KR19990074787A - Method for preparing silk powder peptide by enzymatic digestion - Google Patents
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Abstract
본 발명은 실크피브로인을 단백질 분해효소로 분해한 펩타이드의 제조에 관한것이다. 실크(견사)를 효소분해하여 견단백질인 피브로인을 얻고 이를 염화칼슘과 에탄올에 반응시켜 투석하여 얻은 용액에 단백질 분해효소인 플라보자임(flavourzyme) 및 액티나제(actinase)로 분해하여 동결건조한 후 분말상의 피브로인 펩타이드를 제조하였다. 이들 펩타이드는 분자량이 12,000 - 13,000이고 중합도가 163으로서 pH 1 - 13에서 70% 용해도를 나타내고 있으므로 체내 흡수율이 높아 항산화작용과 알콜대사분해능력이 탁월하여 기능성 식품 또는 의약품으로 사용과 각 성분에 대한 순수 활성물질의 개발에 기여할 수 있다.The present invention relates to the preparation of peptides in which silk fibroin is degraded by protease. Fibroin, a silk protein, was obtained by enzymatic digestion of silk (silk silk), and the solution obtained by dialysis by reacting it with calcium chloride and ethanol was digested with flavonzyme and actinase, protease, and then lyophilized. Fibroin peptides were prepared. These peptides have a molecular weight of 12,000-13,000 and a polymerization degree of 163, which shows 70% solubility at pH 1-13, so they have high absorption rate in the body, which is excellent in antioxidant activity and alcohol metabolism ability. It can contribute to the development of active substances.
Description
본 발명은 실크 피브로인을 단백질 분해효소로 분해한 펩타이드의 제조에 관한 것이다. 보다 상세하게는 실크(견사)를 효소분해하여 염화칼슘과 에탄올 용액에 반응시켜 플라보자임 및 액티나제 효소로 분해하여 동결건조시켜 분말상태의 피브로인 펩타이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to the preparation of peptides that degrade silk fibroin with proteolytic enzymes. More specifically, the present invention relates to a method for producing a powdered fibroin peptide by enzymatically decomposing silk (silk silk), reacting with calcium chloride and ethanol solution, decomposing with flavozyme and actinase enzyme, and lyophilizing.
실크는 섬유이외 분야의 기초소재로써 이용되고 있는데 견 피브로인과 세리신 단백질을 이용한 소재개발이 주가되고 있다. 이것은 이들 단백질을 기능성 식품 혹은 각종 첨가물의 이용에 관한 것이 많으며, 대부분이 강산 혹은 중성염을 사용한 제조방법이다. 예를들어 일본국 특허공개 소58-38449의 미분말상 견피브로인의 제조법, 소59-31520의 견피브로인 펩타이드수용액의 제조 및 특허공개, 평1-256352에서는 견단백질을 이용한 숙취방지용 식품 및 그 제조방법 그리고 대한민국 특허공고 94-2871의 견단백질을 이용한 식품 및 그 식품소재의 제조방법 등 다수의 특허가 국내·외에서 소개되고 있다. 그러나, 이들 종래기술은 강산 혹은 중성염 만을 사용한 분말로서 불규칙한 분자량의 분포로인하여 기능성의 극대화는 기대할수 없다. 또한 산 혹은 염을 사용함으로써 분자량의 조절이 매우 어려울 뿐아니라 중화를 하고난 뒤에도 고 분자량 혹은 가혹한 조건을 사용함으로써 특정 수소이온농도에서의 단백질 분자들 사이의 인력 및 반발로 인한 겔화, 침전물 그리고 저분자화로 인한 필요성분의 급속한 유출등이 생기는 등 제품 공정상의 제한성을 불러일으키고 있다. 때문에 보다 단순화할 수 있고, 보다 적절한 분자량의 조절을 가능케하는 기능성 바이오 실크분말 펩타이드의 제조방법이 요구되고 있을 뿐아니라 그 기능성이 기존의 방법으로 조제된 분말과는 어떻게 다른가의 문제도 대두될 것이다. 이러한 기능성과 관련한 펩타이드의 크기는 영양학적으로도 중요한 문제로 나타날 수도있는데, 펩타이드가 인체내에서 어느정도 소화 흡수의 특성을 나타내는지의 보고(식품 과학과 산업,30권 1호 page 26,1997)를 고려할 때에도 단백질을 섭취할 경우 그것의 소화흡수의 정도는 유리아미노산보다는 Oligopeptide정도의 흡수효율이 훨씬 효과적이라는 연구보고되어 있듯이 효소에 의한 실크분말의 펩타이드화는 중요한 소재가 되고 있다.Silk is used as a basic material in the fields other than fiber, and the development of materials using silk fibroin and sericin protein is mainly used. Many of these are related to the use of functional foods or various additives, and most of them are preparation methods using strong acids or neutral salts. For example, Japanese Patent Publication No. 58-38449 for the preparation of fine powdered fibroin, production of Patent No. 59-31520 for the aqueous solution of Pepibroin peptides, and Japanese Patent Publication No. 1-256352, hangover-prevention foods using silk protein and its manufacturing method In addition, a number of patents have been introduced in Korea and abroad, including foods using the protein of Korean Patent Publication No. 94-2871, and methods of manufacturing the food materials. However, these prior arts are powders using only strong acid or neutral salts, and therefore, maximization of functionality cannot be expected due to irregular molecular weight distribution. In addition, it is very difficult to control the molecular weight by using acid or salt, as well as gelation, sedimentation and low molecular weight due to attraction and repulsion between protein molecules at specific hydrogen ion concentration by using high molecular weight or harsh conditions after neutralization. Due to the rapid outflow of the necessary ingredients, it is causing limitations in the product process. Therefore, there is a need for a method of preparing a functional bio silk powder peptide that can be more simplified and enables more appropriate molecular weight control, as well as how the functionality differs from the powder prepared by the conventional method. The size of the peptides associated with this functionality may be a nutritionally important issue, even when considering the degree of digestive absorption characteristics of the peptides in the human body (Food Science and Industry, Vol. 30, No. 1, page 26,1997). When protein is ingested, the degree of digestion and absorption is reported to be more effective than the free amino acid than that of Oligopeptide. Peptidation of silk powder by enzymes has become an important material.
본 발명에서는 효소를 사용한 바이오 실크펩타이드의 제조분말이 기존의 산가수분해법 혹은 산처리후 분쇄분말법으로 제조한 분말과 분자량의 크기, 유효아미노산 함량의 차이, 용해도의 차이 및 그 기능성에 있어서 어떻게 다른지를 비교하였다. 기능성의 검증은 항산화 작용, 알콜대사분해 작용으로 하였으며, 이것의 결과로부터 어느정도 크기의 분자량이 어떠한 기능성에 사용될 수 있는지에 대한 구체적인 증거를 제시하였다. 이하, 본 발명에 대한 그 구체적인 기술내용을 상세히 설명하기로 한다. 아울러 본 발명의 재료는 실크의 제사 및 제직과정에서 나오는 섬유화할 수 없는 부잠사, 절각견 및 파사의 협잡물을 제거한 실크를 대상으로 하였으므로 이것들로 인한 환경오염을 줄일 수 있고, 원료가 산업폐기물이어서 윈료공급의 측면에서 볼 때에도 고부가가치의 경제성이 충분히 있다고 생각되어진다.또한 분자량이 조절된 특정 기능성 식품보조제, 첨가제 및 의약품으로 개발이 기대되어 진다.In the present invention, how the production powder of bio silk peptide using enzyme is different from the powder prepared by conventional hydrolysis method or grinding powder method after acid treatment, difference in size, effective amino acid content, difference in solubility, and its functionalities. Was compared. Verification of the function was carried out by antioxidant activity and alcohol metabolism action, and from the result, concrete evidence of what kind of molecular weight can be used for the function. Hereinafter, the specific technical contents of the present invention will be described in detail. In addition, the material of the present invention was to remove silk from the fibers of silk weaving and weaving process of subsidiary silkworms, pruning dogs and sediment, so that the environmental pollution caused by these can be reduced, raw materials are industrial wastes In terms of supply, it is considered that there is sufficient economic value of high value-added, and it is expected to be developed into specific functional food supplements, additives and medicines with controlled molecular weight.
도 1은 산 가수분해하여 얻어진 평균분자량(MW) 2,500내외의 실크 분말 전자현미경사진이다.1 is a silk powder electron micrograph of about 2,500 average molecular weights (MW) obtained by acid hydrolysis.
도 2는 본 발명의 효소처리한 평균분자량(MW) 13,000내외의 바이오 실크분말 전자현미경 사진이다.2 is a bio silk powder electron micrograph of about 13,000 enzyme-treated average molecular weight (MW) of the present invention.
제1공정 (세리신 제거공정)Step 1 (Sericin Removal Process)
전 처리과정으로서 액비 1:30에 식용 단백질 분해효소인 플라보자임(Flavourzyme)및 액티나제(actinase)를 0.5∼1 %(w/v) 첨가하여 55℃의 조건에서 정련을 실시하여 일반적으로 쓰이는 비누 및 염을 쓰지않고 고효율 견 단백질의 피브로인(fibroin)을얻는다.As a pretreatment, 0.5-1% (w / v) of flavourzyme and actinase, edible proteolytic enzymes, were refined at 55 ° C in a liquid ratio of 1:30. Obtain fibroin of high-efficiency silk protein without the use of soaps and salts.
제2공정 (피브로인 용해공정)2nd process (Fibroin dissolution process)
상기1공정을 거친 각각의 순수 피브로인 견단백질에 대하여 2N 염산을 110℃에 2시간 용해한 후 가성소오다로 중화시킨것을 탈염기를 사용하여 분자량을 조절한 샘플(샘플 1), 또 대조 샘플로서 정련한 견사를 5% 염산에서 1시간 습열처리한 후 건조분쇄한 샘플(샘플 2) 및 50%의 CaCl2,H2O 및 에탄올 함량비가 1:8:2 M%가 되도록 조절 후 90℃에서 3-5시간 반응시킨 후 투석하여 얻어진 용액에 단백질 분해효소인 플라보자임(Flavourzyme) 및 액티나제(Actinase)를 처리하여 동결건조 한 샘플(샘플3) 등 기존의 샘플제조와 제조방법이 다른 피브로인을 얻는다.Dissolve 2N hydrochloric acid at 110 ° C. for 2 hours to each pure fibroin silk protein that passed through step 1, and neutralize with caustic soda. The silk was heat-treated in 5% hydrochloric acid for 1 hour, and then dried and pulverized (sample 2) and 50% of CaCl 2 , H 2 O and ethanol were adjusted to 1: 8: 2 M%, and then 3- Fibroin, which differs from conventional sample preparation methods such as lyophilized sample (Sample 3) by treatment with proteolytic enzymes Flavorzyme and Actinase, was treated with dialysis solution after 5 hours of reaction. Get
제3공정 (피브로인 용액의 동결건조 공정)3rd process (freeze-drying process of fibroin solution)
제 2 공정에서 얻어진 각각의 제조방법이 다른 피브로인 용액을 동결건조시켜 피브로인 분말을 얻는다.Each production method obtained in the second step lyophilizes another fibroin solution to obtain fibroin powder.
이상과 같은 서로다른 제조공정을 통하여 본 발명에서 목적하는 효소를 사용한 바이오 실크펩타이드 제조분말을 얻을 수 있다. 이하 실시 예를 통해 상세히 설명하기로 한다.Through the different manufacturing process as described above it is possible to obtain a bio silk peptide production powder using the enzyme of the present invention. It will be described in detail through the following examples.
실시 예1) 효소를 사용한 실크펩타이드 분말의 제조법 및 특성Example 1 Preparation and Properties of Silk Peptide Powder
섬유화할 수 없는 부잠사, 절각견 및 파사로부터 협잡물을 완전히 제거한 견사 10Og을 준비하였다.100 g of silk thread was prepared from which debris was completely removed from subfilaments, inseam dogs, and fascia that could not be fibrous.
제 1공정 : 준비된 견사에 대하여 액비 1:30으로 조정한 후 0.5∼1%(W/V)에 단백질 분해효소인 플라보자임(Flavourzyme) 및 액티나제(Actinase)를 55℃의 조건 하에 10분간 질소가스를 투입하여 효소의 산화를 방지한 후, 6시간 정련을 실시하여 고효율의 견 단백질 피브로인(fibroin)을 얻었다. 이때의 연감율은 평균 23%가 얻어졌다.The first step: the prepared silk thread was adjusted to a liquid ratio of 1:30, and then the flavonzyme and actinase, which were proteolytic enzymes, were mixed at 0.5 to 1% (W / V) under a condition of 55 ° C. Nitrogen gas was added for a minute to prevent oxidation of the enzyme, and then refined for 6 hours to obtain high-efficiency silk protein fibroin. The average annual rate at this time was 23%.
제2공정 : 세리신이 제거된 견사 35g에 대하여 CaC12266.4g, H2O 346g, Ethano1 280mℓ를 2구형 둥근 플라스크에 넣어,90℃에서 가열(Boiling)을 하면서 5시간 견 피브로인을 용해시켰다.Second step: About 35 g of silk thread from which sericin was removed, 266.4 g of CaC1 2, 346 g of H 2 O, and 280 ml of Ethano1 were placed in a two-necked round flask, and the silk fibroin was dissolved for 5 hours while heating at 90 ° C.
제3공정 : 용해된 피브로인-CaCl2수용액에 대하여 투석을 4일 실시하여 염을 완전히 제거 시켰다.Step 3: Dialysis was performed on the dissolved fibroin-CaCl 2 aqueous solution for 4 days to completely remove the salt.
제4공정 : 제 3공정에서 얻어진 용액을 사용하여 단백질분해효소인 플라보자임 및 액티나제 1-5%(견사무게 기준)를 첨가하여 55℃에서 3 시간 처리하였다.4th step: The solution obtained by the 3rd process was used, and the proteolytic enzyme flavozyme and actinase 1-5% (soy crab standard) were added, and it processed at 55 degreeC for 3 hours.
제 5공정 : 제1공정에서 얻어진 견사50g에 대하여 2N HCI 1.8ℓ를 넣어서 110℃에서 2시간 산 가수분해시킨 후 액을 여과하여 4 N NaOH액으로 중화 시켰다.Fifth step: To 50 g of silk thread obtained in the first step, 1.8 L of 2N HCI was added thereto, followed by acid hydrolysis at 110 ° C. for 2 hours, and the solution was filtered to neutralize with 4 N NaOH solution.
제6공정 : 제5공정에서 얻어진 액을 분자량(MW)이 1000-3000정도의 분자량을 얻을수 있는 탈염기를 사용하여 분자량 1000-3000정도의 피브르인 액을 얻었다.6th step: The liquid obtained by the 5th process was the fibrin liquid about 1000-3000 molecular weight using the demineralizer which can obtain the molecular weight of about 1000-3000 molecular weight (MW).
제7공정 : 5% HCI수용액 1ℓ 에 견사 50g을 넣어서 80℃에서 1시간 습열 처리한 후 동량의 NaOH용액으로 중화시켰다. 그 후 105℃에서 3시간 완전히 건조시킨 후 60Mesh의 분쇄기를 이용하여 분쇄하였다.Step 7: 50 g of silk thread was added to 1 L of 5% aqueous HCI solution, followed by moist heat treatment at 80 ° C. for 1 hour, and neutralized with the same amount of NaOH solution. Thereafter, the mixture was completely dried at 105 ° C. for 3 hours, and then ground using a 60-mesh mill.
제8공정 : 얻어진 수용액 상태 혹은 제7공정에서 얻어진 분말을 물에 녹인 후 그 액들을 0.8μm의 막을 사용하여 고형물 및 기포를 제거하였다. 또한 GPC에 Injection하기 전의 농도를 Moisture Ana|yzer를 사용하여 정확히 측정한 후,절대 분자량을 확인하였다.Eighth step: After dissolving the powder obtained in the aqueous solution state or the seventh step in water, the liquids were removed using a 0.8 μm membrane to remove solids and bubbles. In addition, the concentration before injection into GPC was accurately measured using Moisture Ana | yzer, and the absolute molecular weight was confirmed.
또한 용해도의 측정은 pH가 다른 수용액 10㎖에 각 샘플을 1g넣은 후, 2시간 처리 후 얻어진 수용액 상태의 카르복실기에 의한 말단기의 양으로 평균 중합도를 계산하였다. 아울러 각 샘플의 전 아미노산 함량은 6N 염산으로 가수분해 하였고, 자동아미노산 분석기로 분석하였다.In addition, the measurement of solubility measured the average degree of polymerization with the quantity of the terminal group by the carboxyl group of the aqueous solution obtained after processing for 1 hour after putting each sample 1g into 10 ml of aqueous solutions which differ in pH. In addition, the total amino acid content of each sample was hydrolyzed with 6N hydrochloric acid and analyzed by an automatic amino acid analyzer.
이상의 제조공정에서 얻어진 수용액 상태를 농축, 동결건조하여 분말 상의 피브로인을 얻었다. 이러한 서로 다른 분자량으로 제조된 피브로인 분말의 미세구조를 100-150배, 2000배 배율의 사진으로 첨부된 도면에서와 같이 각각의 특색있는 모습으로 관찰 되었다. 또한 평균분자량 및 중합도가 표1)과 같이 분석되었으며, 말단기 분석에 의한 중합도가 분자량의 크기와 거의 일치하는 결과를 얻어, 본 특허에서 얻은 분자량의 신뢰도가 타당함을 알았다. 그리고 위에서 언급한 3가지 샘플에 대한 가수분해 된 저분자 상태의 피브로인에 대한 유용한 각종 아미노산 함량의 결과를 표2)에 나타내었다.The aqueous solution state obtained in the above manufacturing process was concentrated and lyophilized, and powdery fibroin was obtained. The microstructures of the fibroin powders produced at these different molecular weights were observed in their characteristic features as shown in the accompanying drawings with pictures of 100-150 times and 2000 times magnification. In addition, the average molecular weight and the degree of polymerization were analyzed as shown in Table 1, and the degree of polymerization obtained by the end group analysis was almost identical to the size of the molecular weight, and it was found that the reliability of the molecular weight obtained in the present patent was valid. And the results of the various useful amino acid contents for the hydrolyzed low molecular fibroin for the three samples mentioned above are shown in Table 2).
[표 1]TABLE 1
다른 조건에서 제조된 피브로인의 평균분자량 및 중합도Average Molecular Weight and Degree of Polymerization of Fibroin Prepared at Different Conditions
[표 2]TABLE 2
바이오 실크펩타이드 분말의 전아미노산 함량비교(%)Comparison of Total Amino Acid Content of Bio Silk Peptide Powder (%)
상기 표 2)에서 가수분해가 된 저분자량으로 존재하는 전 아미노산의 함량이 각각의 샘플에 있어서 그 조성이 다르게 존재하고 있음을 나타내고 있다. 또한 단백질 분해효소인 플라보자임, 액티나제에 의한 아미노산 함량의 차이는 거의 같게 나타났다.특히 여기서 주목해야 할 아미노산의 조성은, 각 샘플에 있어서 Serine 및 Tyrosine의 조성이다. 대조구라고 할 수 있는 샘플 2의 아미노산 조성과 비교하였을 때, 완전 산 가수분해 한 샘플(샘플 1)의 경우와 효소분해 분말(샘플 3)의 경우 모두 견 피브로인의 기본구조인 β-sheet내의 수소결합을 지탱하는 Glycine 및 Alanine의 함량은 거의 유효 근사치 내에 있음을 알 수 있다. 그러나, 효소를 사용한 샘플3의 경우는 온화한 조건 때문인지 β-sheet구조의 기본골격은 유지하지만, 대조인 샘플 2에 비하여 Serine의 함량은 1.5배이상, Tyrosine의 함량은 2배정도 함량의 차이를 나타내었는데, 이것은 식용 단백질 분해효소에 의하여 특정아미노산,즉 수산기(-OH)를 함유하는 Serine 및 Tyrosine의 -OH부분이 영향을 받았음을 확실히 알 수 있고, 상대적으로 많이 존재하는 아미노산 등의 활성기가 유효한 기능성의 역할을 하였을 것이다. 이러한 기본 아미노산 조성의 차이가 어떠한 기능성에 효과가 있는지, 또는 각기 다른 수소이온 영역에 있어서의 용해도 차이 실시 예를 설명한다.In Table 2), the content of all amino acids present in the low molecular weight that was hydrolyzed indicates that the composition was different in each sample. In addition, the difference in amino acid content by the proteolytic enzyme flavozyme and actinase was almost the same. In particular, the amino acid composition to be noted here is the composition of Serine and Tyrosine in each sample. Compared to the amino acid composition of sample 2, which is a control, the hydrogen bonds in β-sheet, which is the basic structure of silk fibroin, in the case of complete acid hydrolyzed sample (sample 1) and enzymatic powder (sample 3), respectively. It can be seen that the content of glycine and alanine that supports is almost the effective approximation. However, in case of sample 3 using enzymes, the basic skeleton of β-sheet structure is maintained due to mild conditions, but the content of Serine is more than 1.5 times and that of Tyrosine is about 2 times higher than that of control sample 2. This shows that certain amino acids, ie, the -OH moieties of Serine and Tyrosine containing hydroxyl groups (-OH), were affected by edible proteolytic enzymes. Would have played a role. Examples of how the difference in the basic amino acid composition has an effect or the solubility difference in different hydrogen ion regions will be described.
[표 3]TABLE 3
각 샘플의 수소이온농도에 의한 용해도비교 (단위 %)Comparison of Solubility by Hydrogen Concentration of Each Sample (Unit%)
표 3)은 효소를 사용한 바이오실크 분말 및 다른 조건으로 조제한 각 샘플의 경우,다른 수소이온영역에 있어서 겔화의 진전 혹은 침전물이 어느정도 발생하는지를 알아보기 위함이다. 위의 표 3)에서와 같이 본 발명의 분자량이 조절된 피브로인의 경우, 대조구라 할 수 있는 샘플2의 경우는 거의 전 pH영역에서 용해되지 않고있음을 나타내고, 샘플3의 경우는 약70%정도 고른 용해가 일어났음을 암시한다. 이러한 용해도의 차이는 인체에 섭식 하였을 경우, 인체 효소에 의한 분해를 생각한다면 어느정도의 분자량이 있어야 함은 물론, 서로 다른 기능성의 차이를 기대할 수 있을것이다. 상기 실시 1)에서 제조한 각 샘플의 기능성 실험의 실시예를 소개한다.Table 3) shows the extent to which gelation progresses or precipitates occur in different hydrogen ion regions in the biosilk powder using enzymes and in each sample prepared under different conditions. As shown in Table 3 above, in the case of fibroin having a controlled molecular weight of the present invention, Sample 2, which is a control, shows almost no dissolution in the entire pH range, and Sample 3 is about 70%. It suggests that even dissolution occurred. If the difference in solubility is fed to the human body, if you consider the decomposition by human enzymes should have a certain molecular weight, as well as can expect different functional differences. An example of the functional experiment of each sample prepared in Example 1) is introduced.
실시예 2) 기능성 시험Example 2) Functional Test
① 항산화 작용 : 최근 천연물은 항산화제, 항암제등을 함유하는, 생물학적으로는 활성이 있는 자원이 주목을 받고 있으며, 특히 항산화작용은 세포막에서의 다가 불포화지방산을 공격하여 지질과산화를 일으키는 인자등과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 결국, 지질과산화로 인한 노화 및 발암의 원인과 매우 밀접한 관계가 있으므로 대단히 증요한 작용인데,항산화작용의 실험은, 시료를 수용액상태로 준비하여 유발마우스의 조직을 마쇄한 후, 시료를 10μg/㎖씩 테스트 튜브에 첨가하여, 대표적인 지질과산화물의 측정에 많이 쓰이는 Thio Barbitric Acid (TBA법) 및 Phenol성 화합물의 산화정도를 나타내는 1,1-Diphenyl-2-Picryl-Hydrazy1 (DPPH법)을 채택 하여 각 시료에 의한 항산화 작용의 효과로 판단하였다.① Antioxidant activity: Natural products are recently attracting attention for biologically active resources containing antioxidants, anticancer agents, etc. In particular, antioxidant activity is associated with factors causing lipid peroxidation by attacking polyunsaturated fatty acids in cell membranes. This is known to be. After all, there is a very important action because it is very closely related to the causes of aging and carcinogenesis due to lipid peroxidation, the anti-oxidation experiment, after preparing the sample in the aqueous solution and grinding the tissue of the induced mouse, the sample was 10μg / ㎖ Thio Barbitric Acid (TBA method) and 1,1-Diphenyl-2-Picryl-Hydrazy1 (DPPH method), which are used for the determination of representative lipid peroxides, are used in the test tubes. It was judged by the effect of the antioxidant activity by the sample.
[표 4]TABLE 4
실크분말의 항산화 효과Antioxidant Effect of Silk Powder
표 4)에서와 같이 샘플1의 산가수분해하여 분자량(MW)을 2500내외로 조절한 분말의 경우, TBA법의 49.5%±1.8% (대조구의 91% 수준)로서, 산으로 가수분해한 분말 30.3%±3.2%에 비하여 우수하였다. 또한 중성염용해후 단백질 분해효소처리(0.1-1% Flavourzyme 및 Actinase)하여 용해수준의 분자량으로 조절한 샘플의 항산화 작용이 47.5±0.9%로서 대조구의 88%수준을 나타내어서 우수한 효과를 나타내었다. 또한 분자량이 아주 큰 샘플 2의 경우는 낮은 항산화작용의 정도를 나타내어서 분자량 및 특정 아미노산의 차이에 의한 항산화작용에 효과가 있음을 나타내고 있다.As shown in Table 4, in the case of the powder obtained by acid hydrolysis of Sample 1 to adjust the molecular weight (MW) to around 2500, the powder hydrolyzed with acid as 49.5% ± 1.8% (91% of the control) of the TBA method. It was superior to 30.3% ± 3.2%. In addition, the antioxidant activity of the sample adjusted to the molecular weight of the dissolution level by neutral proteolytic enzyme treatment (0.1-1% Flavorzyme and Actinase) was 47.5 ± 0.9%, showing 88% of the control group showed an excellent effect. In addition, Sample 2, which has a very high molecular weight, shows a low degree of antioxidant activity, indicating that it is effective in antioxidant activity due to a difference in molecular weight and a specific amino acid.
② Alcoho1대사 분해 활성 평가② Alcoho1 metabolic degradation activity evaluation
현재 개발되어 있는 합성의약품에 의한 알콜대사의 효과는 몇몇 보고가 되어있으나, 합성의약품 자체가 독성 또는 부작용을 나타냄으로써 부작용이 적은 천연물로 부터 유효성분을 얻고자하는 추세에 있다.There are some reports on the effects of alcohol metabolism by synthetic drugs, which are currently being developed. However, the synthetic drugs themselves are toxic or have side effects.
실험전 마우스를 24시간 절식시키고 물만 공급하였다. 본 실험전에 Urethane 500mg/kg식 복강경 내에 투여하여 마취시킨 후 0.5g/ℓ의 arabia gum에 현탁시켜서 경구투여 하였다. 알콜분해 활성의 평가는 알콜을 분해하는 효소인 Alcoholdehydrogenase를 모니터화 하는방법 및 혈중의 알콜양을 측정하는 방법이있는데, 본 특허의 알콜분해효소에 대한 활성의 평가는 후자의 법으로 하였다. in Vitro의 경우는 500μg/mg, in ViV0의 경우는 50μg/kg을 각각 처리하여 어느정도의 알콜분해 능력이 있는지를 확인하였다, 확인된 결과를 표 5)에 나타내었다.Mice were fasted for 24 hours before the experiment and only water was supplied. Urethane was administered in 500mg / kg laparoscopic anesthesia before the experiment and suspended orally in 0.5g / l arabia gum. The evaluation of alcohol degrading activity includes a method of monitoring alcohol dehydrogenase, which is an enzyme that decomposes alcohol, and a method of measuring the amount of alcohol in the blood. The evaluation of the activity of alcohol degrading enzyme of the present patent was performed by the latter method. In Vitro was treated with 500μg / mg, in ViV0 50μg / kg to determine the degree of alcohol degrading ability, respectively, the results are shown in Table 5).
[표 5]TABLE 5
실크분말의 알콜분해능력에 대한 효과Effect of Silk Powder on Alcohol Degradability
표 5)에서와 같이 실크분말의 알콜분해효소에 대한 활성을 보면 ln Vitro시험에서는 산가수분해 분말(샘플 1)과 효소용해 분말(샘플 3) 간에 유의차이가 없었으나 In Vivo 시험에서는 상대적으로 분자량이 큰 효소 용해 분말이 58.40±0.2의 활성치로,나타내어 분자량이 작은 산가수분해 분말의 활성치인 22.61±0.21에 비하여 2.5배이상 높은 분해능력을 발휘하였다. 이러한 사실은, 본 발명에서 규명하고자 하는 분자량 및 특정아미노산의 차이에서오는 기능성에 효과가 있음을 알 수 있다 표2)의 아미노산 조성에서도 알 수 있듯이 Tyrosine 및 Serine의 함량에 의한, 특히,이러한 활성기를 가진 펩타이드 수준의 절단된 유효부분이 작용했음을 짐작할 수있다. 이러한 사실은 영양학적인 측면에서 Oligopeptide레벨의 경우에 소화흡수에 유리하다고 하는 사실과 일치하는 결과를 보여주고 있다.As shown in Table 5, there was no significant difference between acid hydrolysis powder (sample 1) and enzyme soluble powder (sample 3) in the ln Vitro test. This large enzyme dissolving powder exhibited an activity value of 58.40 ± 0.2, and exhibited a decomposition ability of 2.5 times higher than that of 22.61 ± 0.21, an activity value of an acid hydrolysis powder having a small molecular weight. This fact, it can be seen that there is an effect on the functionality resulting from the difference between the molecular weight and the specific amino acid to be identified in the present invention, as can also be seen in the amino acid composition of Table 2), in particular, by the content of Tyrosine and Serine, It can be assumed that the cleaved effective portion of the peptide level at which it was acted. This fact is consistent with the fact that in the nutritional context, Oligopeptide levels favor digestive absorption.
이상에서 살펴본 기능성의 결과와 같이 제조방법에 따라 분자량이 다른 실크분말의 기능성 검정 결과에 있어 분자량과 기능성이 상당한 차이가 있음을 알 수 있었다. 또한 본 발명에서 제시하고자 하는 식용효소에 의한 분자량의 조절이라는 독창적인 사실은 실크분말의 유용 성분이 소화·홉수의 측면에서 효능이 있음을 입증하였고, 각 성분에 의한 천연 순수 활성물질로 개발될 수 있음을 기대할 수 있게 되었다.As a result of the functionalities described above, it was found that the molecular weight and the functionality differ significantly in the functional test results of silk powders having different molecular weights depending on the production method. In addition, the original fact that the molecular weight is controlled by the edible enzyme to be presented in the present invention proved that the useful components of silk powder are effective in terms of digestion and hop number, and can be developed as natural pure active substances by each component. I can expect it.
본 발명에 의해 얻어진 실크 피브로인 분말펩타이드는 단백질분해 효소분해로 인하여 분자량이 12,000-13,500이고 중합도가 163으로서 pH l-13에서 70% 용해도를 나타내고 있듯이 적정분자량으로 인하여 체내흡수율이 높고 항산화작용과 알콜대사분해능력이 탁월하여 기능성식품 또는 의약품 및 순수활성물질의 개발에 기여할 수 있다.The silk fibroin powder peptide obtained by the present invention has a high molecular weight absorption, antioxidant activity and alcohol metabolism due to the proper molecular weight, as the molecular weight is 12,000-13,500 and the degree of polymerization is 163, which shows 70% solubility at pH l-13. Excellent degradability can contribute to the development of functional foods or drugs and purely active substances.
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