KR19990040461A - 항진균 물질 및 살충 물질을 생산하는 스트렙토마이세스 균주및 이의 배양액을 함유하는 생물농약 조성물 - Google Patents

항진균 물질 및 살충 물질을 생산하는 스트렙토마이세스 균주및 이의 배양액을 함유하는 생물농약 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항진균 물질 및 살충 물질을 생산하는 스트렙토마이세스 균주 및 이의 배양액을 함유하는 생물농약 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 항진균 물질, 살충 물질 및 키틴분해저해 물질을 동시에 생산하는 스트렙토마이세스 균주 Bom1와 Bom2, 및 이의 배양액을 함유하는 항진균능과 살충능을 동시에 가지는 생물농약 조성물에 관한 것이다.

Description

항진균 물질 및 살충 물질을 생산하는 스트렙토마이세스 균주 및 이의 배양액을 함유하는 생물농약 조성물
본 발명은 항진균 물질 및 살충 물질을 생산하는 스트렙토마이세스 균주 및 이의 배양액을 함유하는 생물농약 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 항진균 물질, 살충 물질 및 키틴분해저해 물질을 동시에 생산하는 스트렙토마이세스 균주 Bom1와 Bom2, 및 이의 배양액을 함유하는 항진균능과 살충능을 동시에 가지는 생물농약 조성물에 관한 것이다.
농약은 식물에 유해한 곰팡이나 곤충을 제거하기 위해 식물에 처리되고 있다.
현재 화학 살충제가 주로 사용되고 있으나 무분별한 화학 살충제의 남용과 오용, 잔류 독성 및 내성이 심각한 문제가 되고 있다.
이러한 문제점을 해결하는 새로운 형태의 농약으로, 저독성 및 지속성 살충, 항균 능력을 갖는 새로운 생물농약 제제가 주목받고 있다.
현재 바실러스 투린겐시스(Bacillus thurigensis)을 사용한 생물 농약이 개발된 바 있으나, 이 농약은 살충 효과만을 가질 뿐 항진균 효과는 없다는 단점을 가지고 있다. 또한 생물 방제제로 이미 이용되고 있는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 슈도모나스 sp(Psudomonas sp)는 살충 효과가 없다는 단점을 가지고 있다.
이에 본 발명자들은 상기한 문제점이 없는 새로운 생물농약을 개발하고자 연구를 거듭하였다.
한편, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속의 균주는 토양 미생물로 그람 양성이고 진성 세균에 해당하는 것으로, 항생제, 생리활성물질, 비타민 등의 2차 대사산물과 소염제, 소화제 및 각종 효소를 생산하는 등 산업적으로 응용범위가 넓은 유용한 산업 미생물이며 특히 현대 의약품 개발에 가장 많이 이용되는 미생물이다.
따라서 본 발명의 목적은 항진균 물질 및 살충 물질을 동시에 생산하는 스트렙토마이세스 속 균주를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 균주의 배양액을 포함하는 생물농약 조성물 및 그의 제조 방법을 제공하는 데 있다.
도 1은 ISP No.2 배지에서 10일간 배양한 스트렙토마이세스 Bom1의 포자 사슬을 보여주는 주사 전자 현미경 사진(Scanning Electron Microscophy; 5,000 배 배율)이다.
도 2는 ISP No.2 배지에서 10일간 배양한 스트렙토마이세스 Bom2의 포자 사슬을 보여주는 주사 전자 현미경 사진(5,000 배 배율)이다.
상기한 목적에 따라 본 발명에서는 토양으로부터 분리된 항진균 물질, 살충 물질 및 키틴분해저해 물질을 생산하는 스트렙토마이세스 Bom1 및 Bom2 균이 제공된다.
또한 본 발명에서는 상기 균주의 배양액를 함유하는 생물농약 조성물이 제공된다.
또한 본 발명에서는 항진균, 살충 물질을 생산하도록 상기 균주를 배양한 후 진주암석분 및 규산분에 흡착 건조시키는 것을 포함하는 항진균능 및 살충능을 동시에 가지는 생물농약 제제의 제조방법이 제공된다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
먼저, 강원도 고성 지역의 토양 시료를 무작위로 채취하여 멸균 식염수로 10-2내지 10-5배로, 바람직하게는 10-2내지 10-3배로, 희석한 후 베네트 평판 배지[Bennet's media: 1.0% 포도당, 0.2% 펩톤, 0.1% 소고기 추출물, 0.1% 효모 추출물, 1.5% 한천, 5ppm 니스타틴(Nystatin)]에 도말하여 배양하고, 평판 배지상에 성장한 균을 모두 순수 분리하여 토양미생물을 얻는다. 분리된 균을 보관한 다음 2% 당농도를 증가시킨 베네트 액체 배지에 접종하고 진탕배양한 후 진탕배양이 종료된 배양물을 원심분리 또는 여과하고 상등액 또는 여액을 미생물 배양액으로 하여 냉장 보관한다.
캔디다 앨비칸스(Candida albicans) 효모와 라이조프스 스트로니퍼(Rhizopus stronifer) 곰팡이를 YM 배지(0.3% 효모추출물, 0.3% 맥아추출물, 0.5% 펩톤, 1.0% 포도당, 1.8% 한천) 및 PDA 배지(Difco Laboratories 제품)에 중층한 후 원형의 두꺼운 종이를 올려놓고 상기 토양 미생물 배양액을 40㎕씩 적하한 다음 24 내지 72 시간 동안 배양하여 효모와 곰팡이의 성장을 억제하는 균을 1차 선발한다.
1차 선발된 균의 배양액에 대하여 기무라 방법(Kimura shigeru, J. Insect physiol. 19, 115-123(1973))에 따라 키틴 분해효소의 활성을 측정하여, 키틴 분해효소를 저해하는 균주를 2차 선발한다. 키틴의 분해는 곤충의 변태에 매우 중요한데, 키틴 분해효소에 의해 외부의 키틴층이 분해됨으로써 그 밑에 접혀져 있던 새로운 키틴층이 새로운 외부를 형성하게 된다. 따라서 키틴분해를 저해하면 그 다음 단계로의 변태과정을 억제할 수 있게 된다.
2차 선발된 균주중 살충 물질을 생산하는 균주를 선별하기 위하여, 누에(Bombyx mori)에 균주 배양액을 포함하는 인공사료를 공급하여 누에의 치사율을 조사한다. 즉, 2 내지 3% 포르말린 용액에서 소독한 누에알을 비중 1.075 의 염산에서 침산한 뒤 25℃의 배양기내에서 10일간 배양한다. 누에알에서 깨어나온 개미 누에에 누에 인공사료분말 250 g, 물 70㎖, 및 초산 3㎖로 구성된 누에 사료를 제조하여 공급하고 2령이 지나 두 번째 잠을 자도록 한다. 두 번째 잠에서 깨어나 3령이 되면, 3령의 누에에 상기 누에 인공사료 5g과 상기 2차 선발된 미생물 배양액 1㎖를 혼합한 인공사료를 조제하여 부족하지 않도록 계속 경구 급여한다. 4령시에는 찐 인공사료 5g과 배양액 1.2㎖를 혼합한 인공사료를 조제하여 제공하고 5령시에는 찐 인공사료 5g에 배양액 1.5㎖을 혼합한 인공사료를 조제하여 제공한다. 이와 같은 방법으로 누에 인공사료내에 미생물 배양액이 포함된 시험구와 포함되지 않는 대조구를 비교하면서 대조구에 비교하여 치사율이 높은 미생물 배양액을 찾아내고, 최종적으로 항진균 물질, 키틴분해효소저해 물질 및 살충 물질을 생산하는 배양 균주를 선발한다. 이 실험을 명확하게 하기 위하여 바람직하게는 사용 누에 시험구수를 증대시켜 3회 이상 반복 시험하여 재현성이 있는 미생물을 선발한다.
선발된 미생물은 미생물 동정 방법에 따라 형태학적, 생리적, 생화학적 특성을 확인한다.
형태학적 특성을 확인하기 위하여 선발된 균주를 ISP 계열 배지(표 1)에 접종하여 기저균사(substate mycelium), 공중 기균사(aerial mycelium) 및 포자(spore) 형성 과정을 현미경으로 관찰하고 ISP 계열의 평판배지를 이용하여 기저균사의 성장 상태와 색상, 공중 기균사의 형성과 색상, 포자 형성 및 색상을 조사하고, 평판배지상에 색소생성 정도를 관찰한 다음 포자형성 정도를 전자현미경을 이용하여 사진을 찍어 확인한다.
배지 종류 조성
IPS No. 2(효모추출물-맥아추출물 한천배지) 0.4% 효모추출물,1.0% 맥아추출물,0.4% 포도당,2.0 한천.
IPS No. 3(귀리가루 한천배지) 2.0% 귀리가루,1.8% 한천.
IPS No. 4(무기염소-전분 한천배지) 1.0% 가용성 전분,0.1% K2HPO4,0.1% MgSO47H2O,0.1% (NH)4SO4,0.2% CaCO3,2.0% 한천,1.0㎖ 미량원소*.
IPS No. 5(글리세롤-아스파라긴 한천배지) 0.1% L-아스파라긴,1.0% 글리세롤,0.1% K2HPO4,0.05% MgSO47H2O,0.05% NaCl,1.0㎖ 미량원소*,2.0% 한천.
IPS No. 6 3.6% 펩톤-철 한천 배지,1.0% 효모추출물.
IPS No. 7(티로신 한천 배지) 1.5% 글리세롤,0.05% L-티로신,0.1% L-아스파라긴,0.1% K2HPO4,0.05% MgSO47H2O,0.05% NaCl,1.0㎖ 미량원소*,2.0% 한천.
*미량원소용액: 0.1% FeSO47H2O,0.1% MnCl24H2O,0.1% ZnSO47H2O.
선발된 균주의 생화학적 특성을 규명하기 위하여, 선발된 균주를 베네트 액체 배지에 접종하여 배양한 후, 8,000rpm에서 30분간 원심분리하고 상등액을 제거한다. 침전된 균체에 균체량의 20배에 해당하는 물을 첨가한 다음 진탕한 뒤 원심분리기를 이용하여 세척하되 바람직하게는 5회 정도로 한다. 세척이 끝난 균체는 100 내지 110℃의 온도에서 건조하여 생화학적 특성분석에 이용한다.
건조된 균체 0.3g을 가수분해 용기에 넣고 6N 염산 용액을 넣은 다음 진공 펌프를 이용하여 공기를 제거하고 질소를 충진한다. 이와 같은 방법을 바람직하게는 4 내지 5회 반복하여 균체 세포를 가수분해하는 동안 산화되지 않도록 110 내지 120℃에서 8시간 내지 24시간 동안 가수분해한 다음 0.45㎛ 필터를 이용하여 여과한 여액을 표준물질과 함께 박막 크로마토그래피(TLC)를 실시한다. 전개 용매는 메탄올, 증류수, 염산, 피리딘을 혼합하여 사용하고 박막크로마토그래프 판은 실리카 계열을 이용한다. 전개가 끝난 박막 크로마토그래피 판은 60℃에서 건조하여 용매를 제거하고 닌히드린(nynhydrin) 발색제를 분사한 후 발색시킨다. 발색되는 표준 아미노산과 디아미노피멜산(diamino-pimelic acid; DAP)을 구분하여 분리된 균주의 디아미노피멜산의 구조와 아미노산 조성을 조사한다.
또다른 생화학적 분석을 위하여 건조된 균체 0.3g를 가수분해 용기에 넣고 1N 황산 용액을 넣어 상기와 같은 방법으로 공기를 제거한 다음 100 내지 120℃에서 2 내지 6 시간 동안 가수분해한 다음 0.45㎛ 필터를 이용하여 여과한 다음 여액을 표준 당류와 같이 박막 크로마토그래피를 실시한다. 전개 용매로는 노르말부탄올, 피리딘, 증류수, 톨루엔을 혼합하여 사용하고 박막 크로마토그래피 판은 실리카 계열을 이용한다. 전개가 끝난 박막 크로마토그래피 판은 건조하여 용매를 제거하고 아닐린, 디페닐아민 및 인산으로 혼합된 당 발색제를 분사하여 균주 세포내 존재하는 당류를 표준 당류와 비교한다.
분리된 균주를 상기 방법에 따라 생리적, 형태적 및 생화학적 결과에 따라 미생물을 동정하여 스트렙토마이세스 속 Bom1 및 Bom2라 명명하고, 각각을 사단법인 한국종균협회에 1997년 10월 24일자 기탁번호 제 KFCC-10992 호 및 제 KFCC-10993 호로 기탁하였다.
상기한 바와 같이 분리된 스트렙토마이세스 속의 균을 산업용 배지를 이용하여 살충, 항진균 물질 생산을 검토한 결과, 0.1 내지 1.0% 효모추출물, 0.2 내지 3.0% 전분, 0.2 내지 2.0% 글루텐(gluten), 0.1 내지 2.0% 옥수수 액침(C.S.L), 0.2 내지 3.0% 포도당 및 0.1 내지 2.0% 미강류(pH8.0)의 조성을 갖는 배지 조성에서 온도 28 내지 30℃, 교반속도 200rpm, 0.4vvm의 통기조건하에 7 내지 15일 동안 배양한 결과 항진균, 살충 물질 및 포자가 생산되었다.
생산된 항진균, 살충물질 및 포자가 혼합된 배양액, 전분, 조단백질 및 암석분을 함유하는 조성물을 생물농약으로 사용할 수 있다. 상기 농약 제제는 상기 배양액을 전분, 조단백질 및 암석분에 흡착 건조시켜 제조할 수 있는데, 예를 들면, 배양액, 액화전분 및 끓인 대두액을 30 내지 60 중량%: 20 내지 40 중량%: 10 내지 50중량%로 혼합한 후, 이 혼합액 전체부피 ℓ당 비석분 200 내지 400g과 진주암석분 200 내지 400g을 혼합하여 30 내지 70℃, 바람직하게는 45℃에서 건조한 뒤 규산 100 내지 200g과 혼합하여 제조할 수 있다.
본 발명의 농약은 분말, 펠렛 또는 과립등으로 제형화하여 그대로 사용할 수 있다. 제형화된 농약은 식물이 생장하고 있는 토양에 처리할 수 있으며, 또한 성장 중인 식물 표면에 처리되거나 또는 재배하여 수송 또는 저장중인 채소 및 과일의 표면에도 처리될 수 있다.
이하에서 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명하나, 본 발명이 이에 의하여 한정되는 것은 아니다.
참조예 1
300개의 누에알을 2%의 포르말린 용액으로 소독한 후, 비중이 1.075인 염산에서 침산하였다. 침산한 누에알을 배양기에 넣고 25℃에서 습도를 유지한 채 10일간 배양하여 개미누에를 얻었다.
인공 사료로는 누에의 인공사료(23% 뽕잎가루, 27% 탈리대두분, 9% 임자박, 6% 설탕, 23% 옥분, 1.5% 구연산, 1.5% 호박산, 및 9% 불활성 효모) 가루 100g에 물 280㎖ 및 아세트산 1.2㎖를 혼합하여 100℃에서 40분간 찐 것을 사용하였다.
상기 인공 사료를 고갈되지 않도록 급여하면서 개미누에를 25℃에서 키운 결과, 1령 3일 첫 번째 잠 1일, 2령 3일 두 번째 잠 1일, 3령 3일 세 번째 잠 1일, 4령 4일 네 번째 잠 1일, 5령 6 내지 8일이 지난후, 실을 뽑아 고치를 지었고 고치안에서 약 10일간 번데기로 있다가 성충이 되어 밖으로 나왔다.
본 실험은 분리된 균주를 누에에 적용하기 위한 기초 시험으로 하였다.
실시예 1
강원도 고성지역에서 토양시료를 무작위로 채취하여 50 내지 60℃에서 2시간 동안 가열하여 건조시킨 후, 건조된 각각의 토양시료 1g을 취하여 멸균식염수 9㎖에 넣고 10분간 진탕하였다. 각각의 시료를 멸균식염수로 10-2내지 10-4로 연속 희석하고, 이 토양 희석액 0.1㎖를 pH 7 내지 8로 조정한 베네트 평판 배지(1.0% 포도당, 0.2% 펩톤, 0.1% 소고기 추출물, 0.1% 효모 추출물, 1.5% 한천, 5ppm 니스타틴(Nystatin))에 도말하고 28℃에서 7일간 배양하였다. 생성된 균주를 각각 분리하여 동일 배지에서 순수배양하였다.
순수배양한 균주를 한천과 니스타틴을 포함하지 않은 베네트 액체배지에 접종하고 28℃에서 10일간 120 내지 140 rpm의 속도로 진탕배양한 후, 배양액을 8,000 rpm으로 원심분리하여 상등액(이하 "배양 상등액"이라 함)을 얻었다.
PDA 배지에 중층한 라이조프스 스트로니퍼(ATCC6227a)와 YM 배지상에 중층한 캔디다 앨비칸스(ATCC10231)위에 6㎜ 두께의 종이를 올려놓고, 그 위에 상등액 40㎕를 적하한 후 28℃에서 36 내지 72 시간동안 배양하고 라이조프스 스트로니퍼 또는 캔드다 앨비칸스의 성장이 억제된 억제환의 직경을 측정하였다. 이때 대조구로는 멸균한 증류수를 사용하였다.
그 결과는 표 2에 나타낸 바와 같다.
균 주 성장 억제환 (㎜)
캔디다 앨비칸스 라이조프스 스트로니퍼
스트렙토마이세스 sp. Bom1 30 15
스트렙토마이세스 sp. Bom2 22 23
대조구 6 6
스트렙토마이세스 Bom1 및 Bom2 균의 배양 상등액은 캔디다 앨비칸스 효모와 라이조프스 스트로니퍼 곰팡이에 대하여 사멸 효과를 가지는 것으로 나타났다.
실시예 2
화용 직후의 누에로부터 적출한 중장 소화관에 50mM의 구연산-인산나트륨 완충액(pH 5.0)을 가하고 마쇄한 후 원심분리하여 상등액을 얻었다. 상등액에 황산암모늄을 서서히 가하여 최종농도 70%가 되게 한 후 이 용액을 원심분리하여 침전물을 얻었다. 이 침전물에 동일 완충액을 가하여 침전물을 재용해시켜 키틴 분해효소를 얻고 냉동보관하였다.
키틴 100g을 농염산 2ℓ에 넣고 4℃에서 12시간 동안 교반한 후 유리솜으로 여과하였다. 이 여액에 4℃의 증류수 1ℓ를 가하고 6,000 rpm에서 15분간 원심분리하였다. 얻어진 침전물에 5N 가성소다를 가하여 pH를 7로 중화시킨 후 6,000rpm에서 15분간 원심분리하였다. 이 침전물은 증류수 2ℓ로 반복하여 세척하여 키틴을 얻고 냉장보관하였다.
키틴 분해효소의 활성 및 저해 실험은 기무라의 방법(S. Kimura, J. Insect Physiol. 19; 115-123(1973))에 따라 실시하였다. 즉, 실시예 1에서 얻은 배양 상등액을 키틴 분해효소 활성 억제제로 사용하여, 키틴 분해효소의 활성을 측정하였다. 이때 대조구로는 베네트 액체 배지를 사용하였다.
그 결과는 하기 표 3에 나타낸 바와 같다.
균 주 키틴 분해효소 활성(%)
스트렙토마이세스 sp. Bom1 70
스트렙토마이세스 sp. Bom2 80
대조구 100
상기 표 3에서 보는 바와 같이, 스트렙토마이세스 Bom1 및 Bom2의 균주 배양 상등액은 키틴 분해효소의 활성을 저해함을 알 수 있다.
실시예 3
스트렙토마이세스 균주 Bom1 및 Bom2의 배양액을 사용하여 참조예 1에서와 동일한 방법으로 누에를 사육하였다.
이때 대조구로는 참조예 1의 인공사료를 사용하였고, 시험구는 3령시에는 인공사료 5g와 균주 배양액 1㎖를 혼합한 인공사료를, 4령시에는 인공사료 5g과 균주 배양액 1.2㎖를 혼합한 인공사료를, 5령시에는 인공사료 5g과 균주 배양액 1.5㎖를 혼합한 인공사료를 누에에 급여하였다.
그 결과는 하기의 표 4에 나타낸 바와 같다.
균 주 반복 회수 치사율(%)
스트렙토마이세스 sp. Bom1 1회 100
2회 92
3회 88
스트렙토마이세스 sp. Bom2 1회 95
2회 100
3회 100
대조구 1회 0
2회 0
3회 5
표 4에서 보는 바와 같이, 스트렙토마이세스 Bom1 및 Bom2의 균주 배양 상등액은 누에에 대하여 살충효과가 있음을 알 수 있다.
실시예 4
동정에 필요한 형태학적 분석을 위해, 멸균된 ISP No.2 배지를 얇게 오린 후 그 위에 선발 균주를 접종하였다. 이를 슬라이드 글라스 위에 올려놓고 28℃에서 배양하면서 24시간 간격으로 광학 현미경으로 관찰하였다.
그 결과 선발된 균주는 모두 기저균사, 공중 기균사를 형성하였고 공중 기균사 말단에 포자를 형성하였으며, 이는 도 1 및 2에 나타낸 바와 같다. 이때 도 1은 ISP No.2 배지에서 10일간 배양한 스트렙토마이세스 Bom1의 포자 사슬을 보여주는 주사전자현미경 사진(5,000 배 배율)이고, 도 2는 ISP No.2 배지에서 10일간 배양한 스트렙토마이세스 Bom2의 포자 사슬을 보여주는 주사전자현미경 사진(5,000 배 배율)이다.
실시예 5
균주의 생리학적 분석을 위해, 스트렙토마이세스 균주 Bom1 및 Bom2을 각각 각종의 ISP 배지위에서 21일간 배양하면서 성장 정도 및 공중 기균사와 그 후면의 색상을 관찰하였다.
그 결과 스트렙토마이세스 균주 Bom1 및 Bom2의 생리학적 특성은 각각 하기 표 5 및 6에 나타낸 바와 같다.
ISP No. 2 배지 ISP No. 4 배지 ISP No. 5 배지 ISP No. 6 배지 ISP No. 7 배지
성장 +++ +++ +++ +++ +++
공중 기균사 색상 노란색,진한 녹색 녹색 노란색,진한 녹색 보라색 진한 녹색
후면 색상 갈색 갈색 연한 갈색 연한 갈색 갈색
ISP No. 2 배지 ISP No. 4 배지 ISP No. 5 배지 ISP No. 6 배지 ISP No. 7 배지
성장 +++ +++ +++ ++ +++
A.M.쪽 색상 노란색,진한 녹색 진한 녹색 진한 녹색 보라색, 노란색 녹색,노란색
반대쪽 색상 갈색 갈색 연한 갈색 연한 갈색 갈색
표 5 및 6에서 보는 바와 같이, 스트렙토마이세스 균주 Bom1 및 Bom2는 ISP No. 2 내지 7의 모든 배지에서 성장할 수 있었다.
실시예 6
스트렙토마이세스 균주 Bom1 및 Bom2 균체를 각각 세척하고, 104℃에서 건조하여 동정에 사용하였다.
균의 배양학적 특성이 방선균의 특성을 갖고 있으므로, 방선균 동정법(Williams et al., Bergey's manual of Determinative Bacteriology, 9th edition, (1994))에 따라 동정하였다.
방선균 동정의 지표로 세포벽 구성성분인 디아미노피멜산의 구조 및 아미노산의 조성을 확인하기 위해, 선발균주의 균체 0.3g에 6N 염산 20㎖를 가하고 진공펌프로 공기를 빼면서 질소 가스로 치환한 다음 120℃에서 12시간 동안 가수분해시켰다. 가수분해물을 0.45㎛ 필터로 여과하고 여액을 진공농축한 후 실리카겔 판(silica-gel 60, Merck)에서 메탄올:증류수:10N 염산:피리딘(80:17.5:2.5:10) 용액로 전개하여 박막 크로마토그래피를 실시하였다. 이때 표준물질로는 LL-디아미노피멜산과 메소-디아미노피멜산의 혼합물, 알라닌, 글리신, 글루탐산, 라이신 등을 사용하였다. 전개가 완료된 후 실시카겔 판을 60℃에서 건조시킨 후 에탄올에 용해된 5㎎/㎖ 닌히드린 발색시약을 분무하고 발색시켰다.
그 결과 선발균은 LL-디아미노피멜산 구조를 가지며, 알라닌, 글리신 등을 갖는 유형 1의 세포벽 구조를 갖고 스트렙토마이세스 균으로 확인되었다.
세포벽 성분의 조성중 동정에 또다른 특성을 확인하기 위하여, 균체 0.3g에 1N 황산 20 ㎖를 가하고 진공펌프로 공기를 빼면서 질소 가스로 치환한 다음 120℃에서 3시간 동안 가수분해하였다. 가수분해가 종료된 후 1N 수산화바륨으로 중화하고 0.45㎛ 필터로 여과하고 여액을 진공농축한 후, 실리카겔 판(silica-gel 60, Merck)에서 노르말부탄올:증류수:톨루엔(5:3:3:4) 용액로 전개하여 박막 크로마토그래피를 실시하였다. 이때 표준물질로는 람노즈, 자일로즈, 아라비노즈, 글루코즈, 만노즈, 갈락토즈, 프럭토즈, 2-메틸글루코즈 등을 사용하였다. 전개가 완료된 후 실시카겔 판을 80℃에서 건조시킨 후 당 발색 시약(아닐린 1㎖를 알콜 100㎖에 녹인 용액: 디페닐아민(diphenylamine) 1g을 아세톤 100㎖에 녹인 용액: 85% 인산 용액=5:5:1)을 분무하고 발색시켰다.
그 결과, 선발균주의 가수분해물에는 환원당이 존재하지 않는 유형 C에 해당되기 때문에 스트렙토마이세스 속의 균으로 동정하였다.
이를 요약하면 하기 표 7에 나타낸 바와 같다.
균주 당 디아미노피멜산 아미노산
스트렙토마이세스 sp. Bom1 없음 LL-디아미노피멜산 알라닌, 글리신, 무람산, 글루탐산, 글루코사민
스트렙토마이세스 sp. Bom2 없음 LL-디아미노피멜산 알라닌, 글리신, 무람산, 글루탐산, 글루코사민
동정한 분리균은 한국종균협회에 1997년 10월 24일자로 각각 제 KFCC 10992 호 및 제 KFCC 10993 호로 기탁하였다.
실시예 7
분리 동정한 스트렙토마이세스 속 Bom1 및 Bom2 생산물인 살충, 항균물질 및 균포자를 대량으로 얻기 위하여, 이들 균주의 배양 특성을 이용하여 최적 배양조건을 조사하였다. 스트렙토마이세스 속의 Bom1 및 Bom2 균주를 전분 및 복합 다당류를 잘 이용할 수 있었으며, 아질산을 이용하는 특징이 있었으며, 더 나아가 지방을 이용하여 탄소원으로 이용할 수 있음을 확인하였다.
0.3% 효모추출물, 2.5% 옥수수 전분, 1.0% 글루텐, 0.4% 옥수수 액침, 1.0% 포도당, 1.0% 미강류(pH 8)로 구성된 산업용 기질을 이용 배지를 조제하여, 28℃에서 220 내지 250rpm, 통기량 0.4vvm, 12일간 배양한 결과 살충, 항진균 능력이 크게 증진되었으며, 배양이 종료되었을 때 포자 획득율이 90% 이상이었다.
실시예 8
실시예 8에서와 같이 배양하여 얻어진 살충, 항균물질 및 포자가 함유된 배양액 100㎖에 10% 액화전분액 50㎖와 5% 끓인 대두액 20㎖를 잘 혼합한 후 비석분50g과 진주암 성분 20g을 혼합하여 4℃에서 건조하였다. 건조된 혼합물을 분쇄기를 이용하여 분쇄한 후 규산 50g을 혼합하여 저독성 생물 농약을 제조하였다.
실시예 9
실시예 8에서와 동일한 방법으로 배양된 배양액의 살충 능력을 확인하기 위하여, 누에를 포함하는 흰불나방 유충, 초파리 유충, 집파리 유충에게 먹이로 스트렙토마이세스 속 Bom1 또는 Bom2의 농축 배양물이 혼합된 식물의 잎 또는 인공사료를 급여한 후 각 유충의 치사율(%)을 조사하였다.
그 결과 하기 표 8에 나타낸 바와 같다.
해 충 스트렙토마이세스 속 Bom1 스트렙토마이세스 속 Bom2
누에 유충 95-100 95-100
흰불나방 유충 15-35 20-40
담배거세미나방 유충 17-30 21-35
과밤나방 유충 36-80 55-80
집파리 유충 50-75 42-70
표 8에서 보는 바와 같이, 나방이과의 해충, 파리목의 유충 등에 대하여 살충능력이 확인되었다.
본 발명의 스트렙토마이세스 속 Bom1 또는 Bom2는 항균 물질, 살충 물질 및 키틴분해저해 물질을 동시에 생산하므로 본 발명의 균주의 배양액을 포함하는 생물 농약은 항균능과 살충능을 동시에 가지면서 곤충의 변태를 저해한다.

Claims (4)

  1. 항진균 물질, 살충 물질 및 키틴분해저해 물질을 생산하는 스트렙토마이세스 속의 Bom1(제 KFCC 10992 호).
  2. 항진균 물질, 살충 물질 및 키틴분해저해 물질을 생산하는 스트렙토마이세스 속의 Bom2(제 KFCC 10993호 ).
  3. 제 1 항 또는 제 2 항의 균주 배양액, 전분, 조단백질 및 암석분을 함유함을 특징으로 하는 생물농약 조성물.
  4. 생물농약의 제조에 있어, 제 1 항 또는 제 2 항의 균주 배양액을 전분, 조단백질 및 암석분에 흡착 건조시키는 것을 특징으로 하는 생물농약의 제조방법.
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