KR102664454B1 - 젬시타빈에 대한 민감성 향상을 위한 신규 표적 및 이의 활용 - Google Patents

젬시타빈에 대한 민감성 향상을 위한 신규 표적 및 이의 활용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 젬시타빈에 대한 민감성을 향상시키기 위한 신규 표적과 이의 용도에 관한 것으로서, CITED4 단백질의 억제제를 통해 젬시타빈에 대한 민감성을 향상시키거나 젬시타빈에 대한 내성을 억제할 수 있을 뿐만 아니라, CITED4 단백질을 표적으로 하여 그의 발현 또는 활성 정도를 측정함으로써 젬시타빈에 대한 내성을 진단하거나 젬시타빈에 대한 내성 억제제를 스크리닝해 낼 수 있는 장점이 있다.

Description

젬시타빈에 대한 민감성 향상을 위한 신규 표적 및 이의 활용{A Novel Target for improving sensitivity against gemcitabine, and the application thereof}
본 발명은 젬시타빈에 대한 민감성을 향상시키기 위한 신규 표적과 이의 용도에 관한 것이다.
젬시타빈은 디옥시사이티딘 유사체(deoxycytidine analogue)로서 진행성 췌장암의 치료를 위해 미국의 식약청 (Food and Drug Administration: FDA) 승인을 받은 항암제이며 폐암, 난소암, 유방암, 방광암의 치료에 사용되는 중요한 항암제이다. 특히 여러 종류의 암의 치료에 이용되고 있는 매우 효과적인 항암제 중 하나인 시스플라틴의 작용을 증가시키는 효과도 있어 젬시타빈과 시스플라틴의 병합 요법이 여러 장기의 암에서 적용되고 있다.
그러나 암 세포의 항암제에 대한 저항성이 발현되는 경우, 그에 따른 치료 효과가 제한적이게 되는바, 젬시타빈의 경우에도 이에 대한 저항성은 췌장암을 비롯한 여러 종류의 암을 치료하는데 있어 매우 중요한 문제이다. 기존의 여러 암 세포주를 통해서 연구된 젬시타빈에 대한 저항성 기전은 다양한 것으로 보고되어 있고, 그에 따라 젬시타빈에 대한 저항성을 유도하는 단백질 및 유전자를 이용하여 젬시타빈에 대하여 저항성을 나타내는 암을 치료하려는 연구가 다양하게 진행되고 있다.
그럼에도 불구하고, 현재까지 젬시타빈에 저항성을 보이는 암 세포에서 어떠한 유전자 또는 단백질이 젬시타빈 내성을 유도하는 지에 대한 연구 및 젬시타빈에 내성을 갖는 암을 효과적으로 치료하는 방법에 대해서는 연구가 미흡한지라, 이에 대한 연구·개발은 여전히 필요한 실정이다.
본 발명의 일 목적은 암 환자의 젬시타빈에 대한 민감도 향상을 위한 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 젬시타빈을 이용한 암 환자의 암 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 환자의 젬시타빈에 대한 내성을 진단하는데 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 젬시타빈에 대한 내성 억제제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 CITED4 단백질의 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 환자의 젬시타빈에 대한 민감도 향상용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 암 환자는 젬시타빈에 대한 내성을 나타내는 환자일 수 있고, 상기 CITED4 단백질의 억제제는 상기 암 환자의 젬시타빈에 대한 내성을 억제하는 것일 수 있다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 다른 측면은 젬시타빈; 및 CITED4 단백질의 억제제;를 유효성분으로 포함하는 암 환자의 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 암 환자는 젬시타빈에 대한 내성을 나타내는 환자일 수 있고, 상기 CITED4 단백질의 억제제는 상기 암 환자의 젬시타빈에 대한 내성을 억제하는 것일 수 있다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 측면은 암 환자에 분리된 세포에서 CITED4 단백질의 발현 또는 활성의 정도를 측정하는 단계; 및 상기 측정된 CITED4 단백질의 발현 또는 활성의 정도가 정상 세포에 비해 높은 경우, 젬시타빈에 대한 내성을 갖는 것으로 판단하는 단계;를 포함하는, 암 환자의 젬시타빈에 대한 내성을 진단하는데 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 측면은 젬시타빈 내성 암 세포주에 후보 물질을 처리하는 단계; 상기 후보 물질이 처리된 암 세포주에서 CITED4 단백질의 발현 또는 활성의 정도를 측정하는 단계; 및 상기 측정된 CITED4 단백질의 발현 또는 활성의 정도가 상기 후보 물질의 처리 전에 비해 감소된 경우, 상기 후보 물질을 젬시타빈 내성 억제제로 선별하는 단계;를 포함하는 젬시타빈에 대한 내성 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에서는 CITED4 단백질이 과발현 또는 과활성화 되는 경우에 암 세포에서 젬시타빈에 대한 민감성이 저하되고 젬시타빈에 대한 저항성이 증가되는 한편, 이러한 CITED4 단백질의 발현이나 활성을 억제함으로써 암 세포의 젬시타빈에 대한 민간성을 회복하고 젬시타빈에 대한 저항성을 억제할 수 있음이 확인되었는바, 이로부터 암 세포에서 CITED4 단백질의 과발현 여부를 통해 젬시타빈에 대한 저항성(또는 내성)을 판단할 수 있음은 물론, CITED4 단백질의 발현이나 활성을 억제함으로써 젬시타빈의 치료 효과를 더욱 향상시키는 치료 전략이나, 젬시타빈에 대한 내성 억제제를 스크리닝해 낼 수 있게 된 장점이 있다.
다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 젬시타빈 저항성 췌장암 세포주의 확립 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 확립된 젬시타빈 저항성 췌장암 세포주에 대하여 인 비트로에서 젬시타빈에 대한 저항성과 세포자연사를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 확립된 젬시타빈 저항성 췌장암 세포주에서 CITED4 단백질의 발현 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 확립된 젬시타빈 저항성 췌장암 세포주에서 CITED4 단백질의 발현을 일시적으로 감소시킨 경우에, 젬시타빈에 대한 저항성의 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5 내지 도 7은 환자 유래 췌장암 세포주에서 CITED4 단백질의 발현 정도와 CITED4 단백질의 발현을 억제시킨 경우에 젬시타빈에 대한 저항성의 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
먼저, 본 발명의 명세서에서 이용된 용어를 설명한다.
본 발명에서 일컫는 '젬시타빈'은 4-아미노-1-[(2R,4R,5R)-3,3-디플루오로-4-히드록시-5-(히드록시메틸)옥솔란-2-일]피리미딘-2-온(4-amino-1-[(2R,4R,5R)-3,3-difluoro-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]pyrimidin-2-one)의 IUPAC 명을 갖는 하기 화학식 1의 화학 구조를 갖는 뉴클레오사이드 유사체 및 이의 약제학적으로 허용가능한 이의 염을 일컫는다.
[화학식 1]
본 발명에서 일컫는 암 환자의 젬시타빈에 대한 '내성' 또는 '저항성'은 젬시타빈에 대해 반응을 나타내지 않는 것, 즉 목적하는 효과를 보이지 않는 것으로 말하는 것으로서, 젬시타빈의 처리 또는 투여에도 불구하고 암의 증세가 치료, 호전, 완화 또는 경감되지 않는 현상을 의미한다. 상기 젬시타빈에 대한 '내성' 또는 '저항성'은 젬시타빈의 처리 또는 투여 전부터 존재하던 것이거나, 또는 최초에는 내성 또는 저항성을 나타내지 않다가 장기간에 걸친 젬시타빈의 처리 또는 투여로 인해 더 이상 동일한 수준의 젬시타빈의 처리 또는 투여만으로는 상기와 같은 암의 증세가 치료, 호전, 완화 또는 경감되지 않게 된 것일 수 있다. 항암제 치료에 있어서 일반적인 치료 효과 판정은 고형 종양 그룹의 반응 평가 기준(RECIST　v1.1: New response evaluation criteria in solid tumours: Revised　RECIST　guideline (version 1.1))에 기초하여 결정할 수 있다 (EUROPEAN JOURNAL OF CANCER 45, (2009) 228-247). 상기 기준에 따라 암 치료의 효과는 종양의 크기 변화 등으로부터 완전 반응(Complete Response: CR), 부분 반응(Partial Response: PR), 진행(Progressive Disease: PD) 또는 안정(Stable Disease: SD) 그룹으로 분류할 수 있다. 예를 들어, RECIST v1.1에 따라 대상 병변(TL: target lesion)으로 결정된 경우, 상기 완전 반응 그룹(CR)은 모든 대상 병변이 소멸되고, 모든 대상 및 비-대상 병변에서 병리학적 림프절이 감소된(short axis <10 mm) 그룹을 의미할 수 있다. 상기 부분 반응 그룹(PR)은 베이스라인의 총 직경을 기준으로 하여 대상 병변의 직경의 합이 적어도 30% 감소된 그룹을 의미할 수 있다. 상기 진행 그룹(PD)은 연구에 따른 가장 작은 합계를 기준으로 하여 대상 병변의 직경의 합이 적어도 20% 증가되고, 이와 같은 직경의 합이 상대적으로 20% 증가할 뿐만 아니라, 절대적으로 적어도 5 mm가 증가된 그룹을 의미할 수 있다. 상기 안정 그룹(SD)은 연구에 따른 가장 작은 직경을 기준으로, 부분 반응 그룹으로 분류될 만큼 충분히 감소되지 않고, 진행 그룹으로 분류될 만큼 충분히 증가하지 않은 그룹을 의미할 수 있다.
본 발명에서 일컫는 암 환자의 젬시타빈에 대한 '민감도'는 젬시타빈을 이용한 암의 치료에 있어서 젬시타빈의 처리 또는 투여에 의해 암의 증세가 치료, 호전, 완화 또는 경감되는 정도, 즉 젬시타빈이 유효한 항암 활성을 나타내는 정도를 의미한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
1. 젬시타빈에 대한 민감도 향상을 위한 약학적 조성물
본 발명의 일 측면은 암 환자에게서 젬시타빈에 대한 민감도를 향상시키기 위한 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 젬시타빈에 대한 민감도 향상용 약학적 조성물은 CITED4 단백질의 억제제를 유효성분으로 포함한다.
상기 CITED4 단백질은 'Cbp/p300-interacting transactivator 4'라고 불리는 전사 보조-활성자(transcriptional co-activator)로서, 184개의 아미노산으로 이루어진 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는, 분자량 18,569Da의 단백질이다. 상기 CITED4 단백질의 아미노산 서열 또는 이를 코딩하는 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열은 NCBI의 GeneBank 등 공지의 데이터베이스(예를 들어, GenBank No. NM_133467.3, NP_597724.1 등)에서 얻을 수 있다. 그러나, 상기 공지된 서열뿐만 아니라, 상기 CITED4의 공지된 아미노산 서열의 일부 아미노산이 부가, 치환, 결실 등의 방법으로 변이된 변이체도 본 발명의 CITED4 단백질의 범주에 포함될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기와 같은 CITED4 단백질이 과발현되거나 과활성화된 경우에 암 세포에서 젬시타빈에 대한 민감도가 저하되는 반면, 상기와 같은 CITED4 단백질의 발현이나 활성을 억제함으로써 암 세포에서 젬시타빈에 대한 민감도가 회복됨을 확인하였고, 이로부터 암 세포에서 젬시타빈에 대한 민감도를 향상시키기 위한 수단으로 CITED4 단백질의 억제제가 이용될 수 있음을 확인하였다.
상기 CITED4 단백질의 억제제는 암 세포 내에서 CITED4 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 제제를 의미하는 것으로, 예컨대 CITED4 단백질의 발현을 전사 수준에서 감소시키는 CITED4 단백질의 발현 억제제, 또는 발현된 CITED4 단백질의 분해를 증가시키거나 그 활성을 방해하는 CITED4 단백질의 활성 억제제일 수 있다.
상기 CITED4 단백질의 발현 억제제는 상기 CITED4 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA와 RNA 간섭(RNA interference)을 일으킬 수 있는 단일 가닥 또는 이중 가닥의 핵산 서열일 수 있고, 예컨대 상기 CITED4 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 마이크로RNA(microRNA; miRNA), 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA) 등일 수 있다. 상기 CITED4 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA와 RNA 간섭(RNA interference)을 일으킬 수 있는 단일 가닥 또는 이중 가닥의 핵산 서열은 상기 CITED4 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 일부에 대하여 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상 또는 100%의 상동성을 가지는 서열로 이루어질 수 있으며, 상기 CITED4 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 일부에 대하여 상동성을 가지는 서열 부분은 7 염기 이상, 10 염기 이상, 13 염기 이상, 15 염기 이상, 18 염기 이상 또는 20 염기 이상일 수 있다. 한편, 상기 CITED4 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA와 RNA 간섭(RNA interference)을 일으킬 수 있는 단일 가닥 또는 이중 가닥의 핵산 서열은 화학적 또는 생화학적으로 합성되거나, 생체 내에서 합성될 수 있다. 예컨대, 상기 CITED4 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA와 RNA 간섭(RNA interference)을 일으킬 수 있는 단일 가닥 또는 이중 가닥의 핵산 서열은 시험관 내에서 RNA 중합효소 I를 이용하는 등의 방법으로 합성되어 생체 내로 투여될 수 있고, 또는 다중 클로닝 자리(multi-cloning site; MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 등의 방법으로 생체 내에서 합성되도록 할 수도 있다.
상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 상기 CITED4 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 6 내지 100 염기, 8 내지 60 염기 또는 10 내지 40 염기의 길이를 갖는 DNA나 RNA, 또는 이들의 유도체를 의미한다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 상기 CITED4 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 상기 mRNA가 단백질로 번역되는 것을 저해할 뿐만 아니라, 상기 CITED4 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA가 세포질 내로의 전위(translocation)되거나 성숙(maturation)되는 등의 전반적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해하는 작용을 할 수 있다.
상기 마이크로RNA는 상기 CITED4 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 3'-UTR(untranslated region) 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 10 내지 40 염기, 12 내지 30 염기 또는 15 내지 25 염기의 길이를 갖는 DNA나 RNA, 또는 이들의 유도체를 의미한다. 상기 마이크로RNA는 상기 CITED4 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 3'-UTR에 상보적으로 결합하여 상기 mRNA의 불안정화를 유도하거나, 상기 mRNA의 번역을 억제하는 작용을 할 수 있다.
상기 작은 간섭 RNA는 상기 CITED4 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA와 동일한 서열을 가지는 센스 서열의 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 서열의 RNA 가닥으로 이루어지고 10 내지 40 염기, 12 내지 30 염기 또는 15 내지 25 염기의 길이를 갖는 이중 가닥의 RNA를 의미한다. 상기 작은 간섭 RNA는 상기 CITED4 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하여 상기 mRNA의 절단을 통해 RNA 간섭 현상을 유도함으로써 CITED4 단백질의 발현을 억제하는 작용을 할 수 있다.
상기 짧은 헤어핀 RNA는 상기 CITED4 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA에 대한 작은 간섭 RNA의 센스 서열과 안티센스 서열이 3개 내지 10개의 핵산 서열로 연결된 단일 가닥의 RNA가 분자내 염기쌍성(intramolecular base pairing)을 일으킴으로써 형성된 루프를 갖는 헤어핀 구조의 RNA를 의미한다. 상기 짧은 헤어핀 RNA는 세포 내의 다이서(Dicer)에 의해 siRNA로 전환되어 RNA 간섭 현상을 유발할 수 있다.
또한, 상기 CITED4 단백질의 활성 억제제는 CITED4 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스(peptide mimetics), 앱타머(aptamer), 항체 등일 수 있다.
상기 CITED4 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물나 펩티드는 본 발명이 속하는 기술분야에 공지된 통상의 방법, 예컨대 화합물 스크리닝이나 파지 디스플레이 등의 방식으로 얻을 수 있다.
상기 펩티드 미메틱스는 상기 CITED4 단백질의 결합 도메인을 억제하는 펩티드 또는 비펩티드로서, psi 결합과 같은 비펩티드 결합에 의해 결합된 아미노산으로 구성될 수 있다(Benkirane et al., J. Biol. Chem., 271: 33218-33224 (1996)). 또한, 상기 펩티드 미메틱스는 상기 CITED4 단백질의 이차 구조 특성과 유사하게 구조화되고, 항체나 수용성 수용체와 같은 거대한 분자의 억제 특성을 모방할 수 있으며(Park et al.,. Nat. Biotechnol., 18: 194-198 (2000); Takasaki et al., Nat. Biotechnol., 15: 1266-1270 (1997)), 천연의 길항제와 동등한 효과로 작용할 수 있는 신규한 소분자일 수 있다(Wrighton et al., Nat. Biotechnol., 15: 1261-1265 (1997)).
상기 앱타머는 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 상기 CITED4 단백질에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형 핵산)을 의미한다. 상기 앱타머는 고유의 높은 친화성(보통 pM 수준)과 특이성으로 표적분자에 결합할 수 있다는 특성 때문에 단일 항체와 비교가 되고, 특히 '화학 항체'라고 할 만큼 대체 항체로서의 높은 가능성이 있다. 본 발명의 목적상 상기 앱타머는 CITED4 단백질에 결합하여 그 활성을 억제할 수 있는 것인 한, 제한 없이 이용될 수 있다.
상기 항체는 상기 CITED4 단백질의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하는 것으로, 본 발명이 속하는 기술분야에 공지된 통상의 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 항체의 형태는 특별히 제한되지 않고, 다중클론 항체, 단일클론 항체 및 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고, 모든 면역글로불린 항체뿐만 아니라 인간화 항체 등의 특수한 항체를 포함할 수 있다. 아울러, 상기 항체는 전체 길이의 경쇄 2개 및 전체 길이의 중쇄 2개를 갖는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체의 기능적인 단편 또한 포함한다. 상기 항체의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합성을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 될 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 항체는 CITED4 단백질에 결합하여 그 활성을 억제할 수 있는 것인 한, 제한 없이 이용될 수 있다.
상기 암은 식도암, 위암, 간암, 췌장암, 대장암, 직장암, 결장암, 피부암, 골암, 뇌암, 갑상선암, 폐암, 신장암, 방광암, 유방암, 자궁암, 전립선암 등과 같은 고형암, 또는 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수구성 백혈병, 만성 골수구성 백혈병 만성 림프구성 백혈병, 골수섬유증, 다발성 골수증, 림프종, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 골수형성이상증후군, 골수증식종양, 고립성 골수종, 재생불량성 빈혈 등과 같은 혈액암일 수 있다. 특히, 상기 암은 CITED4 단백질이 과발현되거나 또는 과활성화된 것일 수 있다.
한편, 상기 암 환자는 젬시타빈에 대하여 내성을 나타내는 환자일 수 있고, 본 발명의 상기 약학적 조성물은 상기와 같은 암 환자에게서 젬시타빈에 대한 내성을 억제할 수 있다. 상기와 같이 젬시타빈에 대한 내성을 억제함으로써, 젬시타빈을 계속하여 유효한 항암제로 이용할 수 있다. 또한, 상기 암 환자는 젬시타빈에 대하여 내성을 나타내지 않는 환자일 수도 있다. 본 발명의 상기 약학적 조성물은 젬시타빈에 대한 내성의 유무와 관계없이 암 환자의 젬시타빈에 대한 민감도를 향상시켜 종국적으로 젬시타빈에 의한 항암 효과를 더욱 극대화시킬 수도 있다. 따라서 본 발명의 상기 약학적 조성물은 젬시타빈에 대한 항암 보조제로 이용될 수 있다. 이때, 본 발명의 상기 약학적 조성물은 젬시타빈과 함께 병용될 수 있고, 젬시타빈과 동시에, 또는 젬시타빈을 투여하기 전후에 별도로 투여될 수 있다.
상기와 같은 CITED4 단백질의 억제제의 활성에 기초하여, 본 발명의 다른 측면은 젬시타빈과 상기 CITED4 단백질의 억제제를 함께 포함하는 암 환자의 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 CITED4 단백질의 억제제는 CITED4 단백질의 발현을 전사 수준에서 감소시키는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 마이크로RNA(microRNA; miRNA), 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA) 등의 CITED4 단백질의 발현 억제제, 또는 발현된 CITED4 단백질의 분해를 증가시키거나 그 활성을 방해하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스(peptide mimetics), 앱타머(aptamer), 항체 등의 CITED4 단백질의 활성 억제제일 수 있고, 이들에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 상기 약학적 조성물들은 상기와 같은 유효성분들 외에, 약학적으로 허용가능한 담체(carrier) 또는 첨가제를 더 포함할 수 있다.
상기 '약학적으로 허용가능한'의 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다. 상기 '담체'는 세포 또는 조직 내로의 화합물의 부가를 용이하게 하는 화합물로 정의된다.
본 발명의 상기 유효성분들은 단독으로 또는 어떤 편리한 담체 등과 함께 혼합하여 투여될 수 있고, 그러한 투여 제형은 단회 투여 또는 반복 투여 제형일 수 있다. 상기 약학 조성물은 고형 제제 또는 액상 제제일 수 있다. 고형 제제는 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 좌제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 고형 제제에는 담체, 착향제, 결합제, 방부제, 붕해제, 활택제, 충진제 등이 포함될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 액상 제제로는 물, 프로필렌 글리콜 용액 같은 용액제, 현탁액제, 유제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 적당한 착색제, 착향제, 안정화제, 점성화제 등을 첨가하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 산제는 본 발명의 유효 성분인 다중불포화지방산의 테트라-하이드록시 유도체와 유당, 전분, 미결정셀룰로오스 등 약제학적으로 허용가능한 적당한 담체를 단순 혼합함으로써 제조될 수 있다. 과립제는 본 발명의 상기 유효성분들, 약학적으로 허용가능한 적당한 담체 및 폴리비닐피롤리돈, 하이드록시프로필셀룰로오스 등의 약학적으로 허용가능한 적당한 결합제를 혼합한 후, 물, 에탄올, 이소프로판올 등의 용매를 이용한 습식과립법 또는 압축력을 이용한 건식과립법을 이용하여 제조될 수 있다. 또한 정제는 상기 과립제를 마그네슘스테아레이트 등의 약학적으로 허용가능한 적당한 활택제와 혼합한 후, 타정기를 이용하여 타정함으로써 제조될 수 있다.
본 발명의 상기 유효성분들은 치료해야 할 질환 및 개체의 상태에 따라 경구제, 주사제(예를 들어, 근육주사, 복강주사, 정맥주사, 주입(infusion), 피하주사, 임플란트), 흡입제, 비강투여제, 질제, 직장투여제, 설하제, 트랜스더말제, 토피칼제 등으로 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 투여 경로에 따라 통상적으로 사용되고 비독성인, 약학적으로 허용가능한 운반체, 첨가제, 비히클을 포함하는 적당한 투여 유닛 제형으로 제제화될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 매일 약 0.0001 mg/kg 내지 약 10 g/kg이 투여될 수 있으며, 약 0.001 mg/kg 내지 약 1 g/kg의 1일 투여 용량으로 투여될 수 있다. 그러나 상기 투여량은 상기 혼합물의 정제 정도, 환자의 상태(연령, 성별, 체중 등), 치료하고 있는 상태의 심각성 등에 따라 다양할 수 있다. 필요에 따라 편리성을 위하여 1일 총 투여량을 하루 동안 여러 번 나누어 투여될 수 있다.
2. 젬시타빈에 대한 내성 진단 방법 및 젬시타빈에 대한 내성 억제제의 스크리닝 방법
본 발명의 또 다른 측면은 암 환자의 젬시타빈에 대한 내성을 진단하는데 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 암 환자의 젬시타빈에 대한 내성을 진단하는데 필요한 정보를 제공하는 방법은, 암 환자에서 분리된 세포에서 CITED4 단백질의 발현 또는 활성의 정도를 측정하는 단계를 포함한다.
상기 CITED4 단백질의 발현 또는 활성의 정도를 측정하는 것은 상기 CITED4 단백질을 암호화하는 유전자가 전사된 mRNA의 양이나 상기 mRNA가 번역된 단백질의 양을 측정하는 것일 수 있다.
상기 CITED4 단백질을 암호화하는 유전자가 전사된 mRNA의 양을 측정하는 것은, 역전사중합효소연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase chain Reaction, RT-PCR), 경쟁적 역전사중합효소연쇄반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사중합효소연쇄반응(real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏(Northern Blotting), DNA 칩 등을 이용하여 수행할 수 있고, 이때 상기 mRNA에 대한 프라이머(primer) 쌍, 프로브(probe), 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드 (anti-sense oligonucleotide) 등이 이용될 수 있다.
또한, 상기 CITED 단백질의 양을 측정하는 것은, 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 웨스턴 블랏(Western Blotting), 유세포 분석법(FACS), 방사선면역분석 (RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 단백질 칩(protein chip) 등을 이용하여 수행할 수 있고, 이때 상기 단백질에 대한 펩티드, 펩티드 미메틱스(peptide mimetics), 앱타머(aptamer), 항체 등이 이용될 수 있다.
또한, 상기 암 환자의 젬시타빈에 대한 내성을 진단하는데 필요한 정보를 제공하는 방법은, 상기 측정된 CITED4 단백질의 발현 또는 활성의 정도를 정상 세포에서의 발현 또는 활성 정도와 비교하는 단계와, 상기 암 환자에서 분리된 세포에서 측정된 CITED4 단백질의 발현 또는 활성의 정도가 정상 세포에 비해 높은 경우, 젬시타빈에 대한 내성을 갖는 것으로 판단하는 단계를 더 포함한다. 상기 암 환자에서 분리된 세포에서 측정된 CITED4 단백질의 발현 또는 활성의 정도가 정상 세포에 비해 높은 경우는, 상기 암 환자에서 분리된 세포에서 측정된 CITED4 단백질의 발현 또는 활성의 정도가 정상 세포에 비해 1% 이상, 2% 이상, 3% 이상, 4% 이상, 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 100% 이상 높은 경우일 수 있다.
한편, 본 발명의 또 다른 측면은 젬시타빈에 대한 내성 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 젬시타빈에 대한 내성 억제제의 스크리닝 방법은 젬시타빈 내성 암 세포주에 후보 물질을 처리하는 단계와, 상기 후보 물질이 처리된 암 세포주에서 CITED4 단백질의 발현 또는 활성의 정도를 측정하는 단계를 포함한다.
상기 후보 물질은 새롭게 합성된 또는 공지된 화합물로, 젬시타빈에 대한 내성을 억제할 것으로 기대되는 물질을 의미한다.
또한, 상기 CITED4 단백질의 발현 또는 활성의 정도를 측정하는 것은, 상기 CITED4 단백질을 암호화하는 유전자가 전사된 mRNA의 양이나 상기 mRNA가 번역된 단백질의 양을 측정하는 것일 수 있고, 이를 위한 구체적인 수단은 상기에서 설명한 바와 같다.
또한, 상기 젬시타빈에 대한 내성 억제제의 스크리닝 방법은, 상기 측정된 CITED4 단백질의 발현 또는 활성의 정도를 상기 후보 물질을 처리하기 전과 비교하는 단계와, 상기 후보 물질을 처리하고 난 이후에 측정된 CITED4 단백질의 발현 또는 활성의 정도가 사익 후보 물질을 처리하기 전에 비해 감소된 경우, 상기 후보 물질을 젬시타빈에 대한 내성 억제제로 판단하는 단계를 더 포함한다. 상기 후보 물질을 처리하고 난 이후에 측정된 CITED4 단백질의 발현 또는 활성의 정도가 사익 후보 물질을 처리하기 전에 비해 감소된 경우는, 후보 물질을 처리하고 난 이후에 측정된 CITED4 단백질의 발현 또는 활성의 정도가 사익 후보 물질을 처리하기 전에 비해 1% 이상, 2% 이상, 3% 이상, 4% 이상, 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 100% 이상 감소된 경우일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되지 아니한다.
젬시타빈 저항성 췌장암 세포주의 확립
젬시타빈에 민감한 L3.6pl 세포주(MD Anderson Cancer Center)에 루시퍼라아제 렌티바이러스 (luciferase lentivirus)를 도입하여 루시퍼라아제가 안정적으로 발현되는 세포주(L3.6pl-luc 세포주)를 제작하였다. 상기와 같이 제작한 L3.6pl-luc 세포주는 루시페린(luciferin)이 도입되면 루시퍼라아제가 활성화되어 발광하며, IVIS200 장비를 이용하여 루시퍼라아제의 발광 정도를 정량적으로 측정하였다.
상기와 같이 확립된 세포주를 이용하여 췌장암 동소이식 마우스 모델을 제작하였다. 6주령 Balb/c-nu 암컷 마우스의 췌장에 1x106개의 L3.6pl-luc 세포주를 주입하고 일주일에 2번씩 PBS와 50mg/kg의 젬시타빈을 복강 내로 주사하였으며, 일주일에 1번씩 200mg/kg의 D-루시페린(D-luciferin)을 복강 내로에 주입하고 5분 후 IVIS200 이미징 장비로 루시퍼라아제의 발광 정도를 측정함으로써 췌장암 종양의 성장을 평가하였다.
그 결과, 도 1에 도시된 바와 같이, 젬시타빈을 주사한 마우스의 경우, 3~4주차에는 약물에 반응하는 것으로 나타났으나, 5주차부터는 더 이상 약물에 반응하지 않고 췌장암 종양이 지속적으로 증가하는 것으로 확인되었다(도 1의 (A)).
또한, PBS를 주사한 마우스와 젬시타빈을 주사한 마우스 각각의 췌장암 조직으로부터 세포를 분리하여, PBS를 주사한 마우스의 췌장암 조직으로부터 확립한 세포주를 대조군(control)으로, 그리고 젬시타빈을 주사한 마우스의 췌장암 조직으로부터 확립한 세포주를 실험군(Gem-R)으로 각각 명명하고, 이들 두 세포주들에서도 루시퍼라아제가 활성화되는 것을 확인하였으며(도 1의 (B)), STR(short tandem repeat) 분석을 통해 위 췌장암 조직으로부터 분리한 세포가 L3.6pl-luc 유래임을 확인하였다.
인 비트로( in vitro )에서의 젬시타빈에 대한 저항성 확인
3x103개로 배양된 상기 대조군 및 실험군의 세포주들에 젬시타빈을 0.001μg/ml, 0.01μg/ml, 0.1μg/ml의 농도로 처리하고 48시간 경과후 CCK-8 (Cell Counting Kit-8, Dojindo, Japan) 및 유세포 분석기(FACS)를 이용하여 인 비트로 (in vitro)의 환경에서 젬시타빈에 대한 저항성과 세포자연사(apoptosis)를 각각 분석하였다.
그 결과, 도 2에 도시된 바와 같이, 대조군에서 젬시타빈의 IC50은 0.056ng/ml인데 반해, 실험군에서 젬시타빈의 IC50은 5.24ng/ml로, 실험군에서 젬시타빈에 대한 저항성이 100배 정도 증가된 것으로 확인되었다(도 2의 (A)). 더욱이 FACS 실험을 통한 세포자연사 분석 결과, 대조군 대비 실험군에서 젬시타빈에 대한 저항성이 크게 증가하여 세포자연사가 현저히 감소된 것으로 확인되었다(도 2의 (B)).
Gem-R에서 CITED4의 기능 확인
NucleoZOL(MACHEREY-NAGEL)을 이용하여, 상기와 같이 확립된 대조군과 실험군의 세포주들로부터 전체 RNA를 추출하였고, 이 중 400ng의 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 상기와 같이 합성된 cDNA를 대상으로 서열번호 2 및 3의 프라이머 쌍을 이용하여 qRT-PCR을 수행함으로써 CITED4의 mRNA 발현량을 확인하였다. 그리고 상기와 같이 확립된 대조군과 실험군의 세포주들로부터 RIPA 용액을 이용하여 단백질을 추출한 다음, 항-CITED4 항체(Abcam, dilution 1:1000)를 이용하여 웨스턴 블롯으로 CITED4 단백질의 수준을 확인하였다.
그 결과, 도 3에 도시된 바와 같이, 대조군에 비해 젬시타빈 저항성 세포주인 실험군에서 CITED4 단백질이 과발현되어 있음을 확인하였고, 이로부터 CITED4 단백질의 발현양과 젬시타빈 저항성 간의 관련성이 도출되었다.
나아가, CITED4 단백질의 발현을 일시적으로 감소시킨 후 젬시타빈의 반응성을 확인하기 위한 실험을 진행하였다. 6웰 플레이트에 상기 실험군의 세포들을 1ㅧ106개씩 분주하고 RNAiMax reagent(Invitrogen)를 이용하여 그 매뉴얼에 따라 20nM의 서열번호 4의 염기서열을 갖는 si-CITED4 혹은 서열번호 5의 염기서열을 갖는 si-NC를 각각 처리하였다. 그리고, 12시간 경과 후, 젬시타빈을 0.01μg/ml, 0,1μg/ml, 1μg/ml, 10μg/ml, 100μg/ml의 농도로 처리하고 다시 48시간 경과 후, CCK-8를 이용하여 세포의 생존률을 확인하는 한편, Annexin V-FITC/propidium iodide(BD Biosciences)를 이용하여 세포를 표지한 다음 유세포 분석기(FACS)를 통해 세포자연사도 함께 확인하였다.
그 결과, 도 4에 도시된 바와 같이, CITED4 단백질의 발현을 감소시키지 않은 경우(si-NC)에 비해, CITED4 단백질의 발현을 감소시킨 경우(si-CITED4)에 젬시타빈에 대한 반응성이 향상되는 것으로 확인되었고(도 4의 (A)), 그로 인해 젬시타빈의 처리에 따른 세포자연사도 현저히 향상되는 것으로 확인되었다(도 4의 (B)).
실제 환자 유래 췌장암 세포주에서의 적용 가능성 확인
상기와 같은 CITED4 단백질의 발현 억제에 따른 젬시타빈에 대한 저항성 억제 효과가, 실제 췌장암 환자에서 유래한 췌장암 세포주에서도 동일하게 나타나는지 여부를 확인하였다. 이를 위해, 췌장암 환자의 췌장암 조직(BioChain, Cat No. Z7020090)을 대상으로 항-CITED4 항체(Abcam, dilution 1:100)를 이용하여 IHC(immunohistochemistry) 분석을 수행하여 CITED4 단백질의 양을 확인하였다.
그 결과, 도 5에 도시된 바와 같이, 실제 췌장암 환자에서 유래한 췌장암 조직에서도 CITED4 단백질이 과발현되어 있는 것으로 확인되었다(도 5).
또한, 종래 췌장암 환자 유래의 젬시타빈 저항성 세포주로 보고된 AsPC-1과 PANC-1을 대상으로, 상기 실시예 3에서와 동일한 방법으로 CITED4의 mRNA 발현량과 단백질의 양을 각각 qRT-PCR과 웨스턴 블롯으로 확인하였다.
그 결과, 도 6에 도시된 바와 같이, AsPC-1과 PANC-1에서도, 젬시타빈에 민감한 세포주인 L3.6pl에 비해 CITED4의 mRNA과 단백질이 모두 과발현되어 있는 것으로 확인되었다(도 6).
나아가, 종래 췌장암 환자 유래의 젬시타빈 저항성 세포주로 보고된 PANC-1에 상기 실시예 3에서와 동일한 방법으로 si-CITED4를 처리하여 CITED4 단백질의 발현을 일시적으로 감소시킨 후, 젬시타빈을 처리하고, FACS 실험을 통해 세포자연사를 확인하였다.
그 결과, 도 7에 도시된 바와 같이, CITED4 단백질의 발현을 감소시키지 않은 경우(si-NC)에 비해, CITED4 단백질의 발현을 감소시킨 경우(si-CITED4)에 젬시타빈의 처리에 따른 세포자연사도 현저히 향상되는 것으로 확인되었다(도 7).
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위는 상기와 같은 특정 실시예에만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 특허청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology <120> A Novel Target for improving sensitivity against gemcitabine, and the application thereof <130> 2021DPA4122 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 184 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Asp His Leu Met Leu Ala Glu Gly Tyr Arg Leu Val Gln Arg 1 5 10 15 Pro Pro Ser Ala Ala Ala Ala His Gly Pro His Ala Leu Arg Thr Leu 20 25 30 Pro Pro Tyr Ala Gly Pro Gly Leu Asp Ser Gly Leu Arg Pro Arg Gly 35 40 45 Ala Pro Leu Gly Pro Pro Pro Pro Arg Gln Pro Gly Ala Leu Ala Tyr 50 55 60 Gly Ala Phe Gly Pro Pro Ser Ser Phe Gln Pro Phe Pro Ala Val Pro 65 70 75 80 Pro Pro Ala Ala Gly Ile Ala His Leu Gln Pro Val Ala Thr Pro Tyr 85 90 95 Pro Gly Arg Ala Ala Ala Pro Pro Asn Ala Pro Gly Gly Pro Pro Gly 100 105 110 Pro Gln Pro Ala Pro Ser Ala Ala Ala Pro Pro Pro Pro Ala His Ala 115 120 125 Leu Gly Gly Met Asp Ala Glu Leu Ile Asp Glu Glu Ala Leu Thr Ser 130 135 140 Leu Glu Leu Glu Leu Gly Leu His Arg Val Arg Glu Leu Pro Glu Leu 145 150 155 160 Phe Leu Gly Gln Ser Glu Phe Asp Cys Phe Ser Asp Leu Gly Ser Ala 165 170 175 Pro Pro Ala Gly Ser Val Ser Cys 180 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CITED4 <400> 2 ctcctgcggg aggacagttt 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for CITED4 <400> 3 caatggctca gattggggga 20 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-CITED4 <400> 4 cagcuuucgg acucugguu 19 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-NC <400> 5 aaccagaguc cgaaagcug 19

Claims (12)

  1. CITED4 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 마이크로RNA, 작은 간섭 RNA 및 짧은 헤어핀 RNA로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 CITED4 단백질의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 환자의 젬시타빈에 대한 민감도 향상용 약학적 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 암 환자는 젬시타빈에 대한 내성을 나타내는 환자인 것인, 약학적 조성물.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 암 환자의 젬시타빈에 대한 내성을 억제하는 것인, 약학적 조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 암 환자는 췌장암 환자인 것인, 약학적 조성물.
  7. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 항암 보조제인 것인, 약학적 조성물.
  8. 젬시타빈; 및 CITED4 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 마이크로RNA, 작은 간섭 RNA 및 짧은 헤어핀 RNA로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 CITED4 단백질의 발현 억제제;를 유효성분으로 포함하는, 암 환자의 암 치료용 약학적 조성물로서,
    상기 암 환자는 젬시타빈에 대한 내성을 나타내는 환자인 것인, 약학적 조성물.
  9. 삭제
  10. 암 환자에 분리된 세포에서 CITED4 단백질의 발현 또는 활성의 정도를 측정하는 단계; 및
    상기 측정된 CITED4 단백질의 발현 또는 활성의 정도가 정상 세포에 비해 높은 경우, 젬시타빈에 대한 내성을 갖는 것으로 판단하는 단계;
    를 포함하는, 암 환자의 젬시타빈에 대한 내성을 진단하는데 필요한 정보를 제공하는 방법.
  11. 청구항 10에 있어서,
    상기 CITED4 단백질의 발현 또는 활성의 정도는 역전사중합효소연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase chain Reaction, RT-PCR), 경쟁적 역전사중합효소연쇄반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사중합효소연쇄반응(real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏(Northern Blotting), DNA 칩, 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 웨스턴 블랏(Western Blotting), 유세포 분석법(FACS), 방사선면역분석 (RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay) 및 단백질 칩(protein chip)으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 방법으로 측정하는 것인, 암 환자의 젬시타빈에 대한 내성을 진단하는데 필요한 정보를 제공하는 방법.
  12. 젬시타빈 내성 암 세포주에 후보 물질을 처리하는 단계;
    상기 후보 물질이 처리된 암 세포주에서 CITED4 단백질의 발현 또는 활성의 정도를 측정하는 단계; 및
    상기 측정된 CITED4 단백질의 발현 또는 활성의 정도가 상기 후보 물질의 처리 전에 비해 감소된 경우, 상기 후보 물질을 젬시타빈 내성 억제제로 선별하는 단계;
    를 포함하는 젬시타빈에 대한 내성 억제제의 스크리닝 방법.
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