KR19980039953A

KR19980039953A - 테트라옥틸암모늄 브로마이드를 첨가한 쿠마시블루 단백질 검출방법

Info

Publication number: KR19980039953A
Application number: KR1019960059076A
Authority: KR
Inventors: 유경수; 최중갑
Original assignee: 유경수
Priority date: 1996-11-28
Filing date: 1996-11-28
Publication date: 1998-08-17
Also published as: KR100226363B1

Abstract

본 발명은 신속하고 감도 높은 단백질 검출방법에 관한 것으로, 소디움도데실설페이트(SDS)를 포함하는 폴리아크릴아미드 겔 상에 단백질을 부하하여 전기영동시키고, 쿠마시블루 염료로 염색한 후 배경을 탈색시켜 단백질을 검출하는 방법에 있어서, 상기 쿠마시블루 염료에 테트라옥틸암모늄 브로마이드(TOA)를 첨가하여 염색하는 것을 특징으로 하는 본 발명의 단백질 검출 방법에 따르면, 종래의 쿠마시블루 염색법의 감도를 4 배 정도 높일 수 있고 검출에 요하는 시간도 1/10 정도로 단축시킬 수 있다.

Description

테트라옥틸암모늄 브로마이드를 첨가한 쿠마시블루 단백질 검출방법

본 발명은 종래의 쿠마시블루 염색을 이용한 단백질 검출방법에 있어서 검출 시간이 오래 걸리고 감도가 낮다는 단점을 개선하여, 보다 신속하면서도 감도 높은 단백질 검출방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 소디움도데실설페이트(SDS)를 포함하는 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동에 의해 분리된 단백질을 검출하는 방법에 관한 것으로, 종래의 쿠마시블루 염색법에 테트라옥틸암모늄 브로마이드(TOA)를 첨가하여 사용함으로써 검출에 요하는 시간을 대폭 줄이고 검출 감도를 증진시킨 개선된 단백질 검출 방법에 관한 것이다.

소디움도데실설페이트(SDS)를 함유하는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)은 단백질 제제의 순도 시험 및 단백질의 분자량 결정에 사용되는 신뢰도 높은 방법으로 여겨지고 있다[B. D. Hames 및 D. Rickwood, Gel Electrophoresis of Protein: A Practical Approach, 2nd ed., 52-81, IRL Press, Oxford/New York (1990)]. 전기영동후 단백질 밴드의 위치를 확인하기 위해서는 여러가지 방법이 사용되는 데, 특히 쿠마시블루(Coomassie Blue) 염색법[H. Schagger, Aquila H. 및 G. Von Jagow, Anal. Biochem., 128, 412 (1983); 및 W. Diezel, G. Kopperschlager 및 E. Hofmann, Anal. Biochem., 48, 617 (1972)]과 은염색법(silver staining)[Wells, K. 및 Cordingley, J. S., Anal. Biochem., 194, 237 (1991); 및 R. C. Switzer, C. R. Meril 및 S. Shifrin, Anal. Biochem., 98, 231 (1979)]이 가장 널리 사용되고 있다. 이들 중에서도 쿠마시블루 염색이 자주 사용되지만, 이 방법에서는 단백질 검출 감도가 낮고 염색-탈색 과정에 요하는 시간이 18 시간에 이르는 등 검출에 장시간이 소요된다는 단점이 있다[B. D. Zehr, T. J. Savin 및 R. E. Hall, Anal. Biochem., 182, 157 (1989)]. 은염색법은 단백질을 펨토그램(fg: 10^-15g)단위까지 검출할 수 있는 매우 고감도의 방법이기는 하지만[K. Ohsawa 및 N. Ebata, Anal. Biochem., 135, 409 (1983)], 배경 염색의 정도가 심하고 다단계 처리를 요하며 시약이 고가일 뿐 아니라 포름알데히드의 독성 등이 문제가 되어 잘 사용되지 않고 있다[C. R. Meril, R. C. Switzer 및 M. L. Van Keuren, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4335 (1979)].

이처럼 단백질 검출에 있어서는 은 염색법 보다 여러가지로 편리한 쿠마시블루 염색법이 자주 사용되고 있기는 하지만, 낮은 감도와 염색 및 탈색시 속도 문제에 있어서 개선이 필요한 실정이다. 이러한 개선책의 일환으로 칼콘카르복실산(Calconcarboxylic acid)이라는 새로운 염료를 사용하는 방법[H. Y. Hong, J. K. Choi 및 G. S. Yoo, Anal. Biochem, 214, 96 (1993)], 그리고 에반스블루(Evans blue)와 로다민 B(Rhodamine B)의 혼합 염료를 사용하는 방법 등이 있으나, 만족할 정도의 개선을 이루지는 못하고 있다.

본 발명에서는 상기와 같이 단백질 검출을 위한 쿠마시블루 염색법에 있어서 감도를 높이고 처리 속도를 증진시키는 것을 목적으로 한다.

도 1 은 본 발명에 따른 단백질 검출 방법에 있어서, 염색용액으로 0.25 %(w/v) CB 와 1 %(w/v) TOA 용액의 혼합비율에 따라 나타나는 단백질 밴드의 강도를 나타낸 그래프이고,

도 2 는 본 발명에 따른 단백질 검출 방법에 있어서, 혼합 염색용액에서의 염색 시간에 따른 단백질 밴드의 강도를 나타낸 그래프이고,

도 3 는 본 발명에 따른 CB와 TOA 혼합 염색의 감도를 CB 단독 염색의 경우와 비교하여 나타낸 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는 소디움도데실설페이트(SDS)를 포함하는 폴리아크릴아미드 겔 상에 단백질을 부하하여 전기영동시키고, 쿠마시블루 염료로 염색한 후 배경을 탈색시켜 단백질을 검출하는 방법에 있어서, 상기 쿠마시블루 염료에 테트라옥틸암모늄 브로마이드(TOA)를 첨가하여 염색하는 것을 특징으로 하는 단백질 검출 방법을 제공한다.

본 발명에서는 단백질 검출을 위한 쿠마시블루(이하 CB로 약칭) 염색에 있어서, 테트라옥틸암모늄 브로마이드(이하 TOA로 약칭)를 이온쌍 형성제(ion-pairing agent)로 CB와 함께 사용함으로써, CB가 겔 매트릭스에 결합하는 것을 억제시켜 CB의 염색을 증진시키고 배경의 탈색을 용이하게 하여 결과적으로 검출 감도와 속도를 증진시키고자 하였다. 즉, CB는 두개의 설포네이트 그룹을 갖는 음이온성 염료로, 산성 pH에서는 단백질의 프로톤화된 아미노 그룹과 정전기 인력에 의하여 결합할 수 있다[S. Fazekas de St. Groth, R. G. Webster 및 A. Datyner, Biochem. Biophys. Acta., 71, 77 (1963)]. 그러나 폴리아크릴아미드 겔 매트릭스의 구조도 단백질과 유사하기 때문에 CB는 겔 매트릭스와도 비특이적으로 결합하게 되고, 따라서 배경 탈색에 한계가 있게 된다. 단백질의 효과적인 염색을 위해서는 겔 매트릭스와 결합한 과잉의 CB를 쉽게 제거할 수 있어야 하는데, TOA는 이러한 과잉의 CB를 제거하기 위하여 도입된 것이다.

TOA(tetraoctylammonium bromide; [CH₃(CH₂)₇]₄NBr)는 이온쌍 형성제로서 4급 암모늄 양전하를 가지며 4개의 옥틸 그룹으로 인해 소수성을 나타낸다. TOA를 CB와 서로 고농도로 혼합하면, TOA의 4급 암모늄 그룹은 CB의 2개 설포네이트 그룹과 함께 이온쌍 복합체 형성에 참여하게 된다. 즉, TOA는 [CB-TOA] 이온쌍 복합체를 형성하고/하거나 CB 대신 겔 매트릭스에 결합함으로써, CB가 겔 매트릭스에 결합하는 것을 억제할 수 있다. 또한, 단백질 염색의 감도를 증진시키기 위해서는 탈색시간을 줄일 필요가 있는데, TOA를 사용하여 탈색시간을 감소시키면 단백질 염색의 감도를 증진시킬 수 있다.

이하 본 발명에 따른 단백질 검출 방법을 각 단계별로 상세히 설명한다.

먼저, 소디움도데실설페이트(이하 SDS)를 포함하는 폴리아크릴아미드 겔 상에 단백질을 부하하여 전기영동시킨다. 한편, 겔 중의 SDS는 단백질의 소수성 영역에 대한 CB의 결합을 저해하기 때문에 이를 제거하기 위하여 염색전에 겔 세척 단계를 추가로 포함시키는 것이 바람직하다. 즉, 전기영동시킨 겔을 물 중에 함침시켜 겔 용기를 5 분 정도 진탕하는 것에 의하여 겔을 물로 세척하면 겔의 배경이 보다 명확해지고 탈색 시간이 줄어들게 된다.

CB와 TOA를 함께 포함하는 혼합 염색용액을 제조하고, 위에서 세척된 겔을 여기에 함침시켜 진탕함으로써 염색을 실시한다. 이 때, CB와 TOA의 혼합 염색용액은 0.25 % CB와 1 % TOA를 (10 : 0.6)의 용적비율로 혼합하는 것이 바람직하고, 염색시간은 약 20 분 정도로 하는 것이 바람직하다.

위와 같이 염색된 겔을 탈색용액중에서 진탕하여 탈색시키는 데, 40 % 메탄올/7 % 아세트산 용액으로 30 분 동안 탈색시키는 것이 바람직하다.

이처럼, CB에 TOA를 혼합하여 사용하는 본 발명의 단백질 검출 방법에 의하면, 종래의 CB 염색법에서 단백질 검출에 소요되는 시간을 단축시킬 수 있으며, 단백질 검출 한계도 4 배 정도 개선시킬 수 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명의 예시를 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 만으로 제한되는 것은 아니다.

실시예에서 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드, N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민, 아크릴아미드, 암모늄 퍼설페이트, 트리스 염기, 글리신, SDS, 분자량 표지 단백질[소혈청알부민(BSA), 오브알부민(OVA), 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드

로게네이즈(G-3-P DHase), 카르보닉 안하이드레이즈(CA)], 쿠마시블루(CB), 테트라옥틸암모늄 브로마이드(TOA), 및 기타 전기영동용 시약은 시그마 케미칼사(St. Louis, MO, USA)에서 입수한 것이고, 이 밖에 다른 시약은 분석용 등급으로 국내 공급업자에게서 구입한 것이다.

실 시 예 1

(단계 1) 전기영동(Electrophoresis)

램리의 문헌(U. K. Laemmli, Nature, 227, 680 (1970))에 기재된 것과 실질적으로 동일한 방법에 따라 SDS를 포함하는 슬랩 겔을 제작하였다. 바이오-래드(Bio-Rad) 단백질 정량 스탠다드 I(소 혈청-글로불린)을 표준품으로 사용하여, 브랫포드의 방법(M. M. Bradford, Anal. Biochem., 72, 248 (1976))에 따라 단백질 농도를 결정하였다. 전기영동을 실시하기 전에 시료를 시료 완충액(70 mM 트리스-HCl, pH 6.8, 11.4 % 글리세롤, 3 % SDS, 0.01 % 브롬페놀블루, 5 %-머캡토에탄올)중 100 ℃ 수욕상에서 5분 동안 가열하였다. 반응 완충액의 조성은 다음과 같다: 0.025 M 트리스, 0.2 M 글리신, 0.1 % SDS, pH 8.3. 길이 1.5 cm의 스택 겔(4.5 %)을 아크릴아미드 : 비스아크릴아미드의 비율이 (30 : 0.8)인 7.5 % 또는 12.5 %의 아크릴아미드 분리 겔 상에 적층하였다. 단백질 농도는 BSA 10 mg; OVA 10 mg; G-3-P DHase 12 mg; CA 8.6 mg 으로 하여 각 웰에 부하시킨 후, 모델 SE 400 슬랩 겔 장치(Hoefer Sci. Ins., San Francisco, CA, USA)에서 200 V의 정전압하에 약 2 시간 동안 전기영동시켰다.

(단계 2) 염색, 탈색 및 밀도측정(Densitometry)

탈색용액(40 % 메탄올/7 % 아세트산) 중 0.25 %(w/v)의 CB 및 1 %(w/v)의 TOA의 용액을 용적비 10 : 0.6 로 혼합하여 염색용액을 조제하였다(음전하를 띤 CB와 양전하를 띤 TOA는 1 시간 이내에 서로 침전하는 경향이 있으므로, 사용전에 바로 조제하여야 함). 전기영동 겔을 물로 5 분 동안 세척하고, 겔을 함유한 수조를 32-WBS-40 진탕기(Jonsham Co., Korea)를 사용하여 진탕시키면서 염색용액 중에서 20 분 동안 염색하였다. 탈색은 염색된 겔을 탈색용액 중에 함침시켜 30 분 동안 진탕시키는 것에 의하여 수행하였다. 겔을 ME-2B 겔 건조기(Vision Sci. Co., Korea)를 사용하여 70 ℃에서 30 분 동안 와트만 No. 1 여지상에서 건조시켰다. 건조된 겔을 590 nm에서 CS-9000 덴시토메터(Schimadzu Co., Japan)로 스캐닝하였다.

실 시 예 2 내지 5

실시예 1에서 0.25 %(w/v) CB와 1 %(w/v) TOA를 각각 (10 : 0.4), (10 : 0.75), (10 : 0.8) 및 (10 : 1)의 용적비율로 혼합하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.

도 1 은 본 발명에 따른 단백질 검출 방법에 있어서, 염색용액으로 0.25 %(w/v) CB 와 1 %(w/v) TOA 용액의 혼합비율에 따라 나타나는 단백질 밴드의 강도를 나타낸 그래프이다. 여기에서 보면, 최대 단백질 밴드 강도를 나타내는 CB : TOA 용액의 최적 혼합비율은 (10 : 0.6) 이고, 이보다 TOA 용액의 비율이 높을 때는 단백질 밴드 강도가 TOA 농도에 반비례하여 감소하는 것을 알 수 있다.

실 시 예 6 내지 8

실시예 1에서 염색/탈색 시간을 10/25, 30/50 및 40/80 분으로 하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하였다.

도 2 는 본 발명에 따른 단백질 검출 방법에 있어서, 혼합 염색용액에서의 염색 시간에 따른 단백질 밴드의 강도를 나타낸 그래프이다. 여기에서 보면, 동일한 염색용액을 사용하였을 때 최적 염색/탈색 시간은 각각 20/30 분이라는 것을 알 수 있다. 염색 시간이 40 분 이상으로 되면 탈색시간도 길게 요구되나, 그 만큼 밴드 강도를 증가시키지는 못하였다.

비 교 예

실시예 1에서 0.25 % CB 단독 용액으로 염색하고, 탈색 시간을 7시간으로 하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하였다.

도 3 은 본 발명에 따른 CB와 TOA 혼합 염색의 감도를 CB 단독 염색의 경우와 비교하여 나타낸 것으로, a는 CB 단독 염색, b는 CB와 TOA 혼합 염색한 경우이다. 겔 레인당 적용된 BSA의 양은 좌에서 우로 각각 5, 2.5, 1.0, 0.75, 0.5, 0.25, 0.1, 0.075, 0.05, 0.025 및 0.01 g이고 화살표는 검출 한계를 나타낸다. 도 3 에서 보듯이, 0.25 % CB 단독 용액으로 염색하는 경우 BSA의 검출한계는 100 ng인 반면, 본 발명의 0.25 % CB와 1 % TOA 혼합용액에 의한 염색 방법을 사용한 경우에는 검출한계가 BSA 25 ng으로 CB 단독 염색의 경우에 비하여 감도가 4 배 증가한 것을 알 수 있다.

표 1 은 CB 단독 및 TOA를 첨가한 CB로 염색하는 경우 필요로 하는 시간 및 검출한계를 요약한 것이다.

염료	검출 한계	총 소요 시간
비교예 (CB)실시예 (CB + TOA)	100 ng25 ng	8 ∼ 12 시간50 분

이처럼, CB에 TOA를 함께 혼합하여 사용하는 본 발명의 단백질 검출 방법에 의하면, 종래의 CB 염색법에서 단백질 검출에 소요되는 시간이 8-10 시간인데 비하여 이를 50 분까지 단축시킬 수 있을 뿐 아니라, 단백질 검출 한계도 4 배 정도 개선시킬 수 있다.

Claims

소디움도데실설페이트(SDS)를 포함하는 폴리아크릴아미드 겔 상에 단백질을 부하하여 전기영동시키고, 쿠마시블루 염료로 염색한 후 배경을 탈색시켜 단백질을 검출하는 방법에 있어서, 상기 쿠마시블루 염료에 테트라옥틸암모늄 브로마이드(TOA)를 첨가하여 염색하는 것을 특징으로 하는 단백질 검출방법.
제 1 항에 있어서,

상기 혼합 염색용액이 0.25 % CB와 1 % TOA의 10 : 0.6 (용적비) 혼합용액인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 혼합 염색용액으로 염색후 40 % 메탄올/7 % 아세트산 용액으로 탈색시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,

염색하기 전에 전기영동시킨 겔을 물로 세척하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.