KR19980080460A - 대장균 변이주 - Google Patents

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KR19980080460A
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가네모리마사아끼
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유라다까시
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다께우찌마사야스
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Abstract

본 발명은 hslV/U 유전자, clpPX 유전자 및 lon 유전자내에 삼중 결실 변이를 수반하며 대장균에서 발현되는 불안정 단백질을 안정화시키는 기능을 갖는 대장균 변이주, 대장균 변이주의 제조 방법, 대장균 변이주를 이용하여 대장균내에서 불안정 단백질을 안정하게 발현시키는 방법, 대장균 변이주를 이용하여 대장균으로 부터 유래된 불안정 단백질의 안정화 방법, 외래 단백질을 코드하는 유전자를 수반하는 발현 벡터를 대장균 변이주로 도입시키는 방법에 의해 수득 가능한 형질전환체, 및 형질전환체를 이용하여 외래 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

대장균 변이주
본 발명은 대장균 변이주에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 대장균에서 발현되는 불안정 단백질을 안정화시키는 기능을 갖는 대장균 변이주, 대장균 변이주의 제조 방법, 대장균 변이주를 이용하여 대장균에서 불안정 단백질을 안정하게 발현시키는 방법, 대장균 변이주를 이용하여 대장균로 부터 유래된 불안정 단백질의 안정화 방법, 외부 단백질을 코드하는 유전자를 수반하는 발현 벡터를 대장균 변이주로 도입시키는 것으로 이루어지는 방법에 의해 수득될 수 있는 형질전환체, 및 형질전환체를 이용한 외부 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.
대장균을 이용한 외래 유전자의 발현에 의한 유용한 단백질의 생성은 기본적으로 이미 구축된 기술로서 간주될 수 있으나; 많은 단백질은 대장균 세포내에서 급속하게 분해되므로 목적 단백질의 발현 수준이 항상 만족스러운 것은 아니다. 대장균내에서 불안정한 외래 단백질을 안정하게 발현시키기 위한 수단으로써, 프로테아제 유전자내 변이를 수반하는 변이주를 숙주로써 사용하는 것이 제안되었다. 사실상, clpPX 유전자 및 lon 유전자내에 변이를 수반하는 이중 변이주는 외래 단백질의 생성을 위한 숙주로써 제조되었다 (일본 공개 특허 공보 제 헤이 8-140671 호). 그러나, 각종 외래 단백질을 안정하게 발현하는데 효과적인 변이주는 아직까지 수득된 바 없다.
본 발명의 목적은 대장균에서 발현되는 불안정 단백질을 안정화시키는 기능을 갖는 대장균 변이주를 제공하는 것이다.
한 구현예로는, 본 발명은 대장균 변이주를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
다른 구현예로는, 본 발명은 대장균 변이주를 이용하여 불안정 단백질을 안정하게 발현하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 구현예로는, 본 발명은 대장균 변이주를 이용하여 대장균로 부터 유래된 불안정 단백질을 안정화시키는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 구현예로는, 본 발명은 외래 단백질을 코드하는 유전자를 수반하는 발현 벡터를 대장균 변이주로 도입시키는 것으로 이루어지는 방법에 의해서 수득가능한 형질전환체를 제공하는 것이다.
또 다른 구현예로는, 본 발명은 형질전환체를 이용하여 외래 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 및 다른 목적은 하기 기재로 부터 명백해질 것이다.
상기 기재된 프로테아제는 약하지만 감지할 수 있는 기질 특이성을 갖는 것으로 공지되어 있다: 어느 단백질은 Lon 에 의해 분해될 수 있으나, Clp 에 의해서는 분해되지 않는다. 그러므로, 신규한 프로테아제를 발견하여 그의 돌연변이와 공지된 프로테아제의 돌연변이를 결합시키므로써 다양한 외래 단백질의 발현에 이용될 수 있는 억압된 단백질 가수분해 활성을 가진 숙주를 개발하는 것이 기대되어 왔다.
상기 관점에 있어서, 본 발명자들은, 대장균에서 비정상적인 폴딩을 나타내는 단백질을 분해시키는 기능을 기초로하여, 신규한 프로테아제 유전자를 발견하여 hslV/U 오페론을 단리시키고자 노력하여 왔다. hslV/U 오페론의 뉴클레오티드 서열은 이미 보고되었으며, hslV/U 오페론에 의해 코드되는 2 개의 단백질인, HslV 및 HslU 가 각각 ATP-의존성 프로테아제의 촉매 서브유니트 및 조절 서브유니트인 것으로 보고되었다 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 5808-5813 (1996);J. Biol. Chem. 271, 14035-14040 (1996)].
본 발명자들은 외래 단백질로서 사용된 인간 프로우로키나제가 HslV/U 단백질을 과발현하는 대장균 세포내에서 상당히 불안정하게 되고, hslV/U 결실 변이주내에서 약 2 배로 안정화된다는 것을 발견하였다. 그러나, 놀랍게도, 본 발명자들은, hslV/U 결실 변이가 다른 ATP-의존성 프로테아제의 결실 변이와 결합되는 경우, 인간 프루오로키나제가 clpPX 유전자 및 lon 유전자내에 변이를 수반하는 이중 변이주와 같은 다른 변이주, 또는 hslV/U 결실 변이주, 또는 야생주와 비교할 때, hslV/U 유전자, clpPX 유전자, 및 lon 유전자내에 변이를 수반하는 삼중 결실 변이주내에서는 상당히 안정화된다는 것을 또한 발견하였다. 본 발명은 상기 발견을 기초로 하여 완성되었다.
요약하면, 본 발명은 하기에 관한 것이다 :
(1) hslV/U 유전자, clpPX 유전자, 및 lon 유전자내에 삼중 결실 변이를 수반하며, 대장균내에서 발현되는 불안정 단백질을 안정화시키는 기능을 갖는 대장균 변이주;
(2) clpPX 유전자 및 lon 유전자내에 이중 변이를 수반하는 대장균 변이주의 hslV/U 유전자에 결실 변이를 도입시키는 단계로 이루어지는, 상기 (1) 에서 정의된 대장균 변이주의 제조 방법;
(3) 상기 (1) 에서 정의된 대장균 변이주가 사용되는 것을 특징으로 하는, 대장균내에서 불안정 단백질을 안정하게 발현시키는 방법;
(4) 상기 (1) 에서 정의된 대장균 변이주가 사용되는 것을 특징으로 하는, 대장균로 부터 유래된 불안정 단백질을 안정화시키는 방법;
(5) 외래 단백질을 코드하는 유전자를 수반하는 발현 벡터를 상기 (1) 에서 정의된 대장균 변이주로 도입시키는 것으로 이루어진 방법에 의해 수득 가능한 형질전환체; 및
(6) 상기 (5) 에서 정의된 형질전환체가 사용되는 것을 특징으로 하는, 외래 단백질을 제조하는 방법.
본 발명은 하기에 기재된 상세한 설명 및 그림으로 나타내는 수반된 도면으로 부터 보다 더욱 이해될 것이지만, 본 발명이 이에 국한되는 것은 아니다.
도 1 은 대장균 크로모좀상에 clpPX 오페론 및 lon 유전자를 나타내는 도면, 및 clpP 유전자내 MluI 부위 및 lon 유전자내 SalI 부위 사이에 뉴클레오티드 서열을 cat 유전자 서열 (HincII-NheI 단편) 로 대체시킨 결실 변이를 나타내는 도면이고, 이중 화살표는 전사 방향을 나타낸다.
도 2 는 대장균 크로모좀상에 hslV/U 오페론을 나타내는 도면으로, 이중 hslV 유전자내 NsiI 부위 및 hslU 유전자내 NruI 부위 사이의 뉴클레오티드 서열을 tet 유전자 서열 (AvaI-EcoRI 단편) 으로 대체시키므로서 결실 변이가 발생하고, 화살표는 전사 방향을 나타낸다.
도 3 은 웨스턴 블롯팅에 의해 가시화된 인간 프로우로키나제의 발현을 나타내는 전기이동 사진이다.
도 4 는 KY2266 균주를 이용한 인간 프로우로키나제의 안정화를 평가하기 위한 파동 추적 실험의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5 는 KY2266 균주를 이용한 Cryj2 의 안정화를 평가하기 위한 웨스턴 블롯팅 분석을 나타내는 그래프이다.
도 6 은 KY2893 균주를 이용한 σ32의 안정화를 평가하기 위한 웨스턴 블롯팅 분석을 나타내는 그래프이다.
본 발명에 따르면, hslV/U 유전자, clpPX 유전자, 및 lon 유전자내에 삼중 결실 변이를 수반하고, 대장균내에서 발현되는 불안정 단백질을 안정화시키는 기능을 갖는 대장균 변이주를 제공할 수 있다.
여기에서 사용되는 용어 대장균 변이주 는 대장균내에서 발현되는 불안정 단백질을 안정화시키는 기능을 갖는 대장균 변이주를 의미한다. 예를 들어, 상기 변이주의 예로는, hslV/U 유전자, clpPX 유전자, 및 lon 유전자내에 삼중 결실 변이를 수반하여 상기 기재된 안정화 기능을 갖는 대장균 변이주가 포함된다.
여기에서 사용되는 용어 불안정 단백질 은 대장균내에서 예를 들어, 극히 짧은 반감기를 갖는 단백질이 발현될 때조차 신속한 분해를 수행하는 단백질을 의미한다. 불안정 단백질로는, 예를 들어, 열 쇼크 전사 인자 (heat shock transcription factor) σ32와 같은 대장균로 부터 유래된 단백질 및 인간 프로우로키나제, 크립토메리아 야포니카 (Cryptomeria japonica) 화분 항원 Cryj2, 각종 사이토킨 및 성장 인자와 같은, 대장균내에서 높은 수준으로 발현되기 어려운 외래 단백질이 포함된다.
여기에서 사용되는 용어 안정되는 또는 안정화 는 상기 기재된 단백질의 반감기를 상당히 연장시키는, 또는 반감기의 상당한 연장을 의미한다. 반감기는, 예를 들어, 다음 부분에서 보다 구체적으로 기재되는 방사성 표지된 아미노산을 이용한 파동 추적 실험에 의해 측정될 수 있다.
상기 기재된 삼중 결실 변이는, hslV/U 유전자, clpPX 유전자, 및 lon 유전자를 전체적으로 또는 부분적으로 결실시키므로써, 그에 의해 코드되는 프로테아제가 예를 들어, 웨스턴 블롯팅에 의해 가시화되는 경우 대장균에서 감지될 수 없게 된다는 것을 의미한다.
대장균 크로모좀상에서 상기 기재된 삼중 결실 변이의 도입은 PCR 에 의해 확인될 수 있다.
상기 기재된 삼중 결실 변이를 도입하기 위한 대장균 균주가 특히 제한되지는 않으며, 그의 예로는, 예를 들어, K12 균주 및 B 균주가 포함된다. 여기에서, 생물학적 억제를 고려할 때 K12 균주가 바람직하다.
본 발명에 있어서, 불안정 단백질의 안정화를 고려할 때, 특히 바람직한 것은, K12 균주로 부터 유래된, MC4100 균주 [F-araDΔ(argF-lac)U169 rpsL relA flbB deoC ptsF rbsR] 의 hslV/U 유전자, clpPX 유전자, 및 lon 유전자에 삼중 결실 변이를 도입시키는 것으로 이루어지는 방법에 의해 수득되는 KY2266 균주 (FERM BP-6239); K12 균주로 부터 유래된, W3110 균주 [thyA36 deoC2 IN(rrnD-rrnE)1 rph1] 의 hslV/U 유전자, clpPX 유전자, 및 lon 유전자에 삼중 결실 변이를 도입시키는 것으로 이루어지는 방법에 의해 수득되는 KY2893 균주 (FERM BP-6243) 으로, 30 ∼ 42 ℃ 의 온도에서 성장할 수 있는 균주를 선별한다.
본 발명의 대장균 변이주를 제조하는 방법은 바람직한 구현예로서 상기 언급된 KY2266 균주 및 KY2893 균주를 들어 하기에 상세하게 설명될 것이다. 달리 구체화되지 않는다면, 하기 방법은 예를 들어, 문헌 [Sambrook, J. et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989] 에 개시된 방법에 따라서 수행될 수 있으며, 상기 개시는 참고로 포함된다.
우선, KY2266 을 제조하는 방법이 설명될 것이다. KY2266 균주는 상기 언급된 MC4100 균주의 clpPX 유전자 및 lon 유전자에 이중 결실 변이를 도입시키는 것으로 이루어지는 방법에 의해 수득될 수 있다. 다음으로, hslV/U 유전자, clpPX 유전자, 및 lon 유전자내에 삼중 결실 변이를 수반하는 KY2266 균주는 생성된 KY2263 균주의 hslV/U 유전자에 결실 변이를 더 도입시키므로써 수득될 수 있다.
(1) KY2263 균주의 제조 방법
클론 #148, lon 유전자 및 clpP 유전자순으로 배열되고, 그의 인접한 영역을 포함하는 코하라 대장균으로 부터, Lon(La) 프로테아제 및 Clp 프로테아제의 촉매 서브유니트 ClpP 를 각기 코드하는 각각을 다수복제 (multicopy) 플라스미드로 클론시킨다. lon 유전자 및 clpP 유전자는 대장균 크로모좀상에 상호 인접하여 위치하고, 그 사이에 ClpXP (Clp 프로테아제중 하나) 의 조절 서브유니트인, ClpX 를 코드하는 clpX 유전자가 위치하여 clpP 유전자와 함께 오페론을 구성한다 (도 1). clpP 유전자내 MulI 부위 및 lon 유전자내 SalI 부위 사이의 3.7 kbp 단편을 pACYC184 (ATCC 37033) 으로 부터 유래된 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 (cat) 유전자 (HincII-NheI 단편, 1.6 kbp) 로 대체시켜 [Chang, A.C. 및 Cohen, S.N.,J. Bacteriol.134, 1141-1156 (1978)] 결실 변이를 도입시킨다 (도 1). 수득된 플라스미드를 pKV1196 으로 명명하고, 결실 변이를 Δ(clpPX-lon)1196::cat 로 명명한다.
recD 변이주인, FS1576 균주 [Stahl, F.W. et al.,Genetics 113, 215-227 (1986)] 를, 상기 pKV1196 을 HindIII 로 개열시켜 직선화된 DNA 를 이용하여 형질전환시킨다. 크로모좀 DNA 는 클로람페니콜 내성을 가진 형질전환체로 부터 제조된다. 상기 기재된 결실 변이가 크로모좀상에 도입된다는 것이 PCR 에 의해 확인된다.
Δ(clpPX-lon)1196::cat 는 P1 파아지를 이용하여 야생주 MC4100 으로 도입된다 [Yarmolinsky, M.B. 및 Sternberg, N.,The Bacteriophages(ed. Calendar, R.), Plenum Press, New York,1, 291-438 (1988)]. 수득된 변이주를 명명하고 대장균 KY2263 균주로 명시하여 기탁기관 [National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566, Japan] 에 기탁번호 FERM BP-6238 로 기탁되었다 (원기탁일: 1997 년 2 월 18 일; 국제 기탁 권한하에 부다페스트 조양 7.1 조에 따라 승인된 기탁일: 1998 년 1 월 26 일).
(2) KY2266 균주의 제조 방법
HslV/U 프로테아제를 코드하고, 그의 인접 영역을 포함하는 hslV/U 오페론을 SG22094 균주 (MC4100 균주 clpP1::cat Δlon-510, 일본 공개 특허 공보 제 헤이 8-140671 호) 로 부터 다수 복제 플라스미드로 클론시킨다. hslV 유전자내 NsiI 부위 및 hslU 유전자내 NruI 부위 사이의 0.6 kbp 단편을 pBR322 로 부터 유래된 tet 유전자 (AvaI-EcoRI 단편, 1.4 kbp) 으로 대체시킨다 (도 2). 수득된 플라스미드를 pKV1172 로 명명하고, 결실 변이는 ΔhslV/U1172::tet 로 명명된다.
FS1576 균주는 EcoRI 으로 상기 pKV1172 를 개열시켜 직선화된 DNA 를 이용하여 형질전환된다. 크로모좀 DNA 는 테트라사이클린 내성을 가진 형질전환체로 부터 제조된다. 상기 기재된 결실 변이가 크로모좀상에 도입된다는 것이 PCR 에 의해 확인된다.
ΔhslV/U1172::tet 는 P1 파아지를 이용하여 상기 (1) 과 동일한 방법으로 상기 (1) 에서 제조된 KY2263 균주에 도입된다. 수득된 변이주를 명명하고 대장균 KY2266 균주로 명시하여 기탁기관 [National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566, Japan] 에 기탁번호 FERM BP-6239 로 기탁되었다 (원기탁일: 1997 년 2 월 18 일; 국제 기탁 권한하에 부다페스트 조양 7.1 조에 따라 승인된 기탁일: 1998 년 1 월 26 일).
본 발명에서 상기와 같이 제조되어 생성된 대장균 변이주인. KY2266 균주는, 그의 모균주 MC4100 및 이중 변이주 KY2263 균주와 비교하여, 37 ℃, 영양 배지중 성장률에 있어서 상당한 차이가 없는 통상적인 방법, 형질전환 방법, 저장 방법 등으로 조작될 수 있다는 점에서 유리하다.
KY2893 균주를 제조하는 방법은 다음에서 설명될 것이다. KY2893 균주는, MC4100 균주 대신에 W3110 균주를 사용하는 것을 제외하고, 상기 기재된 KY2266 균주에 대한 방법과 동일한 방법으로 제조될 수 있다.
구체적으로, 우선, 이중 결실 변이를 W3110 균주의 clpPX 유전자 및 lon 유전자에 도입시킨다. 수득된 변이주를 명명하고 대장균 KY2783 균주로 명시하여 기탁기관 [National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566, Japan] 에 기탁번호 FERM BP-6244 로 기탁되었다 (부다페스트 조약하의 원기탁일: 1997 년 2 월 3 일).
다음으로, hslV/U 유전자, clpPX 유전자 및 lon 유전자내 삼중 결실 변이를 수반하는 KY2804 균주는 상기 제조된 KY2783 균주의 hslV/U 유전자에 결실 변이를 도입시키므로써 수득된다. 그 다음, 30 ℃ 이상의 온도에서 성장할 수 있는 변이주인 KY2893 균주를 상기 제조된 KY2804 균주로 부터 분리한다. 수득된 변이주를 명명하고 대장균 KY2804 균주 및 대장균 KY2893 균주로 명시하여 기탁기관 [National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566, Japan] 에 기탁번호 FERM BP-6245 및 FERM BP-6243 으로 각각 기탁되었다 (부다페스트 조약하의 원기탁일: 1997 년 2 월 3 일).
또한, 본 발명에서 상기와 같이 제조되어 생성된 대장균 변이주인 KY2893 균주는 그의 모균주 W3110 및 이중 변이주 KY2783 균주와 비교하여, 37 ℃, 영양 배지중 성장률에 있어서 상당한 차이가 없는 통상적인 방법, 형질전환 방법, 저장 방법 등으로 조작될 수 있다는 점에서 유리하다.
더욱이, 본 발명은 상기 기재된 대장균 변이주를 이용하여 대장균내에서 불안정 단백질을 안정하게 발현시키는 방법을 제공한다. 불안정 단백질은 바람직하게는 외래 단백질이며, 보다 바람직하게는 인간 프로우로키나제, 크립토메리아 야포니카 (Cryptomeria japonica) 화분 항원 Cryj2, 등으로, 본 발명의 대장균 변이주에 의해 보다 상당히 안정하게 발현되기 때문이다.
불안정 단백질이 외래 단백질인 경우, 목적 외래 단백질을 코드하는 유전자를 벡터에 도입시켜 재조합 벡터를 제조한다. 상기 벡터는 프로모터 서열, SD 서열, 복제 오리진 및 마커 유전자와 같은, 본 발명의 대장균 변이주에서 발현 조절에 필요한 서열을 가지며, 시판되는 pET, pTrc99A, pKK233 등에 의해 예시된다. 목적 외래 단백질을 발현하는 형질전환체는 상기 제조된 재조합 벡터를 본 발명의 대장균 변이주에 도입시켜, 마커 유전자에 의해 콜로니를 선별하므로써 수득될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 기재된 형질전환체를 제공한다.
목적 불안정한 외래 단백질은 상기 기재된 형질전환체를 배양하므로써 안정하게 발현될 수 있다. 상기 형질발현체는 임의 통상적인 방법에 의해 배양될 수 있다. 사용된 배지는 영양 배지 또는 합성 배지중 하나일 수 있다. 배양 온도는 20 ∼ 42 ℃ 의 범위에서 선택되고, 배양 온도는 가장 바람직하게는 약 37 ℃ 이다.
목적 외래 단백질의 안정성은 대수 성장 상태인 형질전환체를 함유하는 배지에35S-메티오닌을 첨가하여 1 분간 형질전환 세포에 의해 합성된 단백질을 표지하고, 이어서, 비-방사성 메티오닌을 과량 첨가하는 것으로 이루어지는 파동 추적 실험에 의해서 측정될 수 있다. 목적 외래 단백질의 안정성은 그의 반감기에 의해 측정될 수 있다.
더욱이, 본 발명은 상기 기재된 대장균 변이주를 이용한 대장균으로 부터 유래된 불안정 단백질을 안정화시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 이후 대장균의 열 쇼크 전사 인자 σ32를 예로 들어 기재하고 있다.
대장균에서 유래된 불안정 단백질은 상기 기재된 형질전환체의 배양 조건과 동일한 방법으로 본 발명의 대장균 변이주를 배양하므로써 안정화될 수 있다. 단백질은 상기 기재된 대장균 변이주의 세포로 부터 통상적인 방법에 의해 추출된다. σ32의 발현량이 최고인 대장균 변이주는 추출된 단백질의 일정량을 SDS-PAGE 시키고, 분리된 단백질들을 니트로셀룰로스막상으로 전이시킨 다음, 항-σ32항체를 이용한 웨스턴 블롯팅에 의해 단백질을 가시화시키므로써 선별될 수 있다 (일본 공개 특허 공보 제 헤이 8-140671 호).
σ32의 발현량이 최고인 본 발명의 상기 기재된 대장균 변이주는 σ32-분해 프로테아제가 결핍되므로, 외래 유전자의 발현에 의해 생성되는 목적 단백질의 직접적인 분해가 억제될 수 있을 뿐 아니라, 안정화된 σ32에 의해 생성된 다량의 열 쇼크 단백질의 샤페론 기능으로 인해, 목적 단백질이 보다 안정하게 유지될 수 있다. 따라서, σ32의 발현량이 최고인 대장균 변이주가 특히 유용하다.
더구나, 본 발명은 상기 기재된 형질전환체를 이용하여 외래 단백질을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 기재된 형질전환체는 상기와 동일한 방법으로 배양되고, 발현의 유도가 요구되는 경우에 수행될 수 있다. 외래 단백질은, 형질전환체를 파쇄하여 원심분리시켜 상층액을 수합한 다음, 겔 여과법 및 각종 컬럼 크로마토그래피법 [Current Protocols in Protein Science(ed. Coligan, J.E. et al.), John Wiley and Sons, Inc., Chapter 6] 과 같은, 단백질의 정제에 사용된 통상적인 방법에 의해 생성물을 정제하는 것으로 구성되는 방법에 의해서 형질전환체로 부터 회수 및 정제될 수 있다. 또한, 목적 단백질이 페리플라즘에 존재하는 경우, 본 발명에 참고되는 문헌 [Willsky et al.;J. Bacteriol.,127, 595-609 (1976)] 에 개시된 방법 등에 의해서 정제될 수 있다.
실시예
본 발명은 하기 실시예에 의해서 보다 상세하게 설명될 것이며, 실시예에 국한되지는 않는다. 특별히 명기되지 않는한, 하기 방법은 예를 들어, 문헌 [Sambrook, J. et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989] 게 개시된 방법에 따라서 수행되었다.
실시예 1
KY2266 균주의 제조
클론 #148, lon 유전자 및 clpP 유전자순으로 배열되고, 그의 인접한 영역을 포함하는 코하라 대장균으로 부터, Lon(La) 프로테아제 및 Clp 프로테아제의 촉매 서브유니트 ClpP 를 각기 코드하는 각각을 다수복제 플라스미드 pBR322 에 클론시킨다. lon 유전자 및 clpP 유전자는 대장균 크로모좀상에 상호 인접하여 위치하고, 그 사이에 ClpXP (Clp 프로테아제중 하나) 의 조절 서브유니트인, ClpX 를 코드하는 clpX 유전자가 위치하여 clpP 유전자와 함께 오페론을 구성한다 (도 1). clpP 유전자내 MulI 부위 및 lon 유전자내 SalI 부위 사이의 3.7 kbp 단편을 pACYC184 (ATCC 37033) 으로 부터 유래된 cat 유전자 (HincII-NheI 단편, 1.6 kbp) 로 대체시켜 [Chang, A.C. 및 Cohen, S.N.,J. Bacteriol.134, 1141-1156 (1978)] 결실 변이를 도입시킨다 (도 1). 수득된 플라스미드를 pKV1196 으로 명명하고, 결실 변이를 Δ(clpPX-lon)1196::cat 로 명명한다.
recD 변이주인, FS1576 균주 [Stahl, F.W. et al.,Genetics 113, 215-227 (1986)] 를, 상기 pKV1196 을 HindIII 로 개열시켜 직선화된 DNA 를 이용하여 형질전환시킨다. 크로모좀 DNA 는 클로람페니콜 내성을 가진 형질전환체로 부터 제조된다. 상기 기재된 결실 변이가 크로모좀상에 도입된다는 것이 PCR 에 의해 확인된다.
Δ(clpPX-lon)1196::cat 는 P1 파아지를 이용하여 야생주 MC4100 으로 도입된다 [Yarmolinsky, M.B. 및 Sternberg, N.,The Bacteriophages(ed. Calendar, R.), Plenum Press, New York,1, 291-438 (1988)]. 수득된 변이주를 KY2263 균주로 명명하였다 (FERM BP-6238).
HslV/U 프로테아제를 코드하고, 그의 인접 영역을 포함하는 hslV/U 오페론을 SG22094 균주 (MC4100 균주 clpP1::cat Δlon-510, 일본 공개 특허 공보 제 헤이 8-140671 호) 로 부터 상기 기재된 다수 복제 플라스미드로 클론시킨다. hslV 유전자내 NsiI 부위 및 hslU 유전자내 NruI 부위 사이의 0.6 kbp 단편을 pBR322 로 부터 유래된 tet 유전자 (AvaI-EcoRI 단편, 1.4 kbp) 으로 대체시킨다 (도 2). 수득된 플라스미드를 pKV1172 로 명명하고, 결실 변이는 ΔhslV/U1172::tet 로 명명한다.
FS1576 균주는 EcoRI 으로 상기 언급된 pKV1172 를 개열시켜 직선화된 DNA 를 이용하여 형질전환된다. 크로모좀 DNA 는 테트라사이클린 내성을 가진 형질전환체로 부터 제조된다. 상기 기재된 결실 변이가 크로모좀상에 도입된다는 것이 PCR 에 의해 확인된다.
ΔhslV/U1172::tet 는 P1 파아지를 이용하여 상기에서 제조된 KY2263 균주에 도입된다. 수득된 변이주를 KY2266 균주로 명명한다 (FERM BP-6239).
실시예 2
KY2893 균주의 제조
첫번째로, Δ(clpPX-lon)1196::cat 를 P1 파아지를 이용하여 야생주 W3110 으로 실시예 1 과 동일한 방법으로 도입시킨다. 수득된 변이주를 KY2783 균주로 명명한다 (FERM BP-6244).
두번째로, ΔhslV/U1172::tet 를 P1 파아지를 이용하여 상기 제조된 KY2783 으로 실시예 1 과 동일한 방법으로 도입시킨다. 수득된 변이주를 KY2804 균주로 명명한다 (FERM BP-6245).
상기 제조된 KY2804 균주를 L-액체 배지에서 42 ℃ 로 배양하여 성장시키고, 배양된 배지를 이어서 일정 농도로 희석하여 L-아가 플레이트상에 스프레드한다. 다음으로, L-아가 플레이트를 37 ℃ 또는 30 ℃ 에서 1 일간 항온배양시킨다. 결과로써, 콜로니의 수가, 42 ℃ 에서의 배양에 의해 수득된 콜로니와 비교하여, 1/10 또는 1/10000 로 각각 저하되는 것을 발견하였다. 그러므로, KY2804 균주가 저온 감수성이라는 것을 나타낸다.
그러므로, 상기 제조된 KY2804 균주는 L-액체 배지에서 42 ℃ 로 하룻밤동안 배양한 다음, 배양된 배지중 2 μl 를 L-아가 플레이트상에 스프레드하여 30 ℃ 에서 1 일간 배양시킨다. 겹침없이 독립적인 콜로니들을 성장중인 콜로니들로 부터 선별하여 L-아가 플레이트상에 획선으로 긋는다. 그 다음, 획선된 콜로니들을 다시 30 ℃ 에서 배양한다. 유사하게 성장된 콜로니들을 L-아가 플레이트상에 획선으로 긋고 42 ℃ 에서 배양한 다음, 단일 콜로니를 분리시키므로써 30 ∼ 42 ℃ 의 온도에서 성장할 수 있는 KY2893 균주 (FERM BP-6243) 을 수득한다.
실시예 3
KY2266 균주에서 인간 프로우로키나제를 안정하게 발현시키는 방법
pUK-02pm0 는 lacIq 유전자 및 tac 프로모터의 하류에 위치하는 인간 프로우로키나제 유전자를 수반하는 다수 복제 플라스미드이고, 상기 플라스미드로 형질전환된 대장균이 배지내 IPTG 농도에 의존하여 프로우로키나제를 합성하는 것으로 공지되어 있다 [Kanemori, M. et al.,J. Bacteriol.176, 5648-5653 (1994)]. 형질전환체는 상기 플라스미드를 갖는 MC4100 균주 (야생주), KY2263 균주 및 KY2266 균주를 형질전환시키고; 앰피실린-내성 콜로니들을 선별하고; 및 선별된 콜로니내에서의 인간 프로우로키나제의 발현을 웨스턴 블롯팅에 의해 확인하는 단계들에 의해 수득되었다. 각각의 수득된 형질발현체는 합성 배지 (배지-E) (리터당, 0.2 g 의 MgSO4·7H2O, 2 g 의 시트르산·H2O, 10 g 의 K2HPO4및 3.5 g 의 NaNH4HPO4·4H2O 함유) 에서 30 ℃ 로 대수적으로 성장할 수 있다. 그 다음, IPTG 를 최종 농도 10 μM 이 되도록 합성 배지에 첨가하므로써 인간 프로우로키나제의 합성을 유도한다. IPTG 첨가 1 시간 후, 시료를 채취하고, 인간 프로우로키나제의 양을 항-인간 프로우로키나제 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅에 의해서 조사한다.
결과로써, 상당히 증가한 양의 프로우로키나제가 MC4100 형질전환주와 비교하여 KY2263 형질전환주 및 KY2266 형질전환주에서 관찰되었다 (도 3). 발현 속도가 실질적으로 변화하지 않기 때문에, 프로우로키나제의 상기 양에 있어서의 차이는 안정성에 있어서의 차이를 반영하는 것으로 여겨진다. 영양 배지 (L-배지) (리터당, 10 g 의 박토트립톤 (Difco Laboratories 제조), 5 g 의 효모 추출물, 및 5 g 의 NaCl; pH 7.4) 에서 37 ℃ 로 성장시키기 위한 배양 조건하에서 조차, 상기 기재된 바와 유사한 결과가 상기 기재된 형질전환체에서의 인간 프로우로키나제의 양에 대해 수득되었다.
파동 추적 실험은 상기와 동일한 방법으로 배양된 대수 성장 상태인 형질전환체를 함유하는 배지에 IPTG 를 첨가하고; 그들의 세포내에서 합성된 단백질을 1 분간35S-메티오닌 (100 μCi/ml) 으로 표지하고; 이어서 과량의 비-방사성 메티오닌 (최종 농도 200 μg/ml 까지) 을 첨가하고; 비-방사성 메티오닌 첨가후 1 분을 시간 0 으로 하여, 10 분, 20 분, 30 분 및 40 분에 각 형질전환체로 부터 시료를 채취하는 단계들로 수행된다.
상기 기재된 형질전환체 각각에서 인간 프로우로키나제의 양은 면역침전법에 의해 정량적으로 측정되므로써 인간 프로우로키나제의 반감기를 결정한다. 결과로써, 반감기가 MC4100 균주에 대해 10 분 및 KY2263 균주에 대해 30 분인 것으로 밝혀진 반면, KY2266 균주에서는 반감기가 40 분 이상으로 상당히 연장된 반감기를 나타낸다 (도 4).
실시예 4
KY2266 균주에서 크립토메리아 야포니카 화분 항원 Cryj2 를 안정하게 발현하는 방법
각각의 형질전환체는 Cryj2 발현 벡터 pKCJ2I 를 이용하여 실시예 3 에서와 동일한 방법으로 수득된다. 수득된 변이주 각각을 영양 배지에서 37 ℃ 로 배양한다. 대수 성장 상태중에, IPTG 를 최종 농도 1 mM 이 될 때까지 배지에 첨가하여 Cryj2 의 합성을 유도한다. 1 시간 후, 스펙티노마이신을 최종 농도 500 μg/ml 이 될 때까지 첨가하여 단백질 합성을 중단시킨다 (시간 0). 5 분, 10 분, 20 분 및 40 분 후, 각 변이주로 부터 시료를 채취한다.
상기 기재된 각각의 형질전환체에서의 Cryj2 는 웨스턴 블롯팅에 의해 정량적으로 측정된다. 결과로써, MC4100 균주는 7 분의 반감기를 갖는 반면, KY2263 균주 및 KY2266 균주중 Cryj2 의 잔여량은 40 분후에도 실질적으로 초기 수준을 유지하므로 (각각, 약 0.9 및 약 1.0), Cryj2 가 극히 매우 안정화되었다는 것을 나타낸다 (도 5).
실시예 5
KY2266 균주중에서의 σ 32 의 안정화
파동 추적 실험은 30 ℃ 에서 대수 성장 상태인 합성 배지 (배지 E) 에서 성장된 KY2266 균주의 배양액에35S-메티오닌 (100 μCi/ml) 을 첨가하고; KY2266 균주내에서 합성되는 단백질을 1 분간 표지하고; 이어서 과량의 비-방사성 메티오닌 (최종 농도 200 μg/ml) 을 첨가하고; 비-방사성 메티오닌 첨가후 1 분을 시간 0 으로 하여, 5 분, 10 분, 15 분 및 20 분에 KY2266 세포로 부터 시료를 채취하는 단계들로 수행된다. 각 KY2266 세포내의 σ32의 양은 σ32에 대한 항체를 이용한 면역침전법에 의해 정량적으로 측정되므로써 σ32의 반감기를 결정한다. 결과로써, 반감기는 MC4100 균주에 대해 약 1.5 분 및 KY2263 균주에 대해 8 분인 것으로 밝혀진 반면, KY2266 균주에서는 반감기가 40 분 이상으로 KY2266 균주내에서 상당히 연장된 반감기를 나타낸다.
실시예 6
KY2893 균주중에서의 σ 32 의 안정화
클로람페니콜을 37 ℃ 에서 대수 성장 상태인 영양 배지중 W3110 균주, KY2783 균주 및 KY2893 균주의 각 배양액에 첨가하여, 최종 농도가 100 μg/ml 일 때 단백질의 합성이 중단되었다 (시간 0 으로 정의). 0 분, 0.5 분, 1.0 분, 및 1.5 분 후 (W3110 균주), 또는 0 분, 5 분, 10 분, 및 15 분 후 (KY2783 균주 또는 KY2893 균주), 세포 시료를 채취한다.
각 세포에서 σ32의 양을 웨스턴 블롯팅에 의해 정량적으로 측정한다. 결과로써, KY2893 균주가 15 분후에도 그의 초기 수준을 실질적으로 유지하는데 반해, W3110 균주의 반감기는 약 1 분, 및 KY2783 균주의 반감기는 약 10 분이다. 그러므로, σ32가 KY1893 균주내에서 극히 매우 안정하다는 것이 상기로 부터 명백하다 (도 6).
본 발명에 따르면, 대장균내에서 발현되는 불안정 단백질을 안정화시키는 기능을 갖는 대장균 변이주, 대장균 변이주를 제조하는 방법, 대장균 변이주를 이용하여 대장균내에서 불안정 단백질을 안정하게 발현시키는 방법, 대장균 변이주를 이용하여 대장균으로 부터 유래된 불안정 단백질을 안정화시키는 방법, 외래 단백질을 코드하는 유전자를 수반하는 발현 벡터를 대장균 변이주로 도입시키는 방법에 의해 수득 가능한 형질전환체, 및 형질전환체를 이용하여 외래 단백질을 제조하는 방법이 제공될 수 있다. 본 발명에 있어서, 유용한 외래 단백질의 유전 공학적 측면에서의 효율적인 생성이 달성될 수 있다.
상기 기재된 본 발명에서, 동일물이 다수의 방법에 있어서 다양화될 수 있다는 것이 분명해질 것이다. 상기 변이들은 본 발명의 취지 및 범위와 동 떨어진 것으로 간주되지는 않으며, 당 분야의 숙력자들에게 명백한 상기 모든 변형들이 하기 청구범위의 범위내에 포함될 수 있는 것으로 의도된다.

Claims (13)

  1. hslV/U 유전자, clpPX 유전자 및 lon 유전자내에 삼중 결실 변이를 수반하며, 대장균내에서 발현되는 불안정 단백질을 안정화시키는 기능을 갖는 대장균 변이주.
  2. 제 1 항에 있어서, 대장균 변이주가 K12 균주로 부터 유래되는 대장균 변이주.
  3. 제 1 항에 있어서, 대장균 변이주가 KY2266 균주 (FERM BP-6239) 또는 KY2893 균주 (FERM BP-6243) 으로 부터 유래되는 대장균 변이주.
  4. clpPX 유전자 및 lon 유전자내에 이중 변이를 수반하는 대장균 변이주의 hslV/U 유전자에 결실 변이를 도입하는 단계로 이루어지는, 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 정의된 대장균 변이주의 제조 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, clpPX 유전자 및 lon 유전자내에 이중 변이를 수반하는 대장균 변이주가 KY2263 균주 (FERM BP-6238) 또는 KY2783 균주 (FERM BP-6244) 인 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에서 정의된 대장균 변이주가 사용되는 것을 특징으로 하는, 대장균내 불안정 단백질을 안정하게 발현시키는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 불안정 단백질이 외래 단백질인 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 외래 단백질이 인간 프로우로키나제인 방법.
  9. 제 7 항에 있어서, 외래 단백질이 크립토메리아 야포니카 (Cryptomeria japonica) 화분 항원 Cryj2 인 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에서 정의된 대장균 변이주가 사용되는 것을 특징으로 하는, 대장균으로 부터 유래된 불안정 단백질의 안정화 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 대장균으로 부터 유래된 불안정 단백질이 열 쇼크 전사 인자 (heat shock transcription factor) σ32인 방법.
  12. 외래 단백질을 코드하는 유전자를 수반하는 발현 벡터를 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에서 정의된 대장균 변이주로 도입시키는 방법에 의해 수득 가능한 형질전환체.
  13. 제 12 항에서 정의된 형질전환체가 사용되는 것을 특징으로 하는, 외래 단백질의 제조 방법.
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