KR102678213B1 - Use of human small leucine zipper protein for diagnosis of liver fibrosis - Google Patents
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Abstract
본 발명은 간 섬유증의 진단을 위한 인간 작은 류신 단백질의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 본 발명의 인간 작은 류신 단백질은 간 세포에서 플라스미노겐 활성화제 억제제 1의 발현, 분비 및 활성을 음성적으로 조절함으로써 간 섬유증의 진단에 사용할 수 있다.The present invention relates to the use of human small leucine protein for the diagnosis of liver fibrosis, and more specifically, the human small leucine protein of the present invention negatively inhibits the expression, secretion and activity of plasminogen activator inhibitor 1 in liver cells. By controlling it, it can be used for the diagnosis of liver fibrosis.
Description
본 발명은 간 섬유증의 진단을 위한 인간 작은 류신 단백질의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to the use of human small leucine protein for the diagnosis of liver fibrosis.
간 섬유증(liver fibrosis)은 알코올 남용, 바이러스성 C형 간염, 비알코올성 지방간 등으로 인해 간이 반복적으로 손상될 때 흉터 조직이 간 세포를 대체하면서 정상적인 간 기능이 실행되지 않는 것을 의미하며, 최종적으로 간경변증을 일으키게 된다. 흉터 조직이 혈류를 방해하여 간에서 간 세포의 혈액 공급을 제한하며, 간문맥압이 증가하고 이로 인해 문맥고혈압 합병증이 유도된다. 또한, 정상 기능을 할 수 있는 간세포의 수가 과도하게 적어지면서 단백질 합성, 해독 작용 등 간기능 장애로 인한 합병증(황달, 간성 뇌증)이 발생하며, 간암의 발병률도 크게 증가한다. 만성적인 간 조직 손상이 오게 되면, 간 조직을 구성하는 여러 세포 중 하나인 간성상세포가 활성화 과정을 거쳐 근섬유아세포로 바뀌며 섬유화 발생에 결정적 역할을 하는데 이에 대한 분자 기전이 명확이 규명되지 않고 있다. 이로 인해 타깃 선택성이 있는 치료 후보 물질이 개발되지 않아 현재까지 간 이식 이외에는 적절한 치료법이 없는 것으로 알려져 있다.Liver fibrosis means that when the liver is repeatedly damaged due to alcohol abuse, viral hepatitis C, non-alcoholic fatty liver disease, etc., normal liver function is not performed as scar tissue replaces liver cells, ultimately leading to cirrhosis. It causes. Scar tissue interferes with blood flow, restricting the blood supply to liver cells in the liver, increasing portal pressure, which leads to complications of portal hypertension. In addition, as the number of liver cells capable of normal function decreases excessively, complications (jaundice, hepatic encephalopathy) due to liver dysfunction such as protein synthesis and detoxification occur, and the incidence of liver cancer significantly increases. When chronic liver tissue damage occurs, hepatic stellate cells, one of the many cells that make up the liver tissue, undergo an activation process and change into myofibroblasts, which plays a critical role in the development of fibrosis, but the molecular mechanism for this is not clearly identified. As a result, treatment candidates with target selectivity have not been developed, and it is known that there is currently no appropriate treatment other than liver transplantation.
플라스미노겐 활성화제 억제제 1(Plasminogen activator inhibitor-1: PAI-1)은 플라스미노겐을 플라스민으로 분해시키는 조직 플라스미노겐 활성화제(tissue-type plasminogen activator: tPA)와 유로키나제-타입 플라스미노겐 활성화제(urokinase plasminogen activator: uPA)의 활성을 억제하고 섬유소분해(fibrionolysis)를 저해하여 혈전증과 동맥경화의 위험률을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 즉, PAI-1은 플라스민의 형성을 차단함으로써 섬유소분해를 억제하고, 그에 따른 세포외기질의 침착으로 인한 간 섬유증에 관여한다. Plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) is a tissue-type plasminogen activator (tPA) that decomposes plasminogen into plasmin and urokinase-type plasminogen. It is known to increase the risk of thrombosis and arteriosclerosis by inhibiting the activity of urokinase plasminogen activator (uPA) and inhibiting fibrionolysis. In other words, PAI-1 inhibits fibrinolysis by blocking the formation of plasmin and is involved in liver fibrosis due to the subsequent deposition of extracellular matrix.
류신 지퍼 전사 인자 패밀리에 속하는 인간 작은 류신 지퍼 단백질(human small leucine zipper protein, sLZIP)은 전사 조절 인자 혹은 보조 인자로서 주로 암세포의 성장과 중간엽줄기세포의 분화 등에 영향을 미치는 것으로 알려져 있으나 PAI-1의 발현 및 간 섬유증에서의 sLZIP의 역할은 알려져 있지 않다. Human small leucine zipper protein (sLZIP), which belongs to the leucine zipper transcription factor family, is a transcriptional regulator or cofactor and is known to mainly affect the growth of cancer cells and differentiation of mesenchymal stem cells, but PAI-1 The expression and role of sLZIP in liver fibrosis are unknown.
본 발명의 목적은 간 섬유증 조절인자로서의 sLZIP과 PAI-1간의 관계를 규명함으로써 간 섬유증의 진단을 위한 sLZIP의 약제학적 용도를 제공하는 것이다.The purpose of the present invention is to provide a pharmaceutical use of sLZIP for the diagnosis of liver fibrosis by identifying the relationship between sLZIP and PAI-1 as a liver fibrosis regulator.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인간 작은 류신 지퍼 단백질(human small leucine-zipper protein)의 코딩 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 간 섬유증 진단용 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a composition for diagnosing liver fibrosis, which includes an agent for measuring the expression level of the mRNA or protein thereof of the gene encoding human small leucine-zipper protein.
본 발명은 또한 상기 조성물을 포함하는 간 섬유증 진단용 키트를 제공한다.The present invention also provides a kit for diagnosing liver fibrosis comprising the composition.
본 발명은 또한 간 섬유증 의심 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 인간 작은 류신 지퍼 단백질(human small leucine-zipper protein)의 코딩 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및The present invention also includes measuring the expression level of the mRNA or protein thereof of the gene coding for human small leucine-zipper protein in a biological sample isolated from an individual suspected of having liver fibrosis; and
상기 단계에서 측정된 생물학적 시료의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준이 정상 대조군 시료와 비교하여 낮을 경우 간 섬유증으로 판단하는 단계를 포함하는, 간 섬유증 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.Provided is a method of providing information for diagnosing liver fibrosis, including the step of determining liver fibrosis when the expression level of mRNA or protein thereof in the biological sample measured in the above step is low compared to the normal control sample.
본 발명에 따르면, 간 세포에서 인간 작은 류신 단백질은 플라스미노겐 활성화제 억제제 1의 발현, 분비 및 활성을 음성적으로 조절함으로써 간 섬유증의 진단에 사용할 수 있다.According to the present invention, human small leucine protein can be used in the diagnosis of liver fibrosis by negatively regulating the expression, secretion and activity of plasminogen activator inhibitor 1 in liver cells.
도 1은 마이크로어레이에 의해 분석된 인간 간세포주에서 sLZIP에 의한 PAI-1 전사 조절을 보여준다.
도 2는 sLZIP 넉다운과 과발현을 이용한 인간 간세포주에서 PAI-1 mRNA 전사(A, B) 및 단백질 발현(C, D) 조절을 보여준다.
도 3은 함량별로 si-sLZIP (A) 및 GFP-sLZIP을 각각 일시적으로 트랜스펙션 하거나, si-sLZIP 및 GFP-sLZIP를 동시에 트랜스펙션시킨(C) 인간 간세포주 HepG2 세포에서 PAI-1 단백질 분비 조절을 보여준다.
도 4는 함량별로 si-sLZIP 및 GFP-sLZIP를 동시에 트랜스펙션 시킨 인간 간세포주 HepG2 세포에서 분비된 PAI-1의 활성을 측정한 결과(A) 및 혈전 분해 정도를 측정한 결과(B)를 도시한다.
도 5는 si-sLZIP가 트랜스펙션된 HepG2 세포 배양액을 tPA와 함께(A) 또는 배양액 단독(B)을 간성상세포인 LX2 세포에 처리하여 MMP-9 및 MMP-2 mRNA 전사 조절에 대한 효과를 보여준다.
도 6은 간 특이적인 sLZIP 넉아웃 KO 마우스에서 sLZIP mRNA 및 PAI-1 mRNA 발현 변화를 보여준다.
도 7은 간 특이적인 sLZIP 넉아웃 KO 마우스에서 간 섬유화 정도를 조사한 결과를 도시한다.Figure 1 shows PAI-1 transcriptional regulation by sLZIP in human hepatocyte cell lines analyzed by microarray.
Figure 2 shows regulation of PAI-1 mRNA transcription (A, B) and protein expression (C, D) in human hepatocyte cell lines using sLZIP knockdown and overexpression.
Figure 3 shows PAI-1 protein in human liver cell line HepG2 cells transiently transfected with si-sLZIP (A) and GFP-sLZIP, respectively, or simultaneously transfected with si-sLZIP and GFP-sLZIP (C), depending on the content. Shows secretion control.
Figure 4 shows the results of measuring the activity of PAI-1 secreted from human hepatocyte cell line HepG2 cells simultaneously transfected with si-sLZIP and GFP-sLZIP by content (A) and the results of measuring the degree of clot degradation (B). It shows.
Figure 5 shows the effect on the regulation of MMP-9 and MMP-2 mRNA transcription by treating si-sLZIP-transfected HepG2 cell culture with tPA (A) or culture alone (B) on LX2 cells, which are hepatic stellate cells. It shows.
Figure 6 shows changes in sLZIP mRNA and PAI-1 mRNA expression in liver-specific sLZIP knockout KO mice.
Figure 7 shows the results of examining the degree of liver fibrosis in liver-specific sLZIP knockout KO mice.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.Hereinafter, the configuration of the present invention will be described in detail.
본 발명은 인간 작은 류신 지퍼 단백질(human small leucine-zipper protein)의 코딩 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 간 섬유증 진단용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for diagnosing liver fibrosis, which includes an agent for measuring the expression level of the mRNA or protein thereof encoding the human small leucine-zipper protein.
본 발명에서 사용된 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 간 섬유증 발병 여부를 확인하는 것으로서, 간 섬유증 발병 여부를 조기에 확인할 수 있다.As used herein, the term “diagnosis” means confirming the presence or characteristics of a pathological condition. For the purpose of the present invention, diagnosis is to determine whether liver fibrosis has developed, and whether liver fibrosis has developed can be confirmed at an early stage.
본 발명자들은 플라스미노겐 활성화제 억제제 1(Plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1)의 전사 및 간 섬유증의 조절에 대한 인간 작은 류신 지퍼 단백질(human small leucine-zipper protein, sLZIP)의 역할을 조사하였다. 그 결과, sLZIP 넉다운은 mRNA 및 단백질 수준에서 PAI-1의 발현을 향상시키고, PAI-1의 세포 외 분비를 증가시키며, 분비된 PAI-1은 tPA의 활성을 차단함으로써 혈전 용해를 억제하는 것을 통해 활성화 되어있음을 확인하였다. sLZIP 넉다운 세포로부터 획득한 배지는 tPA의 존재에 따라 간성상세포(HSC)에서 MMP 단백질들의 유전자 발현을 부정적으로 조절하였다. 또한, 담관 결찰(BDL)을 통해 간 섬유증을 유도한 간 특이적 sLZIP 넉다운 마우스는 대조군 마우스와 비교하였을 때 간 섬유증이 더 악화되어 있음을 관찰하였다. 따라서, 본 발명은 sLZIP가 PAI-1의 전사와 간성상세포의 활성화를 억제함으로써 간 섬유증의 부정적 조절자로 작용함을 규명하였다.The present inventors investigated the role of human small leucine-zipper protein (sLZIP) in the regulation of transcription of plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) and liver fibrosis. . As a result, sLZIP knockdown enhances the expression of PAI-1 at the mRNA and protein levels, increases extracellular secretion of PAI-1, and secreted PAI-1 inhibits thrombolysis by blocking the activity of tPA. Confirmed that it is activated. Media obtained from sLZIP knockdown cells negatively regulated gene expression of MMP proteins in hepatic stellate cells (HSCs) in the presence of tPA. In addition, liver-specific sLZIP knockdown mice in which liver fibrosis was induced through bile duct ligation (BDL) were observed to have worse liver fibrosis compared to control mice. Therefore, the present invention revealed that sLZIP acts as a negative regulator of liver fibrosis by inhibiting the transcription of PAI-1 and the activation of hepatic stellate cells.
상술한 바와 같이, sLZIP는 정상 간 세포주에서 발현이 증가되어 있고, PAI-1의 전사를 조절하여 PAI-1의 mRNA 및 단백질의 발현을 음성적으로 조절하고, PAI-1의 분비 및 활성을 음성적으로 조절하므로, sLZIP 및/또는 PAI-1의 발현 수준은 간 섬유증 고위험군을 진단할 수 있는 마커로 활용할 수 있다.As described above, sLZIP has increased expression in normal liver cell lines, and negatively regulates the expression of PAI-1 mRNA and protein by regulating the transcription of PAI-1, and negatively regulates the secretion and activity of PAI-1. Therefore, the expression level of sLZIP and/or PAI-1 can be used as a marker to diagnose a high-risk group for liver fibrosis.
본 발명에서 용어 "마커(marker)"란 정상군 개체와 간 섬유증을 가진 개체를 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 본 발명의 간 섬유증을 가지는 개체에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산, 유전자, 지질, 당지질, 당단백질 또는 당 등과 같은 유기 생체 분자들을 모두 포함한다. 특히 본 발명에서는 본 발명의 간 섬유증을 가지는 개체에서 변화되는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the term "marker" refers to a substance that can be used for diagnosis by distinguishing normal subjects from those with liver fibrosis. A polypeptide, protein or nucleic acid that shows an increase or decrease in subjects with liver fibrosis of the present invention, It includes all organic biomolecules such as genes, lipids, glycolipids, glycoproteins, or sugars. In particular, in the present invention, it may be a protein that is changed in an individual with liver fibrosis of the present invention, but is not limited thereto.
본 발명에 사용된 용어 "mRNA 수준 측정"이란 간 섬유증을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 간 섬유증 진단용 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.The term "mRNA level measurement" used in the present invention is a process of confirming the presence and expression level of mRNA of genes for diagnosing liver fibrosis in a biological sample in order to diagnose liver fibrosis, and the amount of mRNA is measured. Analysis methods for this include reverse transcription polymerase reaction (RT-PCR), competitive reverse transcription polymerase reaction (Competitive RT-PCR), real-time reverse transcription polymerase reaction (Real-time RT-PCR), and RNase protection assay (RPA). assay), Northern blotting, DNA chip, etc., but are not limited to these.
상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 프라이머 쌍 또는 프로브이며, 상기 유전자들의 핵산 정보가 GeneBank 등에 알려져 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.The agent for measuring the mRNA level of the genes is preferably a primer pair or probe, and since the nucleic acid information of the genes is known in GeneBank, etc., a primer or probe that specifically amplifies specific regions of these genes based on the sequences can be designed.
상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직하게 간 섬유증 진단을 위하여, 상기 mRNA 수준을 측정하는 제제는 sLZIP의 코딩 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.An agent for measuring the mRNA level of the gene may include a primer pair, probe, or antisense nucleotide that specifically binds to the gene. Preferably for diagnosing liver fibrosis, the agent for measuring the mRNA level may include a primer pair, probe, or antisense oligonucleotide that specifically binds to the coding gene of sLZIP.
본 발명에서 사용된 용어 "프라이머 쌍"은 표적 유전자 서열을 인지하는 정방향 및 역방향의 프라이머로 이루어진 모든 조합의 프라이머쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성을 부여할 수 있다.The term "primer pair" used in the present invention includes any combination of primer pairs consisting of forward and reverse primers that recognize the target gene sequence, but is preferably a primer pair that provides analysis results with specificity and sensitivity. . High specificity can be granted when the nucleic acid sequence of the primer is a sequence that is inconsistent with the non-target sequence present in the sample, so that the primer amplifies only the target gene sequence containing the complementary primer binding site and does not cause non-specific amplification. .
본 발명에서 사용된 용어 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브 분자의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA 일 수 있으며, 가장 바람직하게는 PNA이다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체외에서 제조된 것을 포함하는 것으로 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다. The term "probe" used in the present invention refers to a substance that can specifically bind to a target substance to be detected in a sample, and refers to a substance that can specifically confirm the presence of the target substance in the sample through said binding. do. The type of probe molecule is not limited as it is a material commonly used in the art, but is preferably PNA (peptide nucleic acid), LNA (locked nucleic acid), peptide, polypeptide, protein, RNA, or DNA. Preferably it is PNA. More specifically, the probe is a biomaterial that is derived from or similar to living organisms or includes those produced in vitro, such as enzymes, proteins, antibodies, microorganisms, animal and plant cells and organs, nerve cells, DNA, and RNA. DNA may include cDNA, genomic DNA, and oligonucleotides, RNA may include genomic RNA, mRNA, and oligonucleotides, and examples of proteins may include antibodies, antigens, enzymes, peptides, etc.
본 발명에서 용어, "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체로서, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열은 상기 유전자들의 mRNA에 상보적이고 상기 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미한다. 이는 상기 유전자 mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 길이는 6 내지 100 염기, 바람직하게는 8 내지 60 염기, 보다 바람직하게는 10 내지 40 염기일 수 있다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 통상의 방법으로 시험관 내에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드를 합성하는 한가지 예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 다중클로닝부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 상기 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다. In the present invention, the term "antisense oligonucleotide" is DNA or RNA or a derivative thereof containing a nucleic acid sequence complementary to the sequence of a specific mRNA, and binds to the complementary sequence in the mRNA and inhibits the translation of the mRNA into protein. It works. Antisense oligonucleotide sequence refers to a DNA or RNA sequence that is complementary to the mRNA of the genes and is capable of binding to the mRNA. This may inhibit translation, translocation into the cytoplasm, maturation, or any other essential activity for overall biological function of the gene mRNA. The length of the antisense oligonucleotide may be 6 to 100 bases, preferably 8 to 60 bases, and more preferably 10 to 40 bases. The antisense oligonucleotide can be synthesized in vitro using a conventional method and administered in vivo, or the antisense oligonucleotide can be synthesized in vivo. One example of synthesizing antisense oligonucleotides in vitro is using RNA polymerase I. One example of allowing antisense RNA to be synthesized in vivo is to transcribe the antisense RNA using a vector with the origin of the multiple cloning site (MCS) in the opposite direction. It is preferable that the antisense RNA has a translation stop codon within the sequence so that it is not translated into a peptide sequence.
본 발명에 사용된 용어 "단백질 수준 측정"이란 간 섬유증 진단을 위하여 생물학적 시료에서 간 섬유증 진단용 마커 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정이다. 상기 마커 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있으며, 바람직하게는 항체를 이용하지 않고 단백질 발현 수준 자체를 측정한다.The term “protein level measurement” used in the present invention is a process of confirming the presence and expression level of a marker protein for liver fibrosis diagnosis in a biological sample for the purpose of diagnosing liver fibrosis. The amount of protein can be confirmed using an antibody that specifically binds to the marker protein. Preferably, the protein expression level itself is measured without using an antibody.
상기 단백질 수준 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학(immunohistochemistry) 분석, 면역세포화학(immunocytochemistry) 분석, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏, 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.The protein level measurement or comparative analysis methods include protein chip analysis, immunoassay, ligand binding assay, MALDI-TOF (Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) analysis, and SELDI-TOF (Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) analysis, radioimmunoassay, radioimmunodiffusion method, Ouchteroni immunodiffusion method, rocket immunoelectrophoresis, immunohistochemistry analysis, immunocytochemistry analysis, complement fixation assay, two-dimensional electrophoresis Analysis, liquid chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS), LC-MS/MS (liquid chromatography-Mass Spectrometry/Mass Spectrometry), Western blot, and ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), etc. It is not limited.
간 섬유증 진단을 위하여 바람직하게는 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 sLZIP 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함할 수 있다.For diagnosing liver fibrosis, an agent that measures the protein level may include an antibody that specifically binds to the sLZIP protein.
본 발명에 사용된 용어 "항체"는 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 상기 sLZIP, 아파딘(afadin), Src, Rac1, 또는 JNK(c-Jun N-terminal kinase)의 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.As used herein, the term “antibody” refers to a specific protein molecule directed against an antigenic site. For the purposes of the present invention, an antibody refers to an antibody that specifically binds to the sLZIP, afadin, Src, Rac1, or JNK (c-Jun N-terminal kinase) protein, and is a polyclonal antibody, Includes both monoclonal antibodies and recombinant antibodies. Antibodies can be easily produced using techniques well known in the art.
또한, 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.Additionally, antibodies of the invention include intact forms with two full-length light chains and two full-length heavy chains, as well as functional fragments of the antibody molecule. Functional fragments of antibody molecules refer to fragments that possess at least an antigen-binding function, and include Fab, F(ab'), F(ab') 2, and Fv.
본 발명은 또한 상기 간 섬유증 진단용 조성물을 포함하는 간 섬유증 진단용 키트를 제공한다. The present invention also provides a kit for diagnosing liver fibrosis, including the composition for diagnosing liver fibrosis.
바람직하게는, 상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트 또는 래피드(rapid) 키트 일 수 있다. Preferably, the kit may be a reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) kit, a DNA chip kit, an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit, a protein chip kit, or a rapid kit.
또한, 바람직하게는, 상기 간 섬유증 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다. Also, preferably, the kit for diagnosing liver fibrosis may further include one or more other component compositions, solutions, or devices suitable for the analysis method.
바람직하게는, 상기 진단용 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. RT-PCR(역전사 중합효소반응) 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 상기 각 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp 의 길이이다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.Preferably, the diagnostic kit may be a diagnostic kit characterized by including essential elements required to perform a reverse transcription polymerase reaction. RT-PCR (reverse transcription polymerase reaction) kits include each pair of primers specific for a marker gene. The primer is a nucleotide having a sequence specific to the nucleic acid sequence of each gene, and is about 7 bp to 50 bp in length, more preferably about 10 bp to 30 bp in length. It may also include primers specific to the nucleic acid sequence of the control gene. In addition, the reverse transcription polymerase reaction kit consists of test tubes or other suitable containers, reaction buffer (pH and magnesium concentration vary), deoxynucleotides (dNTPs), enzymes such as Taq-polymerase and reverse transcriptase, DNAse, and RNAse inhibitor DEPC- It may include water (DEPC-water), sterilized water, etc.
바람직하게는, DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.Preferably, it may be a diagnostic kit characterized by including essential elements required to perform a DNA chip. A DNA chip kit may include a substrate to which a cDNA or oligonucleotide corresponding to a gene or a fragment thereof is attached, and reagents, agents, enzymes, etc. for producing a fluorescent probe. The substrate may also include cDNA or oligonucleotides corresponding to control genes or fragments thereof.
또한, 바람직하게는, ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트 됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.Also, preferably, it may be a diagnostic kit characterized by including essential elements required to perform ELISA. ELISA kits contain specific antibodies against these proteins. Antibodies have high specificity and affinity for each marker protein and almost no cross-reactivity to other proteins, and are either monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, or recombinant antibodies. Additionally, ELISA kits may include antibodies specific for control proteins. Other ELISA kits include reagents that can detect bound antibodies, such as labeled secondary antibodies, chromophores, enzymes (e.g., conjugated with antibodies) and their substrates or those that can bind to antibodies. It may contain other substances, etc.
또한, 바람직하게는, 5분내 분석결과를 알 수 있는 신속한 테스트를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 래피드(rapid) 키트일 수 있다. 래피드 키트는 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 래피드 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 래피드 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 특이항체와 2차 항체가 고정된 나이트로 셀룰로오스 멤브레인, 항체가 결합된 비드에 결합된 멤브레인, 흡수패드와 샘플 패드 등 다른 물질 등을 포함할 수 있다.Also, preferably, it may be a rapid kit that includes the essential elements necessary to perform a rapid test that can provide analysis results within 5 minutes. Rapid kits contain specific antibodies against proteins. Antibodies have high specificity and affinity for each marker protein and almost no cross-reactivity to other proteins, and are either monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, or recombinant antibodies. Additionally, the rapid kit may include antibodies specific for control proteins. In addition, the rapid kit includes reagents that can detect bound antibodies, such as nitrocellulose membranes with specific antibodies and secondary antibodies immobilized on them, membranes bound to antibody-bound beads, absorption pads, and sample pads. It may include substances, etc.
본 발명은 또한 간 섬유증 의심 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 인간 작은 류신 지퍼 단백질(human small leucine-zipper protein)의 코딩 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및The present invention also includes measuring the expression level of the mRNA or protein thereof of the gene coding for human small leucine-zipper protein in a biological sample isolated from an individual suspected of having liver fibrosis; and
상기 단계에서 측정된 생물학적 시료의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준이 정상 대조군 시료와 비교하여 낮을 경우 간 섬유증으로 판단하는 단계를 포함하는, 간 섬유증 진단을 위한 정보의 제공 방법에 관한 것이다.It relates to a method of providing information for diagnosing liver fibrosis, including the step of determining liver fibrosis when the expression level of mRNA or protein thereof in the biological sample measured in the above step is low compared to the normal control sample.
본 발명에서 사용된 용어 "생물학적 시료"란 간 섬유증 발병에 의해 유전자 발현 수준 또는 단백질 발현 수준이 차이가 나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 혈액, 간세포 또는 간조직일 수 있다.The term "biological sample" as used in the present invention includes samples such as tissues, cells, whole blood, serum, plasma, saliva, cerebrospinal fluid, or urine in which the gene expression level or protein expression level varies due to the development of liver fibrosis. It is not limited to this. Preferably, it may be blood, liver cells, or liver tissue.
상기 sLZIP는 정상 대조군과 비교하여, 간 섬유증이 있는 개체에서 유전자 발현 수준 또는 해당 단백질의 발현 수준이 변화하는 특징을 가지므로, 상기 수준이 정상 대조군 시료의 발현 수준보다 낮을 경우 간 섬유증으로 진단할 수 있다.Since the sLZIP has the characteristic of changing the gene expression level or the expression level of the corresponding protein in subjects with liver fibrosis compared to the normal control group, liver fibrosis can be diagnosed if the level is lower than the expression level of the normal control sample. there is.
또한, 상기 PAI-1의 코딩 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 추가로 측정할 수 있으며, 간 섬유증 의심 개체의 분리된 시료의 상기 PAI-1의 코딩 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준이 정상 대조군 시료의 단백질의 발현 수준 또는 유전자의 발현 수준보다 높을 경우 간 섬유증으로 진단할 수 있다. In addition, the expression level of the mRNA or protein thereof of the gene encoding the PAI-1 can be additionally measured, and the expression level of the mRNA or protein thereof of the gene encoding the PAI-1 in an isolated sample of an individual suspected of having liver fibrosis is Liver fibrosis can be diagnosed if the protein or gene expression level is higher than that of normal control samples.
상기 mRNA 발현 수준 측정 또는 비교는 역전사 중합효소반응, 경쟁적 역전사 중합효소반응, 실시간 역전사 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩 등을 사용할 수 있으나, 본 발명은 이들에 제한되는 것이 아니다. 상기 측정 방법들을 통하여 정상 대조군에서의 mRNA 발현량과 간 섬유증 환자의 mRNA 발현량을 확인할 수 있고, 이들 발현량 정도를 비교함으로써 간 섬유증 발병 여부를 진단 또는 예측할 수 있다.The mRNA expression level can be measured or compared using reverse transcription polymerase reaction, competitive reverse transcription polymerase reaction, real-time reverse transcription polymerase reaction, RNase protection assay, Northern blotting, or DNA chip, but the present invention is not limited to these. . Through the above measurement methods, the mRNA expression level in the normal control group and the mRNA expression level in the liver fibrosis patient can be confirmed, and by comparing these expression levels, the occurrence of liver fibrosis can be diagnosed or predicted.
바람직하게는, 본 발명의 상기 단백질 발현 수준은 해당 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 측정 및 비교할 수 있다. 상기 항체와 생물학적 시료 내의 해당 단백질이 항원-항체 복합체를 형성하도록 하고, 이를 검출하는 방법을 이용한다. Preferably, the expression level of the protein of the present invention can be measured and compared using an antibody that specifically binds to the protein. The antibody and the corresponding protein in the biological sample form an antigen-antibody complex, and a method is used to detect this.
본 발명에서 사용된 용어 "항원-항체 복합체"는 생물학적 시료 중의 해당 단백질 항원과 이를 인지하는 항체의 결합물을 의미한다. 상기 항원-항체 복합체의 검출은 당업계에 공지된 바와 같은 방법, 예를 들어 분광학적, 광화학적, 생물화학적, 면역화학적, 전기적, 흡광적, 화학적 및 기타 방법을 이용하여 검출할 수 있다.The term “antigen-antibody complex” used in the present invention refers to a combination of a protein antigen in a biological sample and an antibody that recognizes it. The antigen-antibody complex can be detected using methods known in the art, such as spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical, electrical, absorbance, chemical and other methods.
본 발명의 목적상, 상기 단백질 발현 수준 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학(immunohistochemistry) 분석, 면역세포화학(immunocytochemistry) 분석, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LCMS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏, 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.For the purpose of the present invention, the protein expression level measurement or comparative analysis methods include protein chip analysis, immunoassay, ligand binding assay, MALDI-TOF (Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) analysis, and SELDI-TOF (Sulface Mass Spectrometry). Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry analysis, radioimmunoassay, radioimmunodiffusion method, Ouchteroni immunodiffusion method, rocket immunoelectrophoresis, immunohistochemistry analysis, immunocytochemistry analysis, complement Immobilization analysis, two-dimensional electrophoresis analysis, liquid chromatography-Mass Spectrometry (LCMS), liquid chromatography-Mass Spectrometry/Mass Spectrometry (LC-MS/MS), Western blot, and ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) ), etc., but are not limited to this.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in detail by examples. However, the following examples only illustrate the present invention, and the content of the present invention is not limited to the following examples.
<실시예 1> sLZIP의 간 섬유증에서의 특성규명<Example 1> Characterization of sLZIP in liver fibrosis
실험에 사용된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)는 GIBCO technologies, Inc(Gaithersburg)에서 구입하였고, 우태아혈청은 HyClone Laboratory(Logan, UT)에서 구입하였다. 항-β-액틴, 항- α-튜블린, 항-ERK, 항-GFP 항체는 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA)에서 구입하였다. 항-PAI-1, 항 포스포-p44/42 ERK 항체는 Cell Signaling Technology(Danvers, MA, USA)에서 구입하였다. 항-마우스 및 항-토끼 페록시다아제 결합된 2차 항체는 Pierce(Madison, WI)에서 구입하였다. sLZIP에 대한 인간 작은 방해 RNA는 (si-sLZIP)은 GenePharma(Shanghai, China)에서 구입하였다. Low glucose DMEM, Ponceau S 용액, 칼슘 클로라이드, tPA는 Sigma Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) used in the experiment was purchased from GIBCO technologies, Inc (Gaithersburg), and fetal bovine serum was purchased from HyClone Laboratory (Logan, UT). Anti-β-actin, anti-α-tubulin, anti-ERK, and anti-GFP antibodies were purchased from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Anti-PAI-1 and anti-phospho-p44/42 ERK antibodies were purchased from Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Anti-mouse and anti-rabbit peroxidase-conjugated secondary antibodies were purchased from Pierce (Madison, WI). Human small interfering RNA for sLZIP (si-sLZIP) was purchased from GenePharma (Shanghai, China). Low glucose DMEM, Ponceau S solution, calcium chloride, and tPA were purchased from Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA).
(세포배양 및 트랜스펙션)(Cell culture and transfection)
HepG2 및 LX2 세포는 10% FBS와 1% 항생제가 첨가된 DMEM에서 배양하였다. 모든 세포 타입들은 5% CO2를 포함하는 습식 배양기에서 37℃ 온도 조건에서 배양하였다. HepG2 세포는 4Х105 세포/웰의 밀도로 6웰 배양 접시에 플레이팅 하였다. E-fection plus(Lugen science, Gyeonggi, South Korea)를 이용하여 sLZIP을 발현하는 플라스미드를 트랜스펙션 시키고 24시간 동안 인큐베이션 하였다. si-sLZIP은 Interferin(Polyplus-transfection, New York, NY, USA)를 이용하여 트랜스펙션 시키고 48시간 동안 인큐베이션 하였다. 분비되는 단백질을 검출하거나 basic fibroblast growth factor(bFGF)를 배지에 첨가하기 위해서 세포는 24시간 동안 혈청이 없는 DMEM에서 인큐베이션 하였다. LX2 세포는 1Х105 세포/웰의 밀도로 6웰 배양 접시에 플레이팅 하였다. HepG2 and LX2 cells were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS and 1% antibiotics. All cell types were cultured at 37°C in a wet incubator containing 5% CO 2 . HepG2 cells were plated in 6-well culture dishes at a density of 4Х10 5 cells/well. The plasmid expressing sLZIP was transfected using E-fection plus (Lugen science, Gyeonggi, South Korea) and incubated for 24 hours. si-sLZIP was transfected using Interferin (Polyplus-transfection, New York, NY, USA) and incubated for 48 hours. To detect secreted proteins or add basic fibroblast growth factor (bFGF) to the medium, cells were incubated in serum-free DMEM for 24 hours. LX2 cells were plated in 6-well culture dishes at a density of 1Х10 5 cells/well.
(반-정량적 RT-PCR 및 실시간 PCR)(semi-quantitative RT-PCR and real-time PCR)
세포를 PBS로 세척한 후, TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit(Takara Bio Inc, Kusatsu, Shiga, Japan)을 사용하여 RNA를 추출하였고, PrimeScript RT master mix(Takara Bio Inc.)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 총 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 반-정량적 RT-PCR은 Pfu Plus 5Х PCR Master Mix(Elpis Biotech, Inc., Daejeon, South Korea)를 사용하여 T100 Thermal cycler(BioRad, Hercules, CA, USA)를 통해 수행하였다. 실시간 PCR은 Evagreen Express 2Х Master Mix(Applied Biological Materials, Vancouver, BC, Canada)를 사용하여 QuantStudio3 instrument (Thermo Fisher Scientific)를 통해 수행하였다. 내부 대조군으로서 β-액틴을 사용하였다. After washing the cells with PBS, RNA was extracted using the TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit (Takara Bio Inc, Kusatsu, Shiga, Japan), and PrimeScript RT master mix (Takara Bio Inc.) was used according to the manufacturer's protocol. Accordingly, cDNA was synthesized from total RNA. Semi-quantitative RT-PCR was performed using a T100 Thermal cycler (BioRad, Hercules, CA, USA) using Pfu Plus 5Х PCR Master Mix (Elpis Biotech, Inc., Daejeon, South Korea). Real-time PCR was performed using a QuantStudio3 instrument (Thermo Fisher Scientific) using Evagreen Express 2Х Master Mix (Applied Biological Materials, Vancouver, BC, Canada). β-Actin was used as an internal control.
(semi-qRT-PCR) sLZIP
(semi-qRT-PCR)
(qRT-PCR) sLZIP
(qRT-PCR)
(웨스턴 블랏 분석)(Western blot analysis)
세포를 PBS로 세척한 후 RIPA 버퍼(150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 0.1% SDS, 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 및 프로테이즈 인히비터)를 사용하여 세포 추출물을 준비한 후, 현탁액은 4℃에서 12,000Хg, 20분간 원심분리 하였다. 상등액을 모아 샘플 버퍼와 혼합하였다. 동량의 단백질 샘플은 SDS-PAGE(10% 아크릴아마이드 젤)에서 분리하고, 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 옮겼다. 멤브레인과 적당한 항체를 4℃에서 밤새도록 인큐베이션 하였다. 내부 대조군으로서 β-액틴을 사용하였다. 그 후 각 면역 블랏은 2차 면역 항체를 한 시간 동안 인큐베이션 하였다. 면역 표지된 단백질은 WestSave Gold(Young In Frontier, Seoul, South Korea)을 사용하여 관찰하였고, X-선 필름을 사용하여 현상하였다. 분비된 단백질을 검출하기 위해서, 세포 배양액을 4℃에서 5,000Хg, 5분간 원심분리 하였다. 상등액을 모아 샘플 버퍼와 혼합하였다. 동량의 단백질 샘플은 SDS-PAGE(10% 아크릴아마이드 젤)에서 분리하였다. Ponceau S 염색을 통해 로딩 대조군으로 보여주었다.After washing the cells with PBS, prepare cell extracts using RIPA buffer (150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 0.1% SDS, 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, and protease inhibitor). The suspension was centrifuged at 12,000Хg for 20 minutes at 4°C. The supernatant was collected and mixed with sample buffer. Equal amounts of protein samples were separated on SDS-PAGE (10% acrylamide gel) and transferred to nitrocellulose membrane. The membrane and the appropriate antibody were incubated overnight at 4°C. β-actin was used as an internal control. Afterwards, each immunoblot was incubated with secondary immunization antibody for one hour. Immunolabeled proteins were observed using WestSave Gold (Young In Frontier, Seoul, South Korea) and developed using X-ray film. To detect secreted proteins, the cell culture was centrifuged at 5,000Хg for 5 minutes at 4°C. The supernatant was collected and mixed with sample buffer. Equal amounts of protein samples were separated on SDS-PAGE (10% acrylamide gel). Ponceau S staining was shown as a loading control.
(마이크로어레이 분석)(microarray analysis)
전체 RNA는 Flag-sLZIP, Flag-Mock 플라스미드 벡터를 트랜스펙션 시킨 HepG2 세포에서 수득하였다. 마이크로어레이 분석은 Human Gene Expression (v.2) 4Х44K Microarray Kit (Agilent Technologies)을 사용하여 수행되었다. Total RNA was obtained from HepG2 cells transfected with Flag-sLZIP and Flag-Mock plasmid vectors. Microarray analysis was performed using the Human Gene Expression (v.2) 4Х44K Microarray Kit (Agilent Technologies).
(인 비트로 PAI-1 색소 활성 분석)(In vitro PAI-1 pigment activity analysis)
PAI-1 활성은 제조사의 프로토콜에 따라 Plasminogen Activator Inhibitor Type 1 Human Chromogenic Activity Assay Kit(Abcam, Cambridge, MA, USA)를 사용하여 측정하였다. 세포 배양액을 4℃에서 5,000 Х g, 5분간 원심분리 하였다. 상등액을 모아 tPA (20 IU/mL)와 함께 25℃에서 10분간 희석시켰다. 마이크로플레이트는 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 흡광도는 415nm에서 측정되었다.PAI-1 activity was measured using the Plasminogen Activator Inhibitor Type 1 Human Chromogenic Activity Assay Kit (Abcam, Cambridge, MA, USA) according to the manufacturer's protocol. The cell culture was centrifuged at 5,000 Х g for 5 minutes at 4°C. The supernatant was collected and diluted with tPA (20 IU/mL) at 25°C for 10 minutes. The microplate was incubated at 37°C for 1 hour. Absorbance was measured at 415 nm.
(혈전 분해 halo 분석)(blood clot breakdown halo analysis)
마우스에서 심장 채혈을 통해 혈액 샘플을 수득하였다. 96웰 플레이트의 가장자리에 응고 용액(5 nM CaCl2)을 떨어트린 뒤 20 ㎕의 혈액을 포함하고 있는 마이크로피펫의 팁을 사용하여 가장자리를 따라 펼쳐준 뒤 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션 시켰다. 마우스의 혈액이 응고되면, 웰의 바닥 부분에 halo 형태로 혈전이 형성되며, 65 ㎕의 배양액과 5 ㎕의 tPA(1000 IU/mL)를 10분간 처리하였다. 용해된 혈전은 새로운 웰로 이동되고, 490nm에서 흡광도가 측정되었다.Blood samples were obtained from mice through cardiac bleeding. A coagulation solution (5 nM CaCl 2 ) was dropped on the edge of a 96-well plate, spread along the edge using the tip of a micropipette containing 20 ㎕ of blood, and incubated at 37°C for 1 hour. When the mouse's blood coagulates, a blood clot is formed in the form of a halo at the bottom of the well, and 65 ㎕ of culture medium and 5 ㎕ of tPA (1000 IU/mL) are treated for 10 minutes. The dissolved clot was transferred to a new well, and the absorbance was measured at 490 nm.
(동물 실험)(animal testing)
동물실험에는 C57BL6 계통의 마우스가 사용되었다. sLZIP이 동형으로 플럭스드 된 마우스(sLZIPfl/fl)가 KoreaBio (Seongnam, Korea)에서 제작되었다. 마우스는 22 ± 2 ℃, 50 ± 10 % 습도 조건에서 12시간 명:12시간 암 조건으로 유지되었다. The institutional Animal Care와 Use Committee of Korea University에서 이 실험을 승인하였고, 가이드라인을 따라 실험이 수행되었다. sLZIPfl/fl 마우스는 Alb-Cre+/+ 마우스와 교배하여 이형접합 마우스를 제작하였다. 6주령 마우스는 지노타이핑을 통해 유전자형을 확인하였고, 담관결착술을 수행하였다. 담관결착술 진행 3일 후 마우스는 희생되었고 간 조직이 수득되었다.C57BL6 strain mice were used in animal experiments. Mice homogeneously fluxed with sLZIP (sLZIP fl/fl ) were produced by KoreaBio (Seongnam, Korea). Mice were maintained under 12-hour light:12-hour dark conditions at 22 ± 2 °C and 50 ± 10% humidity. The institutional Animal Care and Use Committee of Korea University approved this experiment, and the experiment was performed according to the guidelines. sLZIP fl/fl mice were crossed with Alb-Cre +/+ mice to produce heterozygous mice. The genotype of the 6-week-old mouse was confirmed through genotyping, and biliary duct ligation was performed. Three days after the biliary tract procedure, the mouse was sacrificed and liver tissue was obtained.
(조직학적 분석)(Histological analysis)
마우스는 이소푸루란을 사용하여 마취되었고 4 % paraformaldehyde (PFA)를 포함하는 PBS를 사용하여 펄퓨젼을 진행하였다. 마우스의 간을 떼어내어 4 % PFA에서 4℃, 5시간 동안 인큐베이션 시켰다. 고정된 간은 30% 수크로오스 PBS 용액에서 4℃에서 밤새도록 인큐베이션 하였고, Tissue-Tek Optimal Cutting Temperature compound (Sakura Finetek Japan, Tokyo, Japan)를 사용하여 chuck 위에 마운팅 시킨 뒤 얼렸다. 그 후, 간 조직은 cryotome(Leica)를 사용하여 10 ㎛ 두께로 절편을 냈다. 자연건조 시킨 뒤 조직 슬라이스는 picro-sirius red 용액과 H&E 용액을 사용하여 염색되었다. The mouse was anesthetized using isofuran, and perfusion was performed using PBS containing 4% paraformaldehyde (PFA). The liver of the mouse was removed and incubated in 4% PFA at 4°C for 5 hours. The fixed liver was incubated in 30% sucrose PBS solution at 4°C overnight, mounted on chuck using Tissue-Tek Optimal Cutting Temperature compound (Sakura Finetek Japan, Tokyo, Japan), and frozen. Afterwards, the liver tissue was sectioned at 10 ㎛ thickness using a cryotome (Leica). After air drying, the tissue slices were stained using picro-sirius red solution and H&E solution.
(침습 분석)(invasive analysis)
HepG2 세포는 10% DMEM에서 7Х104 세포/웰의 밀도로 24-웰 트렌스웰 플레이트(8 ㎛ pore size; BD Biosciences, San Jose, CA, USA)에 플레이팅 시켰다. 아래쪽 챔버에 10% 배지가 추가되었다. 침습(Invasion) 분석을 위해, 트렌스웰 인서트가 100 ㎕의 Matrigel (MilliporeSigma, Burlington, MA, USA)로 5시간 동안 코팅되었다. 세포는 48시간 동안 HepG2 세포의 조건부 배양액에서 인큐베이션 되었다. 멤브레인 위쪽 표면에 있는 세포들은 면봉을 사용하여 제거하였다. 멤브레인 아래쪽 표면에 있는 세포들은 0.05% crystal violet (MilliporeSigma) 염색약을 사용하여 염색되었다. 세포는 웰마다 무작위로 5군데를 선정하여 측정되었고 측정값의 평균값이 표현되었다.HepG2 cells were plated in 24-well Transwell plates (8 ㎛ pore size; BD Biosciences, San Jose, CA, USA) at a density of 7Х10 4 cells/well in 10% DMEM. 10% medium was added to the lower chamber. For invasion assays, transwell inserts were coated with 100 μl of Matrigel (MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) for 5 hours. Cells were incubated in conditioned culture of HepG2 cells for 48 hours. Cells on the upper surface of the membrane were removed using a cotton swab. Cells on the lower surface of the membrane were stained using 0.05% crystal violet (MilliporeSigma) dye. Cells were measured in five randomly selected locations per well, and the average value of the measured values was expressed.
(통계 분석)(statistical analysis)
데이터는 평균±표준편차로 나타내었다. 통계 평가는 GraphPad Prism Software 5 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)를 사용하여 시행하였다. 데이터는 양꼬리 학생 t 검정 값에 따라 p ≤0.05일 때 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. Data are expressed as mean ± standard deviation. Statistical evaluation was performed using GraphPad Prism Software 5 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Data were considered statistically significant when p ≤0.05 according to the two-tailed Student's t test value.
<실험예 1> 인간 간세포주에서 sLZIP에 의한 PAI-1 전사 조절<Experimental Example 1> PAI-1 transcriptional regulation by sLZIP in human hepatocyte cell lines
Flag-sLZIP 또는 Flag-Mock 플라스미드 벡터를 트랜스펙션 시킨 HepG2 세포에서 전체 RNA를 수득하고 마이크로어레이를 통하여 sLZIP에 의한 PAI-1 (SERPINE1) 유전자의 전사 조절을 확인하였다.Total RNA was obtained from HepG2 cells transfected with Flag-sLZIP or Flag-Mock plasmid vector, and transcriptional regulation of the PAI-1 (SERPINE1) gene by sLZIP was confirmed through microarray.
도 1에 도시된 바와 같이, sLZIP은 간세포에서 PAI-1의 발현을 음성적으로 조절하는 것을 확인하였다. As shown in Figure 1, sLZIP was confirmed to negatively regulate the expression of PAI-1 in hepatocytes.
또한, 간세포에서 sLZIP이 PAI-1의 mRNA 발현을 조절하는지 확인하기 위해, HepG2 세포에 sLZIP에 대한 siRNA인 si-sLZIP (100 pmole/㎕)으로 일시적으로 트랜스펙션 하거나(도2A), sLZIP을 과발현시키는 플라스미드인 GFP-sLZIP(2㎍) 및 si-sLZIP(50 및 100pmole/㎕)을 동시에 트랜스펙션 시키고(도 2B) 반-정량적 RT-PCR 및 실시간 PCR을 통해 PAI-1의 mRNA 발현량을 확인하였다. sLZIP의 발현 억제는 PAI-1의 mRNA 발현을 증가시키고 sLZIP의 발현 증가는 PAI-1의 mRNA 발현을 감소시켰다. 마찬가지로 PAI-1 단백질 발현에 대한 sLZIP의 효과를 확인하기 위해, GFP-sLZIP (1 및 2㎍) 및 si-sLZIP (100 pmole/㎕)을 동시에 트랜스펙션 시키고 (도 2C, D) 웨스턴 블랏 분석을 통해 PAI-1의 단백질 발현량을 확인하였다. sLZIP의 발현 억제는 PAI-1의 단백질 발현을 증가시키고 sLZIP의 발현 증가는 PAI-1의 단백질 발현을 감소시켰다. Additionally, to confirm whether sLZIP regulates the mRNA expression of PAI-1 in hepatocytes, HepG2 cells were transiently transfected with si-sLZIP (100 pmole/μl), an siRNA against sLZIP (Figure 2A), or sLZIP was transfected with sLZIP. The overexpressing plasmids, GFP-sLZIP (2 μg) and si-sLZIP (50 and 100 pmole/μl), were simultaneously transfected (Figure 2B), and the mRNA expression level of PAI-1 was measured through semi-quantitative RT-PCR and real-time PCR. was confirmed. Inhibition of the expression of sLZIP increased the mRNA expression of PAI-1, and increased expression of sLZIP decreased the mRNA expression of PAI-1. Similarly, to confirm the effect of sLZIP on PAI-1 protein expression, GFP-sLZIP (1 and 2 μg) and si-sLZIP (100 pmole/μl) were simultaneously transfected (Figure 2C, D) and Western blot analysis. The protein expression level of PAI-1 was confirmed through . Inhibiting the expression of sLZIP increased the protein expression of PAI-1, and increasing the expression of sLZIP decreased the protein expression of PAI-1.
<실험예 2> sLZIP에 의한 PAI-1 분비 및 활성 조절<Experimental Example 2> Regulation of PAI-1 secretion and activity by sLZIP
간세포에서 PAI-1의 세포 외 분비에 대한 sLZIP의 효과를 확인하기 위해, HepG2 세포에 함량별로 si-sLZIP (50 및 100 pmole/㎕) (도3A) 및 GFP-sLZIP (1, 3 ㎍)을 (도 3B) 각각 일시적으로 트랜스펙션 하거나, si-sLZIP (100 pmole/㎕) 및 GFP-sLZIP (1, 2 ㎍)을 (도 3C) 동시에 트랜스펙션을 시키고 24시간 뒤 배양액을 무혈청 배지로 갈아주었다. 그 후 배양액을 사용하여 배양액 내로 분비된 단백질을 웨스턴 블랏 분석을 통해 확인해본 결과, 도 3A 내지 C에 나타난 바와 같이, si-sLZIP에 의한 sLZIP의 발현 억제는 PAI-1의 세포 외 분비를 향상시켰으며, 반대로 도3B 내지 C에 나타난 바와 같이, GFP-sLZIP에 의한 sLZIP의 발현 증가는 PAI-1의 세포 외 분비를 감소시켰다.To confirm the effect of sLZIP on the extracellular secretion of PAI-1 in hepatocytes, si-sLZIP (50 and 100 pmole/μl) (Figure 3A) and GFP-sLZIP (1 and 3 μg) were added to HepG2 cells according to content. (Figure 3B) were transiently transfected, respectively, or were simultaneously transfected with si-sLZIP (100 pmole/μl) and GFP-sLZIP (1, 2 μg) (Figure 3C), and 24 hours later, the culture was cultured in serum-free medium. changed it to Afterwards, the proteins secreted into the culture medium were confirmed through Western blot analysis. As shown in Figures 3A to C, inhibition of the expression of sLZIP by si-sLZIP improved extracellular secretion of PAI-1. On the other hand, as shown in Figures 3B to C, increasing the expression of sLZIP by GFP-sLZIP decreased the extracellular secretion of PAI-1.
또한, 간세포에서 분비된 PAI-1의 활성에 대한 sLZIP의 효과를 확인하기 위해, HepG2 세포에 함량별로 si-sLZIP (50 및 100 pmole/㎕) 및 GFP-sLZIP (2㎍)를 동시에 트랜스펙션 시키고 24시간 뒤 배양액을 무혈청 배지로 갈아주었으며, 다시 24시간 뒤 배양액으로 분비된 PAI-1의 활성을 측정하였다(도4A, B). sLZIP에 의해 분비된 PAI-1은 완전한 활성을 가지고 있으며 섬유소분해(fibrinolysis)를 억제하여 혈전 용해를 방해하였다.In addition, to confirm the effect of sLZIP on the activity of PAI-1 secreted from hepatocytes, HepG2 cells were simultaneously transfected with si-sLZIP (50 and 100 pmole/μl) and GFP-sLZIP (2 μg) according to content. 24 hours later, the culture medium was changed to serum-free medium, and again 24 hours later, the activity of PAI-1 secreted into the culture medium was measured (Figure 4A, B). PAI-1 secreted by sLZIP had full activity and inhibited fibrinolysis, thereby preventing thrombolysis.
<실험예 3> 간성상세포에서 PAI-1의 MMP에 대한 활성 조절<Experimental Example 3> Regulation of MMP activity of PAI-1 in hepatic stellate cells
간성상세포에서 PAI-1의 MMP에 대한 전사 활성을 확인하기 위해, HepG2 세포에서 si-sLZIP (100 pmole/㎕)을 트랜스펙션 시키고 24시간 뒤 배양액을 무혈청 배지로 갈아주었으며, 다시 24시간 뒤 배양액을 tPA와 함께 (도5A) 혹은 배양액만을 (도 5B) 간성상세포인 LX2 세포에 24시간 동안 처리하였다. 그 후 실시간 PCR을 통해 확인하였을 때, si-sLZIP에 의해 PAI-1의 분비와 활성이 증가된 배양액을 처리해준 경우에 tPA에 의존적으로 간성상세포의 MMP-9 및 MMP-2의 전사 활성을 저해하였다.To confirm the transcriptional activity of PAI-1 against MMP in hepatic stellate cells, HepG2 cells were transfected with si-sLZIP (100 pmole/㎕), and after 24 hours, the culture medium was changed to serum-free medium, and incubated for another 24 hours. Then, the culture medium was treated with tPA (Figure 5A) or the culture medium alone (Figure 5B) to LX2 cells, which are hepatic stellate cells, for 24 hours. Afterwards, when confirmed through real-time PCR, when the culture medium with increased secretion and activity of PAI-1 was treated with si-sLZIP, the transcriptional activity of MMP-9 and MMP-2 in hepatic stellate cells was increased in a tPA-dependent manner. It was hindered.
<실험예 4> 간 특이적인 sLZIP KO 마우스에서 PAI-1의 발현 변화<Experimental Example 4> Changes in expression of PAI-1 in liver-specific sLZIP KO mice
간 특이적인 sLZIP 넉아웃 마우스에서 섬유증 병소의 증가 수준을 확인하기 위해 간 특이적으로 Cre 유전자가 발현되도록 제작된 알부민 Cre 마우스와 Cre 유전자가 인식해서 제거할 수 있는 LoxP 유전자가 floxed sLZIP 유전자를 가진 마우스를 교배시켜서 나온 간 특이적인 헤테로상태(heterozygous)로 sLZIP이 넉아웃 된 마우스를 제작하였다. 그렇게 제작한 마우스의 간에서 sLZIP의 mRNA 발현이 절반가량 감소된 것을 볼 수 있었으며 그에 따라 PAI-1의 mRNA 발현은 1.5배 가량 증가된 것을 볼 수 있었다(도 6).To confirm the increased level of fibrosis lesions in liver-specific sLZIP knockout mice, albumin Cre mice designed to express the liver-specific Cre gene and mice with a floxed sLZIP gene in which the LoxP gene, which can be recognized and removed by the Cre gene, were used. A liver-specific heterozygous mouse with sLZIP knocked out was created by crossing . In the liver of mice prepared in this way, the mRNA expression of sLZIP was seen to be reduced by about half, and the mRNA expression of PAI-1 was accordingly increased by about 1.5 times (Figure 6).
<실험예 5> 간 특이적인 sLZIP KO 마우스에서 섬유증 병소(fibrotic lesion) 증가 <Experimental Example 5> Increased fibrotic lesions in liver-specific sLZIP KO mice
간 특이적으로 sLZIP이 heterozygous하게 KD된 마우스에 간 섬유화를 유발하는 담관 결찰을 실시하였다. BDL 4일 후, 개복한 뒤 간문맥을 통해 관류를 진행하여 간에서 혈액을 제거한 후 간을 적출하고 고정시켰다. 그 후 고정된 간 조직의 형태를 확인할 수 있는 H&E 염색과 간 섬유화를 확인할 수 있는 Sirius red 염색을 진행하였다. 그 결과, 야생형 마우스보다 sLZIP KD 마우스에서 간 섬유화가 훨씬 진행되어 있었다(도 7). Liver-specific sLZIP heterozygous KD mice were subjected to bile duct ligation to induce liver fibrosis. Four days after BDL, the patient was opened and perfused through the portal vein to remove blood from the liver. The liver was removed and fixed. Afterwards, H&E staining to confirm the shape of the fixed liver tissue and Sirius red staining to confirm liver fibrosis were performed. As a result, liver fibrosis was much more advanced in sLZIP KD mice than in wild-type mice (FIG. 7).
따라서, 본 발명은 sLZIP은 PAI-1을 음성적으로 조절함으로써 간 섬유화 및 간 경변에 영향을 미치는 새로운 조절 물질임을 밝히고 있다.Therefore, the present invention reveals that sLZIP is a new regulatory substance that affects liver fibrosis and liver cirrhosis by negatively regulating PAI-1.
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Claims (8)
플라스미노겐 활성화제 억제제 1(Plasminogen activator inhibitor-1)의 코딩 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 간 섬유증 진단용 조성물.
An agent for measuring the expression level of the mRNA or protein of the gene coding for human small leucine-zipper protein; and
A composition for diagnosing liver fibrosis, comprising an agent for measuring the expression level of the mRNA or protein of the gene encoding plasminogen activator inhibitor-1.
상기 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드인, 간 섬유증 진단용 조성물.
According to paragraph 1,
A composition for diagnosing liver fibrosis, wherein the agent for measuring the expression level of mRNA of the gene is a primer pair, probe, or antisense oligonucleotide that specifically binds to the gene.
상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는, 간 섬유증 진단용 조성물.
According to paragraph 1,
A composition for diagnosing liver fibrosis, wherein the agent for measuring the expression level of the protein includes an antibody that specifically binds to the protein.
A kit for diagnosing liver fibrosis comprising the composition according to claim 1.
상기 단계에서 측정된 생물학적 시료 중 인간 작은 류신 지퍼 단백질의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준이 정상 대조군 시료와 비교하여 낮고, 플라스미노겐 활성화제 억제제 1의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준이 높을 경우 간 섬유증으로 판단하는 단계를 포함하는, 간 섬유증 진단을 위한 정보의 제공 방법.
Expression levels of mRNA or protein of the coding gene for human small leucine-zipper protein and plasminogen activator inhibitor-1 in biological samples isolated from subjects suspected of having liver fibrosis Measuring the expression level of the mRNA of the coding gene or its protein; and
In the biological sample measured in the above step, if the expression level of the mRNA or protein thereof of human small leucine zipper protein is low compared to the normal control sample and the expression level of the mRNA or protein thereof of plasminogen activator inhibitor 1 is high, liver fibrosis occurs. A method of providing information for diagnosing liver fibrosis, comprising the step of determining.
생물학적 시료는 혈액, 간세포 또는 간조직인, 방법.According to clause 6,
The method of claim 1, wherein the biological sample is blood, hepatocytes, or liver tissue.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020200093629A KR102678213B1 (en) | 2020-07-28 | 2020-07-28 | Use of human small leucine zipper protein for diagnosis of liver fibrosis |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020200093629A KR102678213B1 (en) | 2020-07-28 | 2020-07-28 | Use of human small leucine zipper protein for diagnosis of liver fibrosis |
Publications (2)
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|---|---|
| KR20220014050A KR20220014050A (en) | 2022-02-04 |
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ID=80267958
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020200093629A KR102678213B1 (en) | 2020-07-28 | 2020-07-28 | Use of human small leucine zipper protein for diagnosis of liver fibrosis |
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Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| KR20110044545A (en) * | 2009-10-23 | 2011-04-29 | 고려대학교 산학협력단 | A novel human leucine zipper protein isoform and use thereof |
| KR20140129617A (en) * | 2013-04-30 | 2014-11-07 | 고려대학교 산학협력단 | Use of human small leucine-zipper protein in adipogenesis |
| KR20180066317A (en) * | 2016-12-07 | 2018-06-19 | 고려대학교 산학협력단 | Use of leucine-zipper protein for diagnosing or treating Fatty liver disease |
-
2020
- 2020-07-28 KR KR1020200093629A patent/KR102678213B1/en active IP Right Grant
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20110044545A (en) * | 2009-10-23 | 2011-04-29 | 고려대학교 산학협력단 | A novel human leucine zipper protein isoform and use thereof |
| KR20140129617A (en) * | 2013-04-30 | 2014-11-07 | 고려대학교 산학협력단 | Use of human small leucine-zipper protein in adipogenesis |
| KR20180066317A (en) * | 2016-12-07 | 2018-06-19 | 고려대학교 산학협력단 | Use of leucine-zipper protein for diagnosing or treating Fatty liver disease |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| Atherosclerosis. vol. 209, no. 2, 585-91 (2009.10.13.) * |
| Biochimie. vol. 163, 94-100 (2019.05.18.)* * |
| Journal of gastroenterology and hepatology. vol. 23, No. s1, S54-S59 (2008)* * |
| Kang,H & J. Ko, J Biol Chem,2011286(49):p42072-81 |
| Kim, J & Ko, J(2014), The FASEB Journal,28(11), pp. 5010-5021 |
| Tjarnlund-Wolf et al.(2012), Stroke,43(10), pp. 2833-2839 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20220014050A (en) | 2022-02-04 |
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