KR19990014933A - 생체고분자 래더의 제조 방법 및 분석 방법 - Google Patents

생체고분자 래더의 제조 방법 및 분석 방법 Download PDF

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스티븐비.켄트
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월리엄 에이치 그리서
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더글라스 에이 빙햄
더스크립스리서치인스티튜트
월리엄 리치
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Abstract

본 발명은 생체고분자 래더를 제조하는 방법 및 이 생체고분자에 대한 구조적 정보를 수득하는데 사용하는 방법에 관한 것이다. 래더는 촉매 절단 반응을 시작하고 생체고분자의 분자들 말단에서 반응을 종결시켜 제조한다. 종결 반응은 각 절단 순서에서 일정 비율의 생체고분자 분자의 절단을 종결한다.

Description

생체고분자 래더의 제조 방법 및 분석 방법
각종 생체고분자의 구조 분석은 생화학 분야에 있어서 대단히 중요한 영역이다. 분자 유전학은 DNA 또는 RNA 분자의 뉴클레오티드 서열의 파악에 좌우된다. 단백질의 아미노산 서열은 그 기능을 연구하고 그 서열을 암호하는 핵산을 분리하는데 유용한 정보를 제공한다. 분자 수준에서 생물학적 공정을 조정 및 제어하는데 있어서 전사후 단백질 변형이 중요하다는 인식이 증가하고 있는 추세이다. 구체적으로 세포 분열을 비롯한 많은 세포성 공정은 단백질의 선택적이고 가역적인 인산화에 의해서 조절된다. 최근에, 탄수화물이 다양한 생물학적 기능에 있어서 중요한 것으로 입증됨에 따라서, 그 구조에 관심이 집중되고 있다. 또한 천연의 생체고분자의 기능을 모방한 다양한 합성 고분자가 개발되고 있다.
생체고분자의 구조를 분석하기 위한 여러 가지 방법이 있다. 가장 통상적으로 사용되는 핵산 서열의 결정 방법인 디데옥시 방법은, 4 개의 염기 각각으로 종결되는 DNA 분자의 준서열의 4 개의 군을 형성시키는 단계, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)에 의해서 단편들을 분리시키는 단계, 및 자동방사능사진을 사용해서 서열을 해독하는 단계를 포함한다. 이와 대조적으로, 탄수화물 구조의 분석은 다당류로부터 단당류를 반복해서 절단하는 단계, 및 절단된 각 단당류의 실체를 결정하는 단계로 이루어진 조작이 어려운 과정을 포함한다.
펩티드 서열분석을 위해 사용되는 통상의 방법인 에드만(Edman) 분해 방법은, 펩티드의 아미노-말단으로부터 아미노산을 순차적으로 절단하는 단계, 및 이어서 절단된 아미노산의 실체를 결정하는 단계를 포함한다. 그러나, 통상적인 에드만 분해 방법은 폴리펩티드의 전사후 변형에 관해서는 전혀 정보를 제공하지 못한다. 또한, 에드만 분해 방법은 C-말단 서열결정에는 사용될 수 없다. 이와 같은 정보는 유전자 구조와 단백질 기능을 상관시키는데 결정적인 것이다.
또한, 폴리펩티드로부터 말단 아미노산을 제거하는 엑소펩티다제를 사용하는 펩티드 서열 분석 방법이 시도된 바 있다. 이와 같은 방법은 소화 과정의 기간동안에 폴리펩티드의 샘플을 분리하는 단계, 엑소폴리펩티다제의 작용을 종결시키는 다계, 및 수득한 샘플의 수집물을 분석하는 단계를 포함한다. 그러나, 다양한 아미노산들사이에서 효소가 펩티드 결합을 절단하는 속도가 크게 다르기 때문에 혼란이 일어나므로, 생성된 펩티드 수집물들에 차이가 유발될 수 있다.
본 발명은 생화학 기술분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 특히 생체고분자에 관한 구조적 정보를 얻는데 유용한 생체고분자 래더(biopolymer ladder)를 제조하는 방법에 관한 것이다.
도 1 은 본 발명의 제 1 실시양태의 전반적인 절차에 대한 개요도이다.
도 2 는 매트릭스-지원 레이저 탈착/이온화(MALDI) 이동 시보 질량 분광분석계를 도시한 것이다.
도 3 은 합성된 돼지 레닌 기질의 MALDI 이동 시보(TOF) 질량 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 4 는 본 발명의 방법에 의해 제조된 레닌 기질 테트라데카펩티드로 이루어진 펩티드 래더의 매트릭스-지원 레이저 탈착/이온화 질량 분광분석계(MALDI-MS) 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 5 는 종결 시약을 사용하지 않고 카르복시펩티다제로 절단한 합성된 돼지 레닌 기질의 서열분석 스펙트럼을 도시한 것이다.
구체적인 양태의 설명
본 발명은 제조된 폴리펩티드를 촉매 시약을 사용하여 조절 절단하므로써 생체고분자 래더를 제조하는 방법을 제공한다. 생체고분자 래더는 생체고분자 모분자에 대한 구조적 정보를 얻는데 유용하다. 본 발명의 일 양태에 있어서, 생체고분자 래더는 길이가 각각 1 단량체 단위씩 다른 생체고분자 모분자의 그물형 단편(임의적으로 모분자도 포함함)으로 이루어진다. 이 래더는, 예컨대 래더의 인접 구성원들간의 질량차를 측정하여 생체고분자 모분자내의 단위의 서열을 측정하는데 유용하다. 그 질량 차이는 보다 짧은 단편을 만들기 위해 제거된 단위에 상응하는 것으로, 그 단위를 동정할 수 있게 된다.
본 발명의 방법은 생체고분자의 분자들 말단에 대하여 경쟁 반응을 개시시키는 것을 포함한다. 그 한가지 반응은 절단 시약을 사용하여 생체고분자의 분자들로부터 종결 단위를 제거하는 반응, 예컨대 엑소펩티다제를 사용하여 펩티드로부터 말단 아미노산을 가수분해하는 반응이다. 다른 반응은 종결 시약과 생체고분자의 분자들을 반응시켜 생체고분자에 종결부를 첨가하는 것이다. 이러한 반응들에 있어서 종결부를 갖는 생체고분자로부터의 종결 단위 또는 단위들의 제거 속도는 종결부를 갖고 있지 않은 생체고분자의 분자들로부터 종결 단위 또는 단위들을 제거하는 속도보다 더 느리도록 선택한다. 따라서, 종결 시약과 반응시켜 종결부를 생체고분자에 일단 첨가하면 변형된 종결 단위는 절단 시약에 의한 절단에 대해 실질적으로 내성이 생기게 된다.
본 발명의 일 양태는 촉매가 반응의 양방향으로 활성화 에너지를 낮추어 그 반응계가 반응물의 상대적인 농도와 화학 포텐셜에 의해 규정되는 평형에 이르도록 한다는 사실을 이용하고 있다. 이 양태에서 종결 시약은 과량의 몰량으로 반응계에 첨가하여, 생체고분자에 종결부를 첨가하거나 생체고분자로부터 종결부를 제거하는 반응의 평형이 주로 종결부를 첨가하는 반응쪽으로 일어나게 된다. 이 반응계를 적절하게 최적화하면, 임의의 특정 단편 크기를 만들기 위해, 생체고분자의 일정 분획에 종결 부를 첨가하고 다른 일정 분획으로부터는 종결 단위 또는 단위들을 절단한다. 종결부로 캡핑된 이러한 생체고분자 단편들은 추가의 절단 반응에 저항하는 경향이 있다. 캡핑되지 않은 단편은 절단 및 그 이후의 캡핑에도 반응할 수 있을 것이다. 이 반응을 진행시키므로써, 출발 생체고분자의 일군의 절단 단편은 동일한 수의 단량체 단위이지만 조성이 상이한 군의 구성원들로 형성된다.
본원에 사용된 바와 같은, 생체고분자라는 용어는 생화학적 단량체 단위들의 서열로 제조된 중합체를 의미한다. 생체고분자로는, 예컨대 펩티드, 핵산, 복합 탄수화물, 및 이러한 생체고분자의 유사체, 뿐만 아니라 생화학적 단량체 단위들을 연속 첨가한 다른 생성물을 포함한다. 그 예로는, D- 또는 L-아미노산, 아미노산 유사체 및 알파 헬릭스, 베타- 또는 감마- 회전, 또는 다른 구조적 요소들을 유도하는 펩티드유사체를 함유하는 펩티드 및 핵산 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 생체고분자 래더란 용어는 2개 이상, 바람직하게는 3개 이상의 생체고분자의 분자들로 이루어진 중첩형 군을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같은, 중첩형 군이란 용어는 물론 중첩형 군중에서 가장 큰 구성원을 제외한 각 구성원 단위들의 서열이 그 군중에 존재하는 보다 큰 구성원중의 서열에 포함되는 군을 의미한다. 이러한 중첩형 군에 속하는 모든 구성원들간의 크기 차이는 일반적으로 단일 절단 반응에서 제거된 종결 단위들의 수에 해당하는 것이다. 이 군이 3개 이상의 구성원을 함유할 때, 그 군에 속하는 각 구성원의 크기는 그 다음 가장 큰 구성원과 동일한 수의 종결 단위씩 차이가 난다. 예를 들면, 서열 A-B-C-D-E-F-G-H-I를 가진 생체고분자에서 생성된 생체고분자 래더는 예컨대, 다음과 같은 생체고분자의 중첩형 군을 포함할 수 있다: A-B-C-D-E-F-G-H-*, A-B-C-D-E-F-G-*, A-B-C-D-E-F-*, A-B-C-D-E-*, A-B-C-D-*, 및 A-B-C-*(*는 종결부를 나타냄). 이 군중에서, 생체고분자는 생체고분자 1 단위씩 길이에 차이가 난다. 생체고분자로부터 한번에 2개의 종결 단위씩 제거하는 절단 시약의 작용에 의해 생성되는 생체고분자 래더의 또다른 예는 예컨대, A-B-C-D-E-F-G-*, A-B-C-D-E-*, 및 A-B-C-*일 수 있다. 이러한 군에서 생체고분자는 2 단위씩 길이에 차이가 난다. 복합 탄수화물과 같이 분지형 생체고분자인 경우에, 보다 큰 분지형 구조가 하나 이상의 종결 단위, 예컨대 말단 당 부만을 제외하고는 보다 작은 분지형 구조와 동일한 구조라면, 한 서열은 또다른 서열에 포함되는 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, 절단 시약이란 용어는 생체고분자로부터 단량체 단위의 제거를 촉매할 수 있는 촉매 활성을 함유하는 시약을 의미한다. 본 발명의 일 양태에 있어서, 절단 시약은 효소이다. 다른 절단 시약으로는, 예컨대 산, 염기 또는 자연 발생의 생성물을 포함한다. 이 절단 시약은 생체고분자의 말단으로부터 1 단위 또는 복수 단위의 제거를 촉매할 수 있다.
생체고분자가 펩티드인 경우, 절단 시약으로는, 예컨대 엑소펩티다제, 즉 카르복시펩티다제 또는 아미노펩티다제를 포함할 수 있다. 유용한 엑소펩티다제로는 모노펩티다제 및 폴리펩티다제, 예컨대, 디펩티다제 및 트리펩티다제일 수 있다. 본 발명은 특히 카르복시펩티다제 Y, 카르복시펩티다제 P, 카르복시펩티다제 A 및 카르복시펩티다제 B의 사용에 대하여 고찰하고 있다. 또한, 류신 아미노펩티다제, 미소체 펩티다제등과 같은 아미노펩티다제의 사용에 대해서도 고찰한다.
특정 펩티다제는 다른 아미노산들간의 펩티드 결합보다도 더 빨리 특정 아미노산들간의 펩티드 결합의 붕괴를 촉매할 수 있다. 예를 들면, 카르복시펩티다제 A는 카르복시말단에 있는 다른 아미노산들간의 펩티드 결합보다 카르복실말단 프롤린과 다른 아미노산들간의 펩티드 결합(즉, NH2-AA1-....-AAn-Pro-COOH)을 훨씬 느리게 절단한다. 따라서, 본 발명의 특정 양태에서 절단 시약은 1종 이상의 펩티다제를 함유하는 혼합물일 수 있으며, 그 각각의 펩티다제는 펩티드 결합의 절단 속도가 어느 한 절단 시약만을 사용하는 경우의 절단 속도보다 더욱 균일하도록 각각 상이한 특이성을 갖고 있다. 이러한 일예는 카르복시펩티다제 A와 카르복시펩티다제 Y의 혼합물을 사용하는 것으로, 중첩형 군에 속하는 단편들의 모든 구성원들을 나타내는 펩티드 래더가 생성된다.
단백질 및 다른 생체고분자는 절단 시약이 작용할 수 없는 말단 잔기를 남기는 2차 또는 3차 구조를 가질 수 있다. 따라서, 본 발명은 절단 시약이 생체고분자의 분자들 말단에 접근할 수 있도록, 예컨대 생체고분자의 분자들을 변성시켜 그 말단을 노출시키는 수단 및 방법을 제공한다. 본 발명의 일 양태는 열안정한 절단 시약과 생체고분자의 분자들 일체를 접촉시키는 것을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 연안정한 절단 시약이란 용어는 50℃ 이상의 온도에서 최적 활성을 갖는 절단 시약을 의미한다. 이 방법에서, 생체고분자의 분자들 일체는 생체고분자의 분자를 적어도 일부분 변성시키는, 예컨대 2차 및/또는 3차 구조를 붕괴시키는 온도에서 절단 시약과 접촉된다. 많은 단백질들의 경우에, 말단을 노출시키기 위해 분자들을 약 70℃ 이상의 온도에 노출시켜 분자를 적절하게 변성시킬 수 있다. 일반적으로, 반응은 약 100℃ 이하에서 수행될 것이다. 이 온도는 절단 시약의 최적 반응 온도와 비교하여 선택할 수 있다. 예컨대, 90℃의 반응 온도는 그 최적 반응 온도가 90℃인 열안정한 효소인 경우에 바람직할 수 있다.
고온성 박테리아에서 발견되는 것과 같은 열안정한 효소는 본 발명에 유용하게 사용할 수 있다. 이러한 고온성 박테리아로부터 여러 종류의 열안정한 카르복시펩티다제가 동정되어 분리되었다. 예컨대, 써머스 아쿠아티커스(Thermus aquaticus) YT-1에서 발견된 카르복시펩티다제 Taq는 최적 반응 온도가 80℃이다(S. -H. Lee et al. (1994) Biosci. Biotech. Biochem. 58:1490-1495). 열안정한 아미노펩티다제는 바실러스 스테아로써모필러스(Y. Sakamoto(1994) Biosci. Biotech. Biochem. 58:1675-1678); 스트렙토코커스 써모필러스(M.P. Chapotchartier (1994) Eur. J. Biochem. 224:497-506); 스트렙토코커스 살리바리우스 아종 써모필러스(아미노펩티다제 N)(R.G. Midwinter(1994) J. Appl. Bacteriol., 77: 288-295); 및 설포로부스 설파타리쿠스(M. Hanner et al., (1990) Biochem. et Biophys. Acta 1033:148-153)에서 동정되어 분리되었다.
당업자라면 바람직한 성질을 갖는 다른 절단 시약들도 극한 환경에서 생존하는 개체로부터 분리하여 본 발명의 방법에 사용할 수 있다는 것을 분명하게 이해하고 있을 것이다. 예컨대, 내염성 절단 시약은 호염성 박테리아 또는 아케박테리아로부터 분리할 수 있다. 내염성 절단 시약은 높은 이온 강도 조건에서 변성하는 생체고분자, 특히 단백질로부터 생체고분자 래더를 제조하는데 유용하다.
핵산의 경우에, 절단 시약은, 예컨대 3' 또는 5' 엑소뉴클레아제를 포함할 수 있으며, 그 예로는 Bal-31 뉴클레아제, 이.콜리 엑소뉴클레아제 I, 이.콜리 엑소뉴클레아제 VII, 이.콜리 DNA 폴리머라제 I 엑소뉴클레아제 활성, DNA 폴리머라제 I의 크리나우 단편과 관련된 엑소뉴클레아제 활성, T4 콜리파지 DNA 폴리머라제와 관련된 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 것이 있다.
탄수화물의 경우에, 절단 시약으로는, 예컨대 다양한 푸코시다제, 만노시다제, 갈락토시다제등과 같은 엑소글리코시다제를 함유할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 종결 시약이란 용어는 생체고분자와의 반응시 생체고분자와 절단 시약의 반응을 늦추거나 방해하는 종결 부를 생체고분자에 부가하는 시약을 의미한다. 즉, 종결 부를 갖는 생체고분자로부터 종결 단위 또는 단위들의 제거 반응은 종결 부와 반응하지 않은 생체고분자의 분자들로부터 종결 단위 또는 단위들을 제거하는 반응 속도보다 느리다. 절단 시약이 효소인 경우, 종결부를 갖는 생체고분자로부터 종결 단위를 제거하는 최대 속도는 종결부를 갖지 않은 생체고분자로부터 종결 단위를 제거하는 최대 속도보다 느리다.
본 발명의 일양태에 있어서, 예컨대, 절단 시약이 효소인 경우, 절단 시약은 종결 단위의 절단 반응과 종결부의 첨가 반응을 촉매한다. 이러한 경우에, 종결 시약은 생체고분자의 본래 단위와는 충분히 다른 구조를 갖도록 선택할 수 있어 종결 시약의 첨가/제거 반응의 속도 상수는 본래 단위의 첨가/제거 반응의 속도 상수보다 느리다. 본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 비종결형 단위를 생체고분자의 분자들로부터 제거하는 속도는 생체고분자의 분자들의 종결 단위들에 종결 부를 첨가하는 속도보다 더 크다.
예컨대, 절단 시약이 카르복시펩티다제를 포함하는 펩티드의 경우에, 종결 시약은 아미노산 아미드일 수 있다. L-리신아미드는 펩티드 래더 생성에 사용하기 위한 종결 시약으로서 2 이상의 바람직한 성질을 갖고 있다. 첫째, L-리신아미드는 고도로 수용성이다. 이로써 이 분자는 높은 몰농도로 사용할 수 있다. 둘째, L-리신아미드는 염기부를 함유하여, 펩티드를 분석하는데 사용되는 수단이 MALDI 질량 분광분석기라면 펩티드 래더 검출을 향상시킬 수 있는데, 이는 염기성 기들이 이온화를 보조할 수 있기 때문이다. 아미노산 아미드는 카르복실기 대신에 아미드기를 갖고 있기 때문에, 카르복시펩티다제는 통상의 아미노산 보다 여러 차수 낮은 속도로 펩티드의 카르복시 말단으로부터 첨가/제거반응을 촉매한다. 예컨대, 카르복시펩티다제 Y는 FA-Phe-Leu-OH 및 FA-Phe-Gly-NH2의 가수분해에 대한 kcat/KM을 비교할 때 말단 아미드의 경우보다 3 차수 이하의 큰 속도로 펩티드의 C-말단 펩티드 결합의 가수분해를 촉매한다(Raaschou-Nielsen et al.(1994) Peptide Research 7:132-135). 따라서, 모든 실제적인 목적을 위해, 아미노산 아미드를 일단 펩티드의 카르복시-말단에 첨가하면, 카르복시펩티다제는, 다른 펩티드에서 말단 아미노산을 계속 절단하는 것과 같이 아미노산을 제거할 수는 없을 것이다.
절단 시약이 아미노펩티다제인 경우, 종결 시약은 n-아세틸 리신과 같은 n-아세틸 아미노산일 수 있다.
이러한 방법의 변형예로서, 종결 시약은 동위원소들의 혼합물을 포함할 수 있다. 이러한 혼합물을 함유하는 생체고분자 래더는 이 래더의 구성원들을 검측하는데 유용하다. 예컨대, 질량이 상이한 종결부를 함유하는 래더의 구성원은 질량 분광분석기에서 균열된 피크들로 확인할 수 있다(W.R. Gray(1970) Biochem. Biophys. Res. Commun. 41:1111-1119). 또한, 방사능활성 표지된 종결 부를 함유하는 래더의 구성원들은 또한 자동방사능사진으로 확인할 수 있다.
생체고분자 래더를 제조하는 방법은 적당량의 시약을 사용하고 래더를 형성하기 위한 반응 조건을 선택하여 반응계를 최적화하는 것을 포함한다. 이 방법은 각각의 연속 절단 단계에서 종결기를 가진 생체고분자의 검출가능 양을 생성하기 위해 충분량의 종결 시약을 사용하는 것을 포함한다. 이 양은 물론 선택된 검출 수단의 감도에 따라 달라진다. 일반적으로, 종결 시약은 종결 부를 첨가하는 방향으로 반응을 주로 유도할 수 있도록 과량의 몰량을 첨가한다. 일 양태에 따라, 종결 시약은 생체고분자의 수%가 각 반응에서 종결될 정도의 양으로 첨가한다. 래더 분자의 유효량의 범위는 실험적으로 용이하게 결정할 수 있다.
적절한 조건을 맞추기 위해 조정할 수 있는 다른 요인으로는 온도, pH 및 완충계를 포함한다. 일반적으로, 절단 시약이 효소인 경우에 효소가 일반적으로 사용되는 조건은 반응 조건을 더욱 최적화할 수 있는 우수한 개시점을 제공할 것이다. 또한, 효소 절단 시약의 혼합물을 사용해야만 하는 경우에는 혼화성 효소를 선택하는 것이 유용하다. 일 예로서, pH를 설정할 때, 대부분의 경우에는 pH의 함수로서 유사한 활성 프로파일을 갖는 효소를 선택하는 것이 유용하나, 기질 선호 효과를 조절하기 위하여 최적 pH보다 못한 pH에서 효소 절단 시약을 사용하는 것이 필요한 경우도 있을 수 있다.
본 발명의 방법으로 처리한 생체고분자는 다양한 크기를 가질 수 있다. 그러나, 측정된 질량의 평균적 불확실성의 영향은 분자량이 증가함에 따라 더욱 커지게 된다. 3500 달톤 이하인 경우 질량 편차는 ±0.3 달톤 미만이고, 가장 근접한 관련성을 가진 단량체 쌍, 및 특히 아미노산 쌍(Leu/Ile은 동일한 질량을 갖고 있음)들을 구별하는데 전혀 애매한 점이 없다. 그러나, 분자량이 3500 달톤 이상인 경우에는 0.4 내지 0.9 달톤이 불확실하다면 매우 유사한 잔기 질량을 가진 단량체를 동정하기 힘든 어떤 모호성을 유발시킨다. 다른 아미노산과 유사한 질량을 가진 어떤 아미노산도 함유하지 않는 폴리펩티드인 경우에는, 이러한 불확실성이 전혀 문제가 되지 않을 것이다. 이와 같은 중합체내의 특정 단량체를 동정하는데 약간의 모호성이 있을지라도 본 발명의 방법은 유용한 서열 정보를 제공한다. 따라서, 본 발명의 특정 양태에 있어서, 생체고분자는 약 5kDa 이하, 바람직하게는 약 3.5 kDa 이하의 질량을 갖는다. 생체고분자가 폴리펩티드인 경우에, 이 폴리펩티드는 약 50개 미만, 바람직하게는 약 35개 미만의 아미노산을 가질 수 있다. 뿐만 아니라, 보다 큰 크기의 폴리펩티드로부터 가변 서열의 정보를 얻을 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 제조된 생체고분자 래더를 제공한다. 이 래더는 중첩형 군에 함유된 2개 이상, 바람직하게는 3개의 구성원을 갖는 생체고분자의 수집물인 것을 특징으로 하며, 이 구성원들은 동일한 종결부를 갖고 있다. 특히, 본 발명은 촉매적으로 첨가된 종결 부, 예컨대 펩티드라면 리신아미드와 같은 아미노산 아미드를 갖는 래더에 관한 것이다.
생체고분자 래더는 예를 들어 단량체 단위체의 서열을 비롯하여 생체고분자에 관한 유용한 구조적 정보를 제공할 수 있다. 절단 시약이 한번에 생체고분자로부터 하나의 단위체를 절단시킬 때, 래더의 구성원은 제거되는 단위체의 질량에 의해서 상이한 질량을 가지며, 따라서 제거된 단위체를 확인할 수 있는 정보를 제공한다. 한번에 생체고분자로부터 하나 이상의 단량체 단위체를 제거하는 촉매의 작용에 의해서 형성된 래더도 또한 유용한 정보를 제공한다. 예를 들어, 트립신으로 단백질을 분해하면 카르복시-말단에 리신 또는 아르기닌이 남게 될 것이다. 생성 펩티드를 본 발명의 방법에 따라 디-펩티다제로 분해하면, 제거된 처음 2개 단위체의 질량은 아르기닌 또는 리신의 질량 및 끝에서 두 번째의 아미노산의 질량과 동일할 것이며, 따라서 그 실체를 확인할 수 있게 된다. 종종 단백질의 어느 한쪽 말단에 존재하는 몇몇 아미노산의 실체는 단백질을 암호하는 유전자를 증폭하는데 유용한 PCR의 프라이머를 제조하기에 충분할 것이다. 또한, 불완전한 서열 정보는 기타 공급원으로부터의 정보를 보충할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 생체고분자의 서열 정보를 얻는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 본 발명의 방법에 따른 중첩형 군에 생체고분자의 수집물을 포함하는 생체고분자 래더를 제조하는 단계, 구성원들 간의 질량 차이를 측정하는 단계, 및 측정된 질량 차이와 단위체의 질량을 상호 연관지어 단위체의 실체를 결정하는 단계를 포함한다. 래더의 성분 사이의 질량 차이는 제거된 단위체를 확인하는데 도움을 준다.
일양태에 따라서, 본 발명은 폴리펩티드의 아미노산 서열을 결정하는 방법을 제공한다. 본 방법은 각각의 펩티드가 하나의 아미노산씩 또 다른 펩티드와 길이가 다른 펩티드의 중첩형 군을 갖는 폴리펩티드 래더를 생성하는 단계, 중첩형군 내에 펩티드 사이의 질량 차이를 측정하는 단계, 및 측정된 질량 차이와 상호 관련된 질량을 갖는 아미노산의 실체를 결정하는 단계를 포함한다. 중첩형 군내의 아미노산의 실체는 펩티드내의 아미노산 서열을 알려준다. 이 방법은 전체 폴리펩티드의 아미노산 서열의 결정을 필요로 하지는 않는다. 부분적인 서열 또한 유용하다.
본 발명은 생체고분자 래더의 구성원들간의 질량 차이를 측정하는 몇가지 방법에 관한 것이다. 본 발명의 일양태에 따라서, 래더 구성원들간의 질량 차이는 질량 분광분석기로 측정한다. 질량 분광분석을 위한 방법은 예를 들어252Cf 플라즈마 탈착, 전자 분사 이온화, 고속 이온 충격, 화학적 유도 붕괴 및, 특히 매트릭스-지원 레이저 탈착 질량 분광분석계(MALDI-MS)를 포함한다. 생체 분자상에서 질량 분광분석을 조작하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
MALDI-MS를 수행하는 장치 및 방법은 국제 공고 WO93/24835(미국 특허 출원 08/341,555), 미국 특허 5,288,644, R. Beavis 및 B. Chait의 문헌[PNAS 87: 6873-6877(1990)], B. Chait 및 K. Standing의 문헌[Int. J. Mass Spectrom, Ion Phys. 40:185 (1981)] 및 Mamyrin 등의 문헌[Sov. Phy. JETP 37:45 (1973)]에 기재되어 있으며, 이 문헌들은 모두 본원에 참고로 인용하였다. 간단히 말하면, 예를 들어 Q-스위치식 Lumonics HY400 네오디뮴/이트륨 알루미늄 석류석 레이저(Nd-YAG)의 주파수 3배의 출력(355 nm, 10-nsec 출력 펄스)은 렌즈(12-인치의 초점 길이)에 의해 용융 실리카 창을 통하여 질량 분광분석계 내부의 시료상에 초점이 맞춰진다. 레이저에 의해 형성된 생성 이온은 30kV의 정전기 전위에 의해서 가속화된다. 이어서, 이온을 30μPa의 진공을 유지하는 2-m 관으로 이동시키고, 관의 단부에 도착한 이온량을 검출하고, 예를 들면 Lecroy TR8828D 순간 기록기를 사용하여 기록한다. 200 이하의 개개 레이저 발사의 순간 기록을 모두 합하고, 생성 히스토그램을 질량 분광분석기로 플롯팅한다. 피크 중심 측정 및 자료 감축은 VAX 워크 스테이션 또는 기타 컴퓨터 시스템을 사용하여 수행할 수 있다.
하기 과정에 의한 레이저 탈착 분석을 위해서 단백질 시료를 제조할 수 있다. 바람직하게는 300nm 이상을 흡수하는 레이저 탈착 매트릭스 물질은 0.1%(w/w) 트리플루오로아세트산를 함유하는 수성 30%(v/v) 아세토니트릴에 용해시켜 20℃에서 표준 용액(50mM)을 제조한다. 바람직한 매트릭스는 α-시아노-4-히드록시 신남산이다. 이어서 대상 단백질 시료를 포함하는 용액을 매트릭스 용액에 첨가하여 0.1-10μM의 최종 단백질 농도를 제공한다. 이 혼합물의 분취 소량(0.5㎕)을 평평한 금속 프로브 팁(2mm 직경)에 적용하고 실온에서 가압 공기로 건조시킨다. 생성된 침착물은 4℃의 증류수에 팁을 10초 동안 침지시키므로서 세척한다. 이 세척 단계는 단백질 또는 매트릭스를 제거하지 않고 가용성 이온 오염물을 단백질/매트릭스 침착물로 부터 제거할 수 있도록 보조한다. 일단 시료가 세척되면, 질량 분광분석기에 삽입시켜 분석한다. 시료의 제조 개시에서 최종 질량 스펙트럼 분석에 이르기까지의 전체 프로토콜은 약 15분이 걸린다.
생체고분자 래더 구성원들간의 질량 차이를 측정하는데 유용한 다른 방법은 아크릴아미드 겔 전기영동법이다.
발명의 개요
본 발명은, 예를 들면 생체고분자 래더를 제조하는 방법을 제공한다. 제 1 단계에서는, 생체고분자의 분자들 일체를 그 생체고분자의 분자들과 반응시켜 종결 부를 첨가하는 종결 시약과 접촉시키고, 이어서 생체고분자의 말단으로부터 종결 단위를 제거하는데 촉매 작용을 하는 절단 시약과 접촉시킨다. 본 발명의 일 양태에 의하면, 종결 부를 가진 생체고분자의 분자들로부터 종결 단위를 제거하는 속도는, 종결 부를 갖고 있지 않는 생체고분자의 분자들로부터 종결 단위를 제거하는 속도보다 낮다. 생체고분자는 중첩형 군으로 이루어지는 생체고분자의 수집물을 형성할 수 있는 조건 및 양으로 상기 시약과 접촉시킨다.
본 발명의 특정한 구체예에 의하면, 상기 생체고분자는 폴리펩티드이고, 상기 절단 시약은 카르복시펩티다제이며, 폴리펩티드로부터 아미노산이 제거되는 속도는 폴리펩티드에 아미노산 아미드가 첨가되는 속도보다 빠르다. 특정한 구체예에서, 절단 시약은 열안정성인 것이다.
또한, 본 발명은 2 개 이상, 바람직하게는 3 개 이상의 생체고분자의 분자들이 중첩형 군을 구성하고, 그 구성원들이 촉매 작용에 의해 첨가된 동일한 종결 부를 갖는 생체고분자 래더를 제공한다.
이외에도, 본 발명은 본 발명에 의한 방법에 따라서 생체고분자 래더를 제조하는 단계, 래더의 구성원들간의 질량 차이를 측정하는 단계, 및 측정된 질량 차와 관련된 질량을 가진 단위의 실체를 결정하는 단계를 포함하여, 생체고분자의 구조에 관한 정보를 얻는 방법을 제공한다. 본 발명의 한 실시양태에 의하면, 상기 생체고분자는 폴리펩티드이고, 절단 시약은 폴리펩티드의 C-말단 또는 N-말단 펩티드 결합을 절단하므로써, 말단 아미노산을 제거하며, 상기 방법은 폴리펩티드내의 아미노산 서열에 관한 정보를 제공한다. 본 발명의 다른 실시양태에 의하면, 상기 질량 차이를 측정하는 방법은 생체고분자 래더를 질량 분광분석법으로 처리하는 것을 포함한다.
카르복시펩티다제 Y를 사용하여 합성 돼지 레닌 기질 테트라데카펩티드(시그마)의 서열을 결정하였다. 펩티드는 아미노산 서열 DRVYIHPFHL LVYS(서열 번호 1)(아미노산 잔기를 위한 1 문자 암호) 및 1759.0Da의 분자량을 갖고 있다. 도 3은 레닌 기질 테트라데카펩티드의 매트릭스-지원 레이저 탈착 이온화 질량 분광분석기의(MALDI-MS) 스펙트럼이다. MALDI-MS 분석은 락커펠러 대학에서 설계한 레이저 탈착 이온화 이동 시보(time-of-flight) 질량 분석계상에서 수행하였다(R. Beavis 및 B. Chait(1990) Anal. Chem. 62:1836-1840). α-시아노-4-히드록시신남산은 물/아세토니트릴(2:1, v/v)내에 포화된 용액의 형태로 존재하는 레이저 탈착 매트릭스로 사용하였다(Beavis 등, (1992) Org. Mass Spectrom. 27:156-158). 1㎕의 펩티드 용액을 5㎕의 매트릭스 용액과 혼합하였다. 이어서 시료 용액 0.5㎕를 시료 프로브상에 적용하고 분석하였다(도 3). 이 스펙트럼에서, 1가(NH+) 및 2가(2+) 양성자화된 분자 이온은 m/z 1759.9 및 880.5 amu에서 관찰되었다. d-Asp로 나타낸 피크(m/z 1644.7 amu에서)는 아미노-말단의 절단된 펩티드 불순물이다.
이 펩티드의 카르복시-말단 서열은 과량의 아미노산 아미드 존재하에 카르복시펩티다제 분해를 이용하고, 이와 동시에 또는 연속적으로 매트릭스-지원 레이저 탈착 이온화 질량 분광분석계의 자료 분석을 통하여 수득하였다(Hillenkamp 등(1991), Anal. Chem. 63: 1193-1202). 분해 과정중 카르복시펩티다제의 고속 분해 단계에 균형을 맞추고, 서열 공백을 제거하기 위해서 아미노산 아미드인 L-리신아미드를 사용하였다. 경쟁적 카르복시펩티다제 Y 서열화 반응은 pH 7.5에서 과량의 리신아미드(1M, L-리신아미드 디히드로클로라이드(시그마))의 존재하에 수행하였다.
펩티드 기질 5㎕(1mM) 및 카르복시펩티다제 Y(100g/ml) 5㎕를 20분 동안 37℃의 완충액(총 부피 100㎕, 50mM 헤페스, 5mM EDTA 및 1M 리신아미드로 구성)에서 항온 처리하였다. 이어서 2% TFA 20㎕를 반응 용액 10㎕에 첨가하여 반응을 종결시켰다. 1㎕의 반응 혼합 용액을 5㎕ MALDI 매트릭스와 혼합하고, 0.5㎕ 시료 용액을 MALDI-MS로 분석하였다. 생성된 서열 스펙트럼은 도 4에 나타나있다. 스펙트럼은 단일 조작으로 7개 이하의 아미노산 잔기를 가진 폴리펩티드의 카르복시 말단 서열을 제공한다.
아미노산 서열은 하기와 같이 결정하였다. 127Da(L-리신아미드 잔기 질량)을 온전한 분자 이온의 질량(1260 Da)에 첨가하여 1887Da을 얻고, 이어서 리신아미드 변형된 펩티드 피크의 가장 큰 질량(1799.3Da)을 제하므로서 제 1 카르복시-말단의 아미노산 잔기를 결정하였다. 이 계산에 의한 질량 차이는 87.7Da이고, 이는 세린 잔기에 해당한다. 남은 카르복시-말단 서열은 스펙트럼내에 인접한 피크 사이의 질량 차이로 알 수 있다. m/z 1424.5 및 1297.6 에서 피크사이의 질량 차이 126.9 Da는 리신아미드에 해당한다. 리신아미드 잔기의 보다 적은 질량측의 피크는 변형되지 않은 펩티드에 해당하며, 리신아미드의 보다 높은 질량측의 피크는 리신아미드 변형된 펩티드에 해당한다.
비교를 위하여, 동일한 펩티드를 리신아미드의 부재하에서 카르복시펩티다제 Y로 분해하였다. 도 5는 37℃에서 10분간 반응시킨 후의 서열 스펙트럼을 보여준다. 이 스펙트럼은 펩티드 래더의 중간체 구성원이 결실된 수개의 공백을 포함한다. 이 결과로 본 발명의 방법은 신속한 가수분해 반응이 아미노분해 반응과 균형을 이룬다는 것을 명백히 알 수 있다. 결과적으로, 정상적인 카르복시펩티드 Y 분해시의 서열 공백(도 5)은 리신아미드 변형물(도 4)에 의해 충족되었다.
L-리신아미드는 카르복시펩티다제 Y에 의한 펩티드 기질 가수분해의 친핵성 및 경쟁적 기질로 사용되어 가수 분해 속도를 감소시킨다. 펩티드의 C-말단에서 리신아미드의 형성에 의해 생성된 아미노분해 생성물은 가수분해 속도를 감소시킬 수 있다. 이는 다량의 온전한 펩티드가 남아 있는 것에 의해 알 수 있다(도 4). 가수분해 속도의 감소는 단점이 아니다. 이는 분해/래더 형성 과정을 더 잘 조절한다. 속도는 단순히 효소를 더 첨가하므로서 증가시킬 수 있다.
본 발명은 생체고분자 래더를 제조하는 실질적인 신규 방법을 제공한다. 구체적인 실시예를 제공하였지만, 이는 예시를 위한 것이지 제한하려는 것이 아니다. 당업자라면 본 명세서의 검토후 본 발명의 다수의 변형이 가능하다는 것을 명백히 알게 될 것이다. 따라서 본 발명의 범위는 상기 명세서에 한하는 것은 아니며, 대신 본 발명의 전 범위에 따라 첨부된 청구항을 참조하여 결정하여야 한다.
본원에서 인용한 모든 간행물 및 특허 문서는 개별적으로 표시되어 있는 바와 같이 동일한 정도로 모든 목적을 위하여 전체적으로 참고로 개재하였다.
서열목록
(1) 일반 정보 :
(i) 출원인 :
(A) 성명 : 더 락커펠러 유니버시티
더 스크립스 리서치 인스티튜트
사이퍼젠 바이오시스템스, 인코오포레이티드
(ii) 발명의 명칭 : 생체고분자 래더의 제조 방법 및 분석 방법
(iii) 서열의 수 : 1
(iv) 서신 주소:
(A) 수신인 : 타운센드 앤드 타운센드 앤드 크루 엘엘피
(B) 스트리트 : 투 엠바카데로 센터, 8층
(C) 도시 : 샌프란시스코
(D) 주 : 캘리포니아
(E) 국가 : 미국
(F) ZIP : 94111
(v) 컴퓨터 판독 형태 :
(A) 매체 유형 : 플로피 디스크
(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환성
(C) 작동 체계 : PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어 : PatentIn Release #1.0, Version #1.25
(vi) 선행 출원 자료 :
(A) 출원 번호 :
(B) 출원 일자 :
(C) 분류 기호:
(vii) 종래 출원 데이터:
(A) 출원 번호 : 미국 08/474,997
(B) 출원 일자 : 1995년 6월 7일
(viii) 종래 출원 데이터:
(A) 출원 번호 : 미국 08/446,208
(B) 출원 일자 : 1995년 5월 19일
(ix) 종래 출원 데이터:
(A) 출원 번호 : 미국 08/341,555
(B) 출원 일자 : 1994년 11월 23일
(x) 종래 출원 데이터:
(A) 출원 번호 : 미국 07/891,177
(B) 출원 일자 : 1992년 5월 29일
(xi) 대리인 정보 :
(A) 성명 : 스토렐라, 존 알.
(B) 등록번호 : 32,944
(C) 참조번호 : 016866-000310PC
(xii) 통신 정보 :
(A) 전화 : 415-576-0200
(B) 팩스 : 415-576-0300
(2) 서열 번호 1 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 14 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자 종류 : 펩티드
(xi) 서열 : 서열 번호 1:

Claims (47)

  1. (i) 생체고분자의 분자들과 반응하여 종결 부를 첨가하는 종결 시약, 및
    (ii) 상기 생체고분자의 분자들의 말단으로부터 종결 단위를 제거하는 절단 시약과 생체고분자의 분자들 일체를 접촉시키는 것을 포함하며, 상기 종결부를 가진 생체고분자의 분자들로부터 종결 단위의 제거 속도가 종결부를 갖고 있지 않은 생체고분자 분자들로부터의 종결 단위의 제거 속도보다 느리고, 상기 생체고분자의 분자들은, 2 이상의 구성원으로 이루어진 생체고분자의 분자들의 수집물을 중첩형 군으로 생성시키기 위한 양과 조건하에서 절단 시약 및 종결 시약과 접촉시키는 것을 특징으로 하는 생체고분자 래더의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 절단 시약이 생체고분자의 분자들에 대한 종결 부의 첨가 반응을 촉매하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  3. 제2항에 있어서, 절단 시약이 생체고분자의 분자들로부터 비말단성 단위들의 제거를 촉매하는 속도가 절단 시약이 종결부의 첨가를 촉매하는 속도보다 큰 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  4. 제3항에 있어서, 생체고분자의 분자들이 펩티드인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  5. 제4항에 있어서, 절단 시약이 엑소펩티다제를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  6. 제5항에 있어서, 엑소펩티다제가 카르복시펩티다제인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  7. 제6항에 있어서, 카르복시펩티다제가 카르복시펩티다제 A, 카르복시펩티다제 P, 카르복시펩티다제 Y 또는 카르복시펩티다제 B인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  8. 제5항에 있어서, 엑소펩티다제가 아미노펩티다제인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  9. 제8항에 있어서, 아미노펩티다제가 류신 아미노펩티다제 또는 미소체 펩티다제인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  10. 제5항에 있어서, 엑소펩티다제가 폴리펩티다제인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  11. 제6항에 있어서, 종결 시약이 아미노산 아미드인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  12. 제11항에 있어서, 아미노산 아미드가 L-리신아미드인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  13. 제1항에 있어서, 종결 시약이 동위원소의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  14. 제3항에 있어서, 생체고분자의 분자들이 핵산 또는 복합 탄수화물인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  15. 제1항에 있어서, 절단 시약이 열안정성인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  16. 제15항에 있어서, 절단 시약이 열안정한 카르복시펩티다제인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  17. 제16항에 있어서, 열안정성 카르복시펩티다제가 카르복시펩티다제 Taq인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  18. 제15항에 있어서, 절단 시약이 열안정한 아미노펩티다제인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  19. 제18항에 있어서, 열안정한 아미노펩티다제가 바실러스 스테아로써모필러스, 스트렙토코커스 써모필러스, 스트렙토코커스 살리바리우스 아종 써모필러스 또는 설포로부스 설파타리쿠스중에서 발견된 아미노펩티다제인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  20. 제15항에 있어서, 반응 조건으로서 약 70℃ 내지 약 100℃ 사이의 온도에서 열안정한 절단 시약과 생체고분자의 분자들 일체를 접촉시키는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  21. 2 이상의 구성원을 갖는 생체고분자의 분자들의 수집물을 중첩형 군으로 함유하며, 이 구성원들이 동일한 종결 부를 가지며, 이 종결 부가 촉매적으로 첨가된 것인 생체고분자 래더.
  22. 제21항에 있어서, 생체고분자의 분자들이 펩티드인 것을 특징으로 하는 생체고분자 래더.
  23. 제22항에 있어서, 3 이상의 구성원들을 중첩형 군중에 함유하는 생체고분자 래더.
  24. 제23항에 있어서, 종결 부가 아미노산 아미드인 것을 특징으로 하는 생체고분자 래더.
  25. 제24항에 있어서, 종결 부가 L-리신아미드인 것을 특징으로 하는 생체고분자 래더.
  26. 제23항에 있어서, 종결 부가 n-아세틸 아미노산인 것을 특징으로 하는 생체고분자 래더.
  27. 제26항에 있어서, n-아세틸 아미노산이 n-아세틸 리신인 것을 특징으로 하는 생체고분자 래더.
  28. 제21항에 있어서, 생체고분자의 분자들이 핵산인 것을 특징으로 하는 생체고분자 래더.
  29. (a) 제1항의 방법에 따라서 2이상의 구성원들로 이루어진 생체고분자의 분자들의 수집물을 중첩형 군으로 함유하는 생체고분자 래더를 제조하는 단계;
    (b) 이 구성원들간의 질량차를 측정하는 단계; 및
    (c) 측정된 질량차와 단위들의 질량을 상호 연관지어 그 단위체들의 실체를 결정하는 단계로 구성되어, 생체고분자의 구조에 대한 정보를 수득하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 질량차를 측정하는 단계가 매트릭스내에 생체고분자의 분자들을 침착시키는 단계; 및 레이저를 가하여 상기 매트릭스로부터 생체고분자의 분자들을 탈착시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. a) (i) 폴리펩티드 분자들과 반응하여 종결 부를 첨가하는 종결 시약, 및
    (ii) 상기 폴리펩티드의 말단 펩티드 결합을 절단하여 말단 아미노산을 제거하는 절단 시약과 폴리펩티드 일체를 접촉시키며, 이 때 종결부를 가진 폴리펩티드분자들로부터 말단 단위의 제거 속도가 종결부를 갖고 있지 않은 폴리펩티드들로부터 말단 아미노산의 제거 속도보다 느리고, 상기 폴리펩티드는 2 이상의 구성원으로 이루어진 폴리펩티드들의 수집물을 중첩형 군으로 생성시키기 위한 양과 조건하에서 절단 시약 및 종결 시약과 접촉되는 것으로 이루어지는 단계들에 의해 폴리펩티드 래더를 제조하는 단계;
    b) 구성원들간의 질량차를 측정하는 단계; 및
    c) 측정된 질량차와 아미노산의 질량을 상호 연관지어 그 아미노산들의 실체를 결정하는 단계를 포함하며, 이로써 생체고분자 래더중의 질량차의 정도는 폴리펩티드중의 아미노산 서열을 나타내는 아미노산의 실체를 확인시켜 주는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대한 정보를 수득하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 절단 시약이 폴리펩티드 분자에 대한 종결 부의 첨가반응을 촉매하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 절단 시약이 생체고분자의 분자들로부터 비말단성 단위들의 제거반응을 촉매하는 속도가, 생체고분자의 분자들의 종결 단위들에 대한 종결부의 첨가반응을 촉매하는 속도보다 큰 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 절단 시약이 카르복시펩티다제인 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 종결 시약이 아미노산 아미드인 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 절단 시약이 카르복시펩티다제-Y를 포함하고, 종결 시약이 L-리신아미드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제33항에 있어서, 절단 시약이, 펩티드 결합의 절단 속도가 임의의 카르복시펩티다제 단독물을 사용했을 때의 절단 속도보다 아미노산들중에서 더욱 균일한 카르복시펩티다제 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제33항에 있어서, 질량차를 측정하는 단계가 폴리펩티드 래더를 질량 분광분석기로 처리하는 것으로 구성되는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 질량 분광분석법이 매트릭스-지원 레이저 탈착/이온화 질량 분광분석법인 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제38항에 있어서, 폴리펩티드가 약 5kDa 이하의 질량을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제38항에 있어서, 폴리펩티드가 약 3.5kDa 이하의 질량을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제31항에 있어서, 절단 시약이 열안정성인 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 절단 시약이 열안정한 카르복시펩티다제인 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 열안정한 카르복시펩티다제가 카르복시펩티다제 Taq인 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제42항에 있어서, 절단 시약이 열안정한 아미노펩티다제인 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제45항에 있어서, 열안정한 아미노펩티다제가 바실러스 스테아로써모필러스, 스트렙토코커스 써모필러스, 스트렙토코커스 살리바리우스 아종 써모필러스 또는 설포로부스 설파타리쿠스 유래의 아미노펩티다제인 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제42항에 있어서, 반응 조건으로서 약 70℃ 내지 약 100℃ 사이의 온도에서 열안정한 절단 시약과 생체고분자의 분자들 일체를 접촉시키는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
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