KR19990076620A - Kvlqt1을 코딩하는 장기 qt 증후군 유전자 및kvlqt1과 mink의 결합체 - Google Patents

Abstract

본 발명의 한면은 장기 QT 증후군의 분자 체제의 확인에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 돌연변이된 KVLQT1이 장기 QT 증후군을 야기시킨다는 것을 확인하였다. 이 유전자의 분석은 장기 QT 증후군을 갖는 대상의 조기 진단법을 제공할 것이다. 이 진단 방법은 피검체의 KVLQT1 유전자의 핵산 서열을 분석하고, 그것을 천연, 비변이 유전자의 핵산 서열과 비교하는 것으로 이루어진다. 또한, KVLQT1의 아미노산 서열은 장기 QT 증후군을 야기시키는 돌연변이에 대해 분석될 수 있다. 장기 QT 증후군의 징후전 진단은 의사가 현재의 의학 요법을 이용하여 이 질환을 치료할 수 있도록 할 것이다. 본 발명의 제2 면은 KVLQT1이 minK와 함께 회합하여 심장 칼륨 채널을 형성하는 것을 이해한 것에 관한 것이다. 이것은 이 채널과 상호 작용하는 약물을 분석하여 장기 QT를 치료 또는 예방하는데 유용한 새로운 약물을 확인할 수 있게 한다.

Description

ＫＶＬＱＴ1을 코딩하는 장기 ＱＴ 증후군 유전자 및 ＫＶＬＱＴ1과 ｍｉｎＫ의 결합체

본 출원은 국립보건원(National Institutes of Health, Bethesda, Maryland)에 의해 투자된 허가 번호 R01 HL48074 및 미국 공중위생청(Public Health Service)의 허가 번호 M01 RR00064로 정부 지원에 의해 이루어졌다.

본 발명은 장기 QT 증후군(LQT)과 관련된 유전자 및 유전자 생성물, 및 LQT의 진단 및 예방 방법에 관한 것이다. LQT는 본 발명에 따라서 피검체의 KVLQT1 유전자의 DNA 서열을 분석하고, 각각의 DNA 서열을 정상 KVLQT1 유전자의 공지된 DNA 서열과 비교함으로써 진단된다. 또한, 피검체의 KVLQT1 유전자는 LQT를 야기시키는 돌연변이에 대해 스크리닝될 수 있다. LQT의 예측은 의사가 현재의 의학 요법을 이용하여 이 질환을 예방할 수 있도록 할 것이다. 본 발명은 또한 KVLQT1 및 minK 단백질이 함께 회합하여 심장 I_Ks칼륨 채널을 형성한다는 발견에 관한 것이다. 이러한 지식을 이용하여 세포에서 이 두 단백질을 동시 발현시킬 수 있으며, 그러한 형질전환된 세포는 LQT를 치료 또는 예방하는데 유용한 약물의 스크리닝에 이용될 수 있다.

본 발명의 배경을 설명하거나 또는 그 실시에 관계되는 추가의 상세한 내용을 제공하기 위해 본 명세서에 사용된 문헌 및 다른 자료는 참고로 삽입되며 편의상 각각 첨부된 참고 문헌 리스트로 분류된다.

심부정맥은 모든 자연사의 약 11%의 원인이 되는, 이병률 및 사망율의 공통 원인이다(Kannel, 1987; Willich et al., 1987). 일반적으로, 생명을 위협하는 심실성 빈부정맥을 가진 개체의 징후전 진단 및 치료가 불충분하며, 몇몇 경우에는 의학적 처치가 실제적으로 부정맥 및 사망의 위험을 증가시킨다(New Engl. J. Med. 327, 227 (1992)). 이러한 요인 때문에 심부정맥의 위험에 대한 조기 검출 및 부정맥 예방이 중요성이 크게 된다.

유전적 및 후천적 요인은 둘다 심부정맥의 발병 위험에 기여한다. 장기 QT 증후군(LQT)은 심실성 빈부정맥, 특별하게는 토르사데 데 포인테스(torsade de pointes) 및 심실성 세동으로부터의 돌연한 의식 상실, 실신, 급발작 및 급사를 야기시키는 유전적 심부정맥이다(Ward, 1964; Romano, 1965; Schwartz et al., 1975; Moss et al., 1991). 이 질환은 일반적으로 젊은, 그렇지 않다면 건강한 개체에서 발병한다(Ward, 1964; Romano, 1965; Schwartz, 1975). 대부분의 LQT 유전자 캐리어는 이상 심장 재분극의 신호인, 심전도의 QT 간격의 연장을 나타낸다(Vincent et al., 1992). LQT의 임상적 특징은 일시적인 심부정맥, 특별하게는 이 부정맥 및 심실성 세동에서의 심전도의 특징적인 파동성에 대해 칭하는 토르사데 데 포인테스와 같은 재분극 관련 심실성 빈부정맥으로부터 생긴다(Schwartz et al., 1975: Moss and McDonald, 1970). 토르사데 데 포인테스는 심실성 세동, 특히 치사 부정맥으로 변성될 수 있다. LQT가 통상적인 진단법이 아니긴 하지만, 심실성 부정맥은 매우 일반적이며, 매년 300,000 이상의 미국 시민이 갑자기 사망하며(Kannel, et al., 1987; Willich et al., 1987), 많은 경우에 근원적인 메카니즘은 이상형의 심장 재분극일 수 있다. 그러므로, LQT는 분자 수준에서 생명을 위협하는 심부정맥을 연구할 유일한 기회를 제공한다.

LQT의 유전적 및 후천적 형태 모두가 규정되었다. 후천적 LQT 및 2차 부정맥은 심장 허혈, 서맥 및 대사 이상, 예를 들면 저혈청 칼륨 또는 칼슘 농도로부터 발생할 수 있다(Zipes, 1987). LQT는 또한 항생물질, 항히스타민제, 일반 마취제 및 가장 통상적으로는 항부정맥제 투약을 비롯한 특정 투약에 의한 치료로 인해 생길 수도 있다(Zipes, 1987). 유전적 LQT 형태는 3가지 이상의 다른 유전자의 돌연변이의 결과로부터 생긴다. 예전의 연구에서, LQT 자리는 염색체 11p15.5(LQT1) (Keating et al., 1991a; Keating et al., 1991b), 7q35-36(LQT2) 및 3p21-24(LQT3) (Jiang et al., 1994)에 맵핑되었다. 이중에서, 유전적 LQT의 가장 통상적인 원인은 LQT1이다. 본 출원의 데이터는 유전적 LQT의 50% 이상이 이 유전자의 돌연변이 때문이라는 것을 나타낸다(Q. Wang, 비공개 결과). 최근에, 4번째 LQT 자리(LQT4)는 4q25-27에 맵핑되었다(Schott et al., 1995). 본 출원인의 연구는 염색체 21 상에 위치한 유전자인 minK도 LQT와 관련이 있다는 것을 나타낸다.

이 질환의 상염색체 우성 및 상염색체 열성 형태가 보고되어 있다. 상염색체 열성 LQT(Jervell-Lange-Nielson 증후군으로도 알려짐)는 선천성 신경 난청과 관련이 있으며, 이 형태의 LQT는 드물다(Jervell and Lange-Nielson, 1957). 상염색체 우성 LQT(Romano-Ward 증후군)는 더욱 통상적이며, 다른 표현형 이상과 관련이 없다. 유전적 LQT와 매우 유사한 질환은 일반적으로 약리 요법의 결과로서 얻어질 수도 있다(Schwartz et al., 1975; Zipes, 1987).

이 데이터는 LQT의 부정맥 메카니즘과 관계가 있다. LQT에 대한 2가지 가설이 이미 제안되어 있다(Schwartz et al., 1994). 한가지는 좌측 자율 신경 지배의 우세가 이상 심장 재분극 및 부정맥을 야기시킨다는 것을 제안한다. 이 가설은 개에서 부정맥이 우 성상 신경절의 제거에 의해 유도될 수 있다는 발견에 의해 지지된다. 또한, 다른 증거는 일부 LQT 환자가 β-아드레날린 차단제에 의해 또한 좌 성상 신경절 절제에 의해 효과적으로 치료된다는 것을 제시한다(Schwartz et al., 1994). LQT 관련 부정맥에 대한 두번째 가설은 심장 특이적 이온 채널 유전자, 또는 심장 이온 채널을 조절하는 유전자의 돌연변이가 지연된 근세포 재분극을 야기시킨다는 것을 제안한다. 지연된 근세포 재분극은 L-타입 칼슘 채널의 활성화를 촉진시킬 수 있으며, 그 결과 2차 탈분극이 일어난다(January and Riddle, 1989). 이러한 2차 탈분극은 거의 토르사데 데 포인테스 부정맥의 세포 메카니즘과 같다(Surawicz, 1989). 이러한 가설은 칼륨 채널의 약리학적 차단이 인간 및 동물 모델에서 QT 연장 및 재분극 관련 부정맥을 유도할 수 있다는 관찰에 의해 지지된다(Antzelevitch and Sicouri, 1994). LQT의 한 형태가 심장 칼륨 채널 유전자의 돌연변이로부터 발생한다는 발견은 근세포 가설을 지지한다.

1991년에, 상염색체 우성 LQT 및 HRAS에서의 다형체 사이의 완전한 연결이 보고되었다(Keating et al., 1991a; Keating et al., 1991b). 이러한 발견은 LQT1을 염색체 11p15.5에 정위화시켰고 몇몇 과에서 징후전 진단을 가능하게 하였다. 상염색체 우성 LQT는 예전에는 유전적으로 상동성인 것으로 생각되었으며, 연구되었던 처음 일곱 과는 11p15.5에 연결되었다(Keating et al., 1991b). 1993년에, LQT에 대해 위치 이종성이 있음을 발견하였다(Benhorin et al., 1993; Curran et al., 1993; Towbin et al., 1994). 2가지 추가의 LQT 위치는, 염색체 7q35-36(아홉 과) 상의 LQT2 및 3p21-24(세 과) 상의 LQT3으로 이후에 확인되었다(Jiang et al., 1994). 대여섯 과는 알려진 위치에 연결되지 않은 채로 남아있으며, 그것은 LQT에 대해 다른 위치 이종성을 나타내는 것이다. 이러한 이종성 정도는 별개의 LQT 유전자가 심장 재분극 및 부정맥 위험을 조절하기 위해 상호 작용하는 단백질을 코딩할 수 있다는 것을 암시한다.

LQT의 생리 기능에 대해서는 거의 알려지지 않았지만, 이 질환은 이상 심장 재분극의 신호인, 심전도 상의 QT 간격의 연장과 관련이 있다. 이러한 관련은 이온 채널을 코딩하는 유전자, 또는 그의 조절 인자가 LQT의 적당한 후보라는 것을 암시한다. 염색체 11p15.5에 위치된 HRAS는 직접적인 DNA 서열 분석을 기초로 하여 (비공개 관찰) 연결 분석에 의해 LQT1의 후보로서 배제되었다(Roy et al., 1994). 신경 내분비 칼슘 채널 유전자(CACNL1A2; Chin et al., 1991; Seino et al., 1992) 및 칼륨 채널을 조절하는 GTP 결합 단백질을 코딩하는 유전자(GNAI2; Weinstein et al., 1988; Magovcevic et al., 1992)는 그의 염색체 위치를 기초로 하여 LQT3의 후보가 되었다. 그러나, 이후의 연결 분석은 이러한 유전자를 고려하지 않았다(Wang and Keating, 비공개 데이터). 골격근 클로라이드 채널(CLCN1; Koch et al., 1992) 및 심장 무스카린-아세틸콜린 수용체(CHRM2; Bonner et al., 1987)는 그의 염색체 7q35-36 위치를 기초로 하여 LQT2의 후보가 되었지만, 이후의 연결 분석은 이러한 유전자를 배제시켰다(Wang et al., 보고됨).

이론적으로, 심장 나트륨 채널 유전자의 돌연변이는 LQT를 야기시킬 수 있다. 전압 게이트 제어된 나트륨 채널은 심실 근세포에서의 신속한 탈분극을 조정하며 또한 작용 전위의 안정 상 중에 작은 전류를 전도한다(Attwell et al., 1979). 나트륨 채널 기능의 미세한 이상(예를 들면, 지연된 나트륨 채널 불활성화 또는 채널 불활성화의 변화된 전압 의존성)은 심장 재분극을 지연시킬 수 있어, QT 연장 및 부정맥을 유도한다. 1992년에, 겔렌(Gellens)과 그의 동료들은 심장 나트륨 채널 유전자, SCN5A를 클로닝시키고 특징화시켰다(Gellens et al., 1992). 이 유전자의 구조는 2016 아미노산의 거대 단백질을 코딩하는, 이미 특징화된 다른 나트륨 채널과 유사하였다. 이 채널 단백질은 각각 6개의 추정 멤브레인 스패닝 세그먼트(S1-S6)를 함유하는 4개의 상동성 도메인(DI-DIV)을 함유한다. SCN5A는 최근에 염색체 3p21에 맵핑되어 LQT3에 대한 우수한 후보 유전자가 되었으며(George et al., 1995), 그후에 이 유전자는 LQT3과 관련이 있는 것으로 판명되었다(Wang et al., 1995a).

1994년에, 웜키 및 가네쯔키(Warmke and Ganetzky)는 새로운 인간 cDNA, 인간 에테르 a-go-go 관련 유전자를 확인하였다(HERG, Warmke and Ganetzky, 1994). HERG는 체세포 하이브리드 패널의 PCR 분석에 의해 인간 염색체 7에 정위화되어(Warmke and Ganetzky, 1994) LQT2에 대한 후보가 된다. HERG에 의해 코딩된 단백질의 기능은 알려지지 않았지만, 그것은 칼륨 채널과 상동성인 예측된 아미노산 서열을 갖는다. HERG는 칼슘 조절된 칼륨 채널을 코딩하는, 드로소필라(Drosophila) 에테르 a-go-go 유전자(eag)에 대한 상동성에 의해 해마 cDNA 라이브러리로부터 분리되었다(Bruggeman et al., 1993). HERG는 eag의 인간 동족체는 아니지만, ∼50% 아미노산 서열 상동성 만은 갖는다. HERG는 LQT2와 관련이 있는 것으로 나타났다(Curran et al., 1995).

KVLQT1으로 불리우는 새로운 칼륨 채널 유전자가 발견되었다. 본 명세서에 KVLQT1이 LQT1라는 것을 나타내는 증거가 제시되어 있다. KVLQT1에 돌연변이가 있는 16개의 과를 확인하고 특징화시켰으며 16 모든 과에서 LQT1과 KVLQT1 사이에 완전한 결합이 있는 것으로 나타났다. KVLQT1은 염색체 11p15.5에 맵핑되어 있어 LQT1에 대한 후보 유전자가 된다. KVLQT1은 칼륨 채널의 구조적 특징을 갖는 단백질을 코딩하며, 노던 블롯 분석에 의해 측정된 유전자의 발현은 KVLQT1이 심장에서 가장 강하게 발현하는 것을 입증하였다. LQT를 야기시키는 하나의 유전자내 결실 및 10개의 다른 미스센스 돌연변이가 KVLQT1에서 확인되었다. 이러한 데이터는 KVLQT1을 새로운 심장 칼륨 채널 유전자로서 정의하며 이 유전자의 돌연변이가 심실성 빈부정맥 및 급사에 대해 민감성을 야기시킨다는 것을 나타낸다.

I_Ks 채널의 한 성분은 단일 추정 트랜스멤브레인 도메인을 갖는 130 아미노산 단백질인 minK인 것으로 알려졌다(Takumi et al., 1988; Goldstein and Miller, 1991; Hausdorff et al., 1991; Takumi et al., 1991; Busch et al., 1992; Wang and Goldstein, 1995; Wang et al., 1996). 이 단백질의 크기 및 구조로는 minK 단독으로 기능적 채널을 형성하는 것이 불가능한 것으로 보인다(Attali et al., 1993; Lesage et al., 1993). KVLQT1과 minK가 함께 회합하여 심장 I_Ks 칼륨 채널을 형성하는 증거가 제시되었다. I_Ks 기능 이상은 심부정맥의 원인이다.

발명의 요약

본 발명은 장기 QT 증후군의 분자 기본 원리를 입증하는 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 KVLQT1 유전자의 분자 변이체가 LQT의 발병을 야기시키거나 또는 그에 관련되는 것을 확인하였다. 유전자형 분석 결과는 KVLQT1이 16개의 비관련 과에서 LQT1에 완전히 연결됨을 나타낸다. KVLQT1 유전자의 분석은 LQT를 앓는 대상의 조기 진단을 가능하게 할 것이다. 이 진단 방법은 피검체의 KVLQT1 유전자의 DNA 서열을 분석하고, 그것을 정상 비변이 유전자의 DNA 서열과 비교하는 것으로 이루어진다. 제2 실시태양에서, 피검체의 KVLQT1 유전자는 LQT를 야기시키는 돌연변이에 대해 스크리닝된다. 의사는 LQT를 예측함으로써 베타 차단제와 같은 의학 요법으로 이 질환을 예방할 수 있을 것이다.

또한, KVLQT1 및 minK 단백질이 함께 회합하여 심장 I_Ks칼륨 채널을 형성하는 것이 입증되었다. I_Ks기능 이상은 심부정맥의 원인이다. 이러한 두 단백질이 함께 회합하여 I_Ks채널을 형성한다는 사실은 LQT1을 치료하거나 또는 예방하는데 유용한 약물에 대한 스크리닝 분석법을 개발하는데 유용하다. 난모세포와 같은 세포 내에서 야생형 및 그의 돌연변이형 유전자를 둘다 동시 발현시킴으로써, I_Ks채널에 대해 효과를 갖는 약물을 스크리닝할 수 있다. 이러한 사실은 또한 LQT를 앓는 대상의 조기 진단을 위한 minK 유전자의 분석에도 유용하다. 이 진단 방법은 KVLQT1에 대해 상기한 바와 같이 수행된다.

도 1은 LQT 가계 1532 일부의 계도 구조이다. 이환된 개체는 공백이 메워진 원(여) 또는 사각형(남)으로서, 이환되지 않은 개체는 비워진 부호로서, 불분명한 표현형을 가진 개체는 점각법으로 나타내었다. 염색체 11 마커에 대한 유전자형은 각 부호 바로 아래에 하플로타입(haplotype)으로 나타내었다. 마커 순서(상단에서 하단)는 Tel-HRAS-D11S922-TH-D11S1318-D11S454-D11S860-D11S12-Cen이다. 하플로타입의 정확도는 추가의 염색체 11p15.5 마커로부터의 유전자형을 이용하여 보장되었다(Q. Wang, 비공개 결과). 추론된 유전자형은 괄호안에 나타내었다. 질환 염색체는 박스에 의해 표시되었으며 재조합은 짙은 수평선으로 표시되었다. 질환에 걸린 염색체 재조합은 개체에서 일어난다: IV-22, IV-25, V-6, V-17, V-24, V-34, VI-13, VI-14 및 VI-16. 비질환 염색체에서 일어나는 재조합은 표시되지 않았다. KVLQT1은 프라이머 5 및 6에 의해 확인된 KVLQT1 내의 SSCP 이형태체이며, 이 이형태체는 K1532에서 유일하게 확인되었으며 질환 관련 돌연변이를 나타낸다(대립 유전자 2는 돌연변이 대립 유전자임). 하플로타입 분석은 KVLQT1이 플랭킹 마커 D11S922 및 D11S454 사이에 위치한다는 것을 나타낸다.

도 2는 LQT1 영역의 물리적 지도이다. 염색체 11의 표의문자는 LQT1의 대략적 위치를 나타낸다(11p15.5). 다형 마커 및 몇몇 코스미드의 위치는 지도 상에 수직선으로 표시하였다. 정밀한 유전자 지도에는 TH와 D11S454 사이에 LQT1이 위치된다. TH와 D11S454 사이의 거리는 펄스계 겔 분석에 의해 <700 kb로서 평가되었다. 최소 셋트의 중첩 YAC 및 P1 클론의 물리적 지도를 나타내었다. KVLQT1 cDNA의 위치 및 트랩핑된 엑손을 나타내었다. YACs의 대쉬선은 키메라를 나타낸다.

도 3A 및 3B는 KVLQT1(처음 34 아미노산을 코딩하는 영역은 포함하지 않음)의 뉴클레오티드 및 추론된 아미노산 서열을 나타낸다. (A)에는 KVLQT1의 복합 서열이 표시되어 있다. 이 뉴클레오티드 서열은 서열 15이다. 아미노산 서열은 서열 16이다. 6개의 추정 트랜스멤브레인 세그먼트(S1 내지 S6) 및 추정 공극 영역(Pore)이 표시되어 있다. 잠재적인 글리코실화 부위(N160)를 밑줄로 강조하였다. 2개의 일치 폴리아데닐화 시그날은 3' 비번역화된 영역에 굵게 표시하였다. KVLQT1에 대한 복합 cDNA 서열은 중첩 cDNA 클론의 말단 서열화에 의해 또한 프라이머 워킹에 의해 얻었다. KVLQT1 서열은 진뱅크(GenBank) 가입 번호 U40990으로 지정되었다. (B)에는 드로소필라 쉐이커(Drosophila Shaker) 칼륨 채널, DMSHAKE1(SHA)을 갖는 KVLQT1의 S1-S6 영역의 배열이 나타나 있다(Pongs et al., 1988). 동일성(｜) 및 유사성(:)이 표시되어 있다. KVLQT1의 3개의 별개의 단편은 순서대로 서열 17, 서열 18 및 서열 19이다. DMSHAKE1의 3개의 별개의 단편은 순서대로 서열 20, 서열 21 및 서열 22이다.

도 4는 KVLQT1 조직 발현 패턴이다. 노던 분석은 인간의 신장, 폐, 태반, 및 심장의 3.2 kb KVLQT1 mRNA를 밝혀내었으며, 그중 심장에서 최고 수준으로 밝혀졌다.

도 5A 내지 5D는 가계 K1532(도 5A), K2605(도 5B), K1723(도 5C) 및 K1807(도 5D)내의 LQT와 동시 단리된 KVLQT1 미스센스 돌연변이를 나타낸다. 프라이머 쌍 5-6(K1532), 프라이머 쌍 9-10(K1723, K1807) 및 프라이머 쌍 11-12(K2605)에 의한 SSCP 분석의 결과를 각 계도 아래에 나타내었다. 이상 SSCP 이형태체(^*로 표시됨)는 각 가계내의 LQT와 동시분리한다. K1532에 대해서, 217 개체 중 8 만을 나타내었으며, K1532의 추가의 구성원에 대한 SSCP 분석 결과는 도 1에 나타내었다(KVLQT1 대립 유전자 2). K161 및 K162 내의 LQT와 동시 분리하는 이상 SSCP 이형태체는 K1807에 한정된 이상 이형태체와 동일하므로 이 가계에 대한 결과는 나타내지 않았다. 정상 이형태체(좌측) 및 이상 이형태체(우측)의 DNA 서열 분석의 결과는 각 계도 아래에 나타내었다.

도 6A 내지 6G는 가계 K13216(도 6A), K1777(도 6B), K20925(도 6C), K2557(도 6D), K13119(도 6E), K20926(도 6F) 및 K15019(도 6G) 내의 LQT와 조합된 KVLQT1 유전자내 결실 및 미스센스 돌연변이를 나타낸다. 프라이머 쌍 1-2(K13216, K2557, K13119, K15019), 프라이머 쌍 7-8(K1777, K20926) 및 프라이머 쌍 9-10(K20925)에 의한 SSCP 분석 결과를 각 계도 아래에 나타내었다. K2050, K163 및 K164 내의 LQT와 동시 분리하는 이상 SSCP 이형태체는 K1723 및 K1807에 한정된 이상 이형태체와 동일하므로 이 가계에 대한 결과는 나타내지 않았다. 정상 이형태체(좌측) 및 이상 이형태체(우측)의 DNA 서열 분석 결과는 각 계도 아래에 나타내었다. 서열은 안티센스 가닥 위에 나타내었다.

도 7은 KVLQT1 단백질의 예측된 위상 및 KVLQT1 돌연변이의 위치의 개략도이다.

도 8A 및 8B는 인간 및 크세노퍼스(Xenopus) KVLQT1의 구조 및 인간 KVLQT1의 조직 발현 패턴을 나타낸다. (A)는 인간 및 일부 크세노퍼스 KVLQT1 아미노산 서열을 비교한 것이다. 수직선은 동일한 잔기를 나타낸다. 크세노퍼스 아미노산 서열은 서열 23이며 인간 아미노산 서열은 서열 24이다. (B)는 인간 심장, 태반, 폐, 신장 및 췌장내의 KVLQT1의 발현을 나타내는 노던 분석을 나타낸다.

도 9A 내지 9E는 CHO 세포의 KVLQT1 및 hminK 동시 발현이 심장 I_Ks와 거의 동일한 전류를 유도하는 것을 나타낸다. (A)는 -80 mV의 보유 전위로부터 인가된, -50 내지 +40 mV의 멤브레인 전위에 대해 1초 탈분극 펄스 중에 기록된 KVLQT1 전류를 나타낸다. (B)는 KVLQT1(n=6; 1초 펄스) 또는 KVLQT1 및 hminK(n=7; 7.5초 펄스)로 형질감염된 세포에 대해 정규화된 등시성 활성화 곡선을 나타낸다. C-E)는 hminK(C), KVLQT1(D) 또는 KVLQT1 및 hminK(E)로 형질감염된 세포에서 -40, -20, -10, 0, +20 및 +40 mV에 대해 7.5초 펄스 중에 기록된 전류를 나타낸다. 테일 전류는 D에서 -70 mV에서, C 및 E에서 -50 mV에서 측정되었다. +40 mV에서 정상 상태 KVLQT1 전류의 진폭은 0.37 ± 0.14 nA(n=6)였다. KVLQT1 및 hminK로 동시 형질감염된 세포에서, +40 mV에 대해 7.5초 펄스 중의 시간 의존성 전류는 1.62 ± 0.39 nA(n=7)였다.

도 10A 내지 10C는 크세노퍼스 난모세포에서의 KVLQT1의 발현을 나타낸다. (A)는 12.5 ng KVLQT1 cRNA로 주입된 난모세포에서 기록된 전류를 나타낸다. 펄스는 -70에서 +40 ㎷까지 10 ㎷ 증가분으로 인가되었다. (B) KVLQT1 전류에 대한 등시성(1s) 활성화 곡선을 나타낸다. V_½는 -14.0 ± 0.2 mV였고 기울기 팩터는 11.2 ± 0.2 ㎷(n=9)였다. (C)는 E_rev대 log[K⁺]_e의 관계는 선형 함수로 적합하며 49.9 ±0.4 ㎷의 기울기를 가졌다(n=포인트 당 6-7 난모세포). 테일 전류는 +10 ㎷에 대해 1.6초 예비펄스 후에 5 내지 6 전압에서 측정되었다.

도 11A 내지 11E는 크세노퍼스 난모세포 중의 KVLQT1 동족체의 존재를 암시하는 KVLQT1 및 hminK의 동시 발현을 나타낸다. 전류는 5.8 ng KVLQT1(도 11A), 1 ng hminK로 주입되거나(도 11B), 또는 양쪽의 cRNAs로 동시 주입된(도 11C) 난모세포에서 -40, -20, 0, +20 및 +40 ㎷에서 기록되었다. 도 11D는 KVLQT1에 대해 2초 펄스, 및 hminK, 또는 KVLQT1 및 hminK에 대해 7.5초 펄스를 이용하여 측정된 전류-전압 관계를 나타낸다(n=각 조건 당 20 세포). hminK cRNA 60 pg 또는 1 ng으로 주입된 난모세포에 대해, +40 ㎷에서의 I_sK는 2.11 ± 0.12 ㎂ 및 2.20 ± 0.18 ㎂였다. 도 11E는 hminK로 주입되거나 (V½ = 2.4 ± 0.3 ㎷; 기울기 = 11.4 ± 0.3 ㎷; n=16)로 주입되거나 또는 KVLQT1 및 hminK cRNA로 동시 주입된(V½ = 6.2 ± 0.3 ㎷; 기울기 = 12.3 ± 0.2 ㎷; n=20) 난모세포에 대한 정규화된 등시성 활성화 곡선을 나타낸다.

도 12A 내지 12D는 KVLQT1 cDNA에 대한 뉴클레오티드 서열 및 그의 해독 생성물을 나타낸다.

본 발명은 LQT가 KVLQT1 유전자에 맵핑되고 이 유전자의 분자 변이체가 LQT를 야기시키거나 또는 LQT의 발병에 관련되는지를 확인하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 또한 KVLQT1 및 minK가 동시 회합하여 심장 I_Ks칼륨 채널을 형성하는 것을 확인하는 것에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 KVLQT1 유전자의 돌연변이 및 LQT의 진단에서의 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 LQT를 야기시키는 KVLQT1 유전자 변이체의 존재에 대해서 인간을 스크리닝해보는 방법에 관한 것이다. 이제는 LQT를 조기에(즉, 증상이 나타나기 전에) 또한 더욱 명확히 검출할 수 있기 때문에, LQT를 가진 것으로 확인된 개체에서 더 나은 치료 선택이 이루어질 것이다. 본 발명은 또한 LQT1을 치료하거나 또는 예방하는데 유용한 약물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 돌연변이를 확인하기 위해 KVLQT1 유전자를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 그러한 방법은 또한 KVLQT1 유전자의 일부를 증폭시키는 단계로 이루어질 수 있으며, 또한 KVLQT1 유전자의 상기 부분을 증폭시키기 위한 프라이머인 폴리뉴클레오티드 셋트를 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 이 방법은 LQT를 진단하거나 또는 LQT를 예측하는데 사용하기 위한 돌연변이를 확인하는데 유용하다.

장기 QT 증후군은 심부정맥, 상세하게는 토르사데 드 포인테스(torsade de pointes) 및 심실성 세동으로부터 급사를 야기시키는 유전적 질환이다. LQT는 이미 세 곳에 맵핑되었다: 염색체 11p15.5 상의 LQT1, 7q35-36 상의 LQT2 및 3p21-24 상의 LQT3. 본 발명자들은 LQT1과 심장 칼륨 채널 유전자인 KVLQT1 내의 다형체 사이에 유전적 결합이 있다는 것을 발견하였다.

또한, 본 발명은 염색체 21 상의 minK도 또한 LQT와 관련되어 있다는 것을 입증한다. minK 단백질 및 KVLQT1은 함께 회합하여 K⁺채널을 형성한다. 따라서, 본 발명은 minK 유전자를 스크리닝하여 돌연변이를 확인하는 방법을 제공한다. 그러한 방법도 또한 minK 유전자의 일부를 증폭시키는 단계로 이루어질 수 있으며, 또한 minK 유전자의 상기 부분을 증폭시키기 위한 프라이머인 폴리뉴클레오티드 셋트를 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 이 방법은 LQT를 진단하거나 또는 LQT를 예측하는데 사용하기 위한 돌연변이를 확인하는데 유용하다.

마지막으로, 본 발명은 LQT를 치료하거나 또는 예방하는데 유용한 약물을 확인하기 위해 약물 후보를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 약물 스크리닝은 돌연변이 KVLQT1 및(또는) minK 유전자를 난모세포, 포유동물 세포 또는 유전자 도입 동물과 같은 세포에서 동시 발현시키고, I_Ks채널에 대한 약물 후보의 효과를 분석함으로써 수행된다. 이 효과는 야생형 KVLQT1 및 minK 유전자의 I_Ks채널 활성과 비교된다.

KVLQT1 유전자가 LQT를 야기시키는데 관련이 있다는 증거는 이상 KVLQT1 유전자 생성물 또는 이상 농도의 그 유전자 생성물을 형성하는 이환된 가계 구성원으로부터 추출된 DNA 서열을 발견함으로써 얻어졌다. 그러한 LQT 민감성 대립 유전자는 큰 가계의 질환과 동시 분리할 것이다. 그들은 일반 집단의 개체에서 보다 LQT를 갖는 비 가계 개체에서 더 많은 빈도수로 존재할 것이다. 그 핵심은 유전자 생성물의 정상 기능에 대한 명백한 장해를 야기시키기에 충분히 심각한 돌연변이를 발견하는 것이다. 이러한 돌연변이는 여러 형태를 취할 것이다. 가장 심각한 형태는 유전자가 이상 단백질을 코딩하도록 하는 프레임 이동 돌연변이 또는 거대한 결실 또는 단백질 발현을 상당히 변화시키는 것일 것이다. 덜 심각한 장해 돌연변이는 시스테인 잔기로 또는 그로부터의 변화, 염기성 아미노산으로부터 산성 아미노산으로 또는 그 반대로, 소수성 아미노산으로부터 친수성 아미노산으로 또는 그 반대로와 같은, 생성된 단백질에 대해 상당한 효과를 가질 작은 프레임내 결실 및 비보존성 염기쌍 치환, 또는 2차 또는 3차 단백질 구조에 영향을 미칠 다른 돌연변이를 포함할 것이다. 사일런트 돌연변이 또는 보존성 아미노산 치환에 이르게 하는 것은 일반적으로 단백질 기능을 파괴시키지 않는 것으로 예상될 것이다.

본 발명의 진단 및 예측 방법에 따라서, 야생형 KVLQT1 유전자의 변화가 검출된다. 또한, 그 방법은 야생형 KVLQT1 유전자를 검출하고 이러한 유전자 자리의 결과로서 LQT의 결핍 원인을 확인함으로써 수행될 수 있다. "아생형 유전자의 변화"는 코딩 및 비코딩 영역의 결실, 삽입 및 포인트 돌연변이를 비롯한 모든 형태의 돌연변이를 포함한다. 결실은 전체 유전자 또는 이 유전자의 일부에서만 일어날 수 있다. 포인트 돌연변이는 정지 코돈, 프레임 이동 돌연변이 또는 아미노산 치환으로부터 일어날 수 있다. 체강 돌연변이는 생식세포 계열에서 유전적이지 않은 임의 조직에서만 일어나는 것이다. 생식세포 계열 돌연변이는 신체의 임의 조직에서 발견될 수 있으며 유전적이다. 포인트 돌연변이 결과는 mRNA 발현의 손실 또는 감소를 유도하는, 유전자의 프로모터와 같은 조절 영역에서 일어날 수 있다. 포인트 돌연변이는 KVLQT1 유전자 생성물 발현의 손실 또는 mRNA 안정성 또는 해독 효능의 감소를 유도하는, 적당한 RNA 프로세싱을 완전히 파괴할 수도 있다.

LQT의 존재는 KVLQT1 유전자 또는 minK 유전자의 돌연변이에 대해 인간의 임의 조직을 시험함으로써 확인될 수 있다. 참고로 편의상, KVLQT1 유전자에 관해 다음 설명을 할 것이다. 그러나, 그 설명은 minK 유전자 돌연변이에 대해 시험하는데에도 동일하게 적용될 수 있다. 예를 들면, 유전적인 생식세포 계열 KVLQT1 돌연변이를 갖는 사람에서 LQT가 발병하는 것으로 증명될 것이다. 이것은 사람 신체의 임의 조직으로부터 얻은 DNA를 시험함으로써 결정될 수 있다. 더욱 간단하게는, 혈액을 채취하고 그 혈액 세포로부터 DNA를 추출한다. 또한, 태아 검진은 태아 세포, 태반 세포 또는 양막 세포를 KVLQT1 유전자의 돌연변이에 대해 시험함으로써 이루어질 수 있다. 예를 들면, 포인트 돌연변이에 의해서든 또는 결실에 의해서든 야생형 KVLQT1 대립유전자의 변화는 명세서에 논의된 임의 수단에 의해 검출될 수 있다.

DNA 서열 변화를 검출하는데 사용될 수 있는 몇가지 방법이 있다. 직접적인 DNA 서열화, 수동 서열화 또는 자동화된 형광 서열화는 서열 변화를 검출할 수 있다. 다른 방법은 단일 가닥 형태 다형화 분석(SSCP)이다(Orita et al., 1989). 이 방법은 모든 서열 변화를 검출할 수는 없다. 특히, DNA 단편 크기가 200 bp 보다 더 클 경우에 그렇지만 대부분의 DNA 서열 변화를 검출하는데 최적합할 수 있다. 감소된 검출 감도가 단점이지만, SSCP에 의해 가능한 증가된 처리량이 연구를 기초로 한 돌연변이 검출을 위한 직접적인 서열화를 관심있는 실행가능한 대안으로 이용할 수 있게 한다. 그후에, SSCP 겔에 대한 전이된 이동성을 갖는 단편을 서열화하여 DNA 서열 변화의 정확한 특성을 확인한다. 2개의 상보적 DNA 가닥 사이의 미스매치의 검출을 기초로 한 다른 방법은 클램핑된 변성 겔 전기영동법(CDGE)(Sheffield et al., 1991), 이종 이중체(heteroduplex) 분석(HA)(White et al., 1992) 및 화학적 미스매치 분열(CMC)(Grompe et al., 1989)을 포함한다. 상기 방법 중 어느 것도 거대한 결실, 중복 또는 삽입을 검출하지 못할 것이며, 또한 단백질의 전사 또는 해독에 영향을 미칠 조절 돌연변이를 검출하지 못할 것이다. 단백질 절단 분석 또는 비대칭 분석과 같은 이러한 부류의 돌연변이를 검출할 수 있는 다른 방법은 특정 유형의 돌연변이만을 검출하며 미스센스 돌연변이를 검출하지 못할 것이다. DNA 서열 변화를 검출하는 통용되는 방법은 최근(1993)의 그롬프(Grompe)의 보고에서 발견할 수 있다. 일단 돌연변이가 알려지면, 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드(ASO) 혼성화와 같은 대립유전자 특이적 검출 방법이 그 동일한 돌연변이에 대해 다수의 다른 시료을 신속히 스크리닝하는데 이용될 수 있다.

DNA 서열의 다형화를 검출하는 신속한 예비 분석은 하나 이상의 제한 효소에 의한, 바람직하게는 다수의 제한 효소에 의한 DNA 절단을 일련의 서던 블롯으로 관찰함으로써 행해질 수 있다. 각 블롯은 일련의 정상 개체 및 LQT 경우를 포함한다. 혼성화 단편(KVLQT1 자리 부근의 또는 그것을 포함한 서열로 프로빙될 때 대조 DNA와 길이가 다름)을 나타내는 서던 블롯은 가능한 돌연변이를 나타낸다. 매우 거대한 제한 단편을 생산하는 제한 효소가 이용된다면, 펄스계 겔 전기영동법(PFGE)이 이용된다.

포인트 돌연변이의 검출은 당업계에 공지된 기술을 이용한 KVLQT1 대립유전자의 분자 클로닝 및 그 대립유전자의 서열화에 의해 성취될 수 있다.

민감성 대립유전자의 존재를 확인하기 위한 더욱 완전하고, 여전히 간접적인 시험을 위한 6가지 공지된 방법이 있다. 1) 단일 가닥 형태 분석(SSCP)(Orita et al., 1989); 2) 변성 구배 겔 전기영동법(DGGE)(Wartell et al., 1990; Sheffield et al., 1989); 3) RNase 보호 분석(Finkelstein et al., 1990; Kinszler et al., 1991); 4) 대립 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드(ASOs)(Conner et al., 1983); 5) 이. 콜리 mutS 단백질과 같은, 뉴클레오티드 미스매치를 인지하는 단백질의 사용(Modrich, 1991); 및 6) 대립유전자 특이적 PCR(Rano and Kidd, 1989). 대립유전자 특이적 PCR을 위해서, 프라이머는 특별한 KVLQT1 돌연변이에 그의 3' 말단에서 혼성화하는 프라이머가 사용된다. 특별한 돌연변이가 존재하지 않는다면, 증폭 생성물이 관찰되지 않는다. 유럽 특허 출원 공보 제0332435호 및 뉴튼(Newton) 등의 문헌(1989)에 기재된 바와 같이 앰플리케이션 리프랙토리 뮤테이션 시스템(ARMS)이 사용될 수도 있다. 유전자의 삽입 및 결실은 클로닝, 서열화 및 증폭에 의해 검출될 수도 있다. 또한, 유전자 또는 주위 마커 유전자를 위한 제한 단편 길이 다형화(RFLP) 프로브가 대립유전자의 변화 또는 다형화 단편내의 삽입을 기록하는데 사용될 수 있다. 그러한 방법은 이환된 개체를 그 개체에서 발견된 돌연변이의 존재에 대해 스크리닝하는데 특히 유용하다. 당업계에 공지된 바와 같은 삽입 및 결실을 검출하기 위한 다른 기술이 이용될 수 있다.

처음 세가지 방법(SSCP, DGGE 및 RNase 보호 분석)에서, 새로운 전기영동 밴드가 나타난다. SSCP는 차별화하여 이동하는 밴드를 검출하는데, 그 이유는 서열 변화가 단일 가닥, 분자내 염기쌍의 차이를 야기시키기 때문이다. RNase 보호는 돌연변이 폴리뉴클레오티드를 2개 이상의 더 작은 단편으로 분해하는 것을 포함한다. DGGE는 변성 구배 겔을 이용하여 야생형 서열에 비해 돌연변이 서열의 이동 속도의 차이를 검출한다. 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 분석에서, 특이적 서열을 검출하는 올리고뉴클레오티드가 계획되고, 그 분석은 혼성화 시그날의 존재 또는 부재를 검출함으로써 수행된다. mutS 분석에서, 단백질은 돌연변이 및 야생형 서열 사이의 이종 이중체의 뉴클레오티드 미스매치를 포함하는 서열에만 결합한다.

본 발명에 따른 미스매치는 2가닥이 100% 상보적이지 않은 혼성화된 핵산 이중체이다. 전체 상동성의 결핍은 결실, 삽입, 역위 또는 치환으로 인한 것일 수 있다. 미스매치 검출은 유전자 또는 그의 mRNA 생성물내의 포인트 돌연변이를 검출하는데 이용될 수 있다. 이러한 기술이 서열화 보다 덜 민감하긴 하지만, 다수의 시료에 대해 실시하기에는 더 간단하다. 미스매치 분해 기술의 예는 RNase 보호 방법이다. 본 발명의 실시에서, 이 방법은 인간 야생형 KVLQT1 유전자 코딩 서열에 상보적인 표지화된 리보프로브의 사용을 포함한다. 사람으로부터 단리된 mRNA 또는 DNA 및 리보프로브는 함께 어닐링(혼성화)되고, 이어서 이중체 RNA 구조의 약간의 미스매치를 검출할 수 있는 효소 RNase A로 분해된다. 미스매치가 RNase A에 의해 검출된다면, 그것은 미스매치의 부위에서 분해한다. 따라서, 어닐링된 RNA 제조물이 전기영동 겔 매트릭스 상에서 분리될 때, 미스매치가 RNase A에 의해 검출되고 분해되었다면, RNA 생성물은 리보프로브 및 mRNA 또는 DNA에 대한 완전 길이 이중체 RNA 보다 더 작은 것으로 관찰될 것이다. 리보프로브는 mRNA 또는 유전자의 완전 길이일 필요는 없지만, 어느쪽의 세그먼트일 수는 있다. 리보프로브가 mRNA 또는 유전자의 세그먼트로만 이루어진다면, 전체 mRNA 서열을 미스매치에 대해 스크리닝하는데에 이러한 다수의 프로브를 사용할 필요가 있을 것이다.

유사한 방식으로, DNA 프로브는 효소적 또는 화학적 분해를 통해 미스매치를 검출하는데 사용될 수 있다(Cotton et al., 1988; Shenk et al., 1975; Novack et al., 1986). 또한, 미스매치는 매치된 이중체에 상대적인 미스매치된 이중체의 전기영동법의 이동도 전이에 의해 검출될 수 있다(예를 들면, Cariello, 1988). 리보프로브 또는 DNA 프로브를 이용하여, 돌연변이를 함유할 수 있는 세포 mRNA 또는 DNA를 혼성화 이전에 PCR(하기 참조)을 이용하여 증폭시킬 수 있다. KVLQT1 유전자의 DNA 변화는, 특히 변화가 결실 및 삽입과 같은 총체적인 재배열이라면 서던 혼성화를 이용하여 검출할 수도 있다.

PCR을 이용하여 증폭되었던 KVLQT1 유전자의 DNA 서열은 대립유전자 특이적 프로브를 이용하여 스크리닝될 수도 있다. 이러한 프로브는 핵산 올리고머이며, 그 각각은 알려진 돌연변이를 갖는 유전자 서열의 영역을 포함한다. 예를 들면, 한 올리고머는 유전자 서열의 일부에 해당하는 길이가 약 30 뉴클레오티드일 수 있다. 그러한 대립유전자 특이적 프로브의 장치를 이용하여, 유전자내에서 이미 확인된 돌연변이의 존재를 확인하기 위해 PCR 증폭 생성물을 스크리닝할 수 있다. 증폭된 KVLQT1 서열과 대립유전자 특이적 프로브의 혼성화는 예를 들면 나일론 필터 상에서 행해질 수 있다. 엄격한 혼성화 조건하에서의 특별한 프로브에 대한 혼성화는 대립유전자 특이적 프로브에서와 동일한 조직내 돌연변이의 존재를 나타낸다.

후보 위치에서의 돌연변이에 대한 가장 명확한 시험은 대조 집단과 환자로부터 얻은 게놈 KVLQT1 서열을 직접 비교하는 것이다. 또한, 예를 들면, PCR에 의한 증폭 후에 메신저 RNA를 서열화함으로써 후보 유전자의 엑손 구조를 확인할 필요성이 없어지게 된다.

KVLQT1의 코딩 영역 밖의 환자의 돌연변이는 유전자 부근 또는 유전자 내의 조절 서열 및 인트론과 같은 비코딩 영역을 시험함으로써 검출될 수 있다. 비코딩 영역의 돌연변이가 중요하다는 조기 판단은 대조 개체에 비해 환자의 이상 크기의 또는 풍부한 메신저 RNA 분자를 밝히는 노던 블롯 실험에 의해서 이루어질 수 있다.

KVLQT1 mRNA 발현의 변화는 당업계에 공지된 임의 기술에 의해 검출될 수 있다. 공지 방법으로는 노던 블롯 분석, PCR 증폭 및 RNase 보호가 있다. 감소된 mRNA 발현은 야생형 유전자의 변화를 나타낸다. 야생형 유전자의 변화는 야생형 KVLQT1 단백질의 변화에 대해 스크리닝함으로써 검출될 수도 있다. 예를 들면, KVLQT1과 면역반응성이 있는 모노클로날 항체는 조직을 스크리닝하는데 이용될 수 있다. 가계 항원의 결핍은 돌연변이를 나타낼 것이다. 돌연변이 대립유전자의 생성물에 특이적인 항체는 돌연변이 유전자 생성물을 검출하는데 이용될 수도 있다. 그러한 면역학적 분석은 당업계에 공지된 편리한 포맷으로 실시될 수 있다. 그 예로는 웨스턴 블롯, 면역조직화학 분석 및 ELISA 분석이 포함된다. 변화된 KVLQT1 단백질을 검출하는 임의의 수단은 야생형 KVLQT1 유전자의 변화를 검출하는데 이용될 수 있다. 단백질 결합 확인과 같은 기능적 분석법이 이용될 수 있다. 또한, KVLQT1 생화학 기능을 검출하는 분석법이 이용될 수 있다. 돌연변이 KVLQT1 유전자 생성물의 발견은 야생형 KVLQT1 유전자의 변화를 나타낸다.

돌연변이 KVLQT1 유전자 또는 유전자 생성물은 혈청, 대변, 뇨 및 객담과 같은 다른 인체 시료에서 검출될 수도 있다. 조직내의 돌연변이 유전자 또는 유전자 생성물의 검출을 위해 상기 논의된 동일한 기술은 다른 신체 시료에 적용될 수도 있다. 그러한 신체 시료을 스크리닝함으로써 LQT에 대한 간단한 조기 진단이 이루어질 수 있다.

본 발명의 프라이머 쌍은 PCR을 이용하여 특별한 KVLQT1 또는 minK의 뉴클레오티드 서열을 결정하는데 유용하다. KVLQT1에 대한 단일 가닥 DNA 프라이머 쌍은 KVLQT1 유전자 자체의 DNA 합성의 증폭을 준비하기 위하여 염색체 11 상의 KVLQT1 유전자 내 또는 그것을 둘러싸는 서열에 어닐링될 수 있다. minK에 대한 단일 가닥 DNA 프라이머 쌍은 minK 유전자 자체의 DNA 합성의 증폭을 준비하기 위하여 염색체 21 상의 minK 유전자 내 또는 그것을 둘러싸는 서열에 어닐링될 수 있다. 이러한 완전한 셋트의 프라이머는 모든 유전자의 뉴클레오티드 코딩 서열, 즉 엑손의 합성을 가능하게 한다. 이러한 셋트의 프라이머는 바람직하게는 인트론 및 엑손 서열 둘다의 합성을 가능하게 한다. 대립유전자 특이적 프라이머가 사용될 수도 있다. 그러한 프라이머는 특별한 KVLQT1 돌연변이 대립유전자에만 어닐링함으로써 주형으로서 돌연변이 대립유전자의 존재하에 생성물 만을 증폭시킬 것이다.

증폭된 서열의 이후의 클로닝을 용이하게 하기 위하여, 프라이머는 그의 5' 말단에 첨부된 제한 효소 부위 서열을 가질 수 있다. 따라서, 프라이머의 모든 뉴클레오티드는 제한 효소 부위를 형성하는데 필요한 몇몇 뉴클레오티드를 제외하고는, KVLQT1 서열 또는 KVLQT1에 인접한 서열로부터 유래된다. 그러한 효소 및 부위는 당업계에 공지되어 있다. 프라이머 자체도 당업계에 공지된 기술을 이용하여 합성될 수 있다. 일반적으로, 프라이머는 시판되는 올리고뉴클레오티드 합성기를 이용하여 제조될 수 있다. KVLQT1의 서열이 주어지면, 특별한 프라이머의 설계는 당업계의 숙련인에게 자명할 것이다.

본 발명에 의해 제공된 핵산 프로브는 여러 목적에 유용하다. 그것은 상기한 포인트 돌연변이를 검출하기 위한 RNase 보호법에 또한 게놈 DNA에 대한 서던 혼성화에 또한 이용될 수 있다. 프로브는 PCR 증폭 생성물을 검출하는데 이용될 수 있다. 그것은 다른 기술을 이용하여 KVLQT1 유전자 또는 mRNA와의 미스매치를 검출하는데 이용될 수도 있다.

야생형 KVLQT1 유전자를 가진 개체는 LQT를 갖지 않는다는 것을 발견하였다. 그러나, KVLQT1 유전자 생성물의 기능을 저해하는 돌연변이는 LQT의 발병과 관련이 있다. 따라서, 기능 손실, 또는 변화된 기능을 갖는 단백질을 생성하는 변화된 (또는 돌연변이된) KVLQT1 유전자의 존재는 심부정맥의 위험을 증가시키는 LQT를 직접 야기시킨다. KVLQT1 유전자 돌연변이를 검출하기 위하여, 생물학적 시료을 준비하고, 분석될 대립유전자의 서열과 야생형 대립유전자의 서열 사이의 차이에 대해 분석한다. 돌연변이 KVLQT1 대립유전자는 상기한 임의의 기술에 의해 초기에 확인될 수 있다. 그후에, 돌연변이 대립유전자는 특별한 돌연변이 대립유전자의 특정 돌연변이를 확인하기 위해 서열화된다. 또한, 돌연변이 대립유전자는 통상의 기술을 이용하여 돌연변이 (변화된) 단백질을 확인함으로써 초기에 확인될 수 있다. 돌연변이 대립유전자는 그후에 각각의 대립유전자에 대한 특이적 돌연변이를 확인하기 위해 서열화된다. 돌연변이, 특히 단백질의 변화된 기능을 유도하는 것은 본 발명의 진단 및 예측 방법에 사용된다.

KVLQT1 단백질이 minK 단백질과 함께 회합한다는 것이 또한 밝혀졌다. 따라서, minK 유전자 생성물의 기능을 저해하는 minK 돌연변이는 LQT의 발병과 관련이 있다. 따라서, 기능 손실, 또는 변화된 기능을 갖는 단백질을 생성하는 변화된 (또는 돌연변이) minK 유전자의 존재는 심부정맥의 위험을 증가시키는 LQT를 직접 야기시킨다. minK 유전자 돌연변이를 검출하기 위하여, 생물학적 시료을 준비하고, 분석될 대립유전자의 서열과 야생형 대립유전자의 서열 사이의 차이에 대해 분석한다. 돌연변이 minK 대립유전자는 상기한 임의의 기술에 의해 초기에 확인될 수 있다. 그후에, 돌연변이 대립유전자는 통상의 기술을 이용하여 돌연변이 (변화된) 단백질의 특정 돌연변이를 확인하기 위해 서열화된다. 돌연변이 대립유전자는 그후에 각각의 대립유전자에 대한 특이적 돌연변이를 확인하기 위해 서열화된다. 그후에, 돌연변이, 특히 단백질의 변화된 기능을 유도하는 것은 본 발명의 진단 및 예측 방법에 사용된다.

정의

본 발명은 다음 정의를 이용한다.

"프로브". LQT에 감염되기 쉬운 KVLQT1 대립유전자와 관련있는 폴리뉴클레오티드 다형체는 적당히 엄격한 혼성화 및 세척 조건하에서 표적 서열의 것과 안정한 혼성체를 형성하는 폴리뉴클레오티드 프로브에 의한 혼성화에 의해 검출될 수 있다. 프로브가 표적 서열에 완전히 상보적일 것이 예상된다면 엄격한 조건이 이용될 것이다. 약간의 미스매치가 예상된다면, 예를 들면 프로브가 완전히 상보적이지 않은 결과를 갖는 변이체가 예상된다면 혼성화의 엄격성은 완화될 수 있다. 비특이적/우발적 결합을 방해하는, 즉 노이즈를 최소화하는 조건이 선택된다. 그러한 징후는 돌연변이 뿐만 아니라 중성 DNA 다형체를 확인하는 것이므로, KVLQT1 민감성 대립유전자의 검출을 입증하기 위한 추가의 분석을 필요로 한다.

KVLQT1 대립유전자를 위한 프로브는 KVLQT1 영역 또는 그의 cDNA의 서열로부터 유래될 수 있다. 그 프로브는 KVLQT1 영역의 전부 또는 일부에 미치는, 또한 그 영역에 특이적 혼성화를 가능하게 하는 적당한 길이일 수 있다. 표적 서열이 프로브와 동일한 서열을 함유한다면, 프로브는 약 8 내지 30 염기쌍 범위로 짧을 수 있는데, 그 이유는 혼성체가 엄격한 조건하에서도 비교적 안정할 것이기 때문이다. 약간의 미스매치가 프로브에 의해 예상된다면, 즉 프로브가 변이체 영역에 혼성화할 것으로 감지된다면, 필요한 특이성을 갖는 표적 서열에 혼성화하는 더 긴 프로브가 이용될 수 있다.

그 프로브는 표지 또는 리포터 분자에 부착된 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함할 것이며 표준 방법에 의해 서열 유사성을 갖는 다른 폴리뉴클레오티드 서열을 분리하는데 이용될 수 있다. 프로브를 제조하고 표지화하기 위한 기술은 예를 들면 문헌(Sambrook et al., 1989 또는 Ausubel et al., 1992)을 참고로 하면 된다. 다른 유사한 폴리뉴클레오티드는 상동 폴리뉴클레오티드에 의해 선택될 수 있다. 또한, 이러한 또는 유사한 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 유전자 코드의 중복성을 이용하여 합성되거나 또는 선택될 수 있다. 예를 들면, 사일런트 변화에 의해 (다양한 제한 부위를 형성함으로써) 또는 특별한 시스템을 위한 발현을 최적화하기 위하여 다양한 코돈 치환이 도입될 수 있다. 돌연변이는 폴리펩티드의 특성을 변형시키기 위해, 아마도 폴리펩티드 분해 또는 전환율을 변화시키기 위해 도입될 수 있다.

본 발명의 합성 올리고뉴클레오티드 또는 다른 폴리뉴클레오티드로 이루어진 프로브는 천연 또는 재조합 단일 또는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드로부터 유래되거나 또는 화학적으로 합성될 수 있다. 프로브는 닉(nick) 해독, 클레노우 필-인(Klenow fill-in) 반응에 의해 또는 다른 공지된 방법에 의해 표지화될 수도 있다.

KVLQT1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열로부터 얻은, 약 8개 이상, 일반적으로 약 15개의 뉴클레오티드를 갖는, 약 6 kb 미만, 일반적으로 약 1.0 kb 미만의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부가 프로브로서 바람직하다. 이 프로브는 KVLQT1을 코딩하는 mRNA가 세포 또는 조직에 존재하는지를 확인하는데 이용될 수도 있다.

"조절 서열"은 정상적으로 유전자 자리의 코딩 영역 100 kb 내의 서열에 관한 것이지만, 유전자 발현(유전자의 전사, 및 메신저 RNA의 해독, 스플라이싱, 안정성 등을 포함)에 영향을 미치는, 코딩 영역과 더 먼 것일 수도 있다.

"실질적인 상동성 또는 유사성". 핵산 또는 그의 단편이 다른 핵산(또는 그의 상보적 가닥)과 최적으로 배열될 때(적절한 뉴클레오티드 삽입 또는 결실이 있는 상태로), 뉴클레오티드 염기의 약 60% 이상, 일반적으로 약 70% 이상, 더욱 일반적으로 약 80% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상, 더욱 바람직하게는 약 95-98%이 뉴클레오티드 서열 동일성이 있다면, 핵산 또는 그의 단편은 다른 것과 "실질적으로 상동성인" ("또는 실질적으로 유사한") 것이다.

또한, 핵산 또는 그의 단편이 선택적인 혼성화 조건하에 다른 핵산(또는 그의 상보적 가닥)에, 하나의 가닥에, 또는 그의 상보체에 혼성화될 때 실질적인 상동성 또는 (유사성)이 존재한다. 전체적인 특이성 결핍 보다 실질적으로 더욱 선택적인 혼성화가 일어날 때 혼성화의 선택성이 존재한다. 전형적으로, 약 14 이상의 뉴클레오티드 스트레치에 대해 약 55% 이상의 상동성, 바람직하게는 약 65% 이상, 더욱 바람직하게는 약 75% 이상, 가장 바람직하게는 약 90% 이상의 상동성이 있을 때 선택적인 혼성화가 일어날 것이다(Kanehisa, 1984 참조). 더 길게 스트레치될 수 있는, 상동성 길이 비교는 임의의 실시태양에서 종종 약 9 이상 뉴클레오티드, 일반적으로 약 20 이상 뉴클레오티드, 더욱 일반적으로 약 24 이상 뉴클레오티드, 전형적으로 약 28 이상 뉴클레오티드, 더욱 전형적으로 약 32 이상 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 36 이상 뉴클레오티드 스트레치에 대해 일어날 것이다.

핵산 혼성화는 당업계의 숙련인에 의해 쉽게 이해되는 바와 같이, 염기 조성, 상보적 가닥의 길이, 및 혼성화 핵산 사이의 뉴클레오티드 염기 미스매치의 수 이외에도 염 농도, 온도, 또는 유기 용매와 같은 조건에 의해 영향받을 것이다. 엄격한 온도 조건은 일반적으로 30 ℃ 이상, 전형적으로 37 ℃ 이상, 바람직하게는 45 ℃ 이상의 온도를 포함한다. 엄격한 염 농도 조건은 통상적으로 1000 mM 미만, 전형적으로 500 mM 미만, 바람직하게는 200 mM 미만일 것이다. 그러나, 파라메터의 배합은 임의의 단일 파라메터의 측정 보다 더더욱 중요하다(예를 들면, Wetmur & Davidson, 1968).

프로브 서열은 트리플렉스 또는 다른 고차원 DNA 착체를 형성하는 임의의 조건하에서 이중체 DNA에 특이적으로 혼성화될 수도 있다. 그러한 프로브의 제조 및 적당한 혼성화 조건은 당업계에 공지되어 있다.

재조합 또는 화학적으로 합성된 핵산; 벡터, 형질전환체, 숙주 세포의 제조

본 발명의 다량의 폴리뉴클레오티드는 적당한 숙주 세포에서의 복제에 의해 생성될 수 있다. 원하는 단편을 코딩하기 위한 천연 또는 합성 폴리뉴클레오티드 단편은 재조합 폴리뉴클레오티드 작제물, 일반적으로 원핵 또는 진핵 생물 세포에 도입하고 그안에서 복제할 수 있는 DNA 작제물에 혼입될 것이다. 일반적으로, 폴리뉴클레오티드 작제물은 효모 또는 박테리아와 같은 단세포 숙주에서의 복제에 적합할 것이지만, 배양된 포유 동물 또는 식물 또는 다른 진핵 생물 세포주에 (게놈 내로의 동화와 함께 및 동화 없이) 도입하기 위한 것일 수도 있다. 본 발명의 방법에 의해 생성된 핵산의 정제는 문헌(Sambrook et al., 1989 또는 Ausubel et al., 1992)에 설명되어 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 화학적 합성에 의해, 예를 들면 문헌에 기재된 포스포르아미다이트 방법 또는 문헌에 따른 트리에스테르 방법에 의해 생성될 수도 있고, 상업적, 자동화된 올리고뉴클레오티드 합성기 상에서 실시될 수 있다. 이중 가닥 단편은 상보적 가닥을 합성하고 적절한 조건하에서 가닥을 함께 어닐링시키거나 또는 적절한 프라이머 서열을 갖는 DNA 폴리머라아제를 이용하여 상보적 가닥을 첨가함으로써 화학적 합성의 단일 가닥 생성물로부터 얻을 수 있다.

원핵 또는 진핵 생물 숙주로 도입하기 위해 제조된 폴리뉴클레오티드 작제물은 소정의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 포함한, 그 숙주에 의해 인지되는 복제 시스템으로 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 폴리펩티드 코딩 세그먼트에 작동가능하게 연결된 전사 및 해독 개시 조절 서열도 포함할 것이다. 발현 벡터는 예를 들면, 복제원 또는 자율적 복제 서열(ARS) 및 발현 조절 서열, 프로모터, 인핸서 및 필요한 처리 정보 부위, 예를 들면 리보좀 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위, 전사 종결 서열 및 mRNA 안정화 서열을 포함할 수 있다. 그러한 벡터는 당업계에 공지된 표준 재조합 기술에 의해 제조될 수 있으며, 예를 들면 문헌(Sambrook et al., 1989 또는 Ausubel et al., 1992)에 논의되어 있다.

적절한 프로모터 및 다른 필요한 벡터 서열은 숙주에서 기능적이도록 선택될 것이며, 경우에 따라서는 KVLQT1 또는 minK 유전자와 천연적으로 조합된 것을 포함할 수 있다. 세포주 및 발현 벡터의 실행가능한 배합의 예는 문헌(Sambrook et al., 1989 또는 Ausubel et al., 1992; Metzger et al., 1988)에 설명되어 있다. 많은 유용한 벡터는 당업계에 공지되어 있으며 스트라타진(Stratagene), 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), 프로메가 바이오테크(Promega Biotech) 등과 같은 벤더로부터 구입할 수 있다. trp, lac 및 파아지 프로모터, tRNA 프로모터 및 글리콜 분해 효소 프로모터와 같은 프로모터는 원핵 생물 숙주에 이용될 수 있다. 유용한 효모 프로모터로는 메탈로티오네인, 3-포스포글리세레이트 키나아제 또는 다른 글리콜 분해 효소, 예를 들면 에놀라제 또는 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 말토오스 및 갈락토오스를 이용하게 하는 효소 등을 위한 프로모터 영역을 들 수가 있다. 효모 발현에 사용하기에 적당한 벡터 및 프로모터에 대해서는 문헌(Hitzeman, 유럽 특허 공개 제73,675호)에 더 상세히 기재되어 있다. 적절한 비천연 포유동물 프로모터는 SV40으로부터의 초기 및 후기 프로모터(Fiers et al., 1978) 또는 마우스 몰로니 백혈병 바이러스, 마우스 종양 바이러스, 조류 육종 바이러스, 아데노바이러스 II, 소 유두종 바이러스 또는 폴리오마로부터 유래된 프로모터를 들 수가 있다. 또한, 작제물은 유전자의 다중 카피가 만들어질 수 있게 되는 증폭가능한 유전자(예를 들면, DHFR)에 연결될 수 있다. 적절한 인핸서 및 다른 발현 조절 서열은 문헌(Enhancers and Eukaryotic Gene Expression, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1983))에 기재되어 있다.

그러한 발현 벡터는 자율적으로 복제할 수 있긴 하지만, 숙주 세포의 게놈에 삽입됨으로써 당업계에 공지된 방법에 의해 복제될 수도 있다.

발현 및 클로닝 벡터는 선택가능한 마커, 벡터로 형질전환된 숙주 세포의 생존 또는 성장에 필요한 단백질을 코딩하는 유전자를 포함할 수도 있을 것이다. 이러한 유전자의 존재는 삽입물을 발현하는 숙주 세포만의 성장을 보장한다. 전형적인 선택 유전자는 a) 항생물질 또는 다른 독성 물질, 예를 들면 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 등에 대한 내성을 부여하고, b) 보조적 영양 결핍을 보충하거나, 또는 c) 복합 배지에서 이용할 수 없는 결정적인 영양분, 예를 들면 바실러스를 위한 D-알라닌 라세마아제를 코딩하는 유전자를 공급하는 단백질을 코딩한다. 적당한 선택가능한 마커의 선택은 숙주 세포에 좌우될 것이며, 다른 숙주를 위한 적절한 마커는 당 업계에 공지되어 있다.

당해 핵산을 함유하는 벡터는 시험관내에서 전사되고, 형성된 RNA가 당업계에 공지된 방법에 의해, 예를 들면 주입법(Kubo et al., 1988)에 의해 숙주 세포로 도입되거나 또는 벡터가 숙주 세포 유형에 따라 변화되는 당업계에 공지된 방법, 예를 들면 전기천공법; 염화 칼슘, 염화 루비듐, 인산 칼슘, DEAE-덱스트란, 또는 다른 물질을 이용한 형질감염; 미세투사성 충격; 리포펙션; 감염(벡터가 레트로바이러스 게놈과 같은 병원체인 경우); 및 다른 방법에 의해 숙주 세포로 직접 도입될 수 있다(Sambrook et al., 1989 and Ausubel et al., 1992). 특히 상기한 것을 비롯한 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 숙주 세포로 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것은 본 명세서에서 "형질전환"으로서 언급될 것이다. 상기한 핵산이 도입되는 세포는 그러한 세포의 후손도 포함하는 것으로 의미된다.

본 발명의 다량의 핵산 및 폴리펩티드는 친화성 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 벡터 또는 다른 발현 비히클에 KVLQT1 또는 minK 핵산 또는 그의 일부를 발현시킴으로써 제조될 수 있다. 가장 통용되는 원핵 생물 숙주는 에스케리치아 콜리의 균주이며, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 또는 슈도모나스(Pseudomonas)와 같은 다른 원핵 생물도 사용될 수 있다.

포유 동물 또는 다른 진핵 생물 숙주 세포, 예를 들면 효모, 섬유상 진균류, 식물, 곤충, 또는 양서류 또는 조류 종의 것이 본 발명의 단백질 생성에 유용할 수도 있다. 배양물 중의 포유 동물 세포의 증식법은 그 자체로 공지되어 있다(Jakoby and Pastan (eds.) 1979). 통용되는 포유 동물 숙주 세포주의 예로는 VERO 및 HeLa 세포, 챠이니스 햄스터 난소(CHO) 세포, 및 WI38, BHK, 및 COS 세포주가 있지만, 예를 들면 고도의 발현, 소정의 글리코실화 패턴, 또는 다른 특징을 제공하기 위해서 다른 세포주가 적절할 수 있다는 것은 숙련된 실시자라면 이해하고 있을 것이다.

클론은 벡터 구조 방식에 따라 마커를 이용하여 선택된다. 마커는 동일하거나 또는 상이한 DNA 분자, 바람직하게는 동일한 DNA 분자 상에 있을 수 있다. 원핵 생물 숙주에서는, 형질전환체가 예를 들면, 암피실린, 테트라사이클린 또는 다른 항생물질에 대한 내성에 의해 선택될 수 있다. 온도 민감성을 기준으로 한 특별한 생성물의 생성은 적절한 마커로서 작용할 수도 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 원핵 생물 또는 진핵 생물 세포는 본 발명의 핵산 및 폴리펩티드의 생성에 대해서 뿐만 아니라 KVLQT1 또는 minK 폴리펩티드의 특징을 연구하는 데에서도 유용할 것이다.

본 명세서에 설명된 KVLQT1 유전자 서열을 기준으로 한 프로브 및 프라이머는 다른 종에서 상동 KVLQT1 유전자 서열 및 단백질을 확인하는데 이용된다. 이러한 유전자 서열 및 단백질은 그것이 분리되었던 종에 대한 상기 진단/예측, 치료 및 약물 스크리닝 방법에 이용된다.

사용 방법: 약물 스크리닝

본 발명은 형질전환된 세포, 트랜스팩션된 난모세포 또는 유전자도입 동물 의 KVLQT1 및 minK 단백질을 이용하여 화합물을 스크리닝하는데 특히 유용하다. KVLQT1 또는 minK 단백질의 돌연변이가 심장 I_Ks칼륨 채널의 기능을 변화시킬 수 있으므로, 정상 KVLQT1 또는 minK 단백질 및 돌연변이 minK 또는 KVLQT1 단백질, 각각 또는 돌연변이 KVLQT1 및 돌연변이 minK 단백질을 함유하는 세포를 이용하여 채널에 대한 효과에 대해 후보 약물을 스크리닝한다. 이 약물을 배양액 중의 세포에 첨가하거나 또는 유전자 도입 동물에 투여하고 I_Ks칼륨 채널의 유도 전류에 대한 효과를 야생형 KVLQT1 및 minK를 함유하는 세포 또는 동물의 유도 전류와 비교한다. 유도 전류를 더욱 정상 농도로 변화시키는 약물 후보가 LQT를 치료 또는 예방하는데 유용하다.

사용 방법: 핵산 진단 및 진단 키트

개체를 LQT에 감염되기 쉽게 하는 KVLQT1 또는 minK 대립유전자의 존재를 검출하기 위하여, 혈액과 같은 생물학적 시료을 준비하고 KVLQT1 또는 minK의 민감성 대립유전자의 존재 또는 부재에 대해 분석한다. LQT의 존재를 검출하기 위하여 또는 예측 지표로서, 생물학적 시료을 준비하고 KVLQT1 또는 minK의 돌연변이 대립유전자의 존재 또는 부재에 대해 분석한다. 이러한 시험 결과 및 해석 정보는 피검체와의 연락을 위해 건강 관리 제공자에게 넘겨진다. 그러한 진단은 진단 실험실에 의해 수행하거나, 또는 별법으로 진단 키트를 제조하여 건강 관리 제공자에게 또는 자가 진단을 위해 개인에게 판매한다.

초기에, 스크리닝 방법은 관련 KVLQT1 또는 minK 서열의 증폭을 포함한다. 본 발명의 다른 바람직한 실시태양에서, 스크리닝 방법은 비-PCR 기초 방법을 포함한다. 그러한 스크리닝 방법은 당 업계에 공지된 2단계 표지 증폭 방법을 포함한다. PCR 및 비-PCR 기초 스크리닝 방법은 둘다 표적 서열을 고감도로 검출할 수 있다.

현재 사용되는 가장 선호되는 방법은 표적 증폭이다. 여기에서, 표적 핵산 서열은 폴리머라아제로 증폭된다. 폴리머라아제 유도된 증폭을 이용하는 특히 바람직한 한 방법은 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)이다. 폴리머라아제 연쇄 반응 및 다른 폴리머라아제 유도된 증폭 분석은 폴리머라아제 유도된 증폭 사이클을 이용하여 백만배의 카피 수 증가를 성취할 수 있다. 일단 증폭되면, 형성된 핵산은 서열화되거나 또는 DNA 프로브를 위한 기질로서 사용될 수 있다.

프로브가 표적 서열의 존재를 검출하는데 사용될 때, 혈액 또는 혈청과 같은 분석될 생물학적 시료은 필요시에 핵산을 추출하기 위해 처리될 수 있다. 시료 핵산은 표적 서열의 검출을 용이하게 하기 위한 다양한 방법, 예를 들면 변성, 제한 분해, 전기영동 또는 도트 블롯팅으로 제조될 수 있다. 분석 핵산의 표적화된 영역은 일반적으로 프로브의 표적 서열과의 혼성체를 형성하기 위해 적어도 부분적으로 단일 가닥화되어야 한다. 서열이 천연적으로 단일 가닥이면, 변성은 필요하지 않을 것이다. 그러나, 서열이 이중 가닥이면, 서열은 변성되어야 할 필요가 있을 것이다. 변성은 당 업계에 공지된 다양한 기술로 수행될 수 있다.

분석 핵산 및 프로브는 분석물의 추정 표적화된 서열과 프로브내의 표적 서열의 안정한 혼성체 형성을 촉진시키는 조건하에서 배양된다. 분석물에 결합하는데 사용되는 프로브의 영역은 KVLQT1에 대해서 인간 염색체 11의 표적 영역에 완전히 상보적으로 만들어질 수 있다. 그러므로, 부정확한 양성 반응을 방지하기 위하여 아주 엄격한 조건이 요망된다. 그러나, 아주 엄격한 조건은 프로브가 게놈에서 독특한 염색체의 영역에 상보적인 경우에만 이용된다. 혼성화의 엄격한 조건은 혼성화 중에 또한 세척 절차 중에 많은 요인, 예를 들면 온도, 이온 강도, 염기 조성, 프로브 길이 및 포름아미드 농도에 의해 결정된다. 이러한 요인은 예를 들면 문헌(Maniatis et al., 1982 and Sambrook et al., 1989)에 개략되어 있다. 어떤 상황에서는, 트리플렉스, 콰드라플렉스 등과 같은 고차원 혼성체의 형성이 표적 서열을 검출하는 수단을 제공하는데 바람직할 수 있다.

어쨋든, 결과적인 혼성체의 측정은 일반적으로 표지화된 프로브의 사용에 의해 이루어진다. 별법으로, 프로브는 비표지화될 수 있지만, 직접 또는 간접적으로, 표지화된 리간드와의 특이적 결합에 의해 검출될 수 있다. 적당한 표지 및 프로브 및 리간드 표지화 방법은 당 업계에 공지되어 있으며, 예를 들면 공지된 방법(예를 들면 닉 해독, 랜덤 프라이밍 또는 키나아징)에 의해 포함될 수 있는 방사 표지, 바이오틴, 형광기, 화학발광기(예를 들면, 디옥세탄, 특히 트리거된 디옥세탄), 효소, 항체 등을 포함한다. 이러한 기본 조직의 변화는 당업계에 공지되어 있으며, 외부 물질로부터 검출될 혼성체의 분리를 용이하게 하고(또는) 표지화된 잔기로부터 시그날을 증폭시키는 변화를 포함한다. 이러한 많은 변화 방법은 문헌(Matthews & Kricka, 1988; Landegren et al., 1988; 미국 특허 제4,868,105호 및 유럽 특허 공개 제225,807호)에 설명되어 있다.

상기한 바와 같이, 비-PCR 기초 스크리닝 분석은 또한 본 발명에 포함된다. 이러한 절차는 핵산 프로브(또는 정상 포스포디에스테르를 대신하는 메틸포스포네이트 골격과 같은 유사체)를 저농도 DNA 표적에 혼성화한다. 이 프로브는 공유 결합이 혼성화의 특이성을 방해하지 않도록 프로브에 공유 결합된 효소를 가질 수 있다. 이 효소-프로브-콘쥬게이트-표적 핵산 복합체는 자유 프로브 효소 콘쥬게이트로부터 분리될 수 있고, 기질은 효소 검출을 위해 첨가된다. 효소 활성은 발색 또는 발광 산물의 변화로서 관찰되며, 감도가 10³-10⁶증가된다. 예를 들면, 올리고데옥시뉴클레오티드-알칼린 포스파타아제 콘쥬게이트의 제조 및 혼성화 프로브로서의 그의 용도에 관한 예에 대해서는 문헌(Jablonski et al., 1986)을 참조하면 된다.

2단계 표지 증폭 방법은 당 업계에 공지되어 있다. 작은 리간드(예를 들면, 디곡시게닌, 바이오틴 등)가 KVLQT1을 특이적으로 결합시킬 수 있는 핵산 프로브에 부착되는 원리에 기초한다. 대립유전자 특이적 프로브는 이러한 실시예의 영역내에서 예측되며 예시적인 대립유전자 특이적 프로브는 이 특허 출원의 일어나기 쉬운 돌연변이를 달성하는 프로브를 포함한다.

한 실시예에서, 핵산 프로브에 부착된 작은 리간드는 항체-효소 콘쥬게이트에 의해 특이적으로 인지된다. 이 실시예의 한 실시태양에서, 디곡시게닌은 핵산 프로브에 부착된다. 혼성화는 화학발광 기질을 전환시키는 항체-알칼리 포스파타아제 콘쥬게이트에 의해 검출된다. 이 실시태양에 따른 핵산 프로브를 표지화하는 방법은 문헌을 참조하면 된다(Martin et al., 1990). 제2 실시예에서, 작은 리간드는 제1 리간드에 특이적으로 착체화할 수 있는 제2 리간드-효소 콘쥬게이트에 의해 인지된다. 이 실시예의 잘 알려진 실시태양은 바이오틴-아비딘 유형의 상호작용이다. 핵산 프로브를 표지화하는 방법 및 바이오틴-아비딘 기본 분석에서의 그의 용도에 대해서는 문헌(Rigby et al., 1977 and Nguyen et al., 1992)을 참조하면 된다.

본 발명의 핵산 프로브 분석이 KVLQT1 또는 minK를 검출할 수 있는 핵산 프로브 칵테일을 이용할 것이라는 것이 본 발명의 영역내에서 예측된다. 따라서, 세포 시료에서 KVLQT1의 존재를 검출하는 한 예에서, 유전자에 상보적인 하나 이상의 프로브가 이용되며 특히 다른 많은 프로브가 2, 3 또는 5개의 다른 핵산 프로브 서열이다. 다른 실시예에서는, 환자의 KVLQT1 유전자 서열에서 돌연변이의 존재를 검출하기 위하여, 이 유전자에 상보적인 하나 이상의 프로브를 이용하며, 여기서 칵테일은 KVLQT1이 변화된 환자 집단에서 확인된 대립유전자 특이적 돌연변이에 결합할 수 있는 프로브를 포함한다. 이 실시태양에서, 임의 수의 프로브가 이용될 수 있으며, 바람직하게는 LQT에 걸리기 쉬운 개체로서 확인된 주요 유전자 돌연변이에 해당하는 프로브를 포함한다.

사용 방법: 펩티드 진단 및 진단 키트

야생형 KVLQT1 또는 minK 폴리펩티드의 변화를 기초로 하여 LQT의 존재를 검출할 수도 있다. 그러한 변화는 통상의 기술에 따른 서열 분석에 의해 확인될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 항체(폴리클로날 또는 모노클로날)은 KVLQT1 또는 minK 펩티드의 차이 또는 부재를 검출하는데 이용된다. 항체를 형성하고 정제하는 기술은 당업계에 공지되어 있고 그러한 임의의 기술은 본 발명에 청구된 제조 방법을 성취하도록 선택될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 항체는 KVLQT1 또는 minK 단백질을 용액으로부터 면역침전시킬 뿐만 아니라 웨스턴 또는 폴리아크릴아미드 겔의 이뮤노블롯 상에서 이 단백질과 반응할 것이다. 다른 바람직한 실시태양에서, 항체는 면역세포화학 기술을 이용하여 파라핀 또는 냉동 조직 단편에서 KVLQT1 또는 minK를 검출할 것이다.

KVLQT1 또는 minK 또는 그의 돌연변이를 검출하는 방법에 관한 바람직한 실시태양은 모노클로날 및(또는) 폴리클로날 항체를 이용한 샌드위치 분석을 비롯한 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA), 방사선 면역 분석(RIA), 면역방사 분석(IRMA) 및 면역효소 분석(IEMA)을 포함한다. 예시적인 샌드위치 분석은 본 명세서에 참고로 인용한 문헌(David et al., 미국 특허 제4,376,110호 및 동 제4,486,530호)에 기재되어 있다.

사용 방법: 유전자 요법

본 발명에 따라서, 돌연변이 KVLQT1 또는 minK 대립유전자를 갖는 세포에 각각 야생형 KVLQT1 또는 minK 기능을 공급하는 방법이 제공된다. 그러한 기능의 제공은 수용 세포의 정상적인 기능화를 가능하게 해야 한다. 야생형 유전자 또는 그 유전자의 일부는 유전자가 염색체외에 남아있도록 벡터에서 세포로 도입될 수 있다. 그러한 상황에서, 유전자는 염색체외 위치로부터 세포에 의해 발현될 것이다. 더욱 바람직한 것은 야생형 유전자 또는 그의 일부가 돌연변이 세포에 존재하는 내인성 돌연변이 유전자와 재조합하도록 돌연변이 세포에 도입되는 상황이다. 그러한 재조합은 유전자 돌연변이를 수정하게 하는 이중 재조합을 필요로 한다. 재조합 및 염색체외 유지를 위해 유전자를 도입하기 위한 벡터는 당업계에 공지되어 있으며, 임의의 적당한 벡터가 이용될 수 있다. DNA를 전기천공, 인산 칼슘 동시 침전 및 바이러스 형질도입과 같은, DNA를 세포에 도입하는 방법은 당 업계에 공지되어 있으며, 방법의 선택은 실시자의 권한내에 있다.

일반적으로 상기 논의한 바와 같이, KVLQT1 또는 minK 유전자 또는 단편은 세포내의 그러한 유전자의 발현 생성물의 양을 증가시키기 위하여 유전자 요법에 이용될 수 있다. 돌연변이 유전자가 "정상" 수준으로 발현되는 심장 세포에서도 제공된 LQT 유전자의 발현 정도를 증가시키는 것이 유용할 수도 있지만, 그러한 유전자 생성물이 완전히 기능적이지는 않다.

유전자 요법은 문헌(Friedman, 1991)에 기재된 바와 같이 일반적으로 허용되는 방법에 따라 실시될 것이다. 환자로부터 얻은 세포는 세포내의 KVLQT1 또는 minK 폴리펩티드의 생성을 확인하기 위하여 상기 진단 방법에 의해 처음 분석될 것이다. 발현 조절 요소에 연결되어 세포 내부에 복제할 수 있는 KVLQT1 또는 minK 유전자의 카피를 함유하는 바이러스 또는 플라스미드 벡터(이후에 더 상세히 설명됨)가 제조된다. 적당한 벡터는 미국 특허 제5,252,479호 및 PCT 공개 출원 WO93/07282호에 기재된 바와 같이 알려져 있다. 이 벡터를 환자에게 주입한다. 형질감염된 유전자가 표적화된 세포 각각의 게놈에 영구적으로 삽입되지 않는다면, 주기적으로 반복 처리할 수 있다.

당 업계에 알려진 유전자 전달 시스템은 본 발명의 유전자 요법의 실시에 유용할 수 있다. 이것에는 바이러스 및 비바이러스 전달 방법이 포함된다. 다수의 바이러스가 유전자 전달 벡터로서 사용되었으며, 그 예로는 파포바바이러스(예를 들면, SV40, Madzak et al., 1992), 아데노바이러스(Berkner, 1992; Berkner et al., 1988; Gorziglia and Kapikian, 1992; Quantin et al., 1992; Rosenfeld et al., 1992; Wilkinson et al., 1992; Stratford-Perricaudet et al., 1990), 백신 바이러스(Moss, 1992), 아데노 관련 바이러스(Muzyczka, 1992; Ohi et al., 1990), HSV 및 EBV를 포함한 헤르페스바이러스(Margolskee, 1992; Johnson et al., 1992; Fink et al., 1992; Breakfield and Geller, 1987; Freese et al., 1990), 및 조류의 레트로바이러스(Brandyopadhyay and Temin, 1984; Petropoulos et al., 1992), 마우스(Miller, 1992; Miller et al., 1985; Sorge et al., 1984; Mann and Baltimore, 1985; Miller et al., 1988), 및 인간 공급원(Shimada et al., 1991; Helseth et al., 1990; Page et al., 1990; Buchschacher and Panganiban, 1992)이 있다. 대부분의 인간 유전자 요법 절차는 무능하게된 마우스 레트로바이러스를 기초로 한다.

당 업계에 공지된 비바이러스 유전자 전달 방법으로는 칼슘 포스페이트 동시침전과 같은 화학 기술(Graham and van der Eb, 1973; Pellicer et al., 1980); 기계적 기술, 예를 들면 미세주입(Anderson et al., 1980; Gordon et al., 1980; Brinster et al., 1981; Constantini and Lacy, 1981); 리포좀을 통한 멤브레인 융합 매개된 전달(Felgner et al., 1987; Wang and Huang, 1989; Kaneda et al., 1989; Stewart et al., 1992; Nabel et al., 1990; Lim et al., 1992); 및 직접적인 DNA 흡수 및 수용체 매개된 DNA 전달(Wolff et al., 1990; Wu et al., 1991; Zenke et al., 1990; Wu et al., 1989; Wolff et al., 1991; Wagner et al., 1990; Wagner et al., 1991; Cotten et al., 1990; Curiel et al., 1991a; Curiel et al., 1991b)을 들 수가 있다.

생물학적 및 물리적 유전자 전달 방법을 혼합한 방법에서, 임의 크기의 플라스미드 DNA는 아데노바이러스 헥손 단백질에 특이적인 폴리리신-콘쥬게이트된 항체와 배합되며, 그 형성된 복합체는 아데노바이러스 벡터에 결합된다. 트리몰 복합체는 세포를 감염시키는데 이용된다. 아데노바이러스 벡터는 커플링된 DNA가 손상되기 전에 엔도섬의 효율적인 결합, 내부이행 및 분해를 가능하게 한다.

리포솜/DNA 복합체는 생체내 유전자 전달에 직접적인 매개를 할 수 있는 것으로 나타났다. 표준 리포좀 제조에서 유전자 전달 과정이 비특이적이긴 하지만, 정위화된 생체내 흡수 및 발현이 종양 부착물에서, 예를 들면 다음의 직접적인 현장 투여에서 보고되었다(Nabel, 1992).

심장 조직에 직접적으로 DNA를 표적화하는 유전자 전달 기술이 바람직하다. 수용체 매개된 유전자 전달은 폴리리신을 통해 DNA(일반적으로 공유 폐쇄된 슈퍼코일 플라스미드 형태)를 단백질 리간드에 콘쥬게이션시킴으로써 이루어진다. 리간드는 표적 세포/조직 유형의 세포 표면 상의 대응하는 리간드 수용체의 존재를 기초로 하여 선택된다. 리간드-DNA 콘쥬게이트는 필요시에 혈액으로 직접 주입될 수 있고 수용체 결합 및 DNA-단백질 복합체의 내부이행이 일어나는 표적 조직으로 향한다. DNA의 세포내 파괴의 문제를 극복하기 위하여, 아데노바이러스에 의한 동시감염이 엔도섬 기능을 파괴하기 위해 봉입될 수 있다.

그 요법은 다음과 같다: KVLQT1 또는 minK 민감성 대립유전자를 갖는 환자를 그의 심장 전구체 세포의 일부 또는 전부가 기능적인 정상 KVLQT1 또는 minK 대립유전자의 적어도 하나의 추가의 카피를 수용하도록 유전자 전달 비히클로 처치한다. 이 단계에서, 처치된 개체는 민감성 대립유전자의 효과가 정상 대립유전자의 존재에 의해 대항되는 정도로 LQT의 위험이 감소되었다.

사용 방법: 형질전환된 숙주

치료제를 시험하기 위한 동물은 전체 동물의 돌연변이 후에 또는 생식세포 계역 세포 또는 접합체의 처리 후에 선택될 수 있다. 그러한 처리는 일반적으로 제2 동물 종으로부터 얻은 돌연변이 KVLQT1 및(또는) minK 대립유전자의 삽입 뿐만 아니라 파괴된 상동 유전자의 삽입을 포함한다. 별법으로, 동물의 내인성 KVLQT1 또는 minK 유전자는 통상의 기술을 이용하여 삽입 또는 결실 돌연변이 또는 다른 유전자 변화에 의해 파괴될 수 있다(Capecchi, 1989; Valancius and Smithies, 1991; Hasty et al., 1991; Shinkai et al., 1992; Mombaerts et al., 1992; Philpott et al., 1992; Snouwaert et al., 1992; Donehower et al., 1992). 시험 물질을 동물에 투여한 후에, LQT의 존재는 평가되어야 한다. 시험 물질이 LQT의 징조를 예방하거나 또는 억제한다면, 그 시험 물질은 LQT 치료를 위한 후보 치료제이다. 이러한 동물 모델은 잠재적인 치료 생성물을 위한 극히 중요한 시험 비히클을 제공한다.

본 명세서에 LQT 유전자, 후보 유전자 접근법 및 위치상의 클로닝을 확인하는 두가지 방법이 이용되었다. 현재 위치상의 정보는 염색체 11p15.5(Keating et al., 1991a; Keating et al., 1991b)로 맵핑된 LQT1, 7q35-36으로 맵핑된 LQT2 및 3p21-24로 맵핑된 LQT3(Jiang et al., 1994)을 갖는 세 LQT 자리에 대해 이용가능하다. 본 발명은 또한 LQT 유전자로서 염색체 21 상의 minK를 확인하였다. 후보 유전자 접근법은 생리학을 기초로 한 기계학적인 가설에 의존한다. LQT의 생리학에 대해서는 거의 알려진 바가 없지만, 이 질환은 이상 심장 재분극의 신호인, 심전도 상의 QT 간격의 연장과 관련이 있다. 이러한 관련은 이온 채널을 코딩하는 유전자, 또는 그의 조절 인자가 LQT에 대한 적당한 후보임을 암시하는 것이다. 이러한 가설은 이제 염색체 7-결합된 LQT가 추정 심장 칼륨 채널 유전자인, HERG의 돌연변이로부터 일어난다는 것을 발견함으로써 지지된다. 신경내분비계 칼슘 채널 유전자(CACNL1A2; Chin et al., 1991; Seino et al., 1992) 및 칼륨 채널을 조절하는 GTP-결합 단백질을 코딩하는 유전자(GNAI2; Weinstein et al., 1988; Magovcevic et al., 1992)는 그의 염색체 위치를 기초로 하여 LQT3에 대한 후보가 된다. 그러나, 이후의 결합 분석은 이들 유전자를 배제하였다(Wang and Keating, 비공개 데이터). LQT3은 SCN5A와 관련이 있다는 것이 밝혀져 있다(Wang et al., 1995a). 그러나, 상당한 노력에도 불구하고 염색체 11-연결된 LQT에 대한 후보 유전자 접근법은 성공하지 못하였다. 2개의 칼륨 채널 유전자(KCNA4 및 KCNC1)가 염색체 11의 짧은 팔에 맵핑되었지만(Wymore et al., 1994), 두가지 모두 결합 분석에 의해 LQT1에 대한 후보로서 제외되었다(Russell et al., 1995; 현재의 연구). 이미 특징화된 다른 모든 심장 칼륨, 클로라이드, 나트륨 및 칼슘 채널 유전자는 그의 염색체 위치를 기초로 하여 마찬가지로 제외되었다. 본 발명의 연구는 LQT1을 확인하기 위해 위치상 클로닝 및 돌연변이 분석을 이용하였다.

본 발명은 KVLQT1이 16 비관련 과에서 LQT1에 밀접하게 연결된다는 것을 나타내기 위해 유전자형 분석을 이용하였다(실시예에 상세한 설명이 있음). KVLQT1은 추정 심장 칼륨 채널 유전자이며 LQT의 염색체 11-연결된 형태를 야기시킨다. 유전자 분석 결과는 KVLQT1이 심장 재분극에서 기능적 중요성을 가진 전압 게이트 제어된 칼륨 채널을 코딩한다는 것을 암시하며, 이제 KVLQT1이 minK와 함께 회합하여 심장 I_Ks칼륨 채널을 형성하는 것으로 밝혀졌다. 옳다면, 염색체 11-연결된 LQT의 메카니즘은 아마도 감소된 재분극 KVLQT1 전류를 포함할 것이다. 6개의 트랜스멤브레인 도메인을 가진 칼륨 채널이 호모- 또는 헤테로-테트라머로부터 형성되는 것으로 생각되기 때문에(MacKinnon, 1991; MacKinnon et al., 1993; Covarrubias et al., 1991), KVLQT1의 LQT 관련된 돌연변이는 우성-네가티브 메카니즘을 통해 작용할 수가 있다. 본 명세서에 설명된 KVLQT1 돌연변이의 유형 및 위치는 이러한 가설과 일치한다. 칼륨 채널 기능의 결과적인 억제는 이제는 이상 심장 재분극 및 심실성 세동의 위험 증가를 유도할 것이다. HERG에서 확인된 돌연변이 및 칼륨 채널 알파 서브유닛의 생물 물리학은 염색체 7-결합된 LQT가 우성-네가티브 돌연변이 및 그 결과로서 생긴 기능 채널의 감소로부터 일어나는 것을 암시한다. 염색체 3-결합된 LQT에서, 대조적으로 SCN5A에서 확인된 LQT-관련된 결실은 지연된 불활성화 또는 채널 불활성화의 변화된 전압-의존성과 같은 변화된 특성을 가진 기능적 심장 나트륨 채널이 형성되기 쉽다. 지연된 나트륨 채널 불활성화는 멤브레인을 탈분극시키는 내부 나트륨 전류를 증가시킬 것이다. 이 효과는 외부 칼륨 전류가 감소되는 HERG 돌연변이로부터 예상되는 멤브레인 전위 변화와 유사하다. SCN5A의 더 해로운 돌연변이가 LQT를 야기시키는 것은 쉽지 않을 것이다. 심장 나트륨 채널의 전체 수의 감소는, 예를 들면 LQT의 것과 반대 표현형인 작용 전위 기간을 감소시키는 것으로 예상된다.

LQT의 징후전 진단은 심전도 상의 QT 연장의 확인에 의존하였다. 불행히도, 심전도는 젊고, 건강한 개체에서 거의 수행되지 않았다. 또한, 많은 LQT 유전자 캐리어는 비교적 정상 QT 간격을 가지며, 질환의 제1 신호는 치명적인 심부정맥일 수 있다(Vincent et al., 1992). 현재 제3 LQT 유전자(KVLQT1)가 확인되었으며, minK도 LQT와 관련이 있으며, 이 질환을 위한 유전학적 시험이 계획될 수 있다. 이것은 연속된 돌연변이 분석 및 추가의 LQT 유전자의 확인을 필요로 할 것이다. 더욱 상세한 표현형 분석에 의해, LQT의 가변 형태 사이의 표현형 차이가 발견될 수 있다. 이러한 차이는 진단 및 치료에 유용할 수 있다.

SCN5A, HERG 및 KVLQT1 유전자 돌연변이와 LQT 사이의 관련의 확인은 개체의 조기 징후전 스크리닝을 가능하게 하여 LQT의 발병 위험을 확인하게 한다. 그러한 개체를 확인하기 위하여, SCN5A, HERG 및(또는) KVLQT1 대립유전자는 직접적으로 또는 대립유전자를 클로닝시킨 후에 돌연변이에 대해 스크리닝한다. minK 돌연변이도 마찬가지로 발견될 수 있다. 제한되는 것은 아니지만 다음 한 방법을 비롯한 임의의 적당한 기술을 이용하여 정상 대립유전자와 다른 핵산 서열의 존재에 대해 대립유전자를 시험하였다: 형광 현장 혼성화(FISH), 직접 DNA 서열화, PFGE 분석, 서던 블롯 분석, 단일 가닥 형태 분석(SSCP), 결합 분석, RNase 보호 분석, 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드(ASO), 도트 블롯 분석 및 PCR-SSCP 분석. 예를 들면, (1) 클로닝된 대립유전자 및 정상 KVLQT1 유전자 또는 적절한 단편의 뉴클레오티드 서열(코딩 서열 또는 게놈 서열)을 결정하고 비교하거나, (2) KVLQT1 유전자 또는 유전자 단편의 RNA 전사체를 피검체로부터 얻은 단일 가닥화된 전체 게놈 DNA에 혼성화시키고 형성된 이종를 리보뉴클레아제 A(RNase A)로 처리하고 변성 겔 상에 전개시켜 임의의 미스매치 위치를 검출한다. 이러한 두가지 방법은 다음 절차에 따라서 실시할 수 있다.

피검체의 KVLQT1 또는 minK의 대립유전자를 통상의 기술을 이용하여 클로닝시킨다. 예를 들면, 혈액 시료을 개체로부터 취한다. 이 혈액 중의 세포로부터 단리된 게놈 DNA를 약 20 kb의 평균 단편 크기로 부분적으로 분해한다. 18-21 kb 범위의 단편을 분리한다. 형성된 단편을 적절한 벡터에 라이게이션시킨다. 그 클론의 서열을 확인하고 정상 KVLQT1 또는 minK 유전자와 비교한다.

별법으로, 폴리머라아제 연쇄 반응(PCRs)을 KVLQT1 유전자의 5' 영역 또는 엑손에 대한 프라이머 쌍으로 수행한다. PCRs는 정상 KVLQT1 유전자의 임의의 서열을 기초로 한 프라이머 쌍으로도 실시할 수도 있다. 예를 들면, 인트론 중의 하나에 대한 프라이머 쌍을 준비하고 이용한다. 마지막으로, PCR을 mRNA에 대해 실시할 수도 있다. 증폭된 생성물을 통상의 기술을 이용하여 단일 가닥 형태 다형화(SSCP)에 의해 분석하여 임의의 차이를 확인하고 이것을 서열화하고 정상 유전자 서열과 비교한다.

적당한 프라이머 쌍을 이용하여 개체의 DNA를 증폭시키고 증폭된 생성물을 예를 들면 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용한 도트-블롯 혼성화에 의해 분석하여 통상의 KVLQT1 또는 minK 유전자에 대해 개체를 신속히 스크리닝한다.

제2 방법은 RNase A를 이용하여 정상 KVLQT1 또는 minK 유전자와 결함이 있는 유전자 사이의 차이를 검출하는 것을 돕는다. 이러한 비교는 프로브로서 KVLQT1 또는 minK 유전자의 작은 (∼500 bp) 제한 단편을 이용하여 단계별로 수행한다. 처음에, 유전자 서열을 약 500 bp의 단편으로 절단하는 제한 효소(들)로 KVLQT1 또는 minK 유전자를 분해한다. 이 단편을 전기영동 겔 상에서 분리하고, 겔로부터 정제하고 양 방향으로 개별적으로 SP6 벡터(예를 들면, pSP64 또는 pSP65)로 클로닝시킨다. KVLQT1 또는 minK 유전자 단편의 삽입물을 함유하는 SP6 기재 플라스미드를 [α-³²P]GTP의 존재하에 유전자의 양 가닥의 방사표지된 RNA 전사체를 발생시키는, 당업계에 공지된 SP6 전사 시스템을 이용하여 시험관내에서 전사시켰다.

개별적으로, 이러한 RNA 전사체를 이용하여 통상의 기술에 의해 대립유전자 DNA와 이종를 형성한다. 개체로부터 얻은 KVLQT1 또는 minK 단편 및 KVLQT1 또는 minK 대립유전자 서브클론 사이의 서열 차이로 인한, RNA:DNA 이종에서 일어나는 미스매치의 결과로 RNase A로 처리할 때 RNA 가닥의 분해가 일어난다. 그러한 미스매치는 개체의 대립유전자의 포인트 돌연변이 또는 작은 결실의 결과일 수 있다. RNA 가닥의 분해는 2개 이상의 작은 RNA 단편을 형성시키며, 그것은 RNA 프로브 자체 보다 변성 겔 상에서 더 빨리 진행된다.

발견되는 임의의 차이로써 KVLQT1 또는 minK 유전자의 분자 변이체를 가지며 및 결과적인 장기 QT 증후군을 갖는 개체를 확인할 것이다. 이러한 변이체는 여러 형태일 수 있다. 가장 심각한 형태는 유전자에 이상 단백질에 대한 코딩을 야기시키는 프레임 이동 돌연변이 또는 큰 결실 또는 단백질 발현을 상당히 변화시키는 것일 것이다. 덜 심각한 장해 돌연변이는 시스테인 잔기로 또는 그로부터의 변화, 염기성 아미노산으로부터 산성 아미노산으로 또는 그 반대로, 소수성 아미노산으로부터 친수성 아미노산으로 또는 그 반대로와 같은, 생성된 단백질에 대한 상당한 효과를 가질 작은 프레임내 결실 및 비보존성 염기쌍 치환, 또는 2차 또는 3차 단백질 구조에 영향을 미칠 다른 돌연변이를 포함할 것이다. 사일런트 돌연변이 또는 보존성 아미노산 치환에 이르게 하는 것은 일반적으로 단백질 기능을 파괴시키지 않는 것으로 예상될 것이다.

의사는 유전학적 시험에 의해 출생시에 또는 심지어는 출생 전에도 LQT의 위험에 대해 개체를 확인할 수 있을 것이다. LQT의 징후전 진단은 이러한 질환의 예방을 가능하게 할 것이다. 베타 아드레날린 차단제를 비롯한 현재의 의학 요법은 이 질환과 관련된 문제의 발증을 예방 및 지연시킬 수 있다. 마지막으로, 본 발명은 11%의 모든 자연사의 원인이 되는 심부정맥과 같은 일반 심장 질환의 원인의 이해 및 치료법을 변화시킨다. 현재의 진단은 심전도로부터 QT 간격을 측정하는데 집중되어 있다. 이 방법은 장기 QT 증후군 존재의 완전히 정확한 지표가 아니다. 본 발명은 이 질환의 존재의 더욱 정확한 지표이다. LQT의 유전학적 시험 및 개선된 기계학적 이해는 적당한 요법을 통해 생명을 위협하는 부정맥의 예방 기회를 제공한다. 가능하다면, 예를 들면 칼륨 채널 개방제는 KVLQT1, minK 또는 HERG 돌연변이를 가진 환자에 있어서 부정맥의 위험을 감소시킬 것이며, 대조적으로 나트륨 채널 차단제는 SCN5A의 기능을 변화시키는 돌연변이를 가진 환자에 대해 더욱 효과적인 치료를 할 수가 있다. 마지막으로, 이러한 연구는 통상의 부정맥이 종종 이상 심장 재분극과 관련이 있고 유전적 및 후천적인 복합적 요인으로부터 일어날 수 있는 바와 같이, 통상의 부정맥의 기초가 되는 메카니즘에 대해 파악할 수 있게 한다.

본 발명은 다음 실시예에서 더욱 상세히 설명될 것이지만, 이는 예시의 목적으로 제공된 것일 뿐 어떤 의미로든 본 발명을 제한하여서는 안된다. 당업계에 공지된 표준 기술 또는 아래에 특별하게 설명된 기술이 이용된다.

실시예 1

표현형 평가 방법

이 연구를 위하여, 여섯 종류의 큰 LQT 가계(K1532, K1723, K2605, K1807, K161 및 K162) 및 몇몇 작은 가계 및 산발적 경우를 연구하였다. LQT 환자를 북아메리카 및 유럽 전역의 임상으로부터 확인하였다. 표현형에 대해 2가지 인자를 고려하였다: 1) 병력 데이터(실신 여부, 실신 회수, 급발작 여부, 증상 개시 연령, 및 급사 발생); 및 2) 심박도수(QT_c)에 대해 보정된 심전도 상의 QT 간격(Bazzett, 1920). 개체를 잘못 분류하는 것을 피하기 위하여, 예전의 연구에서 성공적이었던 표현형 지정과 동일한 보존적 접근법을 이용하였다(Keating et al., 1991a; Keating et al., 1991b; Jiang et al., 1994). 지방 협회 검열국 지침(local institutional review board guidelines)에 따라서 각 개인 또는 그의 보호자로부터 정보에 근거한 동의를 얻었다. 표현형 데이터를 유전자형에 대한 지식 없이 해석하였다. 0.45초 이상의 보정된 QT 간격(QT_c)을 가진 징후를 나타낸 대상 및 0.47초 이상의 QT_c를 가진 징후가 없는 대상을 이환된 것으로 분류하였다. 0.41초 이하의 QT_c를 가진 징후가 없는 대상도 이환되지 않은 것으로 분류하였다. 0.41초와 0.47초 사이의 QT_c를 가진 징후가 없는 대상 및 0.44초 이하의 QT_c를 가진 징후를 나타낸 대상을 불명확한 것으로 분류하였다.

실시예 2

유전자형 및 연결 분석

표준 기술을 이용하여 엡스타인-바르 바이러스 형질전환된 임파구로부터 유래된 말초 혈액 임파구 또는 세포주로부터 게놈 DNA를 준비하였다(Anderson and Gusella, 1984). 유전자형 분석을 위해, 염색체 11p15.5로 미리 맵핑된 4가지의 작은 탠덤 반복(STR) 다형체를 이용하였다: D11S922, TH, D11S1318 및 D11S860(Gyapay et al., 1984). RFLP 마커(HRAS1, D11S454 및 D11S12)의 유전자형화는 문헌(Keating et al., 1991a)에 기재된 바와 같이 실시하였다.

한쌍 연결 분석을 LINKAGE v5.1 중의 MLINK를 이용하여 수행하였다(Lathrop et al., 1985). 0.90의 침투도 및 0.001의 LQT 유전자 빈도의 가정값을 사용하였다. 유전자 빈도는 남성과 여성을 동일한 것으로 가정하였다. 남성 및 여성 재조합 빈도는 동일한 것으로 고려하였다. n을 관찰된 대립유전자의 수로 할 때 STR 대립유전자 빈도는 1/n이었다. D11S454에 대한 최대 LOD 스코어가 재조합율 0에서 확인되었지만, 하나의 비절대적 재조합의 존재(개개의 VI-14, 도 1)는 D11S454의 LQT 유전자 텔로머를 형성한다.

실시예 3

물리적 맵핑

TH-INS-IGFII 및 D11S454 자리로부터의 서열을 기초로 하여 프라이머를 설계하고 PCR 기본 기술을 이용하여 CEPH YAC 라이브러리로부터 클론을 확인하고 분리하였다(Green and Olson, 1990; Kwiatowski et al., 1990). YAC 말단 서열을 문헌(Ochman et al., 1988)에 설명된 역 PCR에 의해 결정하고 STSs로서 사용하였다.

미리 확인된 코스미드 cosQW22(본 연구), cCI11-469(D11S679), cCI11-385 (D11S551), cCI11-565(D11S601), cCI11-237(D11S454)로부터의 단일 카피 프로브를 이용하여 P1 클론을 분리하였다(Tanigami et al., 1992; Tokino et al., 1991; Sternberg, 1990). 새로 단리된 P1s를 FISH 또는 서던 분석에 의해 염색체 11p15에 맵핑시켰다. 말단 특이적인 리보프로브를 새로 단리된 P1s로부터 발생시키고 추가의 인접 클론을 확인하는데 사용하였다(Riboprobe Gemini Core System Kit; Promega). P1 및 코스미드 클론에 대한 DNA를 알칼리 용해 플라스미드 분리를 이용하여 제조하고 문헌(Sambrook et al., 1989)에 기재된 바와 같이 CsCl-에티듐 브로마이드 구배로 평형 원심분리에 의해 정제하였다. P1 삽입 말단 서열을 문헌(Wang and Keating, 1994)에 기재된 바와 같이 사이클 서열화에 의해 결정하였다. STSs를 이러한 삽입 말단 서열을 기준으로 발생시켰다. P1s와 코스미드 사이의 오버랩은 공통의 제한 단편을 합계하여 계산하였다.

실시예 4

KVLQT1 클론의 분리 및 특징화

성인 인간 심장 cDNA 라이브러리(Stratagene)을 플레이팅시키고, 1 x 10⁶플라크를 프로브로서 트랩핑된 엑손 4181A를 이용하여 스크리닝시켰다. 트랩핑된 엑손 4181A의 서열을 이용하여 cDNA 라이브러리 스크리닝을 위한 올리고뉴클레오티드 프로브를 설계하였다. GENETRAPPER(등록상표) cDNA 포지티브 셀렉션 시스템(Positive Selection System)을 이용하여 인간 심장 cDNA 라이브러리(Life Technologies, Inc.)로부터 1 x 10¹¹클론을 스크리닝하였다. 포획 및 회복 올리고뉴클레오티드의 서열은 5'-CAGATCCTGAGGATGCT-3'(서열 1) 5'-GTACCTGGCTGAGAAGG-3'(서열 2)이었다.

KVLQT1에 대한 복합 cDNA 서열은 중복 cDNA 클론의 말단 서열화에 의해 또한 프라이머 워킹에 의해 얻었다. 서열화는 파마시아(Pharmacia) A.L.F. 자동화 서열기를 이용하여 자동으로, 또는 시쿼나아제 버전(Sequenase Version) 2.0 DNA 시퀀싱 키트(Sequencing Kit)(United States Biochemical, Inc.)를 이용하여 수동으로 실시하였다. 데이타베이스 분석 및 서열 분석을 내셔날 센터 퍼 바이오테크놀로지 인포매이션(National Center for Biotechnology Information)으로부터의 BLAST 네트웍 서비스, GCG 소프트웨어 팩키지, 및 IG 소프트웨어 팩키지를 이용하여 실시하였다.

KVLQT1의 부분 게놈 구조(트랜스멤브레인 도메인 S2로부터 S6까지)를 문헌(Wang and Keating, 1994)에 기재된 바와 같이 P1 18B12의 사이클 서열화에 의해 확인하였다. KVLQT1 cDNA 서열을 기초로 프라이머를 설계하고 사이클 서열화에 사용하였다.

실시예 5

돌연변이 분석

SSCP를 문헌(Wang et al., 1995a; Wang et al., 1995b)에 기재된 바와 같이 실시하였다. 정상 및 이상 SSCP 생성물을 분리하고 문헌(Wang and Keating, 1994)에 기재된 바와 같이 직접 서열화하거나 또는 T-벡터 방법(Marchuk et al., 1990)을 이용하여 pBluescript(SK+; Stratagene)로 서브클로닝시켰다. 후자의 방법을 이용할 때, 시쿼나아제(Sequenase)(등록상표) 버전 2.0(United States Biochemicals, Inc.)을 이용하여 디데옥시 연쇄 종결 방법에 의해 수개의 클론을 서열화하였다.

실시예 6

노던 분석

다중 조직 노던 필터(Human MTN blot 1, Clontech)를 문헌(Curran et al., 1995)에 기재된 바와 같이³²P-표지된 KVLQT1 cDNA 프로브로 프로빙시켰다.

실시예 7

LQT1의 정확한 유전학적 및 물리적 정위화

북유럽계 유타주 대가족인 가계 1532(K1532)의 유전자형 분석에 의해 LQT1의 정확한 위치를 결정하였다(도 1). 이 가계는 처음 LQT 유전자, LQT1을 염색체 11p15.5에 연결하는 초기 연구에서 이용되었다(Keating et al., 1991a; Keating et al., 1991b). 다른 가족 구성원을 217 대상의 총 시료 크기에 대해 확인하고 표현형화하였다. 표현형 결정은 문헌(Keating et al., 1991a; Keating et al., 1991b; Jiang et al., 1994)에 기재된 바와 같이 실시하였다. HRAS, TH, D11S454 및 D11S12에서 마커를 사용한 예비 유전자형 분석은 K1532의 모든 확인된 구성원을 포함하였다. 이러한 실험은 이 가족의 정보 분과를 확인하였다. 추가의 유전자형 분석은 염색체 11p15.5로부터의 3가지의 고 다형화 마커인 D11S922, D11S1318 및 D11S860를 이용하여 실시하였다(Gyapay et al, 1994). 각 마커에 대한 유전자형 및 한쌍 LOD 스코어를 도 1 및 표 1에 나타내었다. 이 마커 중에서, TH 및 D11S1318을 완전히 연결시켰다. 재조합을 HRAS를 비롯한 다른 모든 시험된 마커로 확인하였지만, 각 경우에 통계학적으로 의미있는 포지티브 LOD 스코어(+3 이상)가 확인되었다. 이 데이터는 LQT1이 이 가계에서 TH 및 D11S1318에 완전히 연결되며 이 질환 유전자가 HRAS의 센트로머에 위치한다는 것을 나타낸다.

LQT1의 정확한 정위화를 위하여, K1532의 하플로타입 분석을 실시하였다(도 1 참조). 9가지 염색체 보유 정보 재조합을 확인하였다. 텔로머 재조합은 이환되지 않은 개체 IV-22(D11S922와 TH 사이), 이환된 개체 IV-25(D11S922와 TH 사이), 이환되지 않은 개체 V-6(HRAS와 D11S922 사이) 및 이환된 개체 V-24(HRAS와 D11S922 사이)에서 관찰되었다. 센트로머 재조합은 이환되지 않은 개체 V-17(D11S860과 D11S454 사이), 이환된 개체 V-24(D11S860와 D11S454 사이), 이환되지 않은 개체 V-34(D11S860와 D11S454 사이), 이환되지 않은 개체 VI-13(D11S860와 D11S454 사이), 이환되지 않은 개체 VI-14(D11S454와 D11S1318) 및 이환된 개체 VI-16(D11S860와 D11S454 사이)에서 확인되었다. TH의 LQT1 센트로머 위치에 대한 최근의 연구와 함께(Russell et al., 1995), 이 데이터는 TH와 D11S454 사이 간격의 LQT1의 위치에 관한 것이다.

염색체 11P15.5로부터의 게놈 프로브에 의한 펄스계 겔 분석을 이용하여 LQT1을 함유하는 영역의 크기를 평가하였다. TH, D11S551 및 D11S454로부터의 프로브를 700 kb Mlu I 제한 단편에 혼성화하였다(도 2). 이 데이터는 LQT1을 함유하는 영역이 700 kb 미만이라는 것을 나타낸다. 그 영역으로부터의 프로브를 갖는 P1 라이브러리 및 효모 인공 염색체(YAC)를 스크리닝함으로써 이 영역을 물리적으로 표시하였다(Tanigami et al., 1992; Tokino et al., 1991). 형광 현장 혼성화(FISH) 분석을 이용하여 이 클론의 순서를 다음과 같이 확인하였다: 텔로머-TH-D11S551-D11S679-D11S601-D11S454-센트로머. 초기 실험에서 확인된 클론을 이용하여 인접한 중복 클론을 확인하였다. LQT1 간격으로부터의 클론의 최소 셋트를 도 2에 나타내었다.

LQT1과 11p15.5 마커 사이의 한쌍 LOD 스코어

	재조합율(θ)
	0.0	0.001	0.01	0.05	0.1	0.2	Zmax *	θmax+
HRAS	9.67	9.94	10.50	10.38	9.62	7.57	10.59	0.021
D11S922	10.05	13.05	13.85	13.59	12.59	10.01	13.92	0.019
TH	11.01	10.99	10.82	10.06	9.07	6.96	11.01	0.0
D11S1318	10.30	10.29	10.13	9.40	8.47	6.50	10.30	0.0
KVLQT1	14.19	14.17	13.94	12.89	11.54	8.68	14.19	0.0
D11S454	11.06	11.05	10.89	10.16	9.17	7.01	11.06	0.0
D11S860	5.77	6.92	8.32	9.14	8.92	7.46	9.15	0.058
D11S12	1.50	2.26	3.12	3.46	3.27	2.49	3.46	0.047
LOD 스코어는 90%의 침투도 및 0.001의 유전자 빈도의 가정값으로 계산하였다(ref 31).*Zmax는 최대 LOD 스코어를 나타내며, +θmax는 Zmax에서 평가된 재조합율을 나타낸다.

실시예 8

KVLQT1의 확인 및 특징화

물리적 지도로부터 클론에 의한 엑손 증폭을 실시하여 LQT1에 대한 후보 유전자를 확인하였다. 문헌(Buckler et al., 1991; Church et al., 1994)에 기재된 바와 같이 게놈 P1 클론 상의 pSPL3B(Burn et al., 1995)를 이용하여 엑손 트랩핑을 실시하였다. 각 P1 클론으로부터의 128 트랩핑된 엑손 최소 한도를 PCR 생성물을 크기별로 만들어 초기에 특징화하였다. 이들로부터, 400 클론을 A.L.F. 자동화된 서열기(Pharmacia)를 이용하여 디데옥시 서열화시켜 더 분석하였다. DNA 서열 및 데이터베이스 분석 결과는 이온 채널과 유사성이 있는 예상된 아미노산 서열을 갖는 8개의 가능한 엑손을 나타내었다. 가장 유사성이 많은 것은 추정 공극 영역 일부와의 유사성을 비롯한, 다중 종으로부터 칼륨 채널 단백질과 53% 유사성을 가진 238 염기쌍 트랩핑된 엑손(4181A)에 대해 얻었다. PCR 분석을 이용하여 염색체 11의 짧은 팔에 또한 물리적 지도로부터 2개의 P1s(118A10, 18B12)에 4181A를 맵핑시켰다. 이 데이터는 4181A가 염색체 11p15.5 상의 칼륨 채널 유전자의 일부임을 나타내는 것이다.

2개의 다른 cDNA 라이브러리 스크리닝 방법을 이용하여 트랩핑된 엑손 4181A가 유전자의 일부임을 결정하였다. 성인 인간 심장 cDNA 라이브러리와의 전형적인 플라크 필터 혼성화는 단일 포지티브 클론의 확인을 유도하였다. cDNA 선택을 변화시켜 제2 심장 cDNA 라이브러리(GENETRAPPER(등록상표) cDNA Positive Selection System, Life Technologies, Inc.)를 스크리닝하고, 12개의 독립 클론을 회수하였다. DNA 서열 분석 결과 4181A 및 상기한 다른 트랩핑된 엑손으로부터 유래된 서열과 완전한 배열을 나타내었다. cDNA 클론의 복합 서열을 도 3A에 나타내었다. 가장 긴 오픈 리딩 프레임은 1654 염기쌍에 걸쳐있다. 2개의 일치 폴리아데닐화 시그날은 3' 비번역화된 영역 중의 폴리(A) 테일의 업스트림을 확인하였다. 이 개시 코돈의 동일성은 아직 명확하지 않다.

cDNA는 칼륨 채널의 구조적 특징을 갖는 단백질을 예측하였다. 수치료법 분석은 멤브레인 스패닝 α-헬릭스를 나타낼 수 있는 6개의 주요 소수성 영역의 위상을 제시한다. 이 영역은 칼륨 채널 트랜스멤브레인 도메인 S1-S6과 서열 유사성이 있다. 확인된 유전자 및 쉐이커(Shaker)(SHA) 칼륨 채널(Pongs et al., 1988)로부터 유래된 예측된 아미노산 서열의 비교는 도 3B에 나타내었다. S1-S6을 함유하는 영역에서, 아미노산 서열 동일성은 30%이고 유사성은 59%였다. S1-S6의 서열 위치된 3'은 임의의 공지된 단백질과 중요한 유사성을 갖지 않았다. 이 유전자가 전압 게이트 제어된 칼륨 채널 유전자와 아주 유사하며 LQT1에 대한 강한 후보가 되므로 그것을 KVLQT1로 명명하였다.

노던 블롯 분석을 이용하여 KVLQT1 mRNA의 조직 분포를 확인하였다. KVLQT1 cDNA 프로브는 인간 심장, 신장, 폐 및 태반에서 3.2 kb 전사체를 검출하였지만, 골격근, 간, 또는 뇌에서는 검출되지 않았다(도 4). 심장은 최고도의 KVLQT1 mRNA를 나타내었다.

실시예 9

완전한 KVLQT1 cDNA의 특징화

상기한 연구 결과 KVLQT1의 불완전한 cDNA의 클로닝 및 특징화가 이루어졌다. 이러한 불완전한 cDNA의 서열은 6개의 소수성 멤브레인 스패닝 α-헬릭스(S1-S6) 및 전형적인 K+ 채널 공극 표시 서열을 가진 단백질을 예측하였다(Heginbotham et al., 1994). 그러나, 이 cDNA는 아미노 말단 도메인을 상실한 것으로 보이며 기능적으로 발현하지 않았다. KVLQT1의 완전한 서열을 정의하기 위하여 몇가지 cDNA 라이브러리를 스크리닝하고 새로운 클론을 분리하였다. 스크리닝은³²P로 부분 KVLQT1 cDNA를 방사표지시키고 클론테크(Clontech)로부터 구입한 몇몇 cDNA 라이브러리를 스크리닝하여 실시하였다. 1.2 kb 클론을 췌장 라이브러리로부터 분리하고 pBluescript II로 서브콜로닝시키고 서열화하였다. 이 클론은 추정 해독 출발 부위 및 원래의 KVLQT1 클론을 갖는 프레임내 ATG 서열을 포함하였다. 이러한 새로운 서열 데이터는 초기 서열 데이터와 배합하여 완전한 단백질을 코딩하는 cDNA 서열을 얻었다. cDNA 서열 및 5' 및 3' 비번역화된 영역은 도 12A 내지 12D에 나타내었다. 새로운 cDNA 서열은 완전한 S1 도메인 및 27 아미노산 N-말단 영역을 가진 581 아미노산 단백질을 예측하였다. 이것은 도 8A에 나타내었다. 이러한 새로운 서열은 염색체 11p15.5 결합된 KVLQT1 유전자의 일부였다는 것을 입증하기 위하여, 이 영역으로부터의 135 염기쌍 XhoI 제한 단편을 이용하여 체세포 혼성체 패널로부터의 DNA와 혼성화 실험하였다. 새로운 5' 말단을 염색체 11의 짧은 팔에 맵핑시켰다. 새로운 KVLQT1 서열을 이용한 노던 분석은 인간 췌장, 심장, 신장, 폐 및 태반에서의 3.2 kb의 단일 메신저 RNA와의 혼성화를 나타내었지만, 뇌, 간 또는 골격근에서는 나타나지 않았다(도 8B). 노던 분석은 문헌(Curran et al., 1995)에 나타낸 바와 같이 다중 조직 노던 필터(Human MTN blot 1, Clontech)를 이용하여 실시하였다.

실시예 10

KVLQT1 기능의 특징화

KVLQT1의 기능을 한정하기 위하여, 챠이니스 햄스터 난소(CHO) 세포를 실시예 9에서 기술한 완전한 cDNA로 형질감염시켰다. KVLQT1 cDNA를 pCEP4(InVitrogen)에 서브클로닝시켰다. CHO 세포를 Ham's F-12 배지에서 배양시키고 리포펙타민(Gibco BRL)을 이용하여 일시적으로 형질감염시켰다. 세포를 6 μL 리포펙타민, 그린 형광 단백질(pGreen Lantern-1, Gibco BRL) 0.5 ㎍ 및 pCEP4 중의 KVLQT1 1.5 ㎍을 함유하는 35 ㎜ 디쉬에서 18시간 동안 형질감염시켰다. 형광 세포를 형질감염시킨지 48 내지 78시간 후에 옥소패치(Axopatch) 200 패치 클램프 증폭기(Axon Instruments)를 이용하여 전압 클램핑시켰다. 배쓰(bathing) 용액은 mM 단위로 142 NaCl, 2 KCl, 1.2 MgCl₂, 1.8 CaCl₂, 11.1 글루코오스, 5.5 HEPES 버퍼(pH 7.4, 22-25 ℃)를 함유하였다. 피펫 용액은 mM 단위로 110 칼륨 글루타메이트, 20 KCl, 1.0 MgCl₂, 5 EGTA, 5 K₂ATP, 10 HEPES(pH 7.3)를 함유하였다. 데이터 획득 및 분석은 pCLAMP6(Axon Instruments)을 이용하여 실시하였다. 테일 전류(전류의 불활성화 상의 시험 펄스의 말기로의 외삽에 의해 결정됨)와 볼쯔만(Boltzmann) 기능을 갖는 시험 전위 사이의 관계를 정립시킴으로써 전류 활성화의 전압 의존성을 결정하였다. 테일 전류는 각 난모세포에 대한 가장 큰 값에 대해 정규화하였다.

-60 mV 이상의 전위로 멤브레인 탈분극시킨 후에 전압 의존성 외부 K⁺전류를 관찰하였다(도 9A). 이 전류는 +40 mV에서 1초내에 정상 상태로 도달하였다. 전류의 활성화에 앞서 간단한 지연이 이루어지며, -70 mV로의 재분극이 불활성화전에 진폭(후크)의 초기 증가와 함께 테일 전류를 유도하였다. 유사한 테일 전류 후크는 HERG K⁺채널에 대해 미리 관찰되었으며 그것은 불활성화 보다 더 빠른 속도로 불활성화로부터의 채널 회수에 기인한 것이다(Sanguinetti et al., 1995; Smith et al., 1996; Spector et al., 1996). KVLQT1 전류에 대한 활성화 곡선은 -11.6 ± 0.6 mV에서 반 최대(V_½)였으며, 12.6 ± 0.5 mV의 기울기 팩터(n=6; 도 9B)를 가졌다.

KVLQT1의 생물 물리학적 특성은 다른 공지된 심장 K⁺전류와 달랐다. KVLQT1이 다른 서브유닛과 함께 회합하여 알려진 심장 채널을 형성한다고 가정되었다. 느린 활성화 지연된 정류기 K⁺전류, I_Ks는 심장 작용 전위의 재분극을 조절한다. 집중적인 연구에도 불구하고, I_Ks채널의 분자 구조는 이해되지 않는다. 생리학적 데이터는 I_Ks채널의 한 성분이 단일 추정 트랜스멤브레인 도메인을 가진 130 아미노산 단백질(Takumi et al., 1988)인 minK(Goldstein and Miller, 1991; Hausdorff et al., 1991; Takumi et al., 1991; Busch et al., 1992; Wang and Goldstein, 1995; Wang et al., 1996)라는 것을 암시한다. 그러나, 이 단백질의 크기 및 구조는 minK가 단독으로 기능적 채널을 형성하는지에 대해 의문을 갖게 한다(Attali et al., 1993; Lesage et al., 1993).

이 가설을 시험하기 위하여, CHO 세포를 KVLQT1 및 인간 minK(hminK) cDNAs로 동시 형질감염시켰다. hminK cDNA는 pCEP4(InVitrogen)에 서브클로닝되고 형질감염은 KVLQT1에 대해 상기한 바와 같이 실시하였다. KVLQT1 및 hminK의 동시 형질감염에 대해 각 cDNA 0.75 ㎍이 사용되었다. 이미 보고된 바와 같이(Lesage et al., 1993), hminK 만에 의한 CHO 세포의 형질감염은 검출가능한 전류를 유도하지 않았다(n=10, 도 9C). KVLQT1와 hminK의 동시 형질감염은 KVLQT1 단독으로만 형질감염된 세포에서의 전류 보다 훨씬 더 많은 느린 활성화 지연 정류기 전류를 유도하였다(도 9D 및 9E). 동시 형질감염된 CHO 세포의 전류의 느린 활성화에 앞서 수백 msec간 지연이 지속되었으며, 이것은 의미있는 호모머 KVLQT1 채널 전류가 존재하지 않는다는 것을 나타낸다. 전류는 장기 탈분극 펄스 중에 포화되지 않았으며, 초기 지연 및 전류 활성화의 이상을 가장 잘 설명하는 3차 함수를 필요로 한다. +40 mV로의 30초 탈분극 펄스 중에, 전류는 0.68 ± 0.18, 1.48 ± 0.16 및 8.0 ± 0.6 초(n=4)의 시간 상수로 활성화되었다. 전류에 대한 등시성(7.5초) 활성화 곡선은 7.5 ± 0.9 mV의 V_½, 및 16.5 ± 0.8 mV의 기울기 팩터(n=7; 도 9B)를 가졌다. 비교용으로, 인간 심장 I_Ks에 대한 활성화 곡선의 V_½및 기울기는 9.4 mV 및 11.8 mV였다(Li et al., 1996). KVLQT1 및 hminK가 CHO 세포에서 동시 발현하는 것과 같이 심장 I_Ks의 활성화는 극히 느리며 3차 함수에 의해 가장 잘 설명되었다(Balser et al., 1990; Sanguinetti and Jurkiewicz, 1990). 퀴니딘(50 μM)은 단리된 근세포의 I_Ks에 대한 그의 효과(40-50% 차단)과 유사하게, 동시 형질감염된 CHO 세포에서 테일 전류를 30 ± 8 %(n=5) 만큼 차단하였다(Balser et al., 1991). 따라서, CHO 세포의 KVLQT1와 hminK의 동시 발현은 심장 I_Ks와 거의 동일한 생물 물리학 특성을 갖는 K⁺전류를 유도하였다.

hminK와 KVLQT1의 특성을 더 특징화하기 위하여, 이 채널을 크세노퍼스 난모세포에서 분리하여 또한 함께 발현시켰다. 크세노퍼스 라비스(Xenopus laevis) 난모세포를 분리하고 문헌(Sanguinetti et al., 1995)에 기재된 바와 같이 cRNA로 주입하였다. KVLQT1 cDNA는 pSP64(Promega)로 서브클로닝시켰다. HminK cDNA는 스완슨(R. Swanson)으로부터 기증받았다. KVLQT1 cDNA의 대략의 동몰 농도(난모세포 당 5.8 ng) 및 hminK(난모세포 당 1 ng) cRNA를 이용하여 동시 주입 실험을 행하였다. 배쓰 용액은 mM 단위로 98 NaCl, 2 KCl, 2 MgCl₂, 0.1 CaCl₂, 및 5 HEPES (pH 7.6, 22-25 ℃)를 함유하였다. 역 전위 실험을 위해, KCl에 대해 외부 NaCl을 등몰 치환하여 삼투압을 유지하였다. cRNA를 가진 난모세포의 주입한지 3일 후에 표준 2 미세전극 전압 클램프 기술을 이용하여 전류를 기록하였다(Sanguinetti et al., 1995). 전류를 0.5 kHz에서 여과시키고 2 kHz에서 디지털화하였다. 데이터는 평균 ± s.e.m.으로서 나타내었다.

RNA에 상보적인 KVLQT1로 주입된 난모세포는 KVLQT1 cDNA로 형질감염된 CHO 세포와 거의 동일한 활성화의 전압 의존성을 가진 신속 활성화 외부 K⁺전류를 발현하였다(도 10A 및 10B). KVLQT1 채널의 K⁺선택성은 세포외 K([K⁺]_e)의 다른 농도로 테일 전류의 역 전위(E_rev)를 측정함으로써 결정되었다. E_rev와 log[K⁺]_e사이의 관계의 기울기는 49.9 ± 0.4 mV(n=7; 도 10C)이었으며, 완전히 선택적인 K⁺채널에 대해 넌스트(Nernst) 방정식(58 mV)에 의해 예측되는 것보다 상당히 덜하다. KVLQT1 및 hminK cRNA에 의한 난모세포의 동시 주입은 I_Ks와 유사한 전류를 유도하였다(도 11C). 동시 주입된 난모세포에 대한 E_rev와 log[K⁺]_e사이의 관계의 기울기는 49.9 ± 4 mV(n=6)였으며, 이는 KVLQT1 단독인 것과 기니아 피그 심장 I_Ks(49 mV)와 유사하였다(Matsuura et al., 1987). 동시 주입된 난모세포에 대한 등시성(7.5초) 활성화 곡선은 심장 I_Ks와 유사하게 6.2 mV의 V_½, 및 12.3의 mV의 기울기(도 11 E)를 가졌다.

실시예 11

크세노퍼스에서의 KVLQT1 유전자의 확인

CHO 세포와 대조적으로 hminK는 크세노퍼스 난모세포에서 기능적인 발현을 할 수가 있었다(도 11B). 유도된 전류(I_sK)는 동시 주입된 난모세포에서 유도된 전류보다 더 적었지만, 활성화의 동력학 및 전압 의존성은 유사하였다(도 11 A-E). 2가지 관찰은 크세노퍼스 난모세포의 I_sK는 미확인된 구성 성분으로 발현된 서브유닛과 minK과의 회합에 의해 형성된 채널로부터 형성된다는 가설을 유도하였다. 처음에, 극소량의 minK cRNA를 주입한 후에 I_Ks의 양이 포화되었으며(도 11D), 이는 제한된 양의 내인성 성분이 기능적 발현에 필요하다는 것을 암시한다(Wang and Goldstein, 1995; Cui et al., 1994). 두번째, 포유동물 세포의 minK의 이종 발현은 검출가능한 전류를 유도하지 않으며(Lesage et al., 1993)(도 9C), 이는 minK가 기능적 채널을 형성하기에 충분하지 않다는 것을 암시한다. 이러한 미확인된 서브유닛은 KVLQT1의 동족체일 수 있다는 것이 가정되었다. 이러한 가설을 시험하기 위하여, 크세노퍼스 난모세포 cDNA 라이브러리(Clontech)를 S3-S5 도메인에 확장된 KVLQT1 cDNA 클론으로 스크리닝하였다. 1.6 kb 부분 클론(XKVLQT1, 도 8A)를 분리하였다. XKVLQT1은 KVLQT1의 대응하는 영역과 아미노산 농도가 88% 동일하다(도 8A). 이 데이터는 I_sK가 XKVLQT1 및 minK 단백질의 동시 회합체로부터 형성된 것임을 암시하는 것이다.

KVLQT1 및 hminK가 함께 회합하여 심장 I_Ks채널을 형성한다는 결론이 지어졌다. 2가지의 지연 정류기 K⁺전류, I_Kr및 I_Ks는 심장 근세포에서 작용 전위 기간을 조절한다(Li et al., 1996; Sanguinetti and Jurkiewicz, 1990). 예전의 보고에서는 장기 QT 증후군에 I_Kr채널의 이상을 관련시켰다(Sanguinetti et al., 1995; Curran et al., 1995; Sanguinetti et al., 1996). KVLQT1 돌연변이가 또한 이 질환을 야기시킨다는 관찰(Wang et al., 1996) 및 KVLQT1이 I_Ks및 채널의 일부를 형성한다는 발견은 두 심장 지연 정류기 K⁺채널의 이상이 심부정맥의 급사의 위험에 기여한다는 것을 나타낸다.

실시예 12

여섯 대가족에서 LQT와 KVLQT1 미스센스 돌연변이의 동시 분리

KVLQT1이 LQT1이라는 가설을 시험하기 위해, 단일 가닥 형태 다형화 (SSCP) 분석을 이용하여 염색체 11에 연결을 나타낸 가장 큰 LQT 가족인 K1532의 이환된 구성원을 기능적 돌연변이에 대해 스크리닝하였다. SSCP는 예전에 설명된 바와 같이 실시하였다(Wang et al., 1995a; Wang et al., 1995b). 정상 및 이상 SSCP 생성물을 분리하고 문헌(Wang and Keating, 1994)에 기재된 바와 같이 직접 서열화하거나 또는 T-벡터 방법(Marchuk et al., 1990)을 이용하여 pBluescript(SK+; Stratagene)로 서브클로닝시켰다. 후자의 방법을 이용할 때, 시쿼나아제(Sequenase)(등록상표) 버전 2.0(United States Biochemicals, Inc.)을 이용하여 디데옥시 연쇄 종결 방법에 의해 수개의 클론을 서열화하였다. 분석은 S2와 S6 사이의 영역에 집중되었는데 그 이유는 이 영역이 KVLQT1 기능에 대해 중요하기 때문이다. 본 발명자는 cDNA 서열을 기초로 한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계하였고 KVLQT1-함유 P1, 18B12와의 사이클 서열화 반응에 이 프라이머를 사용하였다(Wang and Keating, 1994). 이 실험은 S2-S6를 코딩하는 인트론 서열 플랭킹 엑손을 한정하였다. 그후에, 추가의 프라이머가 이러한 인트론 서열로부터 발생되었고 SSCP 분석에 사용하였다(표 2).

SSCP 분석은 K1532의 70 이환된 구성원에서 변칙 이형태체를 확인하였다(도 5). 이러한 이상 이형태체는 이 가계의 147 이환되지 않은 구성원에서 또는 200 이상의 비관련 대조 개체로부터 얻은 게놈 DNA에서 관찰되지 않았다(Q. Wang, 비공개 데이터). 이러한 이형 및 LQT 사이의 연결에 대한 2 포인트 LOD 스코어는 재조합율 0에서 14.19였다(표 1). KVLQT1과 LQT1 사이에서는 재조합이 관찰되지 않았는데, 이는 이 자리가 완전히 결합되어 있다는 것을 나타낸다. 정상 및 이상 SSCP 이형태체의 DNA 서열 분석은 코돈 Val-125의 처음 뉴클레오티드에서 단일 염기 치환, G에서 A로의 전이를 나타내었다(도 5 및 표 3). 이러한 돌연변이 결과 S4와 S5 사이의 예측된 세포내 도메인에서 발린의 메티오닌으로의 치환이 일어난다.

KVLQT1의 돌연변이는 LQT를 야기시킨다는 가설을 더 시험하기 위하여, 추가의 큰 다섯 LQT 가계의 이환된 구성원으로부터의 DNA 시료을 연구하였다. 이 영역으로부터의 다형화 마커에 의한 연결 분석 결과는 이 질환 표현형이 이들 가족에서 염색체 11에 연결되어 있다는 것을 나타내었다(Q. Wang, 비공개 결과). 이상 SSCP 이형태체는 K1723, K2605, K1807 (도 5), K161 및 K162(Q. Wang, 비공개 결과)의 이환된 구성원에서 확인되었다. K161 및 K162에서 확인된 SSCP 이형은 K1807에서 관찰된 것과 동일하였다(Q. Wang, 비공개 결과). 이상 SSCP 이형태체는 이들 가계의 이환되지 않은 구성원 또는 200 이상의 비관련 대조 개체로부터 얻은 DNA 시료에서 관찰되지 않았다(도 5; Q. Wang, 비공개 데이터). 각 가족에서 확인된 정상 및 이상 이형태체를 서열화하였다. 뉴클레오티드 변화, 코딩 효과 및 각 돌연변이의 위치를 표 3에 요약하였다.

KVLQT1 돌연변이를 한정하는데 사용되는 PCR 프라이머

프라이머	서열	증폭된 영역	서열 번호
1		S2-S3	3
2			4
3		S3-S4	5
4			6
5		S4	7
6			8
7		S5-공극	9
8			10
9		공극-S6	11
10			12
11		S6	13
12			14

KVLQT1 돌연변이의 요약

코돈	뉴클레오티드 변화	코딩 효과	돌연변이	영역	가계	이환된 수
38-39	ΔTCG	결실	F38W/G39Δ	S2	K13216	1
49	GCC에서 CCC	미스센스	A49P	S2-S3	K13119	1
60	GGG에서 AGG	미스센스	G60R	S2-S3	K2557	3
61	CGG에서 CAG	미스센스	R61Q	S2-S3	K15019	2
125	GTG에서 ATG	미스센스	V125M	S4-S5	K1532	70
144	CTC에서 TTC	미스센스	L144F	S5	K1777	2
177	GGG에서 AGG	미스센스	G177R	공극	K20926	1
183	ACC에서 ATC	미스센스	T1831	공극	K20925	1
212	GCG에서 GAG	미스센스	A212E	S6	K1723	6
212	GCG에서 GAG	미스센스	A212E	S6	K2050	2
212	GCG에서 GTG	미스센스	A212V	S6	K1807	6
212	GCG에서 GTG	미스센스	A212V	S6	K161	18
212	GCG에서 GTG	미스센스	A212V	S6	K162	18
212	GCG에서 GTG	미스센스	A212V	S6	K163	3
212	GCG에서 GTG	미스센스	A212V	S6	K164	2
216	GGG에서 GAG	미스센스	G216E	S6	K2605	11

실시예 13

소가족 및 산발적 경우에서 LQT와 관련된 KVLQT1 유전자내 결실 및 9개의 미스센스 돌연변이

KVLQT1에서의 LQT 관련 돌연변이를 추가로 확인하기 위하여, SSCP 분석을 작은 가계 및 산발적 경우에 대해 실시하였다. SSCP는 가계 13216에서 이상 이형태체를 밝혀냈다(도 6). 200 이상의 비관련 대조 개체의 분석은 이러한 이형을 나타내지 않았다(Q. Wang, 비공개 데이터). 이상 이형태체를 클로닝시키고 서열화한 결과, 코돈 38 및 39를 포함하는 세 염기쌍 결실을 나타내었다. 이 돌연변이는 추정 S2 도메인에서 페닐알라닌에서 트립토판으로의 치환 및 글리신의 결실이 일어난 것이다(표 3).

이상 SSCP 이형태체는 추가의 아홉 가계의 이환된 구성원에서 확인되었다: K1777, K20925, K13119, K20926, K15019(도 6), K2050, K163 및 K164(Q. Wang, 비공개 데이터). K2050에서 확인된 이상 SSCP 이형태체는 K1723에서 관찰된 것과 동일하였고, K163 및 K164에서 확인된 이상 이형태체는 K1807에서 관찰된 것과 동일하였다. 200 이상의 대조 개체로부터 얻은 DNA 시료에서는 이상 이형태체가 관찰되지 않았다(Q. Wang, 비공개 데이터). 각 경우에, 정상 및 이상 이형태체를 서열화하였다. 이 데이터는 도 6에 나타내었고 표 3에 요약하였다. 전체적으로, 16 가족 또는 산발적 경우에서 LQT와 관련된 KVLQT1 돌연변이가 확인되었고(도 7), 이것은 KVLQT1의 돌연변이가 LQT의 염색체 11-연결된 형태를 야기시킨다는 강한 분자 유전학적 증거를 제공하는 것이다.

실시예 14

KVLQT1에 대한 폴리클로날 항체의 형성

KVLQT1 코딩 서열 단편을 이. 콜리에서 융합 단백질로서 발현시켰다. 과도 발현된 단백질을 겔 용출에 의해 정제하고, 그것을 이용하여 문헌(Harlow and Lane, 1988)에 기재된 것과 유사한 절차에 따라 토끼와 마우스를 면역화시켰다. 이 절차는 다양한 다른 단백질에 대해 Abs를 발생시키는 것으로 나타났다(예를 들면, Kraemer et al., 1993).

간단하게는, KVLQT1 코딩 서열 스트레치를 플라스미드 PET5A에서 융합 단백질로서 클로닝시켰다(Novagen, Inc., Madison, WI). IPTG로 유도한 후에, 예상된 분자량을 가진 융합 단백질의 과도 발현을 SDS/PAGE에 의해 입증하였다. 융합 단백질을 전기 용리에 의해 겔로부터 정제하였다. KVLQT1 융합 생성물로서의 단백질의 확인은 N-말단에서의 단백질 서열화에 의해 입증되었다. 다음에, 정제된 단백질을 토끼에서 면역원으로서 사용하였다. 토끼를 완전 프로인트 보조액 중의 단백질 100 ㎍으로 또한 3주 간격으로 2회, 처음에는 불완전 프로인트 보조액 중의 면역원 100 ㎍으로, 이어서 PBS 중의 면역원 100 ㎍을 추가 접종시켜 면역화시켰다. 항체 함유 혈청을 그로부터 2주 후에 모았다.

이 절차를 반복하여 KVLQT1 유전자의 돌연변이 형태에 대한 항체를 형성시켰다. 이 항체를 야생형 KVLQT1에 대한 항체와 함께 이용하여 다양한 조직 및 생물학적 유체에서 돌연변이 형태의 존재 및 상대 농도를 검출하였다.

실시예 15

KVLQT1에 대해 특이적인 모노클로날 항체의 형성

다음 절차에 따라 모노클로날 항체를 형성시켰다. 마우스를 당업계에 잘 알려진 바와 같은 글루타르알데히드 또는 EDC를 이용하여 키홀 임펫 헤모시아닌에 콘쥬게이트된 완전한 KVLQT1 또는 KVLQT1 펩티드(야생형 또는 돌연변이)로 이루어진 면역원으로 면역화시켰다.

면역원을 보조액과 혼합하였다. 각 마우스에게 면역원 10 내지 100 ㎍을 4회 주사하고, 네 번재 주사후에 혈액 시료을 마우스로부터 취하여 혈청이 면역원에 대한 항체를 함유하는지를 확인하였다. 혈청 역가는 ELISA 또는 RIA에 의해 결정하였다. 면역원에 대한 항체의 존재를 나타내는 혈청을 가진 마우스를 하이브리도마 생성을 위해 선택하였다.

면역 마우스로부터 비장을 제거하고 단일 세포 현탁액을 제조하였다(Harlow and Lane, 1988). 거의 문헌(Kohler and Milstein, 1975)에 기재된 바와 같이 세포 융합을 실시하였다. 간단하게는, P3.65.3 골수종 세포(American Type Culture Collection, Rockville, MD)를 문헌(Harlow and Lane, 1988)에 기재된 바와 같이 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 면역 비장 세포와 융합시켰다. 세포를 96 웰 조직 배양 플레이트에서 2 x 10⁵세포/웰의 밀도로 플레이팅시켰다. 개개의 웰을 성장에 대해 검사하고, 성장된 웰의 상징액에 대해 야생형 또는 돌연변이 KVLQT1 표적 단백질을 이용하여 ELISA 또는 RIA에 의해 KVLQT1 특이적 항체의 존재를 시험하였다. 포지티브 웰 중의 세포를 팽창시키고 서브클로닝시켜 모노클로날 형성을 확인하였다.

원하는 특이성을 가진 클론을 팽창시키고 마우스에서 또는 중공 섬유 시스템에서 복수증으로서 성장시켜 특징화 및 분석 개발을 위해 충분량의 항체를 형성시켰다.

실시예 16

KVLQT1에 대한 샌드위치 분석

모노클로날 항체를 플레이트, 관, 비드 또는 과립과 고체 표면에 부착시켰다. 바람직하게는, 항체를 96-웰 ELISA 플레이트의 웰 표면에 부착시켰다. KVLQT1 펩티드/단백질(야생형 또는 돌연변이)을 함유하는 100 ㎕ 시료(예를 들면, 혈청, 뇨, 조직 사이토졸)을 고상 항체에 첨가하였다. 이 시료을 실온에서 2시간 동안 배양시켰다. 다음에, 시료 유체를 따라내고, 고상을 완충액으로 세척하여 비결합 물질을 제거하였다. 제2 모노클로날 항체(KVLQT1 펩티드/단백질 상의 다른 유전소에 대한 것) 100 ㎕를 고상에 첨가하였다. 이 항체를 검출 분자(예를 들면, 125-I, 효소, 형광단 또는 발색단)로 표지화시키고, 제2 항체를 가진 고상을 실온에서 2시간 동안 배양시켰다. 제2 항체를 따라내고 고상을 완충액으로 세척하여 비결합 물질을 제거하였다.

시료 중에 존재하는 KVLQT1 펩티드/단백질의 양에 비례한, 결합 표지의 양을 정량화하였다. 야생형 KVLQT1에 대해 특이적인 모노클로날 항체 및 KVLQT1에서 확인된 각 돌연변이에 특이적인 모노클로날 항체를 이용하여 개별 분석을 실시하였다.

실시예 17

KVLQT1 및 minK K⁺채널에 영향을 미치는 스크리닝 약물 분석

이제는, KVLQT1 및 minK가 함께 회합하여 심장 I_Ks칼륨 채널을 형성한다는 지식을 갖고 이러한 채널에 효과를 가질 약물을 스크리닝하는 분석을 발명할 수 있다. 2개의 유전자, KVLQT1 및 minK를 난모세포 또는 포유동물 세포로 동시 형질감염시키고 상기한 바와 같이 동시 발현시켰다. 동시 형질감염은 야생형 또는 특이적으로 돌연변이된 KVLQT1 및 minK의 임의의 배합을 이용하여 실시하였다. 동시 형질감염에 사용된 유전자 중의 하나가 LQT를 야기시키는 돌연변이를 함유할 때, 유도된 전류 변화는 야생형 유전자 만에 의한 동시 형질감염과 비교하면 알 수 있다. 약물 후보를 형질감염된 세포의 배쓰 용액에 첨가하여 유도 전류에 대한 약물 후보의 효과를 시험하였다. 야생형 KVLQT1 및 minK로 동시 형질감염된 세포로 알 수 있는 전류와 더 가까워지도록 유도 전류를 변화시키는 약물 후보가 LQT를 치료하는데 유용하다.

본 발명이 바람직한 실시태양을 참고로 하여 이 특허 출원으로 개시되었지만, 그 설명은 제한된 의미가 아니라 예시적인 것으로서 본 발명의 취지 및 첨부된 청구 범위의 영역내에서 당업계의 숙련인에 의해 쉽게 변형될 것으로 기대된다.

참고 문헌

유럽 특허 출원 공보 제0332435호

유럽 특허 출원 공보 제225,807호

Hitzeman 등의 EP73,675A

특허 및 특허 출원

PCT 출원 공개 제WO93/07282호

미국 특허 제4,376,110호

미국 특허 제4,486,530호

미국 특허 제4,868,105호

미국 특허 제5,252,479호

〈서열표〉

(1) 일반적 정보 :

(i) 출원인: 유니버시티 오브 유타 리써치 파운데이션

(ii) 발명의 명칭: ＫＶＬＱＴ1 - minK와 회합하여 심장 I_KS칼륨 채널을 형성하는 KVLQT1을 코딩하는 장기 QT 증후군 유전자

(iii) 서열수: 26

(iv) 통신 주소:

(A) 수신인: 베너블, 배티어, 하워드 & 시빌레티, 엘엘피

(B) 거리: 스위트 1000 엔.더블유. 뉴욕 에비뉴 1201

(C) 도시: 워싱톤

(D) 주: 디씨

(E) 국가: 미국

(F) 우편번호: 20005

(v) 컴퓨터 판독 형태

(A) 매체 유형: 플로피 디스켓

(B) 컴퓨터: 아이비엠 피씨 호환형

(C) 작동 시스템: PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어: 윈도우용 워드 6.0

(vi) 현출원 데이타:

(A) 출원번호: -미정-

(B) 출원일: 1996. 12. 20

(C) 분류:

(vii) 변호사/대리인 정보:

(A) 성명: 이넨, 제프리 엘.

(B) 등록 번호: 28,957

(C) 참조/사건 번호: 19780-116871-WO

(ix) 통신 정보:

(A) 전화: 202-962-4800

(B) 팩스: 206-962-8300

(2) 서열 1에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 17 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 기타 핵산

(A) 설명: /desc = "Synthetic Oligomer"

(xi) 서열 설명: 서열 1:

(2) 서열 2에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 17 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 기타 핵산

(A) 설명: /desc = "Synthetic Oligomer"

(xi) 서열 설명: 서열 2:

(2) 서열 3에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 22 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 기타 핵산

(A) 설명: /desc = "PCR primer"

(xi) 서열 설명: 서열 3:

(2) 서열 4에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 21 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 기타 핵산

(A) 설명: /desc = "PCR primer"

(xi) 서열 설명: 서열 4:

(2) 서열 5에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 20 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 기타 핵산

(A) 설명: /desc = "PCR primer"

(xi) 서열 설명: 서열 5:

(2) 서열 6에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 22 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 기타 핵산

(A) 설명: /desc = "PCR primer"

(xi) 서열 설명: 서열 6:

(2) 서열 7에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 20 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 기타 핵산

(A) 설명: /desc = "PCR primer"

(xi) 서열 설명: 서열 7:

(2) 서열 8에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 20 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 기타 핵산

(A) 설명: /desc = "PCR primer"

(xi) 서열 설명: 서열 8:

(2) 서열 9에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 22 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 기타 핵산

(A) 설명: /desc = "PCR primer"

(xi) 서열 설명: 서열 9:

(2) 서열 10에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 22 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 기타 핵산

(A) 설명: /desc = "PCR primer"

(xi) 서열 설명: 서열 10:

(2) 서열 11에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 22 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 기타 핵산

(A) 설명: /desc = "PCR primer"

(xi) 서열 설명: 서열 11:

(2) 서열 12에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 20 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 기타 핵산

(A) 설명: /desc = "PCR primer"

(xi) 서열 설명: 서열 12:

(2) 서열 13에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 21 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 기타 핵산

(A) 설명: /desc = "PCR primer"

(xi) 서열 설명: 서열 13:

(2) 서열 14에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 24 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 기타 핵산

(A) 설명: /desc = "PCR primer"

(xi) 서열 설명: 서열 14:

(2) 서열 15에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 2633 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: cDNA

(iii) 가상: 아님

(iv) 안티센스: 아님

(vi) 공급원:

(A) 생물체: 호모 사피엔스

(ix) 특징:

(A) 명칭/기호: CDS

(B) 위치: 2..1642

(xi) 서열 설명: 서열 15:

(2) 서열 16에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 547 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 단백질

(iii) 가상: 아님

(xi) 서열 설명: 서열 16:

(2) 서열 17에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 26 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 펩티드

(iii) 가상: 아님

(xi) 서열 설명: 서열 17:

(2) 서열 18에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 61 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 펩티드

(iii) 가상: 아님

(xi) 서열 설명: 서열 18:

(2) 서열 19에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 137 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 펩티드

(iii) 가상: 아님

(xi) 서열 설명: 서열 19:

(2) 서열 20에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 66 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 펩티드

(iii) 가상: 아님

(xi) 서열 설명: 서열 20:

(2) 서열 21에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 123 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 펩티드

(iii) 가상: 아님

(xi) 서열 설명: 서열 21:

(2) 서열 22에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 58 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 펩티드

(iii) 가상: 아님

(xi) 서열 설명: 서열 22:

(2) 서열 23에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 376 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 단백질

(iii) 가상: 아님

(iv) 공급원:

(A) 생물체: 크세로퍼스

(xi) 서열 설명: 서열 23:

(2) 서열 24에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 581 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 단백질

(iii) 가상: 아님

(iv) 공급원:

(A) 생물체: 호모 사피엔스

(xi) 서열 설명: 서열 24:

(2) 서열 25에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 2821 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 이중

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (게놈)

(iii) 가상: 아님

(iv) 안티센스: 아님

(vi) 공급원:

(A) 생물체: 호모 사피엔스

(ix) 특징:

(A) 명칭/기호: CDS

(B) 위치: 88..1830

(xi) 서열 설명: 서열 25:

(2) 서열 26에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 581 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 단백질

(xi) 서열 설명: 서열 26:

Claims (27)

1. 서열 26에 기재된 아미노산 서열을 갖는 인간 KVLQT1 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산.
2. 제1항에 있어서, 서열 25에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA, 그의 상보체, 그의 대립유전자 변이체 또는 대응하는 RNA인 단리된 핵산.
3. 장기 QT 증후군을 야기하는 서열 26에 기재된 인간 KVLQT1 폴리펩티드의 돌연변이 형태를 코딩하는 단리된 핵산, 그의 상보체 또는 대응하는 RNA.
4. 제3항에 있어서, 돌연변이가 결실 돌연변이, 넌센스 돌연변이, 삽입 돌연변이 및 미스센스 변이로 이루어진 군에서 선택되는 것인 단리된 핵산.
5. 제3항에 있어서, 상기 단리된 DNA가 표 3에 나타낸 돌연변이 중 하나 이상을 포함하는 단리된 핵산.
6. 시료에서 (i) 서열 1에 기재된 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA, 그의 대립유전자 변이체 및 그의 돌연변이 형태 또는 (ii) 상기 DNA에 대응하는 RNA를 검출하는 혼성화 프로브로서 사용하기 적합한 핵산 서열인, 제1항 내지 5항 중 어느 한 항에 정의된 15개 이상의 연속 핵산을 갖는 단리된 핵산.
7. 제6항에 있어서, 돌연변이를 포함하는 제3항 내지 5항 중 어느 한 항에 정의된 15개 이상의 연속 핵산을 갖는 단리된 핵산.
8. 제1항 내지 7항 중 어느 한 항에 정의된 단리된 핵산 및 숙주 세포에서 작동하는 레플리콘으로 이루어진 복제 클로닝 벡터.
9. KVLQT1 폴리펩티드 또는 그의 변형된 형태의 코딩 서열이 발현 벡터가 도입되는 숙주 세포에서 상기 코딩 서열의 발현을 지시할 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된, 제1항 내지 5항 중 어느 한 항의 단리된 핵산으로 이루어진 발현 벡터.
10. 제8항 또는 9항에 정의된 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
11. (i) KVLQT1 폴리펩티드 제조에 적합한 조건하에서 제1항에 정의된 서열 26에 기재된 아미노산 서열을 갖는 KVLQT1 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드의 변형된 형태를 코딩하는 발현 벡터를 함유하는 제10항의 숙주 세포를 배양하고, (ii) 상기 폴리펩티드를 회수하는 것으로 이루어지는, 제1항에 정의된 서열 26에 기재된 아미노산 서열을 갖는 KVLQT1 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드의 변형된 형태인 폴리펩티드의 제조 방법.
12. 서열 26에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단리된 인간 KVLQT1 폴리펩티드.
13. 서열 26에 기재된 아미노산 서열을 갖는 KVLQT1 폴리펩티드의 돌연변이 형태로 이루어진 단리된 인간 돌연변이 KVLQT1 폴리펩티드.
14. 제13항에 있어서, 상기 돌연변이가 표 3에 나타낸 것인 단리된 KVLQT1 폴리펩티드.
15. 제12항 내지 14항 중 어느 한 항에 정의된 하나 이상의 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 항체.
16. 인간 평가 대상의 조직 시료로부터 단리된 KVLQT1 유전자 또는 그의 발현 생성물의 서열을 야생형 KVLQT1 유전자 또는 그의 발현 생성물과 비교함으로써, 상기 평가 대상에 대하여 장기 QT 증후군의 위험의 지표인 평가 대상의 서열 내의 KVLQT1 유전자의 돌연변이를 스크리닝하는 것으로 이루어지는, 장기 QT 증후군에 대한 인간 평가 대상의 위험 평가 방법.
17. 제16항에 있어서, 상기 발현 생성물이 KVLQT1 유전자의 mRNA 및 KVLQT1 유전자에 의해 코딩된 KVLQT1 폴리펩티드로 이루어진 군에서 선택된 것인 방법.
18. 제16항 또는 17항에 있어서,

    (a) 비변성 폴리아크릴아미드 겔 상에서 상기 시료로부터의 단일 가닥 DNA의 전기영동법의 이동도 변화를 관찰하고,

    (b) KVLQT1 유전자 프로브를 상기 시료로부터 단리된 게놈 DNA에 혼성화시키기 적합한 조건하에서 상기 프로브를 상기 DNA에 혼성화시키고,

    (c) 상기 시료로부터 단리된 게놈 DNA에 대한 대립유전자 특이적 프로브의 혼성화를 측정하고,

    (d) 상기 시료로부터 단리된 KVLQT1 유전자의 전부 또는 일부를 증폭시켜 증폭된 서열을 형성하고 증폭된 서열을 서열화하고,

    (e) 상기 시료내의 특이적 KVLQT1 돌연변이 대립유전자의 존재를 핵산 증폭에 의해 측정하고,

    (f) 상기 시료로부터 단리된 KVLQT1 유전자의 전부 또는 일부를 분자 클로닝시켜 클로닝된 서열을 형성하고 클로닝된 서열을 서열화하고,

    (g) 분자 (1) 상기 시료로부터 단리된 KVLQT1 유전자 게놈 DNA 또는 KVLQT1 mRNA, 및 (2) 인간 야생형 KVLQT1 유전자 DNA에 상보적인 핵산 프로브가 서로 혼성화되어 이중체를 형성할 때 분자 (1)과 (2) 사이에 미스매치가 있는지를 측정하고,

    (h) 상기 시료내의 KVLQT1 유전자 서열을 증폭시키고 야생형 KVLQT1 유전자 서열로 이루어진 핵산 프로브에 상기 증폭된 서열을 혼성화시키고,

    (i) 상기 조직내의 KVLQT1 유전자 서열을 증폭시키고 돌연변이 KVLQT1 유전자 서열로 이루어진 핵산 프로브에 상기 증폭된 서열을 혼성화시키고,

    (j) 결실 돌연변이에 대해 스크리닝하고,

    (k) 포인트 돌연변이에 대해 스크리닝하고,

    (l) 삽입 돌연변이에 대해 스크리닝하고,

    (m) KVLQT1 유전자 서열 또는 돌연변이 KVLQT1 유전자 서열로 이루어진 하나 이상의 핵산 프로브와 상기 시료 내의 KVLQT1 유전자의 반응계내 혼성화를 측정하고,

    (n) 면역블롯팅하고,

    (o) 면역세포화학 처리하고,

    (p) KVLQT1 돌연변이 대립유전자의 폴리펩티드 발현 생성물에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 파트너 및(또는) 서열 26에 기재된 아미노산 서열을 갖는 KVLQT1 폴리펩티드에 대한 결합 파트너와 상기 조직으로부터 단리된 KVLQT1 유전자 단백질 사이의 결합 상호작용에 대해 분석하고,

    (q) 상기 결합 파트너의 생화학적 활성의 억제에 대해 분석하는

    절차를 하나 이상 수행하는 방법.
19. 제16항 내지 18항 중 어느 한 항에 있어서, KVQLT1 폴리펩티드의 아미노산 38-39를 코딩하는 DNA 또는 RNA 또는 KVLQT1 폴리펩티드의 아미노산 38-39를 비교하는 방법.
20. 제16항 내지 18항 중 어느 한 항에 있어서, DNA 또는 RNA가 표 3에 나타낸 돌연변이에 대해 비교되는 방법.
21. 제1항 또는 2항의 DNA로 형질감염된 세포.
22. 제3항, 4항 또는 5항의 DNA로 형질감염된 세포.
23. 제1항 또는 2항의 DNA에 상보적인 RNA로 형질감염된 세포.
24. 제3항, 4항 또는 5항의 DNA에 상보적인 RNA로 형질감염된 세포.
25. 야생형 인간 KVLQT1을 포함하는, 인간을 제외한 유전자도입(transgenic) 동물.
26. 제25항에 있어서, 야생형 인간 minK를 더 포함하는 동물.
27. 돌연변이 인간 KVLQT1을 포함하는, 인간을 제외한 유전자도입 동물.