KR19980703665A - 세포 표면상 제 1 류 ｍｈｃ 단백질의 수준이 낮은 유전적으로변형된 세포의 이식 - Google Patents

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Abstract

포유 동물 세포는 바이러스 유도된 MHC 하향 조절 단백질을 코드화하는 유전자의 도입에 의해 유전적으로 변형된다. 이식에 적합한 세포를 도너로부터 취하여, 하나 이상의 바이러스 유도된 MHC 하향 조절 단백질을 코드화하는 발현 벡터로 트랜스펙션시킨다. 유전적으로 변형된 도너 세포를 생체외에서 팽창시키고, 경우에 따라, 수용자 포유동물 숙주에게 이식한다. 제 1 류 MHC 단백질의 감소된 수준은, 이식된 세포가 유전적으로 변형되지 않은 세포는 이와 다른 경우에 수용자 면역계통에 의해 공격받을 수 있는 조건하에서 생존하도록 한다. 도너 세포는 추가 변형되어 세포를 표적화하거나 포유동물 숙주내에서 도너 세포의 효과기 기능을 증진시킬 수 있다.

Description

세포 표면상 제 1 류 ＭＨＣ 단백질의 수준이 낮은 유전적으로 변형된 세포의 이식
질병 및 감염으로부터 척추동물을 보호하기 위한 정교한 보호 시스템이 발달되어 왔다. 포유 동물에 있어서, 면역 계통은 1차 방어로서의 역할을 하며, 많은 상이한 형태의 세포 및 메카니즘이 숙주, 주로 림프구 및 골수세포를 보호한다. 면역 계통은 자가 항원과 비자가 항원을 구별하는 능력을 전개시키는 림프구 계통의 세포로부터 유래된다. 비자가인 것으로 인지된 세포는 면역 계통에 의해 파괴되고, 이러한 인지는 바이러스 감염, 질병, 종양 항원의 비정상적인 발현, 외래 조직의 이식, 또는 기타 원인으로부터 유래된다.
주요 조직적합성 착체(MHC) 단백질은 자가 대 외래 인식에 대한 시스템에서 중요한 역할을 한다. 각각의 개체는 수개의 상이한 제 1 류 및 2 류 MHC 단백질 세트를 갖는다. MHC 단백질은 자가의 확인 물질로서 역할을 한다. 외래 항원은 일반적으로 자가 + X로 인식되며, 여기서 외래 펩티드에 결합된 자가-MHC의 조합이 인식된다. 이식이 동종 숙주로 이루어지는 경우, 이식 조직이 숙주에 적합한 MHC가 아니거나 숙주가 면역되지 않으면, 상기 이식 조직이 외래로서 인식되고, 면역 계통에 의해 파괴된다. 이식 조직이 면역적격 림프구 또는 단핵 세포를 포함하는 경우, 이식편은 외래로서 숙주를 공격할 수 있으며, 이에 따라 이식편에 대한 숙주 질병이 초래된다.
치료를 위해 수용자에 세포를 이식하고자 할 수 있는 상황이 많이 있다. 숙주가 면역된 경우, 개선된 효과기 기능을 위해 또는 감염된, 병이 든, 또는 기능장애의 세포 또는 암 세포를 치사시키기 위해 유전적으로 변형되거나 변형되지 않고, 특이적 백혈구, 특히 T-세포와 같은 림프구를 주입하여 보호 면역 반응을 제공하는 데 관심이 있을 수 있다. 기타 경우에, 당뇨병의 경우에 랑게르한스 섬, 파킨슨병의 경우에 도파민을 배설하는 세포, 다양한 조혈성 질환에서의 골수세포, 근소모성 질환에서의 근세포, 또는 시각 장애에서의 망막 상피 세포와 같은 특정 세포가 결여되어 있는 경우에, 유전자 생성물을 발현시키고 분비시키므로써 목적하는 기능을 수행할 수 있는 세포를 제공할 수 있는 것으로 바람직할 수 있다.
이식된 세포를 생존시키기 위해서, 이들 세포는 숙주에 의한 침입으로부터 안전해야 한다. 따라서, 이식 후에 작용성을 가질 세포를 생성하면서 수용자의 면역 계통에 의한 침입으로부터 안전한 효과적인 방법을 발견하는 데에 가치가 있다.
관련 문헌
바이러스 단백질에 의한 세포 표면상의 MHC 분자의 하향-조절이 마우슬레이(Maudsley) 및 파운드(Pound)의 문헌((1994)Immnology Today12:429-431)에 기재되어 있다. 아데노바이러스 E3/19 kd 단백질의 활성이 로우데스(Routes)등의 문헌((1993)J. Virol. 67:3176-3181)과 허미스톤(Hermiston)등의 문헌((1993)J. Virol.67:5289-5298))에 기재되어 있다. T-림프종 세포계내 아데노바이러스 E3/19 kd 단백질의 발현은 코너(Korner)와 버거트(Burgert)의 문헌((1994)J. Virol.68:1442-1448)에 기재되어 있다.
CD8+T 림프구에 대한 항원 정위(presentation)를 억제하는 데 있어서 단순 포진 바이러스 ICP47 단백질의 활성은 요크(York)등의 문헌((1994)Cell77:525-535)에 논의되어 있다. MHC 단백질 하향-조절과 관련된 사람 시토메갈로바이러스 단백질은 길버트(Gilbert)등의 문헌((1993) J. Virol. 67:3461-3469) 및 비어스마(Beersma)등의 문헌((1993)J. Immunol.151:4455-4464)에 기재되어 있다. 점액종 바이러스로 감염된 세포 표면으로부터의 제 1 류 MHC 분자의 바이러스 유도 손실은 보시노브(Boshnov)등의 문헌((1992)J. Immunol.148:881-887)에 기재되어 있다.
나림프구증(bare lymphocyte syndrome)은 설리반(Sullivan)등의 문헌((1985)J. Clin. Invest.76:75-79), 클레멘트(Clement)등의 문헌((1988)J. Clin. Invest.81:669-675), 및 흄(Hume)등의 문헌((1989)Human Immunology25:1-11)에 기재되어 있다.
발명의 요약
본 발명의 방법 및 조성물은 MHC 하향조절 단백질 발현이 결과로서 그의 세포 표면상에 제 1 류 MHC 분자의 수준이 감소된 세포의 이식을 위해 제공된다. 이식을 위한 적합한 세포는 도너로부터 얻어지며, 하나 이상의 바이러스 유도된 MHC 하향조절 단백질을 코드화하는 유전자를 함유하는 발현 벡터로 트랜스펙션된다. 상기 세포는 생체외로 확산되며, 경우에 따라, 수용 숙주에 이식된다. 제 1 류 MHC 단백질의 감소된 수준은 유전적으로 변형되지 않은 세포가 이와 다른 경우에 수용 숙주의 면역 계통에 의해 침입받기 쉬운 조건하에서 이식된 세포가 살아남도록 한다. 상기 세포는 추가로 유전적으로 변형되어 변형된 효과기 기능을 위해 또는 숙주내 감소된 또는 바이러스 감염된 세포를 표적화하기 위해 구성물을 포함할 수 있다.
본 발명은 유전적으로 변형된 세포 및 조직을 이식하여 농도가 낮은 제 1 류 MHC 분자를 치료를 위해 발현시키는 것에 관한 것이다.
도 1은 US11를 코드화하는 레트로바이러스로 형질도입되고, 하기 실시예 4에 기재된 바와 같은 HLA 제 1 류에 특이적인 FITC-컨쥬게이트된 항체로 염색된, 143B 골육종 세포의 형광 활성화 세포 분류(fluorescence activated cell sorter:FACS) 분포이다.
도 2는 하기 실시예 5에 기재된 바와 같이 HLA-A2-특이적 CTL에 의한 C1R-A2.1+ 표적물의 용해율을 나타낸 것이다. Y축은 특이적 용해율이고, X축은 효과기 대 표적물(E:T)이 비이다.
도 3은 US11 및 CD4-제타(상부) 또는 CD4-제타(저부)를 코드화하는 레트로바이러스로 형질도입되고, 하기 실시예 5에서 기재된 바와 같이 PE-컨쥬게이트된 항-CD4 항체(Y 축) 및 FITC-컨쥬게이트된 항-HLA 항체(X 축)로 표지화된 C1R-A2.1 세포의 FACS 분포이다.
도 4는 US11을 코드화하는 레트로바이러스로 형질도입되고, 하기 실시예 5에 기재된 바와 같이 FITC-컨쥬게이트된 항-HLA 제 1 류 항체로 염색된 C1R-A2.1의 FACS 분포이다.
도 5a는 하기 실시예 5에 기재된 바와 같이 HLA-A2-특이적 CTL에 의한 용해에 대한 US11을 코드화하는 레트로바이러스로 형질도입된 C1R-A2.1의 저항성을 나타낸다. 도 5b는 하기 실시예 5에 기재된 바와 같이 HLA-A2-특이적 CTL에 의한 용해에 대한 CD4-제타를 코드화하는 레트로바이러스로 형질도입된 C1R-A2.1의 감수성을 나타낸다. Y축은 특이적 용해율이고, X축은 효과기 대 표적물(E:T)이 비이다.
세포는 하나 이상의 바이러스 유도된 MHC 하향조절 단백질을 코드화하는 발현 구성물의 도입에 의해 이들의 표면상의 제 1 류 MHC 단백질을 감소시키도록 유전적으로 변형된다. 변형된 세포는 세포 또는 조직 이식에 사용될 수 있는 데, 이것은 이들 세포가 이식 수용자의 면역계통에 의한 치사에 대해 저항성이 있기 때문이다.
본 방법은 저수준으로 형질도입 또는 형질전환하는 것으로 알려져 있는 조혈성 간세포 및 T 림프구와 같은 세포를 변형하는 데 특히 유용하다. 제 1 류 MHC의 현저한 하향조절은 본 발명의 효과를 증진시키는 하나 이상의 방법을 사용하여 이러한 세포내에서 달성된다. 가치 있는 방법으로는, 특히 단일 mRNA 분자내로 다중 리보좀의 유입을 허용하는 벡터 엘리먼트(IRES 엘리먼트)와 결합하여 하향조절 유전자를 조합하는 방법, 시험관내 배양 동안에 유착 분자에 대한 유착 분자 또는 항체를 사용하므로써 시험간내 형질전환 또는 형질도입을 증진시키는 방법, 및 MHC 제 1 류 분자를 저수준으로 또는 형질전환 또는 형질 도입된 세포을 나타내는 마아커를 높은 수준으로 발현시키는 세포 서브군을 선택하는 방법을 사용하는 것을 포함한다. 또한, 변형된 T 세포의 사용이 천연 치사 세포에 의한 용해에 대해 세포의 감수성을 감소시키는 시험관내 배양 기술에 의해 증진될 수 있다.
이식된 도너 세포의 거부는 도너 세포에 의해 발현된 이식 항체에 의해 매개된다. 주이식 항체는 제 1 류 및 제 2 류 MHC 단백질이다. 제 1 류 분자내 결여된 세포는 일반적으로 세포융해 T 세포에 의해 인식되지 않으며, 이에 따라 여러 개체에 이식되고, 유지될 수 있다. 본 발명의 제 1 류 MHC 단백질의 하향조절은 그의 생성물이 숙주 세포내 제 1 류 MHC 단백질의 세포 표면 발현을 억제하는 바이러스 유도된 유전자를 포함하는 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하므로써 달성된다.
포유 동물 MHC 제 1 류 분자는 MHC 위치내 유전자에 의해 코드화된 알파쇄, β2-미크로글로불린 경쇄 및 내인성 세포 단백질 또는 외래 단백질의 세포내 단백질 분해 퇴해응로부터 유도된 소펩티드로 이루어진 비공유의 세분자 착체이다. 완전한 제 1 류 분자는 소포체내에서 그의 성분으로부터 세포내적으로 회합된다. 완전한 착체의 회합시에만 완전한 제 1 류 MHC 분자가 원형질막에 이식된다. 본 발명에서, 제 1 류 MHC 발현의 후해독 억제는 바이러스 유도된 MHC 하향조절 단백질의 도입에 의해 달성된다.
가치 있는 MHC 하향조절 단백질은 사람 아데노바이러스형 2 E3/19kd 유전자(서열번호 1) 및 사람 아데노바이러스형 5 E3/19kd 유전자(서열번호 2), 단순포진 바이러스 ICP47 유전자(서열번호 3), 사람 시토메갈로바이러스 유전자 US11(서열번호 4), 사람 시토메갈로바이러스 유전자 US5(서열번호 5)등이 포함된다. 하향조절 제 1 류 MHC 발현에 공지된 기타 바이러스에는 점액종 바이러스 및 토끼 섬유종 바이러스가 포함되며, 이로부터 본 발명에 유용한 하향조절 유전자가 사용될 수 있다.
변형을 위한 세포는 정상의, 즉 시험관내 기타 세포와의 세포 치료, 연구, 상호작용등에 사용될 수 있는 가치 있는 형질전환되지 않은 포유동물의 세포일 수 있다. 적합한 세포에는 케라티노사이트와 같은 표피 세포, 망막 상피 세포, 근모세포, 조혈성 간세포 및 T 림프구와 같은 조혈성 세포, 소정맥 및 동맥 상피 세포를 포함하는 상피 세포, 근모세포, 랑게르한스 섬으로부터의 β-세포 및 시험관내에서 용이하게 조작될 수 있는 기타 세포가 포함된다. 상기 세포는 경우에 따라 배양으로 유지되거나 팽찰될 수 있으며, 세포가 오랜 기간 동안 생존하고, 기능성을 가질 수 있는 숙주에 도입될 수 있다.
가치있는 조혈성 세포에는 림프절로부터 단리된 T-세포와 같은 미성숙한 또는 성숙한 림프구, 말초혈등이 포함된다. T 세포는 수집후에 특이적 서브셋(subset) 또는 특이성에 따라 분리될 수 있다. 특히 가치 있는 세포는 항원 특이적 T 세포이다. 특정 항원 특이성을 갖는 다량의 T-세포는 당업에 공지된 바와 같이 항원 자극 및 시험관내 배양에 의해 생성될 수 있다[참조: Lamers et al.(1992) Int. J. Cancer 51:973-979]. 특히 가치 있는 세포는 특이적 표적물로 변경된 효과기 기능을 갖도록 또는 반응성, 예를 들어 세포독성이 있도록 유전적으로 변형된 동종 T 세포이다. 예를 들어, T 세포는 유전적으로 변형되어, MHC 하향 조절 유전자를 발현시키는 것 이외에, 1994년 10월 25일자로 허여된 미국 특허 제 5,359,046호에 기재된 바와 같이 키메라 수용체를 발현시켜 발병된 또는 감염된 세포 또는 암세포를 표적화할 수 있다.
표피 세포는 피부 부위로부터 조직 샘플의 분리와 당업에 공지된 통상적인 방법에 의해 가치있는 서브셋의 분리에 의해 수집될 수 있다.
변형시키려는 세포는 포유동물 숙주에 도입되거나 연구 또는 기타 목적으로 사용되는 경우에 특정 기능을 달성하도록 선택될 것이다. 또한, 가치 있는 세포는 상기 어느 세포에 대해 프로제니터(progenitor)로서 작용하는 간세포일 수 있으며, 이는 최초 프로제니터 또는 이미 특정 계통으로 지정된 프로제니터 세포일 수 있다.
변형을 위한 세포는 적합한 도너로부터 수집된다. 일반적으로 도너는 수용자와 관련하여 비자가성, 예를 들어, 동종일 수 있다. 그러나, 몇몇 경우에, 특히 자가면역 질환과 관련된 경우에, 도너는 자가성일 것이다. 이러한 세포는 뮤린 및 기타 설치동물, 토끼, 돼지, 고양이과 동물, 소과 동물, 개과 동물, 영장류 동물등, 특히 사람을 포함하는 포유동물 숙주로부터 얻을 수 있다.
수집 방법은 세포의 특성에 의존할 것이다. 수혈성 세포는 태아, 신생아 및 성인의 세포가 있으며, 태아 간, 골수, 림프성 조직 또는 혈액, 특히 프로제니터 세포 부동화제, 예를 들어, 당업에 공지된 G-CST, GM-CSF등으로 처리된 말초혈로부터 수집될 수 있다. 조혈성 세포를 가치 있는 서브셋으로 분리시키는 것은 현탁분리, 밀도 분리, 류코포레시스(leukophoresis), 플로우 시메트리(flow cymetry), 고구배 또는 저구배 자성 분리등을 포함하는 당업에 공지된 다수의 방법에 의해 수행될 수 있다.
특히 가치 있는 세포는 배아층으로부터의 케라티노사이트 간세포이다. 정상 점액종은 태아, 신생아 또는 성인 조직을 포함할 수 있는 조직 샘플로부터 얻어진다. 사지, 몸통 및 안외와 같은 여러 근육이 사용될 수 잇다. 이러한 세포는 유전적 변형전에 분리될 수 있다.
수집후, 바이러스 유도된 MHC 하향조절 유전자의 발현을 위해 제공되는 DAN 또는 RNA 구성물은 핵산을 도입하기 위한 표준 방법을 사용하여 셀에 도입된다. 이러한 재조합 구성물은 상술된 바와 같이 하나 이상의 하향조절 유전자를 포함할 것이다. 많은 경우에, 하나 이상의 하향조절 단백질을 도입하는 하여, 특히 작용 형태가 상이한 단백질을 결합시켜 부가적 또는 상승적 효과를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 가치 있는 조합은 서열 번호 3과 결합된 서열 번호 1 또는 서열번호 2, 서열 번호 4와 결합된 서열 번호 1 또는 서열번호 2, 서열 번호 5와 결합된 서열 번호 1 또는 서열번호 2, 서열번호 4와 결합된 서열번호 3, 서열번호 5와 결합된 서열번호 3, 서열번호 5와 결합된 서열번호 4등이 포함된다. 결합된 서열은 단일 벡터상에 나타날 수 있으며, 또는 연달아 또는 함께 세포에 도입된 개개의 벡터상에 도입될 수 있다.
하향조절 유전자의 발현 또는 유전자의 조합은 제 1 류 MCH 분자의 수준을 변형되지 않은 세포와 비교하여 약 70% 이상, 보다 일반적으로는 약 80% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상 감소시키는 것이 바람직할 것이다. 발현의 수준은 세포의 활성 상태에 의해 영향받을 수 있으며, 잠재 세포는 활성화된 세포와 비교될 경우, MHC 분자를 감소시킬 수 있다. MHC 분자의 표면 발현에 대한 검출 및 정량화는 당업에 공지된 바와 같이 표준 면역검정법, 항체 염색법 및 플로우 시메트리등에 의해 수행될 수 있다.
몇몇 경우에, 단일 유전자 보다는 두개 이상의 제 1 류 억제 유전자의 조합으로 HLA 제 1 류를 보다 크게 감소시킬 수 있다. 결과적으로, 동종 세포가 제 1 류-반응 CTL에 훨씬 더 저항성이 있으며, 동종 수용자로 이식할 때 보다 오래 생존할 수 있으므로, 면역 거부 반응에 대해 내성이 보다 크다. 여러 제 1 류 억제 유전자가 HLA 제 1 류 발현을 감소시키는 독특한 메카니즘을 사용한다. 예를 들어, 시토메갈로바이러스(CMV)로부터의 US11은 제 1 류 HLA 중쇄를 소포체로부터 중쇄가 신속하게 분해되는 시토졸로 탈구시키는 원인이 된다[참조:Wiertz(1996)Cell84:769; Jones(1995)J. Virol, 69:4830]. 단순 포진 바이러스(HSV)로부터의 ICP47은 TAP 펩티드 운반 착체에 결합하고, 중쇄 결합 펩티드의 소포체 전좌에 대해 시토졸을 차단하며, 이에 따라 중쇄-펩티드-β2-미크로글로불린 삼량체 착체의 형성 및 운반을 억제한다. 결과적으로, 제 1 류 중쇄는 안정한 착체를 형성하지 않으며, 소포체내에 존속된다[참조: Hill(1995)Nature375:411; Fruh(1995)Nature375:415; York et al.(1994) 상기 문헌]. 아데노바이러스형 2 및 5의 E3/19 단백질은 소포체에 존재하며, 제 1 류 HLA 중쇄의 루우멘( lumen) 도메인에 결합하므로서 추가 운반을 억제한다[참조: Gooding(1990)Crit. Rev. Immunol.10:53; Paabo(1989)Adv. Cancer Res.52:151; Wold(1989)Mol. Biol. Med.6:433; Wold(1991)Life Sci. Adv.10:89; Wold(1991)Virol.184:1]. 제 1 류 HLA의 억제에 대한 상이한 메카니즘의 결과, 두개의 유전자의 동시 발현은 제 1 류 감소에 대한 증가 효과를 가질 수 있다.
사용될 구성물은 재조합 구성물에 결합되지 않은 세포에 대한 것으로서 제 1 류 억제 유전자를 운반하는 DAN가 결합되지 않은 세포를 선택하게 하는 마아커를 포함하는 것이 일반적이다. 다양한 마아커가 존재하며, 특히 G418, 히그로마이신등에 대한 저항 물질과 같은 항생 저항 마아커가 존재한다. 대안으로, 네가티브 선택법이 사용될 수 있으며, 여기서 마아커는 HSV-tk 유전자이며, 이는 에이사이클로비어(acyclovir) 및 간사이클로비어(gancyclovir)과 같은 시제에 민간함 세포를 형성시킬 것이다.
구성물은 종래의 여러 방법으로 제조될 수 있다. 긴 말단 반복, 마아커 유전자 및 제한 부위와 같은 바람직한 특성을 제공하는 다양한 벡터를 사용할 수 있다. 적합한 플라즈미드에 벡터를 도입시킬 수 있으며, 적당한 전사 및 해독 개시 및 말단 영역으로 목적하는 유전자를 제한, 삽입에 의해 벡터를 조작한 후, 적당한 패키징(pakaging) 숙주로 플라즈미드를 도입시킨다. 각각의 조작에 있어서, 적합한 원시핵세포 숙주로 플라즈미드를 성장시키고, 목적하는 구성물이 얻어지는 것을 보장하는 구성물을 분석한 후, 구성물을 추가 조작할 수 있다. 완료되면, 이후 플라즈미드 또는 삭제된 바이러스는 유전적 변형에 사용하기 위한 바이러스 분자의 패키징 및 단리를 위해 패키징 숙주에 도입될 수 있다.
재조합 구성물은 추가 변형되어 하향조절 서열이외의 기능적 실재물을 포함하며, 이는 숙주세포의 구성물질, 증폭물질, 형질전환물질등을 제조하는 데 사용될 수 있다.
하향조절 유전자의 삽입에 유용한 구성물은 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 및 아데노 관련 바이러스 벡터를 포함한다. 레트로바이러스에 관하면, 레트로바이러스, 및 캡시드(capsid) 단백질이 사람 세포를 감염시키는 데 작용을 하는 적당한 패키징계의 조합이 본 발명에 적합할 수 있다. 다양한 양영양성(amphotropic) 바이러스-생성 세포계, 예를 들어, PA12(Miller et al.(1985)Mol. Cell. Biol.5:431-437), PA317(Miller et al.(1986)Mol. Cell. Biol.6:2895-2902), 및 CRIP(Danos et al.(1988)PANS85:6460-6464)이 공지되어 있다. 특히 가치 있는 것은 제 1 사람 T 림프구의 형질도입을 위한kat레트로바이러스 계통이다[참조: Finer et al. (1994) Blood 83:43-50 및 WO94/29438].
하향조절 유전자의 전사는 레트로바이러스 LTR 또는 내프로모터, 예를 들어, 포유동물 포스포글리세레이트 키나아제, 베타 악틴 프로모터, 또는 SR-알파 프로모터와 같은 하이브리드 SW40/HTLV-1 프로모터로부터 조절될 수 있다[참조: Takebe et al.(1988)Mol. and Cell. Biol.8:466]. 하나 이상의 하향조절 유전자를 함유하거나, 선택성 마아커와 같은 또 다른 유전자를 또한 함유하는 레트로바이러스 벡터는 멀티시스트론(multicistron) 전령 RNA를 발현시키는 레트로바이러스를 제조하여 구성될 수 있다. 이러한 멀티시스트론 mRNA는 단일 RNA 분자로부터 하나 이상의 단백질을 효과적으로 해독하도록 하는 내리보좀 유입 부위(IRES 엘리먼트)를 함유한다. IRES 엘리먼트는 소아마비바이러스, 뇌심근염 바이러스(ECMW) 및 관련 바이러스와 같은 피코르나바이러스 또는 기타 바이러스 또는 세포 유전자의 기능 동등물로부터 유도될 수 있다[참조: Pelletier and Songnberg(1988)Nature334:320-325; Jang et al.(1989)J. Virol.63:1651-1660; Ghatta et al.(1991)Mol. Cell. Biol.11:5848-5859].
두 개 이상의 하향조절 유전자를 함유하는 레트로바이러스는, 특히 조혈성 간세포 및 기타 제 1 림프양 세포와 같은 형질도입에 저항성이 있는 세포에서의 제 1 류 분자의 발현을 감소시키는 데 사용한다. IRES 엘리먼트는 또한 신규 귀환 수용체, 시토킨, 시토킨 수용체, 세포 생존 유전자 및 자살 유전자와 같은 추가 단백질을 발현시키는 레트로바이러스를 구성하는 데 사용될 수 있다. 아데노바이러스 벡터에 대해서는 왕(Wang)등의 문헌((1995)Gene Therapy2:775-783)에 기재된 바와 같이 당업에 널리 공지된 방법이 사용될 수 있다.
하나 이상의 하향조절 유전자는 또한 당업에 널리 공지된 방법에 의해 단일 하향조절 유전자를 코드화하는 레트로바이러스로 표적 세포를 연속적으로 형질도입시켜 표적 세포에 도입될 수 있다. 대안으로, 두 개 이상의 하향조절 유전자는 표적 세포의 표면상의 상이한 수용체와 상호작용하는 외피 단백질을 포함하는 바이러스로 패키징되는 재조합 레트로바이러스 벡터와 동시에 표적 세포를 형질도입시키므로써 표적 세포에 도입될 수 있다. 예를 들어, US11을 코드화하는 구성물은 양영양성 외피 단백질을 포함하는 바이러스에 패키징될 수 있으며, Ad2E3/E19를 코드화하는 구성물은 기본 아페 류케미아 바이러스(Gibbon Ape Leukemia Virus) 외피 단백질(미국 특허 제 5,470,726)을 함유하는 바이러스에 패키징될 수 있다.
세포의 형질도입은 배지에서 24시간 이상 동안 세포 및 바이러스를 인큐베이션하므로써 달성될 수 있다. 이후, 상기 세포를 약 2주 이상 동안 배지에서 성장시키고, 이식전 약 5주 이상 동안 성장시킬 수 있다.
본 DNA구성물을 도입한 후, 목적하는 표현형을 나타내는 세포를 제한 분석법, 전기영동법, 서던 블롯(Southern blot) 분석법, 폴리머라제 연쇄 반응, 도너 제 1 류 MHC α 사슬 또는 β2-미크로글로불린에 특이적인 항체로 염색하는 방법 등에 의해 추가 분석할 수 있다. 이후, 형성된 세포는 실질적으로 표면상에 제 1 류 MHC 항원이 전혀 발현되지 않는 것을 보장하기 위해 스크린닝될 것이다. 필요에 따라, 플로우 시토메트리, 고구배 자성 분리법등과 같은 선택 방법은 제 1 류 MHC 발현이 낮은 세포를 풍부하게 하는 데 사용될 수 있다.
분리를 위한 마아커로는 광범위하게 다양한 형광 또는 자성 표지된 분자가 사용될 수 있으며, 이는 MHC 항원을 확인하는 세포 마아커에 특이적인 항원에 대해 표지물로서 컨쥬게이트될 수 있다. 입수할 수 있는 형광 마아커는 플루오레세인(fluorescein), 텍사스 레드(Texas Red), 피코빌리단백질, 알로피코시아닌(allophycocyanin), 시아닌 유도체, 로다민(rhodamin) 및 표면 마아커에 대한 탄뎀(tandem) 컨쥬게이트를 포함한다.
이후, 세포는 확장을 위해 적당한 영양 배지에서 성장되고, 다양한 방법으로 사용될 수 있다. 세포는 이식에 사용되어존재하는 조직의 일부가 될 수 있으며, 또는 성장하여 비동계 숙주에 이식하기 위해 조직을 형성할 수 있다. 예를 들어, 케라티노사이트로, 세포가 화상의 경우에 피부를 교체하기 위해 사용될 수 있는 데, 케라티노사이트는 성장하여 적용전에 연속층을 형성할 수 있다. 유사하게, 케라티노사이트는 또 다른 부위에 사용하기 위해 숙주로부터 제거된 피부를 교체하기 위한 플라스틱 외과수술의 경우에 사용될 수 있다. 케라티노사이트의 기타 용도는 욕창성 궤양의 이식을 포함한다. 랑게르산 섬의 경우에, 케라티노사이트는 성장되어 인슐린을 생성하기 위해 숙주에 삽입되도록 캡슐로 또는 이와 다르게 도입될 수 있다. 망막 상피 세포의 경우에, 케라티노사이트는 반상 변성과 같은 시각 장애를 치료하기 위해 눈의 망막하 공간에 주입될 수 있다. 면역 세포의 경우에, 케라티노사이트는 면역 결함을 치료하기 위해 혈류 또는 그밖의 곳에 주입될 수 있다. 근모세포의 경우에, 케라티노사이트는 뒤시엔느(Duchenne) 근이양양증과 같은 근소모 질환을 치료하기 위해 여러 부위에 주입될 수 있다. 기관 이식을 위해, 심장 또는 간의 이종 이식과 같은 비-동계 조직의 이식이 관련된 종에서 수행될 수 있다.
이식, 특히 림프양 세포 및 조혈성 간세포의 이식에 대한 유전적으로 변형된 도너 세포의 사용에 대한 장애중 하나는 시험관내 이러한 세포의 효과적인 형질도입을 얻는 데 어려움이 있다는 것이다. 형질도입 동안에 조직 배양 플레이트에 대한 피복물로서 유착 분자에 대한 유착 분자 및 항체의 사용은 레트로바이러스 형질도입의 효율을 증가시키는 역할을 한다(계류중인 미국 특허 출원 제 08/517,488에 기재됨). 간 세포에 대해, 유착 분자는 피브로넥틴(fibronectin) 또는 피브로넥틴의 CS-1 도메인일 수 있다. VLA-4, VLA-5, CD29, CD11a, CD11b 및 CD44에 대한 항체가 사용될 수 있다. T 세포에 대해서는, ICAM-1 또는 LFA-3 유착 분자, 또는 CD2 또는 LFA-1에 대한 항체가 사용될 수 있다. B 세포에 대해서는, gp39 분자 또는 CD40에 대한 항체가 사용될 수 있다.
레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 AVV 벡터는 또한 이식된 세포내 치료 단백질의 도입을 위한 역할을 하며, 여기서 단백질은 세포내에 보유되거나 분비될 수 있다. 단백질의 생성은 성장 인자(예를 들어, G-, M- 및 GM-CSF, 표피 성장 인자, 혈소판 유도된 성장 인자, 형질전환 성장 인자등), 인터류킨과 같은 림포킨, ACTH, 소마토메딘(somatomedin), 인슐린, 안지오텐신등과 같은 호르몬, 인자 VIIIC와 같은 응고 인자, 아데노신 데아미나제와 같은 유전적 질병과 관련된 단백질 또는 낭성섬유증과 관련된 단백질의 정상 변형, α1-항트립신과 같은 보호제, L-도파민의 생성을 위한 티롭신 히드록실라제의 발현과 같은 아미노산 유리 생성물의 생성과 관련된 조절 단백질 또는 효소등이 포함될 수 있다. 유전자는 구성 프로모터 또는 유도 프로모터(인핸서 서열을 포함)의 전사 조절하에 있을 수 있다. 후자의 상황에서, 조절은 천연 시그날에 의한 유도 또는 외인성 시그날의 숙주로의 도입에 따라 이루어질 수 잇다.
치료 단백질 이외에, 병에 걸린 또는 기능 장애 세포를 표적화하거나 효과기 기능을 증진시키기는 도너 세포를 재유도하기 위한 단백질을 코드화하는 유전자는 상기 벡터상에, 또는 도너 세포로 도입을 위한 별도의 벡터상에 포함될 수 있다.
세포, 관련된 치료법 및 질병의 특성에 따라, 세포는 특정 부위에 지속시키기 위한 용기내 도입되는 층으로서, 또는 비활성 매트릭스 또는 매트릭스와 관계 없이 주입된 고체 매스(mass)로서 사용될 수 있다. 투여된 세포의 수는 특정 적용 및 세포가 투여되는 방법에 따라 광범위하게 다양할 것이다. 투여는 적당한 부위에 주사, 국부 도포 또는 절개 및 배치에 의해 이루어질 수 있다.
변형된 세포로 사용되는 면역억제 섭생의 수준은 변형되지 않은 세포로의 유사 치료에 정상적으로 사용될 수 있는 것보다 실질적으로 덜 엄격하다. 변형된 세포의 존속을 위해 요구되는 면역억제량은 위험하지 않은 조직적하벙 부위에서의 도너 및 수용자 세포간의 적합 특성, 숙주 면역 계통의 활성 수준, 세포가 도입되는 방법. 외래 세포가 도입되는 특정 부위 및 이식된 세포의 유형 및 수에 따라 다양할 것이다. 사용될 수 있는 섭생은 동종 조직의 이식과 관련된 존재하는 섭생을 기본으로 할 수 있다. 따라서, 상이한 상황 및 환자에 따라 투여량, 투여수, 투여 및 제형 방식이 설정될 수 있다.
본 발명은 면역 억제의 부작용을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기에서 감소는 더 낮은 용량, 감소되 투여 횟수, 약제의 투여의 개시의 지연 및 이들의 조합의 결과로서 일어날 수 있다. 면역 억제 치료는 이식 및/또는 면역계통을 모니터하고, 거부의 개시시에 또는 바람직하게는 개시 전에 이식체를 유지시키도록 면역 억제제의 투여를 조절함으로써 거부의 개시를 방지하도록 유지될 수 있다.
면역 억제법은 많은 형태를 가질 수 있고, 이들 형태의 조합일 수 있다. 면역 억제법은 방사선 조사, 화학요법, 특정 면역 억제제 등을 포함한다. 시클로스포린 A, 시클로스포린 G 및 FK-506; 아자티오프린, 코르티코스테로이드, 예를 들어 프레드니솔론 및 메틸 프레디노솔론, 임파성 및/또는 미엘로이드계의 여러 표면막 단백질에 대한 단클론성 항체 등과 같은 면역 억제제가 특히 중요하다.
초기 투여 수준으로서 정상적으로 사용되는 것에 필적하거나, 어느 정도 더 낮은 면역 억제 수준을 초기에 사용한 후, 투여 수준을 원래 수준의 75% 이하로, 바람직하게는 원래 수준의 60% 이하로 신속하게 감소시킬 수 있다. 50% 이하의 수준이 자주 사용될 수 있다.
하기의 실시예는 예시를 위해 제공되며, 제한을 위한 것은 아니다.
실시예 1
MHC 하향 조절 유전자 발현 인자의 구성
US5 및 US11 사람 시토메갈로바이러스(HCMV) 유전자의 단리.
본 실시예는 US11 유전자를 코드화시키는 pTUS11.4N의 구성을 기술하는 것이다.
107개의 사람 섬유아세포를 HCMV의 타운 변형체로 감염시켰다. 3일 후, 100% 세포 변성 효과의 시점에서, 바이러스를 고속 원심분리에 의해 배양액 상등액으로부터 모은 후, -70℃에서 동결시켰다. 바이러스 DNA를 표준 방법에 의해 녹은 바이러스로부터 단리시켰다.
단리시킨 바이러스 DNA를 제조업자의 지시에 따라 Taq 폴리머라아제와의 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)에 증폭시켰다. 올리고누클레오티드 프라이머를 특히 US5(서열번호 5) 및 US11(서열 번호 4) 리딩 프레임을 증폭시키도록 설계하고 제조하였다. US5에 대한 프라이머는 다음과 같다 : (서열 번호 6) 5'GCCACCATGCATACACAACGGGCC3'; (서열 번호 7) 5'TCCTAGCCACCGGTTGTTA3'. US11에 대한 프라이머는 다음과 같다 : (서열 번호 8) 5'GCCACCATGAACCTTGTAATG3'; (서열 번호 9) 5'TCAGTCTATATATCACCACTGG3'.
PCR 증폭 DNA 생성물을 정제 아가로오스 겔(0.8% 아가로오스, 1X TAE 완충액) 상에서 전기영동시켰다. 648 및 381 bp에서 띠를 절제하고, 페놀 클로로포름으로 2X로 추출시키고, 에탄올을 침전시키고, 10 mM Tris, 1 mM EDTA 중에 재현탁시켰다. 단리된 단편을 PCR II 클로닝 벡터(제조업자의 지시에 따른 인비트로겐)에 결찰시켰다.
경쟁 E. coli One Shot(상표명)(인비트로겐, 산 디에고, CA)를 결찰된 벡터에 의해 형질전환시켰다. 형질전환체를 암피실린의 존재하의 성장에 의해 선택하였다. 적절한 삽입체를 함유하는 형질전환체를 적절한 프라이머 세트에 의한 PCR 증폭에 의해 확인한 후, 증폭 생성물을 겔 전기영동시키고, 적절한 크기의 띠를 검출하였다. 정확한 DNA 서열을 함유하는 플라즈미드를 정제하였다.
단순 포진 바이러스(HSV-1) ICP47 유전자의 단리.
본 실시예는 ICP47 유전자를 코드화시키는 pICP47의 구성을 기술하는 것이다.
107개의 베로 세포를 0.01의 MOI에서 HCMV로 감염시켰다. 4일 후, 바이러스를 고속 원심분리에 의해 배양액으로부터 모은 후, -70℃에서 동결시켰다. 바이러스 DNA를 표준 방법에 의해 녹은 바이러스로부터 단리시켰다. ICP47 유전자를 (서열 번호 3, 1-20) 및 (서열 번호 3, 247-267)에 상응하는 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 증폭 생성물을 상기 기술된 바와 같이 pCR II 벡터에 결찰시켰다.
아데노바이러스 타입 2 (Ad2) E3/19 KD 유전자의 단리.
본 실시예는 아데노바이러스 2로부터의 E3/19 유전자를 코드화시키는 pCRII.Ad2.E3/19의 구성을 기술하는 것이다.
Ad2의 E3 전사 단위를 포함하는 EcoRV C 단편을 문헌[Korner et al. (1992) P.N.A.S. 89:11857-11861]에 기술된 바와 같이 클로닝시켰다. E3 유전자를 경쟁 E3/19 kD 유전자를 플랭킹하는 올리고누클레오티드를 사용하여 PCR에 의해 플라즈미드로부터 증폭시켰다. 증폭 생성물을 상기 기술된 바와 같이 pCRII 벡터에 결찰시켰다.
아데노바이러스 타입 5 (Ad) E3/19 KD 유전자의 단리.
본 실시예는 아데노바이러스 5로부터의 E3/19 유전자를 코드화시키는 pCR3.Ad5 E3/19의 구성을 기술하는 것이다.
유전자를 문헌[Wold et al. (1985) J. Biol. Chem. 260:2424-2431]에 기술된 바와 같이 단리시키고, pCR3-Uni 벡터(인비트로겐) 내로 클로닝시켰다.
레트로바이러스 벡터의 구성 및 바이러스의 생성.
문헌[Finer et al. (1994) Blood 83:43]에 기술된 것과 유사한 레트로바이러스 벡터 및 패키징 세포주를 사용하였다. 서열 번호 1; 서열 번호 2; 서열 번호 3; 서열 번호 4; 및 서열 번호 5를 코드화시키는 DNA 단편을 EcoRI 제한 엔도누클레아제에 의한 소화에 의해 플라즈미드로부터 절제하고, 정제 겔 전기영동에 의해 정제하였다. 정제된 DNA 단편을 레트로바이러스 벡터 rkat2에 결찰시켰다 [Finer et al., supra]. 레트로바이러스 벡터 내에 삽입된 하향 조절 유전자를 함유하는 재조합 플라즈미드를 적절한 프라이머 세트를 사용하여 PCR 증폭에 의해 확인한 후, 증폭 생성물을 전기영동시키고, 적절한 크기의 띠를 확인하였다. 하향 조절 유전자를 함유하는 재조합 플라즈미드를 문헌[Molecula Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis, CSHL, Cold Spring Harbor, NY, 1989]에 기술된 바와 같이 제조하였다.
사람 T 임파구의 정제, 자극 및 배양.
T 세포를 적합한 면역 경쟁 사람 도우너로부의 말초 혈액의 샘플로부터 단리시켰다. 단핵 세포를 Ficoll-Paque(Pharmacia, Uppsala, Sweden) 밀도 그래디언트 원심분리(20℃에서, 20분 동안 600g)에 의해 단리시켰다. 원심분리 후에, 인터파지 세포를 모으고, 완충액 중에 재현탁시키고, 300x g에서 침전시킨 후, 완충액 중에 다시 한번 재현탁시키고, 200x g에서 원심분리시켜서 혈소판을 제거하였다. 다클론성 마우스 항-CD8 또는 항-CD4를 세포 현탁액에 첨가하고, 얼음 위에서 15분 동안 인큐베이팅시켰다. 세포를 세척하고, FITC 콘쥬게이트 항-마우스 항체를 세포에 첨가하였다. 세포를 인큐베이팅시키고, 세척하고, CD8 포지티브 및 CD4 포지티브 세포에 대한 흐름 시토메트리에 의해 분류하였다. 정제된 T 세포를 생체내에서 인터로이킨-2, T 세포 수용체/CD3 착물, 예를 들어 문헌[Lamers et al. (1992) Int. J. Cancer 51:973-979, and Riddell and Greenberg (1990) J. Immunological Methods 128:189-201]에 기술된 바와 같은 항-CD3으로 배양시켰다.
레트로바이러스 중개 유전자 전달.
배양 약 5일 후, 레트로바이러스를 1-10의 MOI에서 2-8㎍/㎖ 폴리브렌과 함께 세포에 첨가하였다. 1 내지 3 분취량의 바이러스를 2 내지 3일 동안 1일 간격으로 첨가하였다. 세포를 후속적으로 세척한 후, IL-2의 존재하에 재배양시켰다. 형질 도입 후 수일 내에, T 세포를 형질 도입된 유전자의 발현을 위해 분석하고, 발현 세포를 비발현 세포로부터 분리하였다. 세포를 팬(pan) 특이적 또는 도우너 특이적 항-제 1류 MHC 단클론성 항체를 사용하여 세포 표면 제 1 류 MHC 분자의 발현을 위해 변형시켰다. 유전자 발현 제 1 류 결핍 형질 도입 세포를 형광 활성화 세포 분류에 의해 비발현 형질 도입 세포로부터 분리하였다. 형질 도입 유전자의 존재의 확인을 바이러스 유도 유전자에 대해 특이적인 프라이머를 사용하여 PCR 증폭에 의해 수행하였다.
하향 조절 유전자의 조합.
상기 제조된 T 세포를 동일한 바이러스 감염 방법을 사용하여 제 2 하향 조절 유전자로 형질 도입시켰다.
실시예 2
이종 조혈 간세포의 이식
본 실시예는 세포 표면 상에서 제 1 류 MHC 분자를 하향 조절하도록 유전적으로 변형된 이종 조혈 간세포의 사람 수용체 내로의 이식을 의한 방법을 제공한다.
도우너는 5㎍/㎏/일의 용량으로 피하적으로 제공되는 GM-CSF이다. 가동화 후 6일, 8일 및 9일째에, 말초 혈액을 모았다. 류코포레시스를 말초 혈액 단핵 세포를 모으도록 설정된 9ℓ, 3시간 처리를 사용하여 수행하였다 [참조예 : L. Campos, et al., (1993) Leukemia 7:1409-15; A. Grigg et al. (1993) Bone Marrow Transplant 11, Suppl. 2:23-9]. 형질전환된 날에, CD34+세포를 CellPro LC34 친화성 칼럼(CellPro, Bothell, WA)를 사용하여 단리시켰다. 회수된 세포를 사전 자극 동안 48시간 동안 100 ng/㎖ huSCF, 50 ng/㎖ huIL-3, 10 ng/㎖ huIL-6 및 10-6M 하이드로코르티손을 함유하는 Myelocult H5100 매질(Stem Cell Technologies Inc., Vancouver, B.C.) 중에 플레이팅시켰다.
간세포내로 하향조절 유전자를 도입시키기 위한 형질도입 방법은 본질적으로는 실시예 1에 기술한 바와 동일하다. 형질 도입 이후에, 293 세포 증식을 억제하기 위해서 100ng/㎖ hu SCF, 50ng/㎖ hu IL-3, 10ng/㎖ hu IL-6, 및 10μM 간사이클로버(gancyclovir)를 첨가하면서 세포를 체외의 미엘로커트(Myelocut) 배지중에서 팽창 분화시켰다. 이들 293 세포는 간사이클로버 선택하에서는 티미딘 키나아제 유전자로 트렌스펙션됨으로 인해 생존하지 못할 것이다.
약 10일의 트렌스펙션 이후에, 시판되는 FITC 컨쥬게이션된 다클론성 항사람 β2-미크로글로불린으로 착색시킴으로써 제 1 류 MHC 발현에 대하여 상기 세포를 분석한다. 필요하다면, 저수준의 표면 제 1 류 분자를 지닌 세포에 대하여 상기 세포를 선택하도록 분류한다.
106세포/㎖의 유전학적으로 변형된 세포를 10cc/분.의 속도로 피검자에게 정맥내 주사로 투여하였다. 피검자에게 3일에 걸쳐 동량의 분취액으로 전제 108세포를 제공하였다.
상기 결과에 따르면, 숙주 세포파괴 T 림프구 또는 제 1 류 HLA 특이적 항체에 의한 면역 파괴에 내성이 있는 공여 세포가 제공될 수 있다. 세포를 유전학적으로 변형시키는 방법은 치료용 이식에서 사용될 수 있으며, 여기에서 이식된 동종 세포가 다르다면 피검자에게 거부될 것이다. 또한, 상기 방법은 자가면역 질병으로 앓고 있는 환자로부터 자가 이식 세포를 변형시키는데 유용하며, 여기에서 세포가 다르다면 숙주 면역 시스템에 의해 공격을 받을 것이다. 이러한 방식으로, 세포의 수 및/또는 기능의 손실로부터 발생되는 광범위한 질병이 치료될 수 있으며, 여기에서 도입된 세포는 생존하고, 증식하며 작용한다.
동물 세포가 본 방법에 의해 유전학적으로 변형되어 이식용 조직 및 세포의 공급원으로서, 이식 치료용 모델로서, 약물 효능을 위한 시험에 실험적으로 사용될 수 있다.
실시예 3
레트로바이러스 벡터의 제조
본 실시예는 하향조절 유전자를 함유하는 레트로바이러스 벡터의 구성 및 숙주 세포의 형질 도입시에 사용되는 재조합 레트로바이러스의 제조를 설명한다. 표 1은 실시예 1에서 기술한 플라즈미드로부터 제조한 레트로바이러스 벡터를 기재하고 있다. 제조된 이들 레트로바이러스는 숙주 세포의 형질도입을 위한 마커(이시스트론성 레트로바이러스 벡터)로서 하향조절 유전자 단독으로 또는 또다른 유전자와 조합한 하향조절 유전자, CD4/제타 유전자를 코드화한다.
바이러스 유전자 단시스트론성 레트로바이러스 벡터 이시스트론성 레트로바이러스 벡터
US11 pRT.US pCD4.US11
Ad2 E3/19 pCD4.Ad2 E3/19
Ad5 E3/19 pCD4.Ad5 E3/19
HSV-1 IC47 pRT.ICP47 pCD4.ICP47
A. 단시스트론성 레트로바이러스 벡터.
벡터 pRT43.267내로 클론화된 바이러스 유전자의 삽입하여 단시스트론성 벡터를 구조화한다. 이러한 레트로바이러스 플라즈미드는, 5'부터 3'까지, 가장 먼저 시토메갈로바이러스(CMV) 증강제/프로모터 영역, 몰로니 뮤린 육종 바이러스(MMSV) R/U5 영역, 접합 공여 부위, 일부의 뮤린 몰로니 백혈병 바이러스(MMLV) 구토 유전자, MMLV 접합 수용체, 하기에 기술한 폴리링커, 및 MMLV 3' LTR을 함유한다. 실시예 1에 기술한 플라즈미드로부터 US11 및 ICP47 유전자를 함유하는 서열을 하기 실시예 C 및 G에 기술한 바와 같이 폴리링커내로 삽입하였다.
(WO94/29348에 기술된) pRT43.2F3으로부터 하기의 단계를 사용하여 레트로바이러스 벡터 pRT43.267을 유도하였다: pRT43.2F3을 EcoRI 및 Apal로 침지시키고 벡터 단편을 분리하였다. BamHI 부위, Notl 부위 및 Sall 부위를 함유하는 올리고누클레오티드를 벡터 단편상의 EcoRI와 Apal 부위 사이의 벡터 단편에 결찰시켰다.
B. 이시스트론성 레트로바이러스 벡터
클론화된 바이러스 유전자를 pRT43.267TNFgsig.ic내로 삽입함으로써 이시스트론성 바이러스를 구조화하였다. 이러한 레트로바이러스 플라즈미드는, 5'부터 3'까지, 가장 먼저 증강제/프로모터 영역, MMSV R/U5 영역, 접합 공여 부위, 일부의 MMLV 구토 유전자, MMLV 접합 수용체, 하기에 기술한 폴리링커, 뇌 척수 심장염 바이러스(ECMV) IRES 엘리먼트, CD4-제타 유전자 및 MMLV 3' LTR을 함유한다. 실시예 1에 기술한 플라즈미드로부터 US11, ICP47, Ad2 E3/19, 및 Ad5 E3/19 유전자를 함유하는 서열을 하기 실시예 D, E, F 및 H에 기술한 바와 같이 폴리링커내로 삽입하여 하향조절 유전자 및 CD4-제타 유전자 둘 모두를 코드화하는 이시스트론성 레트로바이러스 벡터를 제조하였다.
레트로바이러스 벡터 pRT43.267gsig.ic을 하기의 변화체를 갖는 pRT43.2F3로부터 유도하였다: EMCV로부터의 IRES 엘리먼트(겐뱅크 로커스 EVCGAA로부터의 잔기 286-871, 어세션(Accession) 제 X74312)를 pRT43.2F3에서 CD4-제타 유전자의 ATG 개시화 코돈의 5'에 바로 삽입하였다. ATG 개시화 코돈의 CD4-제타 유전자 상류의 5' 번역되지 않은 부분의 102bp를 삭제시켰다. Bam HI, Not I 및 SAlI에 대한 인식 부위를 함유하는 폴리링커 서열을 IRES 엘리먼트의 5'에 삽입하였다. pRT43.2F3에서의 이러한 변화는 종래에 널리 공지된 기술을 사용하여 수행되었다.
C. pRT.US11의 구성
pUS11을 Eco RI로 소화시키고 682 염기쌍 US11 인서트를 겔 전기영동에 의해 분리시켰다. pRT43.267 레트로바이러스 벡터를 Eco RI로 소화시키고, 소 장 인산염으로 처리하며 겔 전기 영동에 의해 정제시켰다. US11 인서트를 T4 DNA 리가아제를 사용하여 벡터에 결합시켰다. 결찰 혼합물을 E. coli를 형질전환시키는데 사용하고, 세포를 LB 플리이트상에서 암피실린으로 플레이트시키고 콜로니를 적당한 배향으로 인서트에 대해 스크리닝시켰다.
D. pCD4.US11의 구성
US11 인서트를 상기에 설명한 바와 같이 분리시켰다. pRT43.267TNFgsig.ic 레트로바이러스 벡터를 SAl I 및 Not I으로 소화시켜 9143 bp 벡터를 제조하였다. 9143 bp 벡터 단편을 겔 전기 영동에 의해 정제시키고, US11 인서트에 결찰시켰다. 재조합 벡터를 상기에 설명한 바와 같이 분리시켰다.
E. pCD4.Ad2 E3/19의 구성
pCRII.Ad. E3/E19를 Spe 1으로 소화시키고, 클레노우(Klenow) pol I으로 처리한 후 Not I으로 소화시켜 Ad2.E3/E18을 함유하는 553 bp 단편을 정제시켰다. 9143 bp 단편을 상기에 설명한 바와 같이 pRT43.267TNFgsig.ic으로부터 제조한 후 Ad2.E3/19 유전자 단편에 결찰시켰다. 재조합 벡터를 상기에 설명한 바와 같이 분리시켰다.
F. pCD4.Ad5 E3/19의 구성
pCR3.Ad. E3/E19를 Hind III 및 Xba I으로 소화시켜 Ad5 E3/E19를 함유하는 551 bp 단편을 제조하였다. 551 bp 단편을 pRT43.267TNFgsig.ic의 Not I 및 Sal I 소화로부터 제조된 9143 bp 벡터 단편에 결찰시키고 재조합 벡터를 분리시켰다.
G. pRT.ICP47의 구성
pICP47을 Eco RI으로 소화시키고 ICP47 유전자를 함유하는 293bp 단편을 정제시켰다. 그 후 이 단편을 Eco R1으로 소화된 pRT43.267에 결찰시켰다. 재조합 레트로바이러스 벡터를 상기에 설명한 바와 같이 제조하였다.
H. pCD.ICP47의 구성
pICP47을 Hind III로 소화시킨 후 클레노우 pol I으로 처리하였다. Not I로의 부가 소화 후에, ICP47 유전자를 함유하는 368 bp 단편을 정제시켰다. 단편을 pRT43.267TNFgsig.ic로부터 제조된 9143 bp 벡터 단편에 결찰시키고 재조합 레트로바이러스 벡터를 분리시켰다.
상기에 설명된 재조합 레트로바이러스를 제조하기 위해 레트로바이러스 벡터를 pIK6.1MCVampac 플라즈미드(이 플라즈미드는 WO 94/29438호에 설명된 바와 같이 gag-pol-amphotropic env를 코드화시킴)와 함께, TSA201 293 세포내로 동시 형질전환시켰다 [참고 문헌: 하인젤(Heinzel) et al. (1988)J. Virol.62(10): 3738-3746]. 세포 배양 상층액을 함유하는 레트로바이러스를 48시간 후에 수집하였고, 여과시키고, 할당시키며 냉동시켰다. 적정 농도를 NIH 3T3 세포상에서 결정하였더니 약 1×106-1×107/ml 였다.
실시예 4
US11은 여러 가지 상이한 사람 세포 유형에서 다수의 제 1류 대립 유전자의 발현을 억제시킨다
본 실시예는 HCMV US11 하부 조절 유전자를 함유하는 레트로바이러스 벡터를 갖는 다양한 서로 다른 사람 세포 유형의 형질도입 및 US11 유전자의 발현시에 상기 세포내에서 제 1 류 HLA 발현의 감소를 설명하고 있다.
A. US11을 코드화시키는 비시스트론성 레트로바이러스는 HLA 발현을 억제시킨다
HCMV US11 및 CD4/제타를 코드화시키는 실시예 3에 설명된 비시스트론성 (IRES 함유) 레트로바이러스로 형질도입시켰다. 하기의 세포를 형질도입시켰다: 143B(사람 골육종 세포 (ATCC CRL-8303); 라지(Raji) 사람 버킷(Burkitt) 림프종 세포(ATCC CCL-86,J. Natl, Cancer Inst. 34:231, 1965); 주르캇(Jurkat) 사람 T 세포 백혈구 세포(ATCC TIB-152,J. Immunol.133: 123-128, 1984); 및 CD8+/CD4-IL-2-종속 정상 사람 T 세포(SJ27로 지정됨)(Finer et al., supra. 및 Morecki et al. (1991) Cancer Immunol. Immother. 32:342에 설명된 바와 같이 유도됨).
배양 상층액 형태의 레트로바이러스를 폴리브렌(2-2.5μg/ml)의 존재하에서 세포에 첨가하였다. 보편적으로, 0.75ml의 바이러스(희석되지 않거나 약 1:4까지 희석됨)를 1×106세포에 첨가하였다. 37℃에서 하룻밤동안 감염시켰다. 일부 경우에, 형질도입된 세포의 수를 증가시키기 위해, 바이러스의 2개의 부가적으로 새로 공급된 할당량을 하루 간격으로 첨가하였다. 대조군으로서, 세포를 레트로바이러스 코드화 CD4/제타만으로 형질도입시켰다. 형질도입후 4일 이상 지나면, 세포를 제 1 류 HLA 및 CD4/제타에 대해 2가지 색상 면역 형광성에 의해 착색시키고 흐름 시토미트리에 의해 분석되었다. 제 1 류 HLA를 검출하는데 사용되는 항체는 HLA-A, B 및 C 류 분자상에서 모노모르프 결정소와 반응한다(J. Immunol. (1982) 128:129- 135; 세포 (1979) 14:9-20). 형질도입된 세포의 비율은 세포의 표면의 CD4 발현의 검출에 의해 결정되고 이의 제 1 류 HLA 표면 착색 강도를 형질도입되지 않는 세포(CD4/제타 네거티브 하위 개체)의 것과 비교하여 제 1 류 HLA 발현의 배감소를 결정하였다. 그 결과를 하기 표 2에 기재하였다.
세포 라인 형질 도입된비율 형질 도이된HLA 분류 I 형질 도입되지않은 HLA 분류 I 배감소
143B 골육종 15% 1.5 60 40
라지 B 4% 54 749 14
주르캇 T 7% 31 109 3.5
SJ27 정상 T 1% 237 430 1.8
상기 표 2에 도시된 바와 같이, 제 1 류 HLA 발현에서의 감소는 143B 골육종 세포에서 가장 높았고 주르캇 T 세포 및 SJ27 정상 T 세포(각각 3.5 및 1.8배에 대해 각각 40 및 14배 감소)에서 가장 낮았다. 부가적으로, CD4/제타 발현은 또한 제 1 류 HLA 발현에서 가장 높은 감소를 갖는 세포 라인(143B 및 라지)에서 가장 강하고, 제 1 류 HLA 발현(주르캇 및 SJ27 T 세포)에서의 가장 낮은 감소를 갖는 세포에서 가장 약하다. US11 및 CD4/제타는 비시스트론성 메시지로부터 발현되기 때문에, CD4/제타 발현의 수준을 US11 발현의 수준의 간접 측정으로서 사용하였다. 그러므로, HLA I 발현에서 감손는 US11의 발현의 추정된 수준과 직접적으로 관계가 있다. T 세포 라인에서 약한 발현에 대한 이유는 공지되어 있지 않다.
이러한 예는 US11이 효과적으로 발현되는 경우, 다양한 서로 다른 세포 유형에서 제 1 류 MHC 발현을 억제시키는데 효과적인 것을 증명한다.
B. US11을 코드화시키는 모노시스트론성 레트로바이러스는 HLA 발현을 억제시킨다.
본 실시예는 IRES 엘리먼트의 부재 및 CD4-제타 유전자의 발현시에, US11만을 코드화시키는 레트로바이러스가 또한 숙주 세포내로 형질도입시키는 경우에 HLA의 발현을 억제시킬 수 있는 것을 증명한다.
143B 골육종 세포를 US11만을 코드화시키는 레트로바이러스 벡터로 형질도입시켰다. 배양의 약 4일 이상 경과 후, 세포를 거두고 제 1 류 세포 표면 수준은 상기에 설명한 비폴리모르프 제 1 류 HLA 결정소와 반응하는 W6/32 제 1 류 특정mAb를 사용하여 면역 형광 및 흐름 시토미트리에 의해 결정하였다. 도 1에서 증명된 바와 같이, 세포중 17%가 CD4/제타만을 코드화시키는 단일 유전자 레트로바이러스 벡터로 형지 도입된 비형질도입 143B 세포, 또는 143B 세포에 의해 발현되는 것보다 30배 더 적은 수준에서 제 1 류를 발현시켰다.
실시예 5
동종 특정 CTL에 의한 HLA-A2.1 발현 및 동종인식의 US11 차단
본 실시예는 하부 조절 US11 유전자로 형질도입된 세포 라인의 표면의 HLA 발현의 감소가 HLA에 대한 T 세포 특성의 세포 분해 효과에 상기 세포의 저항을 일으키는 것을 증명하고 있다.
C1R 세포는 HLA-A를 전혀 발현시키지 않고 HLA-B35저(low)및 HLA-Cw4포지티브가 있는 HLA-A네거티브사람 B 림포블라스토이드 세포 라인((B-LCL), ATCC CRL-1993)이다 [참고 문헌: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2361-2364, 1989; J. IMMUNOL. 148:1941, 1992]. HLA-A2-특정 사람 세포 분해성 작동체 세포(CTL)에 의해 용해시키기 쉬운 세포를 제공하기 위해, CIR 세포를 HLA-A2.1 유전자로 형질전환시켜 HLA-A2.1+라인, C1R-A2.1을 수득하였다 [참고 문헌: Hogan et al. (1988)J. Exp. Med.168:725]. 도 2에 도시된 바와 같이, C1R-A2.1 세포가 CTL에 의해 용해되기 쉬운 반면 C1R는 HLA-A2-특정 CTL에 의한 용해에 대해 저항성이 있다.
HLA-A2.1포지티브C1R 형질전환제를 HCMV US11 및 CD4/제타 2가지 모두를 코드화시키는 비시스트론성(IRES 함유) 레트로바이러스 벡터로 형질도입시켰다. 세포를 제 1 류 MHC 및 CD4 분자에 대해 착색시키고, 2가지 색상의 FACS에 의해 분석하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, 다수의 형질도입된 세포(CD4+)는 형질도입되지 않은 세포(CD4-)와 비교하여 매우 낮은 제 1 류 MHC를 갖는 것으로 밝혀졌다. CD4+세포를 클론시키고, 3개의 클론을 추가 분석을 위해서 선택하였다. 모든 클론은 흐름 시토미트리에 의해 측정되는 바와 같이, 매우 낮은 수준의 제 1 류 HLA를 갖는다(도 4). 부가적으로, 클론 8은 전혀 검출할 수 없는 세포 표면 HLA-A2.1을 갖는 것으로 밝혀졌다. 클론을51Cr으로 표지시키고 A2.1-특정 사람 T 세포 작동체를 사용하여 4시간 세포 분해 검정에서 표적으로 사용하였다. 도 5에 도시되는 바와 같이, US11-형질도입된 C1R-A2.1+클론의 용해는 형질도입되지 않은, 모(HLA-A2네가티브) C1R 세포의 용해의 바탕 수준과 동등하였다. 이와 같이, 도 5는 US11이 완전하게 HLA-A2.1의 발현을 방지하고 동종반응성 CTL에 의한 인식을 차단시키는 것을 증명하였다. 또한 형질도입 레트로바이러스는 CD4/제타를 코드화시키기 때문에 CD4/제타 자체가 HLA-A2.1에 대한 영향이 전혀 없는 것을 나타내는 것이 중요하다. 실제로, CD4/제타에 대해 레트로바이러스 벡터로 형질 도입된 C1R-A2.1 세포는 HLA-A2.1에서 감소를 전혀 나타내지 않고 CTL 용해에 있어서 형질도입되지 않은 C1R-A2.1 세포만큼 민감하다(도 5).
실시예 6
HLA-A3 발현 및 동종특정 CTL에 의한 인식의 US11 차단
본 실시예는 상이한 HLA 대립 유전자의 발현에 대한 US11 유전자의 효과 및 제 2 HLA 대립 유전자에 대한 작용체 T 세포 특성에 의한 특정 세포 분해에 있어서의 US11 유전자를 발현시키는 세포의 저항에 대한 효과를 증명하고 있다.
HLA-A3-특정 사람 CTL 라인을 조사된 HLA-A3포지티브동종 세포로의 HLA-A3네거티브주변 혈액 단핵 세포(PBMC)의 반복 시뮬레이션에 의해 유도하였다. 하기의 세포를 동종 유전자 시뮬레이터 세포로서 사용하였다: PBMC(2000R에서 조사됨)(Jelachich,J. Immunol. 141:1108, 1988), HLA-A3포지티브C1R 형질전환제(10,000R), 주르캇(10,000R) 또는 라지 세포(10,000R). 상기 CTL 라인을 HLA-A3포지티브C1R 형질전환제를 용해시키고, 모(HLA-A3네거티브) C1R 세포는 용해시키지 않는 능력에 대해 먼저 시험하였다. 그 후 HLA-A3포지티브C1R 세포를 US11/CD4/제타 비시스트론성 레트로바이러스 및 CD4/제타+로 형질도입시키고, HLA-A3저(low)세포를 정제시키고 HLA-A3 반응성 CTL에 대한 표적으로서 사용하였다. US11-형질도입된 HLA-A3저(low)C1R 세포를 최소로 용해시키거나 HLA-A3 특정 CTL에 의해 전혀 용해시키지 않는다.
실시예 5와 함께, 본 실시예는 US11 유전자가 상이한 제 1 류 HLA 대립 유전자를 하부 조절시킬 수 있는 것을 증명하고 있다.
실시예 7
CTL 작용체로의 제 1 류-특정 CTL 전구체의 분화를 시뮬레이트시키지 않는 US11 발현 세포
이전 실시예는 차별화된 CTL 작용체 세포가 US11-형질도입된 HLA 제 1 류딤(dim)또는 제 2 류 I네거티브표적 세포를 인식할 수 없는 것을 증명하고 있다. 이식 상태에서, 비용해성 CTL 전구체(CTLp)는 제공자(donor)의 동종 제 1 류 항원을 인식시키고 용해성 CTL 작용체로 분화시켰다. CTLp의 분화는 1회-방식 혼합 림프구 배양물(MLC) 또는 혼합 림프구 종양 배양물(MLTC)의 사용에 의해 생체외에서 증명될 수 있다. 본 실시예는 US11-형질도입된 HLA 제 1 류딤(dim) 또는 네거티브세포는 CTL 작용체로의 제 1 류-특정 CTLp의 분화를 시뮬레이트시킬 수 없는 것을 나타내는 MTLC 시스템의 사용을 예시하고 있다.
CTLp를 함유하는 HLA-A2.1네거티브또는 HLA-A3네거티브사람 PBMC를 US11 유전자로 형질 도입된 조사된(2000R) 동종 HLA-A2+또는 HLA-A3+림프구와 함께 1:1 비율로 또는 US11 유전자로 형질 도입된 조사된(10,000R) 시뮬레이터 세포 라인과 함께 10:1 비율로 배양시켰다. 이러한 시뮬레이터 세포는 HLA-A2+C1R 세포 라인, HLA-A2+JY 세포 라인 또는 HLA-A3+C1R 세포 라인으로부터 유도될 수 있다 [참고 문헌: Takahashi et al, Proc. Natl Acad. Sci 88: 10277, 1991]. 배양의 5-7일 후에, 세포를 거두고 4hr51Cr 방출 검정에서 HLA-A2.1+표적(예를 들어, HLA-A2.1+C1R 또는 JY) 또는 HLA-A3+표적(예를 들어, HLA-A3+C1R 또는 주르캇)에 대한 세포 분해 활성을 시험하였다. 비-HLA 특정 용해성 CD56+세포를 HLA-A2.1 또는 HLA-A3-특정 CTL 활성의 측정 이전에 배양물로부터 제거할 수 있다 [참고 문헌: Kos et al. J. Immunol. 155:578 (1995)]. CTL 활성을 측정하여 제 1 류 HLA-특정 CTL 활성이 US-11 형질도입된 HLA 제 1 류딤(dim) 또는 네거티브세포로 시뮬레이트되는 PBMC 배양물에서 아주 조금 관찰되어가 전혀 관찰되지 않는 것을 증명하였다. 제 1 류-특정 CTLp의 존재를 증명하기 위해 포지티브 조절로서, PBMC를 MHC 제 1 류 포지티브 형질도입되지 않는 세포로 시뮬레이트시켰다.
부가적으로, 상이한 KLA 대립 유전자에 대한 특이한 CTLp 세포의 성숙은 US11의 효과가 A2.1 또는 HLA-A3에 제한되지 않는 것을 증명하는데 적합한 표적에 대해서 측정된다.
실시예 8
143B 골육종 세포에 의해 발현된 다중 제 1 류 대립 유전자의 Ad2 E3/19 및 Ad5 E3/19 블록 발현
본 실시예는 숙주 세포가 아데노바이러스 다운-조절 유전자, Ad2 E3/19 및 Ad E3/19와 함께 형질도입될 때, 이들 유전자가 숙주 세포상에 제 1률 HLA 분자의 발현을 또한 억제할 수 있음을 예증한다.
143B는 세포 표면에 고수준의 제 1 류 HLA를 발현시키는 사람의 골육종 세포주이다. 세포를 두 개의 시스트론성(Ad E3/19; CD4/제타) 레트로바이러스 벡터와 함께, 또는 CD4/제타 분자를 코드화하는 단일 시스트론 벡터와 함께 형질 도입시켰다. 배양 4일 이후에, 샘플을 취하여, 면역형광 및 플로우 시토메트리를 사용하여 세포 표면 제 1률 HLA의 수준을 결정하였다. 형질도입된 세포 비율(%)을 세포 표면에 CD4/제타 분자의 발현으로 측정하였다. 그런후, 제 1 류 HLA 발현에 대하여 CD4포지티브세포를 분석하였다. 표 3에 기재한 바와 같이, Ad5 E3/19 유전자는 HLA 발현을 형질도입된 (CD4+) 개체군의 6.6배까지 감소시켰고, Ad2 E3/19 유전자는 HLA 발현을 형질도입된 (CD4+) 개체군의 7.5%배까지 감소시켰다.
Ad E3/19 유전자 도입율 % 도입되지 않은 제 1 류 HLA 도입된 제 1 류 HLA 배 감소
Ad2 E3/19 48% 38.5 5.1 7.5
Ad5 E3/19 48% 39.2 5.9 6.6
실시예 9
하향조절 유전자의 조합에 의한 HLA 발현의 방해
본 실시예는 하나 이상의 하향조절 유전자를 사용하여 표적 세포에서 제 1 류 HLA의 발현을 억제함을 예시하고 있다. 특히, 하기 조합물을 사용하였다: 1) HCMV US11 및 Ad2 E3/19 또는 Ad5 E3/19; 2) US11 및 ICP47; 및 3) ICP47 및 Ad2 E3/19 또는 Ad5 E1/9.
당해 기술에 잘 공지된 방법에 따라 포유류 세포를 연속적으로 형질도입시키는데 실시예 1에 기술한 재조합 레트로바이러스(이시스트론성 또는 일시트론성)의 조합물을 사용하였다. 또한, 상이한 레트로바이러스와 함께 동시에 상기 세포를 형질 도입시켰다. 동시적인 감염에 대하여, 레트로바이러스 벡터는 상이한 수용체와 상호작용하는 상이한 바이러스 엔빌로우프 단백질을 발현시키는 세포내에 패키징되었다. 하나의 재조합 바이러스를 패키지하기 위해서는 (WO94/29438에 기술된 바와 같은) 양영양 엔빌로우프를 코드화하는 pIK6.1MCVampac 패키징 벡터를 사용하며, 그 밖의 재조합 바이러스를 패키징하기 위해서는 (미국특허 제 5,470,762호에 기술된 바와 같은) 기본 원숭이 백혈병(Gibbon Ape Leukemia) SEATO 바이러스 엔빌로우프 단백질을 코드화하는 pMOV-GaLV를 사용하였다.
제 2 하향조절 유전자가 CD4-제타 유전자에 대하여 치환되는 하향조절 유전자의 조합물을 코드화하는 실시예 1의 프로토콜에 따라 추가의 이시스트론성 벡터를 제조하였다. 이들 이시스트론성 벡터는 이전의 실시예에서 기술된 바와 같이 표적 세포를 형질 도입시키는데 사용되었다.
실시예 10
제 1 류-결함 사람 조절 간세포 및 T 세포의 제조
본 실시예는 하나 이상의 하향조절 유전자를 함유하는 벡터와 함께 도입된 사람 조절 간세포 및 T 세포의 제조를 예시하고 있다. 이들 세포의 충분한 형질 도입 및 제 1 류 HLA 발현의 손실을 확신시키기 위해서, 입과정중에 부착 분자상 및 부착 분자에 대한 항체에 상기 세포를 플레이팅시켰다.
A. 주로 사람의 조절 간세포의 고수준 형질 도입
간세포로부터 유도된 자기 갱생 및 개체 분화 둘 모두를 유지시키는 능력은 골수에서 간세포 및 간질세포의 세포-세포 접촉에 의존한다[참고문헌: Gordon and Greaves,Bone Marrow Transplation,4:335-338 (1989)]. 간질 세포 및 조절 간세포의 접촉은 간질 세포상에서의 키트(kit) 리간드와 간세포에서 발견된 c-키트 수용체[참고문헌: Zsebo et al., Cell, 63: 213-224 (1990)] 및 간질 세포상에서 피브로넥틴과 같은 부착 분자와 조절 간세포상에서의 VLA-4[참고문헌: Williams et al., Nature 352: 438-441 (1991)]에 의해서 예시된, 성장 인자를 포함하여 많은 분자를 포함한다. 이들 접촉 분자는 트렌스맴브레인이거나 또는, 세포 밖에서 정위되면, 트렌스멤브레인 단백질과 접촉하여 자기 갱생 또는 분화에 대한 신호를 간질 세포 및 간세포 사이에 전달되어지게 할 수 있는 단백질이다.
상청액 감염에 의한 조절 간세포로의 레트로바이러스 유전자 전이를 개선시키기 위해서, 출원인이 피너(Finer)등인 미국특허출원 제 08/517,488호에서 기술된 바와 같이 세포-세포 접촉의 개조물이 사용될 수 있다. 피브로넥틴, 피브로넥틴의 CS-1 도메인 또는 VLA-4에 대한 항체가 하기에서 기술한 바와 같이 배양 접시에 첨가되었다.
CD34+세포는 시클로포스파미드 및 G-CSF 치료를 받은 환자의 말초 혈액으로부터 세포를 분리하였다. 단핵세포는 표준 피콜(Ficoll) 성분 (Pharmacia, Piscataway, NJ)를 사용하는 분획에 의해 루코프레스드 혈액으로부터 분리하였다. CD34+세포는 셀프로 세파테(CellPro CEPRATE) LC 친화도 칼럼상(CellPro, Bothell, WA)에서 포지티브 선택을 사용하여 분리하였다. 그런후, 세포의 이러한 개체군을 100ng/㎖의 사람 간세포 인자(SCF), 50ng/㎖의 사람 IL-3, 및 10ng/㎖의 사람 IL-6(매사추세츠 캠브리지 겐자임에서 시판)의 첨가와 함께 테리 폭스 랩스(Terry Fox Labs)(캐나다의 밴쿠버에 소재)로부터 완전한 배지로서 공급된 미엘로이드 롱 텀 컬쳐 메디움(Myeloid Long Term Culture Medium)을 내장한 프리스티뮬레이션(prestimulation) 배지에서 0.5-1x106세포/㎖의 밀도에서 48-72시간 동안 배양시켰다.
CD34+세포의 감염을 위한 바이러스 상청액은 하기와 같이 제조된다. 트렌스펙션이전에 먼저 1.4x106세포/10㎝ 디시의 밀도로 24시간 동안 플레이팅시킴으로써 293 세포를 트렌스펙션시킨 후에, 앞서의 실시예에 기술한 레트로바이러스 벡터 및 7.5㎍의 패킹 플라즈미드 pIK6.1MCVampac로 공동 트렌스펙션시켰다. 18시간이 경과한 후에, 트렌스펙션 배지를 제거하고 10㎖ IMDM(JRH Biosciences, Woodland CA)+10% FBS로 치환한다. 그런후, 24-36시간이 경과한 후에, 바이러스성 상청액을 수집하고 100ng/㎖의 사람 SCF, 50ng/㎖의 사람 IL-3, 10ng/㎖의 사람 IL-6, 및 8㎍/㎖의 폴리브렌을 첨가하였다.
항체 피복된 플레이트를 제조하기 위해서, 10㎍의 항체 또는 항체의 조합물(Immunotech, Westbrook ME)를 상기에서 기술한 바와 같이 1㎖의 PBS중에 용해시키고 조직 배양 플레이트에서 밤새 인큐베이션시켰다. 부착 분자 VLA-4, VLA-5, CD29, CD11a, CD11b, 및/또는 CD44에 대하여 단클론성 항체는 항체 피복을 하기 위해 사용되었다. 인큐베이션을 시킨 이후에, 플레이트를 PBS로 세척하고, 세포 및 바이러스성 상청액을 곧바로 첨가하였다. 비교하는 바와 같이, 윌리암스(Williams)등이 문헌[Nature 352: 438-441 (1991)]에서 모리쯔(Moritz)등이 문헌[J. Clin. Invest 93: 1451-1457 (1994)]에 기록한, 피브로넥틱 또는 피브로넥틴의 키모트립성 단편, CS-1로 조직 배양 플레이트를 피복하였다. 피브로넥틴 및 CS-1 피복된 플레이트는 사람의 혈장, 또는 조직 배양 플레이트에 CS-1(Sigma, St Louis, MO)로부터 유도해낸 피브로넥틴중 30㎍/㎖ PBS를 첨가하여 제조하였다. 그런후, 플레이트를 37℃에서 인큐베이션시키고 PBS로 세척하였다(24 시간 방법). 또한, 플레이트를 뚜껑을 제거한 상태로 UV 광하에 1시간 동안 노출시킨 후에, 뚜껑을 씌운 상태로 추가의 시간 동안 노출시킨 후에, PBS를 제거하고, 1㎖의 2% BSA를 20분 동안 첨가하고, 플레이트를 DPBS/0.2% HEPES로 세척하였다(2 시간 방법)(이하, 윌리암스등).
A. 일차적인 사람 T 세포의 고수준 형질 도입
세포-세포 접촉은 많은 세포의 조절 혈통의 활성화 및 성장을 위해서 중요한 역할을 한다. 예를 들어, 많은 세포-세포 접촉은 LFA-1 및 ICAM-1, 및 CD-2 및 LFA-3과 같은 세포로 대표되는 항원 및 T 림프구상에서 수용체/공동 수용체 쌍의 상호작용을 포함하는 T 세포 활성화를 위해서는 필수적이라는 것이 확인되었다[참고문헌: Bolhuis et al.,Cancer Immunol. Immunother. 34:1-8 (1991)]. B 림프구에서, CD40/gp39 상호작용은 B 림프구 및 T 림프구 사이에서 발생하며, B 림프구 활성화를 위해서는 필수적이다[참고문헌: Armitage et al.,Sem. Immunol.,6:267-278 (1994)]. CD2에 대한 항체[참고문헌: Springer et al.,Nature 323: 262 (1987)] 또는 CD40은 리간드에 대하여 대체할 수 있으며, 세포-세포 상호작용 및 활성화를 중재할 수 있다. 상청액 감염에 의한 T 및 B 림프구의 형질 도입은 저효율인 것으로 보고되었다[참고문헌: Hwu et al.,J. Immunol.9:4104-4115 (1993); Baker et al.,Nucleic Acids Res. 20:5234 (1992)]. 간세포에 대한 접근법과 유사한 접근법을 사용하여, 이들의 각 세포 형태를 활성화시키는 것으로 입증된, 표적 세포상에 존재하는 수용체에 대한 항체(즉, T 림프구에 대한 항 CD2 또는 LFA1 항체, 및 B 림프구에 대한 항 CD40 항체)는 이들 세포의 상청액 형질 도입 효율을 증대시키는데 또한 사용될 수 있다.
하기와 같이 건강한 혈액 제공자의 말초 혈액으로부터 일차 사람 CD8+T 세포를 정제하였다: 피콜-히패크(Ficoll-Hypaque) 밀도 원심분리로 말초 혈액 단핵세포(PBMCs)를 사람의 혈액으로부터 분리하였다. PBMCs를 D-PBSE/CMF(Ca와 Mg가 유리된 1mM EDTA를 함유하는 PBS)로 세 번 세척하고, 0.5%의 사람 감마 글로블린을 함유하는 4㎖의 D-PBSE/CMF중에서 5x107개의 세포 수준으로 재현탁시키고, 적어도 15분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 이후에, 포지티브 패닝에 의해 PBMC 세포 현탁액으로부터 CD8+T 세포를 정제하였다. 특히, T-25 플라스크에 대하여 4㎖당 5x107세포 밀도로 사람의 CD8 단백질에 대해 특이적인 항체로 피복된 미리 세척한 T-25 조직 배양 플라스크(AIS CD8 선택 플라스크(캘리포니아 산타 클라라 소재의 어플라이드 이뮨 사이언스(Applied Immune Science)에서 구입가능)중으로 PBMC 현탁액을 로딩시켰다. 세포를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시키고, 가볍게 피펫팅하고 플라스크를 D-PBSE/CMF로 세 번 세척함으로써 비부착성 세포를 제거하였다. CD8+T 세포를 플라스크로부터 동시에 방출시키고, 10ng/㎖ OKT3(뉴저지 라리탄 소재의 오소 파마슈티칼스(Ortho Pharmaceuticals)에서 구입가능)과 10% IL2(파르마시아에서 구입가능)를 함유하는 10㎖의 T 세포 보존액을 첨가함으로써 활성화시켰다. 또한, 물리적인 분리는 보충물 중재된 분해, 형광 활성화 세포 분류, 자기 비즈(beads), 친화도 크로마토그래피등을 사용하여 달성되었다. 그런후, 세포를 T 세포 배지로 48시간 동안 인큐베이션시키고, 플라스크로부터 채취하고, T 세포 배지로 한번 세척하고, 마지막으로 0.5-1.0x106/㎖의 밀도로 24 웰 플레이트중의 새로운 T 세포 배지(10% FCS, 하이클론; RPM1640, 셀그로(CellGro); 10mM 헵스(Hepes) 완충액(Gibco); 1% 피루브산나트륨(Gibco); 25μM 2-메르캅토에탄올(Sigma) 및 1% 스트렙토마이신/페니실린) 및 10% IL2중에서 재현탁시켰다.
재조합 레트로바이러스를 제조하기 위해서, 293 세포를 1x106세포/6 웰 플레이트로 플레이팅시키고, 48시간이 경과한 후에 적합한 구조물을 사용하여 트렌스펙션시킨다. 24시간의 트렌스펙션 이후에, 트렌스펙션 배지를 제거하고 T 세포 성장 배재로 대체하였다.
상기에서 기술한 바와 같이 항체 플레이를 제조하였다. 상기에서 기술한 바와 같이 제조한 0.5x106정제 및 활성화된 사람 CD8+ T 세포를 항체 피복 플레이트상에 플레이팅시키고, 상기에서 기술한 293 일시적인 트렌스펙션 시스템으로부터 수득한 1㎖의 바이러스성 상청액과 함께 1㎖의 새로운 T 세포 배지(더하여, 10% IL2 및 2㎍/㎖ 폴리브렌)를 사용하여 인큐베이션시켰다. 8시간의 인큐베이션이 경과한 이후에, 각 웰로부터 1.5㎖의 배지를 제거하고, 1.0㎖의 바이러스성 상청액(2㎍/㎖ 수준의 폴리브렌 및 10% 수준의 IL2)과 함께 0.5㎖의 새로운 T 세포 배지로 대체하였다. 12시간의 인큐베이션 이후에, 두 단계 상청액 과정을 반복하였다.
형질 도입된 CD9+ T 세포 개체군을 계속해서 T 세포 배지에서 유지시켰다. T 세포를 OKT3를 10ng/㎖ 수준으로 첨가함으로써, 및 1-2x107CD8+ T 세포/10㎖ T 세포 배지 및 10% IL2의 밀도로 T-25 조직 배양 플라스크중에 고정된 OKT3에 세포를 노출시킴으로써 7 내지 10일 마다 주기적으로 재자극하였다. 세포를 48시간 동안 인큐베이션시키고, T 세포 배지로 1x 세척하고, 0.5-1.0x106/㎖ 수준으로 새로운 배지 및 10% IL2중에서 재현탁시켰다.
상기에서 기술한 바와 같이 제조한 제 1 류 HLA 결함성 T 세포 및 간세포 부개체군을 면역 친화성 기술, 예를 들어, 제 1 류 HLA 특이적 항체 및 보충물 중재 분해, 형광 활성화된 세포 분류, 플라스틱 기층에의 부착, 자기 비즈, 친화성 크로마토그래피등에 의해 임의로 추가로 부화시킨다. 팬 특이적 W6/32 항 제 1 류 HLA 항체 및/또는 대립유전자 특이적 BB7.2 항 HLA-A2.1 제 1 류 항체를 사용한다(ATCC HB-82)[참고문헌: Hum. Immunol.3: 277-299, 1981].
실시예 11
NK 세포에 의한 분해로부터 제 1 류 결함성 세포의 보호
본 실시예는 이식 이후에 제 1 류 HLA 결함성 사람 T 세포를 생존케 하는 방법을 기술하고 있다. 제 1 류 HLA 결함성 사람 T 세포의 사용에 대한 잠재적인 방해는 세포 표면 제 1 류 HLA 결함성 림프양 세포가 천연 살세포(NK)에 의한 분해에 용이하다는 것이 발견되었다는 사실을 통해 알수 있다. 더욱이, 사람의 NK 세포가 체외에서 제 1 류 이종의 동종 림프 아구를 인지하여 분해할 것이라는 것을 보여주고 있다. 이러한 문제점을 극복하기 위해서, 이식하기 전에 체외에서 장기간 제 1 류 HLA 결함성 사람 또는 뮤린 T 세포를 인큐베이션시켜서 NK 인지 및 분해에 대한 이들의 용이성을 감소시킨다.
A. NK 세포에 의한 세포분해에 대한 정상의 사람 T 세포의 저항
상기에서 기술한 바와 같이 사람 T 세포를 분리하여 다클론성 활성제 PHA로 자극하고 2일 또는 5일 동안 계속해서 배양시켰다. 그런후, 생성된 T 림프 아구를51Cr로 표지하고, 새로이 분리한 동종 NK 세포에 의해 분해하는 동안에 표적으로서 시험하였다. 5일의 림프 아구는 NK 분해에 내성이 있지만, 2일의 림프 아구는 분해하기에 용이함이 관찰되었다.
B. NK 분해에 대한 제 1 류 결함성 뮤린 T 세포의 저항
제 1 류 HLA 결함성 사람 림프구용 모델로서, (WO93/16177에 기술된 β2-미크로글로블린 녹아웃 마우스로부터 유도해낸) 제 1 류 결함성 뮤린 T 림프구의 NK 분해에 대한 민감성을 조사하였다. 놀랍게도, T 림프구가 5일 이상의 기간 동안 계속해서 배양된 경우에 제 1 류 결함성 마우스 T 림프구가 NK 분해를 저지함이 발견되었다. 이와는 대조적으로, 2일 림프 양구는 종래 기술을 통해서 기대한 바와 같이 수용할 만하였다. 다른 한편으로는, 제 1 류 HLA 결함성 LPS 활성화된 B 림프 양구는 배양 5일 이후에 NK 분해에 계속해서 전적으로 민감하다.
본 명세서에 인용된 모든 공보 및 특허출원은 각 개별적인 공보 또는 특허출원이 특이적이면서 개별적으로 참조로 인용됨을 나타내는 경우에 참조로 본원에 인용된다.
선행 발명이 자명한 이해를 목적으로 설명 및 실시예에 의해서 약간 상세하게 기술되었음에도 불구하고, 특정 변화 및 변경이 청구의 범위의 정신 또는 범주로로부터 일탈함 없이 수행될 수 있다는 본 발명의 설명의 견지에 있어서 당업자에게는 용이하게 자명하게 될 것이다.
서열목록
(1) 일반적 사항
(ⅰ) 출원인: 셀 제네시스, 인코포레이티드
(ⅱ) 발명의 명칭 : 세포 표면상 제 1 류 MHC 단백질의 수준이 낮은 유전적으로 변형된 세포의 이식
(ⅲ) 서열의 수 : 9개
(ⅳ) 해당 주소:
(A)성명 : 플레어, 호바크, 테스트, 알브리톤 허버트
(B)스트리트 : 슈트 3400 엠바카데로 센터 4
(C)도시명: 샌프란시스코
(D)주: 캘리포니아
(E)국명: 미국
(F)우편번호: 94111-4187
(ⅴ) 컴퓨터 판독형태
(A)매체 유형 : 플로피 디스크
(B)컴퓨터 : IBM PC 호환종
(C)작업 시스템 : PC-DOS/MS-DOS
(D)소프트웨어 : PatnetIn Release #1.0, 버젼 #1.25
(ⅵ) 현재 출원상황 :
(A)출원번호:
(B)출원일:
(C)분류:
(ⅷ) 변리사/대리인 정보:
(A) 성명: 셔우드, 파멜라 제이.
(B) 등록번호: 36,677
(C) 참조번호: Cell 23-1
(ⅸ) 통신처:
(A)전화: 415-494-8700
(H)텔레펙스: 415-494-8771
(2) 서열 번호 1에 대한 사항 :
(ⅰ) 서열의 특성 :
(A)서열의 길이 : 480 염기쌍
(B)서열의 형 : 핵산
(C)쇄의 수 : 1 본쇄
(D)형태 : 직쇄상
(ⅱ) 분자형 : cDNA
(xi) 서열 : 서열 번호: 1
(2) 서열 번호 2에 대한 사항 :
(ⅰ) 서열의 특성 :
(A)서열의 길이 : 515 염기쌍
(B)서열의 형 : 핵산
(C)쇄의 수 : 1 본쇄
(D)형태 : 직쇄상
(ⅱ) 분자형 : cDNA
(xi) 서열 : 서열 번호: 2
(2) 서열 번호 3에 대한 사항 :
(ⅰ) 서열의 특성 :
(A)서열의 길이 : 267 염기쌍
(B)서열의 형 : 핵산
(C)쇄의 수 : 1 본쇄
(D)형태 : 직쇄상
(ⅱ) 분자형 : cDNA
(xi) 서열 : 서열 번호: 3
(2) 서열 번호 4에 대한 사항 :
(ⅰ) 서열의 특성 :
(A)서열의 길이 : 648 염기쌍
(B)서열의 형 : 핵산
(C)쇄의 수 : 1 본쇄
(D)형태 : 직쇄상
(ⅱ) 분자형 : cDNA
(xi) 서열 : 서열 번호: 4
(2) 서열 번호 5에 대한 사항 :
(ⅰ) 서열의 특성 :
(A)서열의 길이 : 381 염기쌍
(B)서열의 형 : 핵산
(C)쇄의 수 : 1 본쇄
(D)형태 : 직쇄상
(ⅱ) 분자형 : cDNA
(xi) 서열 : 서열 번호: 5
(2) 서열 번호 6에 대한 사항 :
(ⅰ) 서열의 특성 :
(A)서열의 길이 : 24 염기쌍
(B)서열의 형 : 핵산
(C)쇄의 수 : 1 본쇄
(D)형태 : 직쇄상
(ⅱ) 분자형 : cDNA
(xi) 서열 : 서열 번호: 6
(2) 서열 번호 7에 대한 사항 :
(ⅰ) 서열의 특성 :
(A)서열의 길이 :19 염기쌍
(B)서열의 형 : 핵산
(C)쇄의 수 : 1 본쇄
(D)형태 : 직쇄상
(ⅱ) 분자형 : cDNA
(xi) 서열 : 서열 번호: 7
(2) 서열 번호 8에 대한 사항 :
(ⅰ) 서열의 특성 :
(A)서열의 길이 : 22 염기쌍
(B)서열의 형 : 핵산
(C)쇄의 수 : 1 본쇄
(D)형태 : 직쇄상
(ⅱ) 분자형 : cDNA
(xi) 서열 : 서열 번호: 8
(2) 서열 번호 9에 대한 사항 :
(ⅰ) 서열의 특성 :
(A)서열의 길이 : 22 염기쌍
(B)서열의 형 : 핵산
(C)쇄의 수 : 1 본쇄
(D)형태 : 직쇄상
(ⅱ) 분자형 : cDNA
(xi) 서열 : 서열 번호: 9

Claims (28)

  1. 다른 수용자로부터 형질전환되지 않은 세포를 수집하는 단계,
    하나 이상의 바이러스 유도된 제 1 류 MHC 하향조절 유전자를 포함하는 핵산 구성물을 상기 세포에 도입시켜 도너 세포를 형성하는 단계로, 상기 세포상에서의 제 1 류 MHC 분자의 표면 발현이 상기 핵산 구성물을 도입함에 따라 70% 이상 감소되는 단계, 및
    상기 도너 세포를 포유 동물 숙주로 이식시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는, 비자가이식 세포를 포유동물 숙주에 이식시키는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 바이러스 유도된 제 1 류 MHC 하향조절 유전자가 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 핵산 구성물이 서열 번호 3과 결합된 서열 번호 1 또는 서열번호 2, 서열 번호 4와 결합된 서열 번호 1 또는 서열번호 2, 서열 번호 5와 결합된 서열 번호 1 또는 서열번호 2, 서열번호 4와 결합된 서열번호 3, 서열번호 5와 결합된 서열번호 3, 서열번호 5와 결합된 서열번호 4로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스 유도된 제 1 류 MHC 하향조절 유전자와 조합됨을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 핵산 구성물이 바이러스 유도된 제 1 류 MHC 하향조절 유전자 사이에 위치한 IRES 엘리먼트를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 2 항에 있어서, 핵산 구성물이 레트로바이러스 벡터를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 2 항에 있어서, 포유동물 숙주가 사람임을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 세포가 조혈성 세포임을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 조혈성 세포를 하나 이상의 유착 분자 및 유착분자에 특이적인 항체를 포함하는 배양물 표면상에서 레트로바이러스 벡터로 형질도입시킴을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 유착 분자 및 부착 분자에 특이적인 항체가 피브로넥틴(fibronectin), 피브로넥틴의 CS-1 도메인, 항 VLA-4, 항 VLA-5, 항 CD29, 항 CD11a, 항 CD11b, 항 CD44, 항 LFA-1, 항 ICAM-1, 항 LFA-3, 항-CD2 및 항 CD40으로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 7항에 있어서, 조혈성 세포가 조혈성 간세포임을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 7항에 있어서, 세포가 T 세포임을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 6항에 있어서, 이식전에 시험관내에서 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항에 있어서, 도너 세포가 포유동물 숙주내에서 병에 걸린 또는 감염된 세포, 또는 암세포를 표적화하는 세포를 유도하기 위해 하나 이상의 단백질을 코드화하는 유전자를 포함하는 구성물을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1 항에 있어서, 도너 세포가 도너 세포의 효과기 기능을 증진시키기 위해 하나 이상의 단백질을 코드화하는 유전자를 포함하는 구성물을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  15. 하나 이상의 바이러스 유도된 제 1 류 MHC 햐향조절 유전자를 포함하는 핵산 구성물을 포함하는 형질전환되지 않은 포유동물 도너 세포로서, 상기 세포상에서 의 제 1 류 MHC 분자의 표면 발현이 상기 핵산 구성물을 도입함에 따라 70% 이상 감소됨을 특징으로 하는 도너 세포.
  16. 제 15 항에 있어서, 핵산 구성물이 레트로바이러스 벡터를 포함함을 특징으로 하는 도너 세포.
  17. 제 15 항에 있어서, 세포가 사람의 세포임을 특징으로 하는 도너 세포.
  18. 제 15 항에 있어서, 바이러스 유도된 제 1 류 MHC 하향조절 유전자가 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 도너 세포.
  19. 제 18 항에 있어서, 핵산 구성물이 서열 번호 3과 결합된 서열 번호 1 또는 서열번호 2, 서열 번호 4와 결합된 서열 번호 1 또는 서열번호 2, 서열 번호 5와 결합된 서열 번호 1 또는 서열번호 2, 서열번호 4와 결합된 서열번호 3, 서열번호 5와 결합된 서열번호 3, 서열번호 5와 결합된 서열번호 4로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스 유도된 제 1 류 MHC 하향조절 유전자와 조합됨을 특징으로 하는 도너 세포.
  20. 제 19 항에 있어서, 핵산 구성물이 바이러스 유도된 제 1 류 MHC 하향조절 유전자 사이에 위치한 IRES 엘리먼트를 포함함을 특징으로 하는 도너 세포.
  21. 제 17 항에 있어서, 세포가 조혈성 세포임을 특징으로 하는 도너 세포.
  22. 제 21 항에 있어서, 조혈성 세포를 하나 이상의 유착 분자 및 유착분자에 특이적인 항체를 포함하는 배양물 표면상에서 레트로바이러스 벡터로 형질도입시킴을 특징으로 하는 도너 세포.
  23. 제 22 항에 있어서, 유착 분자 및 부착 분자에 특이적인 항체가 피브로넥틴, 피브로넥틴의 CS-1 도메인, 항 VLA-4, 항 VLA-5, 항 CD29, 항 CD11a, 항 CD11b, 항 CD44, 항 LFA-1, 항 ICAM-1, 항 LFA-3, 항-CD2 및 항 CD40으로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 도너 세포.
  24. 제 21항에 있어서, 세포가 조혈성 간세포임을 특징으로 하는 도너 세포.
  25. 제 21항에 있어서, 세포가 T 세포임을 특징으로 하는 도너 세포.
  26. 제 15 항에 있어서, 포유동물 숙주내에서 병에 걸린 또는 감염된 세포, 또는 암세포를 표적화하는 세포를 유도하기 위해 단백질을 코드화하는 유전자를 포함하는 핵산 구성물을 추가로 포함함을 특징으로 도너 세포.
  27. 제 15 항에 있어서, 도너 세포의 효과기 기능을 증진시키기 위해 단백질을 코드화하는 유전자를 포함하는 핵산 구성물을 포함함을 특징으로 하는 도너 세포.
  28. T 세포를 약 5 일 이상 동안 시험관내에서 존속시키는 것을 포함함을 특징으로 하는, 천열 치사(NK) 세포에 의한 용해에 대한 포유 동물 T 세포의 감수성을 감소시키는 방법.
KR1019970707064A 1995-04-04 1996-04-03 세포 표면상 제 1 류 ｍｈｃ 단백질의 수준이 낮은 유전적으로변형된 세포의 이식 KR19980703665A (ko)

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