KR19990064640A - Quadruplex PCR systems consisting of STR loci which are high discriminating in Korean population and the methods of human identification using them - Google Patents
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Abstract
본 발명은 유전자 시스템에서 한국인 집단에서 변별력을 가진 유전자 마커의 검출 및 이들의 조합을 이용한 유전자 감식방법에 관한 것으로서, 중합효소연쇄반응을 이용하여 STR 유전자좌들의 조합을 동시에 증폭함으로써 신속하게 유전자감식을 할 수 있는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 멀티플렉스 PCR 시스템을 이용한 유전자 감식방법은 동시에 증폭될 수 있는 적어도 3개 이상, 바람직하게는 4개의 STR유전자좌들을 갖고 있는 하나이상의 분석 DNA 샘플을 얻는 단계, 상기 DNA 샘플에서 특정 프라이머들을 사용하여 STR 서열을 PCR 증폭하는 단계, 증폭된 산물을 전기영동을 통해 검출하여 증폭된 대립유전자들을 평가하고, 이를 통해 DNA 샘플내의 분석된 유전자좌들 조합의 각각의 유전자형들을 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 또한, 본 발명자에 의해 완성된 상기 적어도 3개 이상의 유전자좌들로 구성된 멀티플렉스 STR 시스템은 D5S818, D13S317, D19S253, D3S2406, D2S1371, D8S1477, D12S391, D20S470, D6S1043, D9S925, D7S821, D4S2368, D21S1437, D16S3253, D14S608 및 D18S1270 유전자좌들로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 3개 이상의 유전자좌들의 조합으로 구성되는 것을 특징으로 한다.The present invention relates to a method for detecting gene markers having distinctive powers in a Korean population in a genetic system and a method for identifying genes using a combination thereof. The present invention provides rapid gene identification by simultaneously amplifying a combination of STR loci using a polymerase chain reaction. It is about how it can be. Gene identification using the multiplex PCR system of the present invention comprises obtaining at least one analytical DNA sample having at least three or more, preferably four STR loci, which can be amplified simultaneously, using specific primers in the DNA sample. PCR amplifying the STR sequence, detecting the amplified product by electrophoresis to evaluate the amplified alleles, thereby determining respective genotypes of the analyzed locus combinations in the DNA sample. It is done. In addition, the multiplexed STR system consisting of the at least three or more loci completed by the present inventors D5S818, D13S317, D19S253, D3S2406, D2S1371, D8S1477, D12S391, D20S470, D6S1043, D9S925, D7S821, D4S2368, D21S1437, D16S1437 And a combination of at least three or more loci selected from the group consisting of D14S608 and D18S1270 loci.
Description
본 발명은 유전자 시스템에서 한국인 집단에서 변별력을 가진 유전자마커(genetic markers)의 검출 및 이들의 조합을 이용한 유전자 감식방법에 관한것으로서, 보다 상세하게는 중합효소연쇄반응(PCR; polymerase chain reaction)을이용하여 여러 다형성 유전자좌들의 조합, 특히 STR 유전자좌들(short tandem repeat loci)의 조합을 동시에 증폭함으로써 신속하게 유전자감식을 할 수 있는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for detecting gene markers having distinctive powers in Korean populations in a genetic system and a gene identification method using a combination thereof, and more specifically, using a polymerase chain reaction (PCR). Therefore, the present invention relates to a method for rapidly genetic recognition by simultaneously amplifying a combination of several polymorphic loci, particularly a combination of STR loci (short tandem repeat loci).
일반적으로 친자확인, 강력사건에 있어서의 범인지목을 목적으로 한 유전자 감식법에는 1990년대 들어 비약적으로 그 기술이 발전된 PCR을 이용한 amp-FLP(Amplification Fragment Length Polymorphism) 타이핑 방법이 사용되고 있으며, 간단하면서도 정확한 DNA 타이핑을 위해 STR이 유전자 감식의 마커로서 아주 유용한 것으로 확인되었다. 그 동안 많은 연구들을 통해 다양한 VNTR(Variable Number of Tandem Repeats)과 STR(Short Tandem Repeat)이 발견되었고, 이들 중 일부의 STR 유전자좌들은 법과학분야(Forensic Science)에서 널리 사용되기에 이르렀다.Generally, amp-FLP (Amplification Fragment Length Polymorphism) typing method using PCR, which has been advanced in the 1990s, is used for gene identification for paternity in paternity and violent cases. For typing, STR has been found to be very useful as a marker of genetic identification. Many studies have found a variety of Variable Number of Tandem Repeats (VNTRs) and Short Tandem Repeats (STRs), some of which have been widely used in Forensic Science.
STR 유전자좌들(Short Tandem Repeat loci)은 2 내지 7개의 염기쌍의 짧은 반복서열로 구성되어 있는데, 인간 유전자에는 약 2백만개의 삼량체 및 사량체 STR들이 15 kb당 한 번씩 존재하는 것으로 추정되고 있다(Edwards et al., 1991, DNA typing and genetic mapping with trimeric and tetrameric tandem repeat. Am. J. Hum. Genet. 49:746-756). 상기 Edwards 등의 문헌에 따르면, STR 유전자좌들의 거의 절반이 다형성을 나타내는데, 이는 STR이 유전자 마커로서 매우 유용함을 시시하고 있다.The STR locus (Short Tandem Repeat loci) consists of short repeat sequences of 2 to 7 base pairs, and it is estimated that about 2 million trimer and tetramer STRs exist in the human gene once every 15 kb ( Edwards et al., 1991, DNA typing and genetic mapping with trimeric and tetrameric tandem repeat.Am J. Hum. Genet. 49: 746-756). According to Edwards et al., Almost half of the STR loci exhibit polymorphism, indicating that STR is very useful as a genetic marker.
통상, 이러한 유전자 감식의 신뢰성을 높이기 위해서는 많은 STR을 대상으로조사가 수행되어야 하는데, 많은 STR을 대상으로 유전자 감식을 수행할 경우에는 수많은 STR 대립유전자의 확인에 따른 시간과 인력의 소모라는 문제점이 있었다. 따라서, 이러한 문제점을 해결하기 위해 한 번의 PCR 반응에 여러 유전자좌의 프라이머를 넣고 동시에 반응을 수행하는 멀티플렉스 PCR 시스템이 대안으로 제시되고있다. 예를 들어, 3개의 유전자좌의 반응을 동시에 수행하는 트리플렉스 시스템(triplex system)을 사용할 경우 소요시간, 시약, 장비 및 인력을 3분의 1정도로 줄일 수 있게 된다. 이와 같이 멀티플렉스 PCR 시스템이 갖는 장점 때문에 미국 및 유럽 등지의 선진국가에서는 자국의 현실에 맞는 멀티플렉스 PCR 시스템을 확립하는데 박차를 가하고 있으며, 이미 미국의 프로메가 등은 트리플렉스 PCR 키트를 상용 시판하고 있으며 (Triplex I: HumTHO1, HumTPOX, HumCSF1PO; TriplexⅡ: HumvWA, HumFES/FPS, HumF13AO1), Kimpton 등은 이를 바탕으로 트리플렉스 PCR 시트템 위주의 연구를 활발히 진행하였고(Kimpton et al., 1995, Report on the second EDNAP collaborative exercise Forensic Sci Inter. 71:137-152; Urquhart et al., Sequence variability of the tetranucleotide repeat of the human beta-actin related pseudogene H-beta-AC-psi-2(ACTBP2) locus. Humn Genet. 92:637-6384), 최근에는 미국특허공보 제 5,843,660 호에 개시된 바와 같이 4가지의 유전자좌들을 동시에 분석하는 콰드루플렉스 시스템(quadruplex system) 및 그 이상의 유전자좌들을 동시에 분석하는 멀티플렉스 시스템이 제안되고 있다.In general, in order to increase the reliability of gene identification, a large number of STRs should be investigated. However, when a large number of STRs are genetically identified, there is a problem in that it consumes time and manpower due to the identification of numerous STR alleles. . Therefore, in order to solve this problem, a multiplex PCR system is proposed as an alternative to put primers of several loci in one PCR reaction and perform the reaction at the same time. For example, using a triplex system that simultaneously performs reactions of three loci can reduce the time required, reagents, equipment, and manpower to about one third. Due to the advantages of the multiplex PCR system, developed countries in the United States and Europe are speeding up to establish a multiplex PCR system suitable for their own realities. Promega, etc. of the United States has already commercially sold triplex PCR kits. (Triplex I: HumTHO1, HumTPOX, HumCSF1PO; TriplexII: HumvWA, HumFES / FPS, HumF13AO1), Kimpton et al. second EDNAP collaborative exercise Forensic Sci Inter. 71: 137-152; Urquhart et al., Sequence variability of the tetranucleotide repeat of the human beta-actin related pseudogene H-beta-AC-psi-2 (ACTBP2) locus.Humn Genet. 92: 637-6384) and, more recently, quadruplex systems and more genes that simultaneously analyze four loci as disclosed in US Pat. No. 5,843,660. The multiplex system analyzes the same time have been proposed.
이러한 멀티플렉스 시스템의 지속적인 개발성과는 강력 사범 유전자정보은행(DNA Intelligence Database)의 설립 및 운용에 박차를 가할 만한 획기적인 성과로서 1998년 10월 현재 영국, 미국, 독일, 오스트리아, 네덜란드 등이 유전자정보은행을 운용하고 있으며, 특히 영국의 경우에는 1995년부터 대상자들의 입력을 시작한 이래 현재 400,000명 이상의 데이터를 보유하고 있으며 이 데이터베이스를 통하여 범인을 검거한 제이스가 28,000건을 넘어선 성과를 올리고 있다. 미국의 경우도 주(state) 단위로 운용하던 데이터베이스를 미연방수사국이 관리하는 CODIS(combined DNA Index system)을 이용하여 연방전체의 내셔널 DNA 데이터베이스를 구축하는 단계로 접어들었다.The continuous development of these multiplex systems is a significant achievement that will spur the establishment and operation of the powerful DNA Intelligence Database. As of October 1998, the United Kingdom, the United States, Germany, Austria, the Netherlands, etc. In particular, the UK has more than 400,000 data since entering the subjects since 1995, and Jays arrested more than 28,000 cases through this database. In the United States, the state-run database was set up to build a national-wide DNA database using a combined DNA Index system (CODIS) maintained by the Federal Bureau of Investigation.
그런데, 전술한 바와 같이 이들 국가들에서 운용하고 있는 유전자정보은행의특징을 살펴보면, 1O개 이상의 STR 유전자좌들을 사용함을 알 수 있는데, 이는 정확한 범인검거를 위해 요구되는 중복되는 유전자형이 없는 데이터베이스 구축을 위해 필수적이며, 또한 1O개 이상의 STR 유전자좌들의 증폭을 효율적으로 수행하기 위해서 멀티플렉스 시스템을 채택하고 있음을 알 수 있다.However, as mentioned above, the characteristics of the genetic information banks operating in these countries show that more than 100 STR loci are used, which is used to establish a database without overlapping genotypes required for accurate criminal detection. It is essential that the multiplex system is adopted to efficiently amplify more than 100 STR loci.
한편, 간과해서는 안되는 중요한 점이 있는데, 유전자정보은행을 실시중인 대부분의 국가가 백인이 주류를 이루는 국가이기 때문에 선정한 STR 유전자좌들은백인들에게서 변별력이 높은 것이며, 상용화된 감식 키트 역시 이러한 유전자정보은행 시스템에 맞게 개발되어 있어 한국인과 같은 동양인의 유전자 감식에는 그 만큼 변별력이 낮아질 수밖에 없는 문제점이 있었다. 특히, 전술한 바와 같은 미국특허공보 제 5,843,660 호에 기재된 멀티플렉스 STR 시스템은 백인집단에 알맞는 STR유전자좌들의 조합이며 한국인과 같은 동양인의 다형성 확인 및 유전자 감식을 위해서는 백인집단에 비하여 변별력이 떨어지는 조합이다.On the other hand, there is an important point that should not be overlooked, since most of the countries in which genetic information banks run are white-dominated countries, the selected STR loci are highly distinguishable among white people. It has been developed according to the genetic identification of Asians such as Koreans had a problem that can not only discriminate that much. In particular, the multiplexed STR system described in U.S. Patent No. 5,843,660 described above is a combination of STR genes suitable for Caucasian populations and a combination that is less discriminative than Caucasians for polymorphism identification and genetic identification of Asians such as Koreans. .
따라서, 본 발명이 속하는 기술분야에서는 독자적인 유전자정보은행의 구축을 위해 한국인 등 동양인 집단에 맞는 STR 유전자좌들의 선별과 유전자감식법의 개발이 절실히 요구되어 왔다. 특히, STR 유전자좌들의 확인 즉, 마커의 확인시에은염색(silver staining)을 사용할 경우 한 유전자좌의 증폭산물의 크기와 다른 유전자좌의 증폭산물의 크기가 중복될 경우에는 확인이 어렵게 되므로 대립유전자 크기가 서로 중복되지 않는 STR 유전자좌들의 조합만이 은염색에 대해 식별가능한 점을 감안할 때, 한국인 집단에 대한 높은 변별력을 가지는 동시에 전기영동 후 은염색에 대해 검출가능한 STR 유전자좌들의 조합의 개발은 매우 중요하다고 할 것이다. 또한, 동일 염색체에 존재하는 유전자좌들을 선택할 경우 유전자좌들의연관(linkage)에 의해 변별력에 있어 신뢰성이 떨어지기 때문에 각기 다른 염색체에 존재하는 유전자좌들의 선정은 본 발명이 속하는 기술분야에서 매우 중요한 의미를 갖고 있다. 뿐만 아니라 이러한 STR 유전자좌들의 선별과 멀티플렉스 증폭을뒷받침해 줄 수 있는 프라이머의 제공 역시 매우 중요하다.Therefore, in the technical field to which the present invention belongs, there has been a great demand for the development of genetic identification banks and the selection of STR loci suitable for Asian populations such as Koreans. In particular, identification of STR loci, that is, when silver staining is used to identify markers, is difficult to identify when the size of the amplification product of one locus and the size of the amplification product of another locus overlap, so that allelic sizes are Given that only non-overlapping combinations of STR loci are identifiable for silver staining, the development of combinations of STR loci that are highly discriminating against the Korean population and detectable for silver staining after electrophoresis would be very important. . In addition, the selection of loci existing on different chromosomes has a very important meaning in the art to which the present invention belongs, because the selection of loci existing on the same chromosome is less reliable in discrimination by linkage of the loci. . In addition, the selection of primers to support the selection and multiplex amplification of these STR loci is very important.
따라서, 본 발명의 목적은 한국인 집단에서 변별력을 가지는 STR 유전자좌들의 조합을 제공하는데 있다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a combination of STR loci with distinctiveness in the Korean population.
또한, 본 발명의 목적은 한국인 집단에서 변별력을 지닐 뿐만 아니라 전기영동후 검출가능한 STR 유전자좌들의 조합을 제공하는데 있다.It is also an object of the present invention to provide a combination of STR loci that are detectable after electrophoresis as well as having discrimination in the Korean population.
또한, 본 발명의 목적은 한국인 집단에서 변별력을 가지는 STR 유전자좌들의멀티플렉스 증폭에 적합한 프라이머를 제공하는데 있다.It is also an object of the present invention to provide a primer suitable for multiplex amplification of STR loci having discriminating power in Korean population.
나아가, 본 발명은 상기와 같은 STR 유전좌들의 조합과 프라이머를 이용한 PCR 증폭의 조건을 확립하여 한국인 집단에서 변별력을 지닌 유전자 감식법을 제공하는데 그 목적이 있다.Furthermore, an object of the present invention is to establish a condition for PCR amplification using a combination of the above-described STR loci and primers, and to provide a gene identification method having discrimination in Korean population.
추가로, 본 발명은 상기와 같은 프라이머와 STR 유전자좌들의 조합을 채택함으로써 한국인 집단에서 변별력을 지닌 유전자 감식방법을 구현하고 있는 키트를 제공하는데 그 목적이 있다.In addition, an object of the present invention is to provide a kit that implements a gene identification method having a discriminating power in the Korean population by adopting the combination of the primers and STR loci as described above.
도 1은 실시예 1에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.1 is a photograph showing a band pattern after electrophoresis of a sample multiplex-amplified according to Example 1. FIG.
도 2는 실시예 2에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.FIG. 2 is a photograph showing a band pattern after electrophoresis of a sample multiplex-amplified according to Example 2. FIG.
도 3은 실시예 3에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.3 is a photograph showing a band pattern after electrophoresis of a sample multiplex-amplified according to Example 3. FIG.
도 4는 실시예 4에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.FIG. 4 is a photograph showing a band pattern after electrophoresis of a sample multiplex-amplified according to Example 4. FIG.
도 5는 실시예 5에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.FIG. 5 is a photograph showing a band pattern after electrophoresis of a sample multiplex-amplified according to Example 5. FIG.
도 6은 실시예 6에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.FIG. 6 is a photograph showing a band pattern after electrophoresis of a sample multiplex-amplified according to Example 6. FIG.
도 7은 실시예 7에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.7 is a photograph showing a band pattern after electrophoresis of a sample multiplex-amplified according to Example 7.
도 8은 실시예 8에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.FIG. 8 is a photograph showing a band pattern after electrophoresis of a sample multiplex-amplified according to Example 8. FIG.
도 9는 실시예 9에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.9 is a photograph showing a band pattern after electrophoresis of a sample multiplex-amplified according to Example 9.
도 10은 실시예 10에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.10 is a photograph showing a band pattern after electrophoresis of a sample multiplex-amplified according to Example 10. FIG.
도 11은 실시예 11에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.FIG. 11 is a photograph showing a band pattern after electrophoresis of a sample multiplex-amplified according to Example 11. FIG.
도 12는 실시예 12에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.12 is a photograph showing a band pattern after electrophoresis of a sample multiplex-amplified according to Example 12. FIG.
도 13은 실시예 13에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.FIG. 13 is a photograph showing a band pattern after electrophoresis of a sample multiplex-amplified according to Example 13. FIG.
도 14는 실시예 14에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.FIG. 14 is a photograph showing a band pattern after electrophoresis of a sample multiplex-amplified according to Example 14. FIG.
도 15는 실시예 15에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.FIG. 15 is a photograph showing a band pattern after electrophoresis of a sample multiplex-amplified according to Example 15. FIG.
도 16은 실시예 16에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.FIG. 16 is a photograph showing a band pattern after electrophoresis of a sample multiplex-amplified according to Example 16. FIG.
도 17은 실시예 17에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.FIG. 17 is a photograph showing a band pattern after electrophoresis of a sample multiplex-amplified according to Example 17. FIG.
도 18은 실시예 18에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.FIG. 18 is a photograph showing a band pattern after electrophoresis of a sample multiplex-amplified according to Example 18. FIG.
도 19는 실시예 19에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.19 is a photograph showing a band pattern after electrophoresis of a sample multiplex-amplified according to Example 19. FIG.
도 20은 실시예 20에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.20 is a photograph showing a band pattern after electrophoresis of a sample multiplex-amplified according to Example 20. FIG.
도 21은 실시예 21에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.FIG. 21 is a photograph showing a band pattern after electrophoresis of a sample multiplex-amplified according to Example 21. FIG.
도 22는 실시예 22에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.FIG. 22 is a photograph showing a band pattern after electrophoresis of a sample multiplex-amplified according to Example 22. FIG.
도 23은 실시예 23에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.FIG. 23 is a photograph showing a band pattern after electrophoresis of a sample multiplex-amplified according to Example 23. FIG.
도 24는 실시예 24에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.FIG. 24 is a photograph showing a band pattern after electrophoresis of a sample multiplex-amplified according to Example 24. FIG.
도 25는 실시예 25에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.FIG. 25 is a photograph showing a band pattern after electrophoresis of a sample multiplex-amplified according to Example 25. FIG.
도 26은 실시예 26에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.FIG. 26 is a photograph showing a band pattern after electrophoresis of a sample multiplex-amplified according to Example 26. FIG.
도 27은 실시예 27에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.FIG. 27 is a photograph showing a band pattern after electrophoresis of a sample multiplex-amplified according to Example 27. FIG.
도 28은 실시예 28에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.FIG. 28 is a photograph showing a band pattern after electrophoresis of a sample multiplex-amplified according to Example 28. FIG.
도 29는 실시예 29에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.FIG. 29 is a photograph showing a band pattern after electrophoresis of a sample multiplex-amplified according to Example 29. FIG.
도 30은 실시예 30에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.30 is a photograph showing a band pattern after electrophoresis of a sample multiplex-amplified according to Example 30. FIG.
도 31은 실시예 31에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.FIG. 31 is a photograph showing a band pattern after electrophoresis of a sample multiplex-amplified according to Example 31. FIG.
도 32는 실시예 32에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.32 is a photograph showing a band pattern after electrophoresis of a sample multiplex-amplified according to Example 32. FIG.
도 33은 실시예 33에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.33 is a photograph showing a band pattern after electrophoresis of a sample multiplex-amplified according to Example 33. FIG.
도 34는 실시예 34에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.FIG. 34 is a photograph showing a band pattern after electrophoresis of a sample multiplex-amplified according to Example 34. FIG.
도 35는 실시예 35에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.FIG. 35 is a photograph showing a band pattern after electrophoresis of a sample multiplex-amplified according to Example 35. FIG.
도 36은 실시예 36에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.FIG. 36 is a photograph showing a band pattern after electrophoresis of a sample multiplex-amplified according to Example 36. FIG.
도 37은 실시예 37에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.FIG. 37 is a photograph showing a band pattern after electrophoresis of a sample multiplex-amplified according to Example 37. FIG.
도 38은 실시예 38에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.38 is a photograph showing band patterns after electrophoresis of a sample multiplex-amplified according to Example 38. FIG.
도 39는 실시예 39에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.FIG. 39 is a photograph showing band patterns after electrophoresis of a sample multiplex-amplified according to Example 39. FIG.
도 40은 실시예 40에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.40 is a photograph showing a band pattern after electrophoresis of a sample multiplex-amplified according to Example 40. FIG.
도 41은 실시예 41에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.FIG. 41 is a photograph showing band patterns after electrophoresis of a sample multiplex-amplified according to Example 41. FIG.
도 42는 실시예 42에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.FIG. 42 is a photograph showing a band pattern after electrophoresis of a sample multiplex-amplified according to Example 42. FIG.
도 43은 실시예 43에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.FIG. 43 is a photograph showing a band pattern after electrophoresis of a sample multiplex-amplified according to Example 43. FIG.
도 44는 실시예 44에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.FIG. 44 is a photograph showing a band pattern after electrophoresis of a sample multiplex-amplified according to Example 44. FIG.
도 45는 실시예 45에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.45 is a photograph showing band patterns after electrophoresis of a sample multiplex-amplified according to Example 45. FIG.
도 46은 실시예 46에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.FIG. 46 is a photograph showing a band pattern after electrophoresis of a sample multiplex-amplified according to Example 46. FIG.
도 47은 실시예 47에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.FIG. 47 is a photograph showing a band pattern after electrophoresis of a sample multiplex-amplified according to Example 47. FIG.
도 48은 실시예 48에 따라 멀티플렉스 증폭한 샘플을 전기영동한 후의 밴드패턴을 나타내는 사진이다.FIG. 48 is a photograph showing a band pattern after electrophoresis of a sample multiplex-amplified according to Example 48. FIG.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 대상 STR 유전자좌들의 한국인집단내 대립유전자(allele) 빈도를 일차적으로 고려해야 하는데, 이를 위해 대상 STR 유전자좌들의 조합은 변별력의 척도가 되는 PI(Probability of Identity)가 충분히 낮아야 하며, 이형성(heterozygosity)이 높은 것들이 유리하다. 주지된 바와같이 각각의 유전자좌는 인종간 변이가 심하며 동 인종내에서도 국가마다 약간의 차이를 보이기 때문에 일정한 수의 한국인집단의 대립유전자 빈도를 조사한 후 이중에서 적합한 유전자좌들을 조합하여 멀티플렉스 PCR 시스템을 채택해야만 한다.In order to achieve the above object, the present invention primarily considers the frequency of alleles in the Korean population of the target STR loci. For this purpose, the combination of the target STR loci has a PI (Probability of Identity) that is a measure of discrimination. Those that have to be low enough and have high heterozygosity are advantageous. As it is well known, each locus is highly racially varied and varies slightly from country to country within the same race. Therefore, after examining the frequency of alleles in a certain number of Korean populations, the multiplex PCR system must be adopted by combining the appropriate loci. do.
또한, 본 발명의 증폭의 효율성 측면에서 유사한 PCR 조건을 가지는 유전자좌들을 조합하여 멀티플렉스 PCR 시스템을 만들어야 한다. 이때 가장 중요하게 고려되어야 할 사항이 PCR 상의 어닐링(annealing) 온도이다. 조합된 유전자좌들의 프라이머가 어닐링 온도가 맞지 않는 것이라면 PCR 산물인 증폭단편들은 현저한 농도의 차이를 보일 것이며, 또한 많은 오류밴드(artifact band)들도 생성될 가능성이 있으므로 어닐링 온도의 편차가 크지 않은 프라이머들의 조합으로 이루어진 유전자좌들을 찾는 것이 중요하다.In addition, in terms of the efficiency of amplification of the present invention, multiplex PCR systems should be made by combining loci having similar PCR conditions. The most important consideration here is the annealing temperature on the PCR. If the primers of the combined loci do not match the annealing temperature, the PCR product amplification fragments will show a significant difference in concentration, and many error bands may also be generated. It is important to find a combination of loci.
또한, 본 발명의 멀티플렉스 PCR 시스템은 형광표지물질 검출 뿐만아니라 은염색을 통한 통상적인 전기영동이나 자동 DNA 시퀀서를 이용하여 전기영동을 수행할 것이므로 증폭단편들의 크기가 겹치는 유전자좌들을 조합해서는 안된다. 이밖에도 각 유전자좌 별로 일정한 농도의 밴드패턴을 얻기 위해서는 각 유전자좌의 프라이머 농도를 적절히 조절하는 것이 요구된다.In addition, the multiplex PCR system of the present invention will perform electrophoresis using conventional electrophoresis or automatic DNA sequencer through silver staining as well as fluorescence labeling, and thus should not combine overlapping loci of amplification fragments. In addition, it is required to appropriately adjust the primer concentration of each locus in order to obtain a constant concentration band pattern for each locus.
또 한가지로, 본 발명의 멀티플렉스 PCR 시스템에 포함될 유전자좌들은 재소자의 유전자형 분석을 위해서만 사용될 것이 아니고 강력사건의 증거물에도 똑같이적용될 기법들이므로 상태가 나쁜 감정물에서도 유전자형 검출이 잘 되는 민감도(sensitivity)가 높은 것이어야 하며 2인 이상의 유전자형이 섞인 감정물의 감식에 대비하여 스터터 밴드(stutter band)와 같은 오류밴드가 생성되지 않는 유전자좌들이 선정되어야 한다.In addition, since the loci to be included in the multiplex PCR system of the present invention are not only used for genotyping of inmates, but also for the evidence of a strong case, the genotypes have a high sensitivity to genotype detection even in a bad emotional state. The loci should be high and select loci that do not produce error bands such as stutter bands in preparation for identification of mixed objects of two or more genotypes.
이러한 조건들을 감안하여 본 발명자들은 STR 유전자좌들의 PCR 조건을 검토하여 증폭 및 전기영동 조건을 설정한 후 일정 숫자의 한국인집단에 대한 대립유전자 빈도를 조사하였으며, 이중 변별력이 높은 것들을 조합하여 16개의 유전자좌들로 선택된 적어도 3개 이상의 유전자좌들로 구성된 멀티플렉스 STR 시스템(multiplex STR system), 바람직하게는 콰드루플렉스 STR 시스템(quadruplex STR system)을 개발하였다.In view of these conditions, the present inventors examined the PCR conditions of STR loci, established amplification and electrophoretic conditions, and investigated the frequency of alleles for a certain number of Korean populations. A multiplex STR system, preferably a quadruplex STR system, consisting of at least three or more loci selected as
이러한 본 발명의 멀티플렉스 PCR 시스템을 이용한 유전자 감식방법은Gene identification method using the multiplex PCR system of the present invention
동시에 증폭될 수 있는 적어도 3개 이상, 바람직하게는 4개의 STR 유전자좌들을 갖고 있는 하나 이상의 분석 DNA 샘플을 얻는 단계;Obtaining at least one analytical DNA sample having at least three, preferably four STR loci, which can be amplified simultaneously;
상기 DNA 샘플에서 특정 프라이머들을 사용하여 STR 서열을 PCR 증폭하는 단계;PCR amplifying the STR sequence using specific primers in the DNA sample;
증폭된 산물을 전기영동을 통해 검출하여 증폭된 대립유전자들을 평가하고,이를 통해 DNA 샘플내의 분석된 유전자좌들 조합의 각각의 유전자형들을 결정하는단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.Detecting the amplified product by electrophoresis to evaluate the amplified alleles, thereby determining the respective genotypes of the analyzed locus combinations in the DNA sample.
본 발명자에 의해 완성된 상기 적어도 3개 이상의 유전자좌들로 구성된 멀티플렉스 STR 시스템은 다음과 같은 유전자좌들로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 3개 이상의 유전자좌들의 조합으로 구성되는 것을 특징으로 한다:The multiplexed STR system composed of the at least three loci completed by the inventors is characterized by consisting of a combination of at least three loci selected from the group consisting of the following loci:
D5S818, D13S317, D19S253, D3S2406, D2S1371, D8S1477, D12S391, D20S470, D6S1043, D9S925, D7S821, D4S2368, D21S1437, D16S3253, D14S608 및 D18S1270.D5S818, D13S317, D19S253, D3S2406, D2S1371, D8S1477, D12S391, D20S470, D6S1043, D9S925, D7S821, D4S2368, D21S1437, D16S3253, D14S608 and D18S1270.
상기 적어도 3개 이상의 유전자좌들로 구성된 멀티플렉스 STR 시스템은 바람직하게는 콰드루플렉스 STR 시스템이며, 본 발명의 콰드루플렉스 STR 시스템은 다음과 같은 4종의 유전자좌들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 유전자좌들의 조합을 포함하는 것을 특징으로 한다:The multiplexed STR system consisting of at least three or more loci is preferably a quadruplex STR system, and the quadruplex STR system of the present invention is one or more selected from the group consisting of the following four loci combinations: It is characterized by including a combination of loci:
D5S818, D13S317, D19S253, D3S2406;D5S818, D13S317, D19S253, D3S2406;
D2S1371, D8S1477, D12S391, D20S470;D2S1371, D8S1477, D12S391, D20S470;
D6S1043, D9S925, D7S821, D4S2368;D6S1043, D9S925, D7S821, D4S2368;
D21S1437, D16S3253 , D14S608 , D18S1270;D21S1437, D16S3253, D14S608, D18S1270;
D3S2406, D19S253, D9S925, D5S818;D3S2406, D19S253, D9S925, D5S818;
D4S2368, D19253, D9S925, D5S818;D4S2368, D19253, D9S925, D5S818;
D4S2368, D7S821, D13S317, D5S818;D4S2368, D7S821, D13S317, D5S818;
D18S1270, D19S253, D13S317, D5S818;D18S1270, D19S253, D13S317, D5S818;
D4S2368, D19S253, D13S317, D5S818;D4S2368, D19S253, D13S317, D5S818;
D20S470, D19S253, D13S317, D5S818;D20S470, D19S253, D13S317, D5S818;
D3S2406, D12S391, D13S317, D5S818;D3S2406, D12S391, D13S317, D5S818;
D20S470, D12S391, D13S317, D5S818;D20S470, D12S391, D13S317, D5S818;
D3S2406, D12S391, D8S1477, D2S1371;D3S2406, D12S391, D8S1477, D2S1371;
D4S2368, D12S391, D8S1477, D2S1371;D4S2368, D12S391, D8S1477, D2S1371;
D3S2406, D19S253, D8S1477, D2S1371;D3S2406, D19S253, D8S1477, D2S1371;
D20S470, D14S608, D8S1477, D2S1371;D20S470, D14S608, D8S1477, D2S1371;
D20S470, D19S253, D8S1477, D2S1371;D20S470, D19S253, D8S1477, D2S1371;
D4S2368, D7S821, D8S1477, D2S1371;D4S2368, D7S821, D8S1477, D2S1371;
D20S470, D12S391, D9S925, D2S1371;D20S470, D12S391, D9S925, D2S1371;
D3S2406, D12S391, D13S317, D2S1371;D3S2406, D12S391, D13S317, D2S1371;
D20S470, D14S608, D16S3253, D2S1371;D20S470, D14S608, D16S3253, D2S1371;
D20S470, D12S391, D16S3253, D2S1371;D20S470, D12S391, D16S3253, D2S1371;
D3S2406, D19S253, D13S317, D2S1371;D3S2406, D19S253, D13S317, D2S1371;
D12S391, D13S317, D5S818, D2S1371;D12S391, D13S317, D5S818, D2S1371;
D20S470, D19S253, D13S317, D2S1371;D20S470, D19S253, D13S317, D2S1371;
D20S470, D12S391, D13S317, D2S1371;D20S470, D12S391, D13S317, D2S1371;
D4S2368, D12S391, D9S925, D2S1371;D4S2368, D12S391, D9S925, D2S1371;
D4S2368, D7S821, D9S925, D2S1371;D4S2368, D7S821, D9S925, D2S1371;
D20S470, D12S391, D9S925, D6S1043;D20S470, D12S391, D9S925, D6S1043;
D4S2368, D12S391, D9S925, D6S1043;D4S2368, D12S391, D9S925, D6S1043;
D4S2368, D19S253, D9S925, D6S1043;D4S2368, D19S253, D9S925, D6S1043;
D3S2406, D19S253, D9S925, D6S1043;D3S2406, D19S253, D9S925, D6S1043;
D4S2368, D7S821, D8S1477, D6S1043;D4S2368, D7S821, D8S1477, D6S1043;
D4S2368, D14S608, D16S3253, D6S1043;D4S2368, D14S608, D16S3253, D6S1043;
D4S2368, D7S821, D16S3253, D6S1043;D4S2368, D7S821, D16S3253, D6S1043;
D20S470, D12S391, D8S1477, D6S1043;D20S470, D12S391, D8S1477, D6S1043;
D4S2368, D12S391, D8S1477, D6S1043;D4S2368, D12S391, D8S1477, D6S1043;
D4S2368, D7S821, D13S317, D6S1043;D4S2368, D7S821, D13S317, D6S1043;
D4S2368, D19S253, D13S317, D6S1043;D4S2368, D19S253, D13S317, D6S1043;
D3S2406, D19S253, D13S317, D6S1043;D3S2406, D19S253, D13S317, D6S1043;
D3S2406, D14S608, D16S3253, D21S1437;D3S2406, D14S608, D16S3253, D21S1437;
D20S470, D14S608, D16S3253, D21S1437;D20S470, D14S608, D16S3253, D21S1437;
D4S2368, D14S608, D16S3253, D21S1437;D4S2368, D14S608, D16S3253, D21S1437;
D4S2368, D7S821, D16S3253, D21S1437;D4S2368, D7S821, D16S3253, D21S1437;
D20S470, D14S608, D8S1477, D21S1437;D20S470, D14S608, D8S1477, D21S1437;
D20S470, D12S391, D8S1477, D21S1437; 및D20S470, D12S391, D8S1477, D21S1437; And
D4S2368, D7S821, D9S925, D21S1437.D4S2368, D7S821, D9S925, D21S1437.
더욱 바람직하게는, 상기 콰드루플렉스 STR 시스템은 다음과 같은 4종의 유전자좌들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 유전자좌들의 조합으로 구성되는 것을 특징으로 한다:More preferably, the quadruplex STR system is composed of a combination of one locus selected from the group consisting of the following four loci combinations:
D5S818, D13S317, D19S253, D3S2406;D5S818, D13S317, D19S253, D3S2406;
D2S1371, D8S1477, D12S391, D20S470;D2S1371, D8S1477, D12S391, D20S470;
D6S1043, D9S925, D7S821, D4S2368;D6S1043, D9S925, D7S821, D4S2368;
D21S1437, D16S3253, D14S608, D18S1270.D21S1437, D16S3253, D14S608, D18S1270.
본 발명의 멀티플렉스 PCR 시스템은 증폭되는 각 유전자좌를 플랭킹하는 프라이머의 쌍을 이용하는데, 전술한 바와 같이 프라이머의 선정은 전기영동후 다른유전자좌의 대립유전자와의 중복을 방지하고, PCR 어닐링 온도의 편차가 크지 않도록 하기 위해 매우 중요하다. 본 발명의 멀티플렉스 PCR 시스템에서 사용되는 프라이머들의 각 쌍들은 다음과 같은 프라이머 서열들로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다:The multiplex PCR system of the present invention uses a pair of primers flanking each locus to be amplified. As described above, the selection of the primer prevents duplication with alleles of other gene loci after electrophoresis, and the PCR annealing temperature It is very important to ensure that the deviation is not large. Each pair of primers used in the multiplex PCR system of the present invention is preferably selected from the group consisting of the following primer sequences:
유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D5S818인 경우에는 서열 1 및 서열 2;When one locus of the combination of loci is D5S818, SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2;
유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D13S317인 경우에는 서열 3 및 서열 4;SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 when one locus of the combination of loci is D13S317;
유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D19S253인 경우에는 서열 5 및 서열 6;When one locus of the combination of loci is D19S253, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6;
유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D3S2406인 경우에는 서열 7 및 서열 8, 또는 서열 9 및 서열 10;When one locus of the combination of loci is D3S2406, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8, or SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10;
유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D2S1371인 경우에는 서열 11 및서열 12;When one locus of the combination of loci is D2S1371, SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12;
유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D8S1477인 경우에는 서열 13 및서열 14;If one locus of the combination of loci is D8S1477, SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14;
유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D12S391인 경우에는 서열 15 및서열 16;When one locus of the combination of loci is D12S391, SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16;
유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D20S470인 경우에는 서열 17 및서열 18;If one locus of the combination of loci is D20S470, SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18;
유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D6S1043인 경우에는 서열 19 및서열 20;When one locus of the combination of loci is D6S1043, SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20;
유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D9S925인 경우에는 서열 21 및 서열 22;When one locus of the combination of loci is D9S925, SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22;
유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D7S821인 경우에는 서열 23 및 서열 24;If one locus of the combination of loci is D7S821, SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24;
유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D4S2368인 경우에는 서열 25 및서열 26;If one locus of the combination of loci is D4S2368, SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26;
유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D21S1437인 경우에는 서열 27 및서열 28;When one locus of the combination of loci is D21S1437, SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28;
유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D16S3253인 경우에는 서열 29 및서열 30;When one locus of the combination of loci is D16S3253, SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 30;
유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D14S608인 경우에는 서열 31 및서열 32; 및When one locus of the combination of loci is D14S608, SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 32; And
유전자좌들의 조합 중의 하나의 유전자좌가 D18S1270인 경우에는 서열 33 및서열 34.SEQ ID NO: 33 and SEQ ID NO: 34 when one locus of the combination of loci is D18S1270.
한편, 본 발명의 다른 구체예는 하기와 같은 유전자좌들로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 3개 이상의 유전자좌들의 조합 및 선택된 유전자좌 각각에 해당되는 프라이머들을 가지는 용기를 포함하는, 한국인 집단에서 변별력을 지닌 유전자 감식키트에 관한 것이다:Meanwhile, another embodiment of the present invention includes a combination of at least three or more loci selected from the group consisting of the following loci, and a container having primers corresponding to each of the selected loci. It is about:
D5S818, D13S317, D19S253, D3S2406, D2S1371, D8S1477, D12S391, D20S470, D6S1043, D9S925, D7S821, D4S2368, D21S1437, D16S3253, D14S608 및 D18S1270.D5S818, D13S317, D19S253, D3S2406, D2S1371, D8S1477, D12S391, D20S470, D6S1043, D9S925, D7S821, D4S2368, D21S1437, D16S3253, D14S608 and D18S1270.
한편, 상기 유전자 감식키트의 적어도 3개 이상의 유전자좌들의 조합은 바람직하게는 콰드루플렉스 STR 시스템이며, 본 발명의 유전자 감식키트는 다음과 같은 4종의 유전자좌들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 유전자좌들의 조합을 갖는 것을 특징으로 한다:On the other hand, the combination of at least three or more loci of the gene identification kit is preferably a quadruplex STR system, the gene identification kit of the present invention is one or more loci selected from the group consisting of the following four loci combinations It is characterized by having a combination of:
D5S818, D13S317, D19S253, D3S2406;D5S818, D13S317, D19S253, D3S2406;
D2S1371, D8S1477, D12S391, D20S470;D2S1371, D8S1477, D12S391, D20S470;
D6S1043, D9S925, D7S821, D4S2368;D6S1043, D9S925, D7S821, D4S2368;
D21S1437, D16S3253 , D14S608, D18S1270;D21S1437, D16S3253, D14S608, D18S1270;
D3S2406, D19S253, D9S925, D5S818;D3S2406, D19S253, D9S925, D5S818;
D4S2368, D19253, D9S925, D5S818;D4S2368, D19253, D9S925, D5S818;
D4S2368, D7S821, D13S317, D5S818;D4S2368, D7S821, D13S317, D5S818;
D18S1270, D19S253, D13S317, D5S818;D18S1270, D19S253, D13S317, D5S818;
D4S2368, D19S253, D13S317, D5S818;D4S2368, D19S253, D13S317, D5S818;
D20S470, D19S253, D13S317, D5S818;D20S470, D19S253, D13S317, D5S818;
D3S2406, D12S391, D13S317, D5S818;D3S2406, D12S391, D13S317, D5S818;
D20S470, D12S391, D13S317, D5S818;D20S470, D12S391, D13S317, D5S818;
D3S2406, D12S391, D8S1477, D2S1371;D3S2406, D12S391, D8S1477, D2S1371;
D4S2368, D12S391, D8S1477, D2S1371;D4S2368, D12S391, D8S1477, D2S1371;
D3S2406, D19S253, D8S1477, D2S1371;D3S2406, D19S253, D8S1477, D2S1371;
D20S470, D14S608, D8S1477, D2S1371;D20S470, D14S608, D8S1477, D2S1371;
D20S470, D19S253, D8S1477, D2S1371;D20S470, D19S253, D8S1477, D2S1371;
D4S2368, D7S821, D8S1477, D2S1371;D4S2368, D7S821, D8S1477, D2S1371;
D20S470, D12S391, D9S925, D2S1371;D20S470, D12S391, D9S925, D2S1371;
D3S2406, D12S391, D13S317, D2S1371;D3S2406, D12S391, D13S317, D2S1371;
D20S470, D14S608, D16S3253, D2S1371;D20S470, D14S608, D16S3253, D2S1371;
D20S470, D12S391, D16S3253, D2S1371;D20S470, D12S391, D16S3253, D2S1371;
D3S2406, D19S253, D13S317, D2S1371;D3S2406, D19S253, D13S317, D2S1371;
D12S391, D13S317, D5S818, D2S1371;D12S391, D13S317, D5S818, D2S1371;
D20S470, D19S253,D13S317, D2S1371;D20S470, D19S253, D13S317, D2S1371;
D20S470, D12S391, D13S317, D2S1371;D20S470, D12S391, D13S317, D2S1371;
D4S2368, D12S391, D9S925, D2S1371;D4S2368, D12S391, D9S925, D2S1371;
D4S2368, D7S821, D9S925, D2S1371;D4S2368, D7S821, D9S925, D2S1371;
D20S470, D12S391, D9S925, D6S1043;D20S470, D12S391, D9S925, D6S1043;
D4S2368, D12S391, D9S925, D6S1043;D4S2368, D12S391, D9S925, D6S1043;
D4S2368, D19S253, D9S925, D6S1043;D4S2368, D19S253, D9S925, D6S1043;
D3S2406, D19S253, D9S925, D6S1043;D3S2406, D19S253, D9S925, D6S1043;
D4S2368, D7S821, D8S1477, D6S1043;D4S2368, D7S821, D8S1477, D6S1043;
D4S2368, D14S608, D16S3253, D6S1043;D4S2368, D14S608, D16S3253, D6S1043;
D4S2368, D7S821, D16S3253, D6S1043;D4S2368, D7S821, D16S3253, D6S1043;
D20S470, D12S391, D8S1477, D6S1043;D20S470, D12S391, D8S1477, D6S1043;
D4S2368, D12S391, D8S1477, D6S1043;D4S2368, D12S391, D8S1477, D6S1043;
D4S2368, D7S821, D13S317, D6S1043;D4S2368, D7S821, D13S317, D6S1043;
D4S2368, D19S253, D13S317, D6S1043;D4S2368, D19S253, D13S317, D6S1043;
D3S2406, D19S253, D13S317, D6S1043;D3S2406, D19S253, D13S317, D6S1043;
D3S2406, D14S608, D16S3253, D21S1437;D3S2406, D14S608, D16S3253, D21S1437;
D20S470, D14S608, D16S3253, D21S1437;D20S470, D14S608, D16S3253, D21S1437;
D4S2368, D14S608, D16S3253, D21S1437;D4S2368, D14S608, D16S3253, D21S1437;
D4S2368, D7S821, D16S3253, D21S1437;D4S2368, D7S821, D16S3253, D21S1437;
D20S470, D14S608, D8S1477, D21S1437;D20S470, D14S608, D8S1477, D21S1437;
D20S470, D12S391, D8S1477, D21S1437; 및D20S470, D12S391, D8S1477, D21S1437; And
D4S2368, D7S821, D9S925, D21S1437.D4S2368, D7S821, D9S925, D21S1437.
더욱 바람직하게는, 본 발명의 유전자 감식키트는 다음과 같은 4종의 유전자좌들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 유전자좌들의 조합을 갖는 것을특징으로 한다:More preferably, the gene identification kit of the present invention is characterized by having a combination of one locus selected from the group consisting of the following four combinations of loci:
D5S818, D13S317, D19S253, D3S2406;D5S818, D13S317, D19S253, D3S2406;
D2S1371, D8S1477, D12S391, D20S470;D2S1371, D8S1477, D12S391, D20S470;
D6S1043, D9S925, D7S821, D4S2368; 및D6S1043, D9S925, D7S821, D4S2368; And
D21S1437, D16S3253, D14S608, D18S1270.D21S1437, D16S3253, D14S608, D18S1270.
한편, 이하에서 설명되는 실시예들에서 사용되는 본 발명의 방법론적 기법들을 간략히 설명하면 다음과 같다.Meanwhile, the methodological techniques of the present invention used in the embodiments described below will be briefly described as follows.
가. 혈액으로부터 DNA 추출end. DNA extraction from blood
혈액성분 중 먼저 적혈구를 제거하기 위해서 적혈구 용해용액(1OmM Tris-Cl(pH 8.0), 1OmM NaCl, 5mM MgCl2)을 두 번 처리한 후, 남아 있는 세포에 백혈구 용해용액(1OmM Tris-Cl(pH 8.0), 1mM EDTA, 10OmM NaCl, 1% SDS, 프로테나제 K(200㎍/㎖)를 가하여 2시간 동안 56℃에 둔다. 그런 다음, 페놀/클로로포름/이소아밀알콜(25:24:1)을 처리하여 DNA를 추출한다. DNA는 100% 에틸알콜을 1.5배 넣어서 응축시킨 후 유리막대로 건져낸다. 건져낸 DNA는 잘 말린 후 증류수에 녹인 다음호퍼 형광미터 TKO 1O0(Hoefer fluorometer TKO 1OO)으로 정량한다.To remove red blood cells, red blood cell lysis solution (10mM Tris-Cl (pH 8.0), 10mM NaCl, 5mM MgCl 2 ) was treated twice and then leukocyte lysis solution (10mM Tris-Cl (pH) was added to the remaining cells. 8.0), 1 mM EDTA, 10 mM NaCl, 1% SDS, proteinase K (200 μg / ml) was added and placed at 56 ° C. for 2 hours, then phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25: 24: 1) DNA is extracted and condensed with 1.5 times 100% ethyl alcohol and dried with a glass rod. .
나. 프라이머I. primer
하기 실시예들에서 사용된 34개의 증폭 프라이머들은 한국 바이오니어사(Bioneer), 한국 제노텍(Genotech)사 또는 라이프 테크놀로지사(Life Technology)로부터 합성하여 사용하였다.The 34 amplification primers used in the following examples were synthesized from Bioeer Korea, Genotech Korea or Life Technology.
다. PCR 시약 및 장치All. PCR reagents and devices
또한, 본 발명의 PCR 반응에 사용된 Taq 폴리머라제는 퍼킨 엘머사(Perkin Elmer)에서 구입가능한 AmpliTaq, AmpliTaq Gold이며, dNTP는 파마시아 바이오텍사(Pharmacia Biotech) 또는 베링거만하임사(Boehringer Manheim)에서 구입한 것, 그리고 1O×완충용액은 퍼킨 엘머사에서 구입한 것을 사용하였으며, PCR 써멀 사이클러(PCR thermal cycler)는 퍼킨 엘머사의 Perkin Elmer 2400 또는 9600모델을 사용하였다.In addition, Taq polymerase used in the PCR reaction of the present invention is AmpliTaq, AmpliTaq Gold available from Perkin Elmer, dNTP is purchased from Pharmacia Biotech or Boehringer Manheim The 10 × buffer solution was purchased from Perkin Elmer, and PCR thermal cycler was used with Perkin Elmer 2400 or 9600 from Perkin Elmer.
라. 전기영동la. Electrophoresis
증폭된 산물들은 GIBCO-BRL 모델 SA32의 전기영동장치를 사용하여 50W로 크실렌 시아놀 염색약(Xylene Cyanol Dye)가 겔의 밑바닥에서 약 1Omm 내지 40mm 될 때까지 전기영동을 수행하였다. 겔은 5%T5%C, 7M 우레아 아크릴아미드 겔이며 런닝버퍼 및 겔버퍼는 TBE 버퍼를 사용하였다.The amplified products were subjected to electrophoresis using an electrophoresis device of GIBCO-BRL model SA32 until 50% of xylene cyanol dye was about 10-40 mm at the bottom of the gel. The gel was a 5% T5% C, 7M urea acrylamide gel and the running buffer and the gel buffer used TBE buffer.
마. 은염색hemp. Silver dyeing
전기영동이 끝난 겔은 은염색과정을 거쳐 보관하는데 우선 1%의 질산용액에 5분동안 산화시켰다. 그런 다음 증류수로 잘 수세한 후, O.012M 질산은(silver nitrate)에서 20분 동안 반응시키고 증류수로 다시 한번 세척하였다. 수세된 겔은 0.28M 무수 소디움 카르보네이트와 0.19% 포르말린 용액에서 환원시키면서 나타나는 밴드의 양상에 따라 10% 아세트산 용액으로 염색반응을 중지시켰다. 이렇게 염색된 겔은 3M 종이에 흡착시켜 겔 건조기에서 말린 후 보관한다.After electrophoresis, the gel was stored by silver dyeing process. First, it was oxidized in 1% nitric acid solution for 5 minutes. After washing well with distilled water, the reaction was carried out for 20 minutes in O.012M silver nitrate and washed once again with distilled water. The washed gel was stopped with 10% acetic acid solution according to the appearance of the band while reducing in 0.28M anhydrous sodium carbonate and 0.19% formalin solution. This dyed gel is adsorbed onto 3M paper, dried in a gel drier and stored.
바. 형광물질(fluorescent dye) 표지(labeling)를 이용한 검출bar. Detection using fluorescent dye labeling
형광물질이 표지된 프라이머는 PE 바이오시스템즈 (PE Biosystems)로부터 합성하여 사용하였다. 형광물질은 한 쌍의 증폭 프라이머 중 한 가지 서열에만 표지시켰으며 표지에 사용되는 형광물질은 하기 물질 중 적당한 것을 골라 표지하였다:Fluorescently labeled primers were synthesized from PE Biosystems and used. The fluorescent material was only labeled with one sequence of a pair of amplification primers, and the fluorescent material used for labeling was labeled with an appropriate one of the following materials:
TET ( 4,7,2' ,7' -Tetrachloro-6-carboxyfluorescein );TET (4,7,2 ', 7'-Tetrachloro-6-carboxyfluorescein);
6-FAM ( 6-carboxyfluorescein );6-FAM (6-carboxyfluorescein);
HEX (4,7,2' ,4' ,5' ,7'-Hexachloro-6-carboxylfluorescein);HEX (4,7,2 ', 4', 5 ', 7'-Hexachloro-6-carboxylfluorescein);
TAMRA ( N,N,N' ,N',-teramethyl-6-carboxyrhodamine );TAMRA (N, N, N ', N',-teramethyl-6-carboxyrhodamine);
ROX ( 6-carboxy-X-rhodamine);ROX (6-carboxy-X-rhodamine);
JOE ( 6-carboxy-2' ,7' -dimethoxy-4' ,5' -dichlorofluorescein );JOE (6-carboxy-2 ', 7'-dimethoxy-4', 5'-dichlorofluorescein);
5-FAM ( 5-carboxyfluorescein);5-FAM (5-carboxyfluorescein);
R110 ( 6-carboxyrhodamine); 및R110 (6-carboxyrhodamine); And
R6G ( N,N'-diethyl-2' ,7'-dimethyl-6-carboxyrhodamine).R6G (N, N'-diethyl-2 ', 7'-dimethyl-6-carboxyrhodamine).
형광물질이 표지된 프라이머를 이용하여 증폭된 각 유전자좌의 증폭산물들은 ABI PRISM 377 자동 DNA 시퀀서(PE Biosystems사 제품)를 이용하여 전기영동을 수행하고 대립유전자를 가시화하였다. 전기영동조건은 제조회사가 매뉴얼에 명시한 방법에 의거하였다. 가시화된 대립유전자들은 PE 바이오시스템즈사가 제공하는 유전자 스캔 분석(Gene Scan Analysis)이나 게노파입퍼(Genotyper) 소프트웨어로 분석하였다.The amplification products of each locus amplified using a fluorescently labeled primer were subjected to electrophoresis using an ABI PRISM 377 automated DNA sequencer (manufactured by PE Biosystems) to visualize alleles. The electrophoretic conditions were based on the method specified by the manufacturer in the manual. Visualized alleles were analyzed by Gene Scan Analysis or Genotyper software provided by PE Biosystems.
이하에서는 본 발명을 구현하고 있는 바람직한 실시예들 및 종래의 유전자 감식방법을 구현하고 있는 비교예를 통해 본 발명을 상세히 설명한다. 한편, 이하에서 설명되는 실시예들은 본 발명의 권리범위를 축소하거나 제한하고자 하는 것이아니며 본 발명의 특징을 보다 상세히 설명하기 위해 제시되는 것임을 밝혀둔다.Hereinafter, the present invention will be described in detail through preferred embodiments implementing the present invention and comparative examples implementing the conventional gene identification method. On the other hand, the embodiments described below are not intended to reduce or limit the scope of the present invention, it is to be noted that it is presented to explain the features of the present invention in more detail.
실시예 1Example 1
D6S1043, D9S925, D7S821, D4S2368 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출Multiplex PCR Amplification and Detection of Amplified Genotypes of D6S1043, D9S925, D7S821, and D4S2368 Loci
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10× PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 0.45μM D6S1043 프라이머(서열 19 및 서열 20), 0.30 μM D9S925 프라이머(서열 21 및 서열 22), 0.10μM D7S821 프라이머(서열 23 및 서열 24), O.0875 μM D4S2368 프라이머(서열 25 및 서열 26)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:Human genomic DNA used in this example was used to extract the blood of the donor from the Korean Red Cross blood source. The DNA sample is amplified in one reaction vessel. PCR amplification was performed with 2.0 μl of 10 × PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, 0.75 units of Taq polymerase, 1 to 10 ng DNA template and 0.45 μM D6S1043 primer (SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20), 0.30 μM D9S925 primer (SEQ ID NO: 21 and sequence). 22), a total volume of 20 μl reaction solution consisting of 0.10 μM D7S821 primer (SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24) and O.0875 μM D4S2368 primer (SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26). PCR cycles adopted the following amplification protocols:
95℃에서 3분간 예열;Preheat at 95 ° C. for 3 minutes;
94℃에서 30초, 61℃에서 20초, 72℃에서 30초로 31회 반복; 및31 repetitions of 30 seconds at 94 ° C, 20 seconds at 61 ° C, and 30 seconds at 72 ° C; And
72℃에서 5분간 최종 연장.Final extension for 5 minutes at 72 ° C.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.On the other hand, PCR reagents and devices were used as described above, electrophoresis was also performed in the manner described above. The band pattern as a result of electrophoresis was detected by silver dyeing.
최종 시험걸과는 도 1에 도시된 바와 같다.The final test girl is as shown in FIG.
실시예 2Example 2
D5S818, D13S317, D19S253, D3S2406 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출Multiplex PCR Amplification of D5S818, D13S317, D19S253, D3S2406 Locus and Detection of Amplified Genotypes
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10× PCR 완충용액(PE), O.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 0.1μM D5S818 프라이머(서열 1 및 서열 2), 0.1 μM D13S317 프라이머(서열 3 및 서열 4), O.05μM D19S253 프라이머(서열 5 및 서열 6), 0.25 μM D3S2406 프라이머(서열 7 및 서열 8 또는 서열 9 및 서열 10)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:Human genomic DNA used in this example was used to extract the blood of the donor from the Korean Red Cross blood source. The DNA sample is amplified in one reaction vessel. PCR amplification was performed with 2.0 μl of 10 × PCR buffer (PE), 0.2 mM dNTPs, 0.75 units of Taq polymerase, 1 to 10ng DNA template and 0.1 μM D5S818 primer (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2), 0.1 μM D13S317 primer ( SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4), O.05 μM D19S253 primers (SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6), 0.25 μM D3S2406 primers (SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10) in 20 μl total reaction solution. . PCR cycles adopted the following amplification protocols:
95℃에서 3분간 예열;Preheat at 95 ° C. for 3 minutes;
94℃에서 30초, 58℃에서 60초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및Repeat 28 times at 94 ° C. for 30 seconds, at 58 ° C. for 60 seconds, and at 72 ° C. for 30 seconds; And
72℃에서 5분간 최종 연장.Final extension for 5 minutes at 72 ° C.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 바와 같은 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.Meanwhile, PCR reagents and devices were used as described above, and electrophoresis was also performed in the same manner as described above. The band pattern as a result of electrophoresis was detected by silver dyeing.
최종 시험결과는 도 2에 도시된 바와 같다.The final test results are shown in FIG.
실시예 3Example 3
D2S1371, D8S1477, D12S391, D20S470 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출Multiplex PCR Amplification and Detection of Amplified Genotypes of D2S1371, D8S1477, D12S391, and D20S470 Loci
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액(PE), 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 0.25μM D2S1371 프라이머(서열 11 및 서열 12), 0.125μM D8S1477 프라이머(서열 13 및 서열 14), 0.15μM D12S391 프라이머(서열 15 및 서열 16), 0.125 μM D20S470 프라이머(서열 17 및 서열 18)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:Human genomic DNA used in this example was used to extract the blood of the donor from the Korean Red Cross blood source. The DNA sample is amplified in one reaction vessel. PCR amplification was performed with 2.0 μl of 10 × PCR buffer (PE), 0.2 mM dNTPs, 0.75 units of Taq polymerase, 1 to 10ng DNA template and 0.25 μM D2S1371 primer (SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12), 0.125 μM D8S1477 primer (SEQ ID NO: 2) 13 and SEQ ID NO: 14), 0.15 μΜ D12S391 primers (SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16), and 0.125 μΜ D20S470 primer (SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18) in 20 μl total reaction solution. PCR cycles adopted the following amplification protocols:
95℃에서 3분간 예열;Preheat at 95 ° C. for 3 minutes;
94℃에서 30초, 61℃에서 30초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및Repeat 28 times at 94 ° C for 30 seconds, at 61 ° C for 30 seconds, and at 72 ° C for 30 seconds; And
60℃에서 45분간 최종 연장.Final extension for 45 minutes at 60 ° C.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동역시 전술한 바와 같은 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.Meanwhile, PCR reagents and devices were used as described above, and electrophoresis was performed according to the same manner as described above. The band pattern as a result of electrophoresis was detected by silver dyeing.
최종 시험결과는 도 3에 도시된 바와 같다.The final test results are shown in FIG.
실시예 4Example 4
D21S1437, D16S3253, D14S608, D18S1270 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출Multiplex PCR Amplification of D21S1437, D16S3253, D14S608, and D18S1270 Locus and Detection of Amplified Genotypes
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, O.2mM dNTPs, 1 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 2.15μM D18S1270 프라이머(서열 33 및 서열 34), 0.3μM D14S608 프라이머(서열 31 및 서열 32), O.5μM D16S3253 프라이머(서열 29 및 서열 30), 0.25 μM D21S1437 프라이머(서열 27 및 서열 28)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:Human genomic DNA used in this example was used to extract the blood of the donor from the Korean Red Cross blood source. The DNA sample is amplified in one reaction vessel. PCR amplification was performed with 2.0 μl of 10 × PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, 1 unit of Taq polymerase, 1 to 10ng DNA template and 2.15 μM D18S1270 primer (SEQ ID NO: 33 and SEQ ID NO: 34), 0.3 μM D14S608 primer (SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 32), 0.5 μM D16S3253 primers (SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 30), and 0.25 μM D21S1437 primers (SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28) in a total volume of 20 μl. PCR cycles adopted the following amplification protocols:
94℃에서 1분, 55℃에서 1분 10초, 그리고 72℃에서 10초씩을 30회 반복; 및30 repetitions of 1 minute at 94 ° C, 1 minute 10 seconds at 55 ° C, and 10 seconds at 72 ° C; And
72℃에서 7분간 최종 연장.Final extension for 7 minutes at 72 ° C.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 바와 같은 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.Meanwhile, PCR reagents and devices were used as described above, and electrophoresis was also performed in the same manner as described above. The band pattern as a result of electrophoresis was detected by silver dyeing.
최종 시험결과는 도 4에 도시된 바와 같다.The final test results are shown in FIG.
실시예 5Example 5
D3S2406, D19S253, D9S925, D5S818유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출Multiplex PCR Amplification and Detection of Amplified Genotypes of D3S2406, D19S253, D9S925, and D5S818 Gene Loci
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 0.25 μM D3S2406 프라이머(서열 7 및 서열 8 또는 서열 9 및 서열10), 0.05 μM D19S253 프라이머(서열 5 및 서열 6), 0.25 μM D9S925 프라이머(서열 21 및 서열 22), 0.1 μM D5S818 프라이머(서열 1 및 서열 2)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:Human genomic DNA used in this example was used to extract the blood of the donor from the Korean Red Cross blood source. The DNA sample is amplified in one reaction vessel. PCR amplification was performed with 2.0 μl of 10 × PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, 0.75 units of Taq polymerase, 1 to 10ng DNA template and 0.25 μM D3S2406 primer (SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10), 0.05 μM D19S253 It was performed in a reaction solution having a total volume of 20 μl consisting of a primer (SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6), 0.25 μM D9S925 primer (SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22), and 0.1 μM D5S818 primer (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2). PCR cycles adopted the following amplification protocols:
95℃에서 3분간 예열;Preheat at 95 ° C. for 3 minutes;
94℃에서 30초, 59℃에서 60초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및Repeat 28 times at 94 ° C. for 30 seconds, at 59 ° C. for 60 seconds, and at 72 ° C. for 30 seconds; And
72℃에서 5분간 최종 연장.Final extension for 5 minutes at 72 ° C.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.On the other hand, PCR reagents and devices were used as described above, electrophoresis was also performed in the manner described above. The band pattern as a result of electrophoresis was detected by silver dyeing.
최종 시험결과는 도 5에 도시된 바와 같다.The final test results are shown in FIG.
실시예 6Example 6
D4S2368, D19253, D9S925, D5S818 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출Multiplex PCR Amplification and Detection of Amplified Genotypes of D4S2368, D19253, D9S925, and D5S818 Loci
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 O.0875 μM D4S2368 프라이머(서열 25 및 서열 26), 0.075μM D19253 프라이머(서열 5 및 서열 6), 0.3μM D9S925 프라이머(서열 21 및 서열 22), 0.15 μM D5S818 프라이머(서열 1 및 서열 2)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로트콜을 채택하였다:Human genomic DNA used in this example was used to extract the blood of the donor from the Korean Red Cross blood source. The DNA sample is amplified in one reaction vessel. PCR amplification was performed with 2.0 μl of 10 × PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, 0.75 units of Taq polymerase, 1 to 10ng DNA template and 0.1875 μM D4S2368 primer (SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26), 0.075 μM D19253 primer (SEQ ID NO: 5). And SEQ ID NO: 6), 0.3 μΜ D9S925 primers (SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22), and 0.15 μΜ D5S818 primers (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2) in 20 μl total reaction solution. PCR cycles adopted the following amplification protocols:
95℃에서 3분간 예열;Preheat at 95 ° C. for 3 minutes;
94℃에서 30초, 60℃에서 60초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및Repeat 28 times at 94 ° C. for 30 seconds, at 60 ° C. for 60 seconds, and at 72 ° C. for 30 seconds; And
72℃에서 5분간 최종 연장.Final extension for 5 minutes at 72 ° C.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해검출하였다.On the other hand, PCR reagents and devices were used as described above, and electrophoresis was performed according to the above-described manner. The band pattern as a result of electrophoresis was detected by silver dyeing.
최종 시험결과는 도 6에 도시된 바와 같다.The final test results are shown in FIG.
실시예 7Example 7
D4S2368, D7S821, D13S317, D5S818 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출Multiplex PCR Amplification of D4S2368, D7S821, D13S317, and D5S818 Loci and Detection of Amplified Genotypes
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10× PCR 완충용액, O.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 0.0875μM D4S2368 프라이머(서열 25 및서열 26), O.1μM D7S821 프라이머(서열 23 및 서열 24), 0.15 μM D13S317 프라이머(서열 3 및 서열 4), 0.15μM D5S818 프라이머(서열 1 및 서열 2)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:Human genomic DNA used in this example was used to extract the blood of the donor from the Korean Red Cross blood source. The DNA sample is amplified in one reaction vessel. PCR amplification was performed with 2.0 μl of 10 × PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, 0.75 units of Taq polymerase, 1 to 10ng DNA template and 0.0875 μM D4S2368 primer (SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26), 0.1 μM D7S821 primer (SEQ ID NO: 23). And SEQ ID NO: 24), 0.15 μΜ D13S317 primers (SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4), 0.15 μΜ D5S818 primer (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2) in a reaction solution of 20 μl total volume. PCR cycles adopted the following amplification protocols:
95℃에서 3분간 예열;Preheat at 95 ° C. for 3 minutes;
94℃에서 30초, 60℃에서 60초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및Repeat 28 times at 94 ° C. for 30 seconds, at 60 ° C. for 60 seconds, and at 72 ° C. for 30 seconds; And
72℃에서 5분간 최종 연장.Final extension for 5 minutes at 72 ° C.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해검출하였다.On the other hand, PCR reagents and devices were used as described above, and electrophoresis was performed according to the above-described manner. The band pattern as a result of electrophoresis was detected by silver dyeing.
최종 시험결과는 도 7에 도시된 바와 같다.The final test results are shown in FIG.
실시예 8Example 8
D18S1270, D19S253, D13S317, D5S818 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출Multiplex PCR Amplification of D18S1270, D19S253, D13S317, and D5S818 Loci and Detection of Amplified Genotypes
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 2.15μM D18S1270 프라이머(서열 33 및 서열 34), 0.05μM D19S253 프라이머(서열 5 및 서열 6), 0.1μM D13S317 프라이머(서열 3 및 서열 4), 0.1μM D5S818 프라이머(서열 1 및 서열 2)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로트콜을 채택하였다:Human genomic DNA used in this example was used to extract the blood of the donor from the Korean Red Cross blood source. The DNA sample is amplified in one reaction vessel. PCR amplification was performed with 2.0 μl of 10 × PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, 0.75 units of Taq polymerase, 1 to 10ng DNA template and 2.15 μM D18S1270 primer (SEQ ID NO: 33 and SEQ ID NO: 34), 0.05 μM D19S253 primer (SEQ ID NO: 5 and Sequence) 6), 0.1 μM D13S317 primers (SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4), 0.1 μM D5S818 primers (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2) was performed in a reaction solution having a total volume of 20 μL. PCR cycles adopted the following amplification protocols:
95℃에서 3분간 예열;Preheat at 95 ° C. for 3 minutes;
94℃에서 30초, 58℃에서 60초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및Repeat 28 times at 94 ° C. for 30 seconds, at 58 ° C. for 60 seconds, and at 72 ° C. for 30 seconds; And
72℃에서 5분간 최종 연장.Final extension for 5 minutes at 72 ° C.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.On the other hand, PCR reagents and devices were used as described above, electrophoresis was also performed in the manner described above. The band pattern as a result of electrophoresis was detected by silver dyeing.
최종 시험결과는 도 8에 도시된 바와 같다.The final test result is as shown in FIG.
실시예 9Example 9
D4S2368, D19S253, D13S317, D5S818 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출Multiplex PCR Amplification of D4S2368, D19S253, D13S317, and D5S818 Loci and Detection of Amplified Genotypes
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 0.0875μM D4S2368 프라이머(서열 25 및 서열 26), 0.05μM D19S253 프라이머(서열 5 및 서열 6), 0.1μM D13S317 프라이머(서열 3 및 서열 4), 0.1μM D5S818 프라이머(서열 1 및 서열 2)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:Human genomic DNA used in this example was used to extract the blood of the donor from the Korean Red Cross blood source. The DNA sample is amplified in one reaction vessel. PCR amplification was performed with 2.0 μl of 10 × PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, 0.75 units of Taq polymerase, 1 to 10ng DNA template and 0.0875 μM D4S2368 primer (SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26), 0.05 μM D19S253 primer (SEQ ID NO: 5 and sequence) 6), 0.1 μM D13S317 primers (SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4), 0.1 μM D5S818 primers (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2) was performed in a reaction solution having a total volume of 20 μL. PCR cycles adopted the following amplification protocols:
95℃에서 3분간 예열;Preheat at 95 ° C. for 3 minutes;
94℃에서 30초, 59℃에서 60초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및Repeat 28 times at 94 ° C. for 30 seconds, at 59 ° C. for 60 seconds, and at 72 ° C. for 30 seconds; And
72℃에서 5분간 최종 연장.Final extension for 5 minutes at 72 ° C.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해검출하였다.On the other hand, PCR reagents and devices were used as described above, and electrophoresis was performed according to the above-described manner. The band pattern as a result of electrophoresis was detected by silver dyeing.
최종 시험결과는 도 9에 도시된 바와 같다.The final test results are shown in FIG.
실시예 10Example 10
D20S470, D19S253, D13S317, D5S818 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출Multiplex PCR Amplification of D20S470, D19S253, D13S317, and D5S818 Loci and Detection of Amplified Genotypes
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 10ng DNA 주형 및 0.1μM D20S470 프라이머(서열 17 및 서열 18), 0.05μM D19S253 프라이머(서열 5 및 서열 6), 0.1μM D13S317 프라이머(서열 3 및 서열 4), 0.1μM D5S818 프라이머(서열 1 및 서열 2)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:Human genomic DNA used in this example was used to extract the blood of the donor from the Korean Red Cross blood source. The DNA sample is amplified in one reaction vessel. PCR amplification was performed with 2.0 μl of 10 × PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, 0.75 units of Taq polymerase, 1-10 ng DNA template and 0.1 μM D20S470 primer (SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18), 0.05 μM D19S253 primer (SEQ ID NO: 5 and sequence). 6), 0.1 μM D13S317 primers (SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4), 0.1 μM D5S818 primers (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2) was performed in a reaction solution having a total volume of 20 μL. PCR cycles adopted the following amplification protocols:
95℃에서 3분간 예열;Preheat at 95 ° C. for 3 minutes;
94℃에서 30초, 59℃에서 60초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및Repeat 28 times at 94 ° C. for 30 seconds, at 59 ° C. for 60 seconds, and at 72 ° C. for 30 seconds; And
72℃에서 5분간 최종 연장.Final extension for 5 minutes at 72 ° C.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해검출하였다.On the other hand, PCR reagents and devices were used as described above, and electrophoresis was performed according to the above-described manner. The band pattern as a result of electrophoresis was detected by silver dyeing.
최종 시험결과는 도 1O에 도시된 바와 같다.The final test results are shown in FIG.
실시예 11Example 11
D3S2406, D12S391, D13S317, D5S818 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출Multiplex PCR Amplification of D3S2406, D12S391, D13S317, and D5S818 Loci and Detection of Amplified Genotypes
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, O.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 10ng DNA 주형 및 0.25μM D3S2406 프라이머(서열 7 및 서열 8 또는 서열 9 및 서열 10), 0.125μM D12S391 프라이머(서열 15 및 서열 16), 0.1μM D13S317 프라이머(서열 3 및 서열 4), 0.1μM D5S818 프라이머(서열 1 및 서열 2)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:Human genomic DNA used in this example was used to extract the blood of the donor from the Korean Red Cross blood source. The DNA sample is amplified in one reaction vessel. PCR amplification was performed with 2.0 μl of 10 × PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, 0.25 Taq polymerase, 1-10 ng DNA template and 0.25 μM D3S2406 primer (SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10), 0.125 A total volume of 20 μl reaction solution consisting of μM D12S391 primer (SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16), 0.1 μM D13S317 primer (SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4), and 0.1 μM D5S818 primer (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2). PCR cycles adopted the following amplification protocols:
95℃에서 3분간 예열;Preheat at 95 ° C. for 3 minutes;
94℃에서 30초, 59℃에서 60초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및Repeat 28 times at 94 ° C. for 30 seconds, at 59 ° C. for 60 seconds, and at 72 ° C. for 30 seconds; And
72℃에서 5분간 최종 연장.Final extension for 5 minutes at 72 ° C.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.On the other hand, PCR reagents and devices were used as described above, electrophoresis was also performed in the manner described above. The band pattern as a result of electrophoresis was detected by silver dyeing.
최종 시험결과는 도 11에 도시된 바와 같다.The final test results are shown in FIG.
실시예 12Example 12
D20S470, D12S391, D13S317, D5S818 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출Multiplex PCR Amplification of D20S470, D12S391, D13S317, and D5S818 Loci and Detection of Amplified Genotypes
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 0.1μM D20S470 프라이머(서열 17 및 서열 18), O.125μM D12S391 프라이머(서열 15 및 서열 16), 0.1μM D13S317 프라이머(서열 3 및 서열 4), O.1μM D5S818 프라이머(서열 1 및 서열 2)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:Human genomic DNA used in this example was used to extract the blood of the donor from the Korean Red Cross blood source. The DNA sample is amplified in one reaction vessel. PCR amplification was performed with 2.0 μl of 10 × PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, 0.75 units of Taq polymerase, 1 to 10 ng DNA template and 0.1 μM D20S470 primer (SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18), O.125 μM D12S391 primer (SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16), 0.1 μΜ D13S317 primer (SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4), 0.1 μΜ D5S818 primer (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2) was performed in a reaction solution of 20 μl total volume. PCR cycles adopted the following amplification protocols:
95℃에서 3분간 예열;Preheat at 95 ° C. for 3 minutes;
94℃에서 30초, 59℃에서 60초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및Repeat 28 times at 94 ° C. for 30 seconds, at 59 ° C. for 60 seconds, and at 72 ° C. for 30 seconds; And
72℃에서 5분간 최종 연장.Final extension for 5 minutes at 72 ° C.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.On the other hand, PCR reagents and devices were used as described above, electrophoresis was also performed in the manner described above. The band pattern as a result of electrophoresis was detected by silver dyeing.
최종 시험결과는 도 12에 도시된 바와 같다.The final test result is as shown in FIG.
실시예 13Example 13
D3S2406, D12S391, D8S1477, D2S1371 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출Multiplex PCR Amplification of D3S2406, D12S391, D8S1477, and D2S1371 Loci and Detection of Amplified Genotypes
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 10ng DNA 주형 및 0.3μM D3S2406 프라이머(서열 7 및 서열 8 또는 서열 9 및 서열 10), 0.15μM D12S391 프라이머(서열 15 및 서열 16), 0.125μM D8S1477 프라이머(서열 13 및 서열 14), 0.25μM D2S1371 프라이머(서열 11 및 서열 12)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로트콜을 채택하였다:Human genomic DNA used in this example was used to extract the blood of the donor from the Korean Red Cross blood source. The DNA sample is amplified in one reaction vessel. PCR amplification was performed with 2.0 μl of 10 × PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, 0.75 units of Taq polymerase, 1-10 ng DNA template and 0.3 μM D3S2406 primer (SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10), 0.15 μM D12S391 It was performed in a reaction solution having a total volume of 20 μl consisting of a primer (SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16), 0.125 μM D8S1477 primer (SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14), and 0.25 μM D2S1371 primer (SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12). PCR cycles adopted the following amplification protocols:
95℃에서 3분간 예열;Preheat at 95 ° C. for 3 minutes;
94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및Repeat 28 times at 94 ° C. for 30 seconds, at 60 ° C. for 30 seconds, and at 72 ° C. for 30 seconds; And
60℃에서 45분간 최종 연장.Final extension for 45 minutes at 60 ° C.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해검출하였다.On the other hand, PCR reagents and devices were used as described above, electrophoresis was also performed in the manner described above. The band pattern as a result of electrophoresis was detected by silver dyeing.
최종 시험결과는 도 13에 도시된 바와 같다.The final test results are shown in FIG.
실시예 14Example 14
D4S2368, D12S391, D8S1477, D2S1371 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출Multiplex PCR Amplification of D4S2368, D12S391, D8S1477, and D2S1371 Locus and Detection of Amplified Genotypes
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 10ng DNA 주형 및 0.0875μM D4S2368 프라이머(서열 25 및 서열 26), 0.15μM D12S391 프라이머(서열 15 및 서열 16), O.125μM D8S1477 프라이머(서열 13 및 서열 14), 0.25μM D2S1371 프라이머(서열 11 및 서열 12)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:Human genomic DNA used in this example was used to extract the blood of the donor from the Korean Red Cross blood source. The DNA sample is amplified in one reaction vessel. PCR amplification was performed with 2.0 μl of 10 × PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, 0.75 units of Taq polymerase, 1-10 ng DNA template and 0.0875 μM D4S2368 primer (SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26), 0.15 μM D12S391 primer (SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16), a total volume of 20 μl reaction solution consisting of O.125 μM D8S1477 primer (SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14) and 0.25 μM D2S1371 primer (SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12). PCR cycles adopted the following amplification protocols:
95℃에서 3분간 예열;Preheat at 95 ° C. for 3 minutes;
94℃에서 30초, 61℃에서 30초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및Repeat 28 times at 94 ° C for 30 seconds, at 61 ° C for 30 seconds, and at 72 ° C for 30 seconds; And
60℃에서 45분간 최종 연장.Final extension for 45 minutes at 60 ° C.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.On the other hand, PCR reagents and devices were used as described above, electrophoresis was also performed in the manner described above. The band pattern as a result of electrophoresis was detected by silver dyeing.
최종 시험결과는 도 14에 도시된 바와 같다.The final test result is as shown in FIG.
실시예 15Example 15
D3S2406, D19S253, D8S1477, D2S1371 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출Multiplex PCR Amplification of D3S2406, D19S253, D8S1477, D2S1371 Locus and Detection of Amplified Genotypes
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 10ng DNA 주형 및 0.3μM D3S2406 프라이머(서열 7 및 서열 8 또는 서열 9 및 서열 10), 0.075μM D19S253 프라이머(서열 5 및 서열 6), 0.125μM D8S1477 프라이머(서열 13 및 서열 14), 0.25μM D2S1371 프라이머(서열 11 및 서열 12)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:Human genomic DNA used in this example was used to extract the blood of the donor from the Korean Red Cross blood source. The DNA sample is amplified in one reaction vessel. PCR amplification was performed with 2.0 μl of 10 × PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, 0.75 units of Taq polymerase, 1-10 ng DNA template and 0.3 μM D3S2406 primer (SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10), 0.075 μΜ D19S253 A total volume of 20 μl of reaction solution consisting of primers (SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6), 0.125 μM D8S1477 primer (SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14), and 0.25 μM D2S1371 primer (SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12). PCR cycles adopted the following amplification protocols:
95℃에서 3분간 예열;Preheat at 95 ° C. for 3 minutes;
94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및Repeat 28 times at 94 ° C. for 30 seconds, at 60 ° C. for 30 seconds, and at 72 ° C. for 30 seconds; And
60℃에서 45분간 최종 연장.Final extension for 45 minutes at 60 ° C.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.On the other hand, PCR reagents and devices were used as described above, electrophoresis was also performed in the manner described above. The band pattern as a result of electrophoresis was detected by silver dyeing.
최종 시험결과는 도 15에 도시된 바와 같다.The final test result is as shown in FIG.
실시예 16Example 16
D20S470, D14S608, D8S1477, D2S1371 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출Multiplex PCR Amplification and Detection of Amplified Genotypes of D20S470, D14S608, D8S1477, and D2S1371 Loci
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, O.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 10ng DNA 주형 및 0.1μM D20S470 프라이머(서열 17 및 서열 18), 0.5μM D14S608 프라이머(서열 31 및 서열 32), 0.125μM D8S1477 프라이머(서열 13 및 서열 14), 0.2μM D2S1371 프라이머(서열 11 및 서열 12)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:Human genomic DNA used in this example was used to extract the blood of the donor from the Korean Red Cross blood source. The DNA sample is amplified in one reaction vessel. PCR amplification was performed with 2.0 μl of 10 × PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, Taq polymerase of O.75 units, 1-10 ng DNA template and 0.1 μM D20S470 primer (SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18), 0.5 μM D14S608 primer (SEQ ID NO: 31 And a total volume of 20 μl consisting of SEQ ID NO: 32), 0.125 μM D8S1477 primers (SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14), and 0.2 μM D2S1371 primers (SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12). PCR cycles adopted the following amplification protocols:
95℃에서 3분간 예열;Preheat at 95 ° C. for 3 minutes;
94℃에서 30초, 59℃에서 30초, 72℃에서 30초로 30회 반복; 및30 repetitions of 30 seconds at 94 ° C, 30 seconds at 59 ° C, and 30 seconds at 72 ° C; And
60℃에서 45분간 최종 연장.Final extension for 45 minutes at 60 ° C.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해검출하였다.On the other hand, PCR reagents and devices were used as described above, electrophoresis was also performed in the manner described above. The band pattern as a result of electrophoresis was detected by silver dyeing.
최종 시험결과는 도 16에 도시된 바와 같다.The final test result is as shown in FIG.
실시예 17Example 17
D20S470, D19S253, D8S1477, D2S1371 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출Multiplex PCR Amplification of D20S470, D19S253, D8S1477, D2S1371 Locus and Detection of Amplified Genotypes
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 10ng DNA 주형 및 0.125μM D20S470 프라이머(서열 17 및 서열 18), O.075μM D19S253 프라이머(서열 5 및 서열 6), 0.125μM D8S1477 프라이머(서열 13 및 서열 14), 0.25μM D2S1371 프라이머(서열 11 및 서열 12)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:Human genomic DNA used in this example was used to extract the blood of the donor from the Korean Red Cross blood source. The DNA sample is amplified in one reaction vessel. PCR amplification was performed with 2.0 μl of 10 × PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, 0.75 units of Taq polymerase, 1-10 ng DNA template and 0.125 μM D20S470 primer (SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18), 0.15 μM D19S253 primer (SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6), 0.125 μΜ D8S1477 primer (SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14), 0.25 μΜ D2S1371 primer (SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12) in a total solution of 20 μL. PCR cycles adopted the following amplification protocols:
95℃에서 3분간 예열;Preheat at 95 ° C. for 3 minutes;
94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및Repeat 28 times at 94 ° C. for 30 seconds, at 60 ° C. for 30 seconds, and at 72 ° C. for 30 seconds; And
60℃에서 45분간 최종 연장.Final extension for 45 minutes at 60 ° C.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해검출하였다.On the other hand, PCR reagents and devices were used as described above, electrophoresis was also performed in the manner described above. The band pattern as a result of electrophoresis was detected by silver dyeing.
최종 시험결과는 도 17에 도시된 바와 같다.The final test result is as shown in FIG.
실시예 18Example 18
D4S2368, D7S821, D8S1477, D2S1371 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출Multiplex PCR Amplification of D4S2368, D7S821, D8S1477, and D2S1371 Locus and Detection of Amplified Genotypes
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 10ng DNA 주형 및 0.0875μM D4S2368 프라이머(서열 25 및 서열 26), 0.1μM D7S821 프라이머(서열 23 및 서열 24), 0.125μM D8S1477 프라이머(서열 13 및 서열 14), 0.25μM D2S1371 프라이머(서열 11 및 서열 12)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:Human genomic DNA used in this example was used to extract the blood of the donor from the Korean Red Cross blood source. The DNA sample is amplified in one reaction vessel. PCR amplification was performed with 2.0 μl of 10 × PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, 0.75 units of Taq polymerase, 1-10 ng DNA template and 0.0875 μM D4S2368 primer (SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26), 0.1 μM D7S821 primer (SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 23). 24), in a reaction solution having a total volume of 20 μl consisting of 0.125 μM D8S1477 primer (SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14) and 0.25 μM D2S1371 primer (SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12). PCR cycles adopted the following amplification protocols:
95℃에서 3분간 예열;Preheat at 95 ° C. for 3 minutes;
94℃에서 30초, 61℃에서 30초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및Repeat 28 times at 94 ° C for 30 seconds, at 61 ° C for 30 seconds, and at 72 ° C for 30 seconds; And
60℃에서 45분간 최종 연장.Final extension for 45 minutes at 60 ° C.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.On the other hand, PCR reagents and devices were used as described above, electrophoresis was also performed in the manner described above. The band pattern as a result of electrophoresis was detected by silver dyeing.
최종 시험결과는 도 18에 도시된 바와 같다.The final test result is as shown in FIG.
실시예 19Example 19
D20S470, D12S391, D9S925, D2S1371 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출Multiplex PCR Amplification of D20S470, D12S391, D9S925, and D2S1371 Locus and Detection of Amplified Genotypes
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 10ng DNA 주형 및 0.125μM D20S470 프라이머(서열 17 및 서열 18), 0.15μM D12S391 프라이머(서열 15 및 서열 16), 0.3μM D9S925 프라이머(서열 21 및 서열 22), 0.25μM D2S1371 프라이머(서열 11 및 서열 12)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:Human genomic DNA used in this example was used to extract the blood of the donor from the Korean Red Cross blood source. The DNA sample is amplified in one reaction vessel. PCR amplification was performed with 2.0 μl of 10 × PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, 0.75 units of Taq polymerase, 1-10 ng DNA template and 0.125 μM D20S470 primer (SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18), 0.15 μM D12S391 primer (SEQ ID NO: 15 and sequence) 16), a total volume of 20 μl of 0.3 μM D9S925 primer (SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22) and 0.25 μM D2S1371 primer (SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12) was performed. PCR cycles adopted the following amplification protocols:
95℃에서 3분간 예열;Preheat at 95 ° C. for 3 minutes;
94℃에서 30초, 61℃에서 30초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및Repeat 28 times at 94 ° C for 30 seconds, at 61 ° C for 30 seconds, and at 72 ° C for 30 seconds; And
60℃에서 45분간 최종 연장.Final extension for 45 minutes at 60 ° C.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해검출하였다.On the other hand, PCR reagents and devices were used as described above, electrophoresis was also performed in the manner described above. The band pattern as a result of electrophoresis was detected by silver dyeing.
최종 시험결과는 도 19에 도시된 바와 같다.The final test result is as shown in FIG.
실시예 20Example 20
D3S2406, D12S391, D13S317, D2S1371 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출Multiplex PCR Amplification of D3S2406, D12S391, D13S317, and D2S1371 Locus and Detection of Amplified Genotypes
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 10ng DNA 주형 및 0.25μM D3S2406 프라이머(서열 7 및 서열 8 또는 서열 9 및 서열 10), O.125μM D12S391 프라이머(서열 15 및 서열 16), 0.1μM D13S317 프라이머(서열 3 및 서열 4), 0.2μM D2S1371 프라이머(서열 11 및 서열 12)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:Human genomic DNA used in this example was used to extract the blood of the donor from the Korean Red Cross blood source. The DNA sample is amplified in one reaction vessel. PCR amplification was performed with 2.0 μl of 10 × PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, 0.75 units of Taq polymerase, 1-10 ng DNA template and 0.25 μM D3S2406 primer (SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10), O.125 μM A total volume of 20 μl reaction solution consisting of D12S391 primer (SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16), 0.1 μM D13S317 primer (SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4), and 0.2 μM D2S1371 primer (SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12). PCR cycles adopted the following amplification protocols:
95℃에서 3분간 예열;Preheat at 95 ° C. for 3 minutes;
94℃에서 30초, 59℃에서 60초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및Repeat 28 times at 94 ° C. for 30 seconds, at 59 ° C. for 60 seconds, and at 72 ° C. for 30 seconds; And
60℃에서 45분간 최종 연장.Final extension for 45 minutes at 60 ° C.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해검출하였다.On the other hand, PCR reagents and devices were used as described above, and electrophoresis was performed according to the above-described manner. The band pattern as a result of electrophoresis was detected by silver dyeing.
최종 시험결과는 도 2O에 도시된 바와 같다.The final test results are shown in FIG.
실시예 21Example 21
D20S470, D14S608, D16S3253, D2S1371 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출Multiplex PCR Amplification of D20S470, D14S608, D16S3253, and D2S1371 Locus and Detection of Amplified Genotypes
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 O.1μM D20S470 프라이머(서열 17 및 서열 18), 0.5μM D14S608 프라이머(서열 31 및 서열 32), O.75μM D16S3253 프라이머(서열 29 및 서열 30), 0.2μM D2S1371 프라이머(서열 11 및 서열 12)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:Human genomic DNA used in this example was used to extract the blood of the donor from the Korean Red Cross blood source. The DNA sample is amplified in one reaction vessel. PCR amplification was performed with 2.0 μl of 10 × PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, 0.75 units of Taq polymerase, 1 to 10ng DNA template and 0.1 μM D20S470 primer (SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18), 0.5 μM D14S608 primer (SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 32), O.75 μΜ D16S3253 primers (SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 30), and 0.2 μΜ D2S1371 primers (SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12) in a total volume of 20 μl reaction solution. PCR cycles adopted the following amplification protocols:
95℃에서 3분간 예열;Preheat at 95 ° C. for 3 minutes;
94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및Repeat 28 times at 94 ° C. for 30 seconds, at 58 ° C. for 30 seconds, and at 72 ° C. for 30 seconds; And
60℃에서 45분간 최종 연장.Final extension for 45 minutes at 60 ° C.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해검출하였다.On the other hand, PCR reagents and devices were used as described above, electrophoresis was also performed in the manner described above. The band pattern as a result of electrophoresis was detected by silver dyeing.
최종 시험결과는 도 21에 도시된 바와 같다.The final test result is as shown in FIG.
실시예 22Example 22
D20S470, D12S391, D16S3253, D2S1371 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출Multiplex PCR Amplification of D20S470, D12S391, D16S3253, and D2S1371 Locus and Detection of Amplified Genotypes
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 0.1μM D20S470 프라이머(서열 17 및 서열 18), 0.125μM D12S391 프라이머(서열 15 및 서열 16), 0.75μM D16S3253 프라이머(서열 29 및 서열 30), 0.2μM D2S1371 프라이머(서열 11 및 서열 12)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:Human genomic DNA used in this example was used to extract the blood of the donor from the Korean Red Cross blood source. The DNA sample is amplified in one reaction vessel. PCR amplification was performed with 2.0 μl of 10 × PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, 0.75 units of Taq polymerase, 1 to 10ng DNA template and 0.1 μM D20S470 primer (SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18), 0.125 μM D12S391 primer (SEQ ID NO: 15 and sequence) 16), a total volume of 20 μl of a 0.75 μM D16S3253 primer (SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 30) and 0.2 μM D2S1371 primer (SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12) was performed. PCR cycles adopted the following amplification protocols:
95℃에서 3분간 예열;Preheat at 95 ° C. for 3 minutes;
94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및Repeat 28 times at 94 ° C. for 30 seconds, at 58 ° C. for 30 seconds, and at 72 ° C. for 30 seconds; And
60℃에서 45분간 최종 연장.Final extension for 45 minutes at 60 ° C.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해검출하였다.On the other hand, PCR reagents and devices were used as described above, electrophoresis was also performed in the manner described above. The band pattern as a result of electrophoresis was detected by silver dyeing.
최종 시험결과는 도 22에 도시된 바와 같다.The final test result is as shown in FIG.
실시예 23Example 23
D3S2406, D19S253, D13S317, D2S1371 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출Multiplex PCR Amplification of D3S2406, D19S253, D13S317, and D2S1371 Locus and Detection of Amplified Genotypes
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 0.25μM D3S2406 프라이머(서열 7 및 서열 8 또는 서열 9 및 서열 10), 0.05μM D19S253 프라이머(서열 5 및 서열 6), 0.1μM D13S317 프라이머(서열 3 및 서열 4), 0.2μM D2S1371 프라이머(서열 11 및 서열 12)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:Human genomic DNA used in this example was used to extract the blood of the donor from the Korean Red Cross blood source. The DNA sample is amplified in one reaction vessel. PCR amplification was performed with 2.0 μl of 10 × PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, 0.75 units of Taq polymerase, 1 to 10ng DNA template and 0.25 μM D3S2406 primer (SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10), 0.05 μM D19S253 A total volume of 20 μl of reaction solution consisting of primers (SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6), 0.1 μM D13S317 primer (SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4), and 0.2 μM D2S1371 primer (SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12). PCR cycles adopted the following amplification protocols:
95℃에서 3분간 예열;Preheat at 95 ° C. for 3 minutes;
94℃에서 30초, 59℃에서 60초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및Repeat 28 times at 94 ° C. for 30 seconds, at 59 ° C. for 60 seconds, and at 72 ° C. for 30 seconds; And
60℃에서 45분간 최종 연장.Final extension for 45 minutes at 60 ° C.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해검출하였다.On the other hand, PCR reagents and devices were used as described above, electrophoresis was also performed in the manner described above. The band pattern as a result of electrophoresis was detected by silver dyeing.
최종 시험결과는 도 23에 도시된 바와 같다.The final test result is as shown in FIG.
실시예 24Example 24
D12S391, D13S317, D5S818, D2S1371 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출Multiplex PCR Amplification of D12S391, D13S317, D5S818, and D2S1371 Loci and Detection of Amplified Genotypes
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 0.125μM D12S391 프라이머(서열 15 및 서열 16), 0.1μM D13S317 프라이머(서열 3 및 서열 4), 0.1μM D5S818 프라이머(서열 1 및 서열 2), 0.2μM D2S1371 프라이머(서열 11 및 서열 12)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:Human genomic DNA used in this example was used to extract the blood of the donor from the Korean Red Cross blood source. The DNA sample is amplified in one reaction vessel. PCR amplification was performed with 2.0 μl of 10 × PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, 0.75 units of Taq polymerase, 1 to 10ng DNA template and 0.125 μM D12S391 primer (SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16), 0.1 μM D13S317 primer (SEQ ID NO: 3 and Sequence) 4), a total volume of 20 μl of a 0.1 μM D5S818 primer (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2) and a 0.2 μM D2S1371 primer (SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12) was performed. PCR cycles adopted the following amplification protocols:
95℃에서 3분간 예열;Preheat at 95 ° C. for 3 minutes;
94℃에서 30초, 59℃에서 60초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및Repeat 28 times at 94 ° C. for 30 seconds, at 59 ° C. for 60 seconds, and at 72 ° C. for 30 seconds; And
60℃에서 45분간 최종 연장.Final extension for 45 minutes at 60 ° C.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.On the other hand, PCR reagents and devices were used as described above, electrophoresis was also performed in the manner described above. The band pattern as a result of electrophoresis was detected by silver dyeing.
최종 시험결과는 도 24에 도시된 바와 같다.The final test result is as shown in FIG.
실시예 25Example 25
D20S470, D19S253, D13S317, D2S1371 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출Multiplex PCR Amplification of D20S470, D19S253, D13S317, and D2S1371 Locus and Detection of Amplified Genotypes
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10× PCR 완충용액, O.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 10ng DNA 주형 및 0.1μM D20S470 프라이머(서열 17 및 서열 18), 0.05μM D19S253 프라이머(서열 5 및 서열 6), 0.1μM D13S317 프라이머(서열 3 및 서열 4), 0.2μM D2S1371 프라이머(서열 11 및 서열 12)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:Human genomic DNA used in this example was used to extract the blood of the donor from the Korean Red Cross blood source. The DNA sample is amplified in one reaction vessel. PCR amplification was performed with 2.0 μl of 10 × PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, 0.75 units of Taq polymerase, 1-10 ng DNA template and 0.1 μM D20S470 primer (SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18), 0.05 μM D19S253 primer (SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6), 0.1 μM D13S317 primers (SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4), 0.2 μM D2S1371 primers (SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12) in a total volume of 20 μl reaction solution. PCR cycles adopted the following amplification protocols:
95℃에서 3분간 예열;Preheat at 95 ° C. for 3 minutes;
94℃에서 30초, 59℃에서 60초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및Repeat 28 times at 94 ° C. for 30 seconds, at 59 ° C. for 60 seconds, and at 72 ° C. for 30 seconds; And
60℃에서 45분간 최종 연장.Final extension for 45 minutes at 60 ° C.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.On the other hand, PCR reagents and devices were used as described above, electrophoresis was also performed in the manner described above. The band pattern as a result of electrophoresis was detected by silver dyeing.
최종 시험결과는 도 25에 도시된 바와 같다.The final test result is as shown in FIG.
실시예 26Example 26
D20S470, D12S391, D13S317, D2S1371 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출Multiplex PCR Amplification of D20S470, D12S391, D13S317, and D2S1371 Locus and Detection of Amplified Genotypes
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 10ng DNA 주형 및 O.125μM D20S470 프라이머(서열 17 및 서열 18), O.15μM D12S391 프라이머(서열 15 및 서열 16), 0.15μM D13S317 프라이머(서열 3 및 서열 4), 0.25μM D2S1371 프라이머(서열 11 및 서열 12)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:Human genomic DNA used in this example was used to extract the blood of the donor from the Korean Red Cross blood source. The DNA sample is amplified in one reaction vessel. PCR amplification was performed with 2.0 μl of 10 × PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, 0.75 units of Taq polymerase, 1-10 ng DNA template and O.125 μM D20S470 primer (SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18), O.15 μM D12S391 primer (SEQ ID NO: 15 And SEQ ID NO: 16), 0.15 μΜ D13S317 primers (SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4), 0.25 μΜ D2S1371 primers (SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12) in a total solution of 20 μL. PCR cycles adopted the following amplification protocols:
95℃에서 3분간 예열;Preheat at 95 ° C. for 3 minutes;
94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및Repeat 28 times at 94 ° C. for 30 seconds, at 60 ° C. for 30 seconds, and at 72 ° C. for 30 seconds; And
60℃에서 45분간 최종 연장.Final extension for 45 minutes at 60 ° C.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.On the other hand, PCR reagents and devices were used as described above, electrophoresis was also performed in the manner described above. The band pattern as a result of electrophoresis was detected by silver dyeing.
최종 시험결과는 도 26에 도시된 바와 같다.The final test result is as shown in FIG.
실시예 27Example 27
D4S2368, D12S391, D9S925, D2S1371 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출Multiplex PCR Amplification of D4S2368, D12S391, D9S925, and D2S1371 Locus and Detection of Amplified Genotypes
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 0.0875μM D4S2368 프라이머(서열 25 및 서열 26), 0.15μM D12S391 프라이머(서열 15 및 서열 16), 0.3μM D9S925 프라이머(서열 21 및 서열 22), 0.25μM D2S1371 프라이머(서열 11 및 서열 12)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:Human genomic DNA used in this example was used to extract the blood of the donor from the Korean Red Cross blood source. The DNA sample is amplified in one reaction vessel. PCR amplification was performed with 2.0 μl of 10 × PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, 0.75 units of Taq polymerase, 1 to 10ng DNA template and 0.0875 μM D4S2368 primer (SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26), 0.15 μM D12S391 primer (SEQ ID NO: 15 and sequence) 16), a total volume of 20 μl of 0.3 μM D9S925 primer (SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22) and 0.25 μM D2S1371 primer (SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12) was performed. PCR cycles adopted the following amplification protocols:
95℃에서 3분간 예열;Preheat at 95 ° C. for 3 minutes;
94℃에서 30초, 61℃에서 30초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및Repeat 28 times at 94 ° C for 30 seconds, at 61 ° C for 30 seconds, and at 72 ° C for 30 seconds; And
60℃에서 45분간 최종 연장.Final extension for 45 minutes at 60 ° C.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.On the other hand, PCR reagents and devices were used as described above, electrophoresis was also performed in the manner described above. The band pattern as a result of electrophoresis was detected by silver dyeing.
최종 시험결과는 도 27에 도시된 바와 같다.The final test result is as shown in FIG.
실시예 28Example 28
D4S2368, D7S821, D9S925, D2S1371 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출Multiplex PCR Amplification of D4S2368, D7S821, D9S925, and D2S1371 Loci and Detection of Amplified Genotypes
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10× PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 O.0875μM D4S2368 프라이머(서열 25 및서열 26), 0.1μM D7S82l 프라이머(서열 23 및 서열 24), O.3μM D9S925 프라이머(서열 21 및 서열 22), 0.25μM D2S1371 프라이머(서열 11 및 서열 12)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:Human genomic DNA used in this example was used to extract the blood of the donor from the Korean Red Cross blood source. The DNA sample is amplified in one reaction vessel. PCR amplification was performed with 2.0 μl of 10 × PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, 0.75 units of Taq polymerase, 1 to 10ng DNA template and 0.1875 μM D4S2368 primer (SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26), 0.1 μM D7S82l primer (SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24), 0.3 μM D9S925 primers (SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22), 0.25 μM D2S1371 primers (SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12) in a total solution of 20 μL. PCR cycles adopted the following amplification protocols:
95℃에서 3분간 예열;Preheat at 95 ° C. for 3 minutes;
94℃에서 30초, 61℃에서 20초, 72℃에서 30초로 31회 반복; 및31 repetitions of 30 seconds at 94 ° C, 20 seconds at 61 ° C, and 30 seconds at 72 ° C; And
60℃에서 45분간 최종 연장.Final extension for 45 minutes at 60 ° C.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.On the other hand, PCR reagents and devices were used as described above, electrophoresis was also performed in the manner described above. The band pattern as a result of electrophoresis was detected by silver dyeing.
최종 시험결과는 도 28에 도시된 바와 같다.The final test result is as shown in FIG.
실시예 29Example 29
D20S470, D12S391, D9S925, D6S1043 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출Multiplex PCR Amplification and Detection of Amplified Genotypes of D20S470, D12S391, D9S925, and D6S1043 Loci
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 10ng DNA 주형 및 0.125μM D20S470 프라이머(서열 17 및 서열 18), 0.15μM D12S391 프라이머(서열 15 및 서열 16), 0.3μM D9S925 프라이머(서열 21 및 서열 22), 0.45μM D6S1043 프라이머(서열 19 및 서열 20)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:Human genomic DNA used in this example was used to extract the blood of the donor from the Korean Red Cross blood source. The DNA sample is amplified in one reaction vessel. PCR amplification was performed with 2.0 μl of 10 × PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, 0.75 units of Taq polymerase, 1-10 ng DNA template and 0.125 μM D20S470 primer (SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18), 0.15 μM D12S391 primer (SEQ ID NO: 15 and sequence) 16), a total volume of 20 μl reaction solution consisting of 0.3 μM D9S925 primer (SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22) and 0.45 μM D6S1043 primer (SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20). PCR cycles adopted the following amplification protocols:
95℃에서 3분간 예열;Preheat at 95 ° C. for 3 minutes;
94℃에서 30초, 61℃에서 20초, 72℃에서 30초로 31회 반복; 및31 repetitions of 30 seconds at 94 ° C, 20 seconds at 61 ° C, and 30 seconds at 72 ° C; And
72℃에서 5분간 최종 연장.Final extension for 5 minutes at 72 ° C.
한편, PCR 시약 및 장치는 전슬한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해검출하였다.On the other hand, the PCR reagents and apparatus were used as the original, electrophoresis was also performed in the manner described above. The band pattern as a result of electrophoresis was detected by silver dyeing.
최종 시험결과는 도 29에 도시된 바와 같다.The final test result is as shown in FIG.
실시예 30Example 30
D4S2368, D12S391, D9S925, D6S1043 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출Multiplex PCR Amplification and Detection of Amplified Genotypes of D4S2368, D12S391, D9S925, and D6S1043 Loci
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 O.0875μM D4S2368 프라이머(서열 25 및 서열 26), 0.15μM D12S391 프라이머(서열 15 및 서열 16), 0.3μM D9S925 프라이머(서열 21 및 서열 22), 0.45μM D6S1043 프라이머(서열 19 및 서열 20)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:Human genomic DNA used in this example was used to extract the blood of the donor from the Korean Red Cross blood source. The DNA sample is amplified in one reaction vessel. PCR amplification was performed with 2.0 μl of 10 × PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, 0.75 units of Taq polymerase, 1 to 10ng DNA template and 0.1875 μM D4S2368 primer (SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26), 0.15 μM D12S391 primer (SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16), 0.3 μM D9S925 primer (SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22), and 0.45 μM D6S1043 primer (SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20) in a total volume of 20 μl reaction solution. PCR cycles adopted the following amplification protocols:
95℃에서 3분간 예열;Preheat at 95 ° C. for 3 minutes;
94℃에서 30초, 61℃에서 20초, 72℃에서 30초로 31회 반복; 및31 repetitions of 30 seconds at 94 ° C, 20 seconds at 61 ° C, and 30 seconds at 72 ° C; And
72℃에서 5분간 최종 연장.Final extension for 5 minutes at 72 ° C.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.On the other hand, PCR reagents and devices were used as described above, electrophoresis was also performed in the manner described above. The band pattern as a result of electrophoresis was detected by silver dyeing.
최종 시험결과는 도 30에 도시된 바와 같다.The final test result is as shown in FIG.
실시예 31Example 31
D4S2368, D19S253, D9S925, D6S1043 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출Multiplex PCR Amplification of D4S2368, D19S253, D9S925, and D6S1043 Locus and Detection of Amplified Genotypes
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, O.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 O.0875μM D4S2368 프라이머(서열 25 및 서열 26), 0.1μM D19S253 프라이머(서열 5 및 서열 6), 0.3μM D9S925 프라이머(서열 21 및 서열 22), 0.45μM D6S1043 프라이머(서열 19 및 서열 20)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:Human genomic DNA used in this example was used to extract the blood of the donor from the Korean Red Cross blood source. The DNA sample is amplified in one reaction vessel. PCR amplification was performed with 2.0 μl of 10 × PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, 0.75 units of Taq polymerase, 1 to 10ng DNA template and 0.1875 μM D4S2368 primer (SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26), 0.1 μM D19S253 primer (SEQ ID NO: 5). And 6), a 0.3 μM D9S925 primer (SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22), and a 0.45 μM D6S1043 primer (SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20) in a total volume of 20 μL. PCR cycles adopted the following amplification protocols:
95℃에서 3분간 예열;Preheat at 95 ° C. for 3 minutes;
94℃에서 30초, 60℃에서 20초, 72℃에서 30초로 31회 반복; 및31 repetitions of 30 seconds at 94 ° C, 20 seconds at 60 ° C, and 30 seconds at 72 ° C; And
72℃에서 5분간 최종 연장.Final extension for 5 minutes at 72 ° C.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해검출하였다.On the other hand, PCR reagents and devices were used as described above, electrophoresis was also performed in the manner described above. The band pattern as a result of electrophoresis was detected by silver dyeing.
최종 시험결과는 도 31에 도시된 바와 같다.The final test result is as shown in FIG.
실시예 32Example 32
D3S2406, D19S253, D9S925, D6S1043 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출Multiplex PCR Amplification of D3S2406, D19S253, D9S925, and D6S1043 Loci and Detection of Amplified Genotypes
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, O.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 0.25μM D3S2406 프라이머(서열 7 및 서열 8 또는 서열 9 및 서열 10), 0.05μM D19S253 프라이머(서열 5 및 서열 6), O.25μM D9S925 프라이머(서열 21 및 서열 22), 0.3μM D6S1043 프라이머(서열 19 및 서열 20)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:Human genomic DNA used in this example was used to extract the blood of the donor from the Korean Red Cross blood source. The DNA sample is amplified in one reaction vessel. PCR amplification was performed with 2.0 μl of 10 × PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, 0.75 units of Taq polymerase, 1 to 10ng DNA template and 0.25 μM D3S2406 primer (SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10), 0.05 μM A total volume of 20 μl of a D19S253 primer (SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6), an O.25 μM D9S925 primer (SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22), and a 0.3 μM D6S1043 primer (SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20) was performed. PCR cycles adopted the following amplification protocols:
95℃에서 3분간 예열;Preheat at 95 ° C. for 3 minutes;
94℃에서 30초, 59℃에서 30초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및Repeat 28 times at 94 ° C. for 30 seconds, at 59 ° C. for 30 seconds, and at 72 ° C. for 30 seconds; And
72℃에서 5분간 최종 연장.Final extension for 5 minutes at 72 ° C.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.On the other hand, PCR reagents and devices were used as described above, electrophoresis was also performed in the manner described above. The band pattern as a result of electrophoresis was detected by silver dyeing.
최종 시험결과는 도 32에 도시된 바와 같다.The final test result is as shown in FIG.
실시예 33Example 33
D4S2368, D7S821, D8S1477, D6S1043 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출Multiplex PCR Amplification of D4S2368, D7S821, D8S1477, and D6S1043 Locus and Detection of Amplified Genotypes
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, O.2mM dNTPs, O.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 0.0875μM D4S2368 프라이머(서열 25 및 서열 26), 0.1μM D7S821 프라이머(서열 23 및 서열 24), 0.125μM D8S1477 프라이머(서열 13 및 서열 14), 0.45μM D6S1043 프라이머(서열 19 및 서열 20)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반웅용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:Human genomic DNA used in this example was used to extract the blood of the donor from the Korean Red Cross blood source. The DNA sample is amplified in one reaction vessel. PCR amplification was performed with 2.0 μl of 10 × PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, 0.275 units of Taq polymerase, 1 to 10ng DNA template and 0.0875 μM D4S2368 primer (SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26), 0.1 μM D7S821 primer (SEQ ID NO: 25) 23 and SEQ ID NO: 24), 0.125 μΜ D8S1477 primer (SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14), and 0.45 μΜ D6S1043 primer (SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20) in a total volume of 20 μl semi-acuum solution. PCR cycles adopted the following amplification protocols:
95℃에서 3분간 예열;Preheat at 95 ° C. for 3 minutes;
94℃에서 30초, 61℃에서 20초, 72℃에서 30초로 31회 반복; 및31 repetitions of 30 seconds at 94 ° C, 20 seconds at 61 ° C, and 30 seconds at 72 ° C; And
72℃에서 5분간 최종 연장.Final extension for 5 minutes at 72 ° C.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.On the other hand, PCR reagents and devices were used as described above, electrophoresis was also performed in the manner described above. The band pattern as a result of electrophoresis was detected by silver dyeing.
최종 시험결과는 도 33에 도시된 바와 같다.The final test result is as shown in FIG.
실시예 34Example 34
D4S2368, D14S608, D16S3253, D6S1043 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출Multiplex PCR Amplification of D4S2368, D14S608, D16S3253, and D6S1043 Locus and Detection of Amplified Genotypes
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, O.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 0.075μM D4S2368 프라이머(서열 25 및 서열 26), 0.5μM D14S608 프라이머(서열 31 및 서열 32), 0.75μM D16S3253 프라이머(서열 29 및 서열 30), 0.3μM D6S1043 프라이머(서열 19 및 서열 20)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:Human genomic DNA used in this example was used to extract the blood of the donor from the Korean Red Cross blood source. The DNA sample is amplified in one reaction vessel. PCR amplification was performed with 2.0 μl of 10 × PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, Taq polymerase of 0.15 unit, 1 to 10ng DNA template and 0.075 μM D4S2368 primer (SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26), 0.5 μM D14S608 primer (SEQ ID NO: 31 And 32), 0.75 μΜ D16S3253 primer (SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 30), and 0.3 μΜ D6S1043 primer (SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20) in a 20 μl total reaction solution. PCR cycles adopted the following amplification protocols:
95℃에서 3분간 예열;Preheat at 95 ° C. for 3 minutes;
94℃에서 30초, 59℃에서 20초, 72℃에서 30초로 31회 반복; 및31 repetitions of 30 seconds at 94 ° C, 20 seconds at 59 ° C, and 30 seconds at 72 ° C; And
72℃에서 5분간 최종 연장.Final extension for 5 minutes at 72 ° C.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.On the other hand, PCR reagents and devices were used as described above, electrophoresis was also performed in the manner described above. The band pattern as a result of electrophoresis was detected by silver dyeing.
최종 시험결과는 도 34에 도시된 바와 같다.The final test result is as shown in FIG.
실시예 35Example 35
D4S2368, D7S821, D16S3253, D6S1043 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출Multiplex PCR Amplification of D4S2368, D7S821, D16S3253, and D6S1043 Locus and Detection of Amplified Genotypes
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 0.075μM D4S2368 프라이머(서열 25 및 서열 26), O.075μM D7S821 프라이머(서열 23 및 서열 24), O.75μM D16S3253 프라이머(서열 29 및 서열 30), 0.2μM D6S1043 프라이머(서열 19 및 서열 20)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:Human genomic DNA used in this example was used to extract the blood of the donor from the Korean Red Cross blood source. The DNA sample is amplified in one reaction vessel. PCR amplification was performed with 2.0 μl of 10 × PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, 0.75 units of Taq polymerase, 1 to 10ng DNA template and 0.075 μM D4S2368 primer (SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26), 0.175 μM D7S821 primer (SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24), O.75 μM D16S3253 primer (SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 30), and 0.2 μM D6S1043 primer (SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20) in a total solution of 20 μL. PCR cycles adopted the following amplification protocols:
95℃에서 3분간 예열;Preheat at 95 ° C. for 3 minutes;
94℃에서 30초, 59℃에서 20초, 72℃에서 30초로 31회 반복; 및31 repetitions of 30 seconds at 94 ° C, 20 seconds at 59 ° C, and 30 seconds at 72 ° C; And
72℃에서 5분간 최종 연장.Final extension for 5 minutes at 72 ° C.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.On the other hand, PCR reagents and devices were used as described above, electrophoresis was also performed in the manner described above. The band pattern as a result of electrophoresis was detected by silver dyeing.
최종 시험결과는 도 35에 도시된 바와 같다.The final test result is as shown in FIG.
실시예 36Example 36
D20S470, D12S391, D8S1477, D6S1043 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출Multiplex PCR Amplification and Detection of Amplified Genotypes of D20S470, D12S391, D8S1477, and D6S1043 Loci
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10× PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 10ng DNA 주형 및 0.125μM D20S470 프라이머(서열 17 및 서열 18), 0.15μM D12S391 프라이머(서열 15 및 서열 16), 0.125μM D8S1477 프라이머(서열 13 및 서열 14), 0.45μM D6S1043 프라이머(서열 19 및 서열 20)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:Human genomic DNA used in this example was used to extract the blood of the donor from the Korean Red Cross blood source. The DNA sample is amplified in one reaction vessel. PCR amplification was performed with 2.0 μl of 10 × PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, 0.75 units of Taq polymerase, 1-10 ng DNA template and 0.125 μM D20S470 primer (SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18), 0.15 μM D12S391 primer (SEQ ID NO: 15 and sequence) 16), a total volume of 20 μl reaction solution consisting of 0.125 μM D8S1477 primer (SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14) and 0.45 μM D6S1043 primer (SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20). PCR cycles adopted the following amplification protocols:
95℃에서 3분간 예열;Preheat at 95 ° C. for 3 minutes;
94℃에서 30초, 61℃에서 30초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및Repeat 28 times at 94 ° C for 30 seconds, at 61 ° C for 30 seconds, and at 72 ° C for 30 seconds; And
72℃에서 5분간 최종 연장.Final extension for 5 minutes at 72 ° C.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.On the other hand, PCR reagents and devices were used as described above, electrophoresis was also performed in the manner described above. The band pattern as a result of electrophoresis was detected by silver dyeing.
최종 시험결과는 도 36에 도시된 바와 같다.The final test result is as shown in FIG.
실시예 37Example 37
D4S2368, D12S391, D8S1477, D6S1043 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출Multiplex PCR Amplification of D4S2368, D12S391, D8S1477, D6S1043 Locus and Detection of Amplified Genotypes
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 0.0875μM D4S2368 프라이머(서열 25 및 서열 26), O.15μM D12S391 프라이머(서열 15 및 서열 16), 0.125μM D8S1477 프라이머(서열 13 및 서열 14), 0.45μM D6S1043 프라이머(서열 19 및 서열 20)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:Human genomic DNA used in this example was used to extract the blood of the donor from the Korean Red Cross blood source. The DNA sample is amplified in one reaction vessel. PCR amplification was performed with 2.0 μl of 10 × PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, 0.75 units of Taq polymerase, 1 to 10ng DNA template and 0.0875 μM D4S2368 primer (SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26), 0.15 μM D12S391 primer (SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16), 0.125 μΜ D8S1477 primer (SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14), and 0.45 μΜ D6S1043 primer (SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20) in a total volume of 20 μl. PCR cycles adopted the following amplification protocols:
95℃에서 3분간 예열;Preheat at 95 ° C. for 3 minutes;
94℃에서 30초, 61℃에서 20초, 72℃에서 30초로 31회 반복; 및31 repetitions of 30 seconds at 94 ° C, 20 seconds at 61 ° C, and 30 seconds at 72 ° C; And
72℃에서 5분간 최종 연장.Final extension for 5 minutes at 72 ° C.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.On the other hand, PCR reagents and devices were used as described above, electrophoresis was also performed in the manner described above. The band pattern as a result of electrophoresis was detected by silver dyeing.
최종 시험결과는 도 37에 도시된 바와 같다.The final test result is as shown in FIG.
실시예 38Example 38
D4S2368, D7S821, D13S317, D6S1043 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출Multiplex PCR Amplification of D4S2368, D7S821, D13S317, and D6S1043 Locus and Detection of Amplified Genotypes
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 10ng DNA 주형 및 0.0875μM D4S2368 프라이머(서열 25 및 서열 26), 0.1μM D7S821 프라이머(서열 23 및 서열 24), 0.15μM D13S317 프라이머(서열 3 및 서열 4), 0.45μM D6S1043 프라이머(서열 19 및 서열 20)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:Human genomic DNA used in this example was used to extract the blood of the donor from the Korean Red Cross blood source. The DNA sample is amplified in one reaction vessel. PCR amplification was performed with 2.0 μl of 10 × PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, 0.75 units of Taq polymerase, 1-10 ng DNA template and 0.0875 μM D4S2368 primer (SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26), 0.1 μM D7S821 primer (SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 23). 24), a total volume of 20 μl reaction solution consisting of 0.15 μM D13S317 primer (SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4) and 0.45 μM D6S1043 primer (SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20). PCR cycles adopted the following amplification protocols:
95℃에서 3분간 예열;Preheat at 95 ° C. for 3 minutes;
94℃에서 30초, 60℃에서 20초, 72℃에서 30초로 31회 반복; 및31 repetitions of 30 seconds at 94 ° C, 20 seconds at 60 ° C, and 30 seconds at 72 ° C; And
72℃에서 5분간 최종 연장.Final extension for 5 minutes at 72 ° C.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.On the other hand, PCR reagents and devices were used as described above, electrophoresis was also performed in the manner described above. The band pattern as a result of electrophoresis was detected by silver dyeing.
최종 시험결과는 도 38에 도시된 바와 같다.The final test result is as shown in FIG.
실시예 39Example 39
D4S2368, D19S253, D13S317, D6S1043 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출Multiplex PCR Amplification of D4S2368, D19S253, D13S317, and D6S1043 Locus and Detection of Amplified Genotypes
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 0.075 μMD4S2368 프라이머(서열 25 및 서열 26), 0.075μM D19S253 프라이머(서열 5 및 서열 6), 0.125μM D13S317 프라이머(서열 3 및 서열 4), 0.3μM D6S1043 프라이머(서열 19 및 서열 20)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:Human genomic DNA used in this example was used to extract the blood of the donor from the Korean Red Cross blood source. The DNA sample is amplified in one reaction vessel. PCR amplification was performed with 2.0 μl of 10 × PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, 0.75 units of Taq polymerase, 1 to 10ng DNA template and 0.075 μMD4S2368 primer (SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26), 0.075 μM D19S253 primer (SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6). ), 0.125 μΜ D13S317 primer (SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4), 0.3 μΜ D6S1043 primer (SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20) in 20 μl total reaction solution. PCR cycles adopted the following amplification protocols:
95℃에서 3분간 예열;Preheat at 95 ° C. for 3 minutes;
94℃에서 30초, 59℃에서 60초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및Repeat 28 times at 94 ° C. for 30 seconds, at 59 ° C. for 60 seconds, and at 72 ° C. for 30 seconds; And
72℃에서 5분간 최종 연장.Final extension for 5 minutes at 72 ° C.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.On the other hand, PCR reagents and devices were used as described above, electrophoresis was also performed in the manner described above. The band pattern as a result of electrophoresis was detected by silver dyeing.
최종 시험결과는 도 39에 도시된 바와 같다.The final test result is as shown in FIG.
실시예 40Example 40
D3S2406, D19S253, D13S317, D6S1043 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출Multiplex PCR Amplification of D3S2406, D19S253, D13S317, and D6S1043 Locus and Detection of Amplified Genotypes
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, O.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 0.25μM D3S2406 프라이머(서열 7 및 서열 8 또는 서열 9 및 서열 10), 0.05μM D19S253 프라이머(서열 5 및 서열 6), 0.1μM D13S317 프라이머(서열 3 및 서열 4), 0.3μM D6S1043 프라이머(서열 19 및 서열 20)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:Human genomic DNA used in this example was used to extract the blood of the donor from the Korean Red Cross blood source. The DNA sample is amplified in one reaction vessel. PCR amplification was performed with 2.0 μl of 10 × PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, 0.25 Taq polymerase, 1 to 10ng DNA template and 0.25 μM D3S2406 primer (SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10), 0.05 A total volume of 20 μl reaction solution consisting of μM D19S253 primer (SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6), 0.1 μM D13S317 primer (SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4), and 0.3 μM D6S1043 primer (SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20). PCR cycles adopted the following amplification protocols:
95℃에서 3분간 예열;Preheat at 95 ° C. for 3 minutes;
94℃에서 30초, 59℃에서 60초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및Repeat 28 times at 94 ° C. for 30 seconds, at 59 ° C. for 60 seconds, and at 72 ° C. for 30 seconds; And
72℃에서 5분간 최종 연장.Final extension for 5 minutes at 72 ° C.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.On the other hand, PCR reagents and devices were used as described above, electrophoresis was also performed in the manner described above. The band pattern as a result of electrophoresis was detected by silver dyeing.
최종 시험결과는 도 40에 도시된 바와 같다.The final test result is as shown in FIG.
실시예 41Example 41
D3S2406, D14S608, D16S3253, D21S1437 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출Multiplex PCR Amplification of D3S2406, D14S608, D16S3253, and D21S1437 Loci and Detection of Amplified Genotypes
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10× PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 0.2μM D3S2406 프라이머(서열 7 및 서열 8 또는 서열 9 및 서열 10), 0.3μM D14S608 프라이머(서열 31 및 서열 32), 0.5μM D16S3253 프라이머(서열 29 및 서열 30), 0.25μM D21S1437 프라이머(서열 27 및 서열 28)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:Human genomic DNA used in this example was used to extract the blood of the donor from the Korean Red Cross blood source. The DNA sample is amplified in one reaction vessel. PCR amplification was performed with 2.0 μl of 10 × PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, 0.75 units of Taq polymerase, 1 to 10ng DNA template and 0.2 μM D3S2406 primer (SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10), 0.3 μM D14S608 It was performed in a reaction solution having a total volume of 20 μl consisting of a primer (SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 32), a 0.5 μM D16S3253 primer (SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 30), and a 0.25 μM D21S1437 primer (SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28). PCR cycles adopted the following amplification protocols:
95℃에서 3분간 예열;Preheat at 95 ° C. for 3 minutes;
94℃에서 30초, 56℃에서 60초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및Repeat 28 times at 94 ° C. for 30 seconds, at 56 ° C. for 60 seconds, and at 72 ° C. for 30 seconds; And
72℃에서 5분간 최종 연장.Final extension for 5 minutes at 72 ° C.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.On the other hand, PCR reagents and devices were used as described above, electrophoresis was also performed in the manner described above. The band pattern as a result of electrophoresis was detected by silver dyeing.
최종 시험결과는 도 41에 도시된 바와 같다.The final test result is as shown in FIG.
실시예 42Example 42
D20S470, D14S608, D16S3253, D21S1437 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출Multiplex PCR Amplification of D20S470, D14S608, D16S3253, and D21S1437 Loci and Detection of Amplified Genotypes
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, O.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 0.075μM D20S470 프라이머(서열 17 및 서열 18), 0.5μM D14S608 프라이머(서열 31 및 서열 32), O.75μM D16S3253 프라이머(서열 29 및 서열 30), 0.5μM D21S1437 프라이머(서열 27 및 서열 28)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:Human genomic DNA used in this example was used to extract the blood of the donor from the Korean Red Cross blood source. The DNA sample is amplified in one reaction vessel. PCR amplification was performed with 2.0 μl of 10 × PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, 0.25 Taq polymerase, 1 to 10ng DNA template and 0.075 μM D20S470 primer (SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18), 0.5 μM D14S608 primer (SEQ ID NO: 31). And SEQ ID NO: 32), an O.75 μM D16S3253 primer (SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 30), and 0.5 μM D21S1437 primer (SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28) in a 20 μl total reaction solution. PCR cycles adopted the following amplification protocols:
95℃에서 3분간 예열;Preheat at 95 ° C. for 3 minutes;
94℃에서 30초, 58℃에서 60초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및Repeat 28 times at 94 ° C. for 30 seconds, at 58 ° C. for 60 seconds, and at 72 ° C. for 30 seconds; And
72℃에서 5분간 최종 연장.Final extension for 5 minutes at 72 ° C.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.On the other hand, PCR reagents and devices were used as described above, electrophoresis was also performed in the manner described above. The band pattern as a result of electrophoresis was detected by silver dyeing.
최종 시험결과는 도 42에 도시된 바와 같다.The final test result is as shown in FIG.
실시예 43Example 43
D4S2368, D14S608, D16S3253, D21S1437 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출Multiplex PCR Amplification of D4S2368, D14S608, D16S3253, and D21S1437 Locus and Detection of Amplified Genotypes
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, O.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 10ng DNA 주형 및 O.05μM D4S2368 프라이머(서열 25 및 서열 26), O.5μM D14S608 프라이머(서열 31 및 서열 32), 0.75μM D16S3253 프라이머(서열 29 및 서열 30), 0.5μM D21S1437 프라이머(서열 27 및 서열 28)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:Human genomic DNA used in this example was used to extract the blood of the donor from the Korean Red Cross blood source. The DNA sample is amplified in one reaction vessel. PCR amplification was performed with 2.0 μl of 10 × PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, 0.75 units of Taq polymerase, 1 to 10 ng DNA template and 0.15 μM D4S2368 primer (SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26), 0.5 μM D14S608 primer (SEQ ID NO: 25) 31 and SEQ ID NO: 32), 0.75 μΜ D16S3253 primers (SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 30), and 0.5 μΜ D21S1437 primer (SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28) in 20 μl total reaction solution. PCR cycles adopted the following amplification protocols:
95℃에서 3분간 예열;Preheat at 95 ° C. for 3 minutes;
94℃에서 30초, 58℃에서 60초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및Repeat 28 times at 94 ° C. for 30 seconds, at 58 ° C. for 60 seconds, and at 72 ° C. for 30 seconds; And
72℃에서 5분간 최종 연장.Final extension for 5 minutes at 72 ° C.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.On the other hand, PCR reagents and devices were used as described above, electrophoresis was also performed in the manner described above. The band pattern as a result of electrophoresis was detected by silver dyeing.
최종 시험결과는 도 43에 도시된 바와 같다.The final test result is as shown in FIG.
실시예 44Example 44
D4S2368, D7S821, D16S3253, D21S1437 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출Multiplex PCR Amplification of D4S2368, D7S821, D16S3253, and D21S1437 Loci and Detection of Amplified Genotypes
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 0.05μM D4S2368 프라이머(서열 25 및 서열 26), 0.075μM D7S821 프라이머(서열 23 및 서열 24), 0.75μM D16S3253 프라이머(서열 29 및 서열 30), 0.5μM D21S1437 프라이머(서열 27 및 서열 28)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:Human genomic DNA used in this example was used to extract the blood of the donor from the Korean Red Cross blood source. The DNA sample is amplified in one reaction vessel. PCR amplification was performed with 2.0 μl of 10 × PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, 0.75 units of Taq polymerase, 1 to 10ng DNA template and 0.05 μM D4S2368 primer (SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26), 0.075 μM D7S821 primer (SEQ ID NO: 23 and sequence) 24), a total volume of 20 μl of a 0.75 μM D16S3253 primer (SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 30) and 0.5 μM D21S1437 primer (SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28) was performed. PCR cycles adopted the following amplification protocols:
95℃에서 3분간 예열;Preheat at 95 ° C. for 3 minutes;
94℃에서 30초, 58℃에서 60초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및Repeat 28 times at 94 ° C. for 30 seconds, at 58 ° C. for 60 seconds, and at 72 ° C. for 30 seconds; And
72℃에서 5분간 최종 연장.Final extension for 5 minutes at 72 ° C.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.On the other hand, PCR reagents and devices were used as described above, electrophoresis was also performed in the manner described above. The band pattern as a result of electrophoresis was detected by silver dyeing.
최종 시험결과는 도 44에 도시된 바와 같다.The final test result is as shown in FIG.
실시예 45Example 45
D20S470, D14S608, D8S1477, D21S1437 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출Multiplex PCR Amplification of D20S470, D14S608, D8S1477, D21S1437 Locus and Detection of Amplified Genotypes
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, O.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 10ng DNA 주형 및 0.075μM D20S470 프라이머(서열 17 및 서열 18), 0.5μM D14S608 프라이머(서열 31 및 서열 32), 0.1μM D8S1477 프라이머(서열 13 및 서열 14), 0.5μM D21S1437 프라이머(서열 27 및 서열 28)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:Human genomic DNA used in this example was used to extract the blood of the donor from the Korean Red Cross blood source. The DNA sample is amplified in one reaction vessel. PCR amplification was performed with 2.0 μl of 10 × PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, 0.75 units of Taq polymerase, 1-10 ng DNA template and 0.075 μM D20S470 primer (SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18), 0.5 μM D14S608 primer (SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 32), 0.1 μM D8S1477 primers (SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14), and 0.5 μM D21S1437 primers (SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28) were performed in a 20 μl total reaction solution. PCR cycles adopted the following amplification protocols:
95℃에서 3분간 예열;Preheat at 95 ° C. for 3 minutes;
94℃에서 30초, 58℃에서 60초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및Repeat 28 times at 94 ° C. for 30 seconds, at 58 ° C. for 60 seconds, and at 72 ° C. for 30 seconds; And
72℃에서 5분간 최종 연장.Final extension for 5 minutes at 72 ° C.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.On the other hand, PCR reagents and devices were used as described above, electrophoresis was also performed in the manner described above. The band pattern as a result of electrophoresis was detected by silver dyeing.
최종 시험결과는 도 45에 도시된 바와 같다.The final test result is as shown in FIG.
실시예 46Example 46
D20S470, D12S391, D8S1477, D21S1437 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출Multiplex PCR Amplification of D20S470, D12S391, D8S1477, and D21S1437 Locus and Detection of Amplified Genotypes
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 10ng DNA 주형 및 0.075μM D20S470 프라이머(서열 17 및 서열 18), 0.1μM D12S391 프라이머(서열 15 및 서열 16), 0.1μM D8S1477 프라이머(서열 13 및 서열 14), 0.5μM D21S1437 프라이머(서열 27 및 서열 28)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:Human genomic DNA used in this example was used to extract the blood of the donor from the Korean Red Cross blood source. The DNA sample is amplified in one reaction vessel. PCR amplification was performed with 2.0 μl of 10 × PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, 0.75 units of Taq polymerase, 1-10 ng DNA template and 0.075 μM D20S470 primer (SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18), 0.1 μM D12S391 primer (SEQ ID NO: 15 and sequence) 16), in a reaction solution having a total volume of 20 µl consisting of 0.1 µM D8S1477 primer (SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14) and 0.5 µM D21S1437 primer (SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28). PCR cycles adopted the following amplification protocols:
95℃에서 3분간 예열;Preheat at 95 ° C. for 3 minutes;
94℃에서 30초, 58℃에서 60초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및Repeat 28 times at 94 ° C. for 30 seconds, at 58 ° C. for 60 seconds, and at 72 ° C. for 30 seconds; And
72℃에서 5분간 최종 연장.Final extension for 5 minutes at 72 ° C.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.On the other hand, PCR reagents and devices were used as described above, electrophoresis was also performed in the manner described above. The band pattern as a result of electrophoresis was detected by silver dyeing.
최종 시험결과는 도 46에 도시된 바와 같다.The final test result is as shown in FIG.
실시예 47Example 47
D4S2368, D7S821, D9S925, D21S1437 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 증폭된 유전자형의 검출Multiplex PCR Amplification of D4S2368, D7S821, D9S925, and D21S1437 Loci and Detection of Amplified Genotypes
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 2.0㎕의 10× PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 0.75 유니트의 Taq 폴리머라제, 1 내지 1Ong DNA 주형 및 0.075μM D4S2368 프라이머(서열 25 및 서열 26), 0.05μM D7S821 프라이머(서열 23 및 서열 24), 0.15μM D9S925 프라이머(서열 21 및 서열 22), O.5μM D21S1437 프라이머(서열 27 및 서열 28)로 구성된 전체 부피가 20㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:Human genomic DNA used in this example was used to extract the blood of the donor from the Korean Red Cross blood source. The DNA sample is amplified in one reaction vessel. PCR amplification was performed with 2.0 μl of 10 × PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, 0.75 units of Taq polymerase, 1 to 10ng DNA template and 0.075 μM D4S2368 primer (SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26), 0.05 μM D7S821 primer (SEQ ID NO: 23 and Sequence) 24), a total volume of 20 μl reaction solution consisting of 0.15 μM D9S925 primer (SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22) and 0.5 μM D21S1437 primer (SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28). PCR cycles adopted the following amplification protocols:
95℃에서 3분간 예열;Preheat at 95 ° C. for 3 minutes;
94℃에서 30초, 58℃에서 60초, 72℃에서 30초로 28회 반복; 및Repeat 28 times at 94 ° C. for 30 seconds, at 58 ° C. for 60 seconds, and at 72 ° C. for 30 seconds; And
72℃에서 5분간 최종 연장.Final extension for 5 minutes at 72 ° C.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동 역시 전술한 방식에 따라 실행하였다. 전기영동결과인 밴드패턴은 은염색을 통해 검출하였다.On the other hand, PCR reagents and devices were used as described above, electrophoresis was also performed in the manner described above. The band pattern as a result of electrophoresis was detected by silver dyeing.
최종 시험결과는 도 47에 도시된 바와 같다.The final test result is as shown in FIG.
실시예 48Example 48
D5S818, D13S317, D19S253, D3S2406 유전자좌들의 멀티플렉스 PCR 증폭 및 형광물질 표지를 이용하여 증폭된 유전자형의 검출Detection of Amplified Genotypes Using Multiplex PCR Amplification and Fluorescent Labeling of D5S818, D13S317, D19S253, and D3S2406 Loci
본 실시예에서 사용된 인간 게놈 DNA는 한국적십자 혈액원으로부터 헌혈자의혈액을 공급받아 추출한 것을 사용하였다. 상기 DNA 샘플은 하나의 반응용기에서 증폭된다. PCR 증폭은 1.0㎕의 10×PCR 완충용액(PE), 0.2mM dNTPs, 160 ㎍/ml BSA, 0.5 유니트의 AmpliTaq Gold 폴리머라제, 0.5 내지 2ng DNA 주형 및 0.125μM D5S818 프라이머(서열 1 및 HEX로 표지된 서열 2), 0.14 μM D13S317 프라이머(HEX로 표지된 서열 3 및 서열 4), 0.09μM D19S253 프라이머(HEX로 표지된 서열 5 및 서열 6), 0.25 μM D3S2406 프라이머(서열 7 및 HEX로 표지된 서열 8)로 구성된 전체 부피가 1O㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택하였다:Human genomic DNA used in this example was used to extract the blood of the donor from the Korean Red Cross blood source. The DNA sample is amplified in one reaction vessel. PCR amplification was performed with 1.0 μl of 10 × PCR buffer (PE), 0.2 mM dNTPs, 160 μg / ml BSA, 0.5 unit of AmpliTaq Gold polymerase, 0.5 to 2 ng DNA template and 0.125 μM D5S818 primer (SEQ ID NO: 1 and HEX) 2), 0.14 μM D13S317 primer (SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4), 0.09 μM D19S253 primer (SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6), 0.25 μM D3S2406 primer (SEQ ID NO: 7 and HEX) 8) was performed in a reaction solution having a total volume of 100 mu l. PCR cycles adopted the following amplification protocols:
95℃에서 11분간 예열;Preheat 11 minutes at 95 ° C;
94℃에서 30초, 59℃에서 30초, 72℃에서 60초로 10회 반복;10 repetitions of 30 seconds at 94 ° C, 30 seconds at 59 ° C, and 60 seconds at 72 ° C;
90℃에서 30초, 59℃에서 30초, 72℃에서 60초로 20회 반복; 및20 repetitions of 30 seconds at 90 ° C., 30 seconds at 59 ° C., and 60 seconds at 72 ° C .; And
64℃에서 45분간 최종 연장.Final extension for 45 minutes at 64 ° C.
한편, PCR 시약 및 장치는 전술한 바와 같은 것을 사용하였으며, 전기영동은 전술한 바와 같이 ABI PRISM 377 자동 DNA 시퀀서를 이용하였고 유전자 스캔분석(Gene Scan Analysis) 및 게노파이퍼(Genotyper) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.PCR reagents and devices were used as described above, and electrophoresis was performed using the ABI PRISM 377 automated DNA sequencer as described above and analyzed using Gene Scan Analysis and Genotyper software. It was.
최종 시험결과는 도 48에 도시된 바와 같다.The final test result is as shown in FIG.
한편, 본 발명의 한국인 집단에서의 변별력을 검증하기 위해서 D5S818, D13S317, D19S253, D3S2406, D2S1371, D8S1477, D12S391, D20S470, D6S1043, D9S925, D7S821, D4S2368, D21S1437, D16S3253, D14S608 및 D18S1270 유전자좌 각각에 대한 한국인 집단 대립유전자 분포 데이터를 산출하였다. 이들 유전자좌의 변별력이나 다형성의 척도인 PI(Probability of Identity) 및 예측 이형성(Expected heterozygosity) 등은 하기 수학식 1 및 수학식 2에 의하여 산출하였다.Meanwhile, in order to verify discrimination in the Korean population of the present invention, D5S818, D13S317, D19S253, D3S2406, D2S1371, D8S1477, D12S391, D20S470, D6S1043, D9S925, D7S821, D4S2368, D21S1437, D16S3253, D14S32, D14S32, and D14S32, respectively, and D14S32, Population allele distribution data were calculated. Probability of Identity (PI) and Expected heterozygosity, which are measures of discrimination or polymorphism of these loci, were calculated by the following equations (1) and (2).
[수학식 1][Equation 1]
여기서, qi는 예측 유전자형 빈도임. 예측 유전자형 빈도는 하아디 바인베르크 평형(Hardy-Weinberg Equilibrium) 유전법칙에 따라 각 대립유전자의 빈도로부터 계산된다.Where qi is the predicted genotype frequency. The predicted genotype frequency is calculated from the frequency of each allele according to the Hardy-Weinberg Equilibrium genetic law.
[수학식 2][Equation 2]
여기서, Pi는 각각의 대립유전자 빈도임.Where Pi is the frequency of each allele.
a. D6S1043 유전자좌의 대립유전자 분포a. Allele distribution of the D6S1043 locus
D6S1043 유전자좌는 조사된 한국인 집단에서 13개의 대립유전자가 밝혀졌으며 그 반복단위는 (AGAT)/(ACAT)의 염기서열을 기본단위로 10번 반복에서 22번 반복까지이며 가장 작은 대립유전자 10번은 그 크기가 102bp이며 가장 큰 대립유전자 22번은 149bp 이었다(이하, 대립유전자는 반복단위의 실제 반복수에 따라 명명한다).The D6S1043 locus was found to have 13 alleles in the investigated Korean population, with the repeat units ranging from 10 repeats to 22 repeats based on the base sequence of (AGAT) / (ACAT) with the smallest allele 10 in size. Is 102bp and the largest allele 22 was 149bp (hereinafter, the allele is named according to the actual number of repeats of the repeating unit).
b. D9S925 유전자좌의 대립유전자 분포b. Allele distribution of the D9S925 locus
D9S925 유전자좌는 조사된 한국인 집단에서 총 7개의 대립유전자가 밝혀졌으며 그 반복단위는 (ATAG)/(GTAG)의 염기서열을 기본단위로 13번 반복에서 19번 반복까지이다. 이들 대립유전자는 176bp 내지 200 bp의 크기를 가지고 있었다.A total of seven alleles of the D9S925 locus were identified in the investigated Korean population, and the repeat units range from 13 iterations to 19 iterations of the base sequence of (ATAG) / (GTAG). These alleles ranged in size from 176 bp to 200 bp.
c. D7S821 유전자좌의 대립유전자 분포c. Allele distribution of the D7S821 locus
D7S821 유전자좌는 조사된 한국인 집단에서 총 10개의 대립유전자가 밝혀졌으며 (TGTC)/(TATC)의 염기서열을 기본단위로 구성되어 있다. 가장 작은 대립유전자는 반복단위가 11회 반복되어 있었고, 이들 대립유전자는 218bp 내지 254bp의 크기를 가지고 있었다.The D7S821 locus has been identified with a total of 10 alleles in the Korean population examined and consists of the base sequence of (TGTC) / (TATC). The smallest allele had 11 repeats, and these alleles ranged in size from 218 bp to 254 bp.
d. D4S2368 유전자좌의 대립유전자 분포d. Allele distribution of the D4S2368 locus
D4S2368 유전자좌는 조사된 한국인 집단에서 총 7개의 대립유전자가 밝혀졌으며 CTAT의 염기서열을 기본단위로 구성되어 있다. 반복 염기단위가 8회 반복되어있는 대립유전자가 가장 작은 대립유전자였다. 이들 대립유전자는 307bp 내지 331bp의 크기를 가지고 있었다.The D4S2368 locus has been identified with a total of seven alleles in the investigated Korean population and consists of the base sequence of CTAT. The allele with eight repeated base units was the smallest allele. These alleles ranged in size from 307 bp to 331 bp.
e. D5S818 유전자좌의 대립유전자 분포e. Allele distribution of the D5S818 locus
한국인 표본조사(338명)에 따라 총 9개의 대립유전자가 발견되었는데 이중 가장 작은 크기의 대립유전자는 133bp로 GATA를 반복단위로 하여 7번 반복된 형태였다.A total of nine alleles were found according to a Korean sample survey (338). The smallest allele was 133bp, repeated seven times with GATA.
f. D13S317 유전자좌의 대립유전자 분포f. Allele distribution of the D13S317 locus
한국인 표본조사(338명)에 따라 총 8개의 대립유전자가 발견되었는데 이중가장 작은 크기의 대립유전자는 173bp로 TATC와 AATC를 반복단위로 하여 10번 반복된 형태였다. 염기서열이 밝혀진 대립유전자 모두는 TATC 반복단위 외에 AATC를 반복단위로 가지고 있었는데 모든 샘플에서 1회 혹은 2회의 AATC 반복을 지니고 있었으므로 AATC가 반복단위로 간주되어야 한다.A total of eight alleles were found according to a Korean sample survey (338). The smallest allele was 173bp, repeated 10 times using TATC and AATC. All of the alleles whose sequencing was identified had AATC as repeat units in addition to TATC repeat units, which had one or two AATC repeats in all samples, so AATC should be considered as repeat unit.
g. D19S253 유전자좌의 대립유전자 분포g. Allele distribution of the D19S253 locus
한국인 표본조사(268명)에 따라 9개의 대립유전자가 발견되었는데 이 중 가장 작은 크기의 대립유전자는 209bp로 ATAG를 반복단위로 하여 7번 반복된 형태였다.According to a Korean sample survey (268), nine alleles were found, the smallest of which was 209 bp, repeated 7 times with ATAG repeating units.
h. D3S2406 유전자좌의 대립유전자 분포h. Allele distribution of the D3S2406 locus
한국인 표본조사(216명)에 따라 18개의 대립유전자가 발견되었으며 이 중 가장 작은 크기의 대립유전자는 298bp(서열 7 및 서열 8의 프라이머로 증폭시) 혹은 260bp(서열 9 및 서열 10의 프라이머로 증폭시)로 TATC, TGTC, CGTC, CATC를 반복단위로 하여 28번 반복된 형태였다.According to a sample of Koreans (216), 18 alleles were found, the smallest of which was 298bp (when amplified by primers of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8) or 260bp (amplified by primers of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10). In the case of TATC, TGTC, CGTC, and CATC, it was repeated 28 times.
I. D2S1371 유전자좌의 대립유전자 분포I. Allele distribution of the D2S1371 locus
한국인 표본조사(130명)에 따라 발견된 8개의 대립유전자가 발견되었으며 이중 가장 작은 크기의 대립유전자는 96bp로 TCTA를 반복단위로 하여 9번 반복된 형태였다.Eight alleles were found according to a Korean sample survey (130). The smallest allele was 96 bp, repeated 9 times using TCTA.
j. D8S1477 유전자좌의 대립유전자 분포j. Allele distribution of the D8S1477 locus
한국인 표본조사(100명)에 따라 8개의 대립유전자가 발견되었으며 이 중 가장 작은 크기의 대립유전자는 158bp로 CCTT를 반복단위로 하여 13번 반복된 형태였다.According to a sample of 100 Koreans, eight alleles were found, the smallest of which was 158 bp, repeated 13 times using CCTT as a repeat unit.
k. D12S391 유전자좌의 대립유전자 분포k. Allele distribution of the D12S391 locus
한국인 표본조사(100명)에 따라 9개 이상의 대립유전자가 발견되었으며 이중 217bp의 대립유전자는 AGAT, AGAC, AGAT를 반복단위로 하여 17번 반복된 형태였다.According to a sample of 100 Koreans, more than nine alleles were found, of which 217bp alleles were repeated 17 times using AGAT, AGAC, and AGAT.
l. D20S470 유전자좌의 대립유전자 분포l. Allele distribution of the D20S470 locus
한국인 표본조사(337명)에 따라 12개 이상의 대립유전자가 밝혀졌으며 이 중 273bp의 대립유전자는 CCTT를 반복단위로 하여 8번 반복된 형태였다.According to a Korean sample survey (337), more than 12 alleles were identified, of which 273bp alleles were repeated 8 times using CCTT as repeat units.
m. D18S1270, D14S608, D16S3253, D21S1437 유전자좌의 대립유전자 분포m. Allele distribution of the D18S1270, D14S608, D16S3253, and D21S1437 loci
한국인 표본조사(106명)에 따라 상기 4 유전자좌에서 모두 8개의 대립유전자가 발견되었다. 하기 표 13의 각 대립유전자들의 번호는 실제의 염기서열 결정에의한 반복 숫자가 아니며 발견된 대립유전자들 중 가장 작은 것을 1번으로 하여 임의로 정한 것이니 만큼 외국이나 타 기관과의 자료비교를 위해 대조 DNA인 K562에 대한 유전자형도 명시하였다.According to a Korean sample survey (106), eight alleles were found at all four loci. The numbers of alleles in Table 13 are not repeated numbers by actual sequencing and are randomly determined using the smallest number of alleles found. The genotype for the DNA K562 was also specified.
또한, 본 발명에서 가장 대표적인 4가지 콰드루플렉스에 사용된 유전자좌에대한 대립유전자 크기 범위를 요약하면 다음의 표 14 내지 표 17과 같다.In addition, allele size ranges for the loci used in the four representative quadruplexes in the present invention are summarized in Tables 14 to 17 below.
대립유전자의 크기 범위가 제일 작은 것은 D2S1371로 96 내지 124bp의 크기범위를 가지고 있으며 D3S2406은 서열 7 및 서열 8의 프라이머로 증폭시 298 내지 366bp의 크기범위로 가장 큰 대립유전자들을 갖는 것으로 나타나 상기 4종의 콰드루플렉스는 모두 90 내지 370bp 정도의 크기범위에서 분리될 수 있는 것으로 나타났다. 이 범위는 은염색을 이용한 폴리아크릴아미드 변성겔에서 분리가 무리없이 이루어 질 수 있는 범위이다.The smallest allele size ranges from 96 to 124 bp with D2S1371 and D3S2406 has the largest alleles with size ranges from 298 to 366 bp when amplified with primers SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8. All quadruplexes were found to be separated in the size range of about 90 to 370bp. This range is a range that can be separated without difficulty in polyacrylamide modified gel using silver dyeing.
비교실시예Comparative Example
한편, 현재 상용화된 유전자좌들 중 일반적으로 사용되는 HumvWA, HumTHO1, HumTPOX, HumCSF1P0의 4가지 유전자좌들에 대한 대립유전자 분포데이터를 본 발명의 대표적인 4종의 콰드루플렉스 시스템의 변별력과 대조하기 위해 분석하였다.Meanwhile, allelic distribution data of four loci of HumvWA, HumTHO1, HumTPOX, and HumCSF1P0, which are commonly used among currently available loci, were analyzed to compare the discrimination power of four representative quadruplex systems of the present invention. .
상기 대립유전차 빈도에 근거하여 산출된 PI값은 0.066이며, 예측이형성은 0.805이다.The PI value calculated based on the allele frequency is 0.066, and the predictive dysfunction is 0.805.
상기 대립유전자 빈도에 근거하여 산출된 PI값은 0.176이며, 예측이형성은 0.650이다.The PI value calculated based on the allele frequency is 0.176 and the predictive dysplasia is 0.650.
상기 대립유전자 빈도에 근거하여 산출된 PI값은 0.167이며, 예측이형성은 0.672이다.The PI value calculated based on the allele frequency is 0.167 and the predictive dysplasia is 0.672.
상기 대립유전자 빈도에 근거하여 산출된 PI값은 0.123이며, 예측이형성은 0.723이다.The PI value calculated based on the allele frequency is 0.123, and the predictive dysplasia is 0.723.
전술한 수학식 1및 수학식 2를 이용하여 상기 유전자좌들의 변별력을 조사하였다. PI는 임의의 두 사람이 해당 유전자좌에서 같은 유전자형을 지닐 확률을 의미하게 되는데, 본 발명의 유전자좌들의 4가지 조합인 콰드루플렉스 시스템은 모두 비교실시예 보다 변별력이 높은 것으로 나타났다. 이중 대표적인 콰드루플렉스 시스템인 실시예 1, 실시예 2, 실시예 3 및 실시예 4의 콰드루플렉스 시스템에 대한 각 유전자좌의 PI 값 및 예측 이형성을 종합하여 변별력에 따른 각 유전자좌의 순위를 정리하면 다음의 표 22 내지 표 25와 같다. 한편, 결합 PI 값(Combined PI)은 각 구성 유전자좌의 PI 값을 곱하여 산출한다.The discrimination power of the loci was examined using Equations 1 and 2 described above. PI means the probability that any two people will have the same genotype at the locus. The four combinations of the loci of the present invention, the quadruplex system, are all distinguished more than the comparative example. Among the quadruplex systems of Examples 1, 2, 3, and 4, which are representative quadruplex systems, PI values and predictive heterogeneity of each locus are summed to summarize the rank of each locus according to discrimination. Tables 22 to 25 are as follows. Meanwhile, the combined PI value is calculated by multiplying the PI value of each constituent locus.
PI 값은 유전자정보은행 운용시 데이터 베이스 크기에 따른 적용 유전자좌의숫자를 결정짓는 변수인데, 유전자 정보은행 검색을 통하여 색출된 용의자가 범인으로 확실히 지목되자면 데이터 베이스 내에 그 용의자와 우연히 동일한 유전자형을 지니는 사람이 존재하지 않아야 한다. 즉, 데이터 베이스에 입력된 유전자형들은 이론적으로 그들만의 유일성을 지녀야 하는 것이다. 예를 들어, 어느 한 유전자좌의 PI 값이 0.01이라는 의미는 임의의 두 사람을 비교했을 때 유전자형이 같을확률이 0.01 이므로 100쌍의 비교를 하였을 때 한 번 유전자형이 같을 수 있다는 것이며 이러한 1OO이란 수치는 1/PI로 얻을 수 있다. 그런데, 총 n명의 자료를 보유한 데이터 베이스로부터 만들어지는 임의의 비교쌍은 n(n-1)/2 가지가 되므로 이경우의 수에서 임의의 비교쌍이 서로 같은 유전자형이 되지 않기 위해서는 적어도 n(n-1)/2100의 관계를 만족하여야 할 것이다. 상기 식에서 n을 구하면 n14가 되므로 0.01의 PI 값을 갖는 유전자좌 하나로는 14명 미만의 데이터 베이스를 만드는 것이 타당한 수치이다. 한편, 본 발명의 바람직한 실시예들인 실시예 1 내지 실시예 4의 콰드루플렉스 시스템에 대한 각각의 결합 PI 값(combined PI)은 3.6×10-5에서 4.2×1O-6까지의 수치를 나타내었는데 현재 상용화된 유전자좌들 중 가장 일반적으로 사용되는 HumvWA, HumTHO1, HumTPOX, HumCSF1P0의 4가지 유전자좌들을 조합했을 때 한국인 집단에서 결합 PI 값(Combined PI)(상기 4 유전자좌 각각의 PI값을 곱한 것으로 표 18, 표 19, 표 20 및 표 21의 대립유전자 분포 데이터를 통하여 산출하였음)이 2.4×10-4에 불과한 것을 감안하면 본 발명의 콰드루플렉스 시스템은 한국인 집단에서 매우 변별력이 뛰어나 유전자 감식에 매우 유용한 것임을 알수 있다.The PI value is a variable that determines the number of loci applied according to the size of the database when operating the GIS. If the suspect identified through the GIS search is clearly identified as the culprit, it has the same genotype as the suspect in the database. There should be no people. In other words, the genotypes entered into the database should theoretically have their own uniqueness. For example, if the PI value of any one locus is 0.01, the probability of having the same genotype is 0.01 when comparing two people, so that the genotype may be the same once when comparing 100 pairs. You can get it at 1 / PI. By the way, since there are n (n-1) / 2 kinds of comparison pairs made from a database containing a total of n data, in this case, at least n (n-1) in order for the comparison pairs not to be the same genotype. ) / 2100 relationship must be satisfied. Since n is n14 in the above equation, it is reasonable to make a database of less than 14 people with one locus having a PI value of 0.01. Meanwhile, the combined PI values for the quadruplex systems of Examples 1 to 4, which are preferred embodiments of the present invention, showed values ranging from 3.6 × 10 −5 to 4.2 × 10 −6 . Combined PI (combined PI) in the Korean population when multiplying four loci of HumvWA, HumTHO1, HumTPOX, and HumCSF1P0, which are the most commonly used loci, are multiplied by the PI values of each of the four loci. Given that the allele distribution data of Table 19, Table 20 and Table 21) are only 2.4 × 10 −4 , the quadruplex system of the present invention is very discriminating in Korean population and is very useful for gene identification. Able to know.
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