KR19980043586A

KR19980043586A - 그레이브스 질환의 길항작용 펩티드 및 그의 용도

Info

Publication number: KR19980043586A
Application number: KR1019960061509A
Authority: KR
Inventors: 채시범; 류성호; 조보현; 서판길; 박준영; 김인정; 이미화; 서정곤
Original assignee: 권계홍; 주식회사 녹십자; 정명식; 학교법인 포항공과대학
Priority date: 1996-12-04
Filing date: 1996-12-04
Publication date: 1998-09-05
Also published as: KR100208207B1

Abstract

본 발명은 그레이브스 질환의 길항작용 펩티드에 관한 것으로, 구체적으로는 무작위 펩티드 서열 혼합물로부터 선별된 그레이브스 질환 특이적 자가면역항체에 억제작용이 있는 펩티드 EXFDDA(X는 T,H 또는 E이다.) 및 그의 용도에 관한 것이다.

Description

그레이브스 질환의 길항작용 펩티드 및 그의 용도

본 발명은 그레이브스 질환의 길항작용 펩티드에 관한 것으로, 구체적으로는 무작위 펩티드 서열 혼합물(Peptide Library, 펩티드 라이브러리)로부터 선별된 그레이브스 질환 특이적 자가면역항체에 억제작용이 있는 펩티드 및 그의 용도에 관한 것이다.

정상적인 인간의 갑상선 호르몬 갑상성 자극 호르몬에 의하여 그 합성이 조절되는데, 이는 사상하부에서 분비된 자극 호르몬이 갑상선 조직 세포에서 세포막의 갑상선 자극 호르몬 수용체와 결합하면 G 단백질(G protein)과 아데닐레이트 사이클레이즈(adenylate cyclase)를 경유하는 일련의 신호전달과정을 거쳐 갑상선 호르몬을 합성하게 되며, 갑상선 호르몬이 그 목적기관에 작용하고 그 정도가 정상치를 넘어서면 시상하부에서의 갑상선 자극 호르몬의 발현을 억제하여 결국 갑상선 호르몬의 합성을 억제하게 된다.

그레이브스 질환은 이러한 조절없이 계속적으로 갑상선 호르몬을 합성하여 계속적으로 갑상선 기능이 항진되는 질환으로, 이는 그레이브스 질환의 환자가 갑상선 자극 호르몬 수용체에 대하여 자가면역항체를 가지고 있어 갑상선 자극 호르몬의 작용없이도 일련의 신호전달과정을 거쳐 계속적으로 갑상선 호르몬을 합성하는데서 기인한다.

그레이브스 질환의 치료를 위하여 비선별적인 갑상선 기능 저하제나 갑상선 조직제거 등의 외과 시술이 병행되고 있으나, 비선별적 갑상선 기능 저하제를 사용할 경우 재발의 우려가 높으며 갑상선 조직을 제거할 경우는 지속적으로 갑상선 호르몬을 투여하여야 하고 비정상적인 신체 항상성을 가진다는 문제가 있다.

본 발명자들은 상기한 기존의 방법들의 문제점을 극복하면서 보다 근본적으로 그레이브스 질환을 치료하는 방법에 대하여 연구를 거듭한 결과, 갑상선 자극 호르몬 수용체에 결합하는 펩티드를 펩티드 라이브러리로부터 이 펩티드가 그레이브 질환 환자에서 갑상 선 자극 호르몬에 의한 갑상선 호르몬의 합성에는 영향을 미치지 않으면서 갑상선 자극 호르몬 수용체에 대한 자가면역항체가 갑상선 자극 호르몬 수용체에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하여 결국 자가면역항체에 의한 갑상선 호르몬 합성을 억제한다는 사실을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 그레이브스 질환에 길항작용을 가지는 펩티드, 이를 이용한 진단시약 및 치료제를 제공하는데 있다.

제1도는 펩티드 라이브러리에서 갑상선 자극 호르몬 수용체와 그레이브스 질환환자의 면역글로블린과의 결합을 억제하는 펩티드의 1차 검색 결과를 나타내는 그래프이다.

제2도는 부분적 펩티드 라이브러리에서 갑상선 자극 호르몬 수용체와 그레이브스 질환 환자의 면역글로블린과의 결합을 억제하는 펩티드의 2차 검색 결과를 나타내는 그래프이다.

제3도는 부분적 펩티드 라이브러리로부터 검색되어 정제된 단일 펩티드들이 갑상선 자극 호르몬 수용체와 그레이브스 질환 환자의 면역글로블린과의 결합을 억제하는 정도를 나타내는 그래프이다.

제4도는 갑상선 자극 호르몬 수용체가 발현되는 CHO 세포에서 단독적으로 합성된 펩티드들이 그레이브스 질환의 자가면역항체에 의한 cAMP의 형성을 감소시키는 결과를 나타내는 그래프이다.

제5도는 펩티드 EEFDDA에 의하여 cAMP의 형성이 억제되는 그레이브스 질환 환자군을 나타내는 그래프이다.

제6도는 펩티드 EEFDDA에 의하여 cAMP의 형성이 억제되지 않는 그레이브스 질환 환자군을 나타내는 그래프이다.

본 발명은 그레이브스 질환의 길항 작용을 나타내는 펩티드에 관한 것으로서, 무작위 펩티드 라이브러리로부터 선별되고, 갑상선 자극 호르몬 수용체에 결합하는 펩티드 EXFDDA(X는 T,H 또는 E이다)를 사용함을 특징으로 한다.

본 발명의 명세서 및 도면에서는 아미노산을 표준 단일 약자로 나타내고 있는데, 이 약자의 의미는 통상의 생화학 교재, 예를 들면 1984년 뉴욕 Worth Publisher, 2nc.에서 출판된 Lehniger Principles of Biochemistry에 나와 있다.

또한, 본 발명은 펩티드 EXFDDA(X는 T,H 또는 E이다)를 함유하는 그레이브스 질환의 진단시약을 제공한다.

본 발명의 펩티드 EXFDDA는 갑상선 자극 자가면역항체와 결합하는 것으로 간주되며, 이로써 그레이브스 질환 환자에서 갑상선 자극 호르몬 수용체와 자가면역항체와의 결합을 경쟁적으로 억제하게 된다. 즉 본 발명의 펩티드 EXFDDA는 그레이브스 질환 환자의 자가면역항체의 억제 펩티드가 된다.

또한 본 발명의 펩티드 EXFDDA는 갑상선 자극 호르몬에 의한 갑상선 호르몬의 합성에는 영향을 미치지 않으면서, 자가면역항체에 의한 갑상선 호르몬의 합성을 억제한다.

본 발명의 펩티드 EXFDDA는 그레이브스 환자 50%에 대하여 효과가 있는 것으로 나타났는데, 이는 본 발명의 펩티드 EXFDDA는 그레이브스 환자에서 발견되는 자가면역항체군중에서 일부 자가면역항체를 억제하는데서 기인하는 것으로 보인다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명하나, 본 발명이 이에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

그레이브스 질환 환자의 자가면역항체 확인을 위한 엘리자(ELISA) 방법의 확립

갑상선 자극 호르몬 수용체의 세포바깥부분인 1번에서 413번까지의 아미노산 서열을 대량으로 발현하고, 이를 항원으로 사용하고, 그레이브스 질환 환자의 면역글로블린 G를 첫번째 항체로 사용하여 그레이브스 질환 환자의 자가면역항체를 확인하는 엘리자(ELISA) 방법을 확립하였다.

즉, 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 시스템 전용 벡터인 pSC11에 제한 효소 SmaⅠ위치에 갑상선 자극 호르몬 수용체의 1번에서 413번까지의 아미노산 서열을 발현시키는 유전자를 삽입하여 재조합 벡터를 제조하였다. 이 재조합 벡터를 정상 백시니아 바이러스와 함께 CV-1 원숭이 신장세포종에 전달(transfer)하여 재조합 바이러스를 얻었다. 이 재조합 바이러스를 여성 자궁경부암세포종인 HeLa 3S에 감염시켜, 갑상선 자극 호르몬 수용체의 1번에서 413번까지의 아미노산 서열을 대량으로 발현시켰다. 이를 소수성 단백질 크로마토그래피와 음이온 교환 수지 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다.

96-웰(96-well) 용기에 정제된 갑상선 자극 호르몬 수용체(1번에서 413번까지의 아미노산 서열) 0.1μg을 37℃에서 4시간동안 방치하여 고정시키고, 5% 탈지분유가 든 인산염 완충액으로 37℃에서 한시간 동안 방치하였다. 0.05%의 Tween 20/인산염 완충액으로 용기를 3번씩 세척하였다.

그 다음에 단백질 A(Protein A)를 사용하여 정제한 그레이브스 질환 환자의 면역글로블린 G(Immunoglobulin G) 2.5μg을 37℃에서 시간 동안 처리하였다. 0.05% 농도의 Tween 20/인산염 완충액으로 용기를 3번씩 세척하였다. 인간의 면역글로블린 G에 대한 토끼항체를 2000배로 희석하여 37℃에서 2시간동안 처리하였다. 이때 사용된 두번째 항체는 페록시다아제(peroxidase)가 결합된 것이다. 다시 0.05% Tween 20/인산염 완충액으로 용기를 3번씩 세척한 후, 페록시다아제의 수용성 기질인 0-페닐 디아민 디하이드로클로라이드(O-phenyl diamine dihydrochloride)로 처리하고 적정한 시간 경과한 후 3N 염산으로 반응을 정지시켜 492nm에서 흡광도를 측정하였다.

실시예 2

펩티드 라이브러리의 합성

휴튼의 방법(Houghton R.A., Nature, 84:354, 1991)을 사용하여 펩티드 라이브러리(peptide library)를 합성하였다.

사용된 아미노산은 플루오레닐메톡시카르보닐-아미노산(fluorenylmethoxy carbonyl-amino acid, Fmoc-아미노산)으로, L-알라닌, L-아르기닌-Mtr(4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzene sulfonyl), L-아스파라긴, L-아스파르트산-OtBu(tert-butyl ester), L-글루타민, L-글루탐산-OtBu, L-글리신, L-히스티딘-OtBu, L-이소류신, L-류신, L-리신-Boc, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-타이로신-OtBu, L-발린-, L-세린-tBu(tert-butyl), L-트레오닌-tBu이다.

펩티드 라이브러리는 OXXXXX, XOXXXX, XXOXXX, XXXOXX, XXXXOX, XXXXXO의 6세트를 합성하였는데, 합성방식은 각 세트마다 한 위치는 시스테인과 트립토판을 제외한 18개의 아미노산중 하나로 합성하여 고정하고 나머지 위치는 18개의 아미노산 혼합물로 합성하였다. 예를 들면, OXXXXX의 경우 1번째인 0위치에서 상기한 18개중의 한 아미노산으로 고정하고, 2번째부터 6번째까지의 X위치에는 각 X위치미다 18개의 아미노산 혼합물로 합성하였다.

펩티드 라이브러리의 합성과정은 다음과 같다.

폴리프로필렌 카트리지(Polypropylene cartridge)에 30μM 래피도아미드 수지(rapidoamide resin, 0.6meq/g, 100-200 메쉬, 듀폰사, 미국)를 장치한 후 50% 피페리딘/디메틸포름아미드 3ml를 가하고 9분 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 디메틸포름아미드 3ml로 3회, 메탄올 3ml로 3회, 디메틸포름아미드 3ml로 4회 세척하고, Fmoc-아미노산과 하이드록시벤즈트리아졸(hydroxybenztriazole)을 넣고 상온에서 2시간 동안 흔들면서 반응시키고 상기와 같이 다시 세척한 후 다음 아미노산을 계속 합성하였다. 6번째 아미노산을 세척한 후 최종 Fmoc기를 50% 피페리딘/디메틸포름아미드(1:1, V/V)로 세척한 후 동일 용액을 가하여 9분 동안 반응시켜 떼어낸 다음 삼불화초산/에텐디티올/티오아니졸/증류수(trifluoroaceti cacid/ethandithiol/thioanisole/ D. W., 90:5:4:1, V/V) 용액을 레진에 가하고 16시간 동안 반응시켜 아미노산의 곁사슬 보호기를 제거하였다. 반응후, 얻어낸 삼불화초산 용액을 질소가스를 증발시킨 뒤, 증류수 적당량에 녹이고 디에틸에테르(diethylether) 10ml로 추출하였다. 추출후 남아있는 디에틸에테르를 질소가스를 다시 증발시킨 뒤, 펩티드를 적당 농도씩 분주하여 -20℃에 보관하면서 이후 실험에 사용하였다.

실시예 3

펩티드 라이브러리에서의 1차 검색

경쟁적 엘리자(Competitive ELISA) 방법에 따라, 펩티드 라이브러리에서 갑상선 자극 호르몬 수용체에 대한 자가면역항체의 억제 펩티드를 1차 검색하였다. 검색방법은 첫번째 항체로 갑상선 자극 호르몬 수용체(1번에서 413번까지의 아미노산 서열)와 펩티드 라이브러리를 사용하여 처리하는 과정을 제외하고는 실시예의 1의 방법과 동일하다. 즉 각 웰(well)에 그레이브스 질환 환자의 면역글로블린 G와 실시예 2에서 제조한 펩티드 라이브러리를 각 펩티드 서열의 최종 농도가 1.6nM이 되도록 인산염 완충액으로 섞어넣고 37℃에서 2시간 동안 처리하였다.

전체 반응이 완료된 후, 492nm에서의 흡광도를 측정하여 억제상수를 계산하였다.

억제상수는 1-[(펩티드 처리없이 면역글로블린 G만 처리한 경우의 흡광도-펩티드와 면역글로블린 G 모두를 처리한 경우의 흡광도)/펩티드 처리없이 면역글로블린 G만 처리한 경우의 흡광도]의 백분율로 나타내었다.

그 결과는 제1도와 같다.

즉, N-말단으로부터 첫번째 위치에는 글루탐산이 위치한 경우 갑상선 자극 호르몬 수용체와 자가면역항체와의 결합을 가장 많이 억제시켰으며 그 다음으로 아스파르트산, 글루타민산 순으로 억제 효과가 높은 것으로 나타났다.

또한 세번째 위치에는 페닐알라닌, 티로신 순으로, 네 번째 위치에는 아스파르트산과 글루탐산이, 다섯 번째 위치에는 아스파르트산이 위치한 경우 갑상 선 자극 호르몬 수용체와의 자가면역항체와의 결합을 가장 많이 억제하는 것으로 나타났다.

두번째 위치와 여섯번째 위치에서는 여러 아미노산들이 비슷한 정도로 억제효과를 보였으며, 더 낮은 농도의 0.8nM 농도에서 다시 검색한 경우에는 두번째 위치에는 아스파르트산, 글루탐산, 히스티딘의 순으로 여섯 번째 위치에는 알라닌이 위치한 경우, 갑상선 자극 호르몬 수용체와 자가면역항체와의 결합을 가장 많이 억제하는 것으로 나타났다.

실시예 4

부분적 펩티드 라이브러리에서의 2차 검색

실시예 3의 1차 검색에서 각 위치별로 비교적 억제 효과가 높게 나타난 아미노산을 선택하여 각각 6개 아미노산으로 이루어진 펩티드 6개 세트를 새로 합성하여 이를 부분적 펩티드 라이브러리라 하고, 이 부분적 펩티드 라이브러리에서 갑상선 자극 호르몬 수용체에 대한 자가면역항체의 억제 펩티드를 2차 검색하였다.

부분 펩티드 라이브러리는 XXFDDA, XXFDMA, XXFDSA, XXFEDA, XXFEMA, XXFESA의 6개 세트로 합성하였는데, 이들의 합성은 N-말단으로부터 첫번째 위치에는 글루탐산(E), 메티오닌(M) 및 티로신(T)의 세 종류의 아미노산 혼합물로, 두번째 위치에는 글루탐산(E), 히스티딘(H) 및 티로신(T) 등 세 종류의 아미노산 혼합물로 합성하였고, 세번째 위치에는 페닐알라닌(F)으로, 네 번째 위치에는 글루탐산(E) 및 아스파르트산(D)으로 변화를 주어, 다섯 번째 위치에는 아스파르트산(D), 메티오닌(M), 세린(S)의 세 종류 아미노산으로 변화를 주어, 여섯 번째 위치에는 알라닌(A)으로 고정한 것이다.

부분적 펩티드 라이브러리에서 갑상선 자극 호르몬 수용체에 대한 자가면역항체의 억제 펩티드의 2차 검색은 실시예 3의 1차 검색에서와 동일한 방법으로 하였으며, 그 결과는 제2도와 같다.

6개의 부분적 펩티드 라이브러리중, XXFDDA와 XXFEDA의 부분적 펩티드 라이브러리가 5μm 농도에서 갑상선 자극 호르몬 수용체와 자가면역항체와의 결합을 50% 이상 억제하는 것으로 나타났다. 나머지 4개의 펩티드 라이브러리들은 5μM 농도에서는 거의 작용하지 않는 것으로 나타났으며, 100μM 농도에서 5μM XXFDDA와 XXFEDA 라이브러리에서와 비슷한 정도의 억제효과를 보였다.

XXFDDA의 부분적 펩티드 라이브러리는 갑상선 자극 호르몬 수용체와 자가면역항체와의 결합을 많이 억제하는 것으로 나타났다.

실시예 5

펩티드의 정제 및 아미노산 분석

갑상선 자극 호르몬 수용체와 자가면역항체와의 결합을 많이 억제한 XXFDDA의 부분적 펩티드 라이브러리를 고속 액체 크로마토그래파하여 9개의 단일 펩티드로 정제하고, 그 아미노산 서열과 농도를 결정하였다.

즉 먼저 음이온 교환 수지 고속 액체 크로마토그래피인 AX-300에 XXFDDA의 부분적 펩티드 라이브러리를 적용하고 10mM 인산화 칼륨 수용액(pH 7.4)으로 평형을 유지시킨 후, 염화칼륨 농도구배로 정제하였다.

이렇게 얻은 각각의 시료를 단백질-펩티드 C-18 크로마토그래피에 적용하고 용매 A(증류수/0.05% 삼불화초산)와 용매 B(아세토나이트릴/0.05% 삼불화초산)를 사용하여 60분동안 40%까지의 아세톤이트릴 농도구배로 정제하였다.

이렇게 얻은 각각의 시료들을 모아 실온에서 건조시키고 적당량의 증류수를 가하여 펩티드를 용해시킨 다음, 각 펩티드의 아미노산 분석 및 정량을 하였다. 또한 확실하지 못한 아미노산의 조정은 아미노산 서열 분석기(amino acid sequencer, ABI)로 확인하였다.

각 정제된 시료의 농도를 확인한 후, 실시예 1의 방법에 따라 억제효과를 측정하였다.

그 결과를 제3도와 같다. 9개의 펩티드 중 ETFDDA, EHFDDA 및 EEFDDA의 세 펩티드가 10μM 농도에서 갑상선 자극 호르몬 수용체와 자가면역항체와의 결합을 80%이상 억제하는 것으로 나타났다.

실시예 6

생화학적인 측면에서 자가면역항체의 억제의 검정

실시예 5에서 가장 억제효과가 큰 것으로 나타난 ETFDDA, EHFDDA 및 EEFDDA의 세 펩티드들을 각각 독립적으로 합성하고, 실시예 5에서 기재된 바와 같이 단백질-펩티드 C18 크로마토그래피에 적용하여 정제하였다.

갑상선 자극 호르몬 수용체가 발현되고 있는 중국 햄스터 난소종 CHO 세포 2×10⁵개를 24-웰 용기에 넣고 37℃의 CO₂배양기에서 하루를 보낸 후, 그레이브스 질환 환자 면역글로블린 G와 cAMP 분해효소 억제제인 이소부틸메틸크산틴(IBMX; 3-isobutyl-L-methylxanthine)을 포함하고 염화염이 없는 등장의 헤페스(HEPES) 완충액을 세포에 넣고 37℃의 CO₂배양기에서 3시간 동안 처리하였다. 100% 에탄올을 가하여 세포를 터트린 후, 원시분리하여 상층액을 얻었다.

이 시료의 cAMP 양을 측정하였다. 즉 트리스 완충액으로 다시 녹인 시료 50μl, H³로 표지된 cAMP 및 cAMP 결합단백질을 섞어 200μl로 하고 4℃에서 2시간 동안 반응하였다. 여기에 활성탄을 넣고 12,000 x g에서 3분간 원심분리하여 상층액을 얻고, 여기에 칵테일 용액(Burget Solve, RPI Corp.)을 넣고 베타선 측정기(Liquid scintilattion counter, Canvara Packard)로 측정하였다.

그 결과는 제4도와 같다.

ETFDDA, EHFDDA 및 EEFDDA의 세 펩티드는 25μM 농도에서 그레이브스 질환 환자의 자가면역항체에 의한 cAMP 형성을 50% 감소시키는 것으로 나타났다. 또한 이 펩티드들은 갑상선 자극 호르몬에 의한 cAMP 형성에는 큰 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.

실시예 7

임상실험에서 자가면역항체의 억제의 검정

임상적으로 그레이브스 질환으로 판정된 환자 8명으로부터 면역글로블린 G를 얻고 이들에 대하여 실시예 6의 펩티드 EEFDDA가 자가면역항체에 의한 cAMP 형성을 억제하는지를 실시예 6의 방법에 따라 조사하였다.

그 결과는 제5도 및 제6도에 나타낸 바와 같다.

즉 8명의 그레이브스 질환 환자중 4명의 환자에 대하여는 펩티드 EEFDDA가 25μM 농도에서 자가면역항체에 의한 cAMP 형성을 감소시키는 것으로 나타났으며, 나머지 4명의 환자에 대하여는 25μM 농도에서 자가면역항체에 의한 cAMP 형성에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.

따라서 본 발명의 펩티드 EEFDDA는 그레이브스 질환 환자의 50%에 대하여 효과가 있는 것으로 나타났다.

본 발명의 펩티드 EXFDDA는 그레이브스 질환 환자의 자가면역항체의 억제 펩티드가 된다.

또한 본 발명의 펩티드 EXFDDA는 갑상선 자국 호르몬에 의한 갑상선 호르몬의 합성에는 영향을 미치지 않으면서, 자가면역항체에 의한 갑상선 호르몬의 합성을 억제한다.

본 발명의 펩티드 EXFDDA는 그레이브스 환자 50%에 대하여 효과가 있다.

Claims

EXFDDA(X는 T, H 또는 E이다)의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 펩티드.
EXFDDA(X는 T, H 또는 E이다)의 아미노산 서열을 가지는 펩티드를 함유함을 특징으로 하는 그레이브스 질환 진단시약.
EXFDDA(X는 T, H 또는 E이다)의 아미노산 서열을 가지는 펩티드를 함유함을 특징으로 하는 그레이브스 질환 치료제.