KR102673544B1 - 생물 발광 공명 에너지 전달을 이용한 내분비계 장애물질 검색 방법 - Google Patents

생물 발광 공명 에너지 전달을 이용한 내분비계 장애물질 검색 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생물 발광 공명 에너지 전달을 이용한 내분비계 장애물질 검색 방법에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 내분비계 장애물질 검색 방법은 생물 발광 공명 에너지 전달 방법을 적용하여 지속적으로 사용할 수 있는 영구 안정화 인간 유래 세포주를 구축하고, 이를 이용해 기존의 체내 내분비 호르몬 수용체 단백질과 외인성 화학물질의 결합 활성(Binding affinity)을 호르몬 수용체의 세포 내 신호전달 과정에서 발생하는 단백질-단백질 상호작용(Protein-Protein Interaction)을 기반으로 측정하는 방법으로서, 에스트로겐성 내분비계 장애물질 뿐만 아니라 안드로겐성 내분비계 장애물질을 검색할 수 있으며, 기존의 방사성 동위원소를 이용한 결합 반응 시험법에 비해 안전하고, 다양한 생활 화학 물질에 대한 신뢰성 높은 내분비계 장애 활성 정보를 제공할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

생물 발광 공명 에너지 전달을 이용한 내분비계 장애물질 검색 방법 {Method for screening endocrine disrupting chemicals using bioluminescence resonance energy transfer}
본 발명은 생물 발광 공명 에너지 전달을 이용한 내분비계 장애물질 검색 방법, 생물 발광 공명 에너지 전달을 이용한 내분비계 장애물질 검색을 위한 세포주의 제조 방법, 및 이로부터 제조된 세포주에 관한 것이다.
식품 및 관련 재료에는 내분비계 장애물질(endocrine disrupting chemical)을 비롯한 다양한 종류의 화학물질이 있으며, 내분비계 장애물질은 내분비 호르몬과 유사한 역할을 하는 화학 물질로 체내 항상성 유지나 생식, 발생 등에 관여하는 호르몬 분비 조직계에 영향을 주어 건강을 위협하는 물질을 의미한다. 내분비계 장애물질은 체내에서 내분비 호르몬의 합성, 분비, 운반, 대사, 결합, 작용, 배설, 분해 등에 영향을 주어서 내인성 호르몬의 기능적 역할을 교란하는 외인성 화학물질로서 생물체 및 그 자손에게 악영향을 미친다. 특히, 안드로겐성 내분비계 장애물질은 남성의 많은 생식 질환과 관련된 것으로 밝혀졌다.
다이옥신, DDT, PCB 등 내분비계 장애물질로 추정되고 있는 물질은 일반적으로 환경 중에서 잘 분해되지 않아 생물체 내에 축적되는 성질을 가지고 있다. 따라서 환경 중의 내분비계 장애물질은 먹이사슬에 따라 다양한 생물체로 이동하고, 식품을 통해 사람에게까지 노출될 수 있다. 또한 내분비계 장애물질들은 저용량, 장기 노출을 통해 장기적으로 생태계에 악영향을 미치기 때문에 내분비계 장애물질로 추정되는 물질들은 상당수 이미 금지되었거나 사용이 제한되어 있다.
내분비계 장애물질의 신뢰도 높은 독성정보를 제공하고, 이를 기반으로 사용을 금지하거나 제한하기 위해서는 대상 화학 물질의 내분비계 장애활성을 검색하기 위한 정확한 검색 시험법이 필수적이다. 내분비계 장애물질로 인한 영향은 단지 현재 세대뿐만 아니라 자손세대에까지 영향을 미칠 수 있기 때문에 세계 각국에서는 내분비계 장애물질을 시험·검색할 수 있는 검색 시험법 연구를 진행하고 있다.
특히, 경제협력개발기구(Organization for Economic Cooperation and Development, OECD)에서는 1998년부터 ‘내분비계 장애물질 시험 및 평가를 위한 실무그룹(EDTA)’을 구성하고, 5 단계의 검증 수준에 맞는 내분비계 장애물질 검색 시험법인 'OECD 공인 내분비계 장애물질 검색 시험법(OECD Test Guideline for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption)'을 제공하고 있다.
OECD에서 제공하는 공인 내분비계 장애물질 검색 시험법은 총 5 단계의 검증 수준으로 분류되고 있는데, 이 중 2단계는 세포 내 수준에서 내분비계 장애활성을 시험 및 검색한다. 세포 내 수준의 내분비계 장애물질 검색 시험법은 크게 결합 반응 시험법(Binding assay)과 전사 활성 시험법(Transactivation assay)으로 분류되어 제공되고 있다.
결합 반응 시험법(Binding assay)은 체내의 내분비 호르몬 수용체 단백질과 외인성 화학물질의 결합 활성(Binding affinity)을 측정하여 내인성 내분비 호르몬의 결합 활성과 비교함으로써, 대상 화학물질의 내분비계 장애활성을 평가하는 검색 시험법이다.
현재 OECD에서 제공하는 공인 내분비계 장애물질 2단계 검색 시험법 중 결합 반응 시험법으로는 에스트로겐성 내분비계 장애활성을 검색할 수 있는 검색 시험법(OECD Test Guideline 493)이 제공되고 있으며, 갑상선 호르몬성, 안드로겐성 내분비계 장애활성을 검색할 수 있는 OECD 공인 내분비계 장애물질 검색을 위한 결합 반응 시험법은 제공되고 있지 않은 실정이다.
현재 제공되고 있는 OECD 공인 내분비계 장애물질 검색 시험법 중 에스트로겐성 내분비계 장애물질 검색을 위한 결합 반응 시험법은, 사람의 에스트로겐 수용체에 방사성 동위원소인 삼중수소를 표지한 내분비 호르몬인 에스트로겐을 결합시킨 후 실험 화학물질을 처리하여 방사성 동위원소 표지 에스트로겐의 치환 정도를 내분비계 장애활성으로 계산하여 그 내분비계 장애활성 정보를 제공한다.
이러한 기존의 내분비계 장애물질 검색을 위한 결합 반응 시험법은 방사성 동위원소로 치환된 내분비 호르몬을 이용한 시험법으로, 방사성 동위원소를 이용하기 때문에 안전성에 대한 우려뿐만 아니라, 방사성 동위원소를 다룰 수 있는 시설 및 방사성 동위원소를 다룰 수 있는 전문 인력의 필요 등의 과비용 발생, 대량 시험 및 검색에 이용하지 못하는 한계 등이 존재하였다.
한편, 생물 발광 공명 에너지 전달(bioluminescence resonance energy transfer, BRET) 방법은 살아있는 세포에서 신호전달 기작을 연구하는 분야를 포함하여 단백체 및 기능유전체학 연구분야에 매우 유용한 새로운 실험기술이다. 일반적으로 단백질 상호 결합을 확인하기 위하여 두 가지 형광 물질간에 형광에너지가 전달되는 현상을 이용한다. BRET가 FRET(fluorescence resonance energy transfer)와 유사하게 도너(donor)로부터 억셉터(acceptor)까지의 에너지 전이에 기반하고 있지만, 도너 들뜸(excitation)을 위한 외부 광원을 이용함 없이 생물 분자로부터의 생물발광을 생성한다. 종래의 에너지 도너로서 루시퍼라아제(Luc)는 살아있는 유기체 내에서 자연 발생하는 효소이고, 산소 및/또는 다른 보조인자들의 존재 하에서 효소가 광 발광 색소 루시페린을 옥시루시페린으로 산화시킬 때, 청색 발산 영역(Renilla Luc에 대해 일반적으로 400-500 mm)에서 강한 생물발광(bioluminescence, BL)을 생성시킨다. 이 시스템은 단백질-단백질 상호작용, 수용체-리간드 상호작용의 분석, 및 분자 수준에서의 단일 세포의 이미징에서 명백한 이점을 갖는다.
이에, 본 발명자들은 생물 발광 공명 에너지 전달 방법을 이용하여, 기존의 방사성 동위원소를 사용함으로 인한 단점을 극복하면서 보다 정확하고, 보다 특이성이 높으며, 보다 높은 감도를 나타내는 새로운 개념의 내분비계 장애물질 검색을 위한 결합 반응 시험법을 개발하였다.
한국등록특허 제10-1802325호
본 발명자들은 생물 발광 공명 에너지 전달 방법을 인간 유래 세포주에 안정적으로 도입하여 단발성이 아닌 지속적으로 사용할 수 있는 안정화된 인간 유래 세포주를 개발함으로써, 단백질-단백질 상호작용을 기반으로 한 에스트로겐성 및 안드로겐성 내분비계 장애물질 검색 방법을 개발하였는 바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은 생물 발광 공명 에너지 전달을 이용한 내분비계 장애물질 검색 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 생물 발광 공명 에너지 전달을 이용한 내분비계 장애물질 검색을 위한 세포주의 제조 방법, 및 이로부터 제조된 세포주를 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 생물 발광 공명 에너지 전달을 이용한 내분비계 장애물질 검색 방법을 제공한다:
(a) 에스트로겐 수용체 또는 안드로겐 수용체와 생물 발광 단백질 또는 형광 단백질이 융합된 융합 단백질을 발현하도록 설계된 재조합 벡터로 세포를 형질감염 시키는 단계;
(b) 상기 형질감염된 세포주를 실험 용기에 부착시킨 후 형광 단백질을 활성화 시키는 단계;
(c) 상기 형광 단백질이 활성화된 세포주에 시험물질을 처리하는 단계;
(d) 상기 시험물질을 처리한 세포주에 생물 발광 단백질의 기질을 처리하는 단계;
(e) 상기 생물 발광 단백질의 기질을 처리한 세포주로부터 생물 발광 단백질이 발광하는 파장의 세기 및 형광 단백질이 발광하는 파장의 세기를 측정하는 단계; 및
(f) 상기 생물 발광 단백질이 발광하는 파장의 세기 및 형광 단백질이 발광하는 파장의 세기를 이용하여 시험물질의 내분비계 장애 활성을 산출하는 단계.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 생물 발광 공명 에너지 전달을 이용한 내분비계 장애물질 검색을 위한 세포주의 제조 방법을 제공한다:
(a) 세포를 배지에서 12 내지 36시간 동안 배양하는 단계;
(b) 에스트로겐 수용체 또는 안드로겐 수용체와 생물 발광 단백질이 융합된 융합 단백질, 및 에스트로겐 수용체 또는 안드로겐 수용체와 형광 단백질이 융합된 융합 단백질을 발현하도록 각각 재조합 벡터를 제작하여 상기 배양한 세포에 12 내지 36시간 동안 공동 형질감염 시키는 단계; 및
(c) 상기 형질감염 시킨 세포의 배지를 선별 배지로 교체하고 안정적으로 형질감염된 세포를 분리하는 단계.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된, 생물 발광 공명 에너지 전달을 이용한 내분비계 장애물질 검색을 위한 세포주로서, 영구적으로 사용 가능한 것을 특징으로 하는 세포주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 세포주의 생물 발광 공명 에너지 전달을 이용한 내분비계 장애물질 검색 용도를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 세포는 인간 배아 신장 세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 (a) 단계에서 형질감염된 세포주는 영구적으로 사용 가능할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 내분비계 장애물질은 17β-에스트라디올(Estradiol), 비스페놀(Bisphenol) A, 프로게스테론(Progesterone), 메드록시프로게스테론 아세테이트(Medroxyprogesterone acetate), 2-sec-부틸페놀(Butylphenol), 17α-에티닐 에스트라디올(Ethinyl estradiol), 스피로놀락톤(Spironolactone), 17α-에스트라디올(Estradiol), 비스페놀(Bisphenol) B, 5α-디하이드로테스토스테론(Dihydrotestosterone), 코티코스테론(Corticosterone), 4-안드로스테네디온(Androstenedione), 빈클로졸린(Vinclozolin), 및 아트라진(Atrazine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 생물 발광 단백질은 루시퍼라아제(luciferase)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 형광 단백질은 HaloTag 단백질과 및 그 기질의 복합체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 방법은 단백질-단백질 상호작용을 기반으로 한 결합 반응을 측정하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 내분비계 장애물질 검색 방법은 생물 발광 공명 에너지 전달 방법을 적용하여 지속적으로 사용할 수 있는 영구 안정화 인간 유래 세포주를 구축하고, 이를 이용해 기존의 체내 내분비 호르몬 수용체 단백질과 외인성 화학물질의 결합 활성(Binding affinity)을 호르몬 수용체의 세포 내 신호전달 과정에서 발생하는 단백질-단백질 상호작용(Protein-Protein Interaction)을 기반으로 측정하는 방법으로서, 에스트로겐성 내분비계 장애물질 뿐만 아니라 안드로겐성 내분비계 장애물질을 검색할 수 있으며, 기존의 방사성 동위원소를 이용한 결합 반응 시험법에 비해 안전하고, 다양한 생활 화학 물질에 대한 신뢰성 높은 내분비계 장애 활성 정보를 제공할 수 있는 효과가 있다.
도 1a는 본 발명의 일 구현예에 따른 안드로겐 수용체 융합 Nluc 발현 벡터의 구조를 나타낸 도면이다.
도 1b는 본 발명의 일 구현예에 따른 안드로겐 수용체 융합 HT 발현 벡터의 구조를 나타낸 도면이다.
도 1c는 본 발명의 일 구현예에 따른 에스트로겐 수용체 융합 Nluc 발현 벡터의 구조를 나타낸 도면이다.
도 1d는 본 발명의 일 구현예에 따른 에스트로겐 수용체 융합 HT 발현 벡터의 구조를 나타낸 도면이다.
도 1e는 본 발명의 일 구현예에 따른 영구적 안정화 세포주 개발을 위해 생물 발광 단백질 및 형광 단백질이 융합된 안드로겐 수용체의 세포 도입 비율 및 조합 탐색을 나타낸 도면이다.
도 1f는 본 발명의 일 구현예에 따른 영구적 안정화 세포주 개발을 위해 생물 발광 단백질 및 형광 단백질이 융합된 안드로겐 수용체의 세포 도입 비율 및 도입 후 세포주의 안드로겐 (DHT)에 대한 반응을 농도별로 확인한 도면이다.
도 1g는 본 발명의 일 구현예에 따른 영구적 안정화 세포주 개발을 위해 생물 발광 단백질 및 형광 단백질이 융합된 에스트로겐 수용체의 세포 도입 비율 및 조합 탐색을 나타낸 도면이다.
도 1h는 본 발명의 일 구현예에 따른 영구적 안정화 세포주 개발을 위해 생물 발광 단백질 및 형광 단백질이 융합된 안드로겐 수용체의 세포 도입 비율 및 도입 후 세포주의 에스트로겐(E2)에 대한 반응을 농도별로 확인한 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 구현예에 따른 생물 발광 공명 에너지 전달을 이용한 내분비계 장애물질 검색 방법을 통해 도출된 시험물질의 에스트로겐성 내분비 장애 활성을 확인한 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 구현예에 따른 생물 발광 공명 에너지 전달을 이용한 내분비계 장애물질 검색 방법을 통해 도출된 시험물질의 안드로겐성 내분비 장애 활성을 확인한 도면이다.
본 발명은 하기 단계를 포함하는, 생물 발광 공명 에너지 전달을 이용한 내분비계 장애물질 검색 방법을 제공한다:
(a) 에스트로겐 수용체 또는 안드로겐 수용체와 생물 발광 단백질 또는 형광 단백질이 융합된 융합 단백질을 발현하도록 설계된 재조합 벡터로 세포를 형질감염 시키는 단계;
(b) 상기 형질감염된 세포주를 실험 용기에 부착시킨 후 형광 단백질을 활성화 시키는 단계;
(c) 상기 형광 단백질이 활성화된 세포주에 시험물질을 처리하는 단계;
(d) 상기 시험물질을 처리한 세포주에 생물 발광 단백질의 기질을 처리하는 단계;
(e) 상기 생물 발광 단백질의 기질을 처리한 세포주로부터 생물 발광 단백질이 발광하는 파장의 세기 및 형광 단백질이 발광하는 파장의 세기를 측정하는 단계; 및
(f) 상기 생물 발광 단백질이 발광하는 파장의 세기 및 형광 단백질이 발광하는 파장의 세기를 이용하여 시험물질의 내분비계 장애 활성을 산출하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 방법은 단백질-단백질 상호작용을 기반으로 한 결합 반응을 측정하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, “생물 발광 공명 에너지 전달(Bioluminescence resonance energy transfer, BRET)”은 발광 도너(donor)와 형광 억셉터(acceptor) 사이의 에너지 전달을 의미한다. BRET는 도너와 억셉터 사이의 거리가 10nm 미만이고 효율성이 거리의 6 승에 반비례할 때 발생하기 때문에 살아있는 세포에서 단백질-단백질 상호작용 및 구조적 재배열을 모니터링하기 위한 근접 기반 분석으로 사용되고 있다.
상기 도너는 예컨대, 루시퍼라아제(luciferase) 또는 광단백질(photoprotein)이며, 레닐라(Renilla) 루시퍼라아제, 반딧불이 루시퍼라아제, 강장동물 루시퍼라아제, 북미글로웜(North American glow worm) 루시퍼라아제, 방아벌레 루시퍼라아제, 철도 벌레(railroad worm) 루시퍼라아제, 박테리아 루시퍼라아제, 가우시아(Gaussia) 루시퍼라아제, 애쿠오린, 아라크노캠파(Arachnocampa) 루시퍼라아제, 나노 루시퍼라제 또는 이의 어느 하나의 생물학적 활성 변이체 또는 단편, 또는 이의 2 이상의 키메라로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있고, 본 발명의 일 실시예에 따르면 나노 루시퍼라아제일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 상기 억셉터는 예컨대, 퀀텀닷(QD), 형광 단백질, 화학형광체, 화학소광체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있고, 본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 억셉터는 형광 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 생물 발광 단백질은 기질이 존재하는 한 강하고 일정한 광 방사를 나타내며, BRET의 도너일 수 있다. 상기 생물 발광 단백질은 예컨대 루시퍼라아제(luciferase)일 수 있고, 본 발명의 일 실시예에 따르면 NanoLuc(Nluc)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 형광 단백질은 BRET의 억셉터일 수 있으며, 예컨대 녹색형광단백질(GFP), 변형된 녹색형광단백질(modified green fluorescent protein), 증강된 녹색형광단백질(enhanced green fluorescent protein; EGFP), 황색형광단백질(YFP), 증강된 황색형광단백질(EYFP), 적색형광단백질(RFP), 증강된 적색형광단백질(ERFP), 주황형광단백질(OFP), 남색형광단백질(CFP), 증강된 남색형광단백질(ECFP), 청색형광단백질(BFP), 증강된 청색형광단백질(EBFP), 또는 HaloTag 단백질일 수 있으며, 또는 이들 단백질과 그 기질의 복합체일 수 있고, 본 발명의 일 실시예에 따르면 HaloTag(HT) 단백질 및 HaloTag 리간드의 복합체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, “내분비계 장애물질”은 내분비계의 정상적인 기능을 방해하는 화학 물질로서 환경 중 배출된 화학물질이 체내에 유입되어 마치 호르몬처럼 작용한다고 하여 환경 호르몬으로 불리기도 하는데, 이는 내분비계 장애물질의 화학적 구조가 생체 호르몬과 비슷해 체내에서 마치 천연 호르몬인 것처럼 작용하는 경우가 많기 때문이다. 이를 '모방(mimic)'이라 하며, 몸 속 세포 물질과 결합하여 비정상적인 생리작용을 낳게 된다. 이 과정에서 호르몬이 할 수 있는 역할공간을 이들 내분비계 장애물질이 완전히 빼앗아 버리는 경우도 있는데, 이는 '봉쇄(blocking)'라고 한다. 현재 알려진 대부분의 내분비계 장애물질은 '모방' 또는 '봉쇄'의 두 가지 작용을 하고 있다. 환경호르몬으로 알려진 화학물질로는 쓰레기를 태울 때 발생하는 다이옥신(TCDD 등), PCB, DDT, 합성세제 원료인 알킬페놀, 플라스틱 원료인 비스페놀 A 등이 있으며, 환경호르몬은 가정용 세척제, 살충제, 제초제, 자동차 매연, 폴리스틸렌 재질의 일회용 식기 (컵라면 용기 등), 캔맥주, 캔음료, 심지어 유아용 젖병 등 일상과 관계된 전분야에 걸쳐 검출되고 있다.
예컨대, 본 발명의 일 실험예에 따르면, 상기 내분비계 장애물질은 17β-에스트라디올(Estradiol), 비스페놀(Bisphenol) A, 프로게스테론(Progesterone), 메드록시프로게스테론 아세테이트(Medroxyprogesterone acetate), 2-sec-부틸페놀(Butylphenol), 17α-에티닐 에스트라디올(Ethinyl estradiol), 스피로놀락톤(Spironolactone), 17α-에스트라디올(Estradiol), 비스페놀(Bisphenol) B, 5α-디하이드로테스토스테론(Dihydrotestosterone), 코티코스테론(Corticosterone), 4-안드로스테네디온(Androstenedione), 빈클로졸린(Vinclozolin), 및 아트라진(Atrazine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, “내분비계 장애물질 검색”은 내분비계 장애물질의 존재 여부를 측정 또는 확인하는 것, 및 내분비계 장애물질의 내분비계 장애 활성 수준을 측정 또는 확인하는 것을 모두 포함하는 의미이다.
본 발명에 있어서, “에스트로겐(Estrogen)”은 성 스테로이드 호르몬의 일종으로, 난소의 과립막 세포에서 안드로겐으로부터의 대사로 생긴다. 방출된 에스트로겐은 에스트로겐 수용체에 결합됨으로써 특정 유전자의 전사를 활성화한다. 본 발명에 있어서, “에스트로겐성 내분비계 장애물질”은 에스트로겐과의 분자 구조 유사성 때문에 에스트로겐 수용체와 결합하는 물질을 의미한다.
본 발명에 있어서, “안드로겐(Androgen)”은 성 스테로이드 호르몬의 일종으로, 남성 생식계의 성장, 발달 그리고 기능에 영향을 미치는 모든 남성 호르몬을 말한다. 안드로겐은 에스트로겐의 전구체로 여성의 생리작용에도 중요하며, 대부분의 안드로겐은 고환에서 생성되고, 일부는 부신피질과 난소에서 생성된다. 안드로겐 수용체는 다양한 조직에 존재하여 생리적인 기능을 유지하도록 도와준다. 본 발명에 있어서, “안드로겐성 내분비계 장애물질”은 안드로겐과의 분자 구조 유사성 때문에 안드로겐 수용체와 결합하는 물질을 의미한다.
본 발명에 있어서, “재조합”은 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터에 대하여 사용될 경우, 상기 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종 핵산 또는 단백질의 도입 또는 천연(native) 핵산 또는 단백질의 변경에 의해 변형되었거나, 또는 상기 세포가 그렇게 변형된 세포로부터 유래됨을 의미한다. 즉, 예를 들어, 재조합 세포는 상기 세포의 천연(비(非)재조합) 형태 내에서는 발견되지 않는 유전자를 발현하거나 또는 발현될 경우 비정상적으로 발현되었거나 또는 전혀 발현되지 않았을 천연 유전자를 발현한다.
본 발명에 있어서, “벡터”는 적합한 숙주 내에서 DNA의 발현을 수행할 수 있는 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 구조물을 의미한다. 적합한 조절 서열은 전사를 수행하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게 놈 삽입물일 수 있다. 벡터가 적당한 숙주를 형질전환 시키면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 일부 경우엔 게놈 그 자체에 삽입되어 통합될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 "작동 가능하게 연결된” 이라는 용어는 발현이 필요한 유전자와 이의 조절 서열이 서로 기능적으로 결합되어 유전자 발현을 가능케 하는 방식으로 연결되는 것을 말한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 재조합 벡터는 NanoLuc®(Nluc) 또는 Halo Tag®(HT) 단백질과 에스트로겐 수용체(Estrogen receptor, ER) 또는 안드로겐 수용체(Androgen receptor, AR)가 각각 융합된 융합 단백질을 발현하도록 설계된 것일 수 있으며, 상기 재조합 벡터 내 이들의 순서에는 제한이 없다. 예컨대, Nluc-AR, AR-Nluc, HT-AR, AR-HT, Nluc-ER, ER-Nluc, HT-ER, 또는 ER-HT의 DNA 서열이 재조합 벡터에 삽입될 수 있으며, 상기 Nluc 및 HT는 AR 또는 ER의 N-말단 위치에 융합되어, 효율적으로 생물 발광 공명 에너지 전달 신호를 얻을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 재조합 벡터 형태의 DNA를 세포에 도입하는 방법으로는 특별히 제한이 없으며, 예컨대 뉴클레오펙션(nucleofection), 일시적인 형질감염(transient transfection), 세포 융합, 리포좀 매개된 형질감염(liposem-mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 인산칼슘을 이용한 형질감염(Graham, FL 등, Virology, 52:456(1973)), DEAE 덱스트란에 의한 형질감염, 미세주사에 의한 형질감염(Capecchi, MR, Cell, 22:479(1980)), 양이온성 지질에 의한 형질감염(Wong, TK 등, Gene, 10:87(1980)), 전기천공법(Neumann E등, EMBO J, 1:841(1982)), 형질도입 또는 트랜스펙션 등 문헌(Basic methods in molecular biology, Davis 등, 1986 및 Molecular cloning: A laboratory manual, Davis 등, 1986)에 기재된 바와 같이 본 발명이 속한 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 익히 공지되어 있는 방법들에 따라 이뤄질 수 있다.
본 발명에 있어서, “형질감염(transfection)”은 외래 DNA를 세포 내에 도입하는 것을 지칭한다. 형질감염은, 포스페이트-DNA 공-침전, DEAE-덱스트란-매개 형질감염, 폴리브렌-매개 형질감염, 유리 비이드, 일렉트로포레이션, 마이크로주입, 리포좀 융합, 리포펙션, 원형질체 융합, 바이러스 감염, 바이오리스틱스(biolistics) (즉, 입자 충돌) 등을 포함한 당 기술분야에 공지된 여러 수단에 의해 달성될 수도 있다.
본 발명에 있어서, “기질(substrate)”은 효소와 반응하는 분자를 의미하는 것으로, 효소는 기질을 포함하는 화학반응을 촉매한다. 본 발명의 일 실험예에 따르면, 생물 발광 단백질의 기질로 furimazine를 사용할 수 있으며, 형광 단백질은 HaloTag 단백질의 기질로 HaloTag 리간드를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, “시험물질”은 본 발명의 생물 발광 공명 에너지 전달을 이용한 내분비계 장애물질 검색 방법을 통해 내분비계 장애 활성을 확인하고자 하는 임의의 물질을 의미하며, 이의 종류에는 제한이 없다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 생물 발광 공명 에너지 전달을 이용한 내분비계 장애물질 검색을 위한 세포주의 제조 방법을 제공한다:
(a) 세포를 배지에서 12 내지 36시간 동안 배양하는 단계;
(b) 에스트로겐 수용체 또는 안드로겐 수용체와 생물 발광 단백질이 융합된 융합 단백질, 및 에스트로겐 수용체 또는 안드로겐 수용체와 형광 단백질이 융합된 융합 단백질을 발현하도록 각각 재조합 벡터를 제작하여 상기 배양한 세포에 12 내지 36시간 동안 공동 형질감염 시키는 단계; 및
(c) 상기 형질감염 시킨 세포의 배지를 선별 배지로 교체하고 안정적으로 형질감염된 세포를 분리하는 단계.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된, 생물 발광 공명 에너지 전달을 이용한 내분비계 장애물질 검색을 위한 세포주로서, 영구적으로 사용 가능한 것을 특징으로 하는 세포주를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 세포는 인간 배아 신장 세포일 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에 따르면 HEK293일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 세포주 제조 방법에 있어서, 상기 배양 및 형질감염은 12 내지 36시간, 12 내지 32시간, 12 내지 28시간, 12 내지 24시간, 16 내지 36시간, 16 내지 32시간, 16 내지 28시간, 16 내지 24시간, 20 내지 36시간, 20 내지 32시간, 20 내지 28시간, 20 내지 24시간, 24 내지 36시간, 24 내지 32시간, 24 내지 28시간, 또는 24시간 동안 수행할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 세포주 제조 방법에 있어서, 상기 (a) 단계에서 배지는 FBS(소태아혈청) 및 페니실린-스트렙토 마이신을 함유하는 MEM(Minimum essential medium) 배지일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 세포주 제조 방법에 있어서, 상기 (c) 단계는 선별 배지를 이용하여 장기 세대 배양을 통해 안정적으로 세포의 유전체에 도입 유전자의 융합을 유도하는 단계로서, 상기 선별 배지는 하이그로마이신(hygromycin) B 및 G418(Geneticin)이 함유된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서는 인간 배아 신장 세포 HEK293를 배양하고, 안드로겐 수용체 또는 에스트로겐 수용체가 융합된 NanoLuc®(Nluc) 및 HaloTag®(HT) 발현 벡터를 세포에 형질감염 시켜 지속적으로 사용할 수 있는 영구 안정화 인간 유래 세포주를 구축하였다(실시예 1 참조).
본 발명의 내분비계 장애물질 검색 방법에 있어서, 상기 (b) 단계는 형질감염된 세포주를 실험 용기에 부착시킨 후 형광 단백질을 활성화 시키는 단계로서, 상기 형광 단백질을 활성화 시키는 단계는, HaloTag 단백질의 기질인 HaloTag 리간드를 처리하여 이들의 상호작용을 통해 HaloTag 단백질 및 HaloTag 리간드의 복합체인 형광 단백질을 활성화 시키는 단계일 수 있으며, 이때, 세포주를 실험 용기에 부착시킨 후 10분 내지 3시간, 10분 내지 2시간 30분, 10분 내지 2시간, 10분 내지 1시간 30분, 10분 내지 1시간, 30분 내지 3시간, 30분 내지 2시간 30분, 30분 내지 2시간, 30분 내지 1시간 30분, 30분 내지 1시간, 50분 내지 1시간 30분, 또는 1시간 후에 HaloTag 단백질의 기질을 처리할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 내분비계 장애물질 검색 방법에 있어서, 상기 (c) 단계에서 시험물질은 1 내지 100배, 1 내지 80배, 1 내지 60배, 1 내지 40배, 1 내지 20배, 1 내지 10배, 5 내지 100배, 5 내지 80배, 5 내지 60배, 5 내지 40배, 5 내지 20배, 5 내지 10배, 10 내지 100배, 10 내지 80배, 10 내지 60배, 10 내지 40배, 10 내지 20배, 또는 10배로 희석하여 처리할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이때, 상기 시험물질은 12 내지 36시간, 12 내지 32시간, 12 내지 28시간, 12 내지 24시간, 16 내지 36시간, 16 내지 32시간, 16 내지 28시간, 16 내지 24시간, 20 내지 36시간, 20 내지 32시간, 20 내지 28시간, 20 내지 24시간, 24 내지 36시간, 24 내지 32시간, 24 내지 28시간, 또는 24시간 동안 처리할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 내분비계 장애물질 검색 방법에 있어서, 상기 (d) 단계에서 생물 발광 단백질의 기질은 1 내지 10분, 1 내지 8분, 1 내지 6분, 2 내지 10분, 2 내지 8분, 2 내지 6분, 4 내지 10분, 4 내지 8분, 4내지 6분, 또는 5분 동안 처리할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실험예에서는, 생물 발광 공명 에너지 전달을 기반으로 에스트로겐 수용체 결합 반응 시험을 통해 17β-에스트라디올, 비스페놀 A, 프로게스테론, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 2-sec-부틸페놀, 17α-에티닐 에스트라디올, 스피로놀락톤, 17α-에스트라디올, 및 비스페놀 B의 내분비계 장애 활성을 확인하였다(실험예 1 참조).
본 발명의 다른 실험예에서는, 생물 발광 공명 에너지 전달을 기반으로 안드로겐 수용체 결합 반응 시험을 통해 17β-에스트라디올, 5α-디하이드로테스토스테론, 비스페놀 A, 코티코스테론, 4-안드로스테네디온, 빈클로졸린, 스피로놀락톤, 아트라진, 및 17α-에스트라디올의 내분비계 장애 활성을 확인하였다(실험예 2 참조).
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 생물 발광 공명 에너지 전달(BRET) 기반 결합 분석을 위한 안정적으로 형질감염된 세포주의 구축
인간 배아 신장(Human Embryonic Kidney) 세포인 HEK293 세포를 10% FBS 및 50 U/ml 페니실린-스트렙토 마이신(Gibco, Cat. #. 15140122)을 함유하는 MEM(Minimum essential medium) 배지에서 6-웰 세포 배양 플레이트에 5.0 x 105 세포/웰로 접종하였다. 세포 접종 24시간 후 제조업체의 지침에 따라 Lipofectamine® 3000 형질감염 시약을 사용하여 AR(androgen receptor)/ER(estrogen receptor)이 융합된 NanoLuc®(Nluc) 및 HaloTag®(HT) 발현 벡터 각각 625 ng으로 세포를 안정적으로 공동 형질감염시켰으며, 공동 형질감염 이후에 하이그로마이신(hygromycin) B 및 G418(Geneticin)를 이용하여 장기 세대 배양을 통해 안정적으로 세포의 유전체에 도입 유전자의 융합을 유도하였다. 상기 각각의 벡터 서열은 하기 표 1에 나타내었다.
vector 서열 서열번호
NanoLuc luciferase_Androgen Receptor ATGGTCTTCACACTCGAAGATTTCGTTGGGGACTGGCGACAGACAGCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCCTTGAACAGGGAGGTGTGTCCAGTTTGTTTCAGAATCTCGGGGTGTCCGTAACTCCGATCCAAAGGATTGTCCTGAGCGGTGAAAATGGGCTGAAGATCGACATCCATGTCATCATCCCGTATGAAGGTCTGAGCGGCGACCAAATGGGCCAGATCGAAAAAATTTTTAAGGTGGTGTACCCTGTGGATGATCATCACTTTAAGGTGATCCTGCACTATGGCACACTGGTAATCGACGGGGTTACGCCGAACATGATCGACTATTTCGGACGGCCGTATGAAGGCATCGCCGTGTTCGACGGCAAAAAGATCACTGTAACAGGGACCCTGTGGAACGGCAACAAAATTATCGACGAGCGCCTGATCAACCCCGACGGCTCCCTGCTGTTCCGAGTAACCATCAACGGAGTGACCGGCTGGCGGCTGTGCGAACGCATTCTGGCGGGCTCGAGCGGCGCGATCGCCATGGAAGTGCAGTTAGGGCTGGGAAGGGTCTACCCTCGGCCGCCGTCCAAGACCTACCGAGGAGCTTTCCAGAATCTGTTCCAGAGCGTGCGCGAAGTGATCCAGAACCCGGGCCCCAGGCACCCAGAGGCCGCGAGCGCAGCACCTCCCGGCGCCAGTTTGCTGCTGCTGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAAGAGACTAGCCCCAGGCAGCAGCAGCAGCAGCAGGGTGAGGATGGTTCTCCCCAAGCCCATCGTAGAGGCCCCACAGGCTACCTGGTCCTGGATGAGGAACAGCAACCTTCACAGCCGCAGTCGGCCCTGGAGTGCCACCCCGAGAGAGGTTGCGTCCCAGAGCCTGGAGCCGCCGTGGCCGCCAGCAAGGGGCTGCCGCAGCAGCTGCCAGCACCTCCGGACGAGGATGACTCAGCTGCCCCATCCACGTTGTCCCTGCTGGGCCCCACTTTCCCCGGCTTAAGCAGCTGCTCCGCTGACCTTAAAGACATCCTGAGCGAGGCCAGCACCATGCAACTCCTTCAGCAACAGCAGCAGGAAGCAGTATCCGAAGGCAGCAGCAGCGGGAGAGCGAGGGAGGCCTCGGGGGCTCCCACTTCCTCCAAGGACAATTACTTAGGGGGCACTTCGACCATTTCTGACAACGCCAAGGAGTTGTGTAAGGCAGTGTCGGTGTCCATGGGCCTGGGTGTGGAGGCGTTGGAGCATCTGAGTCCAGGGGAACAGCTTCGGGGGGATTGCATGTACGCCCCACTTTTGGGAGTTCCACCCGCTGTGCGTCCCACTCCTTGTGCCCCATTGGCCGAATGCAAAGGTTCTCTGCTAGACGACAGCGCAGGCAAGAGCACTGAAGATACTGCTGAGTATTCCCCTTTCAAGGGAGGTTACACCAAAGGGCTAGAAGGCGAGAGCCTAGGCTGCTCTGGCAGCGCTGCAGCAGGGAGCTCCGGGACACTTGAACTGCCGTCTACCCTGTCTCTCTACAAGTCCGGAGCACTGGACGAGGCAGCTGCGTACCAGAGTCGCGACTACTACAACTTTCCACTGGCTCTGGCCGGACCGCCGCCCCCTCCGCCGCCTCCCCATCCCCACGCTCGCATCAAGCTGGAGAACCCGCTGGACTACGGCAGCGCCTGGGCGGCTGCGGCGGCGCAGTGCCGCTATGGGGACCTGGCGAGCCTGCATGGCGCGGGTGCAGCGGGACCCGGTTCTGGGTCACCCTCAGCCGCCGCTTCCTCATCCTGGCACACTCTCTTCACAGCCGAAGAAGGCCAGTTGTATGGACCGTGTGGTGGTGGTGGGGGTGGTGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGAGGCGGGAGCTGTAGCCCCCTACGGCTACACTCGGCCCCCTCAGGGGCTGGCGGGCCAGGAAAGCGACTTCACCGCACCTGATGTGTGGTACCCTGGCGGCATGGTGAGCAGAGTGCCCTATCCCAGTCCCACTTGTGTCAAAAGCGAAATGGGCCCCTGGATGGATAGCTACTCCGGACCTTACGGGGACATGCGTTTGGAGACTGCCAGGGACCATGTTTTGCCCATTGACTATTACTTTCCACCCCAGAAGACCTGCCTGATCTGTGGAGATGAAGCTTCTGGGTGTCACTATGGAGCTCTCACATGTGGAAGCTGCAAGGTCTTCTTCAAAAGAGCCGCTGAAGGGAAACAGAAGTACCTGTGCGCCAGCAGAAATGATTGCACTATTGATAAATTCCGAAGGAAAAATTGTCCATCTTGTCGTCTTCGGAAATGTTATGAAGCAGGGATGACTCTGGGAGCCCGGAAGCTGAAGAAACTTGGTAATCTGAAACTACAGGAGGAAGGAGAGGCTTCCAGCACCACCAGCCCCACTGAGGAGACAACCCAGAAGCTGACAGTGTCACACATTGAAGGCTATGAATGTCAGCCCATCTTTCTGAATGTCCTGGAAGCCATTGAGCCAGGTGTAGTGTGTGCTGGACACGACAACAACCAGCCCGACTCCTTTGCAGCCTTGCTCTCTAGCCTCAATGAACTGGGAGAGAGACAGCTTGTACACGTGGTCAAGTGGGCCAAGGCCTTGCCTGGCTTCCGCAACTTACACGTGGACGACCAGATGGCTGTCATTCAGTACTCCTGGATGGGGCTCATGGTGTTTGCCATGGGCTGGCGATCCTTCACCAATGTCAACTCCAGGATGCTCTACTTCGCCCCTGATCTGGTTTTCAATGAGTACCGCATGCACAAGTCCCGGATGTACAGCCAGTGTGTCCGAATGAGGCACCTCTCTCAAGAGTTTGGATGGCTCCAAATCACCCCCCAGGAATTCCTGTGCATGAAAGCACTGCTACTCTTCAGCATTATTCCAGTGGATGGGCTGAAAAATCAAAAATTCTTTGATGAACTTCGAATGAACTACATCAAGGAACTCGATCGTATCATTGCATGCAAAAGAAAAAATCCCACATCCTGCTCAAGACGCTTCTACCAGCTCACCAAGCTCCTGGACTCCGTGCAGCCTATTGCGAGAGAGCTGCATCAGTTCACTTTTGACCTGCTAATCAAGTCACACATGGTGAGCGTGGACTTTCCGGAAATGATGGCAGAGATCATCTCTGTGCAAGTGCCCAAGATCCTTTCTGGGAAAGTCAAGCCCATCTATTTCCACACCCAG 1
Androgen Receptor_HaloTag ATGGAAGTGCAGTTAGGGCTGGGAAGGGTCTACCCTCGGCCGCCGTCCAAGACCTACCGAGGAGCTTTCCAGAATCTGTTCCAGAGCGTGCGCGAAGTGATCCAGAACCCGGGCCCCAGGCACCCAGAGGCCGCGAGCGCAGCACCTCCCGGCGCCAGTTTGCTGCTGCTGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAAGAGACTAGCCCCAGGCAGCAGCAGCAGCAGCAGGGTGAGGATGGTTCTCCCCAAGCCCATCGTAGAGGCCCCACAGGCTACCTGGTCCTGGATGAGGAACAGCAACCTTCACAGCCGCAGTCGGCCCTGGAGTGCCACCCCGAGAGAGGTTGCGTCCCAGAGCCTGGAGCCGCCGTGGCCGCCAGCAAGGGGCTGCCGCAGCAGCTGCCAGCACCTCCGGACGAGGATGACTCAGCTGCCCCATCCACGTTGTCCCTGCTGGGCCCCACTTTCCCCGGCTTAAGCAGCTGCTCCGCTGACCTTAAAGACATCCTGAGCGAGGCCAGCACCATGCAACTCCTTCAGCAACAGCAGCAGGAAGCAGTATCCGAAGGCAGCAGCAGCGGGAGAGCGAGGGAGGCCTCGGGGGCTCCCACTTCCTCCAAGGACAATTACTTAGGGGGCACTTCGACCATTTCTGACAACGCCAAGGAGTTGTGTAAGGCAGTGTCGGTGTCCATGGGCCTGGGTGTGGAGGCGTTGGAGCATCTGAGTCCAGGGGAACAGCTTCGGGGGGATTGCATGTACGCCCCACTTTTGGGAGTTCCACCCGCTGTGCGTCCCACTCCTTGTGCCCCATTGGCCGAATGCAAAGGTTCTCTGCTAGACGACAGCGCAGGCAAGAGCACTGAAGATACTGCTGAGTATTCCCCTTTCAAGGGAGGTTACACCAAAGGGCTAGAAGGCGAGAGCCTAGGCTGCTCTGGCAGCGCTGCAGCAGGGAGCTCCGGGACACTTGAACTGCCGTCTACCCTGTCTCTCTACAAGTCCGGAGCACTGGACGAGGCAGCTGCGTACCAGAGTCGCGACTACTACAACTTTCCACTGGCTCTGGCCGGACCGCCGCCCCCTCCGCCGCCTCCCCATCCCCACGCTCGCATCAAGCTGGAGAACCCGCTGGACTACGGCAGCGCCTGGGCGGCTGCGGCGGCGCAGTGCCGCTATGGGGACCTGGCGAGCCTGCATGGCGCGGGTGCAGCGGGACCCGGTTCTGGGTCACCCTCAGCCGCCGCTTCCTCATCCTGGCACACTCTCTTCACAGCCGAAGAAGGCCAGTTGTATGGACCGTGTGGTGGTGGTGGGGGTGGTGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGAGGCGGGAGCTGTAGCCCCCTACGGCTACACTCGGCCCCCTCAGGGGCTGGCGGGCCAGGAAAGCGACTTCACCGCACCTGATGTGTGGTACCCTGGCGGCATGGTGAGCAGAGTGCCCTATCCCAGTCCCACTTGTGTCAAAAGCGAAATGGGCCCCTGGATGGATAGCTACTCCGGACCTTACGGGGACATGCGTTTGGAGACTGCCAGGGACCATGTTTTGCCCATTGACTATTACTTTCCACCCCAGAAGACCTGCCTGATCTGTGGAGATGAAGCTTCTGGGTGTCACTATGGAGCTCTCACATGTGGAAGCTGCAAGGTCTTCTTCAAAAGAGCCGCTGAAGGGAAACAGAAGTACCTGTGCGCCAGCAGAAATGATTGCACTATTGATAAATTCCGAAGGAAAAATTGTCCATCTTGTCGTCTTCGGAAATGTTATGAAGCAGGGATGACTCTGGGAGCCCGGAAGCTGAAGAAACTTGGTAATCTGAAACTACAGGAGGAAGGAGAGGCTTCCAGCACCACCAGCCCCACTGAGGAGACAACCCAGAAGCTGACAGTGTCACACATTGAAGGCTATGAATGTCAGCCCATCTTTCTGAATGTCCTGGAAGCCATTGAGCCAGGTGTAGTGTGTGCTGGACACGACAACAACCAGCCCGACTCCTTTGCAGCCTTGCTCTCTAGCCTCAATGAACTGGGAGAGAGACAGCTTGTACACGTGGTCAAGTGGGCCAAGGCCTTGCCTGGCTTCCGCAACTTACACGTGGACGACCAGATGGCTGTCATTCAGTACTCCTGGATGGGGCTCATGGTGTTTGCCATGGGCTGGCGATCCTTCACCAATGTCAACTCCAGGATGCTCTACTTCGCCCCTGATCTGGTTTTCAATGAGTACCGCATGCACAAGTCCCGGATGTACAGCCAGTGTGTCCGAATGAGGCACCTCTCTCAAGAGTTTGGATGGCTCCAAATCACCCCCCAGGAATTCCTGTGCATGAAAGCACTGCTACTCTTCAGCATTATTCCAGTGGATGGGCTGAAAAATCAAAAATTCTTTGATGAACTTCGAATGAACTACATCAAGGAACTCGATCGTATCATTGCATGCAAAAGAAAAAATCCCACATCCTGCTCAAGACGCTTCTACCAGCTCACCAAGCTCCTGGACTCCGTGCAGCCTATTGCGAGAGAGCTGCATCAGTTCACTTTTGACCTGCTAATCAAGTCACACATGGTGAGCGTGGACTTTCCGGAAATGATGGCAGAGATCATCTCTGTGCAAGTGCCCAAGATCCTTTCTGGGAAAGTCAAGCCCATCTATTTCCACACCCAGGTTTCTCTCGAGCCAACCACTGAGGATCTGTACTTTCAGAGCGATAACGATGGATCCGAAATCGGTACTGGCTTTCCATTCGACCCCCATTATGTGGAAGTCCTGGGCGAGCGCATGCACTACGTCGATGTTGGTCCGCGCGATGGCACCCCTGTGCTGTTCCTGCACGGTAACCCGACCTCCTCCTACGTGTGGCGCAACATCATCCCGCATGTTGCACCGACCCATCGCTGCATTGCTCCAGACCTGATCGGTATGGGCAAATCCGACAAACCAGACCTGGGTTATTTCTTCGACGACCACGTCCGCTTCATGGATGCCTTCATCGAAGCCCTGGGTCTGGAAGAGGTCGTCCTGGTCATTCACGACTGGGGCTCCGCTCTGGGTTTCCACTGGGCCAAGCGCAATCCAGAGCGCGTCAAAGGTATTGCATTTATGGAGTTCATCCGCCCTATCCCGACCTGGGACGAATGGCCAGAATTTGCCCGCGAGACCTTCCAGGCCTTCCGCACCACCGACGTCGGCCGCAAGCTGATCATCGATCAGAACGTTTTTATCGAGGGTACGCTGCCGATGGGTGTCGTCCGCCCGCTGACTGAAGTCGAGATGGACCATTACCGCGAGCCGTTCCTGAATCCTGTTGACCGCGAGCCACTGTGGCGCTTCCCAAACGAGCTGCCAATCGCCGGTGAGCCAGCGAACATCGTCGCGCTGGTCGAAGAATACATGGACTGGCTGCACCAGTCCCCTGTCCCGAAGCTGCTGTTCTGGGGCACCCCAGGCGTTCTGATCCCACCGGCCGAAGCCGCTCGCCTGGCCAAAAGCCTGCCTAACTGCAAGGCTGTGGACATCGGCCCGGGTCTGAATCTGCTGCAAGAAGACAACCCGGACCTGATCGGCAGCGAGATCGCGCGCTGGCTGTCTACTCTGGAGATTTCCGGT 2
NanoLuc luciferase_Estrogen Receptor alpha ATGGTCTTCACACTCGAAGATTTCGTTGGGGACTGGCGACAGACAGCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCCTTGAACAGGGAGGTGTGTCCAGTTTGTTTCAGAATCTCGGGGTGTCCGTAACTCCGATCCAAAGGATTGTCCTGAGCGGTGAAAATGGGCTGAAGATCGACATCCATGTCATCATCCCGTATGAAGGTCTGAGCGGCGACCAAATGGGCCAGATCGAAAAAATTTTTAAGGTGGTGTACCCTGTGGATGATCATCACTTTAAGGTGATCCTGCACTATGGCACACTGGTAATCGACGGGGTTACGCCGAACATGATCGACTATTTCGGACGGCCGTATGAAGGCATCGCCGTGTTCGACGGCAAAAAGATCACTGTAACAGGGACCCTGTGGAACGGCAACAAAATTATCGACGAGCGCCTGATCAACCCCGACGGCTCCCTGCTGTTCCGAGTAACCATCAACGGAGTGACCGGCTGGCGGCTGTGCGAACGCATTCTGGCGGGCTCGAGCGGCGCGATCGCCATGACCATGACCCTCCACACCAAAGCATCTGGGATGGCCCTACTGCATCAGATCCAAGGGAACGAGCTGGAGCCCCTGAACCGTCCGCAGCTCAAGATCCCCCTGGAGCGGCCCCTGGGCGAGGTGTACCTGGACAGCAGCAAGCCCGCCGTGTACAACTACCCCGAGGGCGCCGCCTACGAGTTCAACGCCGCGGCCGCCGCCAACGCGCAGGTCTACGGTCAGACCGGCCTCCCCTACGGCCCCGGGTCTGAGGCTGCGGCGTTCGGCTCCAACGGCCTGGGGGGTTTCCCCCCACTCAACAGCGTGTCTCCGAGCCCGCTGATGCTACTGCACCCGCCGCCGCAGCTGTCGCCTTTCCTGCAGCCCCACGGCCAGCAGGTGCCCTACTACCTGGAGAACGAGCCCAGCGGCTACACGGTGCGCGAGGCCGGCCCGCCGGCATTCTACAGGCCAAATTCAGATAATCGACGCCAGGGTGGCAGAGAAAGATTGGCCAGTACCAATGACAAGGGAAGTATGGCTATGGAATCTGCCAAGGAGACTCGCTACTGTGCAGTGTGCAATGACTATGCTTCAGGCTACCATTATGGAGTCTGGTCCTGTGAGGGCTGCAAGGCCTTCTTCAAGAGAAGTATTCAAGGACATAACGACTATATGTGTCCAGCCACCAACCAGTGCACCATTGATAAAAACAGGAGGAAGAGCTGCCAGGCCTGCCGGCTCCGTAAATGCTACGAAGTGGGAATGATGAAAGGTGGGATACGAAAAGACCGAAGAGGAGGGAGAATGTTGAAACACAAGCGCCAGAGAGATGATGGGGAGGGCAGGGGTGAAGTGGGGTCTGCTGGAGACATGAGAGCTGCCAACCTTTGGCCAAGCCCGCTCATGATCAAACGCTCTAAGAAGAACAGCCTGGCCTTGTCCCTGACGGCCGACCAGATGGTCAGTGCCTTGTTGGATGCTGAGCCCCCGATACTCTATTCCGAGTATGATCCTACCAGACCCTTCAGTGAAGCTTCGATGATGGGCTTACTGACCAACCTGGCAGACAGGGAGCTGGTTCACATGATCAACTGGGCGAAGAGGGTGCCAGGCTTTGTGGATTTGACCCTCCATGATCAGGTCCACCTTCTAGAATGTGCCTGGCTAGAGATCCTGATGATTGGTCTCGTCTGGCGCTCCATGGAGCACCCAGGGAAGCTACTGTTTGCTCCTAACTTGCTCTTGGACAGGAACCAGGGAAAATGTGTAGAGGGCATGGTGGAGATCTTCGACATGCTGCTGGCTACATCATCTCGGTTCCGCATGATGAATCTGCAGGGAGAGGAGTTTGTGTGCCTCAAATCTATTATTTTGCTTAATTCTGGAGTGTACACATTTCTGTCCAGCACCCTGAAGTCTCTGGAAGAGAAGGACCATATCCACCGAGTCCTGGACAAGATCACAGACACTTTGATCCACCTGATGGCCAAGGCAGGCCTGACCCTGCAGCAGCAGCACCAGCGGCTGGCCCAGCTCCTCCTCATCCTCTCCCACATCAGGCACATGAGTAACAAAGGCATGGAGCATCTGTACAGCATGAAGTGCAAGAACGTGGTGCCCCTCTATGACCTGCTGCTGGAGATGCTGGACGCCCACCGCCTACATGCGCCCACTAGCCGTGGAGGGGCATCCGTGGAGGAGACGGACCAAAGCCACTTGGCCACTGCGGGCTCTACTTCATCGCATTCCTTGCAAAAGTATTACATCACGGGGGAGGCAGAGGGTTTCCCTGCCACGGTC 3
HaloTag_Estrogen Receptor alpha ATGGCAGAAATCGGTACTGGCTTTCCATTCGACCCCCATTATGTGGAAGTCCTGGGCGAGCGCATGCACTACGTCGATGTTGGTCCGCGCGATGGCACCCCTGTGCTGTTCCTGCACGGTAACCCGACCTCCTCCTACGTGTGGCGCAACATCATCCCGCATGTTGCACCGACCCATCGCTGCATTGCTCCAGACCTGATCGGTATGGGCAAATCCGACAAACCAGACCTGGGTTATTTCTTCGACGACCACGTCCGCTTCATGGATGCCTTCATCGAAGCCCTGGGTCTGGAAGAGGTCGTCCTGGTCATTCACGACTGGGGCTCCGCTCTGGGTTTCCACTGGGCCAAGCGCAATCCAGAGCGCGTCAAAGGTATTGCATTTATGGAGTTCATCCGCCCTATCCCGACCTGGGACGAATGGCCAGAATTTGCCCGCGAGACCTTCCAGGCCTTCCGCACCACCGACGTCGGCCGCAAGCTGATCATCGATCAGAACGTTTTTATCGAGGGTACGCTGCCGATGGGTGTCGTCCGCCCGCTGACTGAAGTCGAGATGGACCATTACCGCGAGCCGTTCCTGAATCCTGTTGACCGCGAGCCACTGTGGCGCTTCCCAAACGAGCTGCCAATCGCCGGTGAGCCAGCGAACATCGTCGCGCTGGTCGAAGAATACATGGACTGGCTGCACCAGTCCCCTGTCCCGAAGCTGCTGTTCTGGGGCACCCCAGGCGTTCTGATCCCACCGGCCGAAGCCGCTCGCCTGGCCAAAAGCCTGCCTAACTGCAAGGCTGTGGACATCGGCCCGGGTCTGAATCTGCTGCAAGAAGACAACCCGGACCTGATCGGCAGCGAGATCGCGCGCTGGCTGTCGACGCTCGAGATTTCCGGCGAGCCAACCACTGAGGATCTGTACTTTCAGAGCGATAACGCGATCGCCATGACCATGACCCTCCACACCAAAGCATCTGGGATGGCCCTACTGCATCAGATCCAAGGGAACGAGCTGGAGCCCCTGAACCGTCCGCAGCTCAAGATCCCCCTGGAGCGGCCCCTGGGCGAGGTGTACCTGGACAGCAGCAAGCCCGCCGTGTACAACTACCCCGAGGGCGCCGCCTACGAGTTCAACGCCGCGGCCGCCGCCAACGCGCAGGTCTACGGTCAGACCGGCCTCCCCTACGGCCCCGGGTCTGAGGCTGCGGCGTTCGGCTCCAACGGCCTGGGGGGTTTCCCCCCACTCAACAGCGTGTCTCCGAGCCCGCTGATGCTACTGCACCCGCCGCCGCAGCTGTCGCCTTTCCTGCAGCCCCACGGCCAGCAGGTGCCCTACTACCTGGAGAACGAGCCCAGCGGCTACACGGTGCGCGAGGCCGGCCCGCCGGCATTCTACAGGCCAAATTCAGATAATCGACGCCAGGGTGGCAGAGAAAGATTGGCCAGTACCAATGACAAGGGAAGTATGGCTATGGAATCTGCCAAGGAGACTCGCTACTGTGCAGTGTGCAATGACTATGCTTCAGGCTACCATTATGGAGTCTGGTCCTGTGAGGGCTGCAAGGCCTTCTTCAAGAGAAGTATTCAAGGACATAACGACTATATGTGTCCAGCCACCAACCAGTGCACCATTGATAAAAACAGGAGGAAGAGCTGCCAGGCCTGCCGGCTCCGTAAATGCTACGAAGTGGGAATGATGAAAGGTGGGATACGAAAAGACCGAAGAGGAGGGAGAATGTTGAAACACAAGCGCCAGAGAGATGATGGGGAGGGCAGGGGTGAAGTGGGGTCTGCTGGAGACATGAGAGCTGCCAACCTTTGGCCAAGCCCGCTCATGATCAAACGCTCTAAGAAGAACAGCCTGGCCTTGTCCCTGACGGCCGACCAGATGGTCAGTGCCTTGTTGGATGCTGAGCCCCCGATACTCTATTCCGAGTATGATCCTACCAGACCCTTCAGTGAAGCTTCGATGATGGGCTTACTGACCAACCTGGCAGACAGGGAGCTGGTTCACATGATCAACTGGGCGAAGAGGGTGCCAGGCTTTGTGGATTTGACCCTCCATGATCAGGTCCACCTTCTAGAATGTGCCTGGCTAGAGATCCTGATGATTGGTCTCGTCTGGCGCTCCATGGAGCACCCAGGGAAGCTACTGTTTGCTCCTAACTTGCTCTTGGACAGGAACCAGGGAAAATGTGTAGAGGGCATGGTGGAGATCTTCGACATGCTGCTGGCTACATCATCTCGGTTCCGCATGATGAATCTGCAGGGAGAGGAGTTTGTGTGCCTCAAATCTATTATTTTGCTTAATTCTGGAGTGTACACATTTCTGTCCAGCACCCTGAAGTCTCTGGAAGAGAAGGACCATATCCACCGAGTCCTGGACAAGATCACAGACACTTTGATCCACCTGATGGCCAAGGCAGGCCTGACCCTGCAGCAGCAGCACCAGCGGCTGGCCCAGCTCCTCCTCATCCTCTCCCACATCAGGCACATGAGTAACAAAGGCATGGAGCATCTGTACAGCATGAAGTGCAAGAACGTGGTGCCCCTCTATGACCTGCTGCTGGAGATGCTGGACGCCCACCGCCTACATGCGCCCACTAGCCGTGGAGGGGCATCCGTGGAGGAGACGGACCAAAGCCACTTGGCCACTGCGGGCTCTACTTCATCGCATTCCTTGCAAAAGTATTACATCACGGGGGAGGCAGAGGGTTTCCCTGCCACGGTC 4
도 1a 및 1b에는 각각 AR 융합 Nluc(NL-AR) 및 HT(AR-HT) 발현 벡터의 구조를 나타내었다. 또한, 도 1c 및 1d에는 각각 ER 융합 Nluc(NL-ER) 및 HT(HT-ER) 발현 벡터의 구조를 나타내었다.
세포에 생물 발광 단백질 및 형광 단백질이 융합된 AR을 도입하여 효과적으로 생물 발광 공명 에너지를 전달하기 위해 세포에 영구적 도입 전 다양한 조합 및 비율의 융합 AR 유전자를 일시적으로 세포에 도입(transient transfection)한 후 안드로겐에 대한 반응을 확인한 결과, 도 1e에 나타낸 바와 같이, 생물 발광 단백질 및 형광 단백질이 융합된 안드로겐 수용체의 NL-AR 및 AR-HT 조합이 1:10의 비율일 때 안드로겐에 대한 반응이 높은 것을 확인하였으며, 도 1f에 나타낸 바와 같이 NL-AR 및 AR-HT 조합을 1:7.5, 1:10의 비율로 도입하였을 때 반응성이 높은 것을 확인하였다.
안드로겐 수용체와 마찬가지로, 생물 발광 단백질 및 형광 단백질이 융합된 ER의 최적의 조합 및 비율을 확인한 결과, 도 1g에 나타낸 바와 같이, 생물 발광 단백질 및 형광 단백질이 융합된 에스트로겐 수용체의 NL-ER 및 HT-ER 조합이 1:1의 비율일 때 에스트로겐에 대한 반응이 높은 것을 확인 하였으며, 도 1h 에 나타낸 바와 같이 NL-ER 및 HT-ER 조합을 1:1의 비율로 도입하였을 때 반응성이 높은 것을 확인 하였다.
형질감염된 HEK293 세포는 형질감염 24시간 후 선별을 위해 100 mm 배양 접시로 옮겼다. 안정적으로 형질감염된 세포를 선별하기 위해 성장 배지를 100 μg/ml 하이그로마이신(hygromycin) B 및 400 μg/ml G418(Geneticin)이 함유된 선별 배지로 교체하였다. 배지 교체 10일 후, 안정적으로 형질감염된 HEK293 세포의 단일 콜로니를 클로닝 실린더(Corning, Cat. #. 3166-8)를 사용하여 분리하였으며, BRET 기반 결합 분석을 위해, 분리된 클론의 AR/ER 융합 단백질의 유전자 발현 수준을 실시간 PCR로 조사하여 안정적으로 형질감염된 HEK293 세포를 선택하였다. 이때, Nluc이 융합된 AR/ER 단백질을 실시간 PCR로 조사하기 위하여 5'-AGGTGTGTCCAGTTTGTTTC-3' (forward, 서열번호 5) 및 5'-ATGACATGGATGTCGATCTT-3' (reverse, 서열번호 6)의 프라이머를 이용했고, HT가 융합된 AR/ER단백질을 실시간 PCR로 조사하기 위하여 5'-GAAGTCGAGATGGACCATTA-3' (forward, 서열번호 7) 및 5'-CAGCCAGTCCATGTATTCTT-3' (reverse, 서열번호 8)의 프라이머를 이용하였다.
[실험예]
실험예 1. BRET 기반 에스트로겐 수용체 결합 반응 시험을 통한 내분비계 장애물질 검색
생물 발광 공명에너지 전달(BRET) 방법을 사람의 에스트로겐 수용체에 적용하여, 상기 실시예 1의 방법으로 생물 발광 단백질이 결합된 사람의 에스트로겐 수용체와 형광 단백질이 결합된 사람의 에스트로겐 수용체를 모두 생산할 수 있는 영구 안정화 인간 배아 신장 세포 HEK293을 구축하였다.
그런 다음, 상기 구축한 결합 반응 시험법을 위한 세포주를 배양하여 결합 반응 시험법에 이용할 만큼의 세포를 확보하고, 배양한 세포를 수거하여 96 웰 플레이트에 각 웰당 20,000 세포씩 분주하였다. 이후 세포를 96 웰 플레이트에 부착시키고 1시간 후에 HaloTag 단백질의 기질로 HaloTag 리간드를 처리하였다. HaloTag 단백질의 기질을 처리한 후 세포주에 시험 화학물질로 17β-에스트라디올(Estradiol), 비스페놀(Bisphenol) A, 프로게스테론(Progesterone), 메드록시프로게스테론 아세테이트(Medroxyprogesterone acetate), 2-sec-부틸페놀(Butylphenol), 17α-에티닐 에스트라디올(Ethinyl estradiol), 스피로놀락톤(Spironolactone), 17α-에스트라디올(Estradiol), 또는 비스페놀(Bisphenol) B를 10의 배율로 희석하여 처리하였으며, 시험물질을 24시간 동안 세포에 노출시킨 이후에 생물 발광 단백질의 기질로 furimazine을 처리하였다. 생물 발광 단백질의 기질 처리 5분 후에 생물 발광 단백질이 발광하는 파장의 세기와 형광 단백질이 발광하는 파장의 세기를 분광광도계를 이용하여 측정하였다. 도출된 결과를 분석하고 에스트로겐의 결합 반응 결과와 비교하여 각 시험 화학물질의 에스트로겐성 내분비계 장애 활성 정보를 획득하였다.
도 2에는 각 시험물질의 에스트로겐성 내분비 장애 활성을 나타내었으며, 각 그래프의 x축은 시험물질의 농도(-Log[M])를, y축은 기준 물질인 17β-에스트라디올(Estradiol, -9 농도)과 대비하여 각 시험 화학물질에 대한 반응을 나타낸 것이다. 또한 #1~3은 반복실험을 의미한다. 생물 발광 단백질 및 형광 단백질이 발광함에 따라 그 세기를 시험 화학물질의 내분비계 장애활성으로 산출하는 과정은 다음의 산출식을 거친다.
raw BRET unit = 억셉터(HT)의 RLU(relative light unit)값/도너(Nluc)의 RLU값
corrected BRET unit = 평균 raw BRET 유닛(HT 리간드 존재 시) - 평균 raw BRET 유닛(HT 리간드 부재 시)
상대적 BRET 유닛(Relative BRET unit)(RBU, %) = (시험물질의 평균 corrected BRET 유닛/양성대조군(PC)의 평균 corrected BRET 유닛) X 100
상기 방법을 통해, 여러 가지 시험물질의 에스트로겐성 내분비 장애 활성을 확인할 수 있었다.
실험예 2. BRET 기반 안드로겐 수용체 결합 반응 시험을 통한 내분비계 장애물질 검색
생물 발광 공명에너지 전달(BRET) 방법을 사람의 안드로겐 수용체에 적용하여, 상기 실시예 1의 방법으로 생물 발광 단백질이 결합된 사람의 안드로겐 수용체와 형광 단백질이 결합된 사람의 안드로겐 수용체를 모두 생산할 수 있는 영구 안정화 인간 배아 신장 세포 HEK293을 구축하였다.
이후 과정은 상기 실험예 1에 기재된 방법과 동일하게 수행하였으며, 이때 시험 화학물질로는 17β-에스트라디올(Estradiol), 5α-디하이드로테스토스테론(Dihydrotestosterone), 비스페놀(Bisphenol) A, 코티코스테론(Corticosterone), 4-안드로스테네디온(Androstenedione), 빈클로졸린(Vinclozolin), 스피로놀락톤(Spironolactone), 아트라진(Atrazine), 또는 17α-에스트라디올(Estradiol)을 10의 배율로 희석하여 사용하였다. 도출된 결과를 분석하고 안드로겐의 결합 반응 결과와 비교하여 시험 화학물질의 안드로겐성 내분비계 장애 활성 정보를 획득했다.
도 3에는 각 시험물질의 안드로겐성 내분비 장애 활성을 나타내었으며, 각 x축은 시험물질의 농도(-Log[M])를, y축은 기준 물질인 5α-디하이드로테스토스테론 (Dihydrotestosterone, -9 농도)과 대비하여 각 시험 화학물질에 대한 반응을 나타낸 것이다. 또한 #1~3은 반복실험을 의미한다. 생물 발광 단백질 및 형광 단백질이 발광함에 따라 그 세기를 시험 화학물질의 내분비계 장애활성으로 산출하는 과정은 상기 실험예 1에서의 산출식과 동일한 산출식을 거친다.
상기 방법을 통해, 여러 가지 시험물질의 안드로겐성 내분비 장애 활성을 확인할 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.
<110> Dongguk University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Method for screening endocrine disrupting chemicals using bioluminescence resonance energy transfer <130> MP20-176 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 3294 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NanoLuc luciferase_Androgen Receptor <400> 1 atggtcttca cactcgaaga tttcgttggg gactggcgac agacagccgg ctacaacctg 60 gaccaagtcc ttgaacaggg aggtgtgtcc agtttgtttc agaatctcgg ggtgtccgta 120 actccgatcc aaaggattgt cctgagcggt gaaaatgggc tgaagatcga catccatgtc 180 atcatcccgt atgaaggtct gagcggcgac caaatgggcc agatcgaaaa aatttttaag 240 gtggtgtacc ctgtggatga tcatcacttt aaggtgatcc tgcactatgg cacactggta 300 atcgacgggg ttacgccgaa catgatcgac tatttcggac ggccgtatga aggcatcgcc 360 gtgttcgacg gcaaaaagat cactgtaaca gggaccctgt ggaacggcaa caaaattatc 420 gacgagcgcc tgatcaaccc cgacggctcc ctgctgttcc gagtaaccat caacggagtg 480 accggctggc ggctgtgcga acgcattctg gcgggctcga gcggcgcgat cgccatggaa 540 gtgcagttag ggctgggaag ggtctaccct cggccgccgt ccaagaccta ccgaggagct 600 ttccagaatc tgttccagag cgtgcgcgaa gtgatccaga acccgggccc caggcaccca 660 gaggccgcga gcgcagcacc tcccggcgcc agtttgctgc tgctgcagca gcagcagcag 720 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcaagagact 780 agccccaggc agcagcagca gcagcagggt gaggatggtt ctccccaagc ccatcgtaga 840 ggccccacag gctacctggt cctggatgag gaacagcaac cttcacagcc gcagtcggcc 900 ctggagtgcc accccgagag aggttgcgtc ccagagcctg gagccgccgt ggccgccagc 960 aaggggctgc cgcagcagct gccagcacct ccggacgagg atgactcagc tgccccatcc 1020 acgttgtccc tgctgggccc cactttcccc ggcttaagca gctgctccgc tgaccttaaa 1080 gacatcctga gcgaggccag caccatgcaa ctccttcagc aacagcagca ggaagcagta 1140 tccgaaggca gcagcagcgg gagagcgagg gaggcctcgg gggctcccac ttcctccaag 1200 gacaattact tagggggcac ttcgaccatt tctgacaacg ccaaggagtt gtgtaaggca 1260 gtgtcggtgt ccatgggcct gggtgtggag gcgttggagc atctgagtcc aggggaacag 1320 cttcgggggg attgcatgta cgccccactt ttgggagttc cacccgctgt gcgtcccact 1380 ccttgtgccc cattggccga atgcaaaggt tctctgctag acgacagcgc aggcaagagc 1440 actgaagata ctgctgagta ttcccctttc aagggaggtt acaccaaagg gctagaaggc 1500 gagagcctag gctgctctgg cagcgctgca gcagggagct ccgggacact tgaactgccg 1560 tctaccctgt ctctctacaa gtccggagca ctggacgagg cagctgcgta ccagagtcgc 1620 gactactaca actttccact ggctctggcc ggaccgccgc cccctccgcc gcctccccat 1680 ccccacgctc gcatcaagct ggagaacccg ctggactacg gcagcgcctg ggcggctgcg 1740 gcggcgcagt gccgctatgg ggacctggcg agcctgcatg gcgcgggtgc agcgggaccc 1800 ggttctgggt caccctcagc cgccgcttcc tcatcctggc acactctctt cacagccgaa 1860 gaaggccagt tgtatggacc gtgtggtggt ggtgggggtg gtggcggcgg cggcggcggc 1920 ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcgaggcgg gagctgtagc cccctacggc 1980 tacactcggc cccctcaggg gctggcgggc caggaaagcg acttcaccgc acctgatgtg 2040 tggtaccctg gcggcatggt gagcagagtg ccctatccca gtcccacttg tgtcaaaagc 2100 gaaatgggcc cctggatgga tagctactcc ggaccttacg gggacatgcg tttggagact 2160 gccagggacc atgttttgcc cattgactat tactttccac cccagaagac ctgcctgatc 2220 tgtggagatg aagcttctgg gtgtcactat ggagctctca catgtggaag ctgcaaggtc 2280 ttcttcaaaa gagccgctga agggaaacag aagtacctgt gcgccagcag aaatgattgc 2340 actattgata aattccgaag gaaaaattgt ccatcttgtc gtcttcggaa atgttatgaa 2400 gcagggatga ctctgggagc ccggaagctg aagaaacttg gtaatctgaa actacaggag 2460 gaaggagagg cttccagcac caccagcccc actgaggaga caacccagaa gctgacagtg 2520 tcacacattg aaggctatga atgtcagccc atctttctga atgtcctgga agccattgag 2580 ccaggtgtag tgtgtgctgg acacgacaac aaccagcccg actcctttgc agccttgctc 2640 tctagcctca atgaactggg agagagacag cttgtacacg tggtcaagtg ggccaaggcc 2700 ttgcctggct tccgcaactt acacgtggac gaccagatgg ctgtcattca gtactcctgg 2760 atggggctca tggtgtttgc catgggctgg cgatccttca ccaatgtcaa ctccaggatg 2820 ctctacttcg cccctgatct ggttttcaat gagtaccgca tgcacaagtc ccggatgtac 2880 agccagtgtg tccgaatgag gcacctctct caagagtttg gatggctcca aatcaccccc 2940 caggaattcc tgtgcatgaa agcactgcta ctcttcagca ttattccagt ggatgggctg 3000 aaaaatcaaa aattctttga tgaacttcga atgaactaca tcaaggaact cgatcgtatc 3060 attgcatgca aaagaaaaaa tcccacatcc tgctcaagac gcttctacca 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ttcagcaaca gcagcaggaa 600 gcagtatccg aaggcagcag cagcgggaga gcgagggagg cctcgggggc tcccacttcc 660 tccaaggaca attacttagg gggcacttcg accatttctg acaacgccaa ggagttgtgt 720 aaggcagtgt cggtgtccat gggcctgggt gtggaggcgt tggagcatct gagtccaggg 780 gaacagcttc ggggggattg catgtacgcc ccacttttgg gagttccacc cgctgtgcgt 840 cccactcctt gtgccccatt ggccgaatgc aaaggttctc tgctagacga cagcgcaggc 900 aagagcactg aagatactgc tgagtattcc cctttcaagg gaggttacac caaagggcta 960 gaaggcgaga gcctaggctg ctctggcagc gctgcagcag ggagctccgg gacacttgaa 1020 ctgccgtcta ccctgtctct ctacaagtcc ggagcactgg acgaggcagc tgcgtaccag 1080 agtcgcgact actacaactt tccactggct ctggccggac cgccgccccc tccgccgcct 1140 ccccatcccc acgctcgcat caagctggag aacccgctgg actacggcag cgcctgggcg 1200 gctgcggcgg cgcagtgccg ctatggggac ctggcgagcc tgcatggcgc gggtgcagcg 1260 ggacccggtt ctgggtcacc ctcagccgcc gcttcctcat cctggcacac tctcttcaca 1320 gccgaagaag gccagttgta tggaccgtgt ggtggtggtg ggggtggtgg cggcggcggc 1380 ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg aggcgggagc tgtagccccc 1440 tacggctaca ctcggccccc tcaggggctg gcgggccagg aaagcgactt caccgcacct 1500 gatgtgtggt accctggcgg catggtgagc agagtgccct atcccagtcc cacttgtgtc 1560 aaaagcgaaa tgggcccctg gatggatagc tactccggac cttacgggga catgcgtttg 1620 gagactgcca gggaccatgt tttgcccatt gactattact ttccacccca gaagacctgc 1680 ctgatctgtg gagatgaagc ttctgggtgt cactatggag ctctcacatg tggaagctgc 1740 aaggtcttct tcaaaagagc cgctgaaggg aaacagaagt acctgtgcgc cagcagaaat 1800 gattgcacta ttgataaatt ccgaaggaaa aattgtccat cttgtcgtct tcggaaatgt 1860 tatgaagcag ggatgactct gggagcccgg aagctgaaga aacttggtaa tctgaaacta 1920 caggaggaag gagaggcttc cagcaccacc agccccactg aggagacaac ccagaagctg 1980 acagtgtcac acattgaagg ctatgaatgt cagcccatct ttctgaatgt cctggaagcc 2040 attgagccag gtgtagtgtg tgctggacac gacaacaacc agcccgactc ctttgcagcc 2100 ttgctctcta gcctcaatga actgggagag agacagcttg tacacgtggt caagtgggcc 2160 aaggccttgc ctggcttccg caacttacac gtggacgacc agatggctgt cattcagtac 2220 tcctggatgg ggctcatggt gtttgccatg ggctggcgat ccttcaccaa tgtcaactcc 2280 aggatgctct acttcgcccc tgatctggtt ttcaatgagt accgcatgca caagtcccgg 2340 atgtacagcc agtgtgtccg aatgaggcac ctctctcaag agtttggatg gctccaaatc 2400 accccccagg aattcctgtg catgaaagca ctgctactct tcagcattat tccagtggat 2460 gggctgaaaa atcaaaaatt ctttgatgaa cttcgaatga actacatcaa ggaactcgat 2520 cgtatcattg catgcaaaag aaaaaatccc acatcctgct caagacgctt ctaccagctc 2580 accaagctcc tggactccgt gcagcctatt gcgagagagc tgcatcagtt cacttttgac 2640 ctgctaatca agtcacacat ggtgagcgtg gactttccgg aaatgatggc agagatcatc 2700 tctgtgcaag tgcccaagat cctttctggg aaagtcaagc ccatctattt ccacacccag 2760 gtttctctcg agccaaccac tgaggatctg tactttcaga gcgataacga tggatccgaa 2820 atcggtactg gctttccatt cgacccccat tatgtggaag tcctgggcga gcgcatgcac 2880 tacgtcgatg ttggtccgcg cgatggcacc cctgtgctgt tcctgcacgg taacccgacc 2940 tcctcctacg tgtggcgcaa catcatcccg catgttgcac cgacccatcg ctgcattgct 3000 ccagacctga tcggtatggg caaatccgac aaaccagacc tgggttattt cttcgacgac 3060 cacgtccgct tcatggatgc cttcatcgaa gccctgggtc tggaagaggt cgtcctggtc 3120 attcacgact ggggctccgc tctgggtttc cactgggcca agcgcaatcc agagcgcgtc 3180 aaaggtattg catttatgga gttcatccgc cctatcccga cctgggacga atggccagaa 3240 tttgcccgcg agaccttcca ggccttccgc accaccgacg tcggccgcaa gctgatcatc 3300 gatcagaacg tttttatcga gggtacgctg ccgatgggtg tcgtccgccc gctgactgaa 3360 gtcgagatgg accattaccg cgagccgttc ctgaatcctg ttgaccgcga gccactgtgg 3420 cgcttcccaa acgagctgcc aatcgccggt gagccagcga acatcgtcgc gctggtcgaa 3480 gaatacatgg actggctgca ccagtcccct gtcccgaagc tgctgttctg gggcacccca 3540 ggcgttctga tcccaccggc cgaagccgct cgcctggcca aaagcctgcc taactgcaag 3600 gctgtggaca tcggcccggg tctgaatctg ctgcaagaag acaacccgga cctgatcggc 3660 agcgagatcg cgcgctggct gtctactctg gagatttccg gt 3702 <210> 3 <211> 2319 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NanoLuc luciferase_Estrogen Receptor alpha <400> 3 atggtcttca cactcgaaga tttcgttggg gactggcgac agacagccgg ctacaacctg 60 gaccaagtcc ttgaacaggg aggtgtgtcc agtttgtttc agaatctcgg ggtgtccgta 120 actccgatcc aaaggattgt cctgagcggt gaaaatgggc tgaagatcga catccatgtc 180 atcatcccgt atgaaggtct gagcggcgac caaatgggcc agatcgaaaa aatttttaag 240 gtggtgtacc ctgtggatga tcatcacttt aaggtgatcc tgcactatgg cacactggta 300 atcgacgggg ttacgccgaa catgatcgac tatttcggac ggccgtatga aggcatcgcc 360 gtgttcgacg gcaaaaagat cactgtaaca gggaccctgt ggaacggcaa caaaattatc 420 gacgagcgcc tgatcaaccc cgacggctcc ctgctgttcc gagtaaccat caacggagtg 480 accggctggc ggctgtgcga acgcattctg gcgggctcga gcggcgcgat cgccatgacc 540 atgaccctcc acaccaaagc atctgggatg gccctactgc atcagatcca agggaacgag 600 ctggagcccc tgaaccgtcc gcagctcaag atccccctgg agcggcccct gggcgaggtg 660 tacctggaca gcagcaagcc cgccgtgtac aactaccccg agggcgccgc ctacgagttc 720 aacgccgcgg ccgccgccaa cgcgcaggtc tacggtcaga ccggcctccc ctacggcccc 780 gggtctgagg ctgcggcgtt cggctccaac ggcctggggg gtttcccccc actcaacagc 840 gtgtctccga gcccgctgat gctactgcac ccgccgccgc agctgtcgcc tttcctgcag 900 ccccacggcc agcaggtgcc ctactacctg gagaacgagc ccagcggcta cacggtgcgc 960 gaggccggcc cgccggcatt ctacaggcca aattcagata atcgacgcca gggtggcaga 1020 gaaagattgg ccagtaccaa tgacaaggga agtatggcta tggaatctgc caaggagact 1080 cgctactgtg cagtgtgcaa tgactatgct tcaggctacc attatggagt ctggtcctgt 1140 gagggctgca aggccttctt caagagaagt attcaaggac ataacgacta tatgtgtcca 1200 gccaccaacc agtgcaccat tgataaaaac aggaggaaga gctgccaggc ctgccggctc 1260 cgtaaatgct acgaagtggg aatgatgaaa ggtgggatac gaaaagaccg aagaggaggg 1320 agaatgttga aacacaagcg ccagagagat gatggggagg gcaggggtga agtggggtct 1380 gctggagaca tgagagctgc caacctttgg ccaagcccgc tcatgatcaa acgctctaag 1440 aagaacagcc tggccttgtc cctgacggcc gaccagatgg tcagtgcctt gttggatgct 1500 gagcccccga tactctattc cgagtatgat cctaccagac ccttcagtga agcttcgatg 1560 atgggcttac tgaccaacct ggcagacagg gagctggttc acatgatcaa ctgggcgaag 1620 agggtgccag gctttgtgga tttgaccctc catgatcagg tccaccttct agaatgtgcc 1680 tggctagaga tcctgatgat tggtctcgtc tggcgctcca tggagcaccc agggaagcta 1740 ctgtttgctc ctaacttgct cttggacagg aaccagggaa aatgtgtaga gggcatggtg 1800 gagatcttcg acatgctgct ggctacatca tctcggttcc gcatgatgaa tctgcaggga 1860 gaggagtttg tgtgcctcaa atctattatt ttgcttaatt ctggagtgta cacatttctg 1920 tccagcaccc tgaagtctct ggaagagaag gaccatatcc accgagtcct ggacaagatc 1980 acagacactt tgatccacct gatggccaag gcaggcctga ccctgcagca gcagcaccag 2040 cggctggccc agctcctcct catcctctcc cacatcaggc acatgagtaa caaaggcatg 2100 gagcatctgt acagcatgaa gtgcaagaac gtggtgcccc tctatgacct gctgctggag 2160 atgctggacg cccaccgcct acatgcgccc actagccgtg gaggggcatc cgtggaggag 2220 acggaccaaa gccacttggc cactgcgggc tctacttcat cgcattcctt gcaaaagtat 2280 tacatcacgg gggaggcaga gggtttccct gccacggtc 2319 <210> 4 <211> 2724 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HaloTag_Estrogen Receptor alpha <400> 4 atggcagaaa tcggtactgg ctttccattc gacccccatt atgtggaagt cctgggcgag 60 cgcatgcact acgtcgatgt tggtccgcgc gatggcaccc ctgtgctgtt cctgcacggt 120 aacccgacct cctcctacgt gtggcgcaac atcatcccgc atgttgcacc gacccatcgc 180 tgcattgctc cagacctgat cggtatgggc aaatccgaca aaccagacct gggttatttc 240 ttcgacgacc acgtccgctt catggatgcc 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aggtgtgtcc agtttgtttc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nluc primer R <400> 6 atgacatgga tgtcgatctt 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HT primer F <400> 7 gaagtcgaga tggaccatta 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HT primer R <400> 8 cagccagtcc atgtattctt 20

Claims (10)

  1. 하기 단계를 포함하는, 생물 발광 공명 에너지 전달을 이용한 내분비계 장애물질 검색 방법:
    (a) 에스트로겐 수용체 또는 안드로겐 수용체와 생물 발광 단백질 또는 형광 단백질이 융합된 융합 단백질을 발현하도록 설계된 재조합 벡터로 세포주를 형질감염 시키는 단계로서,
    상기 재조합 벡터는 융합 단백질이 생물 발광 단백질-안드로겐 수용체의 순서 및 안드로겐 수용체-형광 단백질의 순서로 각각 발현되도록 DNA 서열을 포함하는 재조합 벡터, 또는 융합 단백질이 생물 발광 단백질-에스트로겐 수용체의 순서 및 형광 단백질-에스트로겐 수용체의 순서로 각각 발현되도록 DNA 서열을 포함하는 재조합 벡터인 것을 특징으로 하는, 단계;
    (b) 상기 형질감염된 세포주를 실험 용기에 부착시킨 후 형광 단백질을 활성화 시키는 단계;
    (c) 상기 형광 단백질이 활성화된 세포주에 시험물질을 처리하는 단계;
    (d) 상기 시험물질을 처리한 세포주에 생물 발광 단백질의 기질을 처리하는 단계;
    (e) 상기 생물 발광 단백질의 기질을 처리한 세포주로부터 생물 발광 단백질이 발광하는 파장의 세기 및 형광 단백질이 발광하는 파장의 세기를 측정하는 단계; 및
    (f) 상기 생물 발광 단백질이 발광하는 파장의 세기 및 형광 단백질이 발광하는 파장의 세기를 이용하여 시험물질의 내분비계 장애 활성을 산출하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 세포주는 인간 배아 신장 세포주인 것을 특징으로 하는, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 형질감염된 세포주는 영구적으로 사용 가능한 것을 특징으로 하는, 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 내분비계 장애물질은 17β-에스트라디올(Estradiol), 비스페놀(Bisphenol) A, 프로게스테론(Progesterone), 메드록시프로게스테론 아세테이트(Medroxyprogesterone acetate), 2-sec-부틸페놀(Butylphenol), 17α-에티닐 에스트라디올(Ethinyl estradiol), 스피로놀락톤(Spironolactone), 17α-에스트라디올(Estradiol), 비스페놀(Bisphenol) B, 5α-디하이드로테스토스테론(Dihydrotestosterone), 코티코스테론(Corticosterone), 4-안드로스테네디온(Androstenedione), 빈클로졸린(Vinclozolin), 및 아트라진(Atrazine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 생물 발광 단백질은 루시퍼라아제(luciferase)인 것을 특징으로 하는, 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 형광 단백질은 HaloTag 단백질 및 그 기질의 복합체인 것을 특징으로 하는, 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 방법은 단백질-단백질 상호작용을 기반으로 한 결합 반응을 측정하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  8. 하기 단계를 포함하는, 생물 발광 공명 에너지 전달을 이용한 내분비계 장애물질 검색을 위한 세포주의 제조 방법:
    (a) 세포주를 배지에서 12 내지 36시간 동안 배양하는 단계;
    (b) 에스트로겐 수용체 또는 안드로겐 수용체와 생물 발광 단백질이 융합된 융합 단백질, 및 에스트로겐 수용체 또는 안드로겐 수용체와 형광 단백질이 융합된 융합 단백질을 발현하도록 각각 재조합 벡터를 제작하여 상기 배양한 세포주에 12 내지 36시간 동안 공동 형질감염 시키는 단계로서,
    상기 재조합 벡터는 융합 단백질이 생물 발광 단백질-안드로겐 수용체의 순서 및 안드로겐 수용체-형광 단백질의 순서로 각각 발현되도록 DNA 서열을 포함하는 재조합 벡터, 또는 융합 단백질이 생물 발광 단백질-에스트로겐 수용체의 순서 및 형광 단백질-에스트로겐 수용체의 순서로 각각 발현되도록 DNA 서열을 포함하는 재조합 벡터인 것을 특징으로 하는, 단계; 및
    (c) 상기 형질감염 시킨 세포주의 배지를 선별 배지로 교체하고 안정적으로 형질감염된 세포주를 분리하는 단계.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 세포주는 인간 배아 신장 세포주인 것을 특징으로 하는, 방법.
  10. 제8항의 방법으로 제조된, 생물 발광 공명 에너지 전달을 이용한 내분비계 장애물질 검색을 위한 세포주로서,
    상기 세포주는 영구적으로 사용 가능한 것을 특징으로 하고,
    상기 세포주는 융합 단백질이 생물 발광 단백질-안드로겐 수용체의 순서 및 안드로겐 수용체-형광 단백질의 순서로 각각 발현되도록 DNA 서열을 포함하는 재조합 벡터, 또는 융합 단백질이 생물 발광 단백질-에스트로겐 수용체의 순서 및 형광 단백질-에스트로겐 수용체의 순서로 각각 발현되도록 DNA 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질감염된 것을 특징으로 하는, 세포주.
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