KR19990022531A - VIII-protein receptor HNTNAD2 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 사람 G-단백질 PAF 수용체 폴리펩티드, 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 DNA(RNA), 및 이러한 폴리펩티드를 재조합 기술에 의해 제조하기 위한 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 폴리펩티드에 대한 길항제 및 작용제를 확인하기 위해 이러한 폴리펩티드를 사용하는 방법 및 PAF 수용체 폴리펩티드의 저발현 및 과발현에 관련된 질환을 치료하기 위해 작용제 및 길항제를 치료학적으로 사용하는 방법을 기술한다. 또한, PAF 수용체 핵산 서열을 검출하고 숙주로부터 유래된 샘플 내의 가용성 형태의 수용체를 검출하는 진단 방법을 기술한다.The present invention relates to human G-protein PAF receptor polypeptides, DNA (RNA) encoding such polypeptides, and methods for producing such polypeptides by recombinant techniques. The present invention also describes methods of using such polypeptides to identify antagonists and agents against such polypeptides and therapeutically using agents and antagonists to treat diseases associated with low and overexpression of PAF receptor polypeptides. do. Also described are diagnostic methods for detecting PAF receptor nucleic acid sequences and detecting soluble forms of receptors in a sample derived from a host.
Description
본 발명은 새롭게 동정된 폴리뉴클레오티드, 이러한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드, 이러한 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 용도, 및 이러한 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 제조에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명의 폴리펩티드는 혈소판 활성 인자 수용체로 추정 동정된 사람의 7-투과막 수용체이고, 이후부터 G-단백질 PAF 수용체로 언급한다. 본 발명은 또한 이와 같은 폴리펩티드의 작용을 억제하는 것에 관한 것이다.The present invention relates to newly identified polynucleotides, polypeptides encoded by such polynucleotides, the use of such polynucleotides and polypeptides, and the preparation of such polynucleotides and polypeptides. More particularly, the polypeptides of the present invention are human 7-permeable membrane receptors presumably identified as platelet activating factor receptors, hereinafter referred to as G-protein PAF receptors. The invention also relates to inhibiting the action of such polypeptides.
의학적으로 중요한 많은 생리학적 과정에서, G-단백질 및/또는 CAMP와 같은 제2 메신저와 관련된 신호 변환 경로에 참여하는 단백질이 개재되어 있다고 익히 밝혀졌다[참고 문헌; Lefkowitz, Nature, 351:353-354 (1991)]. 본 명세서에서 이들 단백질은 G-단백질이나 PPG 단백질을 갖는 경로에 개입하는 단백질을 의미한다. 이들 단백질의 대표적인 예로는 아드레날린 및 도파민의 수용체와 같은 GPC 수용체[참조 문헌: Kobilka, B.K., et al., PNAS, 84:46-50 (1987); Kobilka, B.K., et al., Science, 238:650-656 (1987); Bunzow, J.R., et al., Nature, 336:783-787 (1988)], G-단백질, 포스포리파아제 C, 아데닐 사이클라제, 포스포디에스테라제와 같은 작용제 단백질, 및 단백질 키나제 A와 단백질 키나제 C와 같은 작동제 단백질[참조 문헌: Simon, M.I., et al., Science 252:802-8 (1991)]을 포함한다.In many medically important physiological processes, it has been found that intervening proteins participate in signal transduction pathways associated with second messengers such as G-proteins and / or CAMPs [Ref. Lefkowitz, Nature, 351: 353-354 (1991). As used herein, these proteins refer to proteins that intervene in pathways with G-proteins or PPG proteins. Representative examples of these proteins include GPC receptors such as adrenergic and dopamine receptors (Kobilka, B.K., et al., PNAS, 84: 46-50 (1987); Kobilka, B.K., et al., Science, 238: 650-656 (1987); Bunzow, JR, et al., Nature, 336: 783-787 (1988)], agonist proteins such as G-protein, phospholipase C, adenyl cyclase, phosphodiesterase, and protein kinase A Agonist proteins such as protein kinase C (Simon, MI, et al., Science 252: 802-8 (1991)).
예를 들면, 어떤 신호 변환 형태로의 호르몬 결합 효과는 세포 내부의 효소, 아데닐레이트 사이클라제가 활성화이다. 호르몬에 의한 효소 활성화는 뉴클레오티드 GTP의 존재에 의존하고 GTP도 호르몬 결합에 영향을 미친다. G-단백질은 호르몬 수용체를 아데닐레이트 사이클라제에 결합시킨다. G-단백질이 호르몬 수용체에 의해 활성화되면 GTP를 결합 GDP로 교환하는 것으로 보인다. 다음, GTP-운반 형태가 활성화된 아데닐레이트 사이클라제에 결합한다. GTP가 G-단백질 자체에 의해 GDP로 가수분해되면 G-단백질은 이의 기본 비활성 형태로 복귀된다. 따라서, G-단백질은 신호를 수용체로부터 효과인자로 전달하는 중계 역할과 신호의 지속시간을 제어하는 시계로서의 두가지 역할을 한다.For example, the hormonal binding effect of some form of signal transduction is the activation of the enzyme, adenylate cyclase, inside the cell. Enzyme activation by hormones depends on the presence of nucleotide GTP and GTP also affects hormone binding. G-proteins bind hormone receptors to adenylate cyclase. When G-proteins are activated by hormone receptors, it appears to exchange GTP for binding GDP. The GTP-carrying form then binds to activated adenylate cyclase. When GTP is hydrolyzed to GDP by the G-protein itself, the G-protein returns to its basic inactive form. Thus, G-proteins serve as a relay for transmitting signals from receptors to effectors and as a clock for controlling the duration of the signals.
G-단백질 결합 수용체의 막단백질 유전자 계열은 8개의 추정 투과막 도메인을 갖는 것을 특징으로 한다. 이 도메인은 세포외 또는 세포질 루프에 의해 연결된 투과막 α-헬릭스를 나타낸다. G-단백질 결합 수용체는 호르몬과 바이러스 성장 인자와 신경수용체와 같은 생리적으로 활성인 넓은 범위의 수용체를 포함한다.The membrane protein gene family of G-protein coupled receptors is characterized by having eight putative membrane domains. This domain represents the permeable membrane α-helix connected by extracellular or cytoplasmic loops. G-protein coupled receptors include a wide range of physiologically active receptors such as hormones and viral growth factors and neuroreceptors.
G-단백질 결합 수용체는 8개 이상의 상이한 친수성 루프를 연결하고 있는, 약 20 내지 30개의 아미노의 7개의 보존적 소수성 스트렛치를 포함함을 특징으로 한다. 결합 수용체의 G-단백질계에는 정신 질환과 신경 질환의 치료에 사용되는 신경성 약물과 결합하는 도파민 수용체가 포함된다. 또 다른 G-단백질계로는 칼시토닌, 아드레날린제, 엔도텔린, cAMP, 아데노신, 무스카린, 아세틸콜린, 세로토닌, 히스타민, 트롬빈, 키닌, 폴리클 자극 호르몬, 옵신, 내피 차동 유전자-1 수용체 및 로돕신, 방향제, 사이토메가로바이러스 수용체 등이 포함된다.G-protein coupled receptors are characterized as comprising seven conservative hydrophobic stretches of about 20 to 30 amino, linking at least eight different hydrophilic loops. G-protein systems of binding receptors include dopamine receptors that bind neurological drugs used in the treatment of mental and neurological diseases. Another G-protein family includes calcitonin, adrenaline, endothelin, cAMP, adenosine, muscarin, acetylcholine, serotonin, histamine, thrombin, kinin, polyclerate stimulating hormone, opsin, endothelial differential gene-1 receptor and rhodopsin, fragrance , Cytomegalovirus receptors, and the like.
G-단백질 결합 수용체의 대부분은 기능성 단백질 구조를 안정화시키는 것으로 추정되는 이황화물 결합을 형성하는 두 개의 제 1 세포외 루프 각각에서 단일의 보존적 시스테인 잔기를 갖는다. 7개의 투과막 영역이 TM1, TM2, TM3, TM4, TM5, TM6, TM7으로 지정된다. TM3은 신호 변환과 밀접한 관련이 있다.Most of the G-protein coupled receptors have a single conserved cysteine residue in each of the two first extracellular loops that form a disulfide bond that is believed to stabilize the functional protein structure. Seven permeable membrane regions are designated TM1, TM2, TM3, TM4, TM5, TM6, TM7. TM3 is closely related to signal conversion.
시스테인 잔기의 인산화와 지질화(팔미트산화 또는 파네스산화 반응)가 특정 G-단백질 결합 수용체의 신호 변환에 영향을 미칠 수 있다. 대부분의 G-단백질 결합 수용체가 세 번째 세포질 루프 및/또는 카복시 말단 내에 인산화 부위를 갖는다. β-아드레노수용체와 같은 여러 G-단백질 결합 수용체에 있어서, 단백질 키나제 A 및/또는 특정 수용체 키나제에 의한 인산화가 수용체 탈감작화와 관계가 있다.Phosphorylation and lipidation of cysteine residues (palmitoxidation or farnes oxidation reactions) can affect the signal transduction of certain G-protein coupled receptors. Most G-protein coupled receptors have a phosphorylation site in the third cytoplasmic loop and / or carboxy terminus. For many G-protein coupled receptors, such as β-adrenoceptors, phosphorylation by protein kinase A and / or specific receptor kinases is associated with receptor desensitization.
G-단백질 결합 수용체의 리간드 결합 부위는, 몇몇 G-단백질 결합 수용체 투과막 도메인에 의해 형성되고 G-단백질 결합 수용체의 소수성 잔기로 둘러싸인 친수성 소켓을 포함한다. 각 G-단백질 결합 수용체 투과막 나선의 친수성 부위는 안쪽으로 향하여 극성 리간드 결합 자리를 형성하는 것으로 간주된다. TM3은 TM3 아스파르테이트 잔기를 포함하는 것과 같이 리간드 결합 자리를 가짐으로써 몇몇 G-단백질 결합 수용체와 밀접하게 연관된다. 또한, TM5 세린, TM6 아스파라긴, TM6 또는 TM7 페닐알라닌 또는 티로신은 리간드 결합과 관계가 있다.The ligand binding site of the G-protein binding receptor comprises a hydrophilic socket formed by several G-protein binding receptor permeable membrane domains and surrounded by hydrophobic residues of the G-protein binding receptor. The hydrophilic sites of each G-protein coupled receptor permeable membrane helix are considered to form inwardly polar ligand binding sites. TM3 is closely associated with several G-protein binding receptors by having a ligand binding site, such as comprising a TM3 aspartate residue. In addition, TM5 serine, TM6 asparagine, TM6 or TM7 phenylalanine or tyrosine are involved in ligand binding.
G-단백질 결합 수용체는 세포내에서 이형삼합체 G-단백질에 의해 여러 가지 세포내 효소, 이온 채널 및 담체와 결합된다[참조 문헌: Johnson et al., Endoc., Rev., 10:317-331 (1989)]. 상이한 G-단백질 α-서브유니트가 우선적으로 특정한 효과인자를 자극하여 세포에서 다양한 생리학적 기능을 조절한다. G-단백질 결합 수용체의 세포질 잔기의 인산화는 어떤 G-단백질 결합 수용체의 G-단백질 결합을 조절하는 중요한 메커니즘인 것으로 확인되었다. G-단백질 결합 수용체은 포유 동물 숙주 내의 여러곳에서 발견된다.G-protein coupled receptors are bound intracellularly with various intracellular enzymes, ion channels and carriers by heterotrimeric G-proteins. Johnson et al., Endoc., Rev., 10: 317-331 ( 1989). Different G-protein α-subunits preferentially stimulate specific effectors to regulate various physiological functions in the cell. Phosphorylation of cytoplasmic residues of G-protein coupled receptors has been found to be an important mechanism for regulating G-protein binding of certain G-protein coupled receptors. G-protein coupled receptors are found in many places in mammalian hosts.
본 발명의 한 측면에 따라, 새로운 성숙한 수용체 폴리펩티드, 및 생리학적으로 활성이고 진단 또는 치료학적으로 유용한 이의 단편, 유사체 및 유도체를 제공한다. 본 발명의 수용체 폴리펩티드는 사람 기원이다.According to one aspect of the present invention, novel mature receptor polypeptides and fragments, analogs and derivatives thereof are physiologically active and diagnostically or therapeutically useful. Receptor polypeptides of the invention are of human origin.
본 발명의 또 다른 측면에 따라, mRNA, DNA, cDNA, 게놈 DNA 및 이의 안티센스 유사체와 생리학적으로 활성이고 진단 및 치료학적으로 유용한 이의 단편을 포함하는, 본 발명의 수용체 폴리펩티드를 암호화하는 분리시킨 핵산 분자를 제공한다.According to another aspect of the invention, an isolated nucleic acid encoding a receptor polypeptide of the invention, including mRNA, DNA, cDNA, genomic DNA and antisense analogs thereof and fragments thereof physiologically active and diagnostically and therapeutically useful Provide a molecule.
본 발명의 또 다른 측면에 따라, 본 발명의 수용체 폴리펩티드의 발현과 회수를 증진하는 조건하에서 수용체 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 갖는 재조합 원핵 및/또는 진핵 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 재조합 기술에 의한 수용체 폴리펩티드의 제조 방법을 제공한다.According to another aspect of the invention, a recombinant technique comprising culturing a recombinant prokaryotic and / or eukaryotic host cell having a nucleic acid sequence encoding a receptor polypeptide under conditions that enhance expression and recovery of the receptor polypeptide of the invention. The present invention provides a method for producing a receptor polypeptide.
본 발명의 또 다른 측면에 따라, 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체를 제공한다.According to another aspect of the invention, an antibody against a polypeptide of the invention is provided.
본 발명의 또 다른 측면에 따라, 본 발명의 수용체 폴리펩티드에 결합하여 이의 활성을 활성화시키거나 억제하는 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.According to another aspect of the invention, there is provided a method for screening a compound that binds to and activates or inhibits its activity of a receptor polypeptide of the invention.
본 발명의 또 다른 측면에 따라, 혈소판 응고를 유도하여 혈우병을 방지 및/또는 치료하고 상처 치유를 증진하는데 유용한 본 발명의 수용체 폴리펩티드와 결합하여 활성화시키는 화합물을 숙주에 투여하는 방법을 제공한다.According to another aspect of the invention, there is provided a method of administering to a host a compound that binds to and activates a receptor polypeptide of the invention useful for inducing platelet clotting to prevent and / or treat hemophilia and promote wound healing.
본 발명의 또 다른 측면에 따라, 알레르기, 독감, 혈관성형 후 재발협착증, 불안정 안기나, 심근 경색, 그리고 폐혈증 또는 폐혈증성 식전증을 방지 및/또는 치료하는데 유용한 본 발명의 수용체 폴리펩티드와 결합하여 활성화시키는 화합물을 숙주에 투여하는 방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, activation in combination with a receptor polypeptide of the present invention useful for preventing and / or treating allergy, flu, restenosis after angioplasty, unstable eye, myocardial infarction, and pulmonary or pulmonary preemic disease Provided are methods for administering a compound to a host.
본 발명의 또 다른 측면에 따라, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열을 특이적으로 하이브리드화시키기에 충분한 길이를 갖는 핵산 분자로 이루어진 핵산 프로브를 제공한다.According to another aspect of the invention, there is provided a nucleic acid probe consisting of a nucleic acid molecule having a length sufficient to specifically hybridize a polynucleotide sequence of the invention.
본 발명의 또 다른 측면에 따라, 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 변이에 관련한 질병을 탐지하고, 수용체 폴리펩티드의 가용성 형태의 변경 수준을 탐지하기 위한 진단 분석을 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a diagnostic assay for detecting a disease associated with a mutation in a nucleic acid sequence encoding a polypeptide of the invention and for detecting the level of alteration of the soluble form of the receptor polypeptide.
본 발명의 또 다른 측면에 따라, 본 발명의 수용체 폴리펩티드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 과학적인 연구와 DNA 합성, DNA 벡터 제조에 이용하는 방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a method of using the receptor polypeptide of the present invention or a polynucleotide encoding the same for scientific research, DNA synthesis, and DNA vector production.
본 발명의 상기 또는 그밖의 측면은 해당 기술의 지식을 습득한 자에게 분명히 이해될 것이다.These or other aspects of the invention will be apparent to those of skill in the art.
다음의 도면은 본 발명의 실시예를 설명하는 것이지 청구 범위에 포함된 본 발명의 범위를 한정하지 않는다.The following drawings illustrate embodiments of the invention and do not limit the scope of the invention, which is included in the claims.
도 1은 혈소판 활성 인자 수용체로 동정된 본 발명의 G-단백질 수용체의 cDNA 서열과 이에 상응하는 추정된 아미노산 서열을 나타낸다. 아미노산에 표준 1문자의 약어를 사용한다. 373 자동 DNA 서열기(Applied Biosystems, Inc.)를 사용하여 서열화한다.1 shows the cDNA sequence of the G-protein receptor of the invention identified as platelet activator receptor and the corresponding estimated amino acid sequence. Use standard one letter abbreviations for amino acids. 373 automated DNA sequencer (Applied Biosystems, Inc.).
도 3은 본 발명의 G-단백질(윗줄)의 아미노산 정렬과 사람 PAF 수용체(아랫줄)의 것을 나타낸다.Figure 3 shows the amino acid alignment of the G-protein (upper row) of the invention and that of human PAF receptor (lower row).
본 발명의 측면에 따라, 도 1(서열 2)의 유추한 아미노산 서열을 갖는 성숙한 폴리펩티드 또는 1995년 6월 1일자로 ATCC 기탁번호 제 호로 기탁된 클론의 cDNA에 의해 암호화된 성숙한 폴리펩티드를 암호화하는 분리시킨 핵산(폴리뉴클레오티드)을 제공한다.According to an aspect of the invention, an isolation encoding a mature polypeptide having the inferred amino acid sequence of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) or a mature polypeptide encoded by cDNA of a clone deposited with ATCC Accession No. 1, June 1, 1995. Nucleic acid (polynucleotide) is provided.
본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드는 백혈구, 폐, 신장에서 발견된다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 사람의 갑상선에서 추출한 cDNA 라이브러리에서 발견되었고, G 단백질-PAF 수용체 계열과 구조적으로 연관이 있다. 337개의 아미노산 잔기로 된 단백질을 암호화하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 갖는다. 단백질은 334개의 아미노산 쇄에서 사람 PAF 수용체와 29.375%의 동일성과 53.438%의 유사성을 나타냄으로써 유사성 정도가 높다.Nucleotides encoding the polypeptides of the invention are found in white blood cells, lungs, kidneys. The polynucleotides of the present invention have been found in cDNA libraries extracted from human thyroid and are structurally related to the G protein-PAF receptor family. It has an open reading frame that encodes a protein of 337 amino acid residues. The protein has a high degree of similarity, showing 29.375% identity and 53.438% similarity with the human PAF receptor in the 334 amino acid chain.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 RNA 형태 또는 cDAN, 게놈 DNA 및 합성 DNA를 포함하는 DNA 형태일 수 있다. DNA는 이본쇄 또는 일본쇄로서, 일본쇄인 경우 암호 쇄이거나 비암호(안티센스) 쇄이다. 성숙한 폴리펩티드를 암호화하는 암호 서열은 도 1(서열 1)에 나타낸 유전 암호 서열이나 기탁된 클론의 암호 서열과 일치하고, 또는 유전 암호의 중복이나 변성으로 인하여 암호 서열이 도 1(서열 1) 또는 DNA나 기탁된 cDNA와 동일한 성숙한 폴리펩티드를 암호화하는 상이한 유전 암호 서열일 수 있다.The polynucleotides of the present invention may be in the form of RNA or in the form of DNA including cDAN, genomic DNA and synthetic DNA. DNA is a double strand or single strand, and in the case of the Japanese strand, it is either a coding strand or a non-coding (antisense) strand. The coding sequence encoding the mature polypeptide matches the genetic coding sequence shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) or the coding sequence of the deposited clone, or due to duplication or denaturation of the genetic code, the coding sequence appears in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) or DNA. Or may be a different genetic coding sequence encoding the same mature polypeptide as the deposited cDNA.
도 1(서열 2)의 성숙한 폴리펩티드 또는 cDNA에 의해 암호화된 성숙한 폴리펩티드에 대하여 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 성숙한 폴리펩티드 암호 서열; 성숙한 폴리펩티드 암호 서열과 추가 암호 서열; 성숙한 폴리펩티드 암호 서열(및 임의적으로 추가 암호 서열)과, 성숙한 폴리펩티드 암호 서열의 인트론이나 비암호 서열 5' 및/또는 3'와 같은 비암호 서열을 포함한다.The polynucleotide encoding for a mature polypeptide of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) or a mature polypeptide encoded by cDNA may comprise a mature polypeptide coding sequence; Mature polypeptide coding sequence and additional coding sequence; Mature polypeptide coding sequences (and optionally additional coding sequences) and non-coding sequences such as introns or non-coding sequences 5 'and / or 3' of mature polypeptide coding sequences.
폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드라는 용어는 추가적인 암호 및/또는 비암호 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라 폴리펩티드 암호 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.The term polynucleotide encoding a polypeptide refers to a polynucleotide comprising a polypeptide coding sequence as well as a polynucleotide comprising additional coding and / or noncoding sequences.
본 발명은 또한 도 1(서열 2)의 추정된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 기탁된 클론의 cDNA에 의해 암호화된 폴리펩티드의 단편, 유사체 및 유도체를 암호화하는 상기에 설명한 폴리뉴클레오티드의 변이체에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드의 변이체는 폴리펩티드의 자연 발생적 대립형질 또는 폴리뉴클레오티드의 인공적인 변이체이다.The invention also relates to variants of the polynucleotides described above encoding fragments, analogs and derivatives of the polypeptides having the putative amino acid sequence of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) or polypeptides encoded by cDNA of deposited clones. Variants of polynucleotides are naturally occurring alleles of a polypeptide or artificial variants of polynucleotides.
그러므로, 본 발명은 도 1(서열 2)의 폴리펩티드의 단편, 유도체 또는 유사체 또는 기탁된 클론의 cDNA에 의해 암호화된 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 변이체뿐만 아니라, 도 1(서열 2)에 나타낸 것과 같은 성숙한 폴리펩티드 또는 기탁된 클론의 cDNA에 의해 암호화된 동일한 성숙한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이와 같은 뉴클레오티드 변이체에는 결실 변이와 대체 변이, 추가 또는 삽입 변이가 포함된다.Thus, the present invention is directed to fragments, derivatives or analogues of the polypeptide of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) or variants of the polynucleotide encoding the polypeptide encoded by the cDNA of the deposited clone, as shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2). Polynucleotides encoding the same mature polypeptide encoded by the mature polypeptide or cDNA of a deposited clone. Such nucleotide variants include deletion and replacement variants, addition or insertion variants.
상기에서 지적한 바와 같이, 폴리뉴클레오티드는 도 1(서열 2)에서 나타낸 암호 서열 또는 기탁된 클론의 암호 서열의 자연 발생적 대립 유전자 변이체를 갖는다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 대립 유전자 변이체는 한 개 이상의 뉴클레오티드가 대체, 결실 또는 추가된 폴리뉴클레오티드의 변이 형태로서 암호화 폴리펩티드의 기능을 실제적으로 바꾸지는 못한다.As noted above, the polynucleotide has a naturally occurring allelic variant of the coding sequence shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) or the coding sequence of the deposited clone. As is known in the art, allelic variants do not substantially alter the function of the coding polypeptide as a variant form of polynucleotide in which one or more nucleotides have been replaced, deleted or added.
폴리뉴클레오티드는 또한 TM으로부터 분해된 폴리펩티드의 세포외 부분과 본 발명의 완전한 길이의 폴리펩티드의 세포내 도메인인 PAF 수용체 폴리펩티드의 가용 형태를 암호화한다.The polynucleotide also encodes an soluble form of the PAF receptor polypeptide, the extracellular portion of the polypeptide digested from the TM and the intracellular domain of the full length polypeptide of the invention.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 암호 서열에 프레임에서 마커 서열과 융착되기 때문에 본 발명의 폴리펩티드를 정제할 수 있게 된다. 마커 서열은 박테리아 숙주의 경우 표지물에 융착된 성숙한 폴리펩티드를 정제하기 위하여 pQE-9 벡터에 의해 공급된 헥사히스티딘 태그이거나, COS-7 세포와 같은 포유 동물 숙주인 경우 헤마글루티닌(HA) 태그이다. HA 태그는 인플루엔자 헤마글루틴 단백질[참조 문헌: Wilson, I., et al., Cell, 37:767 (1984)]로부터 추출한 에피토프에 해당한다.Since the polynucleotide of the present invention is fused with a marker sequence in a frame to a coding sequence, the polypeptide of the present invention can be purified. The marker sequence is a hexahistidine tag supplied by the pQE-9 vector to purify the mature polypeptide fused to the label for bacterial hosts or a hemagglutinin (HA) tag for mammalian hosts such as COS-7 cells. . HA tags correspond to epitopes extracted from influenza hemagglutinin protein (Wilson, I., et al., Cell, 37: 767 (1984)).
본 발명은 또한 상기에 설명한 서열들이 70% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상 일치할 때 서열을 혼성시키는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 특히 엄격한 조건하에 상기에 설명한 폴리뉴클레오티드로 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 엄격한 조건이라 함은 서열간의 동일성이 95% 이상, 바람직하게는 97% 이상일 때에만 하이브리드화가 일어나는 것을 말한다. 한 양태에서 상기 폴리뉴클레오티드로 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드는, 폴리펩티드가 막 결합 PAF 수용체로서 기능을 하지 못한다해도 제2 메신저 반응을 유도하여 수용체의 리간드와 결합하는 능력을 보유함으로써 가용성 PAF로 기능하는 것과 같이 도 1(서열 1)의 cDNA 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 성숙한 폴리펩티드와 동일한 생리학적 기능 또는 활성을 유지하는 폴리펩티드를 암호화한다.The present invention also relates to polynucleotides which hybridize sequences when the sequences described above are at least 70%, preferably at least 90%, more preferably at least 95% identical. The present invention relates to polynucleotides which hybridize to the polynucleotides described above under particularly stringent conditions. Stringent conditions mean that hybridization occurs only when the identity between sequences is at least 95%, preferably at least 97%. In one embodiment, the polynucleotide hybridized to the polynucleotide functions as a soluble PAF by retaining the ability to bind a ligand of the receptor by inducing a second messenger response even if the polypeptide does not function as a membrane binding PAF receptor. A polypeptide that retains the same physiological function or activity as the mature polypeptide encoded by the cDNA or deposited cDNA of FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) is encoded.
또한, 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 폴리뉴클레오티드로 혼성화하고, 상기에 설명한 바와 같이 일치하고, 활성을 보유하거나 보유하지 않을 수 있는 염기를 20개 이상, 바람직하게는 30개 이상, 더욱 바람직하게는 50개 이상 가진다. 예를 들면, 이와 같은 폴리뉴클레오티드는 서열 1의 폴리뉴클레오티드나 이의 변이체로 사용되거나, 진단 프로브 또는 PCR 프라이머로서 뉴클레오티드를 회수하는데 사용될 수 있다.In addition, the polynucleotide hybridizes to the polynucleotide of the present invention and has at least 20 bases, preferably at least 30 bases, more preferably 50 bases, which are identical as described above and which may or may not retain activity. Have more than For example, such polynucleotides can be used as the polynucleotide of SEQ ID NO: 1 or a variant thereof, or used to recover nucleotides as diagnostic probes or PCR primers.
그러므로, 본 발명은 서열 2의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 70% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상 일치하는 폴리뉴클레오티드와 염기를 30개 이상, 바람직하게는 50개 이상 갖는 이의 단편 및 이러한 폴리펩티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드에 관한 것이다.Therefore, the present invention provides at least 30, preferably at least 50 polynucleotides and bases that match at least 70%, preferably at least 90%, more preferably at least 95% of the polynucleotides encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 2. To fragments thereof and polypeptides encoded by such polypeptides.
여기에서 언급한 기탁물은 특허 출원을 목적으로 미생물 기탁에 대해 국제 협약인 부다페스트 조약 하에 유지된다. 이와 같은 기탁물은 본 기술 분야에 숙지의 지식을 가진 자에게 편의를 위해 단순히 제공될 수 있으나 35 U.S.C. §112하에 요구되는 경우는 승인되지 않는다. 기탁된 물질에 포함된 폴리뉴클레오티드 서열 뿐만 아니라 이에 의해 암호화된 폴리펩티드의 아미노산 서열은 여기에 참고로 나타내고 여기에서 서열에 관한 임의 설명과 충돌되는 경우에는 조절할 수 있다. 기탁된 물질을 만들거나, 이용하거나 또는 시판하는 경우 라이센스가 요구될 수 있으나 이와 같은 라이센스는 승인되지 않는다.The deposits referred to herein are maintained under the Budapest Treaty, an international convention on microbial deposits for the purpose of patent application. Such deposits may simply be provided for convenience to those of ordinary skill in the art, but 35 U.S.C. It is not approved if required under § 112. The polynucleotide sequences included in the deposited material as well as the amino acid sequences of the polypeptides encoded thereby are controllable in the case of conflict with any description of the sequences herein. A license may be required to make, use or market a deposited material, but such a license is not approved.
본 발명은 또한 추정된 도 1(서열 2)의 아미노산 서열을 갖거나 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 아미노산 서열을 갖는 PAF 수용체 폴리펩티드, 및 이의 단편, 유사체 및 유도체에 관한 것이다.The present invention also relates to PAF receptor polypeptides having the amino acid sequence of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) or having an amino acid sequence encoded by deposited cDNA, and fragments, analogs and derivatives thereof.
도 1(서열 2)의 폴리펩티드를 언급되는 단편, 유사체 및 유도체의 의미는, PAF 수용체로 기능하는 폴리펩티드나, 수용체의 가용 형태와 같이 G-단백질 PAF 수용체로서 기능을 하지 못한다해도 수용체의 리간드와 결합하는 능력을 가지는 폴리펩티드와 같은 생리학적 기능이나 활성을 유지하는 폴리펩티드를 말한다.The meaning of fragments, analogs and derivatives referring to the polypeptide of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) means that the polypeptide binds to the ligand of the receptor even if it does not function as a G-protein PAF receptor, such as a polypeptide or a soluble form of the receptor. A polypeptide that maintains physiological function or activity, such as a polypeptide having the ability to do so.
본 발명에 따른 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드, 천연 폴리펩티드 또는 합성 폴리펩티드, 바람직하게는 재조합 폴리펩티드이다.Polypeptides according to the invention are recombinant polypeptides, natural polypeptides or synthetic polypeptides, preferably recombinant polypeptides.
도 1(서열 2)의 폴리펩티드의 단편, 유도체 또는 유사체나 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 폴리펩티드에는 (ⅰ) 한 개 이상의 아미노산 잔기가 보존 또는 비보존 아미노산 잔기(바람직게하는, 보존 아미노산 잔기)로 치환되고, 치환된 아미노산 잔기는 유전 코드에 의해 암호화되거나 암호화되지 않은 폴리펩티드, (ⅱ) 한 개 이상의 아미노산 잔기가 치환기를 포함하는 폴리펩티드, (ⅲ) 성숙한 폴리펩티드가 폴리펩티드의 반감기를 증가시키는 화합물(예: 폴리에틸렌 글리콜)과 같은 다른 화합물과 결합하는 폴리펩티드, 또는 (ⅳ) 추가 아미노산이 성숙한 폴리펩티드의 정제에 사용되는 성숙한 폴리펩티드나 단백질 전구체 서열과 결합하는 폴리펩티드, 또는 (ⅴ) 폴리펩티드의 단편이 가용성, 즉 막과 결합하지 않고 막 결합 수용체와 리간드 결합하고 있는 폴리펩티드가 포함된다.In fragments, derivatives or analogs of the polypeptide of FIG. Substituted amino acid residues are polypeptides encoded or unencoded by a genetic code, (ii) polypeptides in which one or more amino acid residues comprise a substituent, (i) a compound in which a mature polypeptide increases the half-life of the polypeptide, such as polyethylene Polypeptides that bind to other compounds, such as glycols), or (iii) additional amino acids bind to mature polypeptides or protein precursor sequences used for purification of mature polypeptides, or (iii) fragments of polypeptides are soluble, i.e., associated with membranes. Ligand binding to the membrane-bound receptor It includes Li peptide.
본 발명의 폴리펩티드와 폴리뉴클레오티드는 분리된 형태로 제공되고 균질하게 정제되는 것이 바람직하다.The polypeptides and polynucleotides of the invention are preferably provided in isolated form and are homogeneously purified.
본 발명의 폴리펩티드는 서열 2의 폴리펩티드와 70% 이상 유사(바람직하게는 70% 이상 동일)하고, 더욱 바람직하게는 서열 2의 폴리펩티드와 90% 이상 유사(바람직하게는 90% 이상 동일)하고, 보다 바람직하게는 서열 2의 폴리펩티드와 95% 이상 유사(바람직하게는 95% 이상 동일)하는 폴리펩티드외에도 서열 2의 폴리펩티드(특히, 성숙한 폴리펩티드)를 포함하고, 30개 이상의 아미노산, 더욱 바람직하게는 50개 이상의 아미노산을 갖는 폴리펩티드 부분을 포함한다.The polypeptide of the present invention is at least 70% similar (preferably at least 70% identical) to the polypeptide of SEQ ID NO: 2, more preferably at least 90% similar (preferably at least 90% identical) to the polypeptide of SEQ ID NO: 2, and Preferably, in addition to a polypeptide that is at least 95% similar (preferably at least 95% identical) to the polypeptide of SEQ ID NO: 2, the polypeptide of SEQ ID NO: 2 (particularly a mature polypeptide) comprises at least 30 amino acids, more preferably at least 50 Polypeptide portions having amino acids.
두 개의 폴리펩티드간의 유사성은 한 폴리펩티드의 아미노산 서열과 그 보전적 아미노산 서열을 다른 폴리펩티드의 서열과 비교하여 측정한다.Similarity between two polypeptides is determined by comparing the amino acid sequence of one polypeptide and its conservative amino acid sequence with that of another polypeptide.
본 발명에 따른 폴리펩티드의 단편 또는 부분은 펩티드 합성에 의해 상응하는 완전한 길이의 폴리펩티드를 제조하는데 사용할 수 있어, 단편은 완전한 길이의 폴리펩티드를 제조하는데 중간체로서 사용할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 단편 또는 부분은 본 발명의 완전한 길이의 폴리뉴클레오티드를 합성하는데 사용할 수 있다.Fragments or portions of the polypeptides according to the invention can be used to produce corresponding full length polypeptides by peptide synthesis, so that fragments can be used as intermediates to produce full length polypeptides. Fragments or portions of the polypeptides of the invention can be used to synthesize full length polynucleotides of the invention.
용어 유전자는 폴리펩티드 쇄를 제조하는데 관여하는 DNA 분절을 의미하고; 개별 암호 분절(엑손) 사이의 개재 배열(인트론)외에도 암호 영역 전후의 영역 리더 및 트레일러를 포함한다.The term gene means a DNA segment involved in making a polypeptide chain; In addition to intervening arrangements (introns) between individual cryptographic segments (exons), they include domain leaders and trailers before and after the cryptographic domain.
용어 분리됨란 물질을 (예: 천연 발생일 경우 자연 환경) 원래의 환경으로부터 제거함을 의미한다. 예를 들면, 살아있는 동물 체내에 존재하는 천연 폴리뉴클레오티드 또는 천연 폴리펩티드는 분리할 수 없지만 자연 시스템에서 공존하는 물질의 일부나 전체로부터 분리시킨 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 분리해낼 수 있다. 이와 같은 폴리뉴클레오티드는 벡터의 일부일 수 있고/있거나 이러한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 조성물의 일부일 수 있으며, 벡터 또는 조성물이 자연 환경의 일부가 아닌 경우 분리할 수 있다.The term isolated means the removal of a substance from its original environment (eg the natural environment if it is a natural occurrence). For example, natural polynucleotides or polypeptides present in a living animal body cannot be separated, but the same polynucleotides or polypeptides isolated from some or all of the coexisting material in a natural system can be isolated. Such polynucleotides may be part of a vector and / or such polynucleotides or polypeptides may be part of a composition and may be isolated if the vector or composition is not part of the natural environment.
본 발명의 폴리펩티드는 서열 2의 폴리펩티드와 70% 이상 유사(바람직하게는 70% 이상 동일)하고, 더욱 바람직하게는 서열 2의 폴리펩티드와 90% 이상 유사(바람직하게는 90% 이상 동일)하고, 보다 바람직하게는 서열 2의 폴리펩티드와 95% 이상 유사(바람직하게는 95% 이상 동일)하는 폴리펩티드외에도 서열 2의 폴리펩티드(특히, 성숙한 폴리펩티드)를 포함하고, 30개 이상의 아미노산, 더욱 바람직하게는 50개 이상의 아미노산을 갖는 폴리펩티드 부분을 포함한다.The polypeptide of the present invention is at least 70% similar (preferably at least 70% identical) to the polypeptide of SEQ ID NO: 2, more preferably at least 90% similar (preferably at least 90% identical) to the polypeptide of SEQ ID NO: 2, and Preferably, in addition to a polypeptide that is at least 95% similar (preferably at least 95% identical) to the polypeptide of SEQ ID NO: 2, the polypeptide of SEQ ID NO: 2 (particularly a mature polypeptide) comprises at least 30 amino acids, more preferably at least 50 Polypeptide portions having amino acids.
당해 분야에 공지된 바와 같이 두 개의 폴리펩티드간의 유사성은 한 폴리펩티드의 아미노산 서열과 그 보전적 아미노산 치환물을 제2 폴리펩티드의 서열과 비교하여 측정한다.As is known in the art, the similarity between two polypeptides is determined by comparing the amino acid sequence of one polypeptide and its conservative amino acid substitutions with that of the second polypeptide.
본 발명의 폴리펩티드의 단편 또는 부분은 펩티드 합성에 의해 상응하는 완전한 길이의 폴리펩티드를 제조하는데에 사용할 수 있다: 그러므로, 상기 단편은 완전한 길이의 폴리펩티드를 제조하는데 중간물로서 사용할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 단편 또는 부분은 본 발명의 완전한 길이의 폴리뉴클레오티드를 합성하는데 사용할 수 있다.Fragments or portions of the polypeptides of the invention can be used to produce corresponding full length polypeptides by peptide synthesis: the fragments can therefore be used as intermediates to prepare full length polypeptides. Fragments or portions of the polypeptides of the invention can be used to synthesize full length polynucleotides of the invention.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 유전학적으로 본 발명의 벡터와 조작되는 숙주 세포 및 재조합 기술에 의한 본 발명의 폴리펩티드의 제조에 관한 것이다.The invention also relates to the production of a polypeptide comprising the polynucleotide of the invention, a host cell genetically engineered with the vector of the invention, and a polypeptide of the invention by recombinant technology.
숙주 세포를 복제 벡터나 발현 벡터와 같은 본 발명의 벡터를 사용하여 유전학적으로 조작(형질도입, 형질전환 또는 형질감염)한다. 벡터는 플라스미드, 바이러스 입자, 파아지 등의 형태이다. 조작된 숙주 세포는 프로모터를 활성화시키거나 형질전환체를 선택하고 또는 본 발명의 유전자를 증폭시키기에 적합하게 조절한 종래의 부양 배지에서 배양된다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현 실험에 선택한 숙주 세포의 것이며, 이는 통상의 숙련가에게는 명백할 것이다.Host cells are genetically engineered (transduced, transformed or transfected) using vectors of the invention such as replication vectors or expression vectors. Vectors are in the form of plasmids, viral particles, phages and the like. Engineered host cells are cultured in conventional flotation medium that is suitably adapted to activate promoters, select transformants, or amplify the genes of the invention. Culture conditions, such as temperature, pH, etc., are those of the host cell chosen for the expression experiment, which will be apparent to those of ordinary skill in the art.
본 발명의 뉴클레오티드는 재조합 기술에 의한 폴리펩티드의 제조에 사용할 수 있다. 따라서, 예를 들면 폴리뉴클레오티드를 폴리펩티드를 발현시키기 위한 여러 가지 발현 벡터 중의 어느 하나에 포함시킬 수 있다. 이와 같은 벡터에는 SV40의 유도체와 같은 염색체, 비염색체 및 합성 DNA 서열; 박테리아 플라스미드; 파아지 DNA; 바쿨로바이러스; 효모 플라스미드; 플라스미드와 파아지 DNA의 조합물과 백시나와 같은 바이러스 DNA로부터 추출한 벡터; 아데노바이러스; 파울 폭스 바이러스; 및 가성광견병균이 포함될 수 있다. 그러나, 이외의 벡터도 숙주내에서 복제가능하고 생존가능한 한 사용할 수 있다.Nucleotides of the present invention can be used for the production of polypeptides by recombinant techniques. Thus, for example, the polynucleotide can be included in any one of a variety of expression vectors for expressing a polypeptide. Such vectors include chromosomal, non-chromosomal and synthetic DNA sequences such as derivatives of SV40; Bacterial plasmids; Phage DNA; Baculovirus; Yeast plasmids; A vector extracted from a combination of plasmid and phage DNA and viral DNA such as vaccinas; Adenovirus; Foul fox virus; And pseudorabies. However, other vectors can be used as long as they are replicable and viable in the host.
여러 가지 방법으로 적합한 DNA 서열을 벡터 내에 삽입할 수 있다. 일반적으로, DNA 서열은 당해 분야에 공지된 방법에 의해 적정한 제한 엔도누클레아제 자리에 삽입된다. 이러한 모든 방법은 당해 분야의 기술의 범주 내에 있는 것으로 간주된다.There are many ways to insert suitable DNA sequences into a vector. In general, DNA sequences are inserted into appropriate restriction endonuclease sites by methods known in the art. All such methods are considered to be within the scope of the art.
발현 벡터 내의 DNA 서열은 mRNA 합성을 지시하는 발현 제어 서열(프로모터)와 결합한다. 이들 촉진 유전자의 대표적인 예로는 LTR 또는 SV40 촉진 유전자; 이. 콜라이(E. Coli), lac 또는 trc, 파이지 람다 PL프로모터, 그리고 원핵 또는 진핵 세포나 이의 바이러스에서 유전자의 발현을 제어하는 기타 프로모터들이 있다. 발현 벡터는 또한 해독 개시와 해독 종료를 위한 리보솜 결합 자리와, 발현을 증폭시키기 위한 서열을 포함할 수 있다.The DNA sequence in the expression vector binds to an expression control sequence (promoter) that directs mRNA synthesis. Representative examples of these promoter genes include LTR or SV40 promoter genes; this. E. Coli, lac or trc, pizi lambda P L promoters, and other promoters that control gene expression in prokaryotic or eukaryotic cells or viruses thereof. Expression vectors may also include ribosomal binding sites for initiation and termination of translation and sequences for amplifying expression.
또한, 발현 유전자는 바람직하게는 진핵 세포 배양에 대한 디하이드로폴레이트 환원효소나 네오마이신 내성, 또는 이. 콜라이에서 테트라사이클린이나 암피실린 내성과 같은 변형된 숙주세포의 선택에 대한 표현형을 제공하는 한가지 이상의 선택성 마커 유전자를 함유한다.In addition, the expression gene is preferably dihydrofolate reductase or neomycin resistance to eukaryotic cell culture, or E. coli. E. coli contains one or more selectable marker genes that provide a phenotype for selection of modified host cells such as tetracycline or ampicillin resistance.
적합한 프로모터나 제어 서열 뿐만 아니라, 상기에 설명한 바와 같이 적합한 DNA 서열을 갖는 벡터를 사용하여 단백질을 발현시킬 수 있는 적합한 숙주로 형질전환시킬 수 있다.As well as suitable promoters or control sequences, a vector having a suitable DNA sequence as described above can be used to transform into a suitable host capable of expressing the protein.
적합한 숙주의 대표적인 예로는 이. 콜라이, 스트렙토마이스(Streptomyces), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)와 같은 박테리아 세포; 효모와 같은 균주 세포; 드로소필라(Drosophilla)와 스포돕테라(Spodoptera) Sf9와 같은 곤충 세포; CHO, COS 또는 보웨스(Bowes) 멜라노마와 같은 동물 세포; 아데노바이러스; 식물 세포 등을 언급할 수 있다.Representative examples of suitable hosts include E. coli. Bacterial cells such as E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium; Strain cells such as yeast; Insect cells such as Drosophilla and Spodoptera Sf9; Animal cells such as CHO, COS or Bowes melanoma; Adenovirus; Plant cells and the like can be mentioned.
보다 특히, 본 발명은 또한 상기에서 설명한 하나 이상의 서열을 포함하는 이루어진 재조합 작제물을 포함한다. 재조합 작제물은 본 발명의 서열이 삽입된 플라스미드나 바이러스 벡터와 같은 벡터를 포함한다. 본 실시예의 바람직한 측면에 있어서, 재조합 작제물은 서열에 결합된 프로모터를 포함하는 조절 서열로 이루어진다. 다수의 벡터와 프로모터가 공지된 것이고 상용된다. 다음과 같은 벡터가 본 발명에서 제공된다. 박테리아 세포 벡터: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pbs, pD10, 파아지스크립트, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia). 진핵 세포 벡터: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). 숙주에서 복제되고 생존가능한 한, 그밖의 다른 플라스미드나 벡터도 이용가능하다.More particularly, the present invention also encompasses recombinant constructs comprising one or more sequences described above. Recombinant constructs include vectors such as plasmids or viral vectors into which the sequences of the invention have been inserted. In a preferred aspect of this embodiment, the recombinant construct consists of regulatory sequences comprising a promoter linked to the sequence. Many vectors and promoters are known and commercially available. The following vectors are provided in the present invention. Bacterial cell vectors: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pbs, pD10, phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia). Eukaryotic cell vectors: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). Other plasmids or vectors are available as long as they are replicable and viable in the host.
선택가능한 마커를 갖는 CAT (클로람페니콜(chloramphenicol) 전이효소) 벡터나 그밖의 벡터를 사용하여 프로모터 영역을 임의의 원하는 유전자로부터 선택할 수 있다. 두가지 적합한 벡터로는 PKK232-8과 PCM7이 있다. 특별히 지명된 박테리아 프로모터에는 lacI, lacZ, T3, T7, gpt, 람다 PR, PL그리고 trp가 포함된다. 진핵 세포 프로모터에는 CMV, HSV, 티미딘 조효소, 초기 및 최근의 SV40, 레트로바이러스로부터의 LTRs, 그리고 마우스 메탈로티오네인-I이 있다. 적합한 벡터 및 프로모터의 선택은 충분히 당해 분야의 기술 수준 범위내이다.A promoter (chloramphenicol transferase) vector or other vector with selectable markers can be used to select the promoter region from any desired gene. Two suitable vectors are PKK232-8 and PCM7. Specially named bacterial promoters include lacI, lacZ, T3, T7, gpt, lambda P R , P L and trp. Eukaryotic cell promoters include CMV, HSV, thymidine coenzyme, early and recent SV40, LTRs from retroviruses, and mouse metallothionein-I. Selection of suitable vectors and promoters is well within the skill level of the art.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 상기에 설명한 재조합 작제물을 갖는 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 포유 동물 세포와 같은 고등 진핵 세포이거나 효모 세포와 같은 저등 진핵 세포이고, 또는 숙주 세포는 박테리아 세포와 같은 원핵 세포이다. 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란 개입 전염, 또는 전기천공에 의해 재조합 작제물을 숙주 세포에 도입시킬 수 있다[참조 문헌: Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)].In another embodiment, the present invention provides a host cell having the recombinant construct described above. The host cell is a higher eukaryotic cell such as a mammalian cell or a lower eukaryotic cell such as a yeast cell, or the host cell is a prokaryotic cell such as a bacterial cell. Recombinant constructs can be introduced into host cells by calcium phosphate transfection, DEAE-dextran intervening transmission, or electroporation. Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)].
숙주 세포에서 재조합 작제물은 기존의 방식에 사용되어 재조합 서열에 의해 암호화되는 유전자 생성물을 제조할 수 있다. 또한, 종래의 펩티드 합성기를 사용하여 본 발명의 폴리펩티드를 합성에 의해 제조할 수 있다.Recombinant constructs in host cells can be used in conventional manner to produce a gene product encoded by the recombinant sequence. In addition, the polypeptide of the present invention can be produced synthetically using a conventional peptide synthesizer.
적당한 프로모터의 제어에 의해 성숙한 단백질은 포유 동물 세포, 효모, 박테리아, 또는 기타 세포에 발현된다. 또한, 본 발명의 DNA 작제물로부터 유도한 RNA를 사용하여 상기 단백질을 제조하는데 무세포 해독 시스템을 채용한다. 원핵 세포와 진핵 세포 숙주와 함께 사용할 적당한 복제 및 발현 벡터에 대해서 문헌[참고: Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)]에 소개되어 있으며, 이는 본 발명에 인용되었다.Under the control of appropriate promoters, mature proteins are expressed in mammalian cells, yeast, bacteria, or other cells. In addition, a cell-free translation system is employed to prepare the protein using RNA derived from the DNA constructs of the invention. Suitable replication and expression vectors for use with prokaryotic and eukaryotic cell hosts are described in Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY, (1989). , Which is cited in the present invention.
벡터에 인핸서 배열을 삽입하면 고등 진핵 세포에 의한 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 DNA의 전사가 증가한다. 인핸서는 프로모터에 작용하여 그 전사를 증가시키는 약 10 내지 300 bp인 DNA의 시스-작용 요소이다. 그 예로는 복제 오리진 bp 100 내지 270의 최근 SV40 인핸서와, 사이토메가로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기원의 최근 폴리오마 인핸서, 그리고 아데노바이러스 인핸서가 있다.Insertion of an enhancer sequence into the vector increases the transcription of the DNA encoding the polypeptide of the invention by higher eukaryotic cells. Enhancers are cis-acting elements of DNA that are about 10 to 300 bp that act on the promoter and increase its transcription. Examples include recent SV40 enhancers of replication origins bp 100 to 270, cytomegalovirus early promoter enhancers, recent polyoma enhancers of replication origin, and adenovirus enhancers.
일반적으로, 재조합 발현 벡터는 이. 콜라이의 암피실린 내성 유전자와 에스. 세레비지애(S. cerevisiae) TRP1 유전자 같은 숙주 세포의 형질전환을 가능케 하는 복제 기원 및 선택성 마커와, 하향 구조 서열의 전사를 지시하는 발현 유전자로부터 유도된 프로모터를 포함한다. 이러한 프로모터는 3-포스포클리세르산 조효소(PGK), α-인자, 탈인산 분해효소, 또는 열처리 단백질과 같은 해당 반응 효소를 암호화하는 오페론으로부터 유도된다. 이종성 구조 서열이 적당한 상에서 해독 개시 및 종료 서열에 의해, 바람직하게는 세포형질 간극이나 세포외 매질 내부로 해독된 단백질의 방출을 지시할 수 있는 선도 영역에 의해 조립된다. 선택적으로, 이종성 서열이 발현된 재조합물을 안정시키거나 간단히 정제시킬 수 있는 것과 같은 바람직한 특성을 갖는 N-말단 결정 펩티드를 포함하는 융착 단백질을 암호화할 수 있다.In general, recombinant expression vectors are E. coli. Ampicillin resistance gene and E. coli. Replication origin and selectable markers that allow the transformation of host cells, such as the S. cerevisiae TRP1 gene, and promoters derived from expression genes directing transcription of down-structure sequences. Such promoters are derived from operons encoding corresponding reactive enzymes, such as 3-phosphocliseric acid coenzyme (PGK), α-factor, dephosphatase, or heat treated protein. The heterologous structural sequence is assembled by a translational initiation and termination sequence in a suitable phase, preferably by a leader region that can direct the release of the translated protein into the cytoplasmic gap or extracellular medium. Optionally, a fusion protein can be encoded comprising an N-terminal determinant peptide having desirable properties such as the ability to stabilize or simply purify a recombinant expressed heterologous sequence.
박테리아에 유용한 발현 벡터는 기능성 프로모터를 갖는 조작가능한 해독기에 해독 개시 및 종료 신호에 의해 원하는 단백질을 암호화하는 구조 DNA 서열을 삽입시켜 구성된다. 벡터는 한가지 이상의 표현형을 갖는 선택가능한 마커 유전자와, 벡터를 유지하고 필요한 경우에 숙주 내에서 유전자를 증폭시키는 복제 개시 영역으로 이루어진다. 형질전환에 적당한 진핵 숙주에는 이. 콜라이, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 살모넬라 티피무리움 및 슈도모나스속, 스트렙토마이세스, 및 포도구균에 속하는 여러 종류를 선택적으로 사용할 수 있다.Expression vectors useful for bacteria are constructed by inserting a structural DNA sequence encoding a desired protein by a translational initiation and termination signal into an operable reader with a functional promoter. A vector consists of a selectable marker gene having one or more phenotypes and a replication initiation region that maintains the vector and, if necessary, amplifies the gene in the host. Eukaryotic hosts suitable for transformation include E. coli. Several species belonging to E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium and Pseudomonas, Streptomyces, and Staphylococcus are optionally available.
한정적이지는 않으나 대표적인 예로서, 박테리아에 유용한 발현 벡터는 선택가능한 마커 유전자와, 잘 알려진 클로닝 벡터 pBR322(ATCC 37017)의 유전자 요소를 포함하는 시판용 플라스미드로부터 얻은 박테리아 복제 개시 유전자를 포함할 수 있다. 이러한 시판용 벡터에는 pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden)과 GEM1(Promega Biotec, Madison, WI, USA)가 포함된다. 이들 pBR322 주형부는 적당한 프로모터와 발현될 구조 유전자 서열과 연결된다.As a non-limiting but representative example, an expression vector useful for bacteria can include a selectable marker gene and a bacterial replication initiation gene obtained from a commercial plasmid comprising the genetic elements of the well-known cloning vector pBR322 (ATCC 37017). Such commercially available vectors include pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) and GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA). These pBR322 templates are linked with appropriate promoters and structural gene sequences to be expressed.
적합한 숙주 균주를 형질전환시키고 적합한 세포 밀도로 숙주 균주를 증식시킨 다음, 선택된 프로모터를 적합한 방법(예: 온도 변화 또는 화학적 유도)에 의해 유도하고 세포들을 추가 기간 동안 배양시킨다.The appropriate host strain is transformed and the host strain is propagated to a suitable cell density, then the selected promoter is induced by a suitable method (eg temperature change or chemical induction) and the cells are incubated for an additional period of time.
세포를 전형적으로 원심분리에 의해 수거하고, 물리 또는 화학적 방법에 의해 분쇄하고, 생성된 조 추출물을 추가 정제를 위해 보유한다.Cells are typically harvested by centrifugation, milled by physical or chemical methods, and the resulting crude extract is retained for further purification.
단백질의 발현에 사용되는 미생물 세포는, 당해 기술의 숙련가에게 익히 공지된 방법들인 결빙융해 순환, 초음파 분해처리, 기계적 분쇄, 또는 세포 용해제의 사용을 포함하는 통상적인 방법에 의해 분쇄시킬 수 있다.Microbial cells used for expression of proteins can be pulverized by conventional methods, including methods that are well known to those skilled in the art, such as freezing thaw circulation, sonication, mechanical grinding, or the use of cell lysates.
또한, 여러 포유류 세포 배양 시스템을 사용하여 재조합 단백질을 발현시킬 수 있다. 포유류 발현 시스템의 예는, 문헌[참조: Gluzman, Cell, 23:175(1981)]에 기술된 원숭이 신장 섬유아세포의 COS-7 주, 및 적합성 벡터를 발현시킬 수 있는 기타 세포주, 예를 들어 C127, 3T3, CHO, HeLa 및 BHK 세포주를 포함한다. 포유류 발현 벡터는 복제 기점, 적합한 프로모터 및 인핸서, 및 필수 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플리스 공여체 및 수용체 부위, 전사 종결 서열, 및 5' 플랜킹 비전사 서열을 포함한다. SV40 스플리스, 및 폴리아데닐화 부위로부터 유도된 DNA 서열을 사용하여 필요로 하는 비전사 유전자 성분을 제공한다.In addition, several mammalian cell culture systems can be used to express recombinant protein. Examples of mammalian expression systems include, but are not limited to, COS-7 strains of monkey kidney fibroblasts described in Gluzman, Cell, 23: 175 (1981), and other cell lines capable of expressing conformation vectors, for example C127. , 3T3, CHO, HeLa, and BHK cell lines. Mammalian expression vectors include origins of replication, suitable promoters and enhancers, and essential ribosomal binding sites, polyadenylation sites, split donor and receptor sites, transcription termination sequences, and 5 'flanking non-transcription sequences. SV40 splits and DNA sequences derived from polyadenylation sites are used to provide the necessary nontranscribed gene components.
본 발명의 G-단백질 PAF 수용체 폴리펩티드를 암모늄 설페이트 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하는 방법에 의해 재조합 세포 배양으로부터 회수하고 정제할 수 있다. 단백질 리폴딩(refolding) 단계를, 필요한 경우 성숙한 단백질의 배열을 완성하는데 사용할 수 있다. 최종적으로, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 최종 정제 단계에 사용할 수 있다.G-protein PAF receptor polypeptides of the invention can be prepared by ammonium sulfate or ethanol precipitation, acid extraction, anion or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography, hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography, hydroxylapatite chromatography and lectins It can be recovered and purified from recombinant cell culture by a method comprising chromatography. Protein refolding steps can be used to complete the arrangement of mature proteins, if necessary. Finally, high performance liquid chromatography (HPLC) can be used for the final purification step.
본 발명의 폴리펩티드는 자연 정제된 생성물, 또는 화학적 합성 과정, 원핵 또는 진핵 세포 숙주(예를 들어, 배양균 중의 세균성, 효모, 고등 식물, 곤충류 및 포유류 세포에 의해)로부터 재조합 기술에 의해 제조된 생성물일 수 있다. 재조합 제조 과정에 사용된 숙주에 따라, 본 발명의 폴리펩티드는 글리코실화 또는 비글리코실화될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 개시 메티오닌 아미노산 잔기를 포함할 수도 있다.Polypeptides of the invention are products that are produced by recombinant technology from naturally purified products, or from chemical synthesis processes, prokaryotic or eukaryotic cell hosts (eg, by bacterial, yeast, higher plant, insect and mammalian cells in culture). Can be. Depending on the host used in the recombinant preparation process, the polypeptides of the invention can be glycosylated or aglycosylated. Polypeptides of the invention may comprise starting methionine amino acid residues.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 사람 질환에 대한 치료제 및 진단약의 발견을 위한 조사 시약 및 물질로서 사용할 수 있다.The polynucleotides and polypeptides of the present invention can be used as investigational reagents and materials for the discovery of therapeutic and diagnostic agents for human diseases.
본 발명에 따른 G-단백질 PAF 수용체는 본 발명의 수용체 폴리펩티드를 활성화(작용제)하거나 활성화를 억제(길항제)하는 화합물을 선별하는 방법에 사용된다.The G-protein PAF receptor according to the present invention is used in a method for selecting a compound that activates (agonizes) or inhibits activation (antagonist) of a receptor polypeptide of the present invention.
일반적으로, 이러한 스크리닝 과정은 표면에 본 발명의 수용체 폴리펩티드를 발현시키는 적당한 세포를 제공함을 포함한다. 이러한 세포로는 포유 동물, 효모, 초파리 또는 이. 콜라이의 세포를 포함한다. 특히, 본 발명의 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 세포를 감염시켜 G-단백질 PAF 수용체를 발현시키는데 사용한다. 발현된 수용체를 시험 화합물과 접촉시켜 결합, 작용성 반응의 자극 또는 억제를 관찰한다.In general, this screening process involves providing suitable cells to express the receptor polypeptide of the invention on a surface. Such cells include mammalian, yeast, fruit flies or E. coli. Cells of E. coli. In particular, polynucleotides encoding the receptors of the present invention are used to infect cells to express G-protein PAF receptors. The expressed receptor is contacted with the test compound to observe binding, stimulation or inhibition of the functional response.
상기 스크리닝 과정은 형질감염되어 본 발명의 G-단백질 PAF 수용체를 발현시키는 멜라닌 보유세포의 사용을 포함한다. 상기 스크리닝 기술은 1992년 2월 6일에 공개된 PCT WO 92/01810에 기술되어 있다.The screening process involves the use of melanin bearing cells that are transfected to express the G-protein PAF receptor of the invention. The screening technique is described in PCT WO 92/01810 published February 6, 1992.
따라서, 예를 들어 본 발명의 수용체 폴리펩티드의 활성을 억제하는 화합물을 스크리닝하기 위해, 수용체에 결합하는 화합물 및 공지된 리간드 둘다 멜라닌 보유세포와 접촉시킨다. 리간드에 의해 발생되는 신호의 억제는 화합물이 수용체에 대해 강력한 길항제라는 것, 즉 수용체의 활성을 억제한다는 것을 의미한다.Thus, for example, to screen for compounds that inhibit the activity of the receptor polypeptides of the invention, both the compounds that bind to the receptor and known ligands are contacted with melanin bearing cells. Inhibition of the signal generated by the ligand means that the compound is a potent antagonist to the receptor, ie inhibits the activity of the receptor.
스크리닝은 상기 세포와 스크리닝할 화합물과 접촉시킴으로서 수용체에 결합하여 이를 활성화시키는 화합물을 측정하고 상기 화합물이 신호를 발생, 즉 수용체를 활성화시키는지의 여부를 측정하기위해 사용할 수 있다.Screening can be used to determine the compound that binds to and activates a receptor by contacting the cell with the compound to be screened and to determine whether the compound generates a signal, ie activates the receptor.
이외의 예는 문헌[참조: Science, volume 246, page 181-296(1989년 10월)]에 기술된 바와 같이, 수용체 활성에 의해 발생하는 세포외 pH 변화를 측정하는 시스템에서 본 발명의 G-단백질 PAF 수용체를 발현시키는 세포(예를 들어, 형질감염된 CHO 세포)의 사용을 포함한다. 예를 들어, 화합물을 본 발명의 수용체 폴리펩티드를 발현시키는 세포와 접촉시킬 수 있고 제2의 메신저 반응, 예를 들어 pH 변화의 신호 전달을 가능성이 있는 화합물이 활성화제 또는 억제제로서 유효한지의 여부를 결정하기 위해 측정할 수 있다.Other examples are described in G, the present invention in a system for measuring extracellular pH changes caused by receptor activity, as described in Science, volume 246, pages 181-296 (October 1989). The use of cells expressing protein PAF receptors (eg, transfected CHO cells). For example, whether a compound can be brought into contact with a cell expressing a receptor polypeptide of the invention and is likely to be effective as an activator or inhibitor in a second messenger response, e. Can be measured to determine
또 다른 방법에서, G-단백질 PAF 수용체를 암호화하는 RNA를 키세노퍼스 낭포체에 유입시켜 수용체를 발현시킴을 포함한다. 낭포체가 수용체 리간드와 시험할 화합물과 접촉한 후, 수용체의 활성화를 억제시키는 화합물인 경우 칼슘 신호의 억제나 활성화를 검출할 수 있다.In another method, the RNA encoding the G-protein PAF receptor is introduced into a chisenoplast cyst to express the receptor. If the cyst is in contact with a receptor ligand and a compound to be tested, then a compound that inhibits the activation of the receptor can detect the inhibition or activation of calcium signals.
G-단백질 PAF 수용체를 발현시켜서 화합물을 선별하는 또 다른 방법에서는, 수용체가 포스포리파아제 C 또는 D와 연결된다. 이러한 세포에는 내피 세포, 평활근 세포, 배아 신장 세포 등을 언급할 수 있다. 포스포리파제 이차 신호로부터 수용체를 활성화하거나 수용체의 활성화를 억제하는 작용을 검출할 수 있다.In another method of selecting a compound by expressing a G-protein PAF receptor, the receptor is linked to phospholipase C or D. Such cells may include endothelial cells, smooth muscle cells, embryonic kidney cells, and the like. The action of activating or inhibiting the activation of the receptor can be detected from the phospholipase secondary signal.
다른 방법에서, 표면에 수용체를 가지는 세포에 마커된 리간드가 결합하는 것을 억제함으로써 본 발명에 따른 길항제의 수용체 폴리펩티드의 활성화를 억제하는 화합물을 선별함을 포함한다. 이 방법은 G-단백질 PAF 수용체를 암호화하는 DNA로 진핵 세포를 형질전환하여 세포가 그 표면상의 수용체를 발현하도록 하고, 표지된 리간드의 존재하에 세포를 상기 화합물과 접촉시킴을 포함한다. 리간드는 방사성 등에 의해 표지화할 수 있다. 수용체의 방사성을 측정하여 수용체에 결합하는 표지된 리간드의 양을 측정한다. 수용체에 결합되는 표지된 리간드의 감소에 의해 측정된 바와 같인 상기 화합물이 수용체에 결합될 경우, 수용체에의 표지된 리간드의 결합은 억제된다.In another method, the method comprises selecting a compound that inhibits the activation of a receptor polypeptide of an antagonist according to the present invention by inhibiting binding of a labeled ligand to a cell having a receptor on its surface. The method involves transforming eukaryotic cells with DNA encoding the G-protein PAF receptor to allow the cell to express a receptor on its surface and contacting the cell with the compound in the presence of a labeled ligand. The ligand can be labeled by radioactivity or the like. The radioactivity of the receptor is measured to determine the amount of labeled ligand that binds to the receptor. When the compound as measured by the reduction of the labeled ligand bound to the receptor is bound to the receptor, the binding of the labeled ligand to the receptor is inhibited.
G-단백질 PAF 수용체는 포유 동물 숙주에 편재되어 있고, 병리학적 증상을 포함하는 많은 생리학적 기능을 담당할 수 있다. 따라서, 한편으로는 G-단백질 PAF 수용체를 자극하고, 다른 한편으로는 G-단백질 PAF 수용체의 기능을 억제하는 화합물과 약물을 발견하는 것이 바람직하다.G-protein PAF receptors are ubiquitous in mammalian hosts and can be responsible for many physiological functions, including pathological symptoms. Thus, it is desirable to find compounds and drugs that stimulate the G-protein PAF receptor on the one hand and inhibit the function of the G-protein PAF receptor on the other.
예를 들면, G-단백질 PAF 수용체를 활성화하는 화합물은 천식, 파킨슨병, 급성 심장마비, 저혈압, 뇨분비폐지, 및 골다공증의 치료와 같은 치료의 목적에 사용할 수 있다.For example, compounds that activate the G-protein PAF receptor can be used for therapeutic purposes such as the treatment of asthma, Parkinson's disease, acute heart failure, hypotension, urinary obstruction, and osteoporosis.
일반적으로, G-단백질 PAF 수용체의 활성화를 억제하는 화합물은 저혈압, 협심증, 심근경색, 궤양, 천식, 알레르기, 양성 전립선 비대증, 그리고 정신분열, 광기, 우울증, 섬막증, 치매나 심한 정신 지체, 헌팅턴병이나 길레스 딜라 토우렛(Gilles dila Tourett) 증후군과 같은 디스키네시아스를 포함하는 정신 및 신경 질환을 치료하는 데에 사용할 수 있다. G-단백질 PAF 수용체를 억제하는 화합물은 또한 내성 식욕 감퇴를 역전시키고 불리미아 제어에 유용하다.In general, compounds that inhibit the activation of the G-protein PAF receptor include hypotension, angina, myocardial infarction, ulcers, asthma, allergies, benign prostatic hyperplasia, and schizophrenia, madness, depression, sclerosis, dementia or severe mental retardation, and Huntington's disease. It can be used to treat mental and neurological diseases, including dyskinesias, such as Gilles dila Tourett syndrome. Compounds that inhibit the G-protein PAF receptor are also useful for reversing resistant appetite loss and controlling bullia.
항체는 본 발명에 따른 G-단백질 PAF 수용체에 대하여 길항작용을 할 수 있거나, G-단백질 PAF 수용체에 결합하지만 이차 메신저 반응을 유도하지 않는 올리고펩티드에 대하여 길항작용을 함으로써 G-단백질 PAF 수용체의 활성을 억제한다. 이러한 항체에는 항체의 항원 결합 자리와 결합하고 있는 특정한 결정인자를 인식하는 항유전자형 항체가 포함된다. 잠재적 길항제 화합물은, 생리학적 기능을 잃고 G-단백질 PAF 수용체와 결합되었을 때 반응을 유도하지 않는 리간드의 단편과 같이 G-단백질 PAF 수용체의 리간드와 밀접한 관련이 있는 단백질을 포함한다.The antibody can antagonize the G-protein PAF receptor according to the present invention, or it can antagonize an oligopeptide that binds to the G-protein PAF receptor but does not induce a secondary messenger response, thereby activating the G-protein PAF receptor. Suppress Such antibodies include antigenic antibodies that recognize specific determinants that bind to the antigen binding site of the antibody. Potential antagonist compounds include proteins that are closely related to ligands of the G-protein PAF receptor, such as fragments of ligands that lose physiological function and do not induce a response when bound to the G-protein PAF receptor.
안티센스 기술에 의해 제조된 안티센스 작제물은 폴리뉴클레오티드가 DNA나 RNA에 결합되는 것을 기초로 안티센스 DNA 또는 RNA의 삼중 나선을 형성하여 유전자 발현을 제어하는데 사용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 성숙한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 암호 부분을 길이가 약 10 내지 40개의 염기쌍으로 된 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 설계하는데 사용한다. DNA 올리고뉴클레오티드는 전사와 관련된 유전자 영역과 상보적으로 설계된다[삼중 나선- 참조: Lee et al., Nucl. Acids Res., 6:3073 (1979); Cooney et al, Science, 241:456 (1988); Dervan et al., Science, 251: 1360 (1991)]. 이로 인해 G-단백질 PAF 수용체의 전사와 제조가 억제된다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드는 mRNA로 하이브리드화되고, mRNA 분자가 G-단백질 PAF 수용체로 해독되는 것을 차단한다 [안티센스 - Okano, J. Neurochem., 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988)]. 상기에 설명한 올리고뉴클레오티드가 세포에 전이되면 안티센스 RNA 또는 DNA가 발현되어 G-단백질 PAF 수용체의 생산을 억제할 수 있다.Antisense constructs prepared by antisense technology can be used to control gene expression by forming triple helices of antisense DNA or RNA based on the polynucleotide binding to DNA or RNA. For example, the 5 'coding portion of a polynucleotide sequence encoding a mature polypeptide of the invention is used to design antisense RNA oligonucleotides of about 10 to 40 base pairs in length. DNA oligonucleotides are designed complementary to gene regions involved in transcription [triple helix— see Lee et al., Nucl. Acids Res., 6: 3073 (1979); Cooney et al, Science, 241: 456 (1988); Dervan et al., Science, 251: 1360 (1991). This inhibits the transcription and production of G-protein PAF receptors. Antisense RNA oligonucleotides hybridize to mRNA and block the mRNA molecule from being translated into the G-protein PAF receptor [antisense-Okano, J. Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988)]. When the oligonucleotides described above are transferred to cells, antisense RNA or DNA may be expressed to inhibit the production of the G-protein PAF receptor.
G-단백질 PAF 수용체와 결합하여 리간드로 접근을 차단함으로써 정상적인 생리학적 활동을 막는 작은 펩티드나 펩티드계 분자와 같은 소형 분자는 본 발명에 따른 수용체 폴리펩티드의 활성화를 억제하는데 사용할 수 있다.Small molecules, such as small peptides or peptide-based molecules that bind to the G-protein PAF receptor and block its access to the ligand to block normal physiological activity can be used to inhibit activation of the receptor polypeptide according to the invention.
G-단백질 PAF 수용체의 단편과 같은 G-단백질 PAF 수용체의 가용 형태는 본 발명의 폴리펩티드의 리간드와 결합하여 리간드가 막결합 G-단백질 PAF 수용체와 상호작용하는 것을 억제함으로써 수용체의 활성화를 억제하는데 사용할 수 있다.Soluble forms of G-protein PAF receptors, such as fragments of G-protein PAF receptors, can be used to inhibit activation of the receptor by binding to the ligand of the polypeptide of the invention and inhibiting the ligand from interacting with the membrane-bound G-protein PAF receptor. Can be.
또한, 본 발명은 G-단백질 PAF 수용체를 발현시키는 포유 동물 세포를 리간드가 G-단백질 PAF 수용체와 결합할 수 있도록 하는 조건에서 리간드와 반응시키는 단계, 및 G-단백질 PAF 수용체와 결합하고 있는 리간드의 존재를 검출하여 리간드가 G-단백질 PAF 수용체와 결합하고 있는지를 결정하는 단계를 포함하여, G-단백질 PAF 수용체와 결합할 수 없는 것으로 알려진 리간드가 수용체에 결합할 수 있는지의 여부를 결정하는 방법을 제공한다. 작용제 및/또는 길항제를 측정하는 상기 시스템을 사용하여 수용체에 결합하는 리간드를 측정할 수도 있다.The present invention also provides a method of reacting a mammalian cell expressing a G-protein PAF receptor with a ligand under conditions that allow the ligand to bind a G-protein PAF receptor, and A method of determining whether a ligand known to be unable to bind a G-protein PAF receptor can bind to the receptor, including detecting presence and determining whether the ligand is binding to a G-protein PAF receptor. to provide. The system for measuring agonists and / or antagonists can also be used to determine ligands that bind to receptors.
또한, 본 발명은 전체 mRNA를 세포로부터 수득하고 이렇게 수득된 mRNA를 하이브리드화 조건하에 수용체를 암호화하는 핵산 분자의 서열 내에 포함되는 서열로 특이적으로 하이브리드화시킬 수 있는 10개 이상의 뉴클레오티드의 핵산 분자를 포함하는 핵산 프로브와 접촉시키고, 프로브로 하이드리드화된 mRNA의 존재를 탐지하여, 세포에 의한 수용체의 발현을 탐지함으로써 본 발명의 G-단백질 PAF 수용체 폴리펩티드의 세포의 표면에서의 발현을 탐지하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a nucleic acid molecule of 10 or more nucleotides capable of obtaining total mRNA from a cell and specifically hybridizing the obtained mRNA to a sequence contained within a sequence of a nucleic acid molecule encoding a receptor under hybridization conditions. A method of detecting expression on the surface of a cell of a G-protein PAF receptor polypeptide of the invention by contacting with a containing nucleic acid probe and detecting the presence of a hybridized mRNA with the probe to detect expression of the receptor by the cell. To provide.
또한, 본 발명은 본 발명의 수용체 폴리펩티드에 관련된 수용체를 동정하는 방법을 제공한다. 본 발명의 G-단백질 PAF 수용체 폴리펩티드에 대한 상사, 저 엄격 교차 하이브리드화, 또는 관련된 천연 또는 합성 리간드와 상호작용하고 본 발명의 G-단백질 PAF 수용체 폴리펩티드의 유전 또는 약리학적 봉쇄 후에 유사한 행위를 유도하는 수용체를 동정함으로써 이들 관련 수용체를 동정할 수 있다.The present invention also provides a method for identifying a receptor associated with a receptor polypeptide of the invention. Interacting with similar, low stringency cross hybridization, or related natural or synthetic ligands to the G-protein PAF receptor polypeptides of the invention and inducing similar behavior after genetic or pharmacological blockade of the G-protein PAF receptor polypeptides of the invention By identifying receptors, these related receptors can be identified.
상기에 설명한 선별 방법으로 확인된 작용제는 혈소판 응고를 유도하고 상처 치유를 자극하므로 혈우병을 치료하는데 사용할 수 있다.The agents identified by the screening methods described above can be used to treat hemophilia because they induce platelet coagulation and stimulate wound healing.
G-단백질 PAF 수용체에 대한 길항제 화합물은 혈관성형, 불안정 안기나, 폐혈증 또는 폐혈증성 식전증 발작, 알레르기, 염증, 심근 경색 후의 재발협착증을 예방 및/또는 치료하는데 사용할 수 있다.Antagonist compounds for the G-protein PAF receptor can be used to prevent and / or treat angioplasty, unstable eyes, or stenosis or pulmonary antenatal seizures, allergies, inflammation, and restenosis after myocardial infarction.
길항제는 이후 설명되는 약제학적으로 허용되는 담체를 갖는 조성물과 함께, 즉 이후 기술된 바와 같이 사용할 수 있다.An antagonist may be used in combination with a composition having a pharmaceutically acceptable carrier described later, ie as described later.
길항제 또는 길항제 화합물은 적합한 약제학적 담체와 함께 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 조성물은 치료학적 유효량의 폴리펩티드, 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함한다. 이러한 담체는 염수, 완충 염수, 덱스트로스, 물, 클리세롤, 에탄올 및 이의 배합물을 포함한다. 상기 제헝은 투여 방식에 적합해야 한다.Antagonists or antagonist compounds can be used in combination with suitable pharmaceutical carriers. Such compositions comprise a therapeutically effective amount of a polypeptide and a pharmaceutically acceptable carrier or excipient. Such carriers include saline, buffered saline, dextrose, water, cglycerol, ethanol and combinations thereof. The gelling should be suitable for the mode of administration.
또한, 본 발명은 본 발명의 약제학적 조성물의 하나 이상의 성분으로 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 약제학적 팩 또는 키트를 제공한다. 상기 용기와 관련된 사항은 약제 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태의 통지일 수 있고, 이 통지는 사람 투여에 대한 제조, 사용 또는 판매의 기관에 의한 승인을 반영한다. 또한, 본 발명의 약제학적 조성물을 다른 약제학적 화합물과 함께 사용할 수 있다.The invention also provides a pharmaceutical pack or kit comprising one or more containers filled with one or more components of the pharmaceutical composition of the invention. The matter relating to the container may be a notice in the form prescribed by a governmental authority that regulates the manufacture, use or sale of a medicament or biological product, which is approved by the agency of manufacture, use or sale for human administration. Reflect. In addition, the pharmaceutical compositions of the present invention can be used with other pharmaceutical compounds.
상기 약제학적 조성물을 통상적인 방법으로, 예를 들어 국부, 정맥내, 복막내, 근육내, 피하, 비강내 또는 피내 경로에 의해 투여할 수 있다. 약제학적 조성물을 특이적인 증상의 치료 및/또는 예방에 효과적인 양으로 투여한다. 일반적으로, 약제학적 조성물은 약 10μg/kg 체중 이상의 양으로 투여하고 대부분의 경우에 매일 약 8mg/kg 체중을 초과하지 않는 양으로 투여해야 한다. 대부분의 경우에, 복용량은 투여 경로, 증상 등을 고려하여, 매일 약 10μg/kg 체중 내지 약 1mg/kg 체중이다.The pharmaceutical composition can be administered by conventional methods, for example by the topical, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, subcutaneous, intranasal or intradermal route. The pharmaceutical composition is administered in an amount effective to treat and / or prevent specific symptoms. In general, pharmaceutical compositions should be administered in an amount of at least about 10 μg / kg body weight and in most cases in an amount of no greater than about 8 mg / kg body weight per day. In most cases, the dosage is about 10 μg / kg body weight to about 1 mg / kg body weight daily, taking into account the route of administration, symptoms, and the like.
G-단백질 PAF 수용체 폴리펩티드 및 폴리펩티드인 길항제 또는 작용제인 폴리펩티드를 발현에 의해 본 발명에 따라 사용할 수 있는데, 이를 유전자 치료라고 한다.G-protein PAF receptor polypeptides and polypeptides that are antagonists or polypeptides that are polypeptides can be used in accordance with the invention by expression, which is called gene therapy.
따라서, 예를 들어 환자의 세포를 생체 외에서 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(DNA 또는 RNA)로 유전공학적으로 조작한 다음, 조작된 세포를 폴리펩티드로 치료할 수 있는 환자에게 제공할 수 있다. 상기 방법은 당해 기술에 익히 공지되어 있다. 예를 들어, 세포를 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 RNA를 함유하는 레트로비루스성 입자를 사용하는 당해 분야에 공지된 방법에 의해 유전공학적으로 조작할 수 있다.Thus, for example, a patient's cells may be genetically engineered with a polynucleotide (DNA or RNA) that encodes the polypeptide in vitro and then provided to the patient who is able to treat the engineered cells with the polypeptide. Such methods are well known in the art. For example, cells can be genetically engineered by methods known in the art using retroviral particles containing RNA encoding the polypeptides of the invention.
유사하게, 예를 들어 당해 기술에서 공지된 방법에 의해 폴리펩티드를 생체 내에서 발현시키기 위해 생체 내에서 조작할 수 있다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 RNA를 함유하는 레트로비루스성 입자를 제조하기 위한 생산자 세포를 생체 내에서 세포를 조작하고 생체 내에서 폴리펩티드를 발현시키기 위해 환자에게 투여할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 상기 방법에 의해 투여하기 위한 모든 방법은 본 발명의 교시로부터 당해 기술의 숙련가에게 명백하여야 한다. 예를 들어, 세포를 조작하기 위한 발현 비히클은 레트로비루스와는 다를 수 있는데, 예를 들어 아데노비루스를 사용하여 적합한 전달 비히클과 결합시킨 후에 생체 내에서 세포를 조작할 수 있다.Similarly, it can be manipulated in vivo to express the polypeptide in vivo by, for example, methods known in the art. As is known in the art, producer cells for preparing retroviral particles containing RNA encoding a polypeptide of the invention can be administered to a patient to manipulate the cells in vivo and to express the polypeptide in vivo. have. All methods for administering a polypeptide of the present invention by this method should be apparent to those skilled in the art from the teachings of the present invention. For example, the expression vehicle for manipulating the cells may differ from retroviruses, for example, using adenoviruses to manipulate the cells in vivo after binding to a suitable delivery vehicle.
상기 언급된 레트로비루스성 플라스미드 벡터가 유래될 수 있는 레트로비루스스로는 몰로니 쥐과의 백혈병 비루스, 비장 괴사 비루스, 로우스 육종 비루스와 같은 레트로바이러스, 하비 육종 비루스, 조류 백혈증 비루스, 깁본 아페(gibbon ape) 백혈병 비루스, 사람 면역결핍증 비루스, 아데노비루스, 골수증식성 육종 비루스 및 포유류 종양 비루스를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 한 양태에 있어서, 레트로바이러스성 플라스미드 벡터는 몰로니 쥐과의 백혈병 비루스로부터 유래된다.Retroviruses from which the above-mentioned retroviral plasmid vectors may be derived include retroviruses such as leukemia virus, splenic necrosis virus, Loose sarcoma virus, Molecular sarcoma virus, avian leukemia virus, and Gibbon ape ape) leukemia viruses, human immunodeficiency viruses, adenoviruses, myeloproliferative sarcoma viruses, and mammalian tumor viruses. In one embodiment, the retroviral plasmid vector is derived from the leukemia virus of Moroni murine.
이러한 벡터는 하나 이상의 프로모터를 포함한다. 사용될 수 있는 적합한 프로모터로는 레트로비루스성 LTR; SV40 프로모터; 및 문헌[참조: Miller, et al., Biotechniques, Vol. 7, No. 9, 980-990(1989)]에 기재된 사람 사이토메갈로비루스(CMV) 프로모터, 또는 기타 프로모터(예를 들면, 히스톤, pol Ⅲ 및 β-액틴 프로모터를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는 진핵성 세포내 프로모터와 같은 세포내 프로모터)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 사용될 수 있는 기타 비루스성 프로모터로는 아데노비루스 프로모터, 티미딘 키나제(TK) 프로모터, 및 B19 파르보비루스 프로모터를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 적합한 프로모터의 선택은 본 명세서의 교시로부터 당해 분야의 숙련인에게 명백할 것이다.Such vectors include one or more promoters. Suitable promoters that can be used include retroviral LTRs; SV40 promoter; And Miller, et al., Biotechniques, Vol. 7, No. 9,980-990 (1989), eukaryotic cells, including but not limited to human cytomegalovirus (CMV) promoters, or other promoters (eg, histone, pol III, and β-actin promoters). Intracellular promoters such as promoters), but is not limited to such. Other nonviral promoters that can be used include, but are not limited to, adenovirus promoter, thymidine kinase (TK) promoter, and B19 parvovirus promoter. Selection of suitable promoters will be apparent to those skilled in the art from the teachings herein.
본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 적합한 프로모터의 조절하에 있다. 사용될 수 있는 적합한 프로모터로는 아데노비루스성 주 레이트 프로모터와 같은 아데노비루스성 프로모터; 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터와 같은 이종 프로모터; 호흡기 합포체성 바이러스(RSV) 프로모터; MMT 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터와 같은 유도성 프로모터; 열 쇼크 프로모터; 알부민 프로모터; ApoAI 프로모터; 사람 글로빈 프로모터; 헤르페스 심플렉스 티미딘 키나제 프로모터와 같은 바이러스성 티미딘 키나제 프로모터; 레트로바이러스성 LTR(상기 언급된 바와 같은 변형된 레트로바이러스성 LTR을 포함함); β-액틴 프로모터; 및 사람 성장 호르몬 프로모터를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 프로모터는 또한 당해 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 조절하는 본래의 프로모터일 수도 있다.Nucleic acid sequences encoding polypeptides of the invention are under the control of suitable promoters. Suitable promoters that can be used include adenovirus promoters such as adenovirus main rate promoters; Heterologous promoters such as cytomegalovirus (CMV) promoters; Respiratory syncytial virus (RSV) promoter; Inducible promoters such as MMT promoter, metallothionein promoter; Heat shock promoters; Albumin promoter; ApoAI promoter; Human globin promoter; Viral thymidine kinase promoters such as the herpes simplex thymidine kinase promoter; Retroviral LTRs (including modified retroviral LTRs as mentioned above); β-actin promoter; And human growth hormone promoters. Such promoters may also be native promoters that regulate the genes encoding the polypeptide.
레트로비루스성 플라스미드 벡터를 사용하여 패키징 세포주를 형질도입하여 생산자 세포주를 형성할 수 있다. 형질감염될 수 있는 패키징 세포의 예로는 본원에 참조로 삽입된 문헌[참조: Miller, Human Gene Therapy, Vol. 1, p. 5-14(1990)]에 기술된 바와 같은 PE501, PA317, ψ-2, ψ-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, ψCRE, ψCRIP, GP+E-86, GP+envAm12, 및 DNA 세포주를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 벡터는 당해 분야에 공지된 어떠한 수단을 통해서 패키징 유전자를 형질도입할 수 있다. 이러한 수단은 전기 천공, 리포좀의 사용 및 CaPO4침전을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 하나의 또 다른 양태에서는, 레트로비루스성 플라스미드 벡터를 리포좀 또는 PAF 내로 봉입하거나 지질에 커플링시킨 다음 숙주에 투여할 수 있다.Retroviral plasmid vectors can be used to transduce packaging cell lines to form producer cell lines. Examples of packaging cells that can be transfected include Miller, Human Gene Therapy, Vol. 1, p. 5-14 (1990)] PE501, PA317, ψ-2, ψ-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, ψCRE, ψCRIP, GP + E-86, GP + envAm12, and DNA cell lines, including but not limited to. Such vectors can transduce packaging genes by any means known in the art. Such means include, but are not limited to, electroporation, use of liposomes, and CaPO 4 precipitation. In another embodiment, the retroviral plasmid vector can be embedded into liposomes or PAFs or coupled to lipids and then administered to a host.
생산자 세포주는 당해 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열(들)을 포함하는 감염성 레트로비루스성 벡터 입자를 생성시킨다. 이러한 레트로비루스성 벡터 입자를 사용하여 시험관내 또는 생체내에서 진핵성 세포를 형질도입할 수 있다. 이와 같이 형질도입된 진핵 세포는 당해 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열(들)을 발현할 것이다. 형질도입될 수 있는 진핵 세포로는 배아 간 세포, 배아 암종 세포, 및 조혈성 간 세포, 혈구, 섬유아세포, 근원세포, 각질세포, 내피 세포 및 기관지 상피 세포를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.Producer cell lines produce infectious retroviral vector particles comprising nucleic acid sequence (s) encoding the polypeptide. Such retroviral vector particles can be used to transduce eukaryotic cells in vitro or in vivo. Such transduced eukaryotic cells will express nucleic acid sequence (s) encoding the polypeptide. Eukaryotic cells that can be transduced include, but are not limited to, embryonic liver cells, embryonic carcinoma cells, and hematopoietic stem cells, blood cells, fibroblasts, myoblasts, keratinocytes, endothelial cells, and bronchial epithelial cells.
본 발명은, 예를 들어 본래 결함성 유전자로부터 발생하는 특정 질환에 대한 진단약으로서 본 발명의 유전자의 사용을 의도한다. 이들 유전자는 결함성 유전자의 서열과 정상 유전자의 서열을 비교함으로써 탐지할 수 있다. 결과적으로, 돌연변이 유전자는 비정상적인 수용체 활성과 관계된다는 것을 입증할 수 있다. 또한, 돌연변이 유전자를 돌연변이를 입증하거나 확인하고자 할 경우 기능성 분석 시스템 내(예를 들어, HEK293 세포의 수용체 결함성 균주에서의 비색계 분석, MacConkey 플레이트에서의 발현, 상보성 실험)에서 발현에 적합한 벡터내로 삽입할 수 있다. 돌연변이 유전자를 동정할 경우, 돌연변이 수용체 유전자의 담체에 대한 집단을 스크리닝할 수 있다.The present invention intends the use of the gene of the present invention as a diagnostic for, for example, a specific disease resulting from a defective gene originally. These genes can be detected by comparing the sequences of defective genes with those of normal genes. As a result, it may be demonstrated that mutant genes are associated with abnormal receptor activity. In addition, mutant genes can be inserted into a vector suitable for expression in a functional assay system (e.g., colorimetric analysis in receptor defective strains of HEK293 cells, expression in MacConkey plates, complementarity experiments) if a mutation gene is to be demonstrated or confirmed. can do. When mutant genes are identified, populations of carriers for mutant receptor genes can be screened.
본 발명의 유전자내에서 돌연변이를 소유하는 개체는 각종 기술에 의해 DNA 농도로 탐지할 수 있다. 진단용 핵산을, 예를 들어 혈액, 소변, 타액, 조직 생체검사 및 검시 물질을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 환자의 세포로부터 수득할 수 있다. 게놈 DNA를 탐지용으로 직접 사용할 수 있거나 분석에 선행하여 PCR[참조: Saiki et al., Nature, 324:163-166(1986)]을 사용하여 효소적으로 증폭시킬 수 있다. RNA 또는 cDNA도 동일한 목적을 위해 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 핵산에 상보적인 PCR 프라이머를 사용하여 본 발며의 유전자에서의 돌연변이를 동정하고 분석할 수 있다. 예를 들어, 결실 및 삽입은 정상 유전자형과 비교해 볼 때 증폭된 생성물의 크기에서의 변화에 의해 탐지될 수 있다. 점변이는 증폭된 DNA를 방사성표지된 본 발명의 RNA 또는 방사성표지된 본 발명의 안티센스 DNA 서열로 하이브리드화시킴으로써 동정할 수 있다. 바람직하게 매치된 서열을 RNase A 분해 또는 융점 온도의 차이에 의해 부적당하게 매치된 듀플렉스(duplex)와 판별할 수 있다. 상기 진단약은 태아 또는 신생아의 시험에 특히 유용하다.Individuals possessing mutations in the genes of the present invention can be detected at various DNA concentrations by various techniques. Diagnostic nucleic acids can be obtained from cells of a patient, including but not limited to, for example, blood, urine, saliva, tissue biopsies and autopsy materials. Genomic DNA can be used directly for detection or can be enzymatically amplified using PCR (Saiki et al., Nature, 324: 163-166 (1986)) prior to analysis. RNA or cDNA can also be used for the same purpose. For example, PCR primers complementary to the nucleic acids of the invention can be used to identify and analyze mutations in genes of the present invention. For example, deletions and insertions can be detected by changes in the size of the amplified product compared to normal genotypes. Point mutations can be identified by hybridizing amplified DNA to radiolabeled RNA of the invention or radiolabeled antisense DNA sequences of the invention. Preferably the matched sequence can be distinguished from an improperly matched duplex by RNase A digestion or difference in melting point temperature. The diagnostic agent is particularly useful for testing fetuses or newborns.
참조 유전자 및 돌연변이간의 서열 차이는 직접 DNA 서열화 방법에 의해 밝힐 수 있다. 또한, 클로닝된 DNA 단편을 프로브로서 사용하여 특이적 DNA 단편을 탐지할 수 있다. 이들 방법의 감도는 PCR과 함께 조합할 경우 매우 증강된다. 예를 들어, 서열 프라이머는 이본쇄 PCR 생성물 또는 개질된 PCR에 의해 생성되는 일본쇄 주형 분자와 함께 사용한다. 서열 결정은 방사성 표지된 뉴클레오티드를 사용하는 통상적인 방법 또는 형광성 태그를 사용하는 자동 서열화 방법에 의해 수행한다.Sequence differences between reference genes and mutations can be revealed by direct DNA sequencing methods. Cloned DNA fragments can also be used as probes to detect specific DNA fragments. The sensitivity of these methods is greatly enhanced when combined with PCR. For example, sequence primers are used with single-chain PCR products or single-chain template molecules produced by modified PCR. Sequencing is performed by conventional methods using radiolabeled nucleotides or by automatic sequencing methods using fluorescent tags.
DNA 서열 차이를 기준으로 한 유전적 시험은 변성제의 존재 또는 부재하에 겔에서 DNA 단편을 전기영동분리적으로 이동시켜 변이를 탐지함으로써 수행될 수 있다. 또한 특정 위치에서의 서열 변화는 RNase 및 S1 보호와 같은 뉴클레아제 보호 분석 또는 화학적 절단 방법(예: Cotton et al., PNAS, USA, 85:4397-4401(1985))에 의해 나타낼 수 있다.Genetic tests based on DNA sequence differences can be performed by detecting the mutation by electrophoretically shifting the DNA fragments in the gel in the presence or absence of denaturing agents. Sequence changes at specific positions can also be indicated by nuclease protection assays or chemical cleavage methods such as RNase and S1 protection (eg, Cotton et al., PNAS, USA, 85: 4397-4401 (1985)).
또한, 특정 질환은 mRNA에서의 변화에 의해 탐지할 수 있는 유전자 발현에서의 변화의 결과 또는 이의 변화를 특징으로 한다. 또한, 본 발명의 유전자를 참조로 사용하여 상기 유형의 수용체와 관련된 기능의 감소를 발현시키는 개체를 동정할 수 있다.In addition, certain diseases are characterized by the results of or changes in gene expression that can be detected by changes in mRNA. In addition, the genes of the present invention can be used as a reference to identify individuals that express a decrease in function associated with this type of receptor.
또한, 본 발명은 다양한 조직 내의 본 발명의 가용성 형태의 G-단백질 PAF 수용체 폴리펩티드의 변화된 수준을 탐지하기 위한 진단 분석에 관한 것이다. 숙주로부터 유도된 샘플 중의 가용성 수용체 폴리펩티드의 수준을 탐지하기 위해 사용된 분석은 당해 기슬의 숙련가에게 익히 공지되어 있고 방사능면역분석, 경쟁적 결합 분석, 웨스턴 블롯 분석 및 바람직하게는 ELISA 분석을 포함한다.The invention also relates to diagnostic assays for detecting altered levels of G-protein PAF receptor polypeptides of the soluble forms of the invention in various tissues. Assays used to detect the level of soluble receptor polypeptide in a sample derived from the host are well known to those skilled in the art and include radioimmunoassays, competitive binding assays, western blot assays and preferably ELISA assays.
ELISA 분석은 우선 G-단백질 PAF 수용체 폴리펩티드의 항원에 대한 특이적 항원에 대한 항체, 바람직하게는 모노클로날 항체를 제조함을 포함한다. 또한, 리포터 항체를 상기 모노클로날 항체에 대하여 제조한다. 이러한 리포터 항체에 방사능, 형광성, 또는 본 실시예에서는 양고추냉이 퍼옥시다제 효소와 같은 검출가능한 시약을 부착시킨다. 샘플을 숙주로부터 제거하고 이를 샘플 중의 단백질과 결합하는 고체 지지체, 예를 들어 폴리스티렌 디쉬 상에서 배양한다. 그 다음, 상기 디쉬 상의 유리 단백질 결합 부위를 소의 혈청 알부민과 같은 비특이적 단백질을 사용하여 배양함으로써 보호한다. 그 다음, 모노클로날 항체를, 이러한 모노클로날 항체가 폴리스티렌 디쉬에 부착된 본 발명의 폴리펩티드에 부착되는 시간 동안 상기 디쉬에서 배양한다. 결합되지 않은 모든 모노클로날 항체를 완충액으로 세척하여 제거한다. 양고추냉이 퍼옥시다제에 결합된 리포터 항체를 디쉬에 놓아 둠으로써 PAF 수용체 단백질에 결합된 모노클로날 항체에 리포터 항체를 결합시킨다. 이어서, 부착되지 않은 리포터 항체를 세척하여 제거한다. 그 다음, 퍼옥시다제 기질을 디쉬에 가하여 소정의 시간 내에 발색된 양은 표준 곡선에 대하여 비교해 볼때, 소정의 환자 샘플 용적 내에 존재하는 본 발명의 PAF 수용체 단백질의 양을 측정한 값이다.The ELISA assay involves first preparing an antibody against a specific antigen, preferably a monoclonal antibody, against an antigen of a G-protein PAF receptor polypeptide. Reporter antibodies are also prepared against these monoclonal antibodies. To such reporter antibodies are attached radioactive, fluorescent, or detectable reagents such as horseradish peroxidase enzymes in this example. The sample is removed from the host and cultured on a solid support, such as a polystyrene dish, that binds to the protein in the sample. The free protein binding site on the dish is then protected by culturing with a nonspecific protein such as bovine serum albumin. The monoclonal antibody is then incubated in the dish for the time that the monoclonal antibody is attached to the polypeptide of the invention attached to the polystyrene dish. All unbound monoclonal antibodies are removed by washing with buffer. By placing the reporter antibody bound to horseradish peroxidase in a dish, the reporter antibody is bound to the monoclonal antibody bound to the PAF receptor protein. The unattached reporter antibody is then washed away. The amount developed within a given time by adding the peroxidase substrate to the dish is then a measure of the amount of the PAF receptor protein of the present invention present in the given patient sample volume when compared to a standard curve.
본 발명의 서열은 염색체 동정에도 유용하다. 상기 서열은 특이적으로 표적되고 개체의 사람 염색체 상의 특정 위치에 하이브리화할 수 있다. 또한, 염색체 상의 특정 부위를 동정해야 할 통상적인 필요가 있다. 염색체 위치를 마킹하기 위한 실제 서열 데이터(반복 다형성)를 기준으로 하는 염색체 마킹 시약을 현재 거의 이용할 수 없다. 본 발명에 따라 DNA의 염색체로의 지도화는 이들 서열을 질환과 관련된 유전자와 상호관련시키는데 있어서 중요한 제1 단계이다.The sequences of the invention are also useful for chromosome identification. The sequence is specifically targeted and can hybridize to a specific location on the human chromosome of the individual. There is also a common need to identify specific sites on chromosomes. Chromosomal marking reagents based on actual sequence data (repeat polymorphism) for marking chromosomal positions are currently rarely available. The mapping of DNA to chromosomes according to the invention is an important first step in correlating these sequences with genes associated with the disease.
간단히, 서열을 PCR 프라이머(바람직하게는 15 내지 25bp)를 cDNA로부터 제조함으로써 염색체로 지도화할 수 있다. 서열의 3' 미해독 영역의 컴퓨터 분석을 사용하여 게놈 DNA 내에 하나 이상의 엑손을 걸치지 않는 프라이머를 신속하게 선택하여, 증폭 방법을 혼화시킨다. 다음 상기 프라이머를 개체의 사람 염색체를 함유하는 체강 세포 하이브리드의 PCR 스크리닝에 사용한다. 상기 프라이머에 상응하는 사람 유전자를 함유하는 하이브리드만이 증폭된 단편을 수득할 수 있다.Briefly, sequences can be mapped to chromosomes by preparing PCR primers (preferably 15-25 bp) from cDNA. Computer analysis of the 3 'untranslated region of the sequence is used to quickly select one or more exons in the genomic DNA to hybridize the amplification method. The primers are then used for PCR screening of celiac cell hybrids containing human chromosomes of the individual. Only hybrids containing human genes corresponding to the primers can obtain amplified fragments.
체강 세포의 PCR 지도화는 특정 DNA를 특정 염색체로 분배하기 위한 신속한 방법이다. 본 발명에 있어서의 동일한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하고, 국소위치화를 특이적 염색체 또는 대형 게놈 클론의 풀로부터의 단편의 패널을 사용하여 유사한 방법으로 성취할 수 있다. 이의 염색체로 지도화하는데 유사하게 사용될 수 있는 다른 지도화 방법은 염색체 특이성-cDNA 라이브러리를 구성하기 위한 동일계 내의 하이브리드화, 표지된 플로우(flow)-분류 염색체를 사용한 예비스크리닝 및 하이브리드화에 의한 예비선택을 포함한다.PCR mapping of celiac cells is a rapid way to distribute specific DNA to specific chromosomes. Using the same oligonucleotide primers in the present invention, localization can be accomplished in a similar manner using panels of fragments from pools of specific chromosomes or large genomic clones. Other mapping methods that can be similarly used to map to their chromosomes include hybridization in situ to construct chromosome specificity-cDNA libraries, prescreening using labeled flow-classified chromosomes and preselection by hybridization. It includes.
cDNA 클론을 중기 염색체 확산배양물과 동일계 내에서 형광성 하이브리드화(FISH)시켜 1단계로 정확한 염색체의 위치를 제공할 수 있다. 이러한 기술은 50 또는 60개의 염기 정도로 짧은 cDNA를 사용할 수 있다. 상기 기술의 재고를 위해, 문헌[참조: Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York(1988)]을 참조할 수 있다.The cDNA clones can be fluorescently hybridized (FISH) in situ with the mid-term chromosomal diffusion culture to provide the correct chromosome location in one step. This technique can use cDNAs as short as 50 or 60 bases. For a review of these techniques, reference may be made to Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988).
서열이 정확한 염색체 위치로 지도화되면, 염색체 상의 서열의 물리적 위치를 유전자 지도 데이터와 상호관련시킨다. 상기 데이터는, 예를 들어 문헌[참조: V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man(구입원: Johns Hopkins University Welch Medical Library를 통해 온 라인으로)]에서 구한다. 다음 유전자 및 동일한 염색체 영역에 지도화된 질환의 관계를 결합 분석(물리적으로 인접한 공동유전형질)을 통해 동정한다.Once the sequence is mapped to the correct chromosomal location, the physical location of the sequence on the chromosome is correlated with the genetic map data. Such data are obtained, for example, from V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (available online from Johns Hopkins University Welch Medical Library). The relationship between the next gene and disease mapped to the same chromosomal region is identified through binding analysis (physically contiguous cogenetics).
다음, 감염자 및 비감염자간의 cDNA 또는 게놈 서열에서 차이를 측정하는 것이 필요하다. 변이가 몇 사람 또는 모든 감염자에서 관찰되나 정상상태의 개체에서는 관찰되지 않을 경우, 변이는 아마도 질환의 작인제일 것이다.Next, it is necessary to measure the difference in cDNA or genomic sequence between infected and uninfected. If the mutation is observed in some or all infected individuals but not in normal individuals, the mutation is probably the agent of disease.
통상적인 물리적 지도화의 분해 및 유전학적 지도화 기술로, 질환과 관련된 염색체 영역으로 정확하게 위치화된 cDNA는 50 내지 500개의 잠재적인 작인 유전자 중 하나일 수 있다(이는 1 메가베이스 지도화 분해능 및 20kb당 하나의 유전자를 취한다).With conventional physical mapping decomposition and genetic mapping techniques, a cDNA precisely located in the chromosomal region associated with a disease may be one of 50 to 500 potential small genes (which is 1 megabase mapping resolution and 20 kb). Take one gene per year).
폴리펩티드, 이의 단편 또는 이외의 유도체, 또는 이의 유사체, 또는 이를 발현시키는 세포를 면역원으로서 사용하여 이에 대한 항체를 제조할 수 있다. 이 항체는, 예를 들어 폴리클로날 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 또한, 본 발명은 키메라성, 일본쇄, 및 사람적응화 항체, 및 Fab 단편, 또는 Fab 발현 라이브러리의 생성물을 포함한다. 당해 기술에 공지된 다양한 방법을 상기 항체 및 단편을 제조하는데 사용할 수 있다.Antibodies can be prepared using polypeptides, fragments or other derivatives thereof, or analogs thereof, or cells expressing them as immunogens. This antibody can be, for example, a polyclonal or monoclonal antibody. The invention also encompasses the products of chimeric, single-chain, and humanized antibodies, and Fab fragments, or Fab expression libraries. Various methods known in the art can be used to prepare the antibodies and fragments.
본 발명의 서열에 상응하는 폴리펩티드에 대해 생성된 항체를 상기 폴리펩티드를 동물 내로 직접 주사하거나 상기 폴리펩티드를 동물, 바람직하게는 사람 이외에 투여함으로써 수득할 수 있다. 다음 상기와 같이 수득된 항체를 상기 폴리펩티드 자체에 결합한다. 상기 방법으로, 상기 폴리펩티드의 단편만을 암호화하는 서열이더라도 전체 천연 폴리펩티드에 결합하는 항체를 생성시키는데 사용할 수 있다. 다음, 상기 항체를 사용하여 상기 폴리펩티드를 발현시키는 조직으로부터 폴리펩티드를 분리시킬 수 있다.Antibodies generated against a polypeptide corresponding to a sequence of the invention can be obtained by injecting the polypeptide directly into an animal or by administering the polypeptide to an animal, preferably non-human. The antibody thus obtained is then bound to the polypeptide itself. In this manner, even sequences encoding only fragments of the polypeptide can be used to generate antibodies that bind the entire natural polypeptide. The antibody can then be used to isolate the polypeptide from tissue expressing the polypeptide.
모노클로날 항체의 제조를 위해, 연속적인 세포주 배양에 의해 제조된 항체를 제공하는 기술을 사용할 수 있다. 예로는 하이브리도마(hybridoma) 기술[참조: Kohler and Milstein, 1975, Nature, 256:495-497], 트리오마(trioma) 기술, 사람 B-세포 하이브리도마 기술[참조: Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72], 사람 단일클론 항체를 제조하기 위한 EBV-하이브리도마 기술[참조: Cole, et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Caner Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96]을 포함한다.For the preparation of monoclonal antibodies, techniques can be used to provide antibodies prepared by continuous cell line cultures. Examples include hybridoma technology (Kohler and Milstein, 1975, Nature, 256: 495-497), trioma technology, human B-cell hybridoma technology (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72], EBV-hybridoma technology for the production of human monoclonal antibodies [Cole, et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Caner Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96].
일본쇄 항체의 제조를 위해 기술된 기술[참조: U.S. Patent 4,946,778]을 적합화하여 본 발명의 면역원성 폴리펩티드에 대한 일본쇄 항체를 제조할 수 있다. 또한, 유전자전환된 마우스를 사용하여 본 발명의 면역원성 폴리펩티드 생성물에 대한 사람적응화 항체를 발현시킬 수 있다.Techniques described for the preparation of single chain antibodies [U.S. Pat. Patent 4,946,778 can be adapted to prepare single-chain antibodies against the immunogenic polypeptides of the present invention. In addition, transgenic mice can be used to express humanized antibodies against the immunogenic polypeptide products of the invention.
본 발명은 하기 실시예에 관련하여 기술할 것이나; 이는 본 발명이 이 실시예에 제한되지는 않는 것으로 해석된다. 다른 방법으로 명시하지 않는 한, 모든 부 또는 양은 질량 기준이다.The present invention will be described with reference to the following examples; This is construed that the present invention is not limited to this embodiment. Unless otherwise specified, all parts or quantities are by mass.
하기 실시예의 이해를 용이하게 하기 위해 종종 나타나는 방법 및/또는 용어를 기술한다.The methods and / or terms that appear often are described in order to facilitate understanding of the following examples.
플라스미드(plasmid)는 우선 소문자 p 및/또는 이어 대문자 및/또는 숫자로 표기된다. 본 발명의 개시 플라스미드는 상업적으로 구입, 제한되지 않은 조건으로 공개적으로 구입할 수 있거나, 구입할 수 있는 플라스미드를 공보된 방법에 따라 작제할 수 있다. 또한, 기술된 것과 동등한 플라스미드는 당해 기술에 공지되어 있고 통상적으로 숙련된 기술자에게 명백할 것이다.Plasmids are first denoted by lowercase p and / or uppercase and / or numeric characters. The disclosed plasmids of the present invention may be publicly purchased under commercially available, non-limiting conditions, or commercially available plasmids may be constructed according to the published methods. In addition, plasmids equivalent to those described are known in the art and will typically be apparent to those skilled in the art.
DNA의 분해(digestion)란 DNA의 특정 서열에서만 작용하는 제한 효소로 DNA를 촉매적으로 절단함을 의미한다. 본 발명에 사용된 여러 제한 효소는 시판용이고 이의 반응조건, 보조인자 및 다른 필요조건은 통상적으로 숙련된 기술자에게 공지된 바와 같이 사용된다. 분석상 목적을 위해, 전형적으로 플라스미드 또는 DNA 1㎍을 약 20㎕의 완충액 중의 효소 약 2 유니트와 함께 사용한다. 플라스미드 작제용 DNA 단편을 분리할 목적으로는, 전형적으로 DNA 5 내지 50μg을 보다 큰 용적으로 효소 20 내지 250 유니트를 사용하여 분해한다. 특정 제한 효소에 적합한 완충액 및 기질량은 제조자에 의해 명시된다. 37℃에서 약 1시간의 배양 시간이 통상적으로 사용되나, 공급자의 지시에 따라 변화될 수 있다. 분해 후에 반응을 폴리아크릴아미드 겔 상에서 직접 전기영동시켜 목적하는 단편을 분리시킨다.Digestion of DNA refers to catalytic cleavage of DNA with restriction enzymes that act only on specific sequences of DNA. Various restriction enzymes used in the present invention are commercially available and their reaction conditions, cofactors and other requirements are commonly used as known to the skilled artisan. For analytical purposes, typically 1 μg of plasmid or DNA is used with about 2 units of enzyme in about 20 μl of buffer. For the purpose of isolating DNA fragments for plasmid construction, typically 5-50 μg of DNA is digested in larger volumes using 20 to 250 units of enzyme. Suitable buffers and base masses for certain restriction enzymes are specified by the manufacturer. Incubation times of about 1 hour at 37 ° C. are conventionally used but may be varied as directed by the supplier. After digestion, the reaction is directly electrophoresed on a polyacrylamide gel to separate the desired fragments.
절단된 단편의 크기 분리를 문헌[참조: Goeddel, D. et al., Nucleic Acids Res., 8:4057(1980)]에 기술된 8% 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 수행한다.Size separation of the cleaved fragments is performed using an 8% polyacrylamide gel described in Goeddel, D. et al., Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980).
올리고뉴클레오티드란 일본쇄의 올리고뉴클레오티드 또는 화학적으로 합성할 수 있는 두 개의 상보적 폴리옥시뉴클레오티드 쇄를 의미한다. 상기 합성 올리고뉴클레오티드는 5' 포스페이트를 전혀 가지지 않으므로 키나제의 존재하에 ATP와 함께 포스페이트를 첨가하지 않을 경우 다른 올리고뉴클레오티드에 연결되지 않는다. 합성 올리고뉴클레오티드는 탈인산화되지 않은 단편에 연결되지 않는다.Oligonucleotides refer to oligonucleotides of a Japanese chain or two complementary polyoxynucleotide chains that can be synthesized chemically. The synthetic oligonucleotides do not have 5 'phosphate at all and therefore are not linked to other oligonucleotides unless phosphate is added with ATP in the presence of kinase. Synthetic oligonucleotides are not linked to fragments that are not dephosphorylated.
연결(ligation)이란 두 개의 이본쇄 핵산 단편간의 포스포디에스테르 결합을 형성하는 방법을 의미한다[참조: Maniatis, T, et al., Id., p. 146]. 다른 방법으로 제공하지 않는 한, 공지된 완충액 및 조건을 사용하여 거의 등몰량의 연결될 DNA 단편 0.5㎍당 T4 DNA 리가제(리가제) 10 유니트와 연결을 수행한다.Ligation refers to a method of forming phosphodiester bonds between two double-stranded nucleic acid fragments. See Maniatis, T, et al., Id., P. 146]. Linking with 10 units of T4 DNA ligase (ligase) per 0.5 μg of DNA fragment to be linked is carried out using known buffers and conditions, unless otherwise provided.
다른 방법으로 나타내지 않는 한, 형질변환을 문헌[참조: Graham, F. and Van der Eb, A., Virology, 52:456-457(1973)]에 기술된 방법과 같이 수행한다.Unless otherwise indicated, transformation is performed as described by Graham, F. and Van der Eb, A., Virology, 52: 456-457 (1973).
실시예 1Example 1
G-단백질 결합 수용체 HTNAD29 (PAF 수용체)의 세균성 발현 및 정제Bacterial Expression and Purification of G-protein Coupled Receptor HTNAD29 (PAF Receptor)
PAF 수용체를 암호화하는 DNA 서열, ATCC 제 호를 처리된 단백질의 서열(신호 펩티드 서열은 뺌) 5' 및 PAF 수용체 유전자에 대한 벡터 서열 3'에 상응하는 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 우선 증폭시킨다. PAF 수용체에 상응하는 부가적인 뉴클레오티드를 5' 및 3' 서열에 각각 가한다. 5' 올리고뉴클레오티드 프라이머는 EcoRI 제한 효소 부위에 이어 개시된 단백질 코돈의 추정된 종결 아미노산으로부터 개시되는 PAF 수용체 암호화 서열의 18개 뉴클레오티드를 함유하는 서열 5' CGAATTCCTCCATGAACAGCACATGTATT 3'을 갖는다. 3' 서열 5' CGGAAGCTTCGTCAAGGACCTCTAATTCC 3'은 HindIII 부위에 이어서, PAF 수용체를 암호화하는 18개의 뉴클레오티드에 상보적인 서열을 갖는다. 제한 효소 부위는 세균성 발현 벡터 pQE-9(공급원: Qiagen, Inc. Chatsworth, CA) 상의 제한 효소 부위에 상응한다. pQE-9는 항생제 내성(Ampr), 세균성 복제 기원(ori), IPTG-조절성 프로모터 작동인자(P/O), 리보솜 결합 부위(RBS), 6-His 태그 및 제한 효소 부위를 암호화한다. 그 다음, pQE-9를 EcoRI 및 HindⅢ을 사용하여 분해한다. 증폭된 서열을 pQE-9에 연결하고 히스티딘 태그 및 RBS를 암호화하는 서열을 사용하여 동일한 프레임 내에 삽입한다. 그 다음, 연결 혼합물을 사용하여 문헌[참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989)]에 기술된 방법에 의해 이. 콜라이 균주 M15/rep4(공급원: Qiagen, Inc.)를 형질전환시킨다. M15/rep 4는 lacⅠ 억제제를 발현시키고 또한 카나마이신 내성(Kanr)을 부여하는 플라스미드 pREP4의 다중 복사물을 함유한다. LB 플레이트 에서 성장하는 이의 능력에 의해 형질전환체를 동정하고 암피실린/카나마이신 내성 콜로니를 선별한다. 플라스미드 DNA를 분리시키고 제한 분석에 의해 확인한다. 목적하는 작제물을 함유하는 클론을 Amp(100ug/ml)와 Kan(25ug/ml) 모두가 보충된 LB 배지 중의 액체 배양물에서 밤새(O/N) 성장시킨다. O/N 배양물을 사용하여 1:100 내지 1:250의 비로 대형 배양물에 접종시킨다. 세포를 0.4 내지 0.6의 광학 밀도 600(O.D600)으로 성장시킨다. 그 다음, IPTG(이소프로필-B-D-티오갈락토 피라노사이드)를 가하여 최종 농도가 1mM이 되도록 한다. lacⅠ 억제인자를 불활성화시킴으로써 IPTG가 유도되는데, 이로써 P/O가 유전자 발현 증가를 유발시킨다는 것이 명백해졌다. 세포를 3 내지 4시간 더 성장시킨다. 그 다음, 세포를 원심분리시켜 수거한다. 세포 펠릿을 카오트로픽제 6몰 구아니딘 HCl 중에서 가용화시킨다. 정화 후, 가용화된 PAF 수용체를, 6-His 태그를 함유하는 단백질에 의해 단단히 결합시켜 주는 조건하에서 니켈-킬레이트 칼럼 상에서 크로마토그래피하여 상기 용액으로부터 정제한다[참조: Hochuli, E. et al., J. Chromatography 411:177-184(1984)]. PAF 수용체를 6몰 구아니딘 HCl(pH 5.0) 중에서 상기 칼럼으로부터 용출시키고 재생시키기 위해서는 3몰 구아니딘 HCl, 100mM 인산나트륨, 10mM 글루타티온(환원됨) 및 2mM 글루타티온(산화됨)으로 조정한다. 이 용액 중에서 12시간 동안 배양한 후, 상기 단백질을 10mM 인산나트륨으로 투석한다.Amplification of the DNA sequence encoding the PAF receptor, ATCC No., is first performed using PCR oligonucleotide primers corresponding to the 5 'sequence of the processed protein (signal peptide sequence iii) and the vector sequence 3' for the PAF receptor gene. Additional nucleotides corresponding to the PAF receptor are added to the 5 'and 3' sequences, respectively. The 5 'oligonucleotide primer has the sequence 5' CGAATTCCTCCATGAACAGCACATGTATT 3 'containing 18 nucleotides of the PAF receptor coding sequence starting from the estimated termination amino acid of the disclosed protein codon following the EcoRI restriction enzyme site. 3 ′ sequence 5 ′ CGGAAGCTTCGTCAAGGACCTCTAATTCC 3 ′ has a sequence complementary to the 18 nucleotides encoding the PAF receptor following the HindIII site. The restriction enzyme site corresponds to the restriction enzyme site on the bacterial expression vector pQE-9 (Qiagen, Inc. Chatsworth, CA). pQE-9 encodes antibiotic resistance (Amp r ), bacterial replication origin (ori), IPTG-regulated promoter effector (P / O), ribosomal binding site (RBS), 6-His tag and restriction enzyme site. PQE-9 is then digested using EcoRI and HindIII. The amplified sequences are linked to pQE-9 and inserted into the same frame using sequences encoding histidine tags and RBS. Then, using the linking mixture, this method was described by Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989). E. coli strain M15 / rep4 (Source: Qiagen, Inc.) is transformed. M15 / rep 4 contains multiple copies of plasmid pREP4, which expresses a lacI inhibitor and also confers kanamycin resistance (Kan r ). Transformants are identified by their ability to grow in LB plates and ampicillin / kanamycin resistant colonies are selected. Plasmid DNA is isolated and confirmed by restriction analysis. Clones containing the desired constructs are grown overnight (O / N) in liquid culture in LB medium supplemented with both Amp (100 ug / ml) and Kan (25 ug / ml). O / N cultures are used to inoculate large cultures at a ratio of 1: 100 to 1: 250. The cells are grown to an optical density of 600 (OD 600 ) of 0.4 to 0.6. IPTG (isopropyl-BD-thiogalacto pyranoside) is then added to bring the final concentration to 1 mM. IPTG is induced by inactivating the lacI inhibitors, making it clear that P / O causes increased gene expression. The cells are grown for another 3-4 hours. The cells are then harvested by centrifugation. Cell pellets are solubilized in 6 molar guanidine HCl from chaotropic agent. After clarification, the solubilized PAF receptor is purified from the solution by chromatography on a nickel-chelate column under conditions that are tightly bound by a protein containing a 6-His tag. Hochuli, E. et al., J. Chromatography 411: 177-184 (1984). PAF receptors are adjusted with 3 mol guanidine HCl, 100 mM sodium phosphate, 10 mM glutathione (reduced) and 2 mM glutathione (oxidized) to elute and regenerate from the column in 6 mol guanidine HCl, pH 5.0. After incubation for 12 hours in this solution, the protein is dialyzed with 10 mM sodium phosphate.
실시예 2Example 2
COS 세포 내에서의 재조합 PAF 수용체의 발현Expression of Recombinant PAF Receptor in COS Cells
플라스미드, PAF 수용체 HA의 발현은 1) SV40 복제 기점, (2) 암피실린 내성 유전자, (3) 이. 콜라이 복제 기점, (4) 폴리링커 영역에 이은 CMV 프로모터에 이어서 , SV40 인트론 및 폴리아데닐화 부위를 함유하는 벡터 pcDNAⅠ/Amp(인비트로겐)로부터 유래한다. 완전한 PAF 수용체 전구체를 암호화하는 DNA 단편 및 이의 3' 말단에서 프레임 내에 융합된 HA 태그를 벡터의 폴리링커 영역 내로 클론화하여, 재조합 단백질 발현을 CMV 프로모터 하에 유도한다. HA 태그는 상기 기술된 바와 같이 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로 부터 유도된 에피토프에 상응한다[참조: I. Wilson, H. Niman, R. Heighten, A Cherenson, M. Connolly, and R. Lerner, 1984, Cell 37. 767]. 표적 단백질로의 HA 태그의 주입은 HA 에피토프를 인식하는 항체로 재조합 단백질을 용이하게 탐지하도록 한다.The expression of the plasmid, PAF receptor HA, is: 1) the origin of SV40 replication, (2) the ampicillin resistance gene, (3) E. E. coli origin of replication, (4) polylinker region followed by CMV promoter, followed by vector pcDNAI / Amp (Invitrogen) containing SV40 intron and polyadenylation site. DNA fragments encoding the complete PAF receptor precursor and HA tags fused in frame at the 3 'end thereof are cloned into the polylinker region of the vector to induce recombinant protein expression under the CMV promoter. HA tags correspond to epitopes derived from influenza hemagglutinin protein as described above. I. Wilson, H. Niman, R. Heighten, A Cherenson, M. Connolly, and R. Lerner, 1984 , Cell 37. 767]. Injection of the HA tag into the target protein facilitates detection of the recombinant protein with an antibody that recognizes an HA epitope.
플라스미드 작제 방법은 하기에 기술한다:Plasmid construction methods are described below:
PAF 수용체를 암호화하는 DNA 서열, ATCC 제 호를 두 개의 프라이머: HindIII 부위에 이어서, 개시 코돈으로부터 출발하는 PAF 수용체 암호 서열의 18개 뉴클레오티드를 함유하는 5' 프라이머 5' GTCCAAGCTTGCCACCATGAACAGCACATGTATT 3'; XhoⅠ부위, 해독 정지 코돈, HA 태그 및 PAF 수용체 암호 서열 중 마지막 18개 뉴클레오티드 (정지 코돈은 함유하지 않음)에 상보적인 서열을 함유하는 3' 서열 5' CTAGCTCGAGTCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGCAAGGACCTCTAATTCCATA 3'을 사용하는 PCR에 의해 작제한다. 따라서, PCR 생성물은 부위, PAF 수용체 암호 서열에 이어서 프레임 내에 융합된 HA 태그에 이어서 해독 정지 코돈 및 XhoⅠ 부위를 함유한다. PCR 증폭된 DNA 서열 및 벡터, pcDNAⅠ/Amp를 HindIII 및 XhoⅠ 제한 효소로 분해하고 연결시킨다. 연결 혼합물을 이. 콜라이 균주 SURE(공급원: Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) 내로 형질변환시키고, 형질전환된 배양물을 암피실린 배지 플레이트 상에 도포하고 내성 콜로니를 선택한다. 플라스미드 DNA를 형질전환체로부터 분리시키고 정확한 단편의 존재를 위해 제한 분석에 의해 조사한다. 재조합 PAF 수용체의 발현을 위해, COS 세포를 DEAE-DEXTRAN 방법에 의해 발현 벡터로 형질감염시킨다[참조: J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989)]. PAF 수용체 HA 단백질의 발현을 방사성표지 및 면역침강 방법에 의해 탐지한다[참조: E. Harlow, D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1988)]. 세포를35S-시스테인으로 8시간 동안 표지화하고 2일 후에 형질감염시킨다. 다음 배양 배지를 수집하고 세포를 계면활성제(RIPA 완충액(150mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 1% NP-40, 0.1% DOC, 50mM 트리스, pH 7.5)로 용해시킨다[참조: Wilson, I. et al., Id. 37:767(1984)]. 세포 용해물 및 배양 배지 모두 HA 특이성 단일클론 항체로 침강시킨다. 침강된 단백질을 15% SDS-PAGE 겔 상에서 분석한다.DNA sequence encoding PAF receptor, ATCC No. 2 primer: 5 'primer 5' GTCCAAGCTTGCCACCATGAACAGCACATGTATT 3 ', containing 18 nucleotides of the PAF receptor coding sequence starting from the start codon followed by two primers: HindIII site; Construct by PCR using a 3 'sequence 5' CTAGCTCGAGTCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGCAAGGACCTCTAATTCCATA 3 'containing a complementary sequence to the last 18 nucleotides of the XhoI site, the translation stop codon, the HA tag, and the PAF receptor coding sequence, but not the stop codon. . Thus, the PCR product contains a site, a PAF receptor coding sequence followed by an HA tag fused in frame followed by a translation stop codon and a XhoI site. PCR amplified DNA sequences and vectors, pcDNAI / Amp, are digested and linked with HindIII and XhoI restriction enzymes. This coupling mixture. Transform into E. coli strain SURE (Source: Stratagene Cloning Systems, La Jolla, Calif.), Transformed cultures are applied on ampicillin medium plates and resistant colonies are selected. Plasmid DNA is isolated from the transformants and examined by restriction analysis for the presence of correct fragments. For expression of recombinant PAF receptors, COS cells are transfected with expression vectors by the DEAE-DEXTRAN method (J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989). Expression of PAF receptor HA protein is detected by radiolabeling and immunoprecipitation methods (E. Harlow, D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1988)). Cells are labeled with 35 S-cysteine for 8 hours and transfected 2 days later. Collect the following culture medium and lyse the cells with a surfactant (RIPA buffer (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 1% NP-40, 0.1% DOC, 50 mM Tris, pH 7.5). , I. et al., Id. 37: 767 (1984)] Both cell lysates and culture media are precipitated with HA specific monoclonal antibodies The precipitated proteins are analyzed on a 15% SDS-PAGE gel.
실시예 3Example 3
바쿨로비루스 발현 시스템을 사용한 G-단백질 결합된 수용체(PAF 수용체)의 클로닝 및 발현Cloning and Expression of G-protein Coupled Receptor (PAF Receptor) Using Baculovirus Expression System
완전한 길이의 PAF 수용체 단백질을 암호화하는 DNA 서열, ATCC 제 호를 유전자의 5' 및 3' 서열에 상응하는 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭시킨다:DNA sequence encoding full length PAF receptor protein, ATCC number, is amplified using PCR oligonucleotide primers corresponding to 5 'and 3' sequences of genes:
5' 프라이머는 서열 5' CGGGATCCCTCCATGAACAGCACATGTATT 3'을 가지고 BamHⅠ 제한 효소 부위(진하게 표시)에 이어 진핵 세포 내에서의 해독 개시에 유효한 신호[참조 문헌: J. Mol. Biol. 1987, 196, 947-950, Kozak, M]와 유사한 4개의 뉴클레오티드(밑줄 친, 해독을 위한 개시 코돈 ATG)를 함유한다.The 5 'primer has the sequence 5' CGGGATCCCTCCATGAACAGCACATGTATT 3 'and is a signal effective for initiating translation in eukaryotic cells following the BamH restriction site (in bold) [J. Mol. Biol. 1987, 196, 947-950, Kozak, M], which contains four nucleotides (underlined, start codon ATG for translation).
3' 프라이머는 서열 5' CGGGATCCCGCTCAAGGACCTCTAATTCCATA 3'을 가지고 제한 엔도뉴클레아제 BamHⅠ 및 PAF 수용체 유전자의 3' 미해독 서열에 상보적인 18개의 뉴클레오티드에 대한 절단 부위를 함유한다. 증폭된 서열을 시판용 키트(상표: Geneclean, 공급원: BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.)을 사용하여 1% 아가로스 겔로부터 분리시킨다. 단편을 엔도뉴클레아제 BamHⅠ를 사용하여 분해시킨 다음 상기와 같이 정제시킨다. 상기 단편을 F2로 명시한다.The 3 ′ primer has the sequence 5 ′ CGGGATCCCGCTCAAGGACCTCTAATTCCATA 3 ′ and contains a cleavage site for 18 nucleotides that is complementary to the 3 ′ untranslated sequence of the restriction endonuclease BamHI and PAF receptor gene. Amplified sequences are separated from 1% agarose gels using a commercial kit (Genene, trade name: BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.). The fragment is digested with endonuclease BamHI and then purified as above. The fragment is designated F2.
벡터 pRG1(하기에 언급된 pVL941 벡터의 변형)를 바쿨로비루스 발현 시스템을 사용하는 PAF 수용체 단백질의 발현에 사용한다[참조: Summer, M.D. and Smith, G.E. 1987, A mannual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures, Texas Agricultural Exprimental Station Bulletin No. 1555]. 상기 발현 벡터는 오토그라파 칼리포니카 핵 폴리헤드로시스 비루스(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus: AcMNPV)의 강한 폴리헤드린 프로모터에 이어 제한 엔도뉴클레아제 BamHⅠ에 대한 인식 부위를 함유한다. 원숭이 비루스(simian virus(SV))40의 폴리아데닐화 부위를 효율적인 폴리아데닐화를 위해 사용한다. 재조합 비루스의 용이한 선택을 위해 이. 콜라이로부터의 베타-갈락토시다제 유전자를 폴리헤드린 프로모터에 이어 폴리헤드린 유전자의 폴리아데닐화 신호와 같은 방향으로 삽입한다. 폴리헤드린 서열을 공동형질감염된 야생형 비루스성 유전자의 세포-매개 상사성 재조합을 위한 비루스성 서열에 의해 양측에 위치할 수 있다. 다수의 다른 바쿨로비루스 벡터를 pAc373, pVL941 및 pAcIM1과 같은 pRG1 대신에 사용할 수 있다[참조: Luckow, V.A. and Summers, M.D., Virology, 170:31-39].The vector pRG1 (a modification of the pVL941 vector mentioned below) is used for the expression of PAF receptor proteins using the baculovirus expression system. Summer, M.D. and Smith, G.E. 1987, A mannual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures, Texas Agricultural Exprimental Station Bulletin No. 1555]. The expression vector contains a strong polyhedrin promoter of Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV) followed by a recognition site for restriction endonuclease BamHI. The polyadenylation site of monkey virus (SV) 40 is used for efficient polyadenylation. For easy selection of recombinant viruses. The beta-galactosidase gene from E. coli is inserted in the same direction as the polyadenylation signal of the polyhedrin gene followed by the polyhedrin promoter. The polyhedrin sequence can be located on both sides by a viral sequence for cell-mediated similar recombination of the cotransfected wild type viral virus. Many other baculovirus vectors can be used in place of pRG1, such as pAc373, pVL941 and pAcIM1. Luckow, V.A. and Summers, M.D., Virology, 170: 31-39.
플라스미드를 제한 효소 BamHⅠ를 사용하여 분해한 다음 송아지 장의 포스파타제를 사용하여 당해 기술에 공지된 방법에 의해 탈인산화시킨다. 다음, DNA를 상기와 동일하게 1% 아가로스 겔로부터 분리시킨다. 상기 단편을 V2로 명시한다.Plasmids are digested using the restriction enzyme BamHI and then dephosphorylated by methods known in the art using calf phosphatase. Next, the DNA is separated from the 1% agarose gel as above. The fragment is designated as V2.
단편 F2 및 탈인산화된 V2를 T4 DNA 리가제와 연결시킨다. 다음, 이. 콜라이 HB101을 형질전환시키고 세균은 효소 BamHⅠ를 사용하여 PAF 수용체 유전자와 함께 플라스미드(pBacPAF 수용체)를 함유하는 것으로 확인한다. 클론된 단편의 서열을 DNA 서열화에 의해 확인한다.Fragment F2 and dephosphorylated V2 are linked with T4 DNA ligase. Next, this. E. coli HB101 was transformed and the bacterium was identified as containing the plasmid (pBacPAF receptor) together with the PAF receptor gene using the enzyme BamHI. The sequence of the cloned fragments is confirmed by DNA sequencing.
플라스미드 pBac 수용체 5㎍을 리포펙션(lipofection) 방법[참조: Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7413-7417(1987)]을 사용하여 시판되고 있는 선형화된 바쿨로비루스(상표: BaculoGoldTM바쿨로비루스 DNA, 공급원: Pharmingen, San Diego, CA.) 1.0㎍과 공동형질감염시킨다.5 μg of the plasmid pBac receptor was subjected to lipofection method (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7413-7417 (1987), is cotransfected with 1.0 μg of a linearized Baculovirus (trade name: BaculoGold ™ Baculovirus DNA, Pharmingen, San Diego, Calif.).
바쿨로골드TM비루스 DNA 1㎍ 및 플라스미드 pBacPAF 수용체 5㎍을 무혈청 그레이스 배지[공급원: Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD] 50㎕를 함유하는 미세적정 플레이트의 멸균 웰에서 혼합한다. 리포펙틴 10㎕와 그레이스 배지 90㎕를 가한 후에, 혼합하고 실온에서 15분 동안 배양시킨다. 다음 형질감염 혼합물을 무혈청 그레이스 배지와 함께 35mm 조직 배양 플레이트에 접종된 Sf9 곤충 세포(ATCC CRL 1711)에 적가한다. 플레이트를 전후로 진탕하여 새롭게 추가된 용액을 혼합한다. 다음 플레이트를 27℃에서 5시간 동안 배양시킨다. 5시간 후에 형질감염 용액을 플레이트로부터 제거하고 10% 태아 송아지 혈청을 첨가한 그레이스 곤충 배지 1ml을 가한다. 플레이트를 배양기 내에 넣고 4일 동안 27℃에서 계속 배양시킨다.1 μg of baculogold TM virus DNA and 5 μg of plasmid pBacPAF receptor are mixed in sterile wells of microtiter plates containing 50 μl of serum-free Grace medium [Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD]. After adding 10 μl of lipofectin and 90 μl of Grace's medium, mix and incubate for 15 minutes at room temperature. The transfection mixture is then added drop wise to Sf9 insect cells (ATCC CRL 1711) inoculated in 35 mm tissue culture plates with serum free medium. Shake the plate back and forth to mix the newly added solution. The plate is then incubated at 27 ° C. for 5 hours. After 5 hours the transfection solution is removed from the plate and 1 ml of Grace insect medium with 10% fetal calf serum added. The plate is placed in an incubator and incubated at 27 ° C. for 4 days.
4일 후에 상등액을 수집하고 플라크 분석을 상기 섬머와 스미스(상기 문헌)에 의해 기술된 방법과 동일하게 수행한다. 변형으로서 블루 염색된 플라크를 용이하게 분리시키도록 하는 블루 Gal(Life Technologies Inc., Gaithersburg)과 함께 아가로스 겔을 사용한다. (플라크 분석의 상세한 기술은 [참조: Life Technologies Inc., Gaithersburg, page 9-10]에 의해 배포된 곤충 세포 배양 및 바쿨로비루스학에 대한 사용자 가이드에서 볼 수 있다).After 4 days the supernatant is collected and plaque analysis is performed in the same manner as described by Summer and Smith (supra). Agarose gels are used in conjunction with Blue Gal (Life Technologies Inc., Gaithersburg) to facilitate separation of blue stained plaques as a variant. (Detailed descriptions of plaque analysis can be found in the user guide to insect cell culture and baculoviruses distributed by Life Technologies Inc., Gaithersburg, page 9-10).
4일 후에 일련의 희석 후, 비루스를 세포에 가하고, 블루 염색된 플라크를 에펜도르프 피펫 팁으로 수거한다. 다음 재조합 비루스를 함유하는 아가를 그레이스 배지 200㎕를 함유하는 에펜도르프 튜브 내에서 재현탁시킨다. 아가를 단시간의 원심분리에 의해 제거하고 재조합 바쿨로비루스를 함유하는 상등액을 사용하여 35mm 디쉬에 접종된 Sf9 세포를 감염시킨다. 4일 후에 상기 배양 디쉬의 상등액을 수거한 다음 4℃에서 저장한다.After 4 days, after serial dilution, the virus is added to the cells and the blue stained plaques are harvested with an Eppendorf pipette tip. The agar containing the recombinant virus is then resuspended in an Eppendorf tube containing 200 μl of Grace's medium. The agar is removed by short centrifugation and the supernatant containing the recombinant baculovirus is used to infect Sf9 cells inoculated in 35 mm dishes. After 4 days the supernatant of the culture dish is collected and stored at 4 ° C.
Sf9 세포를 10% 열-비활성화된 FBS가 첨가된 그레이스 배지 내에서 증식시킨다. 상기 세포를 감염 다중도(multiplicity of infection: MOI) 2에서 재조합 바쿨로비루스 V-PAF 수용체로 감염시킨다. 6시간 후에 배지를 제거하고 메티오닌 및 시스테인 부재 SF900 Ⅱ 배지(Life Technologies Inc., Gaithersburg)로 대체한다. 42시간 후에,35S-메티오닌 5μCi 및35S 시스테인 5μCi(공급원: Amersham)를 가한다. 세포를 원심분리에 의해 수거하기 전에 16시간 동안 추가 배양시키고 표지된 단백질을 SDS-PAGE 및 방사성사진에 의해 가시화시킨다.Sf9 cells are grown in Grace medium with 10% heat-inactivated FBS. The cells are infected with the recombinant baculovirus V-PAF receptor at multiplicity of infection (MOI) 2. After 6 hours the medium is removed and replaced with methionine and cysteine free SF900 II medium (Life Technologies Inc., Gaithersburg). 42 hours later, 35 S- methionine and 35 S cysteine 5μCi 5μCi: it is a (source Amersham). Cells are further incubated for 16 hours prior to harvest by centrifugation and labeled proteins are visualized by SDS-PAGE and radiographs.
실시예 4Example 4
유전자 치료를 통한 발현Expression through gene therapy
피부 생검에 의해 특정 대상체로부터 섬유아세포를 수득한다. 생성된 조직을 조직 배양 배지에 놓아 두고 작은 조각으로 분리시킨다. 이러한 작은 조각을 조직 배양 플라스크의 젖은 표면 위에 놓아두는데, 약 10개의 조각을 각 플라스크에 놓아둔다. 이 플라스크를 거꾸로 하고, 단단하게 밀봉시킨 다음 실온에 밤새 정치시킨다. 실온에서 24시간 후, 플라스크를 전위시키고 조직 조각을 플라스크의 바닥에 고정시킨 채로 두며 신선한 배지(예: 10% FBS, 페니실린 및 스트렙토마이신 함유 햄의 F12 배지)를 가한다. 이어서, 이를 37℃에서 약 1주 동안 배양한다. 이때, 신선한 배지를 가하고 수일마다 계속해서 교체한다. 2주간 더 배양한 후, 섬유아세포의 단층이 나타난다. 이러한 단층을 트립신으로 처리하고 보다 큰 플라스크로 옮긴다.Skin biopsy yields fibroblasts from certain subjects. The resulting tissue is placed in tissue culture medium and separated into small pieces. This small piece is placed on the wet surface of the tissue culture flask, about 10 pieces are placed in each flask. The flask is inverted, tightly sealed and allowed to stand at room temperature overnight. After 24 hours at room temperature, the flask is inverted and the tissue pieces are left fixed at the bottom of the flask and fresh medium is added (eg F12 medium of ham containing 10% FBS, penicillin and streptomycin). It is then incubated at 37 ° C. for about 1 week. At this time, fresh medium is added and replacement is continued every few days. After two more weeks of culture, a monolayer of fibroblasts appears. This monolayer is treated with trypsin and transferred to a larger flask.
몰로니 쥐과의 육종 비루스의 긴 말단 반복에 의해 플랭킹된 pMV-7[참조: Kirschmeier, P. T. et al., DNA, 7: 219-25 (1988)]을 EcoRⅠ 및 HindⅢ로 분해하고 연속적으로 송아지 장내 포스파타제로 처리한다. 선형 벡터를 아가로즈 겔 상에서 분획화하고 유리 비드를 사용하여 정제한다.PMV-7 (Kirschmeier, PT et al., DNA, 7: 219-25 (1988)) flanked by long terminal repeats of sarcoid sarcoma in Moroni, was digested with EcoR I and Hind III and subsequently in calf intestine. Treat with phosphatase. Linear vectors are fractionated on agarose gels and purified using glass beads.
본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA를 5' 및 3' 말단 서열에 각각 상응하는 PCR 프라이머를 사용하여 증폭시킨다. 5' 프라이머는 EcoRⅠ 부위를 함유하고 3' 프라이머는 HindⅢ 부위를 또한 함유한다. 몰로니 쥐과의 육종 바이러스 선형 중축과 증폭된 EcoRⅠ 및 HindⅢ 단편의 등량을 T4 DNA 리가제의 존재하에서 함께 가한다. 생성된 혼합물을 두 단편을 연결시키기에 적당한 조건하에서 유지시킨다. 연결 혼합물을 사용하여 세균 HB101을 형질전환시키고, 이를 벡터가 적절하게 삽입된 관심대상의 유전자를 함유하고 있는지의 여부를 확인하기 위하여 한천을 함유하는 카나마이신 위로 도말한다.CDNA encoding the polypeptides of the invention are amplified using PCR primers corresponding to the 5 'and 3' terminal sequences, respectively. The 5 'primer contains the EcoRI site and the 3' primer also contains the HindIII site. Molecular murine sarcoma virus linear contraction and equivalent amounts of amplified EcoRI and HindIII fragments are added together in the presence of T4 DNA ligase. The resulting mixture is maintained under conditions suitable for joining the two fragments. The ligation mixture is used to transform bacterial HB101 and plated onto kanamycin containing agar to determine whether the vector contains the gene of interest, as appropriately inserted.
앰포트로픽 pA317 또는 GP+am12 패키징 세포를 10% 송아지 혈청(CS), 페니실린 및 스트렙토마이신을 갖는 둘벡코 변형된 이글즈 배지(DMEM)에서 융합성 밀도로 조직 배양액에서 증식시킨다. 상기 유전자를 함유하는 MSV 벡터를 배지에 가하고 패키징 세포를 상기 벡터로 형질도입한다. 이때 패키징 세포는 유전자를 함유하는 감염성 바이러스성 입자를 생산한다(패키징 세포는 본원에서 생산자 세포로서 언급함).Ampotropic pA317 or GP + am12 packaging cells are grown in tissue culture at a confluent density in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with 10% calf serum (CS), penicillin and streptomycin. MSV vectors containing the genes are added to the medium and packaging cells are transduced with the vectors. The packaging cells then produce infectious viral particles containing the gene (packaging cells are referred to herein as producer cells).
신선한 배지를 형질도입된 생산자 세포에 가하고, 연속적으로 융합성 생산자 세포의 10cm 플레이트로부터 배지를 수거한다. 감염성 바이러스성 입자를 함유하는 소모된 배지를 미소기공 여과기를 통하여 여과시켜 분리된 생산자 세포를 제거하고 이 배지를 사용하여 섬유아세포를 감염시킨다. 배지를 섬유아세포의 아융합성 플레이트로부터 제거하고 생산자 세포로부터의 배지로 신속히 교체한다. 이 배지를 제거하고 신선한 배지로 교체한다. 비루스의 역가가 높으면, 실질적으로 모든 섬유아세포가 감염될 것이며 어떠한 선별도 필요치 않는다. 역가가 극히 낮을 경우에는, neo 또는 his와 같은 선별성 마커를 갖는 레트로비루스성 벡터를 사용하는 것이 필요하다.Fresh medium is added to the transduced producer cells and the medium is harvested from 10 cm plates of confluent producer cells in succession. The spent medium containing the infectious viral particles is filtered through a microporous filter to remove isolated producer cells and the medium is used to infect fibroblasts. The medium is removed from the subfused plate of fibroblasts and quickly replaced with medium from producer cells. Remove this medium and replace with fresh medium. If the titers of viruses are high, virtually all fibroblasts will be infected and no selection is necessary. If the titer is extremely low, it is necessary to use retroviral vectors with selectable markers such as neo or his.
이어서, 유전공학적으로 조작된 섬유아세포를 단독으로 또는 사이토덱스 3 미소담체 비드 상에서 융합까지 증식시킨 후에 숙주에 도입한다. 이때, 섬유아세포는 단백질 생성물을 생성시킨다.The genetically engineered fibroblasts are then introduced into the host either alone or after propagation to fusion on cytodex 3 microcarrier beads. At this time, the fibroblasts produce protein products.
본 발명의 수 많은 변형 및 변이가 상기 교시에 비추어 볼 때 가능하므로, 첨부된 청구의 범위내에서 본 발명은 구체적으로 기술된 것 이외의 양태로 실시할 수 있다.Many modifications and variations of the present invention are possible in light of the above teachings, and therefore, the invention may be practiced otherwise than as specifically described in the appended claims.
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