KR20000008880A - 글루코스 센서 및 그의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 고분자 음이온(2-Acrylamido-2-methylpropanesulfonyl acid)과 글루코스 옥시다아제(Glucose oxidase)가 접합된 단백질 복합체를 전도성 고분자의 도판트(Dopant)로 사용하는 글루코스 센서 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
당뇨병 환자의 혈중 글루코스 농도를 측정하는데 쓰이는 글루코스 센서는 글루코스 효소 전극이 제안된 이래로 많은 연구개발이 있었으나 지금까지 개발된 글루코스 센서들은 낮은 생체 적합성과 생체내 낮은 감도, 반응시간의 지연등으로 많은 문제점이 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 전도성 고분자와 단백질 복합체(고분자 음이온과 글루코스 옥시다아제가 접합)를 이용한 글루코스 센서를 제조하는데 있다.
본 발명의 글루코스 센서는 고분자 음이온으로 2-아크릴아미도-2-메틸프로판설포닉산과 단백질로 글루코스 옥시다아제를 접합시켜 단백질 복합체의 합성효율 및 전기활성도를 높이고 이를 전도성 고분자의 도판트로 사용함으로써 장기간 체내 이식용으로 사용할 수 있다.

Description

글루코스 센서 및 그의 제조방법
본 발명은 고분자 음이온(2-Acrylamido-2-methylpropanesulfonyl acid, AMPS)이 단백질(Glucose oxidase, GOD)과 접합된 단백질 복합체를 전도성 고분자의 도판트(Dopant)로 이용한 글루코스 센서 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
전도성 고분자에 항원, 항체, 효소 또는 약리적 작용을 갖는 단백질을 접합시킬 경우 이들 단백질의 기능을 감시하거나 기능상태를 전기적으로 조절이 가능하므로 실제 생체감응기구(Biosensor)에 전도성 고분자와 단백질 복합체가 이용되고 있다. 지금까지 연구 및 개발된 생체감응기구중 당뇨병 환자의 혈중 글루코스 농도를 측정하느데 쓰이는 글루코스 센서는 글루코스 효소 전극[Analyst, 117, 1657(1992)]이 제안된 이래로 많은 연구 및 개발이 진행되어 왔다. 그러나 지금까지 개발된 글루코스 센서들은 낮은 생체 적합성과 생체내에서의 낮은 감도 그리고 반응 시간의 지연등의 문제점으로 사용에 많은 제약을 받아왔다. 종래의 전도성 고분자와 단백질 복합체를 결합시킨 글루코스 센서의 제조방법에는 단백질을 직접 전도성 고분자의 도판트로 사용하는 방법과 전도성 고분자의 단량체에 단백질을 결합시켜 이를 전기적으로 중합시키는 방법이 사용되었다.[ACS Symposium series, 556, (1994)] 그러나 단백질을 직접 전도성 고분자의 도판트로 사용한 경우는 단백질이 도판트로서 전도성 고분자 기질내에 고정되었는지 불확실하며, 또한 단백질을 결함시켜 이를 전기적으로 중합시키는 방법은 전도성 고분자와 단백질 복합체 내의 단백질 분포 및 함량 조절이 가능하지만 전도성 고분자의 단량체 개질에 따른 물성저하와 고분자로의 중합이 어려운 문제점이 있다.
본 발명은 고분자 음이온(AMPS)과 글루코스 옥시다아제(GOD)를 접합시킨 단백질 복합체를 전도성 고분자의 도판트로 이용하여 글루코스 센서를 제조하여 종래의 글루코스 센서제조에 사용된 단백질 고정화 방법의 문제점을 해결하고 고분자 음이온과 글루코스 옥시다아제의 전기활성도를 높여 전도성 고분자의 도판트로 사용함으로써 전도성 고분자에 단백질 복합체의 합성효율을 높이고 장기간 사용가능한 체내이식용 글루코스 센서를 제조할 수 있다.
도 1 은 전도성 단량체(Pyrrole)와 단백질 복합체 및 전도성 단량체(Pyrrole) 와 글루코스 옥시다아제와의 전기화학적 중합을 나타낸 크로노암페로그램(Chronoamperogram)
도 2 의 점선은 2-아크릴아미도-2-메틸프로판술포닉산과 글루코스 옥시다아제가 결합된 단백질 복합체를 전도성 고분자(Polypyrrole)의 도판트로 사용할 때의 시클릭 볼타모그램(Cyclic voltammogram)이고, 실선은 2-아크릴아미도-2-메틸프로판술포닉산을 전도성 고분자(Polypyrrole)의 도판트로 사용할 때의 시클릭 볼타모그램(Cyclic voltammogram)이다.
도 3 은 전도성 고분자(Polypyrrole)와 단백질 복합체가 결합된 글루코스 센서내부의 글루코스 옥시다아제(GOD)의 생리활성에 대한 크로노암페로그램(Chronoamperogram)이다.
본 발명은 고분자음이온(2-Acrylamido-2-methylpropanesulfonyl acid, AMPS)과 글루코스 옥시다아제(Glucose oxidase, GOD)를 접합시킨 단백질 복합체를 전도성 고분자의 도판트로 사용하여 글루코스 센서를 제조하였다.
고분자 음이온(AMPS)과 접합된 글루코스 옥시다아제(GOD)는 지금까지 글루코스 센서 제조에 사용된 단백질 고정화 방법의 단점을 해결하고 전도성 고분자와 단백질 복합체의 합성효율 및 전기활성도를 높이기위해 전도성 고분자의 도판트로 사용한다. 전도성 고분자 기질에 고분자 음이온(AMPS)이 접합된 글루코스 옥시다아제(GOD)의 고정화 기작을 아래에 나타냈다.
R은 전도성 고분자를 나타내며 전도성 고분자에는 폴리아세틸렌, 폴리파라페닐린, 폴리피롤, 폴리파라페닐린 설파이드, 폴리티오펜, 폴리파라페닐린 비닐린, 폴리-3-메틸티오펜, 폴리카르바졸, 폴리이소티아나펜, 폴리(1,6-헵타다인), 폴리아닐린 등이 있다.
이하 본 발명을 다음의 실시예와 시험예에 의하여 더욱 자세히 설명한다. 그러나 이들은 본 발명의 이해를 쉽게 하기 위해 제공되는 것으로써 본 발명의 기술적 범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 > 전도성 단량체인 피롤(Pyrrole)과 단백질 복합체와의 전기화학적 중합
전기화학적 측정에는 정전압 정전류기(EG&G, Model 263A)와 3 전극 시스템을 사용하여 백금 전극(Wire)을 작업전극(Working electrode), 백금 망(Mesh)을 상대전극(Counter electrode), 3M Ag/AgCl을 기준전극(Refererce electrode)으로 사용한다. 중합반응전 작업전극은 표면을 Al2O3슬러리로 연마하여 세척하고 중합에 사용된 피롤(Pyrrole)의 농도는 0.2M이고 도판트인 단백질 복합체의 농도는 0.1 wt/용매부피로 고정한다.
중합은 0.8V 일정 전압하에서 진행시키고 반응에 사용된 용매는 8㎖의 증류수를 사용하며 반응온도는 도판트로 사용되는 단백질 복합체내의 글루코스 옥시다아제의 변성을 막기위해 4℃이하로 유지하고 반응시간은 10분으로 고정한다. 또한 고분자 음이온(아크로스사)에 접합된 글루코스 옥시다아제(시그마사의 글루코스 옥시다아제 타이프Ⅱ)에 대한 조절시료로서 글루코스 옥시다아제(GOD) 만을 도판트로 사용해 피롤(Pyrrole)을 중합하였다.
이때 전도성 단량체인 피롤의 농도는 0.2M, 전압은1.0V, 용매는 8㎖의 증류수를 사용하며 글루코스 옥시다아제(GOD)를 접합시킨 도판트의 농도는 0.4wt /용매부피, 중합시간은 1시간으로 유지하고 반응온도는 4℃이하로 유지한다.
중합반응 후 표면에 전도성 고분자인 폴리피롤(Polypyrrole)이 성장한 작업전극은 표면에 묻어있는 미반응 단량체인 피롤(Pyrrole)과 도판트로 사용한 단백질 복합체를 제거하기 위해 증류수와 0.1M, pH 7.4인 완충용액(Phosphate buffer solution, PBS)으로 세척한다. 고분자 음이온(AMPS)와 글루코스 옥시다아제(GOD)가 접합된 단백질 복합체를 도판트로 사용한 피롤의 전기화학적 중합반응은 도 1의 크로노암페로그램(Chronoamperogram)으로 확인하였으며 조절시료로서 글루코스 옥시다아제만(GOD)을 도판트로 사용한 피롤의 중합반응도 도 1에서 확인할 수 있다.
< 시험예 > 글루코스 센서내 단백질 복합체의 전기활성도 및 글루코스 옥시다아제의 생리활성도 측정
폴리피롤(Polypyrrole)과 단백질 복합체가 합성된 글루코스 센서의 전기활성도는 시클릭 볼타메트리(cyclic voltametry)로 측정한다. 측정에 사용된 전해질 용액은 피롤과 단백질 복합체의 합성에 사용된 0.1M, pH 7.4인 완충용액 (Phosphate buffer solution, PBS)을 사용했으며 측정전압은 +1.0V 부터 -1.0V까지 사용한다. 폴리피롤과 단백질 복합체가 합성된 글루코스 센서 내에 있는 글루코스 옥시다아제의 생리활성에 따른 전기신호는 일정 전압하에서 변화하는 전류의 양으로서 측정하며 전기신호 측정에 사용된 전압은 0.4V이고 용매는 0.1M, pH 7.4 완충용액(Phosphate buffer solution, PBS)을 사용하고 온도는 글루코스 옥시다아제(GOD)의 생리활성에 필요한 온도 및 실제 생체감응기구로서 응용될 때의 온도인 37℃에서 측정하였다.
글루코스 센서내 단백질 복합체의 전기활성도는 도 2의 시클릭 볼타메트리(cyclic voltametry)로 확인하였으며 글루코스 센서 내의 글루코스 옥시다아제의 생리활성도 역시 도 3에서 확인하였다.
고분자 음이온(AMPS)과 글루코스 옥시다아제(GOD)가 접합된 단백질 복합체를 도판트로 사용하고 전도성 고분자로 이용한 폴리피롤의 전기화학적 중합은 도 1에 있는 것처럼 10분 이내에 활발히 일어났음을 알 수 있고 순수 글루코스 옥시다아제(GOD) 만을 도판트로 사용한 방법은 고분자 음이온(AMPS)과 글루코스 옥시다아제(GOD)의 접합 도판트와 같은 반응조건에서는 피롤의 중합이 일어나지 않았고 보다 높은 전압(1.0V)과 높은 도판트 농도(4wt/용매부피)에서 1시간동안 반응시켜서 겨우 불균일하게 성장한 폴리피롤을 얻을 수 있었다. 고분자 음이온과 글루코스 옥시다아제가 접합된 단백질 복합체를 도판트로 사용하고 전도성 고분자로 폴리피롤을 이용하여 합성한 글루코스 센서 내의 단백질 복합체의 전기활성도는 도 2에 나타나고 있는 것처럼 고분자 전해질을 도판트로 사용한 글루코스 센서 내의 전도성 고분자(Polypyrrole)가 나타내는 전형적인 전기활성도를 보였다.
본 발명에 의한 고분자 음이온(AMPS)이 글루코스 옥시다아제(GOD)와 접합된 단백질 복합체를 전도성 고분자인 폴리피롤에 결합시켜 제조한 글루코스 센서는 전도성 고분자와 단백질 복합체의 낮은 합성효율과 생체내에서의 낮은 감도, 개질된 전도성 고분자로부터 단백질 복합체의 중합이 어려운 기존 합성법의 문제점을 해결하였으며 폴리피롤과 고분자 음이온이 접합된 글루코스 옥시다아제 복합체의 생리활성도는 글루코스 농도에 대한 전기적 신호를 측정한 결과 도 3에서 처럼 생체감응기구로서 응용가능한 결과인 20mM의 글루코스 농도까지 선형적 관계를 나타냈다.

Claims (3)

  1. 고분자 음이온과 단백질을 접합시킨 단백질 복합체를 전도성 고분자의 도판트로 함을 특징으로 하며 다음의 일반식으로 표시되는 글루코스 센서.
    R은 전도성 고분자, SO3 -는 고분자 음이온, GOD는 단백질
  2. 제 1 항에 있어서, 전도성 고분자는 폴리피롤(Polypyrrole), 고분자 음이온은 2-아크릴아미도-2-메틸프로판술포닉산(AMPS), 단백질은 글루코스 옥시다아제(GOD)인 것을 특징으로 하는 글루코스 센서.
  3. 전도성 고분자와 단백질 복합체를 결합시키는 방법에 있어서, 전도성 고분자의 농도는 0.2M, 단백질 복합체의 농도는 0.1wt/용매부피, 용매는 8㎖의 증류수로 4℃의 온도, 10분 동안 0.8V의 전압에서 전기화학적 중합하는 것을 특징으로 하는 글루코스 센서의 제조방법.
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