KR19990035906A - 염증성 질환의 치료를 위한 보먼-버크 저해제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 염증의 치료를 위하여 보먼-버크 저해제를 포함하는 조성물을 제공한다. IBD 및 간염의 치료에 있어서 본 조성물을 사용하는 방법 또한 제공한다.

Description

염증성 질환의 치료를 위한 보먼-버크 저해제 조성물

본 발명은 국립 보건협회(National Institutes of Health)가 후원하는 연구의 과정에서 생겨난 것이다. 미국 정부는 본 발명에 대한 일정한 권리를 가질 수 있다.

본 발명은 염증성 질환의 치료를 위한 조성물 및 그 치료방법에 관한 것이다.

프로테아제 저해제들은 일반적으로 콩류, 곡류, 견과류, 과일류 및 채소류와 같은 여러 가지 다른 종류의 음식물에서 발견되는 조성물들의 군(classes)이다. 가장 특징적인 프로테아제 저해제의 하나는 소이빈(soybean)으로부터 추출된 보먼 버크 저해제(BBI)이다. 이것은 서로 다른 결합위치에 트립신 및 키모트립신과 1 : 1로 결합하는 7개의 이황화결합을 가지는 71아미노산 사슬이고 대략 8,000의 분자량을 갖는다.

프로테아제 저해제의 생체내 및 시험관내 연구에서, 특히 BBI는 효과적인 항암 인자임을 보여준다. 이는 보먼에 의해 기술된 효소저해제에서 나타났으며, Proc. Soc. Exptl. Med. 1946, 63, 547 and Birk et al., Bull. Res. Council Israel 1962, Sec. 1, 11, 48 and Biochim. Biophys. Acta 1963, 67, 326, 그리고 계속해서 보먼-버크 저해제(Bowman-Birk Inhibitor; BBI)로 언급되며, 배양균 및 실험동물에 있어서 방사능적 또는 화학적으로 유발되는 세포의 악성형질 전환을 막거나, 또는 적어도 상당히 감소시킨다.

Yavelow et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1985, 82, 5395-5399에서는, 가공하지 않은 콩 추출물을 아세톤으로 탈지하면 시험관에서의 세포형질 전환을 효과적으로 막을 수 있다고 보고하였다. 이러한 관찰결과들은 역학적 자료와 함께, 특히 결장암에 대한 추정상의 식이요법 함암제로서 BBI를 제시하였다.

Weed et al., Carcinogenesis 1985, 6, 1239-1241에서는, 보먼-버크 프로테아제 저해제를 포함하는 소이빈의 추출물을 디메틸히드라진(DMH) 규정식에 첨가하여 치료한 쥐가 결장점막의 선종양을 두드러지게 회복하는 결과를 얻었다고 게재하고 있다. 쥐에서 DMH-유도된 결장암은 일반적으로 인간의 결장에서 종양을 유발하는 것과 유사한 결장 및 직장의 선암종을 유발하여, 바람직하지 않은 부작용없이 인간 결장암의 발달에 대한 방어를 할 수 있는 어떤 종류의 식이적 첨가가 연구되는 가능성을 제시하는 인간의 질환에 대한 뛰어난 동물 모델로 간주된다.

상기 BBI 추출물 및 그 제조에 대한 방법은 Yavelow et al., Cancer Res. 1983, 43, 2454-2459; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1985, 82, 5395-5399에서 기술되었다.

Messadi et al., JNCI 1986, 76, 447-452에서는 햄스터 볼주머니(cheek pouch)에서 7, 12-디메틸-벤즈(a)안트라센(DMBA)-유도되는 발암을 억제하는 프로테아제 저해제 BBI를 포함하는 소이빈 추출물이 설명되어있다. 이러한 경구 암 모델은 동일한 병력(histopathology), 성장패턴 및 대부분의 인간 경구암, 편평 상피암의 일반적인 형태와 같은 전암증상의 장애를 갖는다. 본 연구는 햄스터 볼주머니 발암현상이 BBI에 의해 저해될 수 있음을 보여주며 인간 경구암도 유사하게 BBI에 반응한다는 것을 시사한다. 본 연구에서 BBI 조합제(preparation)는 Yavelow et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1985, 82, 5395-5399에 기재된 바와 같이 자연 그대로의 저해제 추출물이 제공된다.

Baturay et al., Cell Biology and Toxicology 1986, 2, 21-32에서는 조(crude) 소이빈 추출물이 아세톤으로 탈지된 BBI 조합제가 공통-발암성물질(co-carcinogen), 피렌(pyren)에 대한 증가 또는 증가없이 시험관내에서 방사선 및 화학적으로 유도되는 형질전환을 억제한다고 게재하였다. Yavelow et al., 1985에서는 순수 BBI 또는 C3H1OT1/2 세포들에서 방사유도되는 형질전환을 억제하는 방법과 일치되는 제조된 BBI 추출물을 보여준다. Kennedy et al., 1984에서는 순수 BBI 또는 제조된 BBI 추출물이 Bloom's syndrome(일반 암보다 발병률이 높아 환자들이 감염되기 쉽다고 생각되는 높은 수준의 염색체 이상이 있는 유전성 질환)을 앓는 환자의 세포에서의 염색체 이상 정도를 감소시키는 방법과 일치된다고 보고한다. 다른 연구에서도 콩-추출된 프로테아제 저해제가 생체내에서 피부, 흉부 및 간암발생에 대한 억제효과가 있음을 시사한다.

Kennedy et al. in Anticarcinogenesis and Radiation Protection, edited by Cerutti et al., Plenum Pub. Co. 1987, pp. 285-295 에서는 아세톤으로 탈지되어 조합된 조BBI 추출물을 사용하는 여러 시스템에서 BBI가 종양발생을 억제한다고 발표하였다. 상기 결과들은 아주 낮은 농도의 BBI-타입 프로테아제 저해제 제조물들이 결장암에 대한 화학예방제로써 효과적임을 시사해 준다. 화학예방제로서의 프로테아제 저해제의 사용이 발생가능한 유독성의 문제에 의해 악화됨을 시사한 증거는 없다.

St. Clair et al., Cancer Res. 1990, 50, 580-586 에서는 0.5% 또는 0.1%의 반-정제된 BBI를 DMH 식이에 첨가하여 치료된 쥐가 통계학적으로 간 및 결장 종양의 혈관종 및 결절상의 이상증식의 중요한 억제결과를 얻었다고 보고하였다. 상기 연구의 결과는 또한 0.5% 또는 그 이하로 식이에 포함된 BBI는 쥐의 건강에 대해 해로운 효과가 없고 간 및 결장 종양을 억제하는 능력이 있음을 시사한다.

소이빈 추출물에 풍부한 BBI는, 보먼-버크 저해제 농축물(BBIC)이라 명명하고, 식품의약국으로부터 연구용 신약자격을 받고, 인간 암 화학치료제로서 평가하기위해 인간실험을 시작하였다.

Frenkel et al. Carcinogenesis 1987, 8(9), 1207-1212 에서는 12-O-테트라데노일-포볼-13-아세테이트(TPA)-프로테아제 저해제 및/또는 수퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD)의 부재 또는 존재하에서 활성화된 폴리모르포뉴클레어 류코사이트(PMNs)에 의한 H₂O₂의 형성을 관찰하였다. 프로테아제 저해제를 감자 저해제 1(PtI-1) 및 2(ptI-2), PtI-2(PCI-2)의 키모트립신 저해단편, 닭 난저해제(COI), 칠면조 오보뮤코이드 난저해제(TOOI), 보먼-버크 저해제(BBI), 리아 빈 저해제(LBI) 및 소이빈(Kunitz) 트립신 저해제(SPTI)를 포함하여 시험하였다. H₂O₂형성의 저해로 측정되는 활성화의 순서는 PtI-1≥PCI-2＞PtI-2＞COI＞BBI≥TOOI＞LBI＞SBTI로 트립신 특성이 아닌, 키모트립신에 대한 프로테아제 특성을 보여주고, 흥분한 인간 PMNs 산화의 돌발기간 동안 활성 산소류의 형성을 저해할 수 있음을 보여준다.

Perlmann et al., Methods Enzymology 1970, 19, 860-861에서는 탈지 소이빈 추출물로부터 BBI를 얻는 상세한 방법이 설명되어 있다.

미국특허 제4,793,996호(Kennedy et al.)는 아세톤으로 소이빈을 처리하고, 에탄올 추출 및 BBI를 얻기 위한 아세톤 침전으로 구성되는 방법을 게재하고 있다. 상기 소이빈은 아세톤 처리전에 탈지될 수 있다. 또한 BBI는 통상적인 방법에 의해서 더 정제될 수 있다. Kennedy 등은 소이빈에서 BBI를 제조하는 통상의 방법에서 세포의 악성 형질전환을 저해할 수 있는 BBI의 작용에 역효과가 남는다는 사실을 발견하였다. 이 요소가 제거되면 BBI 생성물은 세포의 악성 형질전환을 저해할 수 있었다. 에탄올 추출단계 전에 아세톤으로 소이빈을 처리함으로써 이 요소를 제거할 수 있다는 것이 Perlmann 등에 의해서 지적되었다.

Kennedy 등은 단지 단일 단백질을 포함하는 생성물을 얻기 위해 요구되는 완벽한 추출물의 정제과정을 수행하는 것이 불필요함을 지적하였다. 대신에 그들은 조저해제 추출물이 얻어지는 시점에서 정제과정을 멈추는 것이 효과적이란 것을 발견했다. 이러한 조추출물은 그 자체로 경구를 통한 식용에 적합하고 세포의 악성 형질전환에 대한 저해제로 사용될 수 있다. Kennedy 등은 악성 세포 형질전환 저해제를 포함하는 조소이빈 추출물을 제조하기 위해 소이빈을 탈지하고 상기 탈지된 소이빈으로부터 상기 저해제를 추출하는 단계로 구성되는 단계를 개시하고 있다.

BBI의 항암활성이 알려져 있음에도 불구하고 그 항염증적인 효과는 아직까지 알려지지 않았다.

본 발명의 목적은 염증의 치료를 위한 BBI 조성물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 염증성 결장 질환을 가진 동물에게 투여하는 BBI의 유효량을 포함하는 동물의 염증성 결장질환을 치료하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 간염을 가진 동물에게 투여하는 BBI의 유효량을 포함하는 동물의 간염을 치료하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

도 1은 프로테아제 활성에 대한 인체 생검시료의 분석을 보여준다. 감염되지 않은(즉 정상으로 보이는) 인체 결장 점막의 생검시료 및 감염된 부분의 결장상피를 궤양성 결장염 환자로부터 얻었다. 상기 시료들은 젤라틴 지모그램에서의 프로테아제 활성을 위하여 균질화되어 분석되었다. 50㎍의 단백질을 겔의 각 레인(lane)에 놓았다. 시료들은 처리되지 않거나 또는 지모그램에서 실험되기 전에 트립신으로 활성화되었다. 감염된(Involved): 결장의 감염된 부위로부터의 조직 생검. 감염되지 않은(Uninvolved): 정상적으로 보이는 결장의 상피로부터 얻은 물질. 44 kDa 프로테아제는 결장의 정상적으로 보이는 부위로부터 얻은 비활성화된 시료에는 존재하지 않는다. 그러나 이 프로테아제는 UC환자의 결장의 감염된 부위에서는 (트립신 활성없이) 존재한다. 도 1 우측의 숫자는 kDa의 분자량을 나타낸다. 도 1 좌측의 화살표는 44 kDa 프로테아제 활성의 위치를 가리킨다.

도 2는 염증성 볼주머니 질환의 쥐 모델 시스템에서의 궤양성 결장염 병변과 관련된 단백질분해 활성의 분석을 보여준다. 조직은 7일째되는 DNBS/에탄올 시료로부터 얻었다. 결장조직의 작은 조각이 제거되고, 평량되어 차가운 포스페이트 완충 염수(PBS) 400㎕와 함께 2㎖ 마이크로퓨지 튜브에 넣어졌다. 상기 조직은 조직 균질화기에서(얼음위에서) 10분간 연마되었고 PBS 1㎖ 당 50㎎ 조직이 되도록 최종농도를 맞추기 위해서 PBS가 첨가되었다. 상기 시료들은 얼음 위에서 10초간 초음파로 처리되었다. 상기 균질화된 조직은 5℃에서 5분간 14,000 × g로 원심분리되었다. 상청액은 추출되어 겔 구멍에 넣었다. 상기 겔이 운행되어 다른 칼럼들이 끊기어 다른 특정한 저해제를 포함하는 매개물에서 배양되었다. 결과에서 나타난 젤라틴을 갖는 SDS-폴리아크릴아미드 겔은 프로테아제의 특정한 류에 대한 저해제의 효과를 지적한다. 펩스타틴(아스파르트 프로테아제에 대한 저해제) 및 NEM(티올 프로테아제에 대한 저해제)은 작은 효과를 갖는 대신, EDTA(메탈로 프로테아제에 대한 저해제)는 시료에서의 단백질분해 활성에 영향을 미치는 어떤 능력을 갖는다. DFP(세린 프로테아제의 저해제; DFP는 또한 신경가스로도 알려져있다) 및 BBI는 반드시 UC병변에 존재하는 단백질분해 활성을 파괴한다. 이들 연구에서, DFP는 BBI가 1.25μM 사용될 때, 1mM 사용되었다; 그리므로 BBI는 UC 병변에서의 단백질분해를 저해하는데 있어 DFP보다 현저히 낮은 농도에서 효과적이다.

도 3은 쥐 결장의 UC 병변에서 두 개의 다른 BBI 생성물(BBI 및 BBIC)의 치료효과를 보여준다. BBI 또는 BBIC(10㎍/㎖)는 약간의 생검시료에 첨가되어 균질화되고 젤라틴 지모그램에서 프로테아제 활성이 분석되었다. 14일째 DNBS/에탄올 치료된 동일한 쥐의 결장시료는 프로테아제/지모그램 분석에 사용되었다. 상기 겔은 200V에 40분간 다뤄진 후 조각으로 나뉜다. 각 겔/칼럼은 하기와 같이 처리된다: 1)대조-함유하는 5ng 트립신; 2) pH 8.0의 Tris에서 배양된 UC시료; 3)10㎍/㎖의 최종농도를 얻기위해 첨가된 BBI와 pH 8.0 Tris에서 배양된 UC 시료; 4)10㎍/㎖의 최종농도를 얻기위해 BBI와 대조-함유하는 5ng 트립신; 5)10㎍/㎖의 최종농도를 얻기위해 첨가된 BBIC와 pH 8.0의 Tris에서 배양된 UC 시료를 최종농도가 10㎍/㎖가 되도록 첨가; 6)10㎍/㎖의 최종농도를 얻기위해 첨가된 대조-함유하는 5ng 트립신과 BBIC를 최종농도가 10㎍/㎖ 되도록 첨가.

레인 4 및 6을 레인 1과 비교할 때, BBI 및 BBIC가 트립신의 단백질분해 활성을 효과적으로 저해하는 것을 관찰할 수 있다. 이 결과는 BBI가 UC 시료에서의 단백질 분해 활성을 2.8배 저해할 때, BBIC는 활성을 3.1배 저해함을 제시한다. 상기 결과들은 스캐닝 농도계에 의하여 정량화되었다.

도 4는 정상적인 사람으로부터 취한 결장 점막 생검 부위에서의 단백질분해 활성의 레벨 및 결장암 발달의 위험성이 상승된 곳을 보여준다. 결장 암 발달의 위험성이 상승된 곳에서의 조직 시료들은 1) 궤양성 결장염; 2) 내시경적으로 절제된 하나 또는 그 이상의 아데노마성 개체가 갖는 역사(history), 즉 개체의 역사; 및 3)결장암을 갖게된 역사를 갖는 환자의 결장 점막에서 정상적으로 보이는 부위를 대표한다. 이들 데이터는 결장암 발달에 대한 정상적인 확률보다 높은 개인으로부터 취한 결장 점막조직에서의 단백질분해 활성의 일정한 형태의 상승된 레벨이 있음을 제시한다.

도 5는 DNH＋BBI로 처리되는 쥐와 DMH만을 제공받는 쥐에서의 세가지 다른 기질에서 측정되는 단백질분해 활성의 감소를 보여주는 데이터를 제공한다.

결장 점막 생검 시료부위는 결장암 발생 연구에서 동물에게 DMH의 마지막 양이 투여된 한달 후 동물로부터 취한다. 결장점막의 정상적으로 보이는 부위에서, DMH 처리결과는 정상적인 동물에서 관찰되는 레벨과 비교해서 단백질분해 활성의 레벨이 훨씬 높고, DMH 노출된 정상적으로 보이는 부위를 BBI 치료한 결과는 DMH에 노출되지 않은 대조동물과 활성의 레벨이 크게 다르지 않았다.

염증성 결장질환(IBD)은 19세기 초에 설명되어졌고 후에 궤양성 결장염 및 Crohn's 질환의 두 주요 범주로 나뉘어졌다. IBD 경우의 작은 부분집합이 있는데 어떤 범주로도 나뉘지 않을 뿐 아니라 IBD 타입으로 분류되는 경우도 거의 드물다. 미국에서의 IBD 판정에 있어 적지않은 편차가 있으나, 대부분의 연구에 백만 내지 2백만이 감염되어있고, 해마다 20,000 내지 25,000의 새로운 환자가 발생한다고 예측한다. 백인에게 있어 Crohn's 질환의 발병연령은 15∼30세가 최고점이고, 궤양성 결장염의 발병연령은 20∼35세가 최고점은 비모달(bimodal) 분포를 한다. 이 질환의 두 번째 최고점은 약 70세에서 나타난다. 일반적으로 보다 젊은 나이에 발병하는 질환일수록 더 심각하다. 산업화된 국가들, 특히 미국 및 북부유럽은 IBD의 비율이 높으나, 일본 및 남미국가들은 발병율이 낮다.

궤양성 결장염은 주로 결장의 점막벽에 감염되는 질환이나 회장의 말단부분에 감염될 수도 있다. 상기 질환은 경감될 수 있으나 대개 재발할 것이다. 임상적 징후는 전형적으로 복통, 피로, 체중감소, 유혈 설사 및/또는 변비를 동반한다. 전격적으로 발병하는 경우에는 궤양성 대장염이 생명을 위협할 수도 있다. 단지 약 10%의 환자들만이 장의 외부손상을 가질 수 있고 약 20-25%의 환자들이 이 질환에 걸린 10년 후에 결장절제를 할 수도 있다. 이는 또한 피부, 간, 담관, 관절, 혈액 디스크라시아스(dyscrasias) 질환 및 시각장애와 병행될 수도 있다. 궤양성 결장염 환자의 내시경적 및 병력학적 평가는 결장 점막의 대칭적이고 연속적인 염증을 보여준다. 상기 질환은 대개 직장(rectum)에서 발생하고 항문 및 회장으로 진행된다. 상기 질환은 연속적이다. 진무름(erosion) 및 염증의 임상적인 유형은 치료가 수반되고 종종 점막표면에 염증성 삼출물이 있다. 급성질환인 경우는 소낭 농양에 의해 구별되어지고 궤양이 근육층까지 전파되고 두드러진 염증세포의 침투를 동반한다. 만성의 경우 부가적인 섬유화 및 림프원형질 세포의 침투 및 점막구조의 파괴를 동반한 장벽의 비대화가 발생한다. 궤양성 대장염의 병인학은 알려져 있지 않다.

Crohn's 질환은 결장벽 모든 층을 포함하는 만성적 재발과정이고 구강에서부터 항문에 이르는 소화기관의 어디에서나 발생할 수 있다. 임상적인 징후로는 전형적으로 설사(유형 또는 무혈), 복통 및 체중감소가 있다. 이는 종종 항문주변의 누관형성을 수반한다. 또한 심각한 신장 질환과 관계된 Crohn's 질환도 있다. 내시경 및 병역학적으로 Crohn's 질환은 패치(patchy) 즉 병변(lesions)에 대한 명확한 경계를 가진 부분적인 질환이다. 상기 장(intestine)은 비대화되고 섬유화되며 만성의 경우에는 장내면이 길고 울퉁불퉁한 균열이 있는 고무 호스처럼 딱딱해질 수 있다. 만성적 장벽변성(transmural) 염증, 장벽내의 누(sinuses), 림프성 집합체, 및 비-건락화 육아종들은 Crohn's 질환의 주요 특성이다. Crohn's 질환의 병인학은 알려져 있지 않다.

금세기초 이후로 IBD는 결장암의 증가된 위험율과 관련하여 알려져 왔다. 조사자료는 궤양성 대장염이 Crohn's 질환에 비해 약간 더 결장암으로 발전하기 쉽고 질병의 초기기간으로부터의 시간과 함께 암으로 발전하는 기회가 증가하다고 지적한다. 만약 소장의 Crohn's 질환의 아니라면 결장외부 다른 부위에서는 암의 위험성이 증가하지 않는다. 소장벽의 Crohn's 질환을 가진 환자에 있어서, 소장벽의 선암종의 위험성은 일반인에 비해 50 내지 100배이다. 레트로스펙티브 스터디(retrospective study)에서, 궤양성 대장염 환자에 비해 일반인이 결장암에 걸릴 위험성이 3 내지 30배 작고 Crohn's 질환 환자에 비해서는 4 내지 20배 작다. 위험성의 산정에 있어서 편차는 인구조사의 타입, 조사 기간 및 방법, 및 다른 역학적 인자에 의한다. 결장성 염증의 범위 및 기간은 IBD 환자의 암에 있어서 주된 위험성 인자로 나타나고 질병의 초기 이후로 8 내지 10년동안 위험성이 급격히 증가한다. 결장종양으로의 발전에 이르는 만성염증의 효과가 인정되고 있다. IBD 환자의 암진단은 암증상을 차폐함(masking)때문에 복잡하다. 전형적으로 IBD 환자들은 해마다 내시경 검사, 및 형성장애(dysplasias) 및 암의 발달의 관찰하기 위한 생검을 받는다.

병인학에 대한 유행지역조사는 유전, 대사적 결함, 점막적 결함, 면역학적 장애, 자가면역 및 식이적 인자를 포함한다. 유행지역 조사는 면역조절, 시토킨(cytokines), T세포 및 항산화제 같은 지극히 특정한 표적을 갖는 대체제의 이용을 포함하는 치료학 발달에 관심을 둔다.

본 발명은 염증치료를 위한 BBI를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직한 구체예에서 이러한 조성물은 제약학적으로 수용가능한 담체를 더 포함한다. 이들 조성물들은 염증성 장질환 및 간염의 치료에 특히 효과적이다. "BBI"는 어떤 보먼 버크 저해제나 보먼 버크 저해제 생성물도 포함하는 것을 의미하고 이 기술 분야에서 알려진 방법에 의해 제조된 BBI 및 미국특허 제5,217,717호의 방법과 관련하여 제조되는 BBI 농축을 포함하며 이에 제한되지 않는다. 또한 BBI를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하여 동물의 염증을 치료하는 방법도 제공된다. "동물"이란 인간을 포함한 포유동물을 포함하는 것을 의미하며 이에 제한되지 않는다.

질병예방적 식이 보충으로써 또는 제약학적으로 청구된 조성물의 유효량의 투여는 본 발명의 내용속에 있다. "유효량"이란 용어는 일정 형태의 단백질 분해 활성, 예를 들어 44 kDa 단백질의 발현을 막는 양으로 언급된다. 이러한 양은 알려진 방법과 관련된 해당분야의 기술에 의해서 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 비경구적으로, 직장으로, 국소적으로, 피부를 통하여, 또는 경구적으로 투여할 수 있으며 경구적 투여가 바람직하다. 제약학적 또는 질병예방적 식이 보충의 형식화의 예는 시럽, 현탁액, 유상액, 정제(tablets), 캡슐, 정제(lozenges) 및 양치질 약등을 포함하며 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 한 구체예는 현탁액 또는 제약학적으로 수용가능한 액체상 담체내에 있는 현탁액 또는 조성물 용액을 포함하는 액체상의 형태이다. 적합한 액체상 담체는 에탄올, 글리세린, 폴리에틸렌 글리콜 같은 무수용액, 오일(oils) 또는 부유제를 함유한 물, 방부제(preservatives), 조미료(flavorings) 또는 염색제, 또는 적당한 이들의 조합이 있으며 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 유용한 또 다른 BBI 조성물의 액체상 형태는 연장된 점막과의 접촉시간을 제공하는 안정된 양치질약 용액으로, 맛있고, 투여하기 쉬우며, 저비용 대량생산에 적합하다. 타액 대체제는 점막 접촉기간 및 생물학적 이용효능을 증가시키기 위해 필요한 점액질 용액을 제공하고, 많은 화합물의 연속적인 방출을 제공한다고 알려져 왔다. BBI 농축(BBIC) 생성물의 한 형태로는 소르비톨, 카르복시메틸셀룰로스, 또는 메틸파라벤 및 물이 포함된다.

또 다른 구체예에서는, 정제(tablets) 형태의 조성물을 고체 형태를 만들기 위해 정기적으로 사용되는 어떤 적합한 제약학적 담체를 사용하여 제조된다. 이러한 담체의 예로는 마그네슘, 스테아레이트, 녹말, 락토스, 수크로스 및 셀룰로스를 포함하며 이에 제한되지 않는다.

캡슐형태의 조성물은 일정한 캡슐화 과정을 사용하여 제조된다. 예를 들어, 펠렛(pellets), 과립 또는 본 발명의 조성물을 함유하는 분말이 표준담체를 이용하여 제조될 수 있고 그후 단단한 젤라틴 캡슐에 채워진다. 양자택일적으로, 분산(dispersion)액이나 현탁액이 적당한 제약학적 담체를 사용하여 제조될 수 있고 상기 분산액이나 현탁액은 부드러운 젤라틴 캡슐에 채워진다. 적당한 제약학적 담체는 수성 고무질(agueous gums), 셀룰로스, 규산염 및 오일을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

또 다른 구체예에서는, 비경구적 투여를 위한 조성물이 용액이나 현탁액으로써 처방된다. 이 용액 또는 현탁액은 일반적으로 무균 수성 담체 또는 비경구적으로 수용가능한 오일이 본 발명의 조성물을 포함한 부분이다. 비경구적으로 수용가능한 오일의 예는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 피롤리돈, 레시틴, 아라키스 오일 및 참깨 기름을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 선택적으로 상기 용액은 냉동건조할 수 있고 그후 투여직전에 적당한 용매로 복원된다.

만성 결장염을 위한 합텐-유도된(hapten-induced)모델은 IBD 병인학에서의 면역학적 성분이 있다는 이론에 바탕을 두고 발전하여 왔다. 이 모델은 보호점막 및 2,4,6-트리니트로벤젠술폰산(TNBS)을 제거하기 위해 에탄올을 사용한다. 관련된 모델에서 2,4,6-디니트로벤젠술폰산(DNBS)은 TNBS모델과 유사하게 결장에서의 만성 염증 및 궤양을 만드는데 사용된다. 이들 모델은 만성 결장염의 염증의 치료를 측정하는데 사용되어 왔다.

정상적인 인체 생검 시료 및 결장상피의 감염된(involved) 부위의 인체 생검 시료는 궤양성 결장염 환자로부터 얻는다. 상기 시료들은 젤라틴 지모그램(zymograms)에서의 프로테아제 활성을 위해서 균질화되고 분해된다. 50마이크로그램의 단백질을 각 겔의 레인(lane)에 담는다. 시료들은 지모그램에서 실험되기 전에 처리되지 않거나 또는 트립신으로 활성화된다. 결장의 감염된 부분으로부터의 조직 생검은 브러싱(brushing) 과정을 이용하여 얻는다. 정상적인 또는 감염되지 않은 결장의 상피도 같은 방법으로 얻는다. 도1에서 보여주는 바와 같이 정상적인 결장의 상피로부터 얻은 활성화되지 않은 시료에는 44 kDa 프로테아제가 없다. 다른 결장 생검 시료들로부터도 유사한 결과를 얻었다.

BBI 및 DFP는 둘다 UC 병변에 존재하는 프로테아제의 활성을 저해하는 효과가 높고 시료에 존재하는 거의 모든 프로테아제 활성을 제거한다. 도2 참조. 스캐닝 농도계로 분석한 결과로, 그 칼럼은 BBI 칼럼보다 7.7배 이상의 활성을 갖고; EDTA 칼럼보다 1.6배 이상 그리고 DFP 칼럼보다 10.1배 이상의 활성을 갖는 프로테아제 저해제 활성이 없는 UC 병변을 나타낸다. 펩스타틴(아스파르트 프로테아제의 저해제) 및 NEM(티올 프로테아제의 저해제)는 UC 병변에서의 프로테아제 활성에 적은 영향을 갖는다.

유사한 지모그램들은 UC 병변에 존재하는 단백질분해 활성에 대한 BBI의 효과에 대 BBIC의 효과를 비교하기 위해 분석된다. 이러한 결과들은 도3에 나타내었다. UC 병변에 존재하는 단백질 분해 활성의 저해에 있의 BBI 만큼 BBIC가 효과적임의 도3에서 관찰할 수 있다.

도2 및 도3에서 나타난 결과는 BBI 및 BBIC의 영향을 받는 UC 병변에서 높은 레벨로 존재하는 몇몇 다른 단백질분해 활성이 있음을 제시한다. 프로테아제 중의 하나가 IBD의 원인으로 작용하고 UC병변에 존재하는 것은 44 kDa 프로테아제이며 그 44 kDa 프로테아제는 UC의 쥐모델에서 BBI에 의해서 프로테아제 활성이 저해된다고 믿어져 왔다. 상기 BBI는 다른 형태의 실험에서 관찰되어진 다른 잠재적으로 중요한 단백질분해 활성의 표현 레벨에 영향을 미칠 수 있다. 이들 특정한 단백질분해 활성의 레벨은 생체내 및 시험관내에서의 발암물질-처리된 세포에서 증가하고 암발생의 위험성이 정상적인 것보다 높은 인체조직에서의 레벨이 높아진다. UC 환자의 결장 점막의 생검 시료에서의 단백질분해 활성의 레벨은 결정되어졌다. 도4에서 보여지는 바와 같이, 감염되지 않은 즉 정상적으로 보이는 UC 환자에서의 결장점막 부분에서의 마커(marker) 단백질분해 활성의 레벨을 상승시킴을 보여준다. BBI를 포함하는 조성물을 사용하는 치료는 UC환자의 결장의 감염되지 않은 부분에서의 이들 단백질분해 활성의 상승된 레벨을 정상적인 레벨로 되돌려 놓을 것이다. 동물에서의 결장암발생 연구에서 특정한 단백질분해 활성이 DMH-처리된 결장 점막에서 상승되고 상기 DMH 및 BBI 또는 BBIC 처리를 받은 동물은 DMH-유도된 결장암 발생의 BBI 억제에 필적하는 이들 단백질분해 활성의 레벨이 감소되는 것이 관찰되었다. BBI를 포함하는 조성물로의 치료는 UC 환자의 정상적으로 보이는 결장 점막에서의 이들 단백질 분해 활성의 레벨을 조절할 수 있어서, 궤양형성에 이르는 염증의 진행을 막는다. 도4에서의 히스토그램으로부터 얻은 데이터는 각 환자 즉, UC 또는 정상적인 개인에 대한 것으로, 하기 표1에 나타내었다. IBD의 발생이 있거나 없는 모든 결장점막의 생검 시료들은 결장 점막의 정상적으로 보이는 부분으로부터 취한다.

상대적 형광성의 단위(RFU)/hr/μg단백질

정상적 생검
기질	환자
	표본1	표본2	표본3	평균	표준편차
Boc-Val-Pro-Arg	24.17	43.23	38.41	35.27	9.91
Boc-Val-Leu-Lys	3.19	3.83	8.33	5.12	2.80
Glt-Gly-Arg	2.15	1.41	2.62	2.06	0.61

궤양성 결장염 생검
기질	환자
	UC1	UC2	UC3	UC4	평균	표준편차
Boc-Val-Pro-Arg	72.50	714.00	47.71	66.26	225.12	326.09
Boc-Val-Leu-Lys	20.00	92.40	8.74	12.83	33.49	39.55
Glt-Gly-Arg	20.58	41.20	9.69	4.31	18.95	16.31

단백질분해 활성의 레벨은 하기에 의해서 판단된다. 결장 점막의 생검시료는 얼음에서 녹고 무균 테프론-유리 균질기의 얼음-냉각된 PBS에서 균질화된다. 단백질분해 활성의 레벨은 0.1M 트리스(pH 7.5)-5mM CaCl₂에서 하기 합성기질 각각과 함께 시료의 앨리쿼트(aliguots)를 배양함에 의해 측정된다: Boc-Val-Pro-Arg-MCA; Boc-Val-Leu-Lys-MCA; 및 Glt-Gly-Arg-MCA(peninsula Laboratories, Inc., Belmont, CA). 37℃에서 2시간 배양 후, 상기 반응은 1.8㎖의 증류된 H₂O로 희석함으로서 종결된다. 아미노-메틸 쿠아린, 형광성의 리포터 그룹의 해체는 380 및 460㎚의 여기 및 발산 파장 각각에서 분광광도분석적으로 결정된다. 단백질 알갱이(content)는 Anal. Biochem. 1976, 72, 248-254에서 기재된 것과 같은 Bradford 방법으로 표본으로 소의 혈청 알부민을 사용하여 판단한다. 데이터는 단백질의 편차에 의해서 표준화되고 단백질 분해활성/μg 단백질로 표현된다. 이들 테이타는 도4에 나타나있다. 시험을 할 때, Welch's 보정을 이용하여 불균등한 변화를 계산하여 조정할 때, 얻어진 p-값이 UC환자에 비해 정상적인 조절의 단백질분해 활성 레벨이 각각 판이하게 다르다는 것을 나타낸다.

대조 쥐 대(vs.) 화학적 발암물질 DMH에 노출된, BBI 치료를 하거나 하지않은 쥐의 결장 점막 생검시료에서의 단백질 분해 활성의 레벨을 판단하기 위해 유사한 연구가 수행되었다. 이러한 연구에서, 동물들은 3주동안 매주 2회씩 DMH로 처리되거나 처리되지 않았다. 상기 DMH의 투여된 양은(총투여량 80㎎/㎏) 동물에서의 결장암을 유발시키기 위한 것임을 이미 기재하였다. 처리된 동물의 한 그룹을 또한 DMH 투여기간 동안 그리고 그 후에도 0.1% 식이 BBIC에 노출시켰다. DMH를 투여한 나머지 동물들은 한달후 죽었다. 인체 점막 생검시료에 대한 평가로서 결장 생검시료를 얻고 단백질 분해 활성 레벨이 판단되었다. 이들 연구에서의 데이터는 하기의 표2에 나타나 있다.

대조: 1동물, 3시료들

프로테아제 활성/μg단백질
RFU/hr/μg단백질	평균	표준편차
Boc-Val-Pro-Arg-MCA	15.97	0.12
Boc-Val-Leu-Lys-MCA	3.07	0.04
Glt-Gly-Arg-MCA	1.21	0.04

DMH: 1동물, 3시료들

프로테아제 활성/μg단백질
RFU/hr/μg단백질	평균	표준편차
Boc-Val-Pro-Arg-MCA	43.43	0.67
Boc-Val-Leu-Lys-MCA	10.15	0.16
Glt-Gly-Arg-MCA	6.15	0.04

DMH＋BBI: 1동물, 3시료들

프로테아제 활성/μg단백질
RFU/hr/μg단백질	평균	표준편차
Boc-Val-Pro-Arg-MCA	22.22	0.03
Boc-Val-Leu-Lys-MCA	1.96	0.03
Glt-Gly-Arg-MCA	0.81	0.00

이들 데이터는 또한 도5에 나타내었다. 이들 결과는 DMH만을 처리한 한달 후 단백질분해 활성의 레벨이, DMH-폭로된 동물이 BBIC로 치료된 거의 정상적인 단백질분해 활성의 레벨보다 두드러지게 상승됨을 가리킨다. 이들 연구의 결과는 발암성이라고 알려진 DMH의 양에서, 동물은 그 마지막 양이 투여된지 한달 후 단백질분해 활성의 레벨이 급격히 상승됨을 보여준다. 동물에게 결장암을 유발시키는 DMH 처리의 조건하에서, 0.1% 식이의 BBIC는 많은 수의 결장암 동물 및/또는 각 동물의 종양수를 두드러지게 감소시킨다. 이들 데이터는 식이의 BBIC가 결장암 동물의 수를 감소시키는 조건하에서, 또한 DMH-처리된 동물들의 프로테아제 레벨을 감소시킨다는 것을 보여준다. BBIC처리는 처리되지 않은 대조 동물에서 관찰되는 DMH-상승된 프로테아제 레벨을 급격히 감소시킬 수 있다. 이들 실험의 결과들은 DMH＋BBIC 처리그룹은 DMH처리 그룹에서의 관찰된 레벨과 비교해 프로테아제의 레벨이 상당히 감소됨을 보여준다. BBI 및 BBIC의 항-암발생 활성을 위해 필요한 양은 염증의 감소 및 저해를 위해서도 유용하고, 이러한 항-염증성 활성은 단백질분해 활성의 레벨이 감소하는 것과 상관관계가 있다고 인정된다.

IBD 증상 및 UC환자의 내시경적 관찰에 의한 거시적 염증의 경감에 있어서의 BBI를 포함하는 조성물의 효험을 판단하기 위한 인간의 시도에서, BBIC의 4종류의 다른 사용량, 즉, 100, 200, 400 및 800 키모트립신 저해제(C.I.) 단위로 연구될 것이다. 200 C.I. 단위 사용량은 대략 전통 일본식이에서 소이빈 프로테아제 저해제 활성의 양이다. 각 사용량 그룹당 8명의 환자가 연구될 것이다. 환자들은 3달동안 알약 형태의 BBIC를 먹을 것이다. 그들은 BBIC 치료기간동안 총 3번(연구를 시작할 때, 연구에 접어든지 1.5달째, 그리고 BBIC 치료를 시작한지 3달 후) 그리고 BBIC 시도 기간이 끝난지 한달후에 관찰될 것이다. 유동적인 S자 결장경(sigmoidoscopy) 및 생검 과정은 BBIC 치료가 수행되기 전 및 3달의 시도기간의 마지막에 실시된다. 1) Boc-Val-Pro-Arg, Boc-Val-Leu-Lys, 및 Glt-Gly-Arg 기질의 가수분해에 의해 판단되는 단백질분해의 활성; 2) 44 kDa 프로테아제의 특이적 단백질분해 활성; 및 3) 시토킨 IL-1β, IL-6 및 TNF-2 와 같은 염증마커의 레벨 및 지질과산화; 의 분석을 위해 세 개의 생검시료가 취해진다. UC환자의 결장 점막의 정상적으로 보이는 부분으로부터 취한 하나의 생검시료는 44 kDa 프로테아제의 레벨에 대한 분석을 하는 동안 기질 가수분해 평가를 위해 사용될 것이고 염증의 마커(markers)로는 가장 심하게 감염된 결장 점막의 부분으로부터 취한 두 개의 생검시료를 사용할 것이다. IBD 증상에 있어서의 BBIC의 효과는 이들 마커들의 효과와 상호관계가 있다. BBI 대사물의 혈액으로의 흡수 및 소변으로의 배출은 UC환자에 있어 BBIC 복잡한 투약 실험계획서의 일부로서 수행될 수 있다. 모든 소변시료들은 이후 3개월 연구에서 BBIC 투여의 시작, 중간 그리고 마지막 기간의 24시간에 걸쳐 수집된다.

환자에게 BBIC 조성물은 4가지 다른 양(25, 100, 200 및 400 C.I. 단위)이 양치질액처럼 투여되어 삼켜진다. 혈액 시료들은 BBIC 치료 전 및 BBIC 치료 약 4주일 후에 환자로부터 취해진다. 혈액 시료분석의 일부로서 간기능 검사가 수행된다. 정상적인 범위 이상의 혈청 글루타믹-옥살로아세틱 트렌스아미나제(SGOT) 및 혈청 글루타믹-피루빅 트랜스아미나제(SGPT)의 농도는 간염의 일반적인 증상이다. 이 연구가 갖는 세가지 주제는 상승된 SGOT 또는 SGPT에 있어, BBIC 치료는 이들 농도가 정상으로 돌아온다는 것에 기초를 둔다. 이들 연구에서 정상적인 SGOT의 농도범위는 5 내지 40 U/L이다. 이들 연구에서 정상적인 SGPT의 농도 범위는 7-56U/L이다. 본 연구로부터 얻은 테이타를 표3에 나타내었다.

환자I.D.(BBIC의 양)	혈액 시료	SGOT분석(U/L)	SGPT분석(U/L)
K.B.(25 C.I. 단위)	BBIC투여 전	H44	49
	BBIC투여 후	40	28
P.D(200 C.I. 단위)	BBIC투여 전	H55	H71
	BBIC투여 후	30	24
J.M.(400 C.I. 단위)	BBIC투여 전	H44	53
	BBIC투여 후	20	26

상기 숫자 옆의 "H"는 이들 임상적 실험분석에서 "High"를 나타낸다. 상승된 SGOT 및 SGPT의 농도를 정상치로 되돌리는데 있어서의 BBIC 치료의 효과는 BBI 조성물의 항-염증 효과와 일치한다.

하기 실시예들은 본 발명의 실시 및 정화 및 생성물의 실용성을 설명하기 위한 것이다. 이들은 단지 예시를 위한 것이지 본 발명을 한정하고자 하는 것은 아니다.

화학제품

DNBS는 ICN으로부터 구입했다. 젤라틴은 DIFCO(petroit, MI)로부터 구입했다. EDTA, 에탄올, DFP(디이소프로필플루오로포스페이트), 트립신 및 펩스타틴은 Sigma(St. Louis, MO)로부터 얻었다. 보먼-버크 저해제 농축(BBIC)은 Central Soya(Ft. Wayne, IN)로부터 얻었고; 그리고 정제된 BBI는 DEAE 이온-교환 크로마토그래피에 의하여 BBIC로부터 얻었다.

결장시료들

바이러스 항체가 없는, 38수컷 스프라그 도올리(Sprague-Dawley) 쥐(250-300g)는 Charles River Laboratories로부터 구입했고 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals에 따른 표준 세트(set)에 따라 아스팬 칩 배딩(aspen chip bedding)에 미세절연 우리(cage)를 설치하였다. 이들은 Purina Mills(St. Louis, MO)로부터 Laboratory Rodent Dict #5001에 공급된다. 동물들은 네 그룹으로 나뉜다: 음성의 또는 절차상의 대조 그룹; 염수관장을 실시한 양성의 대조 그룹; 0.25㎖의 에탄올이 주어지는 매개물 대조 그룹; 및 0.25㎖의 에탄올에서 30㎎의 DNBS가 주어진 DNBS/에탄올 그룹. 상기 화합물은 금속 위관영양 바늘을 그 끝이 항문으로부터 약 8㎝될 때까지 직장으로 삽입하여 관장함으로써 주어지는데, 이 위치는 대략 비장의 굴곡부위이다. 상기 동물들은 관장 후 약 30초간 억류되었다. 절차상의 대조 그룹에서의 3마리 동물; 각 동물은 1, 3 및 7일에 CO₂로 안락사시켰다. 양수 대조그룹에서의 5마리 동물; 쥐 1마리는 1일, 쥐 2마리는 7일, 그리고 2마리는 14일째에 안락사시켰다. 남아있는 치료된 그룹에는 각각 15마리의 동물이 있었다. 각 그룹에서 다섯 마리의 동물이 있었다. 각 그룹에서 다섯 마리의 동물을 관장전 1일, 7일 및 14일에 CO₂로 안락사시켰다. 모든 동물들은 살아있는 1일, 7일 및 14일에 체중을 측정하였다. 결장의 몸부위 8㎝를 제거하여 세로로 절개하였다. 배설물을 제거하고 조직은 염수에 씻었다. 결장에서의 총 병변은 궤양, 염증 및 출혈(MG)에 근거하여 측정하였다. 결장은 다시 세로로 잘라서 반은 포르말린에 넣었고 나머지 반은 드라이아이스에 넣고서 프로테아제 활성을 분석할 때까지 -80℃로 냉동시켰다.

병역학

포르말린 고정 결장 조직은 전통적인 유형으로 진행되었다: 파라핀이 끼워지고 헤마톡실린 및 에오신으로 착색되었다. 결장조각의 각 끝부분으로부터 얻은 하나의 시료와 결장의 중앙으로부터 얻은 두 개의 시료들을 취하여 각 조직을 검사하고 하기에 따라 등급을 매겼다.

0 = 정상

1a = 국소적인 진무름(상피표면에 한정된 손상)

1b = 점막에 한정된 염증

2a = 국소적인 궤양

2b = 트랜스무어럴(transmural) 염증

3a = 국소적인 궤양과 트랜스무어럴 염증

3b = 광범위한 진무름 및 트랜스무어럴 염증

4 = 광범위한 궤양 또는 정상 점막에서의 가장자리의 응고성 괴저 및 트랜스 무어럴 염증

5a = 광범위한 궤양 및 전체부위를 포함하는 트랜스무어럴 염증

5b = 광범위한 점막의 응고성 괴저 및 전체 부위를 포함하는 트랜스무어럴 염증

용어정의

진무름: 점막 부위가 떨어져나가는(missing)것이나 점막은 근육성 점막이 많이 남아있다.

궤양: 점막이 근육성 점막만큼 또는 그보다 더 깊게 떨어져 나간다.

트랜스무어럴(transmural): 점막, 점막아래, 근육성 층 및 장막을 포함한다.

조직 시료채취 및 균질화

결장 조각의 중앙으로부터 또는 궤양의 중심으로부터 취해진 조직시료들은 "C"라고 명명된다; 조직의 끝부분과 중앙의 사이에 위치한 중간에서 취해진 시료들은 "I"라고 명명된다; 조직시료의 끝으로부터 취해진 시료들은 "E"라고 명명된다.

결장부분에서 채취한 조직의 작은 조각을 무게를 달고 차가운 포스페이트 완충 염수(PBS) 400㎕와 함께 2㎖ 마이크로퓨지(microfuge) 튜브에 넣었다. 상기 조직은 10초동안 Tekmar Ultra-Turrax 균질화기(Cincinnati, OH)에 의해 얼음에서 연마된다. PBS 1㎖당 5㎎ 조직의 비율을 만들기 위해 충분한 PBS를 첨가한다. 얼음에서 머무르는 동안에, 시료는 10초동안 Fisher Sonic Dismembranator (Farmingdale, NY)에 의해서 음파처리하였다. 균질화된 조직은 5℃에서 5분간 14,000 × g로 원심분리하였다. 상청액은 필요할 때까지 얼음에 보관하였다.

치모겐 프로테아제 분석

0.75㎜ 두께의 20퍼센트 소듐 디오데실 술페이트(SDS) 폴리아미드 겔은 0.1% 젤라틴을 포함하도록 제조되었다. 2% 젤라틴 스톡(stock)은 사전에 따뜻한 증류된 물에 젤라틴을 녹임으로서 준비되었다. 시료들은 0.1% SDS를 포함한 표준 SDS-겔-로딩버퍼(loading-buffer)에서 겔 웰(wells)에 두었다. 이들은 로딩(loading)전에는 가열하지 않았다. 겔들은 Bio-Rad Mini ProteanⅡ 기구에서 40분동안 20V로 되었고 그후 회전 혼합기에서 20℃로 15동안 2% Triton X-100을 함유한 증류된 물에 담궜다. 겔은 증류된 물에서 10mM EDTA와 2% Triton X-100에 담긴 EDTA를 포함하는 버퍼에 넣었다. 겔은 배양 버퍼로 옮겨져서 38.5℃에서 16시간 동안 배양되어 아미도 블랙으로 염색된 후, 물-에탄올-아세트산(리터당 7% 메탄올 및 5% 아세트산)에서 탈색시켰다.

배양 버퍼

pH 5.2, 8, 9 및 10.2에서 제조되는 배양버퍼에 의하여 pH의 최적조건이 판단된다. 사전에 50mM 아세트산, pH 5.2 및 50mM 글리신-NaOH, pH10.2가 준비되었다. pH8 및 pH9의 버퍼는 또한 50mM Tris-HCL을 사용하여 제조하였다.

프로테아제 특수 저해제를 제조하였다. 순수한 스톡 디이소프로필 플루오로포스페이트(DFP) 10㎕를 세린 프로테아제에 대한 저해제인 50mM Tris 5㎖에 넣었다. 에탄올내에 100mM N-에틸말레이미드(NEM) 표준용액은 사전에 준비되었고 pH8.0, 50mM Tris에 첨가하여 티올 프로테아제에 대한 저해제로서 1mM의 농도로 만들었다. 메탄올내의 100mM 표준 펩스타틴은 사전에 제조되었고 pH8.0 50mM Tris에 첨가하여 산 프로테아제에 대한 저해제로서 1mM의 농도로 만들었다. 증류된 물내의 200mM 표준 EDTA는 사전에 제조되었고 pH8.0 50mM Tris에 첨가하여 메탈로-프로테아제에 대한 저해제로서 10mM의 농도로 만들었다. 물 1㎖당 BBI 500㎎을 포함하는 엘리쿼트(aliguots)는 사전에 제조되었고 필요시까지 -20℃로 냉각시켰다. BBI 500㎎의 엘리쿼트는 그후 BBI에 의해 저해되는 프로테아제에 대한 저해제로서 pH8.0, 트리스 49㎖에 첨가되었다.

조직의 분석

각 시험 그룹의 조직은 하기와 같이 분석되었다:

일(day) 음성대조그룹 염수대조그룹 에탄올대조그룹 DNBS/에탄올

1 병력 병력 병력 병력

pH최적 pH최적 pH최적 pH최적

저해제 저해제 저해제 저해제

C, I, E, neg C, I, E, neg C, I, E, neg

7 병력 병력 병력 병력

pH 8 pH최적 pH최적 pH최적

저해제 저해제 저해제

14 병력 병력 병력

pH최적 pH최적 pH최적

저해제 저해제 저해제

C, I, E, neg C, I, E, neg C, I, E, neg

조직 부위

C : 병변의 중앙 또는 결장부위의 중앙

I : 중앙과 끝부위 사이의 중간물 조각

E : 결장조직의 끝 조각

neg : 음성 대조그룹으로부터의 시료

간염을 저해하기 위한 BBIC양치질액의 투여

소이빈으로부터의 BBI농축(BBIC)은 미세한 분말, C.I. 활성=100㎎/g로서 Central Soya로부터 공급되었다. BBIC는 양치질액으로서 투여되었다. 연장된 점막 접촉시간을 제공하는 안정된 양치질액 용액을 제공하기 위해 고안된 이 생성물은, 맛있고 투여하기 쉽고 그리고 저비용 대량생산에 적합하다. 타액 대체제는 점막 접촉시간 및 생물학적 이용효능을 증가시키기 위해 필요한 점성을 갖는 용액을 제공하고 많은 화합물의 일련의 해체를 제공한다는 것을 보여주었다. 이들 실험을 준비하기 위한 형식화에서는 BBI농축(BBIC), "타액 대체물"(Roxane Laboratories, Inc. Columbus, OH) 및 물을 포함하였다.

두 개의 분리된 컨테이너에서의 조사 대상에 각 20밀리리터가 공급되었다. 각각의 2온스병은 14밀리리터의 타액 대체제 및 6 밀리리터의 물을 담고 있었다. 투여하기 전의 혼합물을 위해 BBIC (25 및 100 C.I.)는 분리된 컨테이너에 제공되었다. 40㎖ 및 80㎖ 양치질액 부피에 200 및 400 단위량이 투여되었다.

성분을 혼합(mixing)하고 30초동안 현탁액의 흔들고(shaking) 난 직후, 각 대상에 자가-투여된 양치질액 20밀리리터(또는 40 또는 80㎖)는 1분동안 스위시된(swished)후 삼켜졌다. 각 대상은 위장에서의 흡수를 돕기 위해 BBIC의 투약후 물 6 oz.를 마셔야 했다.

BBIC의 투약 전에, 베이스-라인(0시간) 혈액시료를 정맥을 통하여 채취하였다. BBIC를 투약한지 약 4주후 또다른 혈액시료를 채취하였다. SGOT 및 SGPT 레벨은 잘 알려진 방법으로 각 혈액에서 측정하였다.

Claims (6)

1. 염증을 치료하기 위한 BBI를 포함하는 것을 특징으로하는 조성물.
2. 제1항에 있어서, 제약학적으로 수용가능한 담체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 염증성 내장 질환을 가진 동물에게 BBI의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 동물의 염증성 내장 질환을 치료하기 위한 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 BBI가 제약학적으로 수용가능한 담체와 결합하여 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 간염을 가진 동물에게 BBI의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 동물의 간염을 치료하는 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 BBI가 제약학적으로 수용가능한 담체와 결합하여 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.