계 항생제를 제조하는 방법.
7. 제 6 항의 방법으로 제조되는 2,11-디히드록시안트라사이클린.