KR19980073833A - 타입 iv 콜라게네이즈 활성을 억제하는 timp-2 유래 합성펩타이드 - Google Patents

Abstract

본 발명은 타입 IV 콜라게네이즈의 활성을 억제하는 TIMP-2(Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-2)의 아미노산 서열 6번에서 15번까지의 펩타이드에서 유래되어 변형되거나 TIMP-2 아미노산 서열 108번에서 126번까지의 아미노산 서열을 포함하거나 첨가된 펩타이드로서, 다음과 같은 서열을 갖는다.

1. 아미노산 서열이 VHPQQAFCNEHA 인 펩타이드

2. 아미노산 서열이인 펩타이드

3. 아미노산 서열이 SIKVAVVHPQQAFCNEHA 인 펩타이드

4. 아미노산 서열이 RGDVHPQQAFCNEHA 인 펩타이드

5. 아미노산 서열이 YIGSRVHPQQAFCNEHA 인 펩타이드

6. 아미노산 서열이 VHPQQHAFCNEHA 인 펩타이드

7. 아미노산 서열이 PQQAFCNEHA 인 펩타이드

8. 아미노산 서열이 VHPQQHFCNEHA 인 펩타이드

9. 아미노산 서열이 VHPQQAFCHNEHA 인 펩타이드

10. 아미노산 서열이 PQQHAFCNEHA 인 펩타이드

11. 아미노산 서열이인 펩타이드

12. 아미노산 서열이인 펩타이드

13. 아미노산 서열이 DTLSTTQKKSLNHRYQMGCA 인 펩타이드

14. 아미노산 서열이 PVHPQQAFCNPGCQYRHNLSHKQTTSL 인 펩타이드

15. 아미노산 서열이인 펩타이드

이들 펩타이드들은 타입 IV 콜라게네이즈의 활성을 억제함으로써, 혈관신생과 전이를 억제하여 항암제로 사용될 수 있다.

Description

타입 IV 콜라게네이즈 활성을 억제하는 TIMP-2 유래 합성펩타이드

본 발명은 암의 전이억제와 혈관신생 억제 작용이 있는 합성 펩타이드 및 그의 제조방법에 관한 것으로서, TIMP-2(Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-2)에서 유래한 펩타이드를 변형시켜 제조하며, 이들 펩타이드는 전이억제제로 사용된다. 좀더 상세하게는 본 발명의 합성펩타이드는 야생형 TIMP-2의 6번에서 15번까지의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 얻고 이것을 변형시키거나 TIMP-2의 108번에서 126번까지의 아미노산 서열을 첨가하여 제조한 것으로서, 타입 IV 콜라게네이즈의 활성을 억제하여 전이억제제로 사용할 수 있다.

암세포의 혈관신생은 암세포의 성장과 전이에 중요한 역할을 한다. 암세포가 혈관신생을 하지 못하거나, 혈관으로 출입을 할 수 없으면 대부분의 암은 직경이 1∼2mm 이상을 넘게 자라지 못하고 원발성 위치에 국소화된 채로 남아 있을 것이다 (Folkman and Tyler; Cancer Invasion and metastasis: Biologic mechanisms and Therapy(S.B. Day ed.) Raven press, New York, 1977, PP:94-103). 암의 혈관신생은 고형의 암을 향하여 기존의 혈관들로부터 모세 혈관이 뻗어나가는 과정을 통하여 일어나며, 이를 전자 현미경으로 관찰하면 일정한 패턴을 볼 수 있는데, 암으로부터의 혈관 신생 자극에 대한 반응으로 기존의 혈관, 특히 모세 혈관후의 세정맥주위의 기저막이 분해되고, 그 다음은 혈관내피세포가 혈관으로부터 나와 암을 향해 이동한다. 이 때 뒤에 따르는 세포는 DNA 합성과 세포분화를 하여 일단 미성숙한 새로운 혈관이 연장되면 가지를 만들고 혈관의 계제(loop)를 형성하면서 관형성의 과정을 거쳐 완전한 혈관조직망을 형성한다. 마지막으로 모세혈관이 기저막 또는 혈관주위 세포층에 의해 둘러 쌓여져서 성숙한 모세혈관상을 형성한다(Ausprunk and Folkman; Microvasc Res 14, 53-65(1977) ; Burger, Chandler and Kintworth, Lab. Invest 48, 169-180(1983)).

암세포는 FGF(Fibroblast Growth Factor), VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor), Angiogenin, TGF-α와 같은 혈관신생을 자극하는 인자(Angiogenic factors)를 방출하여 혈관신생을 야기한다. 혈관신생은 종양에 두가지 중요한 역할을 하는데, 첫째는 일차종양과 전이된 이차종양의 성장과 증식에 필요한 영양과 산소를 공급하는 것이고, 둘째는 종양까지 침투한 신생 모세혈관들은 전이하는 암세포가 혈액순환계로 들어갈 수 있는 기회를 주어 암세포가 온몸에 퍼져 전이(Metastasis)가 되게 한다.

암환자 사망의 주 원인은 전이이며, 전이란 암세포가 일차 종양괴로부터 분리되어 해부학적으로 먼곳에 있는 조직이나 장기에 착상하여 성장하는 현상이다[Sugarbaker, Weingard and Roseman; Cancer Invasion and Metastasis(L.A. Liotta and I.R. Hart ed.) Boston, Nijhoff. 1982. PP 427-465]. 현재 임상에서는 암의 치료성적을 향상시키기 위하여 화학요법이나 면역요법들을 이용하고 있는데, 이러한 치료방법이 일부 종양에서 어느정도 효과를 거두고는 있지만 암 환자의 생존율을 늘이는데 기여하지 못하고 있는 것은 바로 암의 전이 때문이다.

전이가 일어나는 일련의 생화학적 현상을 리오타(Liotta) 등은 다음과 같이 제시하였는데, 첫 단계로 암세포가 기저막에 있는 라미닌 또는 지질에 있는 피브로넥틴과 같은 기질에 암세포의 표면수용체를 통해 부착한다. 두 번째 단계로 고정된 암세포는 가수분해 효소를 분비하거나, 숙주세포로 하여금 효소를 분비하게 하여 기질을 분해한다. 세 번째 단계는 암세포가 가수분해된 기질의 부분을 통해서 이동하는 것이다. 계속되는 기질의 침습은 이 세단계를 반복하여 일어난다 (Liotta, Kleinerman, Catanzara and Rynbrandt; J. Natl Cancer Inst 58, 1427-1439(1977)). 암세포가 원격 장기로 전이하려면 우선 암세포가 주위조직으로 침습해 들어가야 한다. 정상적인 상피세포는 기저막(basement membrane)에 의해 둘러싸여 주위 간질로부터 격리 되어 있으며, 혈관내피세포 밖의 기저막은 암세포가 혈관으로부터 조직 실질로 침투하는데 장벽이 되므로 기저막은 암세포 침윤에 대한 일차 방어벽이 된다. 따라서, 기저막 붕괴는 전이가 일어나고 있음을 알려준다.

혈관신생과 전이가 일어나는 과정은 각각 다르지만 두 개의 과정은 기능적으로 공통점을 가지고 있는데 그것은 기저막이 분해되어야만 두 개의 과정이 일어날 수 있다는 것이다. 기저막은 전이와 혈관 신생이 일어날 때 중요한 장벽의 역할을 한다. 이러한 기저막은 불용성이며 연속적으로 되어 있어, 큰 단백질이 통과할 수 없는 연성구조로 되어 있으며, 기저막의 주성분은 타입 IV 콜라겐, 라미닌, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸으로 되어 있다 (Vracko Am. J. Pathol 77, 313-317 (1974)).

전이하는 암세포에서 활성이 증가하는 효소중에 타입 IV 콜라게네이즈가 있다. 이 타입 IV 콜라게네이즈는 매트릭스 메탈로프로테이네이즈 (Matrix Metalloproteinase ; 이하 MMP라고 약칭함)계에 속하는 효소이며, 기저막의 주요골격을 이루고 있는 타입 IV 콜라겐을 특이적으로 붕괴시키는 효소로서, 암의 전이와 직접적인 관계가 있다고 여러 연구에서 보고되고 있다 (Garbisa et al.; Cancer Res 47, 1523-1528(1987), Ostrowski et al.; Mol carcinogenesis 1, 13-19(1988), Liotta et al.; Nature 284, 67-68(1980)). 이 효소들의 과잉 발현이나 높은 활성은 악성종양이나 류마치스 관절염 등과 같은 여러종류의 병리학적 상태와 연관되어 있다(Okada, et al.; J. Biol. Chem. 261, 14245-14255(1986), Kalebic et al.; Science 221, 281-283(1983), Liotta et al.; Nature 284, 64-68(1980)).

타입 IV 콜라게네이즈는 두가지 아형이 있다고 알려져 있으며, 잠복형의 분자량이 72KDa인 타입 IV 콜라게네이즈를 MMP-2라고 하며, 분자량이 92KDa인 타입 IV 콜라게네이즈를 MMP-9이라고 한다. 이들 MMP계에 속하는 효소들은 모두 활성이 없는 잠복형으로 생성분비되며, 트립신이나 플라스민과 같은 효소를 처리하거나 유기수은 화합물에 노출하면 활성화되는데, 이 때 아미노 말단으로부터 80개 정도의 아미노산 잔기가 제거되어 활성화된다.

그러나, MMP가 활성화되었다 해도 TIMP가 존재하면 기질과 반응하지 못한다.

TIMP(Tissure Inhibitor of Metalloproteinase)는 생체에 존재하고 있는 천연의 MMP억제제로서 현재까지 TIMP-1,2,3의 세가지 종류가 보고되고 있는데, 12개의 시스테인이 디설파이드결합을 이루어 6개의 루프(loop)와 2개의 도메인(domain)을 형성한다. 그 중 아미노산 말단의 3개의 루프만으로도 MMP의 활성을 억제할 수 있다고 보고되고 있으며, 카르복시 말단의 3개의 루프는 TIMP-1이 MMP-9의 잠복형과 결합하는데 중요역할을 한다고 생각된다 (Murphy et al.; Biochemistry 30, 8097-8102, 1991). 또한 TIMP-1에서 MMP를 억제하는 부분은 불연속적이며, 적어도 6개의 루프중 2개의 다른 루프로부터의 아미노산 배열을 포함할 것이라고 보고되고 있다 (O'shea et al.; Biochem 31, 10146-10152, 1992). 또한 TIMP-1이 MMP-1을 억제하는데 중요한 역할을 하는 부분으로 디설파이드결합 (Cys¹3-Cys¹²⁴, Cys¹²⁷-Cys¹⁷⁴)이 보고되고 있다 (Bodden et al.; J. Biol. Chem. 269, 18943-18952(1994)).

TIMP-2는 TIMP-1과 아미노산서열에서 40%가 일치하며 MMP-2의 잠복형(pro form) 및 활성형(active form) 모두와 결합하며, 활성형의 모든 MMP를 억제한다고 보고되고 있다. TIMP-2를 트립신으로 일부 가수분해 시켰을 때 아미노산 말단 부근의 13.5kDa 조각이 MMP-1 활성형과 결합하는 능력이 있다고 보고되고 있다(DeClerck er al., Biochem J. 289, 65-69(1993)). 따라서, 6개 디설파이드결합 중 처음 3개의 디설파이드결합을 포함하는 부분이, MMP-2와 복합체(complex)를 이루는데 중요한 부분일 것이라고 추측되고 있다. 이와 같이 TIMP-2는 타입 IV 콜라게네이즈 활성을 억제하는 활성이 있으므로, TIMP-2를 항암제로 사용할 수 있다.

TIMP-2를 항암제로 개발할 때 TIMP-2의 구조중 타입 IV 콜라게네이즈의 활성을 억제하는 부분만을 포함하는 펩타이드들을 제조하면 분자량이 적어져서 전체 사이즈의 TIMP-2에 비하여 약제로 개발될 때 흡수전달이 빠르고 분해효소의 공격을 덜 받아 농도를 오래 지속시킬 수 있다는 장점이 있다.

이에 본 발명자는 야생형 TIMP-2 아미노산 서열중 타입 IV 콜라게네이즈와 결합하는데 중요한 역할을 하는 부분의 펩타이드의 서열을 밝히고 특허출원한 바 있으며(대한민국 특허출원 제94-23476호), 연구를 계속하여 야생형 TIMP-2에서 유래된 펩타이드를 변형시켜 더욱더 활성이 큰 펩타이드를 얻어 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 TIMP-2계 유래 합성펩타이드들은 암의 혈관신생과 전이에 결정적으로 중요한 역할을 하는 MMP를 억제함으로써 암의 성장과 전이를 막을 수 있다.

본 발명은 야생형 TIMP-2에서 유래되어 변형된 펩타이드를 제공하는 것을 목적으로 한다. 이 합성펩타이드는 TIMP-2가 MMP를 억제하는데 중요한 역할을 하는 TIMP-2의 6번 아미노산에서 15번 아미노산까지의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드에서 유래되어 서열이 변형되거나, TIMP-2의 108번 아미노산부터 126번 아미노산까지의 펩타이드 및 이 아미노산 서열이 첨가된 펩타이드를 포함한다. 이러한 합성 펩타이드들은 암의 혈관신생과 전이에 결정적으로 중요한 역할을 하는 효소인 MMP-2를 억제함으로써 혈관신생을 막아 암의 성장을 막고 암의 전이를 억제한다.

도 1은 암세포 배양액으로부터 분리한 타입 Ⅳ 콜라게네이즈(MMP-2, 9)의 활성을 지모그람(zymogram)으로 확인한 그림이다.

도 2는 펩타이드의 MMP-2 활성 억제를 실험한 결과를 나타낸 것이다.

도 3은 rTIMP-2의 농도에 따른 전이억제 효능을 측정한 것이다.

도 4는 HB 703 유도체의 MMP-2 활성 억제를 실험한 것이다.

도 5는 B16BL6로 종양을 일으킨 쥐의 생존연장을 실험한 것이다.

도 6은 B16BL6로 종양을 일으킨 쥐의 생존연장을 실험한 것이다.

도 7은 rTIMP-2에 의한 HUVE 세포의 관형성(tube formation)에 미치는 영향을 본 실험이다.

도 8은 펩타이드에 의한 HUVE 세포의 관형성에 미치는 영향을 본 실험이다.

도 9는 rTIMP-2와 펩타이드에 의한 혈관신생 억제를 동물실험으로 측정한 결과이다.

도 10은 누드(Nude) 마우스에서 사람 위암에 대한 펩타이드의 약효실험을 한 것이다.

도 11은 펩타이드를 처치한 누드 마우스에서 자란 사람 위암의 종양무게를 측정한 것이다.

도 12는 펩타이드에 의해 생존이 연장된 누드 마우스에서 위암의 성장을 44일간 측정한 것이다.

도 13은 누드 마우스에서 사람 위암에 대한 생존연장 실험을 한 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 야생형 TIMP-2에서 유래된 합성펩타이드를 제조하여, MMP-2 억제효과를 야생형 TIMP-2와 비교하기 위하여 먼저 유전공학적 방법으로 야생형 TIMP-2를 제조한다. 본 발명자들은 TIMP-2 제조방법에 대하여 특허출원한 바 있으며(대한민국 특허출원 제94-23475호), 상기 방법에 의하면 TIMP-2를 고수율로 손쉽게 얻을 수 있다.

이하 TIMP-2의 제조방법에 대하여 기술한다.

제조예 재조합 TIMP-2의 제조

간암환자의 간암조직으로부터 분리한 mRNA로부터 만들어진 cDNA 라이브러리를 주형으로 하고, 5'의 시발체(primer)에는 TIMP-2의 N말단부위와 상보성을 가지고 있는 일부 염기서열과Nde I제한효소의 인식부위가 삽입되어 있고, 3'-시발체에는 TIMP-2의 C 말단부위와 상보성을 가지고 있는 일부 염기서열과Hind III제한효소의 인식 부위가 삽입되어 있는 2가지 시발체를 사용하여 중합 효소 연쇄반응(polymerase chain reaction)을 실시하여 TIMP-2 유전자를 증폭시킨 후 정제하였다. 위의 중합효소 연쇄반응 산물인 DNA를Nde I과Hind III의 제한효소로 자른 뒤 발현 벡터로 널리 사용되고 있는 pGEMEX-1(Promega)벡터에 삽입하였다. 이 발현 플라스미드를 pGMX-TP로 명명을 하였고, 이것을 이용하여, 대장균[E. coli JM109(DE3)]을 형질 전환시켰다. 형질 전환된 대장균을 적당한 배양 조건하에서 LB(Luria-Broth) 배지에서 배양 후 이소프로필 티오-β-D-갈락토사이드(IPTG)로 단백질 발현을 유도하면 TIMP-2의 단백질이 대장균의 세포질에 인클루젼 바디로 생성되고 이 인클루젼 바디를 단백질 변성체로 용해시키고 원래형태(native)의 TIMP-2로 폴딩(folding)시킨 후 음이온 교환수지를 이용하여 정제, 제조하였다.

또한, 본 발명자들은 상기 제조예에 의하여 제조한 TIMP-2의 아미노산 서열중 타입 IV 콜라게네이즈와 결합하는데 중요한 역할을 하는 부분이라고 생각되는 펩타이드들을 제조하면, 분자량이 적어져서 전체크기의 TIMP-2에 비하여 약제로 개발될 때 전달이 빠르고 분해효소의 공격을 덜받아 농도를 지속시킬 수 있는 장점이 있으므로, 상기 제조예에 제조한 TIMP-2를 이용하여 집중연구한 결과 TIMP-2 아미노산 서열 1번에서 15번까지를 포함한 펩타이드가 타입 IV 콜라게네이즈의 억제작용에 중요한 부분임을 발견하고 이들을 포함하는 펩타이드를 합성한 바 있다(대한민국 특허출원 제94-23476호).

본 발명자들은 연구를 더욱 계속한 결과 TIMP-2 아미노산 서열 중 특히 6번에서 15번 서열을 변형시킨 펩타이드는 타입 IV 콜라게네이즈의 억제작용이 뛰어남을 발견하였다. 야생형 TIMP-2 아미노산 배열 6번부터 15번까지의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 MMP-2 억제효과가 전혀 없었으나, 이 펩타이드 서열을 변형하거나 아미노산 서열 108번부터 126번까지의 펩타이드 및 이 아미노산 서열을 첨가한 펩타이드들은 MMP-2 활성을 억제하였다. 이와같이 MMP-2 활성을 억제하는 펩타이드들은 B16BL6 멜라노마를 이용한 전이억제실험과 생존연장 실험에서 우수한 결과를 나타냈으며, 혈관신생 실험에서 혈관신생을 강력하게 억제하였다. 또한, 누드마우스를 가지고 사람 위암에 대한 효과를 측정한 결과 종양의 성장을 억제하고 누드마우스의 생존을 연장시켰다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 TIMP-2 유래 펩타이드의 제조

본 발명의 펩타이드들은 TIMP-2의 구조중 MMP-2와 결합하는 부분이라고 생각되는 부분인 아미노산 말단으로부터 세 개의 루프(loop)를 포함하는 아미노산 배열의 일부를 변형시켜 얻은 펩타이드들로서, 펩타이드 합성기(Applied Biosystems Model 431A)를 이용하여 고체상(solid phase) 펩타이드 합성법으로 합성하였다. 0.25mmol의 파라히드록시 메틸페닐옥시메틸 폴리스티렌(HMP) 레진을 표준 반응용기(38ml)에 넣고 합성하려는 펩타이드의 카르복실 말단의 Fmoc-아미노산을 넣고 합성을 시작하였다.

펩타이드 합성은 ABI사에서 개발한 표준 스케일 Fmoc 커플링 프로토콜(protocol)에 따라 시행전에 파라메타를 편집하고 자동합성 메뉴에 따라 시행하였다(ABI User's Manual. Jan, 1992 참조). 표준 스케일 Fmoc을 사용할 때는 데프로텍션(deprotection)을 N-메틸 피롤리딘(NMP)으로 희석한 20% 피페리딘을 사용하여 21분 동안 수행하였으며 NMP로 9분 동안 세척하고 커플링을 71분 동안 실시하였다. 커플링에는 1-히드록시-벤조트리아졸(HOBT)을 사용하였고 NMP로 7분간 세척하는 시스템을 이용하였다.

실시예 2 펩타이드의 분리 및 정제

합성이 완료된 후 펩타이드의 분리는 트리플루오로아세트산(TFA)을 사용하여 고체 지지체(solid support)로부터 끊어내고, ABI사 매뉴얼(Introduction to Cleavage Techniques, P6-19(1990))을 참고로 하여 펩타이드를 분리하였다. 즉 합성이 끝나면 펩타이드가 붙은 레진을 둥근 플라스크에 넣고 냉각시킨 후 0.75g 결정 페놀, 0.25ml 1,2-에탄디티올(EDT), 0.5ml 티오아니솔, 0.5ml 증류수 및 10ml TFA를 넣고 뚜껑을 닫고 실온에서 1-2시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 레진과 반응액을 규화(sintered) 유리 깔때기를 통해 저진공으로 여과하여 레진과 펩타이드 용액을 분리하였다. 플라스크와 유리 깔때기를 5-10ml 디클로로메탄(DCM)으로 씻어 이 용액이 펩타이드용액과 섞이게 한 후 50ml 이상의 차가운 디에틸에테르를 첨가하여 펩타이드의 침전물을 얻었다. 이 침전물을 약 3000rpm 정도의 속도로 원심분리하여 상등액을 제거하고 동결 건조하였다. 이렇게하여 얻어진 펩타이드를 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)로 정제하였다. 이때 칼럼은 C₄Semi-prep column(Vydac)을 사용하였으며 완충용액 A는 증류수와 0.1% TFA를 사용하여 평형화시키고 B는 80% 아세토니트릴과 0.1% TFA를 사용하여 펩타이드를 용출하였다. 그 결과 고순도로 정제된 펩타이드를 얻었으며 합성수율은 60±5% 정도였다.

이렇게 하여 합성 정제된 펩타이드중 야생형 TIMP-2의 6번부터 15번까지의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 HB 700이라 명명하였고, TIMP-2의 6번부터 15번까지의 아미노산 서열과 108번부터 126번까지의 아미노산 서열을 변형시켜 만든 펩타이드들을 HB 701, 703, 705, 707, 710, 711, 714라고 명명하였다. 합성된 펩타이드의 아미노 말단부터의 아미노산 서열은 다음과 같다.

HB 700 : VHPQQAFCNA

HB 701 : AFCNEHA

HB 703 : VHPQQAFCNEHA

HB 705 : LNHRYQMGCA

HB 707 : KCLNHRYQMGCA

HB 710 : DTLSTTQKKSLNHRYQMGCA

HB 711 : PVHPQQAFCNPGCQYRHNLSHKQTTSL

HB 714 :

합성된 펩타이드에 대하여 질량 분석과 아미노산 서열분석을 한 결과 순서대로 합성되었으며, 질량분석에 의해 계산된 분자량과 합성된 펩타이드의 분자량이 같음을 확인하였다.

실시예 3 MMP-2 활성억제 실험

(단계 1) MMP-2의 제조

MMP-2를 얻기 위하여 전이성이 있는 사람 섬유육종세포인 HT-1080(ATCC CCL121) 세포나 T98G(ATCC CRL-1690)를 DMEM 10% FBS 배지에서 배양한 후 배지를 제거하고 혈청이 없는 DMEM 배지로 교환하고 24-72시간 배양한 배지를 회수하여 MMP-2를 포함하는 상층액을 얻었다. 0-70% 까지 황산암모늄으로 침전시키고 20mM Tris(pH 7.4)에 녹인 다음 평형완충액(50mM Tris, pH 7.6, 0.5M NaCl, 5mM CaCl₂, 0.05% Brij 35, 0.02% NaN₃)에 투석(dialysis)시킨 후 젤라틴-세파로즈에 로딩하고 1M NaCl과 5% DMSO가 섞인 평형완충액으로 용출시켜 정제된 72KDa MMP-2를 얻었다. MMP-2의 활성은 지모그램(zymogram)으로 확인하였다 (도 1 참조). 그러나, 암세포 배양액으로부터 정제한 MMP-2는 그중 일부가 TIMP-2와 결합되어 있고 젤라틴-세파로즈 컬럼으로는 분리하기 어려운 문제가 있어 순수한 MMP-2만을 얻기 위하여 바큘로바이러스 시스템(Baculovirus system)을 이용하여 Sf9 곤충세포에서 발현시켰다. 우선 MMP-2 cDNA를 pBS-KS에 다시 클로닝하고 pBS-GEL이라 명명하였다. pBS-GEL의 1.9 Kb MMP-2 cDNA를 포함하는 Xho I과 Not I으로 자른 조각을 pBacPAK 9 이동벡터에 이동시키고 이 이동벡터와 BacPAK6 바이러스 DNA를 인산칼슘방법으로 Sf9 세포에 감염시켰다. Sf9 세포는 10% 소 태아 혈청이 있는 TNM-FH 배지로 27℃에서 키우며, 감염시키기 위하여 세포를 원심분리하고 10⁷세포/ml의 농도가 되도록 혈청이 없는 배지에 재현탁시키고 바이러스와 함께 상온에서 1시간 인큐베이션하였다. 감염된 Sf9 세포는 96시간동안 키우고 배지를 수거하여 MMP-2 정제방법에 따라 정제하였다. 바큘로바이러스(Baculovirus)에서 얻은 MMP-2는 암세포배양액에서 얻은 MMP-2보다 자가분해가 잘되어 MMP-2가 잘려지는 경향을 보였다.

(단계 2) MMP-2 활성억제 실험

본 발명의 펩타이드들이 대상물질인 MMP-2의 활성을 억제하는 것을 정량적으로 분석하기 위하여 이들 펩타이드들을 MMP-2와 상온에서 20분간 인큐베이션시킨 후³H 콜라젠 I을 기질로 하여 콜라게네이즈 완충액(50mM Tris, pH 7.5, 200mM NaCl, 10mM CaCl₂, 0.05% Brij 35, 0.02% NaN₃)와 37℃에서 인큐베이션시킨다. 이때 1mM APMA를 첨가하여 MMP-2를 활성화시킨다. 250mM EDTA로 반응을 중단시키고 10% TCA/0.5% 탄닌산을 첨가한 후 13000 rpm에서 10분간 원심분리하고 상층액을 조심스럽게 취하여 신틸레이션 측정기로 방사능의 양을 측정하였다. 본 발명에서 합성한 펩타이드들을 가지고 MMP-2 활성 억제 실험을 한 결과 야생형 TIMP-2의 6번부터 15번까지의 아미노산 배열을 포함하는 펩타이드 HB 700은 MMP-2 활성을 억제하는 효과가 없었으나 HB 700을 변형한 HB 703은 MMP-2 활성을 강하게 억제하였다. 합성한 펩타이드들을 가지고 야생형 rTIMP-2에 비하여 효과가 좋은 펩타이드를 스크리닝한 결과 도 2에 나타난 바와같이 HB 703, HB 710, HB 711, HB 714가 MMP-2 활성을 억제하는데 야생형 rTIMP-2와 효과가 비슷하거나 더 좋은 효과를 나타냈다.

실시예 4 전이를 측정하는 동물실험 (Experimental metastasis model)

생후 6-7주의 C57BL/6 웅성 마우스를 그룹당 10마리씩 분할하고 마리당 5 × 10⁴개의 B16 멜라노마 세포를 꼬리에 정맥 주사하고 주사한 날로부터 먼저 rTIMP-2를 기준으로 하여 투여 용량을 정하기 위하여 rTIMP-2를 마리당 0.2mg씩 3회 복강내 주사, 0.5mg씩 2회 복강내 주사 또는 1.0mg씩 1회 정맥주사하여 야생형 rTIMP-2의 전이억제 효과를 측정하였다. 2주 후에 부검하여 현미경을 이용하여 폐에 전이된 콜로니수를 세었다. rTIMP-2를 마리당 0.2mg씩 3회 복강주사하였을 경우 B16 멜라노마세포가 폐로 전이한 콜로니수는 대조군에 비하여 39% 억제되었고, 0.5mg씩 2회 복강주사했을 경우 70% 억제되었으며, 1.0mg씩 1회 정맥주사했을 경우 82% 억제되었다 (도 2 참조). 상기 실험에 의거하여, MMP-2활성 억제 실험으로 효과가 있는 펩타이드들을 0.2mg씩 3회(총 0.6mg/마리) 복강주사하고 2주 후 폐로 전이된 콜로니수를 측정하여 rTIMP-2와 전이억제 효과를 비교해 보았다. rTIMP-2가 39% 정도로 전이를 억제할 때 같은 용량인 0.2mg씩 3회 복강주사한 경우, 펩타이드 HB 703이 66%로서 가장 좋은 전이억제효과를 나타냈으며, HB 714가 그 다음으로 45% 억제효과를 보였다. 그 밖에 MMP-2 활성억제 실험에서 효과가 있었던 HB 710, HB 711은 대조군과 거의 가까운 수의 콜로니가 폐에 생긴것으로 보아 억제 효과가 전혀 없었고, MMP-2 활성억제 효과가 없던 HB 707은 동물실험에서도 역시 효과를 나타내지 못했다 (표 1 참조).

[표 1]

펩타이드에 의한 전이 억제실험

실시예 5 선도물질로부터 변형된 펩타이드의 합성

TIMP-2의 6번부터 15번까지의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 HB 703을 선도물질로 하여 HB 703을 다이머(dimer)의 형태로 한 펩타이드(HB 715)를 합성하였고, 선도물질인 HB 703의 효능을 극대화하기 위하여 HB 703에 암세포가 부착하는 것을 억제한다고 알려진 아미노산 배열을 첨가하였다. 즉, 암세포 수용체가 인지하는 피브로넥틴(fibronectin), 비트로넥틴(vitronectin)의 일부인 RGD 아미노산 배열을 붙이거나(HB 716), 라미닌(laminin)을 인지하는 YIGSR 아미노산 배열을 붙이거나(HB 717), 또는 SIKVAV 아미노산 배열을 붙인 펩타이드(HB 718)들을 합성하고 정제하였다. 또한 HB 703에 MMP-2 억제에 중요한 역할을 한다고 생각하는 히스티딘을 위치를 바꾸어 삽입하거나(HB 719, HB 723), 아미노산 하나를 히스티딘으로 바꾼 펩타이드(HB 722)를 합성하였으며, HB 703에서 아미노산이 2개가 적어진 펩타이드를 합성하였고(HB 721), 히스티딘을 삽입한 펩타이드를 합성하였다(HB 724). 또한 각각의 HB 703과 HB 710을 디설파이드 결합으로 연결시킨 펩타이드(HB 726)를 합성하고, HB 703과 HB 710을 연이어 합성한 후 디설파이드 결합으로 연결시킨 펩타이드(HB 727)를 합성하고 정제하였다.

가지 친 펩타이드의 합성은 상기 실시예 1에서 기술한 바와같이 ABI사의 431A 자동합성기를 이용하였다. 파라히드록시 메틸페닐옥시메틸 폴리스티렌(HMP) 레진에 먼저 Fmoc-Gly(Advanced Chemtech.)을 반응시켜 글리신을 붙이고, 이어서 라이신의 측쇄 끝에 있는 아미노 그룹에 Fmoc을 붙인 Fmoc-Lys(fmoc)을 반응시키면, 그 다음부터는 데프로텍션한 후 아미노 그룹이 분자당 2개씩 노출되므로 합성된 펩타이드 한 분자에 같은 서열의 펩타이드가 2개씩 존재하게 된다. 이러한 방법으로 HB 703으로부터 가지친 펩타이드 HB 715를 합성하였다.

합성한 펩타이드들의 아미노산 서열은 다음과 같다.

HB 703 : VHPQQAFCNEHA

HB 715 :

HB 716 : RGDVHPQQAFCNEHA

HB 717 : YIGSRVHPQQAFCNEHA

HB 718 : SIKVAVVHPQQAFCNEHA

HB 719 : VHPQQHAFCNEHA

HB 721 : PQQAFCNEHA

HB 722 : VHPQQHFCNEHA

HB 723 : VHPQQAFCHNEHA

HB 724 : PQQHAFCNEHA

HB 726 :

HB 727 :

실시예 6 MMP-2 활성 억제 효과의 측정

도 4에서 보는 바와 같이 HB 718, HB 726 및 HB 727이 MMP-2 억제 효과가 매우 좋았으며, 그 다음으로 HB 715, HB 716, HB 722, HB 723, HB 724, HB 719, HB 717 순으로 억제 효과를 보였으며, 모두 HB 703에 비하여 MMP-2 억제효과가 증대되었음을 보여주었다. 그러나 이 펩타이드들을 가지고 C57BL/6 마우스에서 정맥주사한 B16BL6 세포가 폐로 전이하는 것을 억제하는 동물실험을 한 결과 HB 718이 그중 효과가 좋았으나 다른 펩타이드중에서는 HB 715, HB 719, HB 722와 HB 723이 HB 703과 비슷한 효과를 보였다.

실시예 7 생존연장 실험

C57BL/6마우스에 0.2ml HBSS에 현탁시킨 2 × 10⁵개의 B16BL6 멜라노마 세포를 피하주사하고 무작위로 섞어 한 그룹당 6마리로 나누어 마리당 0.2mg씩 rTIMP-2와 각각의 펩타이드 HB 703, HB 715, HB 719, HB 722와 HB 723을 매일 복강주사하여 30일 동안 생존율을 측정하여 효과가 좋은 것을 선별하였다. 즉, C57BL/6 마우스에 B16BL6를 피하주사하여 고형암을 일으키고 한달동안 대조군의 개체수와 rTIMP-2와 펩타이드들을 각각 주사한 그룹의 개체수의 변화를 비교해 본 결과 HB 703이 가장 효과가 좋았고, rTIMP-2와 HB 715도 생존연장 효과가 있었다. 암세포를 주입후 한달 동안 대조군은 6마리에서 2마리로 줄어든데 비해 HB 703과 rTIMP-2와 HB 715 처리군은 한 마리만 사망하고 5마리가 남았다(도 5 참조). HB 719, HB 722와 HB 723은 대조군과 유사한 결과를 보였다(도 6 참조).

실시예 8 마트리젤(Matrigel)에서 HUVE 세포의 관형성에 대한 영향

혈관신생에 대한 효과를 간접적으로 알 수 있는 실험관내 실험으로써 사람의 혈관내피세포에 의한 모세혈관과 같은 구조 형성에 미치는 영향을 관찰하였다. 관형성(Tube Formation) 실험을 시행하기 위하여 우선 HUVE(Human Umbilical Vein Endothelial) 세포를 얻는 실험을 시행하였다. 즉, 제왕절개수술로 얻은 신선한 사람의 탯줄에서 정맥의 내피세포를 분리한 후 혈관내피세포를 배양하여 얻은 세포를 VIII 인자의 항체를 이용한 세포면역학적 염색으로 HUVE 세포를 성공적으로 분리함을 확인한 후 혈관내피세포를 마트리젤(Matrigel)상에서 배양하였다. 마트리젤을 젤화시킨 다음 마트리젤 위에서 내피세포들을 배양하면 2차원적 관형성을 하는데, 37℃에서 16-18시간 배양후에 관찰되는 망상의 관구조는 혈관형성의 한 과정으로 생각할 수 있으며, 이때 야생형 TIMP-2들을 100ug/ml 농도로 처리하였을 때와 같은 농도의 펩타이드들을 각각 처리하였을 때 나타나는 결과를 관찰함으로써 혈관신생에 미치는 영향을 간접적으로 확인하였다. rTIMP-2를 처리하였을 때 관형성을 강하게 억제하여 튜브(tube)간의 연결이 끊어진 곳이 많이 보이고 300ug/ml을 넣어주면 튜브를 형성한 세포들이 제대로 형체를 갖추지 못하는 결과를 보였다(도 7 참조). HB 703, HB 715와 HB 718도 100ug/ml 및 300ug/ml 농도에서 rTIMP-2에 비하면 정도는 약하였으나 HUVE 세포의 관형성을 억제하였고 HB 718은 300ug/ml 농도에서 관을 형성한 세포들이 강하게 뭉치는 현상을 보였다(도 8 참조).

실시예 9 혈관신생을 측정하는 동물실험(Mouse matrigel model)

동물실험으로 전이억제 효과가 있고 생존연장 실험에서 효과를 보였으며 HUVE 세포의 관형성을 억제하는 후보물질 HB 703과 HB 715와 HB 718이 동물실험으로 혈관신생을 억제하는지를 마우스 마트리젤 모델(Mouse matrigel model)로 확인하였다. 6-8주의 C57BL/6 마우스에 마트리젤 0.5ml와 혈관신생유도인자인 염기성 FGF 1ng/ml 및 헤파린 20-40 단위/ml을 혼합하여 피하주사하면 강한 혈관신생이 된다. 3-5일후 표피를 제거하여 마트리젤을 조심스럽게 분리하여 젤을 회수한 후 드랩킨(Drabkin) 시약을 이용하여 헤모글로빈 양을 측정하였다. 전이억제 효과가 인정된 펩타이드 HB 703 및 그 유도체들과 rTIMP-2 각각을 상기의 마트리젤에 섞었을 때 혈관신생 억제효과를 대조군에 비하여 정량적으로 측정해 본 결과 HB 718이 가장 혈관신생 억제효과가 좋았으며, 그 다음으로 HB 705, HB 703, rTIMP-2순으로 효과가 있었다(도 9 참조).

실시예 10 누드 마우스에서 사람 위암에 대한 약효실험

연세 암센타에서 수립한 사람의 위암 세포주인 KHH를 배양하여 Balb/C/nu/nu 5주령 숫컷 누드 마우스(미국 B K Universal Inc. 로 부터 구입)에 마리당 5 × 10⁶개의 위암 세포를 피하로 주입하여 이종이식하고 HB 703, HB 715 및 HB 718을 마리당 0.2mg씩 종양 주입 1일째부터 복강으로 매일 주사하였다. 대조군은 생리식염수를 주사하였다. 종양크기의 변화는 5일째부터 매일 측정하였고 치료 21일째 쥐를 희생하여 종괴를 적출한 다음 피부를 벗겨내고 최종 크기와 무게를 측정하여 펩타이드의 효과를 측정하였다. 도 10에서 보는 바와 같이 HB 703을 투여한 군은 21일후 최종 종양의 부피가 대조군에 비해 60%정도 밖에 되지 않았다. HB 703은 종양의 부피와 무게에서 모두 확실하게 효과가 있었으며, HB 715는 HB 703보다는 낮았으나 효과가 있었고, HB 718은 종양의 부피에서는 효과가 없었으나 무게에서는 효과가 있었다(도 10 및 도 11 참조).

실시예 11 누드 마우스에서 사람 위암에 대한 생존연장 실험

펩타이드에 의한 생존기간 연장을 관찰하는 실험은 실시예 10의 약효실험과 동일한 방법으로 시행하되 위암세포주를 이종이식한 날로부터 펩타이드를 마리당 0.2mg씩 복강으로 매일 주사하였으며, 쥐가 사망할 때까지 치료를 진행하였다. 종양 주입후 44일까지 진행된 결과를 분석해 보면 이 실험에서도 HB 703이 가장 효과가 좋았으며, 확실하게 생존연장의 효과가 있었다. 그 다음으로 HB 715가 효과가 있었다. 또한 종양주입후 44일까지 종양의 크기를 면적으로 비교하였을 때 약간의 곡선 변화가 있었으나 이는 마우스가 사망할 때 종양의 크기 변화가 있었기 때문이라 생각되며 HB 703은 대조군에 비해 종양의 성장을 억제하고 있음을 보여주고 있다. 이 결과는 B16BL6에 대한 생존연장 실험 결과와 일치하였다. HB 715는 후반부에 가서 효과를 나타냈으며 HB 718은 별 효과가 없었다(도 12 및 도 13 참조). 후보물질들의 약효시험과 생존연장 실험을 진행하는 동안 마우스의 몸무게가 줄지 않았으며 별다른 독성현상도 보이지 않았다.

본 발명의 합성펩타이드는 타입 IV 콜라게네이즈의 활성을 억제하는 TIMP-2의 아미노산 서열 6번에서 15번까지의 서열을 갖는 펩타이드에서 유래되어 변형되거나 TIMP-2의 아미노산 서열 108번에서 126번까지의 아미노산 서열을 포함하거나 첨가된 펩타이드로서 이들 펩타이드들은 MMP-2의 활성을 억제함으로써, 혈관신생을 억제하여 암의 성장을 억제하고, 전이를 막아 생명을 연장시키는 효과를 나타내므로, 이들 합성펩타이드는 다음과 같은 여러 가지 용도로 사용될 수 있다.

이 펩타이드들은 고형암의 성장과 전이를 억제하고, 외과수술 후 미세전이가 있더라도 더 이상의 성장을 막고 전이를 억제하는 전이억제제 즉 항암제로 사용할 수 있다.

또한, 과다한 혈관신생으로 인한 질병의 치료제로 사용될 수 있다. 예를 들면 과다한 MMP의 활성에 의한 질병; 관절염, 당뇨병성 망막증, 비대성 반흔, 건선, 점막 및 상피조직의 궤양, 자가면역에 의한 염증, 폐손상, 육아종성 질환에 사용할 수 있으며, 기저막의 분해와 관련된 질병; 낭창, 자가면역성 신경장애, 근세포 파괴, 즉 심근경색증, 사구체 이상에도 사용될 수 있으며, 특히 안과 질환중 신생혈관성 녹내장, 눈의 혈관 형성 등 안압을 낮추는데도 적용할 수 있다.

Claims (24)

1. TIMP-2의 아미노산 서열 6번에서 15번까지의 서열을 갖는 펩타이드에서 유래되어 변형되거나 TIMP-2의 아미노산 서열 108번에서 126번까지의 아미노산 서열을 포함하거나 첨가된 펩타이드로서 타입 IV 콜라게네이즈의 활성을 억제하는 펩타이드.
2. 제 1항에 있어서, 아미노 말단부터의 아미노산 서열이 VHPQQAFCNEHA 인 펩타이드.
3. 제 1항에 있어서, 아미노 말단부터의 아미노산 서열이인 펩타이드.
4. 제 1항에 있어서, 아미노 말단부터의 아미노산 서열이 SIKVAVVHPQQAFCNEHA 인 펩타이드.
5. 제 1항에 있어서, 아미노 말단부터의 아미노산 서열이 RGDVHPQQAFCNEHA 인 펩타이드.
6. 제 1항에 있어서, 아미노 말단부터의 아미노산 서열이 YIGSRVHPQQAFCNEHA 인 펩타이드.
7. 제 1항에 있어서, 아미노 말단부터의 아미노산 서열이 VHPQQHAFCNEHA 인 펩타이드.
8. 제 1항에 있어서, 아미노 말단부터의 아미노산 서열이 PQQAFCNEHA 인 펩타이드.
9. 제 1항에 있어서, 아미노 말단부터의 아미노산 서열이 VHPQQHFCNEHA인 펩타이드.
10. 제 1항에 있어서, 아미노 말단부터의 아미노산 서열이 VHPQQAFCHNEHA인 펩타이드.
11. 제 1항에 있어서, 아미노 말단부터의 아미노산 서열이 PQQHAFCNEHA인 펩타이드.
12. 제 1항에 있어서, 아미노 말단부터의 아미노산 서열이인 펩타이드.
13. 제 1항에 있어서, 아미노 말단부터의 아미노산 서열이인 펩타이드.
14. 제 1항에 있어서, 아미노 말단부터의 아미노산 서열이 DTLSTTQKKSLNHRYQMGCA 인 펩타이드.
15. 제 1항에 있어서, 아미노 말단부터의 아미노산 서열이 PVHPQQAFCNPGCQYRHNLSHKQTTSL 인 펩타이드.
16. 제 1항에 있어서, 아미노 말단부터의 아미노산 서열이인 펩타이드.
17. 제 1항 부터 제 16항 까지 어느 한 항에 있어서, 펩타이드 말단의 아미노기가 아세틸, 포르밀, 벤조일, 트리플루오로아세틸, 숙시닐, 메톡시숙시닐 등과 같은 아실그룹, 벤질 옥시카보닐 같은 방향족 우레탄 그룹, 3차 부틸 옥시카보닐, 아다만틸 옥시카보닐, 플루오레닐 메틸 옥시카보닐 같은 지방족 우레탄 그룹으로 치환된 펩타이드.
18. 제 1항 부터 제 16항 까지 어느 한 항에 있어서, 펩타이드 말단의 카르복실기에 아미노기가 붙거나, 3차 부틸, 벤질 또는 다른 그룹이 에스터 또는 에테르 결합으로 연결된 펩타이드.
19. 제 1항 부터 제 16항 까지 어느 한 항에 있어서, L-아미노산을 이용하여 합성한 펩타이드.
20. 제 1항 부터 제 16항 까지 어느 한 항에 있어서, 펩타이드 서열중 일부 아미노산이 D-아미노산으로 치환된 펩타이드.
21. 제 1항 부터 제 16항 까지의 펩타이드 서열의 아미노기와 카르복실기가 서로 바뀌도록 순서를 반대로 하고 D-아미노산을 이용하여 합성한 펩타이드.
22. 제 1항 또는 제 21항에 있어서, 펩타이드 서열중 일부 아미노산이 하이드록시프롤린, 하이드록시라이신, 시스틴, 타이록신, 노르로이신, 피로글루탐산 등과 같은 아미노산 유도체로 치환된 펩타이드.
23. 제 12항, 제 13항 또는 제 16항에 있어서, 펩타이드의 디설파이드 결합을 황 대신 알킬기 등으로 변형하여 고리를 형성하게 만든 펩타이드.
24. 전이억제제, 항암제로 사용하거나 또는 과다한 MMP의 활성에 의한 질병인 관절염, 당뇨병성 망막증, 비대성 반흔, 건선, 점막 및 상피조직의 궤양, 자가면역에 의한 염증, 폐손상, 육아종성 질환; 기저막의 분해와 관련된 질병인 낭창, 자가면역성 신경장애, 근세포 파괴, 즉 심근경색증, 사구체 이상; 또는 안과질환증 신생혈관성 녹내장, 눈의 혈관형성 등과 같은 과다한 혈관신생으로 인한 질환의 치료제로서의 용도.