KR19990027554A - 재조합 효모를 이용한 재조합 단백질의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 외래 유전자를 포함한 발현벡타로 형질전환된 재조합 효모를 배지의 조성 및 주입속도 등을 조절하여 고농도로 배양한 다음 단백질 발현에 적합한 생산배지 및 배양조건을 이용하여 재조합 단백질을 대량으로 또한 그 대부분을 단량체의 형태로 분비,생산하는 제조방법에 관한 것이다.
보다 상세하게는 본 발병은 효모 살상독소의 분비 시그날, 사람 인터류킨 1β의 아미노 말단을 융합분비시그날로 이용하여 외래단백질을 GAL10-MFα1 등의 이종 프로모터로부터 생산할 수 있는 발현벡터로 형질전환된 효모를 성장배지의 조성과 주입속도 등을 최적화시킴으로 에탄올의 축적없이 고농도로 배양한 다음 배양된 재조합 효모를 다시 갈락토오스 등이 포함된 단백질 발현에 최적화된 생산배지를 사용하여 배양함으로써 유용한 외래 단백질을 대량으로 생산하는 제조방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 과정에 더하여 효모 배양액의 pH를 조절하면서 비이온 계면활성제 등을 가하여 재조합 단백질을 단량체(monomer)의 형태로 분비, 생산하는 제조방법을 제공한다.
본 발명의 제조방법에 의하면 발효배지 1 리터 당 재조합 외래 단백질을 200 ∼ 1500mg 생산할 수 있으며 또한 그 대부분을 최대의 활성을 지닌 단량체의 형태로 얻을 수 있다.
Description
본 발명은 외래 유전자를 포함한 발현벡타로 형질전환된 재조합 효모를 배지의 조성 및 주입속도 등을 조절하여 고농도로 배양한 다음 단백질 발현에 적합한 배지를 사용하여 재조합 단백질을 대량으로 생산하면서 상기 재조합 단백질을 분비된 단량체의 형태로 얻는 제조방법에 관한 것이다.
보다 상세하게는 본 발병은 효모 살상독소의 분비 시그날, 사람 인터류킨 1β의 아미노 말단을 융합분비시그날로 이용하여 외래단백질을 GAL10-MFα1 등의 이종 프로모터로부터 생산할 수 있는 발현벡터로 형질전환된 효모를 성장배지의 조성과 주입속도 등을 최적화시킴으로 에탄올의 축적없이 고농도로 배양한 다음 배양된 재조합 효모를 다시 갈락토오스 등이 포함된 단백질 발현에 최적화된 생산배지를 사용하여 배양함으로써 유용한 외래 단백질을 대량으로 생산하는 제조방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 과정에 더하여 효모 배양액의 pH를 조절하면서 비이온 계면활성제 등을 가하여 재조합 단백질을 분비된 단량체(monomer)의 형태로 얻는 제조방법에 관한 것이다.
현재 외래 단백질을 생산하는데 가장 널리 사용되는 균주는 대장균인데, 이는 배양이 쉽고 유전자 구조가 잘 규명되어 있기 때문이다. 하지만 대장균에서 외래 단백질을 생산할 경우 단백질의 번역후 외부로 분비되지않고, 과량으로 발현될 경우 응집체(inclusion body)로서 세포내부에 축적되는 문제가있어 정제단계에서 활성을 가지는 가용성 형태로 만들어 주는 과정(refolding)이 추가되어야 하는데, 이때 상당한 수율의 감소가 발생하는 단점들이 있다. 또한 대장균의 경우 인체에 치명적인 내독소(endotoxin)를 함유하고 있어 정제시 이것에 의한 오염이 발생할 우려가 있다.
반면 효모는 단백질을 고등 진핵세포와 유사한 방식으로 그 자신의 세포내 분비시스템을 이용하여 활성이 있는 형태로 배지로 분비시킬수 있으므로 유전자 재조합 기술에 의해 유용한 외래 단백질을 생산하기 위한 숙주로서의 이용성이 증대되고 있다.
효모는 1981년에 인터페론(interferon) 생산에 최초로 이용된 후(Hitzeman et al, 1981,nature, 293; 717-722) 사람 또는 동물유래의 외래 단백질생산에 이용되어 왔다. 또한 미국 FDA에 의해 인체에 대한 안정성이 인정되었고, 유전자 발현 조절의 원리도 대부분 밝혀져 있다.[Strathern et al,The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Metabolism and Gene Expression, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.(1982)]. 이와같이 효모를 이용하여 외래 단백질을 생산할 경우 인체에 안전하며, 동물 또는 사람세포에서 발현되는 단백질과 유사한 형태의 비활성도(specific activity)가 높은 외래단백질을 세포외로 분비 생산할 수 있으며, 또한 재조합 대장균 시스템에 비해 발효 후 정제공정이 현저히 간단하고 리폴딩(refolding)등의 과정 없이 곧바로 활성이 있는 외래 단백질을 얻을 수 있으므로 정제수율이 아주 높은 등 장점이 많다. 이러한 장점에도 불구하고 효모는 호기성 조건에서 조차 배지내 포도당(glucose) 농도, 배지 조성, 비성장속도에 따라 세포성장 및 단백질합성의 저해물질인 에탄올을 생산(Crabtree effect)하므로 대장균에 비해 고농도 배양이 어렵고, 외래 단백질의 생산 시 낮은 발현 및 분비효율등의 이유로 외래 단백질의 생산에의 이용에 제한을 받아왔다.
재조합 단백질을 고농도로 생산하기 위해서는 유가식 배양방법에 의해 형질전환된 효모를 고농도로 배양하는 것이 요구되는데 이를 위하여 복합배지(complex medium), 합성배지(synthetic medium), 반합성배지(semi-synthetic medium)등 다양한 조성의 배지와 정속주입(constant feeding), 계단식 증가(stepwise increase), 지수적 증가(exponential), 비 성장속도(specific growth rate)에 의한 조절, 용존산소에 의한 조절(DO-stat), 포도당 및 에탄올농도에 의한 조절(glucose, ethanol concentration control)등 다양한 배지주입방법들이 개발되어 있으나 실질적 배양방법에서는 각각의 재조합 균주에 대하여 특이적으로 작용하는 배양방법과 최적조건이 존재하여 배지 주입방법의 선택과 배지를 포함한 배양방법의 최적화가 고농도 균체배양의 효율성을 좌우한다.
형질전환된 효모의 단백질 합성은 성장환경과 관련된 균체 내의 여러 생리/생태학적인 요인들(플라스미드 안정성 및 카피수, 전사 및 해독 효율)과 밀접한 관계가 있으므로 수율 및 생산성을 극대화하는 최적 배양조건을 확립해야 한다. 재조합 단백질을 고수율로 발현시키기 위해서는 고농도로 배양된 형질전환된 효모의 배양액에 갈락토오스(galactose)와 같은 적당한 발현유도인자의 투입과 단백질 생산에 적당한 조성의 배지를 주입해야 하며 필요에 따라 그 조성과 방법등을 달리하여 외래 단백질을 생산해야 한다.
세포내 소기관중의 하나인 리보좀(ribosome)에서 합성된 단백질은 이황화(disulfide) 결합과 코아 글리코실레이션(core glycosylation)이 일어나는 소포체(endoplasmic reticulum)와 추가적인 글리코실레이션(glycosylation)이 일어나는 골지체(Golgi complex)를 거쳐 베지클(vesicle)에 충진된후 세포막과 융합되어 배지로 분비된다. 단백질의 분비에 중요한 요인으로는 외래 단백질과 효모 분비기관과의 적합성, 단백질 분비에 관여하는 세포내 소기관(소포체, 골지체, 베지클)들의 활성도(activity), 세포막의 유동성(fluidity), 균체의 비성장속도 등을 들수있는데, 이들 요인들에 영향을 미치는 배양조건들을 탐색하여 최적조건을 결정해야 한다.
재조합 효모에서 외래 단백질을 배지로 분비시키는 경우 문제로 대두되는 것중의 하나는 생성된 외래 단백질의 분비효율과 분비후 배지내 에서의 다량체(multimer 또는 oligomer) 형성이다. 고농도의 외래 단백질이 배지로 분비되어 재조합 단백질의 생산기간 동안 배지내에 계속 체류하는 경우, 소수성 상호작용, 이황화(disulfide) 공유결합 등의 결합력에 의해 다량체를 형성하는 경우가 빈번한데, 이 경우 단백질의 활성이 현저히 저하되며(Biochimica et Biophysica Acta, 998:167-172, 1989) 정제 단계에서 이를 최대 활성을 지닌 형태인 단량체(monomer)로 재해리시키는 단계가 필요하게 되어 단백질 수율이 상당히 감소하게 된다. 단백질이 다량체로 생산될 경우 이로부터 활성을 갖춘 단백질을 순수 분리해내기 위해서는 단백질의 구조형태(conformation)에 영향을 미치지 않는 적절한 농도의 유레아(urea)를 사용한 생체외 해리, 투석, 한외여과(in vitrodissociation, dialysis, ultrafiltration)에 의한 농축등으로 이루어진 복잡한 과정이 추가되어야 한다. 다량체의 불완전 해리와 각 정제단계에서의 일부 단백질 손실은 불가피하며 결국 전체 생산공정의 상당한 수율 저하가 초래되게 된다. 따라서 재조합 단백질의 발효 생산단계에서 이와같은 다량체 형성을 방지하여 단량체로 생산하기 위한 발효 기술의 개발이 아주 중요하다.
이와 같은 배경에서 본 발명자들은 재조합 효모의 성장을 최적화하기 위해 성장배지를 사용하는 유가식 배양중에 에탄올 생성을 최소화할 수 있는 배지 공급속도를 결정하는 특정 알고리즘을 개발하고 이를 이용하여 탄소원과 질소원의 최적 조성비를 탐색하였고, 또한 효모 살상독소의 분비 시그날과 사람 인터류킨 1β의 아미노 말단을 융합 분비파트너로 이용하는 여러 재조합 단백질들 (사람 GCSF, 사람 성장 호르몬 등)을 대량으로 제조하는데 공통적으로 적용될 수 있는 생산배지의 칼락토오스 적정농도 및 갈락토오스와 질소원의 최적 조성비를 탐색하여 재조합 효모로부터 재조합 단백질을 대량으로 생산하고, 효모 배양액의 pH 조절과 비이온성 계면활성제의 첨가가 재조합 단백질의 다량체 형성을 저해함을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 외래 유전자를 포함한 발현벡타로 형질전환된 재조합 효모를 배지의 조성 및 주입속도 등을 조절하여 고농도로 배양한 다음 단백질 발현에 적합한 배지를 사용하여 재조합 단백질을 대량으로 생산하고 이에 더하여 상기 재조합 단백질을 분비된 단량체의 형태로 얻는 제조방법을 제공함에 그 목적이 있다.
도 1은 재조합 효모의 고농도 배양에 이용된 성장배지 주입 조절을 위한 특정 알고리즘을 나타낸 것이고,
도 2는 배양액내 갈락토오스의 농도가 비성장속도 및 재조합 사람 과립구 콜로니 자극인자(granulocyte colony stimulating factor, 이하 “GCSF”로 약함) 수율에 미치는 영향을 나타낸 것이고,
도 3은 최적화된 반합성 성장배지와 특정 알고리즘을 이용하여 재조합 효모를 고농도로 배양한 결과를 나타낸 것이고,
도 4a는 고농도로 배양된 재조합 효모로부터 최적화된 반합성 생산배지를 이용하여 재조합 사람 GCSF를 분비, 생산한 결과를 나타낸 것이고,
도 4b는 분비, 생산한 재조합 인간 GCSF를 SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동(SDS-PAGE) 후 쿠마시 블루(coomassie blue)로 염색한 결과를 나타낸 것이고,
레인 1∼8 : 배양중 배지 상등액을 배양 시간에 따라 각각 35μL 주입
도 5a는 고농도로 배양된 재조합 효모로부터 최적화된 반합성 생산배지를 이용하여 재조합 사람 성장호르몬을 분비 생산한 결과를 나타낸 것이고,
도 5b는 분비 생산한 재조합 사람 성장호르몬을 SDS-PAGE 후 쿠마시 블루로 염색한 결과를 나타낸 것이고,
레인 1∼8 : 배양중 배지 상등액을 배양 시간에 따라 각각 35μL 주입
도 6은 배지에 트윈80 (Tween 80)을 첨가하여 재조합 사람 GCSF를 분비 생산한 결과를 나타낸 것이고,
도 7은 배양 pH 및 첨가된 트윈 80이 분비 생산된 재조합 사람 GCSF의 단량체 형성에 미치는 영향 [배양액의 네이티브-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동 (native-PAGE) 후 웨스턴 블럿 결과]을 나타낸 것이고,
(가) 트윈 80을 첨가하지 않았을 경우
레인 1 :형질전환된 대장균에서 생산된 사람 GCSF 시제품 (Glasin, 제일약품) ; 레인 2 : 재조합 사람 GCSF
(나) 트윈 80을 첨가한 경우
레인 1 : 형질전환 대장균에서 생산된 사람 GCSF 시제품 (Glasin, 제일약품)
레인 2 : pH 5.0에서 분비/생산된 발효 당시의 재조합 사람 GCSF
레인 3 : pH 5.5에서 분비/생산된 발효 당시의 재조합 사람 GCSF
레인 4 : pH 6.5에서 분비/생산된 발효 당시의 재조합 사람 GCSF
(다)트윈 80을 첨가한 경우
레인 1 : 형질전환 대장균에서 생산된 사람 GCSF 시제품 (Glasin, 제일약품)
레인 2: pH 6.5에서 생산되고 발효후 4일동안 냉동보관(-20℃)한 후의 재조합 사람 GCSF
레인 3: pH 5.5에서 생산되고 발효후 4일동안 냉동보관(-20℃)한 후의 재조합 사람 GCSF
레인 4: pH 5.0에서 생산되고 발효후 4일동안 냉동보관(-20℃)한 후의 재조합 사람 GCSF
도 8은 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquld chromatography, HPLC)로 정제된 재조합 사람 GCSF(레인 1: 0.14μg, 레인 2: 0.014μg)와 재조합 대장균에서 생산된 사람 GCSF 시제품 (레인 3: 0.18μg, 레인 4: 0.018μg)의 실버스테이닝(silver staining) 결과를 나타낸 것이고,
도 9는 순수 정제된 재조합 사람 GCSF (레인 1 :0.27μg, 레인 2: 2.7μg), 카복시 펩티데이즈 (carboxypeptidase) Y (레인 3: 0.1μg, 레인 4: 1.0μg), 재조합 효모에서 생산된 NIBSC 표준 GCSF (레인 6: 0.25μg), 재조합 대장균에서 생산된 사람 GCSF 시제품 (레인 8: 0.37μg, 레인 9: 3.7μg)과 재조합 CHO 세포에서 생산된 사람 GCSF (레인 11: 0.25μg, 레인 12: 2.5μg)의 글리컨스테이닝 (glycan staining) 결과 (레인 5, 7, 10: 재조합 GCSF를 포함하지 않은 sample buffer)를 나타낸 것이고,
도 10은 순수 정제된 재조합 사람 GCSF의 ESI 질량분석(ESI mass spectrometer) 결과를 나타낸 것이고,
도 11은 순수 정제된 재조합 사람 GCSF와 재조합 대장균에서 생산된 사람 GCSF 시제품의 써큘러 다이크로이즘 (circular dichroism) 분석 결과를 나타낸 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 외래 유전자를 포함한 발현벡타로 형질전환된 재조합 효모를 배지의 조성 및 주입속도 등을 조절하여 고농도로 배양한 다음 단백질 발현에 적합한 배지를 사용하여 재조합 단백질을 대량으로 생산하는 제조방법을 제공한다.
구체적으로 본 발병은 효모 살상독소의 분비 시그날, 사람 인터류킨 1β의 아미노 말단을 융합분비시그날로 이용하여 외래단백질을 GAL10-MFα1 등의 이종 프로모터로부터 생산할 수 있는 발현벡터로 형질전환된 효모를 성장배지의 조성과 주입속도 등을 최적화시킴으로 에탄올의 축적없이 고농도로 배양한 다음 배양된 재조합 효모를 다시 갈락토오스 등이 포함된 단백질 발현에 최적화된 생산배지를 사용하여 배양함으로써 유용한 외래 단백질을 대량으로 생산하는 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 재조합 단백질을 분비된 단량체의 형태로 얻는 제조방법을 제공한다.
구체적으로 상기 효모 배양액의 pH를 조절하면서 비이온 계면활성제 등을 가하여 재조합 단백질을 분비된 단량체(monomer)의 형태로 얻는 제조방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
1. 재조합 효모의 고농도 배양
본 발명은 외래 유전자를 포함한 발현벡타로 형질전환된 재조합 효모를 성장배지의 조성 및 주입속도 등을 조절하여 고농도로 배양한 다음 단백질 발현에 적합한 생산배지 및 배양조건을 이용하여 재조합 단백질을 대량으로 생산하는 제조방법을 제공한다.
구체적으로 본 발명은 우선 성장배지의 배지조성과 배지주입속도를 최적화하여 재조합 효모를 고농도로 배양하고 다시 생산배지의 조성, 발현 유도물질의 배양액내 농도를 최적화시킴으로 재조합 단백질을 대량으로 생산한다.
본 발명은 효모 살상독소의 분비 시그날, 사람 인터류킨 1β의 아미노 말단을 융합분비시그날로 이용하여 외래단백질을 GAL10-MFα1 등의 이종 프로모터로부터 생산할 수 있는 발현벡터로 형질전환된 효모를 이용한다.
구체적으로 본 발명은 [효모 살상독소의 분비 시그날-사람 인터류킨 1β의 아미노 말단-KEX2 절단부위(lys-arg)-외래단백질]의 융합단백질을 코우딩하는 유전자와 GAL10-MFα1의 이종 프로모터를 포함하는 발현벡터로 효모를 형질전환시킨 뒤, 제조된 재조합 효모를 반합성 성장배지에 접종하여 배양한다.
가) 성장배지 조성의 최적화
본 발명은 재조합 효모를 고농도로 배양하기 위하여 성장배지 조성을 최적화시킨다.
상기 성장배지에서 그의 조성을 최적화시키기 위하여, 배지내의 탄소원과 복합 질소원의 종류 및 상기 성분들의 비율을 조절한다.
본 발명은 탄소원으로 포도당을, 복합 질소원으로는 플라즈미드 불안정성을 최소화하는 우라실이 제거된 카사미노산(casamino acids) 등을 사용한다.
또한 본 발명은 유가식 배양 중 최대 균체 질량수율(생산된 균체질량/소모된 단위 탄소원 질량)을 얻을 수 있는 성장배지의 탄소원과 복합 질소원 간의 최적비를 제공하는데, 이 때 포도당/카사미노산 비가 2∼4.7 범위인 것이 바람직하다.
나)성장배지의 주입속도 조절
재조합 균주로서 효모를 이용하기 위해서는 성장 저해물질인 에탄올이 축적되지 않도록 성장배지를 최적화시켜 효모를 고농도로 배양한다.
일반적으로 효모는 호기성 조건에서도 포도당 농도가 1-2g/L, 비성장속도가 0.2-0.25h -1이상이면 에탄올을 생산하기 시작하는데, 본 발명은 상기 두가지 인자를 조절하여 에탄올의 축적없이 효모를 배양한다.
구체적으로 본 발명은 유가식 배양 중에 이 두가지 인자를 조절하여 재조합 효모를 고농도로 배양하기 위하여, 배지공급속도를 정밀하게 통제할 수 있는 알고리즘(도 1 참조)을 개발하여 배지공급속도를 최적화시킨다.
유가식 배양도중 성장배지의 공급이 잘 조절되어서 발효 전 기간동안 배지내 에탄올이 축적되지 않는다면 재조합 효모의 비성장속도()는 탄소원과 균체 농도()의 함수가 되며 또한 하기 수학식 1에서와 같이 균체농도에 따라 선형적으로 감소하게 된다.
상기 수학식 1에서,은 도달할 수 있는 최대 균체농도로서 상수이다. 또한 효모 세포와 탄소원의 질량수지식을 이용하면 하기 수학식 2, 3, 4를 얻을 수 있다.
상기 수학식 2, 3, 4에서, 하첨자은시간에서의 설계 변수들을 나타내고(예:에서 유가식 배양은 시작된다.),는 조절 소프트웨어에서의 계산 간격을 의미한다().는 의사 정상상태(quasi-steady state)에서 탄소원의 질량수지식으로부터 구할 수 있는 지수적으로 증가하는 배지 공급속도(exponentially-increasing volumetric feed rate) 이다. 또한는 소모된 단위 탄소원 질량당 생성된 균체 질량(균체 질량 수율),는 공급 배지내 탄소원의 농도,는 발효기내 균체 농도,는 발효액의 부피를 의미한다.
본 발명은 위 식들을 기본으로 하여 성장배지의 공급속도는 도 1에 나타낸 특정 알고리즘을 이용하여 결정한다. 이 알고리즘은 초기에 원하는 재조합 효모의 비성장속도()와 속도론적 매개변수(kinetic parameter)인 균체 질량 수율(), 도달할 수 있는 최대 균체농도() 그리고 유가식 배양을 시작할때의 조업 변수인 균체농도()와 발효액의 부피()를 입력하여서 30초 간격으로 성장배지의 새로운 공급속도()를 결정한다. 또한 주기적으로 시료를 채취하여 재조합 효모의 농도가 계산치와 불일치하면 측정치를 재입력하고 에탄올이 발견되면와을 적절하게 변화시킨다.
본 발명은 재조합 효모의 비성장속도가 세포농도에 선형적으로 감소하는 상기 수학식 1로 나타나는 성장속도식과 도 1과 같은 특정 알고리즘을 이용하여 배양 전 기간 동안 에탄올 축적없이 상기 재조합 효모를 고농도로 배양한다 (도 3 참조).
다) 재조합 단백질의 최적 생산조건 확립
본 발명은 상기 재조합 효모를 고농도로 배양한 다음 생산배지의 조성과 발현 유도물질의 배양액 내 농도를 최적화시킴으로 재조합 단백질을 대량으로 발현시킨다.
구체적으로 본 발명은[효모 살상독소의 분비 시그날-사람 인터류킨 1β의 아미노 말단-KEX2 절단부위(lys-arg)-외래단백질]의 융합단백질을 코우딩하는 유전자와 GAL10-MFα1의 이종 프로모터를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 효모로부터 외래 단백질을 발현시킨다. 상기 유전자 발현체계는 갈락토오스에 의해서 유도되는 것이므로 고농도의 재조합 효모 배양액에 갈락토오스를 포함하는 생산배지를 주입하여 외래 단백질을 생산한다.
이때 중요한 것은 배양액내의 갈락토오스 농도와 생산배지에서 사용할 복합 질소원의 종류 및 탄소원인 갈락토오스와 질소원의 비이다.
구체적으로 상기 재조합 효모를 고농도로 배양하여 재조합 단백질을 대량으로 제조하기 위하여는 배양액내 갈락토오스 농도는 10g/L이상이 바람직하고, 복합질소원으로는 카사미노산(casamino acids)과 효모 추출물이 사용될 수 있으나 효모 추출물의 사용이 바람직하며 또한 갈락토오스와 질소원의 비는 갈락토오스와 효모 추출물의 비(Gal/YE)가 3 이하가 바람직하며 최적 갈락토오스/효모추출물 범위는 0.5에서 3 사이인 것이 더욱 바람직하다.
상기의 과정으로 본 발명은 사람 GCSF와 성장호로몬 등을 포함한 모든 유용한 외래단백질을 대량으로 생산하는 방법을 제공한다.
2. 배양 pH 조절 및 비이온성 계면활성제를 이용한 단량체 재조합 단백질 생산율 증대
본 발명은 상기에서 얻은 재조합 효모의 배양액에서 재조합 외래 단백질을 단량체 형태로 대량 분비, 생산하는 제조방법을 제공한다.
형질전환된 효모에서 외래 단백질을 배지로 분비시키는 경우 분비 효율이 낮고 분비된 재조합 단백질이 배지 내에서 다량체로 형성되는데 이를 개선하기 위하여, 본 발명은 배지의 pH를 조절하면서 비이온성 계면활성제를 첨가한다.
구체적으로, 세포내 소기관중의 하나인 리보좀에서 번역된 재조합 단백질은 소포체와 골지체를 거쳐 베지클(vesicle)에 충진된 후 최종적으로 세포막(plasmalema)과 융합되어 배지로 분비된다. 이 경우 세포 성장에 영향을 끼치지 않는 비이온성 계면활성제를 첨가하면 세포막과의 물리화학적 작용에 의해 세포막의 유동성(membrane fluidity)이 증가되어 베지클에 의해 운반된 세포막에 융합된 단백질의 투과를 촉진시킴으로 외래 단백질의 분비 효율이 증가된다.
배지로 분비된 외래 단백질이 다량체로 전환되는 과정에는 이황화(disulfide) 결합에 의한 공유결합이나 단백질간의 소수성 상호작용에 의한 경우가 많은데, 배양액의 pH가 증가하게 되면 산화환원력(redox potential)이 감소하게 되어 전체 배양액의 조건이 환원성으로 전이되므로 이황화 결합에 의한 다량체 형성을 방지할 수 있으며, 또한 계면활성제를 첨가하는 경우에도 소수성 작용을 저하시켜 다량체 형성을 용이하게 억제할 수 있다.
구체적으로 본 발명의 방법에서 단백질 생산기의 배양액 pH 는 6.0∼7.0 범위로 유지시키는 것이 바람직하고 비이온성 계면활성제로는 트윈 80 등을 사용하는 것이 바람직하다. 실제적으로 상기 pH의 범위와 트윈 80을 사용한 결과 재조합 단백질 분비효율을 50% 이상으로 상승시킴과 동시에 분비된 단백질 대부분을 단량체의 형태로 발효 생산하였다(도 7 참조).
상기의 과정으로 본 발명은 사람 GCSF와 사람 성장호르몬 등을 단량체 형태로 대량 생산하는 제조방법을 제공한다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며 본 발명이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 최적화된 성장배지와 특정 알고리즘을 이용한 재조합 효모의 고농도 배양
가) 반합성 성장배지의 최적화
하기 표 1에 나타난 바와 같이 성장배지의 포도당/카사미노산 비가 2∼4.7의 범위에서 균체 질량수율이 0.4이상으로 유지되어 최적 성분비율임을 확인하였다.
| 포도당/카사미노산 | 2 | 3 | 4 | 4.7 | 7.2 | 8.8 |
| 균체질량수율 (g/g) | 0.44 | 0.48 | 0.42 | 0.40 | 0.32 | 0.30 |
| 최대세포농도 (g/L) | 62 | 82 | 67 | 66 | 52 | 48 |
나) 배지공급속도를 조절하는 알고리즘을 이용한 효모의 배양
포도당/카사미노산 비가 3으로 고정된 성장배지와 본 발명에서 개발한 특정 알고리즘을 이용하여 [효모 살상독소의 분비 시그날-사람 인터류킨 1β의 아미노 말단-KEX2 절단부위(lys-arg)-외래단백질]의 융합단백질을 코우딩하는 유전자와 GAL10-MFα1의 이종 프로모터를 포함하는 효모 발현벡터 pIL20GC로 형질전환된 재조합 효모Saccharomyces cerevisiaeGC1 (한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에서 입수;수탁번호 KCTC 0193BP)를 유가식 배양하였다.
회분식 및 유가식 배양을 위해 사용된 시스템은 5L 실험실용 발효기이고, 전 배양기간동안 pH 와 온도는 각각 5.5, 30℃로 유지하였으며 또한 호기성 상태로 유지하기 위해 용존 산소농도는 40% 이상으로 조절되었다. 유가식 배양을 위해 사용된 성장배지의 타성분의 조성은 하기 표 2과 같다.
| 성분 | 1L당 조성 |
| 포도당 | 409g |
| 카사미노산 | 46g - 204g |
| KH2PO4 | 5g |
| MgSO4·7H2O | 4g |
| (NH4)2SO4 | 3g |
| 비타민, 10X1 | 3.5mL |
| 소량 금속, 10X2 | 5mL |
| 110X 비타민 1L당 이노시톨 6g, Ca-판토텐산염 1.2g, 피리독신-HCl 1.2g, 티아민 1.2g, 바이오틴 0.1g 포함 | |
| 210X 소량 금속 1L당 FeSO4·7H2O 2.78g, ZnCl2·2H2O 1.36g, CuSO4·5H2O 0.8g, Na2MoO4·2H2O 2.42g, CoCl2·6H2O 2.38g, MnSO41.69g 포함 |
도 1의 알고리즘을 사용하여 성장배지를 주입함으로써 배지내 포도당농도와 비성장속도를 각각 100mg/L이하, 0.2이하로 유지할 수 있었고 결과적으로 배지내의 에탄올은 발효 전 기간동안 효모성장에 영향을 미치지 않는 농도인 1g/L이하로 유지되었다. 이리하여 본 발명에서 개발한 알고리즘과 최적 포도당/카사미노산 비를 이용하여 세포농도를 최대 82g/L 까지 얻을 수 있었다(도 3 참조).
실시예 2 재조합 단백질의 최적 생산조건 (생산배지의 조성, 발현 유도물질의 배지내 농도) 확립
사람 GCSF 유전자를 GAL10-MFα1의 이종 프로모터로부터 발현할 수 있는 발현벡터 pIL20GC로 형질전환된 재조합 효모Saccharomyces cerevisiaeGC1 (한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에서 입수;수탁번호 KCTC 0193BP)를 이용하여 본 발명의 재조합 단백질 최적 생산조건을 확립하였다.
가) 발현유도물질 농도의 최적화
배양액내 갈락토오스 농도가 발현에 미치는 영향을 결정하기 위해 포도당/효모추출물 비가 2로 고정된 생산배지를 이용하여 배양액내의 갈락토오스 농도를 1에서 30g/L까지 변화시킨 결과 사람 GCSF 수율은 배양액내 갈락토오스 농도가 10g/L이상일 경우 농도가 그 이하인 경우에 비해 180% 정도 증가하였으며(도 2 참조) 분비효율도 40% 이상까지 향상되었다(표 3 참조).
| 배양액내 탄소원 (농도, g/L) | 세포 농도, g/L(평균 비성장 속도, h-1) | 세포내 사람 GCSF,mg/L | 배양액내 사람 GCSF, mg/L | 분비 효율1 | 단위 균체질량 당 발현된 전체 사람GCSF 질량,mg/g균체 |
| 갈락토오스(1) | 444649(0.016) | 254.4334.6250.4 | 90.4120.0126.6 | 0.260.260.34 | 7.879.927.70 |
| 갈락토오스(21) | 485762(0.078) | 193.9260.7254.6 | 166.7219.1221.9 | 0.460.460.47 | 7.488.47 7.75 |
| 1합성된 전체 사람 GCSF (세포내와 배지의 GCSF의 합) 농도에 대한 배지 내 사람 GCSF의 농도비 |
나)반합성 생산배지 조성의 최적화
최적 복합질소원의 종류를 결정하기 위하여 카사미노산(Casamino acids)과 효모 추출물을 비교해 본 결과 하기 표 4에 나타난 바와 같이 갈락토오스에 대한 균체 질량수율은 두 경우 비슷하였지만 GCSF 생산수율은 효모 추출물을 사용한 경우가 2∼3배 더 높았다.
최적화된 탄소원과 질소원의 비를 결정하기 위하여 상기의 최적화된 성장배지와 개발된 특정 알고리즘을 이용하여 재조합 효모를 일정농도(약 30g/L)까지 배양한 다음, 갈락토오스 농도를 30g/L 근방으로 유지시키면서 여러 가지 갈락토오스/복합 질소원 비를 가진 생산배지(표 5)를 주입하여 단백질 생산 효율을 시험하였다.
하기 표 4에 나타난 바와 같이 갈락토오스와 효모 추출물의 비가 3 이상인 경우에는 GCSF 생산수율이 급격히 감소하였으며 결과적으로 최적 갈락토오스와 효모 추출물의 비의 범위는 0.5에서 3 사이임을 확인하였다. 효모 추출물을 사용하였음에도 플라스미드 안정성을 약 90% 이상으로 유지하였다.
| 갈락토오스/복합질소원 | 카사미노산 포함 생산배지 | 효모 추출물 포함 생산배지 | |||
| Yp/x | Yx/s | Yp/x | Yx/s | 플라스미드 안정성(%) | |
| 0.5 | 0.42 | 0.42 | 1.26 | 0.39 | 94 |
| 1 | 0.85 | 0.48 | 1.27 | 0.46 | 94 |
| 2 | 0.34 | 0.40 | 1.19 | 0.44 | 90 |
| 3 | - | - | 0.97 | 0.46 | 93 |
| 5 | 0.38 | 0.56 | - | - | - |
| 10 | - | - | 0.79 | 0.41 | 86 |
| 성분 | 1L당 조성 |
| 갈락토오스 | 273g |
| 카사미노산/효모 추출물 | 54 - 546g / 27 - 546g |
| KH2PO4 | 5g |
| MgSO47H2O | 4g |
| (NH4)2SO4 | 3g |
| 비타민, 10X1 | 3.5mL |
| 소량 금속, 10X2 | 5mL |
| 110X 비타민 1L당 이노시톨 6g, Ca-판토텐산염 1.2g, 피리독신-HCl 1.2g, 티아민 1.2g, 바이오틴 0.1g 포함 | |
| 210X 소량 금속 1L당 FeSO47H2O 2.78g, ZnCl22H2O 1.36g, CuSO45H2O 0.8g, Na2MoO42H2O 2.42g, CoCl26H2O 2.38g, MnSO41.69g 포함 |
상기와 같은 과정을 통하여, 본 발명에서는 효모추출물을 사용하여 플라스미드 안정성을 90%이상으로 유지시킬 수 있는 생산배지를 얻었고, GCSF 질량 수율이 최대가 되는 갈락토오스/효모 추출물 범위가 0.5에서 3사이임을 확인하였으며 배양액내의 갈락토오스 농도는 10g/L 이상에서 최대의 GCSF 질량 수율을 얻을 수 있음을 확인하였다(도 2 참조).
실시예 3 최적화된 반합성 생산배지를 이용하여 재조합 사람 GCSF의 대량생산.
외래 단백질 유전자로 사람 GCSF 유전자가 삽입된 발현벡터 pIL20GC로 형질전환된 재조합 효모Saccharomyces cerevisiaeGC1 (한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에서 입수;수탁번호 KCTC 0193BP)을 실시예 1의 방법으로 30g/L까지 배양한 후, 상기 실시예 2에서 결정된 최적 생산조건에 따라 주입배지를 갈락토오스/효모 추출물 비가 2로 고정된 생산배지로 치환하여 갈락토오스를 배양기간 동안 약 21g/L로 유지시킨 결과, 최종적으로 배양액내 재조합 사람 GCSF를 230mg/L까지 분비 생산할 수 있었다 (도 4 참조).
실시예 4 최적화된 반합성 생산배지를 이용하여 재조합 사람 성장 호르몬의 대량생산.
외래 단백질 유전자로 사람 성장호르몬 유전자가 삽입된 발현벡터 pIL20XGH에 의해 형질전환된 재조합 효모Saccharomyces cerevisiaeXGH (한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에서 입수;수탁번호 KCTC 0331BP)를 실시예 3와 동일한 방법으로 배양한 결과, 90% 이상의 플라즈미드 안정성과 함께 재조합 사람 성장호르몬을 1300mg/L까지 분비 생산할 수 있었다(도 5 참조).
실시예 5 비이온성 계면활성제를 첨가하여 재조합 사람 GCSF의 분비효율 향상.
비이온성 계면활성제인 트윈 80을 성장배지 및 생산배지에 각각 0.06 부피%로 첨가하여 상기 실시예 1의 재조합 효모를 실시예 3와 동일한 방법으로 배양한 결과 하기 표 6에서 나타난 바와 같이 배지로 분비된 재조합 사람 GCSF의 농도를 50% 이상 향상시킬 수 있었다 (도 6 참조).
| 배양액내 Tween 80 농도, % | 세포 농도,g/L(평균 비성장속도,h-1) | 세포내 사람 GCSF,mg/L | 배양액내 사람 GCSF, mg/L | 분비 효율1 | 단위 균체질량 당 발현된 전체 사람 GCSF 질량,mg/g세포 |
| 0 | 2945(0.060) | 120.3266.1 | 48.9146.9 | 0.290.36 | 5.839.18 |
| 0.06 | 324348(0.064) | 105.1144.2290.4 | 88.3188.3232.7 | 0.460.570.44 | 6.057.7310.97 |
| 1합성된 전체 사람 GCSF (세포내와 배지의 GCSF의 합) 농도에 대한 배지내 사람 GCSF의 농도비. |
실시예 6 배양액의 pH 조절 및 비이온성 계면활성제 첨가에 의한 단량체 형태의 재조합 사람 GCSF의 생산.
단백질 생산기의 배양액 pH를 5.0, 5.5, 6.5로 변화시키고 비이온성 계면활성제인 트윈 80을 성장배지 및 생산배지에 0.2 부피%로 첨가하여 실시예 2의 재조합 효모를 실시예 2와 동일한 방법으로 배양한 결과, 재조합 사람 GCSF를 대부분 단량체 형태로 생산할 수 있었으며 또한 pH가 증가함에 따라 다량체 형성이 현저하게 감소하고 있음을 확인하였다 (도 7 참조).
실시예 7 배지로 분비, 생산된 사람 GCSF의 분리.
실시예 5의 방법으로 분비 생산된 사람 GCSF를 원심분리를 통한 균체제거, 상등액의 한외 여과(ultrafiltration, MWCO 10kDa), 젤 투과 크로마토그래피(gel permeation chromatography, Sephacryl S200)에 의한 순수분리, 역상 고성능 액체 크로마토그래피(reversed-phase HPLC, C4)를 통한 초순수분리의 과정을 순차적으로 통과시킴으로써 초 고순도의 GCSF로 정제할 수 있었다. 최종 정제된 사람 GCSF를 SDS-PAGE후 실버스테이닝 방법으로 염색하면 단일밴드로 나타남을 확인하였다 (도 8 참조).
실시예 8 순수 정제된 사람 GCSF의 물리 화학적 특성.
실시예 7의 정제과정을 통하여 분리된 사람 GCSF를 글리컨 스테이닝 방법을 이용하여 분석한 결과 당쇄가 연결되어 있지 않음을 확인 하였고(도 9 참조), 또한 ESI 질량 분석기(ESI mass spectrometer)를 이용하여 분자량 측정 결과 순수 정제된 사람 GCSF의 분자량은 아미노산 서열에 의한 이론치인 18.7KDa 임을 확인하였다(도 10 참조).
상기 순수 정제된 재조합 사람 GCSF와 재조합 대장균에서 생산된 사람 GCSF 시제품(Grasin, 제일 약품)과의 써큘러 다이크로니즘(circular dichronism) 분석 결과를 비교하였을 때 단백질의 이차구조가 동일함을 확인하였다(도 11 참조).
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 방법을 이용하여 재조합 효모를 배지조성 및 주입속도 등을 조절하여 고농도로 배양시켜 재조합 단백질을 발현시키면 발효배지 1 리터 당 재조합 외래 단백질을 200 ∼ 1500mg 생산할 수 있으며 또한 그 대부분을 최대의 활성을 지닌 단량체의 형태로 얻을 수 있다.
Claims (8)
- 외래 유전자를 포함하는 발현벡터에 의해 형질전환된 재조합 효모를 성장배지의 조성 및 주입속도를 조절하여 고농도로 배양한 다음 다시 재조합 효모를 외래 유전자 발현에 적합한 생산배지로 배양하여 재조합 단백질을 대량으로 얻는 제조방법
- 제 1항에 있어서, 성장배지는 탄소원으로 포도당, 복합 질소원으로 카사미노산(casamino acids)을 포함하고, 탄소원과 복합질소원의 비율은 2 ∼ 4.7 범위인 것이 바람직한 제조방법.
- 제 1항에 있어서, 성장배지의 주입속도는 세포농도에 대한 선형적 의존성을 나타낸 성장속도식을 이용하여 성장배지의 주입속도를 결정함으로써 얻어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제 3항에 있어서, 성장배지의 주입속도의 결정은 초기에 원하는 재조합 효모의 비성장속도()와 속도론적 매개변수(kinetic parameter)인 균체 질량 수율(), 도달할 수 있는 최대 균체농도()를 결정하는 제 1단계와 유가식 배양을 시작할때의 조업 변수인 균체농도()와 발효액의 부피()를 입력하는 제 2단계를 거쳐 성장배지의 새로운 공급속도()를 결정하고, 주기적으로 시료를 채취하여 에탄올이 발견되면 제 1단계의와을 적절하게 변화시키고 에탄올이 발견되지 않아도 재조합 효모의 농도가 계산치와 불일치하면 제 2단계의 측정치를 재입력하는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질의 제조방법.
- 제 1항에 있어서, 형질전환된 재조합 효모는 효모 살상독소의 분비 시그날,사람 인터류킨 1β의 아미노 말단을 융합 분비 시그날로 이용하여 외래단백질을 GAL 10-MFα1 프로모터로부터 생산할 수 있는 발현벡터로 형질전환된 것을 특징으로 하는 제조방법
- 제 1항 또는 제 5항에 있어서, 생산배지는 복합질소원으로 효모 추출물을 사용하는 것이 바람직하고, 탄소원인 갈락토오스와 복합질소원의 비율이 0.5 ∼ 3 범위인 것이 바람직한 제조방법.
- 제 1항, 제 5항 또는 제 6항에 있어서, 생산배지의 발현유도물질인 갈락토오스 농도가 배양액내에서 10g/L이상인 것이 바람직한 제조방법.
- 제 1항, 제 5항 또는 제 6항에 있어서, 재조합 효모 배양액의 pH를 6.0 ∼ 7.0의 범위로 조절하거나 비이온성 계면활성제를 배양액에 첨가하여 분비된 재조합 단백질의 다량체 형성을 저지하여 그 대부분을 단량체의 형태로 분비, 생산하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
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|---|---|---|---|
| KR1019970050022A KR100250804B1 (ko) | 1997-09-30 | 1997-09-30 | 재조합효모를이용한재조합단백질의제조방법 |
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| KR1019970050022A KR100250804B1 (ko) | 1997-09-30 | 1997-09-30 | 재조합효모를이용한재조합단백질의제조방법 |
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| KR19990027554A true KR19990027554A (ko) | 1999-04-15 |
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| KR1019970050022A KR100250804B1 (ko) | 1997-09-30 | 1997-09-30 | 재조합효모를이용한재조합단백질의제조방법 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100672745B1 (ko) * | 2005-04-20 | 2007-01-24 | 재단법인 목암생명공학연구소 | 효모 발현시스템에서의 재조합 외래단백질의 분비효율을향상시키는 방법 |
-
1997
- 1997-09-30 KR KR1019970050022A patent/KR100250804B1/ko not_active IP Right Cessation
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100672745B1 (ko) * | 2005-04-20 | 2007-01-24 | 재단법인 목암생명공학연구소 | 효모 발현시스템에서의 재조합 외래단백질의 분비효율을향상시키는 방법 |
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| KR100250804B1 (ko) | 2000-04-01 |
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