KR101008828B1

KR101008828B1 - Multiplex pcr system comprising 16 str loci and amelogenin which are highly discriminative in korean population and the method of human identification using them

Info

Publication number: KR101008828B1
Application number: KR1020100098833A
Authority: KR
Inventors: 이승환; 이숭덕; 우광만; 박수정; 오혜현; 장애화
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2010-03-12
Filing date: 2010-10-11
Publication date: 2011-01-19

Abstract

PURPOSE: A method for identifying gene using a multiplex gene amplification system is provided to save various reagents and cost and to improve distinguishing Korean group. CONSTITUTION: A method for identifying gene using multiplex gene amplification system comprises: a step of collecting DNA sample; a step of amplifying DNA samples using a complex amplification system containing fluorescence-labeled primers and primers which corresponds to STR loci of D2S1371, D8S1477, D12S391, D20S470, D6S1043, D9S925, D7S821, D4S2368, D5S818, D13S317, D19S253, D3S2406, D1S1612, D15S659, D11S1978 and D22S691; and a step of isolating alleles from the amplified DNA sample and determining allele of the DNA sample.

Description

Multiplex PCR system comprising 16 STR loci and amelogenin which are highly discriminative in Korean population with 16 short repeating unit loci and discriminating sex chromosomal loci in Korean population and the method of human identification using them}

본 발명은 유전자 시스템에서 한국인 집단에서 변별력을 가진 유전자마커(genetic markers)의 검출 및 이들의 조합을 이용한 유전자 감식방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 중합효소연쇄반응(PCR; polymerase chain reaction)을이용하여 여러 다형성 유전자좌들의 조합, 특히 한국인 집단에서 변별력을 가진 16개의 STR 유전좌위들(short tandem repeat loci) 및 성염색체 좌위의 조합을 동시에 증폭함으로써 신속하게 유전자감식을 할 수 있는 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a method for detecting gene markers having distinctive powers in a Korean population in a genetic system and a gene identification method using a combination thereof, and more specifically, using a polymerase chain reaction (PCR). Therefore, the present invention relates to a method for rapid genetic recognition by simultaneously amplifying a combination of several polymorphic loci, especially a combination of 16 STR short loci and sex chromosome loci, which are distinguishable in the Korean population.

개인식별을 위한 유전자감정은 1990년대 초반부터 PCR(Polymerase Chain Reaction, 연쇄중합반응)을 이용한 Amp-FLP(Amplication Fragment length Polymorphism) 타이핑 방법이 본격적으로 사용되고 있으며 이러한 원리는 강력사건을 대상으로 한 법의학적 타이핑(Forensic typing)이나 DNA 신원확인 정보(구 유전자정보은행)와 같은 DNA 데이터베이스의 구축에도 동일하게 적용되고 있다.
Genetic sentiment for personal identification has been used in Amp-FLP (Amplication Fragment length Polymorphism) typing method using PCR (Polymerase Chain Reaction) since the early 1990s. The same holds true for the construction of DNA databases such as forensic typing and DNA identification information (formerly Gene Information Bank).

인간 게놈(genome) 내의 어떤 형질 등의 유전정보를 담고 있지 않은 인트론(intron) 내에 널리 분포한 것으로 알려진 반복염기서열(tandem repeat sequence)들은 유전자 감정의 마커(marker)로서 범세계적으로 유용하게 사용되고 있다. 인간의 게놈에서 많은 유전좌위가 다형성의 STR 부위를 함유하고 있다. STR 좌위는 길이가 2 내지 7개의 염기쌍인 짧은 반복 서열 요소로 구성되어 있는데, 인간의 게놈에는 매 15 kb마다 한 번씩, 2백만개의 삼량체 및 사량체 STR이 존재하는 것으로 추정된다. 특정 좌위에서의 짧은 반복 배열 단위의 수가 변함에 따라, 이 좌위에서의 DNA 길이가 각 대립 형질(allele) 및 각 개인에 따라 변하게 된다. STR 좌위는 이 반복 배열의 측부에 동정되어 있는 특정 프라이머 서열을 이용하여 폴리머라제 연쇄 반응법(PCR)을 통해 증폭시킬 수 있다. 이러한 유전좌위의 대립 형질들은 증폭된 부위 내에 함유되어 있는 반복 서열의 복제수(the number of copy)에 따라 구분되며, 전기 영동법으로 분리한 후, 방사성, 형광, 실버 스테인 및 색채 등 적당한 검출 방법을 사용하여 식별한다.
Tandem repeat sequences, known to be widely distributed in introns that do not contain genetic information, such as certain traits in the human genome, are used worldwide as markers of gene emotion. . Many loci in the human genome contain polymorphic STR sites. The STR locus consists of short repeating sequence elements of 2 to 7 base pairs in length, with an estimated 2 million trimer and tetramer STRs in the human genome, once every 15 kb. As the number of short repeat units at a particular locus changes, the DNA length at this locus varies with each allele and each individual. STR loci can be amplified via polymerase chain reaction (PCR) using specific primer sequences identified on the sides of this repeat sequence. Alleles of these loci are classified according to the number of copies of the repeat sequences contained in the amplified sites, and separated by electrophoresis, and then appropriate detection methods such as radioactivity, fluorescence, silver stain, and color can be obtained. To identify.

또한, 인간의 성별을 식별하기 위하여 성염색체 아멜로게닌 좌위가 사용될 수 있다. 아멜로게닌 좌위는 유전자은행(GenBank)에서 남성 DNA에 존재하는 Y 염색체 상의 좌위를 확인하는 경우 HUMAMELY로서 여성 DNA에 존재하는 X 염색체 상의 좌위를 확인하는 경우 HUMAMELX 로서 확인된다.
In addition, sex chromosomal amegenin loci can be used to identify human gender. Amelogenin loci are identified as HUMAMEL when GenBank identifies loci on Y chromosomes present in male DNA and as HUMAMELX when loci on X chromosomes present in female DNA.

한편, 멀티플렉스 PCR 시스템은 한번의 PCR 반응으로 여러 유전좌위들(loci)의 프라이머를 넣고 한 튜브 내에서 실험반응을 수행하는 것으로서, 멀티플렉스 PCR 시스템을 사용하게 되면 감정인력 및 분석에 사용되는 taq 폴리머라아제(PCR 반응효소)등 각종의 시약류의 절감 효과와 함께 유전자형 모세관 자동분석기의 가동을 최소화시켜 비용을 줄일 수 있는 큰 장점이 있다. 유전자감식에는 상용화된 고가의 반응시약류들이 소모되는 것을 감안할 때 예산상의 절감효과도 상당히 거둘 수 있는 장점을 지니고 있다. 이렇듯 멀티플렉스 PCR 시스템이 가지는 인력, 예산 면에서의 효용가치로 인하여 유전자감식을 선도하는 영국, 미국을 비롯한 선진국가에서는 자국의 현실에 맞는 (통계학적 적합성 등) 멀티플렉스 PCR 시스템을 확립하려는 연구가 활발히 이루어져 왔다. On the other hand, the multiplex PCR system is to put the primers of several loci in one PCR reaction and perform the experiment in one tube. When the multiplex PCR system is used, taq is used for emotional personnel and analysis. Along with the savings of various reagents such as polymerases (PCR reaction enzymes), there is a big advantage that the cost can be reduced by minimizing the operation of the automatic genotype capillary analyzer. Genetic identification has the advantage of significantly reducing the budget considering the consumption of commercially available expensive reaction reagents. As such, due to the manpower and budgetary value of the multiplex PCR system, advanced countries including the UK and the US, which lead gene recognition, are actively researching to establish a multiplex PCR system suitable for their realities (statistical suitability). Has been made.

프로메가 社(Promega Corporation, Madison, Wi, 미국)에서 상용 시판되고 있던 트리플렉스 PCR 키트 (I. II)에 근거하여 초기에는 트리플렉스 PCR 시스템 위주의 연구 개발이 활발히 이루어져 왔다(Kimpton et al.,1993; Urquhart et al., 1994). 그러나 4가지 유전좌위를 동시에 분석하는 콰드루플렉스 시스템(Sprecher et al., 1996 ; Lins et al., 1996 ; Robertson J.M et al., 1995)도 개발하기에 이르렀으며 현재는 그 이상의 유전좌위를 동시에 수행하는 멀티플렉스도 많은 연구가 이루어져 왔다(Kimpton et al., 1996; Evett et al., 1997). Based on the triplex PCR kit (I. II), which is commercially available from Promega Corporation (Promega Corporation, Madison, Wi, USA), research and development mainly focused on triplex PCR systems have been actively conducted (Kimpton et al., 1993; Urquhart et al., 1994). However, a quadruplex system (Sprecher et al., 1996; Lins et al., 1996; Robertson JM et al., 1995), which analyzes four loci simultaneously, has also been developed. Many studies have also been conducted on the multiplexes performed (Kimpton et al., 1996; Evett et al., 1997).

이러한 멀티플렉스 PCR 시스템의 지속적인 개발성과는 유전자정보은행(DNA intelligence database)의 설립, 운용에 박차를 가할만한 획기적인 성과였다. 2009년 12월 현재 세계적으로 유전자 정보은행을 실시중인 나라들은 영국, 미국, 독일, 오스트리아, 네덜란드, 캐나다, 핀란드, 노르웨이, 스웨덴, 덴마크, 스페인, 스위스, 벨기에 등이 있으며 수많은 국가들에서 기술검토, 입법 등을 진행하는 것으로 알려지고 있다. 앞선 예에서 영국의 경우 1995년부터 대상자들의 입력을 시작한 이래로 2009년 12월 현재 4,500,000여명의 데이터를 보유하고 있으며 이 데이터베이스를 통하여 범인을 찾아낸 케이스는 벌써 무수히 많은 것으로 평균 1주당 300건 이상의 범인을 색출해 내는 성과를 거두고 있다. 미국의 경우 과거 각 주 단위로 실시해 오던 데이터베이스는 미연방수사국(FBI)이 관리하는 CODIS(Combined DNA Index 시스템)을 이용하여 연방 전체의 국립 DNA 데이터베이스를 구축 통합하여 2009년 현재 7,000,000명이 넘는 대상자를 입력하여 매우 효율적으로 운용되고 있는 것으로 알려졌다. 그 외의 네덜란드 1996년, 오스트리아, 독일 1997년 또는 1998년 초에 대상자의 입력을 시작하여 현재 입력이 활발하게 이루어지고 상당한 효과를 거두고 있는 것으로 알려지고 있다. The continuous development of these multiplex PCR systems has been a breakthrough for the establishment and operation of the DNA intelligence database. As of December 2009, there are UK, US, Germany, Austria, Netherlands, Canada, Finland, Norway, Sweden, Denmark, Spain, Switzerland and Belgium. It is known to proceed with legislation. In the previous example, the UK has had more than 4,500,000 data as of December 2009, since the entry of the subjects started in 1995, and the database has already found a myriad of cases, with an average of more than 300 criminals per week. It is doing well. In the United States, the state-run database has been built and consolidated by the Federal Bureau of Investigation (CBI), the Combined DNA Index System (CODIS), to provide more than 7,000,000 people as of 2009. It is known to operate very efficiently. In addition, the Netherlands began inputting subjects in 1996, Austria, Germany in 1997 or early 1998, and is known to be actively inputted and have significant effects.

그러나 현재 유전자정보은행을 실시중인 국가 모두가 백인이 주 민족인 국가들이므로 이들 국가가 선정한 유전좌위들은 국가간에 중복되는 것이 많은 유사한 시스템으로 구성되어 있다. 이 시스템에 맞게 어플라이드 바이오시스템즈 社(AB, Applied Biosystems, Foster City, Ca, 미국) 또는 프로메가 社와 같은 다국적 기업에서 이들 데이터베이스를 겨냥하여 이들 국가가 사용하는 유전좌위에 대한 감식기법을 개발 상용화하였으며 상당수의 국가가 이미 이를 사용하고 있다. However, because all of the countries that are currently running the Genetic Information Bank are white-dominant nations, the genetic loci selected by these countries are composed of similar systems with many overlaps. For this system, multinational companies like Applied Biosystems (AB, Appostered Biosystems, Foster City, Ca, USA) or Promega have developed and commercialized the identification techniques for the loci used by these countries for these databases. Many countries already use it.

현재 한국에서 널리 사용되고 있는 체세포 염색체 STR 증폭 방법 역시 외국회사에서 제조, 판매하고 있는 상용 키트이다. 이는 1990년대 후반 PCR에 의한 STR 분석법 개발을 주도하였던 미국, 영국에서 개발된 STR 마커들을 해당 국가의 회사들이 인수해 키트로 상용화하였기 때문이다. 특히 범죄자 DNA 데이터베이스가 세계적으로 일반화되면서 국가 간의 DNA 정보 교환을 위해 모든 국가가 공통적인 STR 마커를 포함하여 사용할 것이 권유되었고 이에 따라 후발국들은 모두 해당 STR 마커들을 광범위하게 포함하고 있는 상용화 키트를 사용하게 되었다. 여러 국가들이 권유하고 있는, STR 마커들을 나열하면 아래와 같다. The somatic chromosome STR amplification method widely used in Korea is also a commercial kit manufactured and sold by a foreign company. This is because STR markers developed in the United States and United Kingdom, which led the development of STR method by PCR in the late 1990s, were acquired by companies in the country and commercialized as kits. In particular, as criminal database of DNA is generalized globally, it is recommended that all countries use common STR markers for the exchange of DNA information among nations, so that later countries use commercialization kits that include a wide range of STR markers. . The list of STR markers recommended by different countries is as follows:

또한, 현재 흔히 사용되고 있는 상용 STR 분석 키트들은 다음과 같다.
In addition, currently available commercial STR assay kits are as follows.

1. One. 어플라이드Applied 바이오시스템즈Biosystems 社의 Company STRSTR 키트Kit

- AmpFlSTR Profiler Plus™ : D3S1358, VWA, FGA, Amelogenin, D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317, D7S820 -AmpFlSTR Profiler Plus ™: D3S1358, VWA, FGA, Amelogenin, D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317, D7S820

- AmpFlSTR COfiler™ : D3S1358, D16S539, Amelogenin, TH01, TPOX, CSF1PO, D7S820 AmpFlSTR COfiler ™: D3S1358, D16S539, Amelogenin, TH01, TPOX, CSF1PO, D7S820

- AmpFlSTR SGM Plus™: D3S1358, VWA, D16S539, D2S1338, Amelogenin, D8S1179, D21S11, D18S51, D19S433, TH01, FGA AmpFlSTR SGM Plus ™: D3S1358, VWA, D16S539, D2S1338, Amelogenin, D8S1179, D21S11, D18S51, D19S433, TH01, FGA

- AmpFlSTR Identifiler™: D8S1179, D21S11, D7S820, CSF1PO, D3S1358, TH01, D13S317, D16S539, D2S1338, D19S433, VWA, TPOX, D18S51, Amelogenin, D5S818, FGA AmpFlSTR Identifiler ™: D8S1179, D21S11, D7S820, CSF1PO, D3S1358, TH01, D13S317, D16S539, D2S1338, D19S433, VWA, TPOX, D18S51, Amelogenin, D5S818, FGA

- AmpFlSTR MiniFiler™: D13S317, D7S820, Amelogenin, D2S1338, D21S11, D16S539, D18S51, CSF1PO, FGA AmpFlSTR MiniFiler ™: D13S317, D7S820, Amelogenin, D2S1338, D21S11, D16S539, D18S51, CSF1PO, FGA

- AmpFlSTR Yfiler™: DYS456, DYS389I, DYS390, DYS389II, DYS458, DYS19, DYS385a/b, DYS393, DYS391, DYS439, DYS635, DYS392, Y_GATA_H4, DYS437, DYS438, DYS448 -AmpFlSTR Yfiler ™: DYS456, DYS389I, DYS390, DYS389II, DYS458, DYS19, DYS385a / b, DYS393, DYS391, DYS439, DYS635, DYS392, Y_GATA_H4, DYS437, DYS438, DYS448

- AmpFlSTR Profiler™: D3S1358, VWA, FGA, Amelogenin, TH01, TPOX, CSF1PO, D5S818, D13S317, D7S820 AmpFlSTR Profiler ™: D3S1358, VWA, FGA, Amelogenin, TH01, TPOX, CSF1PO, D5S818, D13S317, D7S820

- AmpFlSTR SEfiler™: D3S1358, VWA, D16S539, D2S1338, Amelogenin, D8S1179, SE33, D19S433, TH01, FGA, D21S11, D18S51 AmpFlSTR SEfiler ™: D3S1358, VWA, D16S539, D2S1338, Amelogenin, D8S1179, SE33, D19S433, TH01, FGA, D21S11, D18S51

- AmpFlSTR Green I: Amelogenin, TH01, TPOX, CSF1PO AmpFlSTR Green I: Amelogenin, TH01, TPOX, CSF1PO

- AmpFlSTR Blue: D3S1358, VWA, FGA
-AmpFlSTR Blue: D3S1358, VWA, FGA

2. 2. 프로메가Pro Mega 社의 Company STRSTR 키트Kit

- PowerPlex16 : D3S1358, TH01, D21S11, D18S51, Penta E, D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, CSF1PO, Penta D,Amelogenin, VWA, D8S1179, TPOX, FGAPowerPlex16: D3S1358, TH01, D21S11, D18S51, Penta E, D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, CSF1PO, Penta D, Amelogenin, VWA, D8S1179, TPOX, FGA

- PowerPlexY: DYS391, DYS389I, DYS439, DYS389II, DYS438, DYS437, DYS19, DYS392, DYS393, DYS390, DYS385a/b PowerPlexY: DYS391, DYS389I, DYS439, DYS389II, DYS438, DYS437, DYS19, DYS392, DYS393, DYS390, DYS385a / b

- PowerPlex1.2:almost same as PowerPlex 1.1 but for ABI 310 instead of FMBIO PowerPlex1.2: almost same as PowerPlex 1.1 but for ABI 310 instead of FMBIO

- PowerPlex1.1:for FMBIO users PowerPlex 1.1: for FMBIO users

- PowerPlex2.1:for FMBIO users PowerPlex2.1: for FMBIO users

- PowerPlex16 BIO: same as PowerPlex 16 but for FMBIO users PowerPlex16 BIO: same as PowerPlex 16 but for FMBIO users

- PowerPlexES: D3S1358, TH01, D21S11, D18S51, SE33, Amelogenin, VWA, D8S1179, FGA
PowerPlexES: D3S1358, TH01, D21S11, D18S51, SE33, Amelogenin, VWA, D8S1179, FGA

3. 형광색소를 이용하지 않는, 3. Do not use fluorescent dyes, 은염색Silver dyeing 사용 키트( Usage kit ( SilverSilver StainStain SystemsSystems ))

- CTT:CSF1PO, TPOX, TH01CTT: CSF1PO, TPOX, TH01

- CTTV: CSF1PO, TPOX, TH01, VWA CTTV: CSF1PO, TPOX, TH01, VWA

- FFV:F13A1, FESFPS, VWA -FFV: F13A1, FESFPS, VWA

- FFFL: F13A1, FESFPS, F13B, LPL FFFL: F13A1, FESFPS, F13B, LPL

- GammaSTR^TM: D16S539, D7S820, D13S317, D5S818
^{- GammaSTR TM: D16S539, D7S820,} D13S317, D5S818

그러나 현재 외국회사에 의해 공급되어 상업적으로 사용되고 있는 키트들은 백인집단에서 높은 변별력을 보이는 유전좌위 위주로 이루어져 있어 이들 키트들을 그대로 사용하게 될 경우 한국인 내에서의 변별력은 그만큼 떨어질 수밖에 없다. 특히 현재 사용되고 있는 상용화된 키트들은 9개 내지 15개의 STR 마커들을 동시에 분석할 수 있는 시스템인데, 혈연관계 확인의 경우에는 정확도를 위하여 일반적으로 더 많은 STR 마커들의 분석이 요구되기도 한다. 가까운 근친관계에서 직계존비속관계인지 아니면 3촌 관계인지를 가려내는 일이나 형제, 이복형제 등을 판단하는 일에는 더 많은 STR 마커들이 요구된다. 예를 들어 중국교포의 국적신청과 관련한 유전자감식에서 더 정확한 분석결과를 위해 현재 사용되고 있는 상용 키트 외에 '추가의' STR 마커를 포함하는 분석 시스템을 개발, 보완 분석법으로 사용하는 것이 필요하다. 이는 입력숫자가 수십만 명 혹은 수백만 명을 넘어서는 경우에도 우연히 중복되는 유전자형 없는 데이터를 만들기 위한 필요요건이다. 또한 입력숫자가 엄청나게 늘어날 것을 대비하여, 실제로 유럽은 DNA 데이터를 공유하여 7,000,000명 이상의 DNA 데이터를 공유하고 있는 것으로 알려지고 있고, 이에 따라 STR 유전좌위의 우연한 일치를 배제하기 위하여 2, 3가지의 유전좌위를 추가 시키려는 방향으로 활발히 연구되고 있다. 따라서 한국 실정에 맞는 다수의 유전좌위를 마련해 두어야 할 필요성이 대두되고 있으며, 한국인 집단에서 변별력이 높은 유전좌위 위주로 선별된 추가의 STR 마커들을 더 포함하는 유전자 감식 시스템이 개발되어야 할 필요성이 있다.
However, the kits currently supplied by foreign companies and used commercially are mainly based on genetic loci that show high discrimination in Caucasian groups. If these kits are used as they are, the discrimination in Koreans will fall. In particular, commercially available kits are currently capable of analyzing nine to fifteen STR markers at the same time. In the case of kinship confirmation, more STR markers are generally required for accuracy. More STR markers are needed to determine whether a close relative or uncle is a close relative, or to determine brothers or half brothers. For example, it is necessary to develop and use an analytical system containing 'additional' STR markers in addition to the commercial kits currently used for more accurate analysis in gene identification related to Chinese nationality applications. This is a requirement for creating genotype-free data that inadvertently overlaps even if the input number exceeds hundreds of thousands or millions. In addition, in preparation for the enormous increase in input numbers, in fact, Europe is known to share more than 7,000,000 DNA data by sharing DNA data, thus eliminating accidental matching of STR loci. Actively researched in the direction of adding a seat. Therefore, there is a need to prepare a plurality of genetic loci suitable for the Korean situation, and there is a need to develop a genetic identification system further including additional STR markers selected based on the highly discriminating loci in the Korean population.

또한 위와 같은 상용화 키트는 편리하다는 장점도 있지만 외국회사의 기술에 의존하게 되는 단점을 지니고 있다. 실제로 이들 키트를 생산하는 회사는 앞서 살펴본 바와 같이 어플라이드 바이오시스템즈 社와 프로메가 社가 주요 회사이며 이들 회사에서 10여 종의 상용 키트들이 생산 판매되고 있다. 세계시장을 독점하다시피 한 이들 두 회사의 키트 가격은 생산원가에 비해 매우 비싼 편으로 유전자 감식 비용의 큰 부분을 차지하고 있다. 또한 이들 외국 키트를 이용하여 DNA 신원 확인 정보 시스템을 구축하면 감식기술을 외국회사에 의존하게 되는 것으로 향후 만일 키트가 절판된다거나, 공급에 이상이 생긴다거나, 키트의 가격을 대폭 인상하는 경우에도 대응할 수 있는 방안이 없고 따라서 그동안 입력된 데이터는 모두 소용없는 위기에 처할 수 있다. 따라서 이를 대체하거나 보완할 수 있는 자체개발 키트를 만드는 것이 큰 의미를 갖는다. 국제적인 사정이 변화한 경우라도 DNA 신원확인정보 시스템이 운용이 계속되어야 하기 때문이다. 범죄자 DNA 데이터베이스와 같이 대량의 샘플을 연간 처리해야 하는 경우 상용키트를 자체 키트로 대체할 수 있다면 데이터베이스가 항구적으로 운영되는 제도라는 것을 감안할 때 국가적으로 경제적인 면에 기여할 수 있게 된다. 특히 우리나라의 DNA 신원확인정보은행에서 정해진 시간 내 수많은 재소자를 대상으로(국내 DNA 신원확인 정보 시스템 운용시 연간 15,000명) 유전자형을 실시하는 경우에는 각각의 STR 유전좌위를 일일이 분석하는데 많은 노력과 비용이 요구되는 실정이다.
In addition, the commercialization kit as described above has the advantage of convenience, but also has the disadvantage that depends on the technology of the foreign company. In fact, the companies that produce these kits are the main companies, as described above, with Applied Biosystems and Promega, which have produced and sold more than 10 commercial kits. As they monopolized the global market, the kit prices for these two companies are very expensive relative to the cost of production, making up a large portion of the cost of genetic identification. In addition, building a DNA identification information system using these foreign kits will depend on foreign companies for identification techniques, so if the kit is out of print, there is a problem in supply, or the price of the kit is greatly increased. There is no solution, and all the data entered in the meantime can be put to useless crisis. Therefore, making a self-developed kit that can replace or supplement this has a great meaning. This is because the DNA identification information system should continue to operate even if the international circumstances change. If a large sample, such as an offender's DNA database, needs to be processed annually, a commercial kit can be replaced with its own kit, which would contribute to the national economics given that the database is a permanent operation. In particular, when DNA identification information banks in Korea perform genotypes for a large number of inmates within a given time period (15,000 annually when operating the domestic DNA identification information system), much effort and expense are required to analyze each STR locus individually. It is required.

이러한 이유로 국내의 DNA 데이터베이스인 DNA 신원확인정보 시스템을 위하여 한국인 집단에서 변별력이 높은 유전좌위 위주로 선별 및 추가하여 한국인의 집단에서 특히 높은 변별력을 가지면서도, 감정인력 및 분석에 사용되는 각종의 시약류의 절감 효과와 함께 유전자형 모세관 자동분석기의 가동을 최소화시켜 비용을 줄일 수 있는 멀티플렉스 PCR 시스템을 개발하는 것이 필요하다.
For this reason, the DNA identification information system, which is a domestic DNA database, is selected and added mainly in the region of high discrimination in the Korean population, thereby reducing the various reagents used for emotional personnel and analysis while having a high discrimination ability in the Korean population. In addition, there is a need to develop a multiplex PCR system that can reduce costs by minimizing the operation of genotype capillary autoanalyzers.

이와 관련하여, 국제출원공개공보 제 WO 1997/391387호 및 미국 출원 제 US 2009/0142764호의 경우 백인집단에서 높은 변별력을 보이는 유전좌위 위주로 이루어져 있어 이들 키트들을 그대로 사용하게 될 경우 한국인 내에서의 변별력은 그만큼 떨어질 수밖에 없다는 문제점을 내포하고 있다. In this regard, International Publication No. WO 1997/391387 and US Application No. US 2009/0142764 consist mainly of genetic loci that show high discrimination in Caucasian populations. There is a problem that can not but fall.

다만, 한국특허출원공개 제1999-0064640호에서 한국인에 적합한 STR 마커들에 대한 연구 개발이 이루어진 바 있으나, 이 분석 시스템은 콰드루플렉스 시스템에 최적화되어있어 실질적으로 변별력을 높이기 위해서는 콰드루플렉스 시스템이 2가지 이상 병행되어야 한다. 또한, 위 시스템에서 일부 유전좌위는 298-366bp의 증폭 산물을 만들어 내는 프라이머로 개발되었으나 STR 산물의 크기가 커질수록 손상된 DNA에서 해당 기법에서의 증폭산물이 얻어지지 않는 로커스 드롭(locus drop) 현상이 발생할 가능성이 크다는 문제점이 있고, 또한 일부 유전좌위에서 PCR 효율이 저하되는 현상이 나타날 수 있으므로 이러한 문제점들이 개선된 보다 진보된 멀티플렉스 PCR 시스템 개발에 대한 필요성은 여전히 존재한다.
However, in Korean Patent Application Publication No. 1999-0064640, STR markers suitable for Koreans have been researched and developed. However, this analysis system is optimized for quadruplex system, so quadruplex system is applied to increase the discriminating power. It must be two or more in parallel. In addition, some of the loci have been developed as primers to produce amplification products of 298-366bp, but as the size of the STR product increases, locus drop occurs in which the amplification products of the technique cannot be obtained from damaged DNA. There is still a problem that there is a high possibility of occurrence, and in some loci there may be a decrease in PCR efficiency, there is still a need for the development of a more advanced multiplex PCR system in which these problems are improved.

국제출원공개공보 제 WO 1997/391387호, 미국 출원 제 US 2009/0142764호 및 한국특허출원공개 제1999-0064640호는 물론 본 명세서에 언급된 여러 특허 및 선행문헌들은 그 전문이 본 명세서의 일부로서 참고자료로 편입된다.
International Patent Application Publication No. WO 1997/391387, US Application No. US 2009/0142764 and Korean Patent Application Publication No. 1999-0064640, as well as the various patents and prior documents mentioned herein, are incorporated by reference in their entirety as part of this specification. It is incorporated by reference.

따라서, 본 발명은 기존의 유전자 증폭 시스템에 한국인 집단에서 변별력을 가지는 STR 유전좌위들 및 성염색체 좌위를 추가하여 한국인 집단에서 보다 높은 변별력을 지니며 기존의 유전자 증폭 시스템의 단점을 보완한 멀티플렉스 유전자 증폭 시스템에 의한 유전자 감식기법을 제공하는 데 그 목적이 있다.
Therefore, the present invention adds the STR loci and sex chromosomal loci with discrimination in the Korean population to the existing gene amplification system, and has a higher discrimination power in the Korean population and complements the disadvantages of the existing gene amplification system. The purpose of the present invention is to provide a gene identification technique by an amplification system.

또한, 본 발명의 목적은 한국인 집단에서 변별력을 가지는 STR 유전자좌들 및 성염색체 유전좌위의 멀티플렉스 증폭에 적합한 프라이머를 제공하는데 있다.
It is also an object of the present invention to provide a primer suitable for multiplex amplification of STR loci and sex chromosomal loci with discriminating powers in the Korean population.

나아가, 본 발명은 상기와 같은 유전좌들의 조합과 프라이머를 이용한 PCR 증폭의 조건을 확립하여 한국인 집단에서 변별력을 지닌 유전자 감식법을 제공하는데 그 목적이 있다.
Furthermore, an object of the present invention is to establish a condition for PCR amplification using a combination of the above loci and primers, and to provide a gene identification method having distinctive power in Korean population.

추가로, 본 발명은 상기와 같은 프라이머와 유전자좌들의 조합을 채택함으로써 한국인 집단에서 변별력을 지닌 유전자 감식방법을 구현하고 있는 키트를 제공하는데 그 목적이 있다.
In addition, an object of the present invention is to provide a kit for implementing a gene identification method having a discriminating power in the Korean population by adopting the combination of the primers and loci as described above.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 다음과 같은 사항들이 고려되었다. In order to achieve the above object, the following matters were considered.

먼저, 형광색소를 부착한 STR 타이핑법을 이용하기 위하여 증폭 산물의 크기가 동일한 형광색소를 사용한 하나의 세트 내에서는 겹치지 않도록 하여야 한다. First, in order to use the STR typing method in which fluorescent dyes are attached, the amplification products should not overlap in one set using the same fluorescent dyes.

이외에도 특정 유전좌위의 경우 증폭의 민감도가 다른 유전좌위에 비해 낮아 증폭량이 떨어지므로 각 유전좌위 프라이머의 농도를 적절히 조절하는 방법으로 분석율을 높여야 한다. In addition, in the case of a specific locus, the sensitivity of amplification is lower than that of other loci, resulting in a decrease in amplification. Therefore, the analysis rate should be increased by appropriately adjusting the concentration of each locus primer.

또한 멀티플렉스에 포함될 유전좌위들은 재소자의 유전자형 분석을 위하여만 사용될 것이 아니고 강력사건의 증거물에서도 똑같이 적용될 기법이므로 상태가 나쁜 감정물에서도 유전자형 검출이 잘되는 민감도가 높도록 설계 되어야 하며, 2인 이상의 유전자형이 섞인 감정물의 감식에 대비하여 스터더 밴드(stutter band)와 같은 가공 구조(artfact)에 의한 오류 밴드가 잘 생성되지 않는 유전좌위 위주로 선정되어야 한다.In addition, the locus to be included in the multiplex is not only used for genotyping of inmates, but also applies to the evidence of strong cases, so it should be designed to have high sensitivity for genotyping even in bad condition. In preparation for the identification of mixed emotions, it should be selected based on the locus where error bands due to artfacts, such as stutter bands, are not easily generated.

앞서 기술한 조건에 부합하는 멀티플렉스를 개발하기 위하여 수십 종 이상의 STR 유전좌위에 대한 PCR 조건을 검토하여 증폭조건을 잡아 일정 숫자의 한국인에 대한 유전자 빈도 (Population frequency)를 조사하여 변별력이 높은 것들로 조합하고 추가로 빈도를 조사하여 유전좌위를 선정하여 형광색소를 부착시켰고 서로 중복되는 염색체에 존재하는 좌위들은 변별력계산에서 사용될 수 없으므로 배제시켰다.
In order to develop a multiplex that meets the above-mentioned conditions, the PCR conditions for dozens of STR loci can be examined to determine amplification conditions, and to investigate the gene frequency for a certain number of Koreans. By combining and investigating the frequency, genetic loci were selected and fluorescent dyes were attached, and loci on overlapping chromosomes were excluded because they could not be used in discrimination calculations.

본 발명에서 선택된 STR 유전좌위는 한국특허출원공개 제1999-0064640호에서 개시된 D2S1371, D8S1477, D12S391, D20S470, D6S1043, D9S925, D7S821, D4S2368, D5S818, D13S317, D19S253 및 D3S2406의 12개의 유전좌위에 새로운 STR 좌위인 D1S1612, D15S659, D11S1978, D22S691 및 성 염색체 (Amelogenin) 좌위를 추가하였다. The STR loci selected in the present invention are selected from the 12 STR loci of D2S1371, D8S1477, D12S391, D20S470, D6S1043, D9S925, D7S821, D4S2368, D5S818, D13S317, D19S253 and D3S2406 as disclosed in Korean Patent Application Publication No. 1999-0064640. The loci D1S1612, D15S659, D11S1978, D22S691 and the sex chromosome (Amelogenin) locus were added.

- D1S1612 (Genebank No. G07863)-D1S1612 (Genebank No. G07863)

- D15S659 (Genebank No. G07907)-D15S659 (Genebank No. G07907)

- D11S1978 (Genebank No. G08858)-D11S1978 (Genebank No. G08858)

- D22S691 (Genebank No. G08091)
-D22S691 (Genebank No. G08091)

1. 이러한 본 발명의 멀티 플렉스 유전자 증폭 시스템을 이용한 유전자 감식 방법은, 1. Gene identification method using the multiplex gene amplification system of the present invention,

(1) 분석 대상이 되는 하나 이상의 DNA 표본(시료)을 수득하는 단계;(1) obtaining one or more DNA samples (samples) to be analyzed;

(2) D2S1371, D8S1477, D12S391, D20S470, D6S1043, D9S925, D7S821, D4S2368, D5S818, D13S317, D19S253, D3S2406, D1S1612, D15S659, 아멜로게닌 (Amelogenin), D11S1978 및 D22S691의 16개의 STR 유전좌위 및 아멜로게닌 좌위를 포함하는 유전좌위 세트에서 각각의 유전좌위에 대응되는, 프라이머들 및 형광물질로 표지된 프라이머들을 포함하는 복합 증폭 시스템을 사용하여 상기 분석 대상이 되는 하나 이상의 DNA 샘플(시료) 내 서열을 증폭하는 단계; 그리고(2) D2S1371, D8S1477, D12S391, D20S470, D6S1043, D9S925, D7S821, D4S2368, D5S818, D13S317, D19S253, D3S2406, D1S1612, D15S659, Amellogenin (Amelogenin) and D22691, D22S1978 Sequences in one or more DNA samples (samples) to be analyzed are analyzed using a complex amplification system comprising primers and primers labeled with fluorescent material corresponding to each locus in the set of loci comprising genome loci. Amplifying; And

(3) 상기 단계에서 증폭된 산물에서 대립 유전자들을 분리 검출함으로써 증폭된 대립 유전자들을 평가하고, 이를 통해 샘플 내의 각각의 유전자형들을 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
(3) evaluating the amplified alleles by isolating and detecting alleles in the product amplified in the step, thereby determining respective genotypes in the sample.

바람직하게는, 본원발명의 방법은 상기 16개의 STR 유전좌위 및 아멜로게닌 좌위로 구성된 17 유전좌위 세트를 동시에 증폭 및 분석하는 PCR 시스템에 대한 것이다. (가칭으로서, 본 명세서에서 '17-멀티플렉스' 시스템 또는 'Q17' 시스템이라 칭함)
Preferably, the method of the present invention is directed to a PCR system for simultaneously amplifying and analyzing a set of 17 loci consisting of the 16 STR loci and an amegenin locus. (Tentatively referred to herein as a '17 -multiplex 'system or a' Q17 'system)

이하에서 본 발명의 방법론적 기법들을 간략히 설명하면 다음과 같다. 그러나 이하의 설명은 본 발명의 권리범위를 축소하거나 제한하고자 하는 것이 아니며 본 발명의 특징을 보다 상세히 설명하기 위해 제시되는 것임을 밝혀둔다.
Hereinafter, the methodological techniques of the present invention will be briefly described. However, the following description is not intended to reduce or limit the scope of the present invention, but rather to present the features of the present invention in more detail.

가. 혈액으로부터 end. From blood DNADNA 추출 extraction

혈액성분 중 먼저 적혈구를 제거하기 위해서 적혈구 용해 용액을 처리한 후, 남아 있는 세포에 백혈구 용해 용액을 가하여 처리한다. 그런 다음, 완충용액(TE buffer)이나 순수한 물(D.W.)에 DNA를 추출한다. 추출한 DNA를 정량하고 PCR 증폭에 적합한 농도로 희석한다.
The erythrocyte lysis solution is first treated to remove erythrocytes from the blood components, and then the leukocyte lysis solution is added to the remaining cells. Then, the DNA is extracted into TE buffer or pure water (DW). Quantify the extracted DNA and dilute to a concentration suitable for PCR amplification.

나. I. 프라이머primer

본 발명에서 사용되는 프라이머들은 한국 바이오니어사(Bioneer), 한국 제노텍(Genotech)사 등으로부터 합성하여 사용할 수 있으며, 형광색소로 라벨링된 또는 라벨링 되지 않은 프라이머는 또한 어플라이드 바이오시스템즈 社 (Foster City, CA)를 통해 제작할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
The primers used in the present invention can be synthesized from Bioneer Korea (Bioneer), Genotech (Korea), etc., and primers labeled or unlabeled with fluorescent dyes may also be applied to Applied Biosystems (Foster City, CA). ), But is not limited thereto.

다. All. PCRPCR 시약 및 장치 Reagents and Devices

본 발명의 PCR 반응에 사용된 Taq 폴리머라제는 어플라이드 바이오시스템즈 社에서 구입 가능한 AmpliTaq, AmpliTaq Gold을 사용할 수 있으며, dNTP는 파마시아 바이오텍사(Pharmacia Biotech) 또는 베링거만하임사(Boehringer Manheim)에서 구입한 것, 그리고 완충용액은 어플라이드 바이오시스템즈 社에서 구입한 것을 사용할 수 있고, PCR 써멀 사이클러(PCR thermal cycler)는 엠제이사(MJ)의 PTC-220 모델을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
Taq polymerase used in the PCR reaction of the present invention may be used AmpliTaq, AmpliTaq Gold available from Applied Biosystems, dNTP is purchased from Pharmacia Biotech or Boehringer Manheim, The buffer solution may be purchased from Applied Biosystems, and the PCR thermal cycler may use PTC's PTC-220 model of MJ, but is not limited thereto.

라. 전기영동la. Electrophoresis

증폭된 산물들은 어플라이드 바이오시스템즈 社의 ABI PRISM 3130xl과 3130 시리즈의 모세관 전기영동(capillary elcetrophoresis)법을 이용하여 증폭 산물을 분리할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The amplified products can be separated using, but not limited to, capillary elcetrophoresis of ABI PRISM 3130xl and 3130 series of Applied Biosystems.

마. 형광물질(hemp. Fluorescent material ( fluorescentfluorescent dyedye ) 표지() sign( labelinglabeling )를 이용한 검출Detection using

형광물질은 한 쌍의 증폭 프라이머 중 한 가지 서열에만 표지시킬 수 있으며 표지에 사용되는 형광물질은 각각 서로 독립적으로 하기 물질 중 적당한 것을 골라 표지할 수 있다. (예컨대, 미국 특허 US 6,649,598 호; 6,096,723 호; 6,303,775 호; 6,020,481 호; 6,008,379 호; 및 6,221,604 호에 개시된 형광 물질 등) 또한 형광물질이 표지된 프라이머는 어플라이드 바이오시스템즈 社로부터 합성하여 제공되는 것을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.:The fluorescent material can be labeled only one sequence of a pair of amplification primers, and the fluorescent material used for labeling can be selected by selecting one of the following materials independently from each other. (E.g., fluorescent materials disclosed in US Pat. Nos. 6,649,598; 6,096,723; 6,303,775; 6,020,481; 6,008,379; and 6,221,604, etc.) Fluorescently labeled primers can also be used that are synthesized from Applied Biosystems, Inc. However, it is not limited to this:

TET (4,7,2' ,7' -Tetrachloro-6-carboxyfluorescein);TET (4,7,2 ', 7'-Tetrachloro-6-carboxyfluorescein);

6-FAM (6-carboxyfluorescein);6-FAM (6-carboxyfluorescein);

VIC^® (어플라이드 바이오시스템즈 社);VIC ^® (Applied Biosystems);

NED^® (어플라이드 바이오시스템즈 社);NED ^® (Applied Biosystems);

PET^®(어플라이드 바이오시스템즈 社);PET ^® (Applied Biosystems);

HEX (4,7,2' ,4' ,5' ,7'-Hexachloro-6-carboxylfluorescein);HEX (4,7,2 ', 4', 5 ', 7'-Hexachloro-6-carboxylfluorescein);

TAMRA (N,N,N' ,N',-teramethyl-6-carboxyrhodamine);TAMRA (N, N, N ', N',-teramethyl-6-carboxyrhodamine);

ROX (6-carboxy-X-rhodamine);6-carboxy-X-rhodamine (ROX);

JOE (6-carboxy-2' ,7' -dimethoxy-4' ,5' -dichlorofluorescein );JOE (6-carboxy-2 ', 7'-dimethoxy-4', 5'-dichlorofluorescein);

5-FAM (5-carboxyfluorescein);5-FAM (5-carboxyfluorescein);

R110 (6-carboxyrhodamine); 및R110 (6-carboxyrhodamine); And

R6G (N,N'-diethyl-2' ,7'-dimethyl-6-carboxyrhodamine).R6G (N, N'-diethyl-2 ', 7'-dimethyl-6-carboxyrhodamine).

형광물질이 표지된 프라이머를 이용하여 증폭된 각 유전자좌의 증폭 산물들은 ABI PRISM 3130, 3130xl 자동 유전자형 분석기(Genetic Analyser)의 Data collection 프로그램을 이용하여 전기영동을 수행하고 대립유전자를 가시화할 수 있다. 전기영동 조건은 제조회사가 매뉴얼에 명시한 방법에 의거한다. Amplification products of each locus amplified using fluorescently labeled primers can be subjected to electrophoresis and visualization of alleles using the data collection program of ABI PRISM 3130, 3130xl automatic genotype analyzer (Genetic Analyser). Electrophoretic conditions are based on the method specified in the manual by the manufacturer.

가시화된 대립유전자들은 어플라이드 바이오시스템즈 社가 제공하는 유전자 분석 프로그램인 진 매퍼 아이디(GeneMapper ID) 소프트웨어로 분석할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
Visualized alleles can be analyzed by GeneMapper ID software, a gene analysis program provided by Applied Biosystems, but is not limited thereto.

바. bar. 래더(Ladder)의Ladder 제작 making

유전자 분석 장치에서 자동으로 유전자형을 분석하기 위해서는 레퍼런스(reference)로서 대립 유전자의 래더에 대한 정보가 입력되어야 한다. 래더의 제작은 각각의 대립유전자 사이즈 기준(Allelic ladder)으로 빈도조사에서 나타난 각각 좌위의 해당 대립유전자들의 이형접합체를 찾아서 증폭 산물량을 비교하여 혼합하고, 해당 유전자형(allele)과 동일한 염기 배열을 가진 것으로 확인된 동형접합체를 추가하는 방법으로 수행한다. In order to automatically analyze the genotype in the genetic analysis device, information about the ladder of the allele must be input as a reference. Ladder fabrication is to find heterozygotes of alleles of each locus shown in the frequency survey on the basis of allelic size and compare the amplification products, mix them, and have the same base sequence as the corresponding genotype (allele). This is done by adding homozygotes that have been found to be.

17 멀티플렉스 래더는 각 유전좌위에 대한 한국인 집단 데이터(Korean population data)를 바탕으로 하여 나타나는 대립유전자를 모두 또는 대부분 포함하도록 한다. 각 유전좌위에 해당되는 대립유전자들이 최소한으로 중복되게 DNA 템플레이트를 선택하고 각각 단일 유전좌위 PCR 산물을 얻은 뒤 그 결과물을 유사한 피크 높이를 나타내도록 고르게 섞어 희석한 후 다시 17 멀티 플렉스 프라이머를 이용하여 증폭하는 방법으로 제조한다. 향후에는 각각의 대립유전자들을 클로닝 하여 증폭하는 방법이나, 이미 만들어진 래터 템플레이트를 희석하여 재 증폭하는 방법으로 지속적으로 래더 사용이 가능하다. 제조된 래더 산물을 GenemapperID v3.2(어플라이드 바이오시스템즈 社) 유전자형분석 프로그램에서 사용하려면 각 유전좌위의 정보가 담겨있는 패널(panel)과 각 유전좌위의 대립유전자에 대한 사이즈 정보가 담겨있는 빈(Bin)을 설정한다. 패널에 대한 정보는 각 유전좌위의 각 대립유전자들에 대한 시퀀싱을 통해 확인된 반복 유닛의 반복횟수를 근거로 작성한다.The multiplex ladder includes all or most of the alleles that appear based on the Korean population data for each locus. Select DNA templates with minimal overlap of alleles at each locus, obtain a single locus PCR product, dilute the resulting mixture to show similar peak heights, and amplify again using 17 multiplex primers It is prepared by the method. In the future, it is possible to continuously use ladders by cloning and amplifying individual alleles, or by diluting and re-amplifying a previously created rat template. In order to use the manufactured ladder product in GenemapperID v3.2 (Applied Biosystems) genotyping program, a panel containing information on each locus and a bin containing size information on alleles of each locus ). The information on the panel is based on the number of iterations of the repeat unit identified by sequencing each allele at each locus.

각 대립유전자의 사이즈 정보인 빈(Bin)은 대립유전자의 시퀀싱 결과를 통해 확인된 염기의 수를 세어 확인된 사이즈 값을 입력하는 방법으로 한다. 각 대립유전자에 대하여 ±0.5 ~ 0.6의 오차 범위를 두어 기계적인 차이에 의한 사이즈 편차(size variation)를 보정한다.
Bin, the size information of each allele, is a method of inputting the size value identified by counting the number of bases identified through the sequencing result of the allele. An error range of ± 0.5 to 0.6 is corrected for each allele to correct for size variations due to mechanical differences.

2. 본 발명의 멀티플렉스 PCR 시스템은 증폭되는 각 유전자좌를 플랭킹하는 프라이머의 쌍을 이용하는데, 사용되는 프라이머의 각 쌍들은 다음과 같은 프라이머 서열들이 선택되는 것이 바람직하다. : 2. The multiplex PCR system of the present invention uses a pair of primers flanking each locus to be amplified, and each pair of primers used is preferably selected from the following primer sequences. :

D2S1371 좌위의 경우 서열 1 및 서열 2; SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 for the D2S1371 locus;

D8S1477 좌위의 경우 서열 3 및 서열 4; SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 for the D8S1477 locus;

D12S391 좌위의 경우 서열 5 및 서열 6; SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 for the D12S391 locus;

D20S470 좌위의 경우 서열 7 및 서열 8; SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 for the D20S470 locus;

D6S1043 좌위의 경우 서열 9 및 서열 10; SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 for the D6S1043 locus;

D9S925 좌위의 경우 서열 11 및 서열 12; SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 for the D9S925 locus;

D7S821 좌위의 경우 서열 13 및 서열 14; SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14 for the D7S821 locus;

D4S2368 좌위의 경우 서열 15 및 서열 16; SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16 for the D4S2368 locus;

D5S818 좌위의 경우 서열 17 및 서열 18; SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18 for the D5S818 locus;

D13S317 좌위의 경우 서열 19 및 서열 20; SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 for the D13S317 locus;

D19S253 좌위의 경우 서열 21 및 서열 22; SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22 for the D19S253 locus;

D3S2406 좌위의 경우 서열 23 및 서열 24; SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 for the D3S2406 locus;

D1S1612 좌위의 경우 서열 25 및 서열 26; SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26 for the D1S1612 locus;

D15S659 좌위의 경우 서열 27 및 서열 28; SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28 for the D15S659 locus;

아멜로게닌 좌위의 경우 서열 29 및 서열 30; SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 30 for the amelogenin locus;

D11S1978 좌위의 경우 서열 31 및 서열 32; 그리고SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 32 for the D11S1978 locus; And

D22S691 좌위의 경우 서열 33 및 서열 34.
SEQ ID NO: 33 and SEQ ID NO: 34 for the D22S691 locus.

한국특허출원공개 제1999-0064640호에서 D3S2406 유전좌위는 298-366bp의 증폭 산물을 만들어내는 프라이머로 개발되었다. 그러나 본 발명에서는 STR 산물의 크기가 커질수록 깨진 DNA에서 로커스 드롭(locus drop) 현상이 발생할 가능성이 크므로 다른 세트와의 균형을 맞추기 위해 프라이머의 위치를 변경하였다. 그 결과 본 발명에서는 38bp정도의 증폭 산물 크기가 감소되는 256-332bp의 증폭 산물을 얻을 수 있게 되었다. 이로써 본 발명의 17 멀티플렉스 시스템은 최소 96bp 최대 357bp의 PCR 증폭 산물 사이즈 범위를 지닌 멀티플렉스 시스템으로 새롭게 만들어지게 되었다.
In Korean Patent Application Laid-Open No. 1999-0064640, the D3S2406 locus was developed as a primer to produce an amplification product of 298-366bp. However, in the present invention, as the size of the STR product increases, the locus drop phenomenon is more likely to occur in the broken DNA, so that the position of the primer was changed to balance with another set. As a result, in the present invention, it is possible to obtain an amplification product of 256-332 bp in which the amplification product size of about 38 bp is reduced. This makes the 17 multiplex system of the present invention newly made into a multiplex system having a PCR amplification product size range of at least 96 bp up to 357 bp.

3. 바람직하게는 상기 프라이머의 각 쌍들은, 3. Preferably each pair of primers

D2S1371 좌위의 경우 역방향 프라이머인 서열 2의 5'말단에 형광 염료가 라벨링 되고; For the D2S1371 locus a fluorescent dye is labeled at the 5 'end of SEQ ID NO: 2, which is the reverse primer;

D8S1477 좌위의 경우 정방향 프라이머인 서열 3의 5'말단에 형광 염료가 라벨링 되고; For the D8S1477 locus a fluorescent dye is labeled at the 5 'end of SEQ ID NO: 3, which is a forward primer;

D12S391 좌위의 경우 정방향 프라이머인 서열 5의 5'말단에 형광 염료가 라벨링 되고; For the D12S391 locus a fluorescent dye is labeled at the 5 'end of SEQ ID NO: 5, which is a forward primer;

D20S470 좌위의 경우 역방향 프라이머인 서열 8의 5'말단에 형광 염료가 라벨링 되고; For the D20S470 locus a fluorescent dye is labeled at the 5 'end of SEQ ID NO: 8 which is the reverse primer;

D6S1043 좌위의 경우 정방향 프라이머인 서열 9의 5'말단에 형광 염료가 라벨링 되고; For the D6S1043 locus a fluorescent dye is labeled at the 5 'end of SEQ ID NO: 9, which is a forward primer;

D9S925 좌위의 경우 정방향 프라이머인 서열 11의 5'말단에 형광 염료가 라벨링 되고; For the D9S925 locus a fluorescent dye is labeled at the 5 'end of SEQ ID NO: 11, which is a forward primer;

D7S821 좌위의 경우 정방향 프라이머인 서열 13의 5'말단에 형광 염료가 라벨링 되고; For the D7S821 locus a fluorescent dye is labeled at the 5 'end of SEQ ID NO: 13 which is a forward primer;

D4S2368 좌위의 경우 정방향 프라이머인 서열 15의 5'말단에 형광 염료가 라벨링 되고; For the D4S2368 locus a fluorescent dye is labeled at the 5 'end of SEQ ID NO: 15, which is a forward primer;

D5S818 좌위의 경우 정방향 프라이머인 서열 17의 5'말단에 형광 염료가 라벨링 되고; For the D5S818 locus a fluorescent dye is labeled at the 5 'end of SEQ ID NO: 17, which is a forward primer;

D13S317 좌위의 경우 정방향 프라이머인 서열의 5'말단에 형광 염료가 라벨링 되고; For the D13S317 locus a fluorescent dye is labeled at the 5 'end of the sequence that is the forward primer;

D19S253 좌위의 경우 정방향 프라이머인 서열 21의 5'말단에 형광 염료가 라벨링 되고; For the D19S253 locus a fluorescent dye is labeled at the 5 'end of SEQ ID NO: 21, which is a forward primer;

D3S2406 좌위의 경우 정방향 프라이머인 서열 23의 5'말단에 형광 염료가 라벨링 되고; For the D3S2406 locus a fluorescent dye is labeled at the 5 'end of SEQ ID NO: 23 which is a forward primer;

D1S1612 좌위의 경우 정방향 프라이머인 서열 25의 5'말단에 형광 염료가 라벨링 되고; For the D1S1612 locus a fluorescent dye is labeled at the 5 'end of SEQ ID NO: 25, which is a forward primer;

D15S659 좌위의 경우 정방향 프라이머인 서열 27의 5'말단에 형광 염료가 라벨링 되고; For the D15S659 locus a fluorescent dye is labeled at the 5 'end of SEQ ID NO: 27 which is a forward primer;

아멜로게닌 좌위의 경우 정방향 프라이머인 서열 29의 5'말단에 형광 염료가 라벨링 되고; A fluorescent dye is labeled at the 5 'end of SEQ ID NO: 29, which is the forward primer for the amegenin locus;

D11S1978 좌위의 경우 정방향 프라이머인 서열 31의 5'말단에 형광 염료가 라벨링 되고; ; 그리고The fluorescent dye is labeled at the 5 'end of SEQ ID NO: 31, which is the forward primer for the D11S1978 locus; ; And

D22S691 좌위의 경우 정방향 프라이머인 서열 33의 5'말단에 형광 염료가 라벨링 된다.
In the case of the D22S691 locus, a fluorescent dye is labeled at the 5 'end of SEQ ID NO: 33, which is a forward primer.

본 발명자는 모든 프라이머의 정방향 5’위치에 형광 색소로 라벨링 하는 경우 D2S1371과 D20S470 유전좌위에서 PCR 효율이 저하되는 현상을 보인다는 것을 발견하였다. 그 원인을 해결하고자 프라이머의 양을 조절하거나, PCR 사이클 조건을 변화시켜 보았으나 문제점을 개선할 수 없었지만, 결과적으로 두 유전좌위의 역방향 프라이머에 형광색소 라벨링하는 방법으로 문제를 해결할 수 있었다. The present inventors found that the PCR efficiency was reduced in the D2S1371 and D20S470 loci when labeled with fluorescent dyes at 5 ′ positions of all primers. In order to solve the cause, the amount of the primer was adjusted or the PCR cycle conditions were changed, but the problem could not be solved. However, it was possible to solve the problem by labeling fluorescent dyes on the reverse primers of the two loci.

또한, 여기서 각 프라이머의 라벨링에 사용되는 형광 염료는 각각 서로 독립적으로 동일하거나 상이할 수 있다.
In addition, the fluorescent dyes used for labeling each primer may be the same or different from each other independently of each other.

4. 일 실시 태양에 있어서, 본 발명에서 사용된 프라이머의 라벨링에 있어서는, 4. In one embodiment, in the labeling of the primers used in the present invention,

상기 D2S1371, D8S1477, D12S391, D20S470, D6S1043, D9S925, D7S821, D4S2368, D5S818, D13S317, D19S253, D3S2406, D1S1612, D15S659, D11S1978 및 D22S691의 16개의 STR 유전좌위들 및 아멜로게닌 (Amelogenin) 좌위를 포함하는 유전좌위 세트를 둘 이상의 그룹으로 나누어 각 그룹별로 서로 상이한 형광 염료를 사용하여 각 서열에 대응되는 프라이머를 라벨링 할 수 있다.
The 16th STRogen loci containing the mutogen loci of the D2S1371, D8S1477, D12S391, D20S470, D6S1043, D9S925, D7S821, D4S2368, D5S818, D13S317, D19S253, D3S2406, D1S1612, D15S659, D11S1978 and D22S691. By dividing the set of loci into two or more groups, different groups of fluorescent dyes can be used to label primers corresponding to each sequence.

5. 바람직하게는, 본 발명에서 사용된 프라이머의 라벨링에 있어서는, 5. Preferably, in the labeling of the primers used in the present invention,

D2S1371, D8S1477, D12S391 및 D20S470 좌위의 경우 제 1 형광 염료가 사용되고; A first fluorescent dye is used for the D2S1371, D8S1477, D12S391 and D20S470 loci;

D6S1043, D9S925, D7S821 및 D4S2368 좌위의 경우 제 2 형광 염료가 사용되고; A second fluorescent dye is used for D6S1043, D9S925, D7S821 and D4S2368 loci;

D5S818, D13S317, D19S253 및 D3S2406 좌위의 경우 제 3 형광 염료가 사용되고; 그리고A third fluorescent dye is used for D5S818, D13S317, D19S253 and D3S2406 loci; And

D1S1612, D15S659, 아멜로게닌, D11S1978 및 D22S691 좌위의 경우 제 4 형광 염료가 라벨링 되며, For the D1S1612, D15S659, Amelogenin, D11S1978, and D22S691 loci, the fourth fluorescent dye is labeled,

여기서 제 1 형광 염료, 제 2 형광 염료, 제 3 형광 염료 및 제 4 형광 염료는 각각 서로 독립적으로 동일하거나 상이할 수 있다.
Here, the first fluorescent dye, the second fluorescent dye, the third fluorescent dye and the fourth fluorescent dye may be the same as or different from each other independently.

6. 상기 제 1 형광 염료, 상기 제 2 형광 염료, 상기 제 3 형광 염료 및 상기 제 4 형광 염료는 각각 서로 독립적으로 6-FAM, VIC^®, NED^® 및 PET^®로 구성된 그룹에서 선택되는 것이 바람직하다.
6. The first fluorescent dye, the second fluorescent dye, the third fluorescent dye and the fourth fluorescent dye are each independently selected from the group consisting of 6-FAM, VIC ^® , NED ^® and PET ^® . Do.

7. 또한, 본 발명에서 7. In addition, in the present invention

상기 제 1 형광 염료는 6-FAM; The first fluorescent dye is 6-FAM;

상기 제 2 형광 염료는 VIC^®; The second fluorescent dye is VIC ^® ;

상기 제 3 형광 염료는 NED^®; 그리고 The third fluorescent dye is NED ^® ; And

상기 제 4 형광 염료는 PET^®로 하는 것이 바람직하다.
It said fourth fluorescent dye is preferably in the PET ^®.

본 발명에서는 프라이머의 안정성과 대립유전자의 증폭량 정도를 고려하여 형광색소를 선택하였다. 그 결과 안정적이고 피크 강도가 높은 6-FAM(blue) 형광색소를 D2S1371, D8S1477, D12S391 및 D20S470 좌위의 프라이머에 라벨링 하고, 차례로 VIC^®(green) 형광색소를 D6S1043, D9S925, D7S821 및 D4S2368 좌위에, NED^®(yellow) 형광색소를 D5S818, D13S317, D19S253 및 D3S2406 좌위의 프라이머에, 그리고 PET^® 형광 색소를 D1S1612, D15S659, 아멜로게닌, D11S1978 및 D22S691 프라이머에 라벨링 하는 것이 바람직하다.
In the present invention, the fluorescent dye was selected in consideration of the stability of the primer and the amplification amount of the allele. As a result, the stable and high peak intensity 6-FAM (blue) fluorescent dyes were labeled on the primers of the D2S1371, D8S1477, D12S391 and D20S470 loci, and the VIC ^® (green) fluorescent dyes were in turn placed on the D6S1043, D9S925, D7S821 and D4S2368 loci, It is desirable to label the NED ^® (yellow) fluorescent dyes with primers at the D5S818, D13S317, D19S253 and D3S2406 loci, and the PET ^® fluorescent dyes with D1S1612, D15S659, amelogenin, D11S1978 and D22S691 primers.

8. 본 발명에서 최종 농도 기준으로 각 유전좌위 별 프라이머의 최적 농도는 아래와 같다. : 8. In the present invention, the optimal concentration of each locus primer based on the final concentration is as follows. :

D2S1371 좌위의 경우 0.50μM;0.50 μM for D2S1371 locus;

D8S1477 좌위의 경우 0.15μM;0.15 μM for D8S1477 locus;

D12S391 좌위의 경우 0.07μM;0.07 μM for D12S391 locus;

D20S470 좌위의 경우 1.50μM;1.50 μM for the D20S470 locus;

D6S1043 좌위의 경우 0.125μM;0.125 μM for D6S1043 locus;

D9S925 좌위의 경우 0.25μM;0.25 μM for D9S925 locus;

D7S821 좌위의 경우 0.10μM;0.10 μM for D7S821 locus;

D4S2368 좌위의 경우 0.20μM;0.20 μM for D4S2368 locus;

D5S818 좌위의 경우 0.20μM;0.20 μM for the D5S818 locus;

D13S317 좌위의 경우 0.20μM;0.20 μM for D13S317 locus;

D19S253 좌위의 경우 0.07μM;0.07 μM for D19S253 locus;

D3S2406 좌위의 경우 0.60μM;0.60 μM for the D3S2406 locus;

D1S1612 좌위의 경우 0.4μM;0.4 μM for D1S1612 locus;

D15S659 좌위의 경우 0.65μM; 0.65 μM for the D15S659 locus;

아멜로게닌 좌위의 경우 0.15μM;0.15 μM for the amellogenin locus;

D11S1978 좌위의 경우 0.175μM; 그리고0.175 μM for D11S1978 locus; And

D22S691 좌위의 경우 0.2μM의 농도로 사용되는 것이 바람직하다.
In the case of the D22S691 locus, it is preferably used at a concentration of 0.2 μM.

본 발명에서 사용된 프라이머의 양은 전체 유전좌위간의 피크 높이 균형(peak height balance)과 각 색소 세트간의 균형을 고려하여 최적의 농도 조건을 결정하였다. 또한, 각 프라이머의 부피가 많게 되면 분석될 DNA 샘플 부피에 영향을 끼칠 수 있다.
The amount of primer used in the present invention was determined in consideration of the peak height balance between the entire locus and the balance between each pigment set to determine the optimal concentration conditions. In addition, increasing the volume of each primer can affect the volume of the DNA sample to be analyzed.

9. 바람직하게는, 본원 발명에서 증폭된 대립 유전자들을 평가하고, 이를 통해 각각의 대립유전자형을 결정하는 단계에서는 다음을 포함하는 래더 템플레이트를 사용할 수 있다. : 9. Preferably, in the step of evaluating the alleles amplified in the present invention and determining each allele type, a ladder template comprising the following may be used. :

상기 D2S1371 유전좌위에 대하여 TCTA를 반복단위로 하여 9번 내지 17번 반복된 형태의 9가지의 대립유전자들, 9 alleles of the 9 th to 17 th repeats with TCTA as the repeating unit for the D2S1371 locus,

상기 D8S1477 유전좌위에 대하여 CCTT를 반복단위로 하여 11번 내지 21번 반복된 형태의 11가지의 대립유전자들, 11 alleles of the 11 th to 21 th repeats with CCTT as the repeating unit for the D8S1477 locus,

상기 D12S391 유전좌위에 대하여 (AGAT)l(AGAC)m(AGAT)n [여기서 l+m+n은 14~17, 17.2 또는 18-27임]를 반복단위로 하는 15가지의 대립유전자들, 15 alleles with repeating units (AGAT) l (AGAC) m (AGAT) n [where l + m + n is 14-17, 17.2 or 18-27] for the D12S391 locus,

상기 D20S470 유전좌위에 대하여 CCTT를 반복단위로 하여 7번 내지 21번 반복된 형태의 15가지의 대립유전자들, 15 alleles of the form 7 to 21 times repeated with CCTT as the repeating unit for the D20S470 locus,

상기 D6S1043 유전좌위에 대하여 AGAT를 반복단위로 9번 반복에서 23번 반복된 형태의 15가지의 대립유전자들, 15 alleles in the form of repeating AGAT in 9 repeats 23 times for the D6S1043 locus,

상기 D9S925 유전좌위에 대하여 ATAG를 반복단위로 12번 내지 20번 반복된 형태의　 9가지의 대립유전자들, 9 alleles in the form of repeating ATAG 12 to 20 times with respect to the D9S925 locus,

상기 D7S821 유전좌위에 대하여 (TGTC)l(TATC)m [여기서 l+m은 11~20임]를 반복단위로 하는 10가지의 대립유전자들, 10 alleles with repeating units of (TGTC) l (TATC) m (where l + m is 11-20) for the D7S821 locus,

상기 D4S2368 유전좌위에 대하여 CTAT을 반복단위로 8번 내지 14번 반복된 형태의 7가지의 대립유전자들, 7 alleles in the form of repeating CTAT 8 to 14 times with respect to the D4S2368 locus,

상기 D5S818 유전좌위에 대하여 GATA를 반복단위로 하여 7번 내지 15번 반복된 형태의 9가지의 대립유전자들, 9 alleles of the form repeated 7 to 15 times using GATA as a repeating unit for the D5S818 locus,

상기 D13S317 유전좌위에 대하여 TATC를 반복단위로 8번 내지 14번 반복된 형태의 7개의 대립유전자들, Seven alleles of the form repeating TATC 8 to 14 times in the D13S317 locus,

상기 D19S253 유전좌위에 대하여 ATAG를 반복단위로 하여 7번 내지 15번 반복된 형태의 9개의 대립유전자들, 9 alleles of a form repeated 7 to 15 times using ATAG as a repeating unit for the D19S253 locus,

상기 D3S2406 유전좌위에 대하여 (TATC)l(TGTC)m(CGTC)n(CATC)o [여기서 l+m+n+o은 27~46이며, l,m,n,o 중 어느 하나가 ‘0’인 경우도 존재함]를 반복단위로 하는 20가지의 대립유전자들, (TATC) l (TGTC) m (CGTC) n (CATC) o for the D3S2406 locus, wherein l + m + n + o is 27 to 46, and any one of l, m, n, o is 0 20 alleles with repeating units,

상기 D1S1612 유전좌위에 대하여 TTCC를 반복단위로 하여 10번 내지 18반복된 형태의 9가지의 대립유전자들, 9 alleles of 10 to 18 repeated forms with TTCC as repeat units for the D1S1612 locus,

상기 D15S659 유전좌위에 대하여 GATA를 반복단위로 하여 7번 내지 8번 또는 10번 내지 19반복된 형태의　 12가지의 대립유전자들, 12 alleles of the 7 th to 8 th or 10 th to 19 th repeats with GATA as a repeating unit for the D15S659 locus,

상기 D11S1978 유전좌위에 대하여 (GATA)n [여기서 n은 9~14] 또는 (GATA)n GAT [여기서 n은 14~18임]를 반복단위로 하는 11가지의 대립유전자들, 그리고 11 alleles with repeating units (GATA) n [where n is 9-14] or (GATA) n GAT [where n is 14-18] for the D11S1978 locus, and

상기 D22S691 유전좌위에 대하여　 TCTA를 반복단위로 하여 9번 내지 15번 또는 17번 반복된 형태의 8가지의 대립유전자들.
Eight alleles of the type 9 to 15 or 17 times repeated with TCTA as the repeating unit for the D22S691 locus.

10. 본원 발명의 일 실시 태양에 있어서, 분석 대상이 되는 DNA 시료는, D2S1371, D8S1477, D12S391, D20S470, D6S1043, D9S925, D7S821, D4S2368, D5S818, D13S317, D19S253, D3S2406, D1S1612, D15S659, D11S1978, D22S691 및 아멜로게닌 (Amelogenin) 좌위들만으로 구성된 총 17 유전좌위 세트에서 각각의 유전좌위에 대응되는, 프라이머들 및 형광물질로 표지된 프라이머들을 포함하는 복합 증폭 시스템을 사용하여 동시에 증폭될 수도 있다.
10. In one embodiment of the present invention, the DNA sample to be analyzed is D2S1371, D8S1477, D12S391, D20S470, D6S1043, D9S925, D7S821, D4S2368, D5S818, D13S317, D19S253, D3S2406, D1S1612, D69S659, D151978, D15S659. And amplification systems using a complex amplification system comprising primers and primers labeled with fluorescent substances corresponding to each locus in a total of 17 locus sets consisting of only amelogenin loci.

11. 본원 발명은 또한 D2S1371, D8S1477, D12S391, D20S470, D6S1043, D9S925, D7S821, D4S2368, D5S818, D13S317, D19S253, D3S2406, D1S1612, D15S659, D11S1978 및 D22S691의 16개의 STR 유전좌위들 및 아멜로게닌 (Amelogenin) 좌위를 포함하는 유전좌위 세트의 각각의 유전좌위에 대응되는 프라이머들 및 형광물질로 표지된 프라이머들을 포함하는 용기; 그리고 상기 유전좌위 세트의 각각의 대립유전자들을 포함하는 래더 템플레이트 또는 이의 PCR 증폭 산물을 포함하는 용기를 포함하며, 유전좌위 세트를 동시에 증폭 및 분석하는데 사용하는 한국인 집단에서 변별력을 갖는 유전자 감식 키트를 제공한다. 11.The present invention also relates to D2S1371, D8S1477, D12S391, D20S470, D6S1043, D9S925, D7S821, D4S2368, D5S818, D13S317, D19S253, D3S2406, D1S1612, D15S659, D11S1978, and D22S691, and the amines of the Melaninin® Alinogenin® A container comprising primers corresponding to each locus of the set of loci comprising a locus and primers labeled with a fluorescent substance; And a container containing a ladder template containing each allele of the locus set or a PCR amplification product thereof, and providing a gene identification kit having discriminating power in a Korean population used to simultaneously amplify and analyze the locus set. do.

본원 발명의 상기 키트에 포함된 올리고뉴클레오티드 프라이머의 서열, 형광 물질 라벨링에 사용된 형광 염료의 종류, 위치 및 프라이머들의 농도, 그리고 상기 유전좌위 세트의 각각의 대립유전자들을 포함하는 래더 템플레이트 또는 이의 PCR 증폭 산물은 전술한 바와 같다. Ladder template or PCR amplification comprising the sequence of the oligonucleotide primers included in the kit of the present invention, the type, location and concentration of the fluorescent dyes used in the fluorescent material labeling, and alleles of each of the locus sets The product is as described above.

본원 발명의 유전자 감식 키트는 Taq 폴리머라제, 버퍼, 증폭 수율을 확인하기 위한 양성 대조군 DNA 등을 더 포함할 수 있다.
Gene identification kit of the present invention may further comprise a Taq polymerase, a buffer, a positive control DNA to confirm the amplification yield.

이상과 같은 본 발명의 구성에 따르면, 감정인력 및 분석에 사용되는 각종의 시약류의 절감 효과와 함께 유전자형 모세관 자동분석기의 가동을 최소화시켜 비용을 줄일 수 있으며, 특히 기존의 유전자 증폭 시스템의 단점이 보완되고 한국인 집단에서 변별력이 개선된 유전자 감식 방법이 제공된다. According to the configuration of the present invention as described above, it is possible to reduce the cost by minimizing the operation of the automatic genotype capillary analyzer with the effect of reducing the various types of reagents used for emotional personnel and analysis, in particular to compensate for the disadvantages of the existing gene amplification system And improved genetic discrimination in Korean population.

또한 예컨대 항구적으로 운영되어야 하는 범죄자 DNA 데이터베이스 등의 구축에 있어서도 정확도를 높이고 해외 의존도를 줄여 국가적으로 경제적인 면은 물론 신용도에도 기여할 수 있게 된다.
In addition, for example, it is possible to contribute to national economics and credit by increasing accuracy and reducing dependence on foreign countries, for example, in constructing criminal DNA databases that must be operated permanently.

도 1은 실시예 1 내지 3에 따라 래더 템플레이트를 증폭하고 증폭 샘플을 GeneMapper ID 소프트웨어로 분석한 결과를 도시한 것이다.
도 2는 실시예 1 내지 3에 따라 샘플 유전자를 증폭하고 GeneMapper ID 소프트웨어로 분석한 결과를 도시한 것이다.
도 3은 어플라이즈 바이오시스템즈 사(社) 제공의 007 DNA샘플 유전자를 증폭하고 GeneMapper ID 소프트웨어로 분석한 결과를 도시한 것이다. 1 shows the results of amplifying the ladder template and analyzing the amplified samples with GeneMapper ID software according to Examples 1-3.
Figure 2 shows the results of amplifying the sample gene and analyzed by GeneMapper ID software according to Examples 1 to 3.
Figure 3 shows the results of amplifying the 007 DNA sample gene provided by Applied Biosystems, Inc. and analyzed by GeneMapper ID software.

이하에서는 본 발명을 구현하고 있는 바람직한 실시예들 및 종래의 유전자 감식방법을 구현하고 있는 비교예를 통해 본 발명을 상세히 설명한다. 한편, 이하에서 설명되는 실시예들은 본 발명의 권리범위를 축소하거나 제한하고자 하는 것이아니며 본 발명의 특징을 보다 상세히 설명하기 위해 제시되는 것임을 밝혀둔다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail through preferred embodiments implementing the present invention and comparative examples implementing the conventional gene identification method. On the other hand, the embodiments described below are not intended to reduce or limit the scope of the present invention, it is to be noted that it is presented to explain the features of the present invention in more detail.

분석 대상이 되는 Subject to analysis DNADNA 샘플을 얻는 단계 Step to get a sample

가) (1) 혈액 200ul를 튜브에 취하였다.A) (1) 200ul of blood was taken to the tube.

나) (1) 타액이 묻은 면봉 중 솜 부분만을 절단하여 튜브에 모았다.B) (1) Only cotton part of cotton swab with saliva was cut and collected in the tube.

다) 각종 샘플들은 원심분리 튜브로 옮긴 후 완충액 ATL(QIAGEN) 180 ul와 프로테나아제(Proteinase) K 20ul, 8μl의 1M DTT(dithiothreitol) 시약를 첨가한 후 잘 섞어주고 56℃에서 세포 용해(lysis) 하였다. 이때 용해 시간은 보통 1~3 시간이면 적당하나 샘플에 따라 6~8 시간까지 늘렸다. 용해 중간에 용액을 가끔 섞어주며 용해 정도를 체크 하였다.C) Transfer samples to a centrifuge tube, add 180 μl of buffer ATL (QIAGEN) and 20 μl of Proteinase (Proteinase) K, 8 μl of 1M dithiothreitol (DTT) reagent, mix well, and lysis at 56 ° C. It was. At this time, the dissolution time is usually 1 to 3 hours, but was increased to 6 to 8 hours depending on the sample. The degree of dissolution was checked by occasionally mixing the solution in the middle of dissolution.

라) 용해가 완료되면 200ul 완충액 AL(QIAGEN)을 첨가하고 섞어주었다. 10분간 70℃에서 반응 시켰다. D) After lysis, 200ul buffer AL (QIAGEN) was added and mixed. The reaction was carried out at 70 ° C. for 10 minutes.

마) 100% 에탄올을 첨가하여 잘 섞어준 후 용액을 2ml 수집 튜브(collection tube)에 든 스핀 컬럼 (spin column)에 옮겼다.E) After adding 100% ethanol and mixing well, the solution was transferred to a spin column in a 2ml collection tube.

바) 8,000rpm에서 1분간 원심분리하여 밑의 수집 튜브로 분리된 용액을 버린다. 스핀 컬럼은 새 수집 튜브에 놓았다.F) Centrifuge for 1 minute at 8,000 rpm and discard the separated solution with the collection tube below. The spin column was placed in a new collection tube.

사) 완충액 AW1(QIAGEN) 500ul를 컬럼에 첨가하고 (바)의 과정을 반복하였다.G) 500 ul of buffer AW1 (QIAGEN) was added to the column and the procedure of (bar) was repeated.

아) 완충액 AW2(QIAGEN) 600ul를 첨가 후 14,000 rpm에서 1분간 원심분리 후, 추가로 3분간 원심분리 하였다. 스핀 컬럼을 조심스럽게 꺼내 용리(elution) 용 튜브에 옮겼다. A) After adding 600ul of buffer AW2 (QIAGEN), centrifuged at 14,000 rpm for 1 minute, and then centrifuged for 3 minutes. The spin column was carefully removed and transferred to an elution tube.

자) 완충액 AE(용리 완충액, QIAGEN) 50~100ul를 컬럼에 첨가하고 상온에 1분간 방치하였다. I) 50-100ul of buffer AE (elution buffer, QIAGEN) was added to the column and allowed to stand at room temperature for 1 minute.

차) 8,000 rpm에서 1분간 원심분리하여 튜브 밑으로 용리된 DNA 용액을 취하였다. E) Centrifuged for 1 minute at 8,000 rpm to take the DNA solution eluted under the tube.

하) 추출된 DNA 양을 정량하였다. H) The amount of extracted DNA was quantified.

* 또한, 위의 과정은 QIAcube(QIAGEN)라는 자동 DNA 추출장치를 사용할 수 있고, 장비 매뉴얼에 따라 이용 가능함.
* In addition, the above process can use an automatic DNA extraction device called QIAcube (QIAGEN), which can be used according to the equipment manual.

D2S1371D2S1371 , , D8S1477D8S1477 , , D12S391D12S391 , , D20S470D20S470 , , D6S1043D6S1043 , , D9S925D9S925 , , D7S821D7S821 , , D4S2368D4S2368 , D5S818, , D5S818, D13S317D13S317 , , D19S253D19S253 , , D3S2406D3S2406 , , D1S1612D1S1612 , , D15S659D15S659 , , 아멜로게닌Amelogenin ( ( AmelogeninAmelogenin ), D11S1978 및 ), D11S1978, and D22S691D22S691 의 16개의 Of 16 STRSTR 유전좌위Genetic locus 및 And 아멜로게닌Amelogenin 좌위로To the left 구성된 17 Configured 17 유전heredity 좌위들에 각각 대응되는, 형광물질로 With corresponding phosphors, respectively 표지된Labeled 프라이머들을Primers 포함하는 17 멀티플렉스 (Q17) 17 multiplexes included (Q17) PCRPCR 시스템을 사용하여 Using the system DNADNA 샘플 내 서열을 The sequence in the sample PCRPCR 증폭하는 단계 Step of amplification

1. 마스터 혼합물(1. Master mixture ( MasterMaster mixmix )의 제조Manufacturing

가. end. 샘플 당Per sample 반응 혼합물 (10 μl 기준) Reaction mixture (based on 10 μl)

(1) 시료 DNA 0.5~1 ng (1) 0.5-1 ng of sample DNA

(DNA의 상태에 따라 증감) (Depending on the condition of the DNA)

(2) Gold STR 10x 완충액 (promega) 1 μl(2) 1 μl Gold STR 10x buffer (promega)

(3) 10 x Q 17 프라이머 세트 1 μl (3) 1 μl of 10 x Q 17 primer set

(4) AmpliTaq Gold DNA 폴리머라아제 0.2 μl (4) 0.2 μl AmpliTaq Gold DNA Polymerase

(5units/μl,ABI) (5 units / μl, ABI)

(5) D.W 나머지(5) D.W rest

(시료 DNA + D.W.= 7.8μl)
(Sample DNA + DW = 7.8 μl)

나. I. 래더(ladder)의Of the ladder 증폭 (10 μl 기준) Amplification (10 μl standard)

Q17의 래더 템플레이트(template)를 1/10의 비율로 연속 희석하여 1/10000의 배수로 희석된 샘플을 래더 템플레이트로 정하였다. PCR 반응 혼합물의 조건은 아래와 같았다.The ladder template of Q17 was serially diluted at the rate of 1/10 to determine the sample diluted in multiples of 1/10000 as the ladder template. The conditions of the PCR reaction mixture were as follows.

(1) 래더 템플레이트(10^-4) 4 μl(1) Ladder template (10 ^-4 ) 4 μl

(2) 10 X PCR 반응 혼합물 1 μl(2) 1 μl of 10 X PCR reaction mixture

(3) 10 X 프라이머 세트 1 μl (3) 1 μl of 10 X primer set

(4) AmpliTaq Gold DNA 폴리머라아제(4) AmpliTaq Gold DNA Polymerase

(5 units/μl) 0.4 μl(2 Unit) (5 units / μl) 0.4 μl (2 Unit)

(5) D.W 나머지(3.8μl)
(5) DW remainder (3.8μl)

프라이머의 제조(최종 농도 기준)Preparation of the primer (based on final concentration) 유전좌위Genetic locus 서열번호SEQ ID NO:
프라이머primer 방향 direction 형광 염료로 With fluorescent dye 라벨된Labeled /Of 라벨되지Not labeled 않은 Not
프라이머primer 서열 order 프라이머primer
최종 농도Final concentration D2S1371D2S1371 1 정방향
2 역방향 1 forward
2 reverse 5'-TAACACAAGTTGGGGGAAGCAT-3'
5'-[6- FAM ]-GATAGCAAGAAGGGCTTTCC-3' 5'-TAACACAAGTTGGGGGAAGCAT-3 '
5 '-[6- FAM ] -GATAGCAAGAAGGGCTTTCC-3' 0.50uM0.50 uM D8S1477D8S1477 3 정방향
4 역방향3 forward
4 reverse 5'-[6- FAM ]-AGCAAACTTCATCCACTTGG-3'
5'-TTCCTGTCCTCTAATGTAACTTACC-3 5 '-[6- FAM ] -AGCAAACTTCATCCACTTGG-3'
5'-TTCCTGTCCTCTAATGTAACTTACC-3 0.15uM0.15 uM D12S391D12S391 5 정방향
6 역방향5 forward
6 reverse 5'-[6- FAM ]-AACAGGATCAATGGATGCAT-3'
5'-TGGCTTTTAGACCTGGACTG-3' 5 '-[6- FAM ] -AACAGGATCAATGGATGCAT-3'
5'-TGGCTTTTAGACCTGGACTG-3 ' 0.07uM0.07 uM D20S470D20S470 7 정방향
8 역방향 7 forward
8 reverse 5'-CCTTGGGGGATATAGCCTAA-3'
5'-[6- FAM ]-TGAGTGACAGAGTGATACCATG-3'5'-CCTTGGGGGATATAGCCTAA-3 '
5 '-[6- FAM ] -TGAGTGACAGAGTGATACCATG-3' 1.50uM1.50 uM D6S1043D6S1043 9 정방향
10 역방향9 forward
10 reverse 5'-[ VIC ]-CAAGGATGGGTGGATCAATA-3'
5'-TTGTATGAGCCACTTCCCAT-3' 5 '-[ VIC ] -CAAGGATGGGTGGATCAATA-3'
5'-TTGTATGAGCCACTTCCCAT-3 ' 0.125uM0.125 uM D9S925D9S925 11 정방향
12 역방향11 forward
12 reverse 5'-[ VIC ]-TGTGAGCCAAGGCCTTATAG-3'
5'-GTCTGGGTTCTCCAAAGAAA-3' 5 '-[ VIC ] -TGTGAGCCAAGGCCTTATAG-3'
5'-GTCTGGGTTCTCCAAAGAAA-3 ' 0.25uM0.25 uM D7S821D7S821 13 정방향
14 역방향13 forward
14 reverse 5'-[ VIC ]-ACAAAACCCCAAGTACGTGA-3'
5'-TATGACAGGCATCTGGGAGT-3' 5 '-[ VIC ] -ACAAAACCCCAAGTACGTGA-3'
5'-TATGACAGGCATCTGGGAGT-3 ' 0.10uM0.10 uM D4S2368D4S2368 15 정방향
16 역방향15 forward
16 reverse 5'-[ VIC ]-GAGCCAGACCTTGTCTCAAA-3'
5'-AAGGGATTTTAGGAACTGATACG-3' 5 '-[ VIC ] -GAGCCAGACCTTGTCTCAAA-3'
5'-AAGGGATTTTAGGAACTGATACG-3 ' 0.20uM0.20 uM D5S818D5S818 17 정방향
18 역방향17 forward
18 reverse 5'-[ NED ]-GGGTGATTTTCCTCTTTGGT-3'
5'-TGATTCCAATCATAGCCACA-3' 5 '-[ NED ] -GGGTGATTTTCCTCTTTGGT-3'
5'-TGATTCCAATCATAGCCACA-3 ' 0.20uM0.20 uM D13S317D13S317 19 정방향
20 역방향19 forward
20 reverse 5'-[ NED ]-ACAGAAGTCTGGGATGTGGA-3'
5'-GCCCAAAAAGACAGACAGAA3' 5 '-[ NED ] -ACAGAAGTCTGGGATGTGGA-3'
5'-GCCCAAAAAGACAGACAGAA3 ' 0.20uM0.20 uM D19S253D19S253 21 정방향
22 역방향21 forward
22 reverse 5'-[ NED ]-ATAGACAGACAGACGGACTG-3'
5'-GGGAGTGGAGATTACCCCT-3' 5 '-[ NED ] -ATAGACAGACAGACGGACTG-3'
5'-GGGAGTGGAGATTACCCCT-3 ' 0.07uM0.07 uM D3S2406D3S2406 23 정방향
24 역방향23 forward
24 reverse 5'-[ NED ]-AGATAGCCTTTACAGTCACA-3'
5'-AAGTCAGTCACCATGCAAAAAGTA-3' 5 '-[ NED ] -AGATAGCCTTTACAGTCACA-3'
5'-AAGTCAGTCACCATGCAAAAAGTA-3 ' 0.60uM0.60 uM D1S1612D1S1612 25 정방향
26 역방향25 forward
26 reverse 5'-[ PET ]-TCCCATGCCAAAATTCTTAG-3'
5'-GAAAGAAAGAGAAAGAAGGAAGG-3' 5 '-[ PET ] -TCCCATGCCAAAATTCTTAG-3'
5'-GAAAGAAAGAGAAAGAAGGAAGG-3 ' 0.4uM0.4 uM D15S659D15S659 27 정방향
28 역방향27 forward
28 reverse 5'-[ PET ]-GTGGATAGACACATGACAGATAGG-3'
5'-TATTTGGCAAGGATAGATACAGG-3' 5 '-[ PET ] -GTGGATAGACACATGACAGATAGG-3'
5'-TATTTGGCAAGGATAGATACAGG-3 ' 0.65uM0.65 uM 아멜로게닌
(Amelogenin ) Amelogenin
( Amelogenin ) 29 정방향
30 역방향29 forward
30 reverse 5'-[ PET ]-ACCACCTCATCCTGGGCACC-3'
5'-ACACAGGCTTGAGGCCAACCA-3' 5 '-[ PET ] -ACCACCTCATCCTGGGCACC-3'
5'-ACACAGGCTTGAGGCCAACCA-3 ' 0.15uM0.15 uM D11S1978D11S1978 31 정방향
32 역방향31 forward
32 reverse 5'-[ PET ]-CAT CAT CTG CAC TCC ACA AA-3'
5'-TGT CCA TCG ACA GAT GAA TG-3' 5 '-[ PET ] -CAT CAT CTG CAC TCC ACA AA-3'
5'-TGT CCA TCG ACA GAT GAA TG-3 ' 0.175uM0.175uM D22S691D22S691 33 정방향
34 역방향33 forward
34 reverse 5'-[ PET ]-TGG TCT CTT CCT CAT AAC GAC-3'
5'-TGG GGG AGT CTT TGT GTG ATT-3' 5 '-[ PET ] -TGG TCT CTT CCT CAT AAC GAC-3'
5'-TGG GGG AGT CTT TGT GTG ATT-3 ' 0.2 uM0.2 uM

2. 온도 사이클(2. Temperature cycle ( ThermalThermal CyclingCycling ) )

PTC-220 DNA Engine Dyad Peltier Thermal Cycler (MJ Research) 사용
Using PTC-220 DNA Engine Dyad Peltier Thermal Cycler (MJ Research)

가. 온도 사이클 조건end. Temperature cycle conditions

(1) 초기 배양(Initial incubation) : 95℃ 11분(1) Initial incubation: 95 ℃ 11 minutes

(2) 사이클링: 28 사이클 (래더는 16 사이클)(2) Cycling: 28 cycles (16 cycles for ladder)

(3) 94℃ 1분 → 59℃ 1분 → 72℃ 1분 (3) 94 ° C 1 minute → 59 ° C 1 minute → 72 ° C 1 minute

(4) 최종 연장(Final Extension): 60℃ 60 분(4) Final Extension: 60 ℃ 60 minutes

(5) 냉각(Chilling): 4℃ 지속(Forever)
(5) Chilling: 4 ° C Forever

증폭된 산물을 전기영동을 통하여 분리하여 검출함으로써 증폭된 대립 유전자들을 평가하고, 이를 통해 샘플 내의 각각의 유전자형들을 결정하는 단계Evaluating the amplified alleles by separating and detecting the amplified products by electrophoresis, thereby determining respective genotypes in the sample

1. One. 장비명Equipment name : :

3100-Avant Genetic Analyzer(4-capillary)3100-Avant Genetic Analyzer (4-capillary)

3130xl Genetic Analyzer(16-capillary) , 어플라이드 바이오시스템즈 社.
3130 xl Genetic Analyzer (16-capillary), Applied Biosystems.

2. 런(2. Run RunRun ) 샘플의 준비A) preparation of samples

가. 10개의 샘플을 위한 마스터 혼합물의 제조시 120μl의 Hi-Di Formamide(어플라이드 바이오시스템즈 社)에 1.5μl의 500-Liz(어플라이드 바이오시스템즈 社) 사이즈 표준(size Standard)을 섞고 볼텍싱(vortexing) 하였다.end. In preparation of the master mixture for 10 samples, 1.5 μl of 500-Liz (Applied Biosystems) size standard was mixed and vortexed into 120 μl of Hi-Di Formamide (Applied Biosystems).

나. 옵티컬 96 웰(well) 플레이트에 12μl 씩 분주 하였다(각각 모세관의 수에 맞게 채움).I. 12 μl aliquots were dispensed into optical 96 well plates (each filled to the number of capillaries).

다. PCR 반응이 끝난 PCR 산물 1.5 μl 씩을 각 웰에 첨가하고 가볍게 혼합하였다.
All. 1.5 μl of each PCR product was added to each well and mixed lightly.

3. 유전자형 분석기( Genetic Analyzer )를 이용한 모세관( capillary type ) 전기영동 3. Genotype analyzer (Genetic Capillaries (capillary using the Analyzer) type ) Jeon Ki-dong

가. DS-33(어플라이드 바이오시스템즈 社) 매트릭스 표준(matrix standard)을 이용하여 5가지 형광 염료를 분석할 수 있는 G5 필터 세트로 주파수 보정(spectral calibration) 하였다.end. Using the DS-33 (Applied Biosystems) matrix standard, a spectral calibration was performed with a set of G5 filters capable of analyzing five fluorescent dyes.

나. 전기영동 조건은 36cm 모세관, POP4 폴리머(어플라이드 바이오시스템즈 社)를 이용하는 프로토콜을 선택하였다. I. The electrophoresis conditions were selected using a 36 cm capillary, POP4 polymer (Applied Biosystems).

다. 전기영동 후 원천 데이터가 저장될 결과 그룹(Result Group)을 정하였다.
All. After the electrophoresis, a result group for storing the source data was determined.

4. 유전자형 확인 프로그램을 이용한 데이터 분석4. Data analysis using genotyping program

가. GeneMapper ID 소프트웨어 ( 어플라이드 바이오시스템즈 社)에 의해 수행되는 작업의 요약
end. GeneMapper ID Software ( Applied A summary of the work performed by the Biosystems 社)

원천 데이터(.Source data (. fsafsa 파일) file)

↓↓

사이즈 콜링(Size calling ( sizesize callingcalling ))

* ↓ 피크 탐지, 사이즈 매칭(Matching), 사이징 커브(Sizing Curve)작성, 사이즈 특성(Size quality) 평가 * ↓ Peak detection, size matching, sizing curve creation, size quality evaluation

제노타이핑(Xeno Typing GenotypingGenotyping ))

↓ 빈 오프세팅(Bin Offsetting), 대립유전자 콜링(Allele Calling), 라벨 필터링(Label Filtering), 유전형 특성(Genptype quality) 평가 ↓ Bin Offsetting, Allele Calling, Label Filtering, Genptype Quality Assessment

플롯(Plots plotplot )과 테이블 생성) And create table

↓↓

결과를 "프로젝트(Results in "Project ( projectproject )"데이터베이스에 저장Save to database

나. 프로젝트 파일 만들기I. Create project file

(1) GeneMapper ID 소트프웨어를 연다. 비밀번호 입력(1) Open GeneMapper ID software. Enter Password

(2) 자동으로 새 프로젝트 화면이 뜨면, "File>Add sample to project"를 클릭하여 해당 결과 그룹(Result group)에 저장되어 있는 원천 데이터(Raw data)를 찾아 프로젝트에 추가하였다. (2) When the new project screen appears automatically, click "File> Add sample to project" to find the raw data stored in the result group and add it to the project.

(3) 샘플 파일을 분석하기 전에 소프트웨어에서 아래의 조건들을 설정하였다.(3) The following conditions were set in the software before analyzing the sample file.

- 샘플 종류(Sample Type) ; 래더, 대조군(control), 샘플 Sample Type; Ladder, Control, Sample

- 분석 방법(Analysis Method) ; HID, Q12 분석, Q17 분석, SNP 등Analysis Method; HID, Q12 analysis, Q17 analysis, SNP, etc.

- 패널(Panel) ; 래더내 좌위의 분포, 대립유전자의 크기 등에 대한 정보Panel; Information about the distribution of loci in the ladder, the size of alleles, etc.

- 사이즈 표준(Size standard) ; 사이즈 표준 종류에 따라 미리 만든 것 중에 선택.Size standard; Choose from pre-made according to the standard type.

↓↓

↓↓

↓↓

(4) 분석 조건의 선택이 완료되면 그린색 세모 버튼을 눌러 분석을 시작하고, 프로젝트 명칭(Project name)을 정하였다.(4) When the selection of the analysis conditions was completed, the analysis was started by pressing the green triangle button, and the project name was determined.

(5) 일단 분석이 완료되면 샘플들의 PQV(Process Quality value)와 SQ(Sizing Quality)를 확인하였다. 상태를 표시하는 플레그(Flag)가 녹색을 띠면 정상적으로 분석이 완료된 것이다. 노란색이나 빨간색으로 표시되면 원천 데이터와 사이즈 표준을 확인하여 문제점을 찾았다. (고농도 DNA, 스파이크(spike), 사이즈 표준(size standard) 불량, 풀업(Pull up) 등). SQ값이 낮으면 대립유전자 콜(Allele call)이 이루어지지 않기 때문이다.(5) Once the analysis was completed, the PQV (Process Quality Value) and SQ (Sizing Quality) of the samples were confirmed. If the flag indicating the status is green, the analysis is completed. If it is displayed in yellow or red, the source data and size standard were checked to find the problem. (High concentrations of DNA, spikes, poor size standards, pull ups, etc.). If the SQ value is low, allele calls are not made.

(6) 샘플 데이터를 보기 위해 툴바에 있는 아이콘

을 클릭하였다.(6) Icon on the toolbar to view the sample data

Clicked.

피크가 존재하는 유효 구간만 확대시키기 위해서는 마우스를 드래그하는 방식으로 구역을 정해 부분 확장하였다.In order to enlarge only the effective section in which the peak exists, the area is partially expanded by dragging the mouse.

(7) 래더와 샘플분석을 위한 패널(panel)과 빈(Bin)을 설정하였다. 이때 래더에 포함된 모든 대립유전자가 패널에 표시되어야 하며, 다양한 대립유전자들의 분석이 여러 조건에서 정확하게 분석 되도록 빈(Bin)값을 설정하여야 한다. (7) Panels and bins for ladder and sample analysis were set. At this time, all the alleles included in the ladder should be displayed on the panel, and the bin value should be set so that the analysis of various alleles can be accurately analyzed under various conditions.

각 좌위(패널)의 정상 빈(Bin)값 범위를 벗어나는 대립유전자에는 ‘OL' 메시지가 나타나므로 진정한 피크(real peak)인지, 풀-업(pull-up)에 의한 피크인지 확인하였다.
Alleles beyond the normal bin value range of each locus (panel) appear with an 'OL' message, so it was checked whether it was a real peak or a peak due to pull-up.

(8) 또한 샘플 데이터의 피크가 너무 낮아 랩(Lab)에서 디폴트(Default)로 정한 RF 값에서 검출(detection) 되지 않거나 너무 높은 RF 값인 경우 Analysis Method Editor-HID 에서 각 염료(Dye)에 따라 역치(Threshold) 값을 조절하여 선택한 샘플만 "Analysis>selected sample analysis"로 재분석하였다. (8) In addition, if the peak of the sample data is too low to be detected at the RF value set as the default in Lab or is too high, the threshold value according to each dye in the Analysis Method Editor-HID. Only the sample selected by adjusting the threshold value was reanalyzed by "Analysis> selected sample analysis".

한국인 집단에서의 변별력 검증Discrimination test in Korean group

본 발명의 한국인 집단에서의 변별력을 검증하기 위해서 D2S1371, D8S1477, D12S391, D20S470, D6S1043, D9S925, D7S821, D4S2368, D5S818, D13S317, D19S253, D3S2406, D1S1612, D15S659, D11S1978 및 D22S691 유전자좌 각각에 대한 한국인 집단 대립유전자 분포 데이터를 산출하였다. 이들 유전자좌의 변별력이나 다형성의 척도인 PI(Probability of Identity) 및 예측 이형접합성(Expected heterozygosity) 등은 하기 수학식 1 및 수학식 2에 의하여 산출하였다.D2S1371, D8S1477, D12S391, D20S470, D6S1043, D9S925, D7S821, D4S2368, D5S818, D13S317, D19S253, D3S2406, D1S1612, D15S659, D11S1978, and D1169, respectively. Gene distribution data was calculated. Probability of identity (PI) and predicted heterozygosity, which are the measures of discrimination or polymorphism of these loci, were calculated by the following equations (1) and (2).

여기서, qi는 예측 유전자형 빈도(expected genotype frequency)임. 예측 유전자형 빈도는 하아디 바인베르크 평형(Hardy-Weinberg Equilibrium) 유전법칙에 따라 각 대립유전자의 빈도로부터 계산된다.Where qi is the predicted genotype frequency. The predicted genotype frequency is calculated from the frequency of each allele according to the Hardy-Weinberg Equilibrium genetic law.

여기서, Pi는 각각의 대립유전자 빈도임.
Where Pi is the frequency of each allele.

또한, 유전자좌의 변별력의 척도인 PD(Power of Discrimination, 식별력)는 수학식 3에 의하여 산출하였다.In addition, PD (Power of Discrimination, Discriminant Power), which is a measure of the discrimination power of the loci, was calculated by Equation 3.

여기서, Pi: 예측 유전자형 빈도 (Fisher RA. Standard calculations for evaluating a blood group system, Heredity. 1951 vol5 p 95-102 참조)
Where Pi: predicted genotype frequency (see Fisher RA.Standard calculations for evaluating a blood group system, Heredity. 1951 vol5 p 95-102)

이하는 각 STR 유전좌위의 대립 유전자 분포로서, 한국인 400명을 조사한 결과이다. 대립유전자는 각 유전자형의 염기서열 분석(sequencing) 결과에서 확인 된 반복단위의 실제 반복 수에 따라 명명한다. The following is an allelic distribution of each STR locus, the result of a survey of 400 Koreans. Alleles are named according to the actual number of repetitions of the repeat units identified in each genotype sequencing.

이는 1993년 DNA Commission of the International Society of Forensic Haemogenetics (ISFH)에서 STR system의 반복염기서열횟수에 대한 명명법을 국제적으로 통일한 데에 따른 것이다. 위원회에서는 염기서열분석(Sequencing)을 통해 증폭 산물의 크기와 반복 단위를 확인하고, 유전자형(Allele No.)은 포함된 완전한 반복 단위(repeat)의 반복 횟수(n)에 의해 결정 한다는 내용을 정하였다. 반복 단위가 2개 이상으로 구성된 Complex 타입의 마커는 중심(core) 반복 단위를 염기서열 분석 결과로 확인 한 뒤, 각 중심 반복 단위의 합을 유전자형(Allele No.)으로 결정 하였다.This is due to the international coordination of the nomenclature for repetitive nucleotide sequences of the STR system by the DNA Commission of the International Society of Forensic Haemogenetics (ISFH) in 1993. The committee determined that the size and repeat units of the amplification products were determined by sequencing, and genotype (Allele No.) was determined by the number of repeats (n) of the complete repeats included. . Complex type markers composed of two or more repeat units were identified by genome sequence analysis of the core repeat unit, and the sum of each central repeat unit was determined as the genotype (Allele No.).

본원에서 사용된 래더에 포함된 각 기법의 대립유전자(allele)은 한국인 집단에서 빈번하게 관찰 되는 모든(대부분의) 대립 유전자를 포함하도록 구성하였으며, 모든 기법의 유전자형(allele no.)은 해당 기법에서 관찰되는 증폭 산물을 다양하게 선택하여 염기서열 분석(sequencing) 한 결과로부터 증폭 산물의 크기(bp) 및 중심 반복 단위와 반복 단위의 개수를 확인하고 아래와 같은 내용으로 결정하였다. 래더에 포함된 각 기법의 반복 단위와, 유전자형의 분포는 아래와 같다. Alleles of each technique included in the ladder used herein were constructed to include all (most) alleles frequently found in the Korean population, and allele nos. From the results of sequencing by selecting various amplification products observed, the size (bp) of the amplification products and the number of central repeat units and repeat units were determined and determined as follows. The repeat unit and genotype distribution of each technique included in the ladder are as follows.

조사된 집단의 증가로 인하여 한국특허출원공개 제1999-0064640호에 개시된 대립유전자 분포와 다소 차이가 있을 수 있으며, 다수를 대상으로 한 만큼 데이터의 정확성은 보다 높아졌다고 할 수 있다.
Due to the increase in the population examined, there may be a slight difference from the allele distribution disclosed in Korean Patent Application Publication No. 1999-0064640, and the accuracy of the data is higher as it is a large number.

1) D2S1371 유전좌위의 대립유전자 분포1) Allele distribution of the D2S1371 locus

D2S1371 유전좌위는 조사된 한국인 집단에서 9개의 대립유전자가 발견되었으며 이중 가장 작은 크기의 대립유전자는 96bp로 TCTA를 반복단위로 하여 9번 반복된 형태였다. In the D2S1371 locus, nine alleles were found in the investigated Korean population. The smallest allele was 96 bp, repeated 9 times using TCTA.

D2S1371 (TCTA)n 여기서 n은 9~17D2S1371 (TCTA) n where n is 9 to 17

대립유전자Allele 전체 횟수Total 빈도frequency 99 1One 0.001250.00125 1010 33 0.003750.00375 1111 8383 0.103750.10375 1212 200200 0.250.25 1313 214214 0.26750.2675 1414 199199 0.248750.24875 1515 8080 0.10.1 1616 1818 0.02250.0225 1717 22 0.00250.0025 총계sum 800800 1One

2) D8S1477 유전좌위의 대립유전자 분포2) Allele Distribution of the D8S1477 Locus

D8S1477 유전좌위는 조사된 한국인 집단에서 11개의 대립유전자가 발견되었으며 이 중 가장 작은 크기의 대립유전자는 150bp로 CCTT를 반복단위로 하여 11번 반복된 형태였다.In the D8S1477 locus, 11 alleles were found in the investigated Korean population. The smallest allele was 150 bp, repeated 11 times with CCTT as repeat unit.

D8S1477 (CCTT)n 여기서 n은 11~21D8S1477 (CCTT) n where n is 11 to 21

대립유전자Allele 전체 횟수Total 빈도frequency 1111 22 0.00250.0025 1212 44 0.0050.005 1313 3434 0.04250.0425 1414 132132 0.1650.165 1515 263263 0.328750.32875 1616 141141 0.176250.17625 1717 134134 0.16750.1675 1818 6161 0.076250.07625 1919 2323 0.028750.02875 2020 55 0.006250.00625 2121 1One 0.001250.00125 총계sum 800800 1One

3) D12S391 유전좌위의 대립유전자 분포3) Allele distribution at the locus of D12S391

D12S391 유전좌위는 조사된 한국인 집단에서 15개의 대립유전자가 발견되었으며 이중 217bp의 대립유전자는 (AGAT), (AGAC), (AGAT)를 반복단위로 하여 17번 반복된 형태였다. In the D12S391 locus, 15 alleles were found in the investigated Korean population. Of these, 217 bp alleles were repeated 17 times with (AGAT), (AGAC) and (AGAT) as repeat units.

D12S391 (AGAT)l(AGAC)m(AGAT)n 여기서 l+m+n은 14~17, 17.2, 18-27 [불완전 반복 단위가 중심 반복 단위 중간에 삽입된 경우에는 불완전 반복 단위의 염기의 개수를 세어 완전 반복 단위와 함께 표기하되 ‘.’로 구분하여 표기한다.(예, D12S391의 17.2 )]D12S391 (AGAT) l (AGAC) m (AGAT) n where l + m + n is 14 to 17, 17.2, 18-27 [number of bases of incomplete repeat units if incomplete repeat units are inserted in the middle of the central repeat units And count it with a complete repeating unit and separate it with '.' (Eg 17.2 of D12S391)

대립유전자Allele 전체 횟수Total 빈도frequency 1414 22 0.00250.0025 1515 1616 0.020.02 1616 22 0.00250.0025 1717 8888 0.110.11 17.217.2 1One 0.001250.00125 1818 213213 0.266250.26625 1919 148148 0.1850.185 2020 145145 0.181250.18125 2121 8080 0.10.1 2222 4949 0.061250.06125 2323 3030 0.03750.0375 2424 1919 0.023750.02375 2525 55 0.006250.00625 2626 1One 0.001250.00125 2727 1One 0.001250.00125 총계sum 800800 1One

4) D20S470 유전좌위의 대립유전자 분포4) Allele distribution of the D20S470 locus

D20S470 유전좌위는 조사된 한국인 집단에서 15개의 대립유전자가 밝혀졌으며 이 중 273bp의 대립유전자는 CCTT를 반복단위로 하여 8번 반복된 형태였다. The D20S470 locus was found to have 15 alleles in the Korean population examined, of which 273bp alleles were repeated eight times with CCTT as repeat units.

D20S470 (CCTT)n 여기서 n은 7~21D20S470 (CCTT) n where n is 7 ~ 21

대립유전자Allele 전체 횟수Total 빈도frequency 77 1One 0.001250.00125 88 22 0.00250.0025 99 2323 0.028750.02875 1010 8989 0.111250.11125 1111 2424 0.030.03 1212 3030 0.03750.0375 1313 9191 0.113750.11375 1414 129129 0.161250.16125 1515 118118 0.14750.1475 1616 148148 0.1850.185 1717 9393 0.116250.11625 1818 3636 0.0450.045 1919 1111 0.013750.01375 2020 44 0.0050.005 2121 1One 0.001250.00125 총계sum 800800 1One

5) D6S1043 유전좌위의 대립유전자 분포5) Allele distribution of the D6S1043 locus

D6S1043 유전좌위는 조사된 한국인 집단에서 15개의 대립유전자가 밝혀졌으며 그 반복단위는 (AGAT)의 염기서열을 기본단위로 9번 반복에서 23번 반복까지이며 가장 작은 대립유전자 9번은 그 크기가 98bp이며 가장 큰 대립유전자 23번은 154bp 이었다.The D6S1043 locus was identified with 15 alleles in the Korean population examined, and the repeating unit was the base unit of (AGAT) from 9 to 23 repetitions, and the smallest allele 9 was 98bp in size. The largest allele 23 was 154 bp.

D6S1043 (AGAT)n 여기서 n은 9~23D6S1043 (AGAT) n where n is 9 to 23

[단, D6S1043의 최대 대립유전자(n=23)는 도 1의 래더(ladder)에는 포함되어 있지 않으나, 아래의 변별력 계산에는 이를 반영하였다. 참고로 래더의 범위를 벗어나는 대립유전자가 발견되는 경우는 유전자형 분석 프로그램(GeneMapper ID)에서 증폭 산물의 크기가 측정되는 경우 인접한 대립유전자의 크기와 비교하여 결정하거나, 크기의 비교가 어려운 경우는 해당 기법 래더의 최저 크기보다 작은 유전자형은 ‘< n'로 표기하고, 최대 크기보다 큰 유전자형은 ’> n'으로 표기할 수 있다.][However, the maximum allele (n = 23) of the D6S1043 is not included in the ladder of FIG. 1, but this is reflected in the following discrimination force calculation. For reference, if an allele is found out of the ladder range, the size of the amplification product is determined by genotyping program (GeneMapper ID). Genotypes smaller than the minimum size of the ladder may be labeled '<n' and genotypes larger than the maximum size may be labeled as '> n'.]

대립유전자Allele 전체 횟수Total 빈도frequency 99 22 0.00250.0025 1010 2020 0.0250.025 1111 7979 0.098750.09875 1212 7979 0.098750.09875 1313 127127 0.158750.15875 1414 112112 0.140.14 1515 77 0.008750.00875 1616 77 0.008750.00875 1717 4444 0.0550.055 1818 148148 0.1850.185 1919 123123 0.153750.15375 2020 3838 0.04750.0475 2121 88 0.010.01 2222 55 0.006250.00625 2323 1One 0.001250.00125 총계sum 800800 1One

6) D9S925 유전좌위의 대립유전자 분포6) Allele distribution of the D9S925 locus

D9S925 유전좌위는 조사된 한국인 집단에서 총 9개의 대립유전자가 밝혀졌으며 그 반복단위는 (ATAG)의 염기서열을 기본단위로 12번 반복에서 20번 반복까지이다. 이들 대립유전자는 172bp 내지 204bp의 크기를 가지고 있었다.In the D9S925 locus, a total of nine alleles were identified in the investigated Korean population, and the repeat units ranged from 12 repeats to 20 repeats based on the base sequence of (ATAG). These alleles ranged in size from 172 bp to 204 bp.

D9S925 (ATAG)n 여기서 n은 12~20D9S925 (ATAG) n where n is 12 to 20

대립유전자Allele 전체 횟수Total 빈도frequency 1212 1One 0.001250.00125 1313 1616 0.020.02 1414 102102 0.12750.1275 1515 169169 0.211250.21125 1616 263263 0.328750.32875 1717 181181 0.226250.22625 1818 6565 0.081250.08125 1919 22 0.00250.0025 2020 1One 0.001250.00125 총계sum 800800 1One

7) D7S821 유전좌위의 대립유전자 분포7) Allele distribution of the D7S821 locus

D7S821 유전좌위는 조사된 한국인 집단에서 총 10개의 대립유전자가 밝혀졌으며 (TGTC)/(TATC)의 염기서열을 기본단위로 구성되어 있다. 가장 작은 대립유전자는 반복단위가 11회 반복되어 있었고, 이들 대립 유전자는 238bp 내지 274bp의 크기를 가지고 있었다.The D7S821 locus has been identified with a total of 10 alleles in the investigated Korean population and consists of the base sequence of (TGTC) / (TATC). The smallest allele had 11 repeats, and these alleles ranged in size from 238 bp to 274 bp.

D7S821 (TGTC)l(TATC)m 여기서 l+m은 11~20D7S821 (TGTC) l (TATC) m where l + m is 11-20

대립유전자Allele 전체 횟수Total 빈도frequency 1111 1One 0.001250.00125 1212 1212 0.0150.015 1313 7878 0.09750.0975 1414 4343 0.053750.05375 1515 149149 0.186250.18625 1616 219219 0.273750.27375 1717 189189 0.236250.23625 1818 8888 0.110.11 1919 1919 0.023750.02375 2020 22 0.00250.0025 총계sum 800800 1One

8) D4S2368 유전좌위의 대립유전자 분포8) Allele Distribution of the D4S2368 Locus

D4S2368 유전좌위는 조사된 한국인 집단에서 총 7개의 대립유전자가 밝혀졌으며 CTAT의 염기서열을 기본 단위로 구성되어 있다. 반복 염기단위가 8회 반복되어있는 대립유전자가 가장 작은 대립유전자였다. 이들 대립유전자는 306bp 내지 330bp의 크기를 가지고 있었다.In the D4S2368 locus, a total of seven alleles were identified in the investigated Korean population and consisted of the base sequence of CTAT. The allele with eight repeated base units was the smallest allele. These alleles ranged in size from 306 bp to 330 bp.

D4S2368 (CTAT)n 여기서 n은 8~14D4S2368 (CTAT) n where n is 8 to 14

대립유전자Allele 전체 횟수Total 빈도frequency 88 55 0.006250.00625 99 2828 0.0350.035 1010 129129 0.161250.16125 1111 358358 0.44750.4475 1212 236236 0.2950.295 1313 4141 0.051250.05125 1414 33 0.003750.00375 총계sum 800800 1One

9) D5S818 유전좌위의 대립유전자 분포9) Allele Distribution of the D5S818 Locus

D5S818 유전좌위는 조사된 한국인 집단에서 총 9개의 대립유전자가 발견되었는데 이중 가장 작은 크기의 대립유전자는 133bp로 GATA를 반복단위로 하여 7번 반복된 형태였다.A total of nine alleles were found in the D5S818 locus in the Korean population. The smallest allele was 133bp, repeated 7 times with GATA.

D5S818 (GATA)n 여기서 n은 7~15D5S818 (GATA) n where n is 7 to 15

대립유전자Allele 전체 횟수Total 빈도frequency 77 1212 0.0150.015 88 66 0.00750.0075 99 6666 0.08250.0825 1010 152152 0.190.19 1111 271271 0.338750.33875 1212 157157 0.196250.19625 1313 132132 0.1650.165 1414 33 0.003750.00375 1515 1One 0.001250.00125 총계sum 800800 1One

10) D13S317 유전좌위의 대립유전자 분포10) Allele distribution of the D13S317 locus

D13S317 유전좌위는 조사된 한국인 집단에서 총 7개의 대립유전자가 발견되었는데 이중 가장 작은 크기의 대립유전자는 173bp로 TATC를 반복단위로 하여 8번 반복된 형태였다. 염기서열이 밝혀진 대립유전자 모두는 TATC 반복단위 외에 AATC를 반복단위로 가지고 있었다. [예컨대, 어플라이드 바이오시스템즈 社의 키트와 같은 상업적 키트와 분석 결과의 일치성(concordance)을 대조하기 위하여 유전자형 명명 기준을 동일하게 적용하였다. 다만, 한국특허출원공개 제1999-0064640호에 기재된 D13S317 에 대한 대립 유전자의 명명 번호와는 -2 만큼의 차이가 있다. 즉 10번 유전자형은 본 명세서에서 8번으로 명명되었다.] In the D13S317 locus, a total of seven alleles were found in the investigated Korean population, of which the smallest allele was 173bp, repeated eight times using TATC. All of the alleles whose nucleotide sequences were identified had AATC as repeat units in addition to TATC repeat units. [For example, genotyping naming criteria were equally applied to compare the concordance of the results with commercial kits such as Applied Biosystems' kit. However, there is a difference of -2 from the naming number of the allele for D13S317 described in Korean Patent Application Publication No. 1999-0064640. Ie genotype 10 was designated as number 8 herein.]

D13S317 (TATC)n 여기서 n은 8~14
D13S317 (TATC) n where n is 8 to 14

대립유전자Allele 전체 횟수Total 빈도frequency 88 187187 0.233750.23375 99 108108 0.1350.135 1010 115115 0.143750.14375 1111 212212 0.2650.265 1212 141141 0.176250.17625 1313 2828 0.0350.035 1414 99 0.011250.01125 총계sum 800800 1One

11) D19S253 유전좌위의 대립유전자 분포11) Allele distribution of the D19S253 locus

D19S253 유전좌위는 조사된 한국인 집단에서 9개의 대립유전자가 발견되었는데 이 중 가장 작은 크기의 대립유전자는 209bp로 ATAG를 반복단위로 하여 7번 반복된 형태였다.In the D19S253 locus, nine alleles were found in the investigated Korean population. The smallest allele was 209bp, repeated seven times with ATAG repeating units.

D19S253 (ATAG)n 여기서 n은 7~15D19S253 (ATAG) n where n is 7 to 15

대립유전자Allele 전체 횟수Total 빈도frequency 77 126126 0.15750.1575 88 4444 0.0550.055 99 1010 0.01250.0125 1010 2424 0.030.03 1111 114114 0.14250.1425 1212 266266 0.33250.3325 1313 157157 0.196250.19625 1414 5151 0.063750.06375 1515 88 0.010.01 총계sum 800800 1One

12) D3S2406 유전좌위의 대립유전자 분포12) Allele distribution of the D3S2406 locus

D3S2406 유전좌위는 조사된 한국인 집단에서 20개의 대립유전자가 발견되었으며 이 중 가장 작은 크기의 대립유전자는 256bp로 TATC, TGTC, CGTC, CATC를 반복단위로 하여 27번 반복된 형태였다.In the D3S2406 locus, 20 alleles were found in the investigated Korean population, and the smallest allele was 256 bp, repeated 27 times using TATC, TGTC, CGTC, and CATC.

D3S2406 (TATC)l(TGTC)m(CGTC)n(CATC)o 여기서 l+m+n+o은 27~46D3S2406 (TATC) l (TGTC) m (CGTC) n (CATC) o where l + m + n + o is 27 to 46

[단, l,m,n,o 중 어느 하나가 ‘0’인 경우도 존재하며, 이때에는 반복 단위의 반복 횟수 합을 구하여 유전자형으로 결정한다.][However, there is a case where any one of l, m, n, o is '0', and in this case, the sum of the number of repetitions of the repeating units is determined to determine the genotype.]

대립유전자Allele 전체 횟수Total 빈도frequency 2727 1One 0.001250.00125 2828 33 0.003750.00375 2929 3333 0.041250.04125 3030 7070 0.08750.0875 3131 2121 0.026250.02625 3232 3030 0.03750.0375 3333 6161 0.076250.07625 3434 6868 0.0850.085 3535 5757 0.071250.07125 3636 5656 0.070.07 3737 8484 0.1050.105 3838 123123 0.153750.15375 3939 6868 0.0850.085 4040 4040 0.050.05 4141 3636 0.0450.045 4242 2424 0.030.03 4343 1515 0.018750.01875 4444 77 0.008750.00875 4545 1One 0.001250.00125 4646 22 0.00250.0025 총계sum 800800 1One

13) D1S1612 유전좌위의 대립유전자 분포13) Allele Distribution of the D1S1612 Locus

D1S1612 유전좌위는 조사된 한국인 집단에서 9개의 대립유전자가 발견되었는데 이 중 가장 작은 크기의 대립유전자는 96bp로 TTCC를 반복단위로 하여 10번 반복된 형태였다.In the D1S1612 locus, nine alleles were found in the investigated Korean population. The smallest allele was 96 bp, repeated 10 times with TTCC.

D1S1612 (TTCC)n 여기서 n은 10~18D1S1612 (TTCC) n where n is 10-18

대립유전자Allele 전체 횟수Total 빈도frequency 1010 22 0.00250.0025 1111 66 0.00750.0075 1212 3333 0.041250.04125 1313 125125 0.156250.15625 1414 261261 0.326250.32625 1515 221221 0.276250.27625 1616 9999 0.123750.12375 1717 4444 0.0550.055 1818 99 0.011250.01125 총계sum 800800 1One

14) D15S659 유전좌위의 대립유전자 분포14) Allele distribution of the D15S659 locus

D15S659 유전좌위는 조사된 한국인 집단에서 13개의 대립유전자가 발견되었는데 이 중 가장 작은 크기의 대립유전자는 161bp로 GATA를 반복단위로 하여 7번 반복된 형태였다.[단, 대립유전자 9의 빈도는 0이므로 실질적으로 12개의 대립유전자임]In the D15S659 locus, 13 alleles were found in the investigated Korean population, the smallest of which was 161 bp, repeated 7 times with GATA repeats. Is actually 12 alleles]

D15S659 (GATA)n n은 7~19D15S659 (GATA) n n is 7 ~ 19

대립유전자Allele 전체 횟수Total 빈도frequency 77 1One 0.001250.00125 88 22 0.00250.0025 99 00 00 1010 1313 0.016250.01625 1111 115115 0.143750.14375 1212 170170 0.21250.2125 1313 7777 0.096250.09625 1414 3535 0.043750.04375 1515 142142 0.17750.1775 1616 156156 0.1950.195 1717 6969 0.086250.08625 1818 1919 0.023750.02375 1919 1One 0.001250.00125 총계sum 800800 1One

15) D11S1978 유전좌위의 대립유전자 분포15) Allele distribution of the locus of D11S1978

D11S1978 유전좌위는 조사된 한국인 집단에서 11개의 대립유전자가 발견되었는데 이 중 가장 작은 크기의 대립유전자는 256bp로 GATA를 반복단위로 하여 9번 반복된 형태였다.D11S1978 genetic locus Eleven alleles were found in the surveyed Korean population, the smallest of which was 256 bp, repeated 9 times with GATA as the repeat unit.

D11S1978 (GATA)n 여기서 n은 9~14D11S1978 (GATA) n where n is 9-14

(GATA)nGAT 여기서 n은 14~18 (GATA) nGAT where n is 14-18

[염기서열 분석 결과 14 대립유전자(allele) 이후에는 불완전 반복 단위인 GAT가 연속된 반복 단위 안에 삽입된 형태로 관찰되어 GAT 3개의 염기가 더해진 ‘n.3’의 유전자형으로 표현한다.][Base sequence analysis shows that after the 14 allele, the incomplete repeating unit GAT is inserted into a continuous repeating unit and expressed as a genotype of 'n.3' with three bases of GAT added.]

대립유전자Allele 전체 횟수Total 빈도frequency 99 88 0.010.01 1010 3737 0.046250.04625 1111 204204 0.2550.255 1212 147147 0.183750.18375 1313 2828 0.0350.035 1414 77 0.008750.00875 14.314.3 55 0.006250.00625 15.315.3 115115 0.143750.14375 16.316.3 111111 0.138750.13875 17.317.3 103103 0.128750.12875 18.318.3 3535 0.043750.04375 총계sum 800800 1One

16) D22S691유전좌위의 대립유전자 분포16) Allelic Distribution of the D22S691 Locus

D22S691 유전좌위는 조사된 한국인 집단에서 9개의 대립유전자가 발견되었는데 이 중 가장 작은 크기의 대립유전자는 325bp로 TCTA를 반복단위로 하여 9번 반복된 형태였다. [단, 대립유전자 16의 빈도는 0이므로 실질적으로 8개의 대립유전자임]In the D22S691 locus, nine alleles were found in the investigated Korean population. The smallest allele was 325bp, repeated 9 times with TCTA. [However, since the frequency of allele 16 is 0, it is substantially eight alleles.]

D22S691 (TCTA)n n은 9~17D22S691 (TCTA) n n is 9 ~ 17

대립유전자Allele 전체 횟수Total 빈도frequency 99 1010 0.01250.0125 1010 174174 0.21750.2175 1111 152152 0.190.19 1212 255255 0.318750.31875 1313 145145 0.181250.18125 1414 5353 0.066250.06625 1515 99 0.011250.01125 1616 00 00 1717 22 0.00250.0025 총계sum 800800 1One

성별의 구분은 남성 DNA를 템플레이트로 한다.
Gender division uses male DNA as a template.

전술한 수학식 1 및 수학식 2를 이용하여 상기 유전자좌들의 변별력을 조사하였다. PI는 임의의 두 사람이 해당 유전자좌에서 같은 유전자형을 지닐 확률을 의미한다. 즉, PI 값은 유전자정보은행 운용시 데이터 베이스 크기에 따른 적용 유전자좌의숫자를 결정짓는 변수인데, 유전자 정보은행 검색을 통하여 색출된 용의자가 범인으로 확실히 지목되자면 데이터 베이스 내에 그 용의자와 우연히 동일한 유전자형을 지니는 사람이 존재하지 않아야 한다. 즉, 데이터 베이스에 입력된 유전자형들은 이론적으로 그들만의 유일성을 지녀야 하는 것이다. 예를 들어, 어느 한 유전자좌의 PI 값이 0.01이라는 의미는 임의의 두 사람을 비교했을 때 유전자형이 같을확률이 0.01 이므로 100쌍의 비교를 하였을 때 한 번 유전자형이 같을 수 있다는 것이며 이러한 1OO이란 수치는 1/PI로 얻을 수 있다. 따라서 PI이 값이 작을수록 변별력이 뛰어나 유전자 감식에 유용함을 알 수 있다. The discrimination power of the loci was examined using Equations 1 and 2 described above. PI refers to the probability that any two people will have the same genotype at that locus. In other words, the PI value is a variable that determines the number of loci applied according to the size of the database in the operation of the GIS. If the suspect identified through the GIS search is clearly identified as the culprit, the genotype is accidentally identical to the suspect in the database. There should be no one with. That is, the genotypes entered into the database should theoretically have their own uniqueness. For example, if the PI value of any one locus is 0.01, the probability of having the same genotype is 0.01 when comparing two people, so that the genotype may be the same once when comparing 100 pairs. You can get it at 1 / PI. Therefore, the smaller the value of PI, the better the discrimination is, which is useful for gene identification.

결합 PI 값(Combined PI)은 각 구성 유전좌위의 PI 값을 곱하여 산출하였다. PD는 유전자좌의 변별력의 척도를 의미한다.
Combined PI values were calculated by multiplying the PI values of each constitutive locus. PD refers to a measure of discrimination of the locus.

본 발명의 멀티 플렉스 유전자 증폭 시스템을 이용한 유전자 감식 방법에서 16개의 STR 유전좌위들의 변별력Discrimination of 16 STR Loci in Gene Identification Method Using Multiplex Gene Amplification System of the Present Invention
그룹 1

Group 1
D2S1371D2S1371 D8S1477D8S1477 D12S391D12S391 D20S470D20S470 PDPD 0.9190.919 0.9290.929 0.9520.952 0.9690.969 PIPI 0.0810.081 0.0710.071 0.0480.048 0.0310.031
결합 PI 값

Combined PI Value

8.55749 E-06
8.55749 E-06
그룹 2

Group 2
D6S1043D6S1043 D9S925D9S925 D7S821D7S821 D4S2368D4S2368 PDPD 0.9690.969 0.9110.911 0.940.94 0.8880.888 PIPI 0.0310.031 0.0890.089 0.060.06 0.1120.112
결합 PI 값

Combined PI Value

1.85405 E-05
1.85405 E-05
그룹 3

Group 3
D5S818D5S818 D13S317D13S317 D19S253D19S253 D3S2406D3S2406 PDPD 0.9170.917 0.9320.932 0.9350.935 0.9870.987 PIPI 0.0830.083 0.0680.068 0.0650.065 0.0130.013
결합 PI 값

Combined PI Value

4.76918 E-06
4.76918 E-06
그룹 4Group 4
D1S1612D1S1612 D15S659D15S659 D11S1978D11S1978 D22S691D22S691 PDPD 0.9130.913 0.9560.956 0.9550.955 0.9170.917 PIPI 0.0870.087 0.0440.044 0.0450.045 0.0830.083
결합 PI 값

Combined PI Value

1.42976 E-05

1.42976 E-05

16 16 STRSTR 좌위의Supine
총 gun PIPI

1.08187 E-201.08187 E-20

비교 compare 실시예Example

한국특허출원공개 제1999-0064640호에 개시된 STR 유전좌위들 모두의 조합 한 경우의 변별력을 본 발명의 유전자 감식 방법의 변별력을 대조하기 위하여 분석하였다. STR disclosed in Korean Patent Application Laid-Open No. 1999-0064640 The discrimination power of the combination of all the loci was analyzed to contrast the discrimination power of the gene identification method of the present invention.

아래 표 19에서, 한국특허출원공개 제1999-0064640호에 개시된 16개의 STR 유전좌위들 각각의 대립유전자의 빈도는 본 발명과의 보다 객관적인 비교를 위하여 한국인 400명을 조사한 결과 얻어진 표 2 내지 표 13의 갱신된 대립유전자의 빈도 데이터를 이용하였다.
In Table 19 below, the frequency of the allele of each of the 16 STR loci disclosed in Korean Patent Application Publication No. 1999-0064640 was obtained by examining 400 Koreans for a more objective comparison with the present invention. The frequency data of the updated allele of was used.

한국특허출원공개 제1999-0064640호에 개시된 16개의 STR 유전좌위들 모두의 조합한 경우의 변별력Discrimination in the case of the combination of all 16 STR loci disclosed in Korean Patent Application Laid-Open No. 1999-0064640
그룹 1

Group 1
D2S1371D2S1371 D8S1477D8S1477 D12S391D12S391 D20S470D20S470 PDPD 0.9190.919 0.9290.929 0.9520.952 0.9690.969 PIPI 0.0810.081 0.0710.071 0.0480.048 0.0310.031 순위ranking 1111 99 44 22
결합 PI 값

Combined PI Value

8.55749 E-06
8.55749 E-06
그룹 2

Group 2
D6S1043D6S1043 D9S925D9S925 D7S821D7S821 D4S2368D4S2368 PDPD 0.9690.969 0.9110.911 0.940.94 0.8880.888 PIPI 0.0310.031 0.0890.089 0.060.06 0.1120.112 순위ranking 33 1313 66 1616
결합 PI 값

Combined PI Value

1.85405 E-05
1.85405 E-05
그룹 3

Group 3
D5S818D5S818 D13S317D13S317 D19S253D19S253 D3S2406D3S2406 PDPD 0.9170.917 0.9320.932 0.9350.935 0.9870.987 PIPI 0.0830.083 0.0680.068 0.0650.065 0.0130.013 순위ranking 1212 88 77 1One
결합 PI 값

Combined PI Value

4.76918 E-06
4.76918 E-06
그룹 4Group 4
D21S1437D21S1437 D16S3253D16S3253 D14S608D14S608 D18S1270D18S1270 PDPD 0.9020.902 0.9130.913 0.9440.944 0.9240.924 PIPI 0.0980.098 0.0870.087 0.0560.056 0.0760.076 순위ranking 1515 1414 55 1010
결합 Combination PIPI 값 value

3.62867 E-053.62867 E-05

16 16 STRSTR 좌위의Supine
총 gun PIPI

2.74573E-202.74573E-20

표 18 및 표 19에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 16개의 STR 유전자좌들 조합 시스템의 변별력(16 STR 좌위의 총 PI 값 1.08187 E-20)은 비교 실시예 (16 STR 좌위의 총 PI 값 2.74573E-20)보다 변별력이 높은 것으로 나타났다. As shown in Table 18 and Table 19, the discrimination power (total PI value 1.08187 E-20 of the 16 STR loci) of the 16 STR locus combination systems of the present invention was compared to the comparative example (total PI value of the 2. 16 STR locus 2.74573E − 20) higher discrimination ability.

특히, 표 18의 그룹 4에서 새로이 추가된 STR 유전좌위들의 변별력(결합 PI 값 1.42976 E-05)은 비교 실시예인 표 19의 그룹 4에 개시된 STR 유전좌위들의 변별력(결합 PI 값 3.62867 E-05)에 비하여 현저히 높은 것으로 나타났다. In particular, the discrimination power of the STR loci newly added in Group 4 of Table 18 (binding PI value of 1.42976 E-05) was the discrimination force of the STR loci disclosed in Group 4 of Table 19 of the comparative example (Binding PI value of 3.62867 E-05). It was significantly higher than that.

또한 본 발명의 경우, 16개의 STR 유전좌위들과 동시에 남녀의 성별을 구분할 수 있는 성염색체(amelogenin)의 분석도 가능하므로, 이를 감안하면 비교 실시예에 비한 변별력 개선 효과는 더욱 현저하다고 할 수 있다.
In addition, in the present invention, since it is possible to analyze sex chromosomes (amelogenin) capable of distinguishing sex between men and women at the same time as 16 STR loci, the discrimination improvement effect is more remarkable compared to the comparative example. .

어플라이드 바이오시스템 사(社)로부터 입수한 007 DNA샘플 유전자를 상기 실시예 2 및 실시예 3의 방법에 따라 증폭하고 GeneMapper ID 소프트웨어로 분석하고, 그 결과를 도 3에 도시하였다.The 007 DNA sample gene obtained from Applied Biosystem Co., Ltd. was amplified and analyzed by GeneMapper ID software according to the method of Example 2 and Example 3, and the results are shown in FIG. 3.

007 유전자는 상업적으로 입수가 용이하므로 이 분석 결과에 기초하여 상기 실시예에 따라 구축한 래더의 정확성을 역으로 검증하는 것도 가능하다.Since the 007 gene is commercially available, it is also possible to reversely verify the accuracy of the ladder constructed in accordance with the above embodiment based on the analysis result.

서열목록 전자파일 첨부Attach an electronic file to a sequence list

Claims

Gene identification method using multiplex gene amplification system comprising the following steps:
(1) obtaining one or more DNA samples to be analyzed,
(2) The DNA samples were stored in D2S1371, D8S1477, D12S391, D20S470, D6S1043, D9S925, D7S821, D4S2368, D5S818, D13S317, D19S253, D3S2406, D1S1612, D15S659, D11S1978, and D22S691 genes, Simultaneously amplifying using a complex amplification system comprising primers and primers labeled with a fluorescent substance corresponding to each locus in a set of loci comprising a (Amelogenin) locus, and
(3) evaluating the amplified alleles by simultaneously separating and detecting alleles from the DNA sample amplified in the step, thereby determining each allele type in the amplified DNA sample.

The method of claim 1,
Primers labeled with primers and fluorescent material corresponding to each locus used in step (2)
SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 for the D2S1371 locus;
SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 for the D8S1477 locus;
SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 for the D12S391 locus;
SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 for the D20S470 locus;
SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 for the D6S1043 locus;
SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 for the D9S925 locus;
SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14 for the D7S821 locus;
SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16 for the D4S2368 locus;
SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18 for the D5S818 locus;
SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 for the D13S317 locus;
SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22 for the D19S253 locus;
SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 for the D3S2406 locus;
SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26 for the D1S1612 locus;
SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28 for the D15S659 locus;
SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 30 for the amelogenin locus;
SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 32 for the D11S1978 locus; And
The gene identification method of SEQ ID NO: 33 and SEQ ID NO: 34 for the D22S691 locus.

The method of claim 2,
Primers labeled with fluorescent material, corresponding to each locus used in step (2),
For the D2S1371 locus a fluorescent dye is labeled at the 5 'end of SEQ ID NO: 2, which is the reverse primer;
For the D8S1477 locus a fluorescent dye is labeled at the 5 'end of SEQ ID NO: 3, which is a forward primer;
For the D12S391 locus a fluorescent dye is labeled at the 5 'end of SEQ ID NO: 5, which is a forward primer;
For the D20S470 locus a fluorescent dye is labeled at the 5 'end of SEQ ID NO: 8 which is the reverse primer;
For the D6S1043 locus a fluorescent dye is labeled at the 5 'end of SEQ ID NO: 9, which is a forward primer;
For the D9S925 locus a fluorescent dye is labeled at the 5 'end of SEQ ID NO: 11, which is a forward primer;
For the D7S821 locus a fluorescent dye is labeled at the 5 'end of SEQ ID NO: 13 which is a forward primer;
For the D4S2368 locus a fluorescent dye is labeled at the 5 'end of SEQ ID NO: 15, which is a forward primer;
For the D5S818 locus a fluorescent dye is labeled at the 5 'end of SEQ ID NO: 17, which is a forward primer;
For the D13S317 locus a fluorescent dye is labeled at the 5 'end of the sequence that is the forward primer;
For the D19S253 locus a fluorescent dye is labeled at the 5 'end of SEQ ID NO: 21, which is a forward primer;
For the D3S2406 locus a fluorescent dye is labeled at the 5 'end of SEQ ID NO: 23 which is a forward primer;
For the D1S1612 locus a fluorescent dye is labeled at the 5 'end of SEQ ID NO: 25, which is a forward primer;
For the D15S659 locus a fluorescent dye is labeled at the 5 'end of SEQ ID NO: 27 which is a forward primer;
A fluorescent dye is labeled at the 5 'end of SEQ ID NO: 29, which is the forward primer for the amegenin locus;
The fluorescent dye is labeled at the 5 'end of SEQ ID NO: 31, which is the forward primer for the D11S1978 locus; ; And
Genetic identification method characterized in that the fluorescent dye is labeled at the 5 'end of SEQ ID NO: 33, the forward primer in the case of the D22S691 locus.

4. The method according to any one of claims 1 to 3,
Primers labeled with fluorescent material, corresponding to each locus used in step (2),
The 16th STRogen loci containing the mutogen loci of the D2S1371, D8S1477, D12S391, D20S470, D6S1043, D9S925, D7S821, D4S2368, D5S818, D13S317, D19S253, D3S2406, D1S1612, D15S659, D11S1978 and D22S691. Genetic identification method characterized in that the primer set corresponding to each sequence is labeled by dividing the set of locus into two or more groups and using different fluorescent dyes for each group.

4. The method according to any one of claims 1 to 3,
Labeling of fluorescently labeled primers corresponding to each locus used in step (2) above
A first fluorescent dye is used for the D2S1371, D8S1477, D12S391 and D20S470 loci;
A second fluorescent dye is used for D6S1043, D9S925, D7S821 and D4S2368 loci;
A third fluorescent dye is used for D5S818, D13S317, D19S253 and D3S2406 loci; And
For the D1S1612, D15S659, Amelogenin, D11S1978, and D22S691 loci, the fourth fluorescent dye is labeled,
Wherein the first fluorescent dye, the second fluorescent dye, the third fluorescent dye and the fourth fluorescent dye are each independently the same or different from each other.

The method of claim 5,
Wherein the first fluorescent dye, the second fluorescent dye, the third fluorescent dye and the fourth fluorescent dye are each independently selected from the group consisting of 6-FAM, VIC ^® , NED ^® and PET ^® . Identification method.

The method of claim 6,
The first fluorescent dye is 6-FAM;
The second fluorescent dye is VIC ^® ;
The third fluorescent dye is NED ^® ; And
Genetic identification method characterized in that the fourth fluorescent dye is PET ^® .

4. The method according to any one of claims 1 to 3,
The primer concentration used in step (2) is based on the final concentration
0.50 uM for D2S1371 locus;
0.15 uM for D8S1477 locus;
0.07 uM for D12S391 locus;
1.50 uM for D20S470 locus;
0.125 uM for D6S1043 locus;
0.25 uM for D9S925 locus;
0.10 uM for D7S821 locus;
0.20 uM for D4S2368 locus;
0.20 uM for D5S818 locus;
0.20 uM for D13S317 locus;
0.07 uM for D19S253 locus;
0.60 uM for D3S2406 locus;
0.4 uM for D1S1612 locus;
0.65 uM for D15S659 locus;
0.15 uM for amellogenin locus;
0.175 uM for D11S1978 locus; And
Genetic identification method, characterized in that for the D22S691 locus is used at a concentration of 0.2uM.

4. The method according to any one of claims 1 to 3,
Evaluating the amplified alleles, thereby determining each allele type (3) uses a ladder template comprising the following:
9 alleles of the 9 th to 17 th repeats with TCTA as the repeating unit for the D2S1371 locus,
11 alleles of the 11 th to 21 th repeats with CCTT as the repeating unit for the D8S1477 locus,
15 alleles with repeating units (AGAT) l (AGAC) m (AGAT) n [where l + m + n is 14-17, 17.2 or 18-27] for the D12S391 locus,
15 alleles of the form 7 to 21 times repeated with CCTT as the repeating unit for the D20S470 locus,
15 alleles in the form of repeating AGAT in 9 repeats 23 times for the D6S1043 locus,
9 alleles in the form of repeating ATAG 12 to 20 times with respect to the D9S925 locus,
10 alleles with repeating units of (TGTC) l (TATC) m (where l + m is 11-20) for the D7S821 locus,
7 alleles in the form of repeating CTAT 8 to 14 times with respect to the D4S2368 locus,
9 alleles of the form repeated 7 to 15 times using GATA as a repeating unit for the D5S818 locus,
Seven alleles of the form repeating TATC 8 to 14 times in the D13S317 locus,
9 alleles of a form repeated 7 to 15 times using ATAG as a repeating unit for the D19S253 locus,
(TATC) l (TGTC) m (CGTC) n (CATC) o for the D3S2406 locus, wherein l + m + n + o is 27 to 46, and any one of l, m, n, o is 0 20 alleles with repeating units,
9 alleles of 10 to 18 repeated forms with TTCC as repeat units for the D1S1612 locus,
12 alleles of the 7 th to 8 th or 10 th to 19 th repeats with GATA as the repeating unit for the D15S659 locus,
11 alleles with repeating units (GATA) n [where n is 9-14] or (GATA) n GAT [where n is 14-18] for the D11S1978 locus, and
Eight alleles of the type 9 to 15 or 17 times repeated with TCTA as the repeating unit for the D22S691 locus.

4. The method according to any one of claims 1 to 3,
In the step (2), the DNA sample is prepared by using D2S1371, D8S1477, D12S391, D20S470, D6S1043, D9S925, D7S821, D4S2368, D5S818, D13S317, D19S253, D3S2406, D1S1612, D15S659, D11S1978, Delino, Amelin, and Dene And amplifying at the same time using a complex amplification system comprising primers corresponding to each locus and primers corresponding to each locus in a total of 17 locus sets composed of only a single locus.

Discriminant Gene Identification Kit from Korean Populations Used to Simultaneously Amplify and Analyze a Set of Locus Set, Including:
-16 mutogen loci including the D2S1371, D8S1477, D12S391, D20S470, D6S1043, D9S925, D7S821, D4S2368, D5S818, D13S317, D19S253, D3S2406, D1S1612, D15S659, D11S1978 and D22S691 A container comprising primers and primers labeled with a fluorescent material corresponding to each locus of the set of loci; And
A container comprising a ladder template comprising respective alleles of the set of loci or a PCR amplification product thereof.

The method of claim 11,
Primers labeled with primers and fluorescent material corresponding to the respective loci,
SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 for the D2S1371 locus;
SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 for the D8S1477 locus;
SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 for the D12S391 locus;
SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 for the D20S470 locus;
SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 for the D6S1043 locus;
SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 for the D9S925 locus;
SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14 for the D7S821 locus;
SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16 for the D4S2368 locus;
SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18 for the D5S818 locus;
SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 for the D13S317 locus;
SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22 for the D19S253 locus;
SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 for the D3S2406 locus;
SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26 for the D1S1612 locus;
SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28 for the D15S659 locus;
SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 30 for the amelogenin locus;
SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 32 for the D11S1978 locus; And
Gene identification kit characterized in that for the D22S691 locus is SEQ ID NO: 33 and SEQ ID NO: 34.

The method of claim 12,
Primers labeled with fluorescent material corresponding to the respective loci,
For the D2S1371 locus, a fluorescent dye was labeled at the 5 'end of SEQ ID NO: 2 which is the reverse primer;
For the D8S1477 locus a fluorescent dye was labeled at the 5 'end of SEQ ID NO: 3, which is a forward primer;
For the D12S391 locus a fluorescent dye was labeled at the 5 'end of SEQ ID NO: 5, which is a forward primer;
For the D20S470 locus a fluorescent dye was labeled at the 5 'end of SEQ ID NO: 8 which is the reverse primer;
For the D6S1043 locus a fluorescent dye was labeled at the 5 'end of SEQ ID NO: 9, which is a forward primer;
For the D9S925 locus a fluorescent dye was labeled at the 5 ′ end of SEQ ID NO: 11, which is a forward primer;
For the D7S821 locus a fluorescent dye was labeled at the 5 'end of SEQ ID NO: 13, which is a forward primer;
For the D4S2368 locus a fluorescent dye was labeled at the 5 'end of SEQ ID NO: 15, which is a forward primer;
For the D5S818 locus a fluorescent dye was labeled at the 5 'end of SEQ ID NO: 17 which is a forward primer;
For the D13S317 locus a fluorescent dye was labeled at the 5 'end of the sequence that is the forward primer;
For the D19S253 locus a fluorescent dye was labeled at the 5 ′ end of SEQ ID NO: 21;
For the D3S2406 locus a fluorescent dye was labeled at the 5 'end of SEQ ID NO: 23 which is a forward primer;
For the D1S1612 locus a fluorescent dye was labeled at the 5 'end of SEQ ID NO: 25, which is a forward primer;
For the D15S659 locus a fluorescent dye was labeled at the 5 'end of SEQ ID NO: 27 which is a forward primer;
In the case of the amelogenin locus, a fluorescent dye was labeled at the 5 'end of SEQ ID NO: 29;
For the D11S1978 locus a fluorescent dye was labeled at the 5 'end of SEQ ID NO: 31 which is a forward primer; And
Genetic identification kit, characterized in that the fluorescent dye is labeled at the 5 'end of SEQ ID NO: 33 in the case of the D22S691 locus.

The method according to any one of claims 11 to 13,
In the labeling of the fluorescently labeled primers corresponding to the respective loci,
The 16th STRogen loci containing the mutogen loci of the D2S1371, D8S1477, D12S391, D20S470, D6S1043, D9S925, D7S821, D4S2368, D5S818, D13S317, D19S253, D3S2406, D1S1612, D15S659, D11S1978 and D22S691. Dividing the set of locus into two or more groups, and each primer is labeled with a primer corresponding to each sequence using different fluorescent dyes.

The method according to any one of claims 11 to 13,
In the labeling of the fluorescently labeled primers corresponding to the respective loci,
A first fluorescent dye is used for the D2S1371, D8S1477, D12S391 and D20S470 loci;
A second fluorescent dye is used for D6S1043, D9S925, D7S821 and D4S2368 loci;
A third fluorescent dye is used for D5S818, D13S317, D19S253 and D3S2406 loci; And
For the D1S1612, D15S659, Amelogenin, D11S1978, and D22S691 loci, the fourth fluorescent dye is labeled,
Wherein the first fluorescent dye, the second fluorescent dye, the third fluorescent dye and the fourth fluorescent dye are each independently the same or different.

16. The method of claim 15,
Wherein the first fluorescent dye, the second fluorescent dye, the third fluorescent dye and the fourth fluorescent dye are each independently selected from the group consisting of 6-FAM, VIC ^® , NED ^® and PET ^® . Identification kit.

The method of claim 16,
The first fluorescent dye is 6-FAM;
The second fluorescent dye is VIC ^® ;
The third fluorescent dye is NED ^® ; And
The fourth fluorescent dye is a genetic identification kit, characterized in that PET ^® .

The method according to any one of claims 11 to 13,
The concentration of the primers is based on the final concentration,
0.50 μM for D2S1371 locus;
0.15 μM for D8S1477 locus;
0.07 μM for D12S391 locus;
1.50 μM for the D20S470 locus;
0.125 μM for D6S1043 locus;
0.25 μM for D9S925 locus;
0.10 μM for D7S821 locus;
0.20 μM for D4S2368 locus;
0.20 μM for the D5S818 locus;
0.20 μM for D13S317 locus;
0.07 μM for D19S253 locus;
0.60 μM for the D3S2406 locus;
0.4 μM for D1S1612 locus;
0.65 μM for the D15S659 locus;
0.15 μM for the amellogenin locus;
0.175 μM for D11S1978 locus; And
Genetic identification kit, characterized in that for the D22S691 locus is used at a concentration of 0.2 μM.

The method according to any one of claims 11 to 13,
A ladder template comprising alleles of each set of loci set or a PCR amplification product thereof comprises:
9 alleles of the 9 th to 17 th repeats with TCTA as the repeating unit for the D2S1371 locus,
11 alleles of the 11 th to 21 th repeats with CCTT as the repeating unit for the D8S1477 locus,
15 alleles with repeating units (AGAT) l (AGAC) m (AGAT) n [where l + m + n is 14-17, 17.2 or 18-27] for the D12S391 locus,
15 alleles of the form 7 to 21 times repeated with CCTT as the repeating unit for the D20S470 locus,
15 alleles in the form of repeating AGAT in 9 repeats 23 times for the D6S1043 locus,
9 alleles in the form of repeating ATAG 12 to 20 times with respect to the D9S925 locus,
10 alleles with repeating units of (TGTC) l (TATC) m (where l + m is 11-20) for the D7S821 locus,
7 alleles in the form of repeating CTAT 8 to 14 times with respect to the D4S2368 locus,
9 alleles of the form repeated 7 to 15 times using GATA as a repeating unit for the D5S818 locus,
Seven alleles of the form repeating TATC 8 to 14 times in the D13S317 locus,
9 alleles of a form repeated 7 to 15 times using ATAG as a repeating unit for the D19S253 locus,
(TATC) l (TGTC) m (CGTC) n (CATC) o for the D3S2406 locus, wherein l + m + n + o is 27 to 46, and any one of l, m, n, o is 0 20 alleles with repeating units,
9 alleles of 10 to 18 repeated forms with TTCC as repeat units for the D1S1612 locus,
12 alleles of the 7 th to 8 th or 10 th to 19 th repeats with GATA as the repeating unit for the D15S659 locus,
11 alleles with repeating units (GATA) n [where n is 9-14] or (GATA) n GAT [where n is 14-18] for the D11S1978 locus, and
Eight alleles of the type 9 to 15 or 17 times repeated with TCTA as the repeating unit for the D22S691 locus.

The method according to any one of claims 11 to 13,
Genetic set of left-handed genes of Amelogenin (Amelogenin), respectively A container comprising primers corresponding to the locus and primers labeled with a fluorescent substance; And a container containing a ladder template comprising each allele of the set of loci or a PCR amplification product thereof, wherein the gene identification kit has discriminating power in a Korean population used to simultaneously amplify and analyze the set of loci.