KR102663444B1 - Primer set for the detection of 5 species of malaria - Google Patents
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Abstract
본 발명은 말라리아 5종(삼일열, Plasmodium vivax; 열대열, P. falciparum; 사일열, P. malariae; 난형열, P. ovale; 원숭이열, P. knowlesi)을 검출할 수 있는 프라이머 세트와 이를 이용한 조성물 또는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 기존 검사법의 문제점을 보완한 다중 실시간 유전자 증폭(multiplex Real-time PCR) 방법의 확립함으로써 신속 정확한 말라리아 종 감별 또는 말라리아 감염증 진단이 가능하다.The present invention provides a primer set capable of detecting five types of malaria (Plasmodium vivax; Plasmodium vivax ; P. falciparum ; P. malariae ; P. ovale ; Monkey fever, P. knowlesi ) and a primer set using the same. relates to a composition or method. The present invention enables rapid and accurate identification of malaria species or diagnosis of malaria infection by establishing a multiplex real-time PCR method that complements the problems of existing testing methods.
Description
본 발명은 말라리아 5종(삼일열, Plasmodium vivax; 열대열, P. falciparum; 사일열, P. malariae; 난형열, P. ovale; 원숭이열, P. knowlesi)을 검출할 수 있는 프라이머 세트 및 이를 포함하는 조성물 또는 검출방법에 관한 것이다.The present invention includes a primer set capable of detecting five types of malaria (Plasmodium vivax; Plasmodium vivax ; P. falciparum ; P. malariae ; P. ovale ; Monkey fever, P. knowlesi ) and the same. It relates to a composition or detection method.
말라리아는 열원충(Plasmodium) 속 원충(삼일열, P. vivax; 열대열, P. falciparum; 사일열, P. malariae; 난형열, P. ovale; 원숭이열, P. knowlesi)에 속하는 기생충이 척추동물의 적혈구에 기생하여 발생하는 급성 열성질환이다. 우리나라에서는 1984년 이후 사라졌던 삼일열 말라리아가 1993년 이후 주로 휴전선 인근 경기 북부 지역에 근무하는 장병들을 중심으로 급속히 확산되어 1998~2000년에는 연간 약 4천 명의 환자가 발생하였다. 재출현 이후 민간인의 비율이 점차 증가하여 2002년 부터는 민간인의 비율이 전체 환자의 절반 이상을 차지하고 있다.Malaria is a parasite belonging to the genus Plasmodium ( P. vivax ; P. falciparum ; P. malariae ; P. ovale ; monkey fever, P. knowlesi ). It is an acute febrile disease caused by parasites on red blood cells. In Korea, Samil fever malaria, which had disappeared since 1984, spread rapidly after 1993, mainly among soldiers working in the northern Gyeonggi region near the cease-fire line, resulting in approximately 4,000 patients per year between 1998 and 2000. After the re-emergence, the proportion of civilians gradually increased, and since 2002, the proportion of civilians has accounted for more than half of all patients.
말라리아는 얼룩날개모기속에 속하는 암컷 모기에 의해 전파되며 국내는 총 6종의 얼룩날개모기종에서 말리리아 전파능력이 확인되었다. Malaria is spread by female mosquitoes belonging to the spotted wing mosquito genus, and in Korea, a total of six species of spotted wing mosquito species have been confirmed to have the ability to transmit malaria.
WHO에 따르면 2019년 전 세계적으로 약 2억 2천 9백만 명의 환자와 40만 9천 명의 사망자가 보고되었다. 매년 3-5억 명의 환자가 발생하며 연간 200만 명 이상이 말라리아로 인해 사망하고 있다. 여행자에서는 전 세계적으로 매년 만 명 이상이 해외여행 도중 말라리아에 감염되고 있으며, 최근 우리나라 사람들도 점차 아프라키 등 말라리아 위험 지역으로의 방문이 증가하고 있어 해외에서 감염되는 사례가 증가하고 있다. According to WHO, approximately 229 million cases and 409,000 deaths were reported worldwide in 2019. Every year, 300 to 500 million people are diagnosed with malaria, and more than 2 million people die from malaria each year. Among travelers, more than 10,000 people around the world are infected with malaria every year while traveling abroad, and recently, Koreans are increasingly visiting malaria-risk areas such as Africa, so the number of cases of infection abroad is increasing.
국내 삼일열 말라리아의 경우, 적절한 치료를 받으면 완치되며 사망사례는 거의 없으나 중증 말라리아(대부분 열대열 말라리아)의 경우 성인 20%, 소아 10% 치사율이 확인되었다. 국내 말라리아 발생 현황을 보면 2017년에 436명이 보고되어 전년대비 27.6% 감소하였다. 그러나 해외여행이 늘어남에 따라 최근 5년간 연도별 유입 국가별 발생 현황을 보면 2017년(79명) 국외 유입 사례가 2013년(60명) 대비 31% 이상 증가하였다. 국외 유입 사례에서는 사망율이 높은 열대열이 가장 많은 부분을 차지하기 때문에 지속적인 감시가 필요하며, 이를 위해서는 정확성과 신속성을 겸비한 검사 시스템의 확립이 필수적이다.In the case of domestic falciparum malaria, it can be completely cured with appropriate treatment and there are almost no deaths, but in the case of severe malaria (mostly falciparum malaria), a mortality rate of 20% in adults and 10% in children has been confirmed. Looking at the domestic malaria outbreak status, 436 cases were reported in 2017, a 27.6% decrease from the previous year. However, as overseas travel has increased, looking at the status of inflow cases by country by year over the past five years, the number of overseas inflow cases in 2017 (79 people) increased by more than 31% compared to 2013 (60 people). Since tropical fever, which has a high mortality rate, accounts for the majority of imported cases, continuous surveillance is necessary, and for this, the establishment of a testing system that combines accuracy and speed is essential.
말라리아의 신속한 치료를 위해 신속진단키트검사(Rapid Diagnostic Test, RDT Kit)를 먼저 실시한다. 말라리아 신속진단키트검사에서 양성이 나오면 반드시 확진을 위해 현미경 검사(혈액도말법) 또는 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR) 등의 유전자 검출검사를 실시하여 원충 또는 특이 유전자를 확인한다. 신속진단검사(RDT Kit)의 경우 결과는 15~20분 내 감염 여부를 확인할 수 있으나 말라리아 열원충 종 감별을 할 수는 없고, 반응 후 장시간 방치 시 위 양성으로 나타날 수 있다는 단점이 있다. 현미경 도말 검사는 민감도가 낮다는 단점이 있다. 현재 구축된 유전자 검출 검사는 이중 중합효소 연쇄반응법(Nested PCR)을 통해 표적 유전자를 확인하는 것이다. 1차 PCR은 말라리아 원충 존재 확인을 위한 시험이며, 종 감별을 위해 2차 PCR을 수행하기 때문에 신속성이 결여되는 문제점이 있다. 따라서, 기존 검사법의 문제점을 보완한 다중 실시간 유전자 증폭(multiplex Real-time PCR) 방법의 확립과 표준화된 시약의 공급을 통해서 말라리아 질환의 신속한 검사체계 구축에 기여할 수 있을 것으로 판단된다. For rapid treatment of malaria, a rapid diagnostic test (RDT Kit) is first performed. If the malaria rapid diagnostic kit test is positive, a genetic detection test such as microscopic examination (blood smear) or polymerase chain reaction (PCR) must be performed to confirm the diagnosis. In the case of the rapid diagnostic test (RDT Kit), the results can confirm infection within 15 to 20 minutes, but it cannot differentiate between malaria falciparum species and has the disadvantage that it may appear falsely positive if left for a long time after reaction. Microscopic smear tests have the disadvantage of low sensitivity. The currently established gene detection test identifies target genes through nested PCR. The first PCR is a test to confirm the presence of malaria parasites, and since the second PCR is performed to identify species, it has the problem of lack of speed. Therefore, it is believed that it will be possible to contribute to the establishment of a rapid testing system for malaria disease through the establishment of a multiplex real-time PCR method that complements the problems of existing testing methods and the supply of standardized reagents.
실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)은 기존의 PCR과는 달리 유전자의 증폭산물에 결합된 형광물질로부터 방출되는 형광량을 실시간을 측정하는 원리이다. 검출을 위하여 형광이 표지된 probe를 이용하는데 프로브의 5' 말단에는 서로 다른 파장을 나타내는 FAM, VIC, TET, HEX 등의 reporter dye를 부착하며 3' 말단에는 quencher dye를 표지한다. TaqManTMprobe는 annealing step에서 주형 DNA에 특이적으로 결합하지만, 프로브의 quencher에 의해 형광 발색이 억제되며 Extension 반응 시에 Taq. DNA polymerase가 갖는 5'->3' exonuclease 활성으로 주형 DNA에 결합한 프로브가 분해되어 형광색소가 프로브에서 유리되면서 quencer에 의한 억제가 해제되어 형광을 나타낸다. 실시간 중합효소연쇄반응은 전기영동이 필요 없어 신속하고 간편하게 결과를 해석할 수 있으며, 검출 특이도와 민감도가 매우 높고 교차 오염의 위험성이 적어 질병의 진단검사법으로 유용하게 사용될 수 있다. Real-time polymerase chain reaction (Real-time PCR), unlike conventional PCR, measures the amount of fluorescence emitted from a fluorescent substance bound to a gene amplification product in real time. For detection, a fluorescently labeled probe is used. Reporter dyes such as FAM, VIC, TET, and HEX, which show different wavelengths, are attached to the 5' end of the probe, and a quencher dye is labeled to the 3' end. The TaqMan TM probe specifically binds to the template DNA during the annealing step, but fluorescence is suppressed by the probe's quencher, and TaqMan TM probe binds specifically to the template DNA during the extension reaction. The 5'->3' exonuclease activity of DNA polymerase decomposes the probe bound to the template DNA, and the fluorescent dye is released from the probe, thereby releasing the inhibition by the quencer and causing fluorescence. Real-time polymerase chain reaction does not require electrophoresis, so results can be interpreted quickly and easily. It has very high detection specificity and sensitivity and has a low risk of cross-contamination, making it useful as a diagnostic test for diseases.
한국등록특허 제2039178호는 말라리아 원충의 감염진단을 위한 유전자 증폭용 프라이머 및 이를 이용한 말라리아 원충의 검사 방법에 관한 것으로, 말라리아 원인인 삼일열, 열대열, 사일열 또는 난형성 원충의 존재 여부를 탐지할 수 있는 증폭용 프라이머에 관해 개시하고 있고, 한국공개특허 제2010-0135128호는 말라리아 원충 검출용 프라이머, 탐침 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것으로, 시료 내에 열대열, 삼일열, 사일열, 난형열이 혼재되어 있을지라도 한번에 실시간으로 검출할 수 있는 프라이머에 관해 개시하고 있으며, 한국공개특허 제2011-0118179호는 말라리아 검출을 위한 프로브 및 프라이머에 관한 것으로, 열대열 또는 삼일열 말라리아 검출을 위한 실시간 PCR 방법이 개시되어 있다.Korean Patent No. 2039178 relates to a primer for gene amplification for diagnosing infection with malaria parasites and a method for testing malaria parasites using the same, which can detect the presence of Plasmodium falciparum, Plasmodium falciparum, Plasmodium falciparum, or oval parasites that cause malaria. It discloses primers for amplification that can detect malaria parasites, and Korean Patent Publication No. 2010-0135128 relates to primers, probes, and detection methods using the same for detecting malaria parasites. Plasmodium falciparum, P. falciparum, P. falciparum, and Oval falciparum are mixed in the sample. It discloses primers that can detect in real time all at once, and Korean Patent Publication No. 2011-0118179 relates to probes and primers for detecting malaria, and discloses a real-time PCR method for detecting falciparum or P. falciparum malaria. It is done.
하지만, 본 발명의 특정 서열을 갖는 열대열, 삼일열, 사일열, 난형열, 원숭이열 감별용 프라이머 세트에 대해서는 아직까지 개시된 바가 없다. However, no primer set for distinguishing P. falciparum, P. falciparum, P. falciparum, P. falciparum, or P. falciparum and monkey fever having a specific sequence of the present invention has been disclosed so far.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 말라리아 5종(삼일열, Plasmodium vivax; 열대열, P. falciparum; 사일열, P. malariae; 난형열, P. ovale; 원숭이열, P. knowlesi)을 검출할 수 있는 프라이머 세트 및 이를 이용한 감별 방법을 확인하여 본 발명을 완성하였다.The present invention was developed in response to the above-mentioned needs, and the present inventors have developed a method for treating five types of malaria ( Plasmodium vivax ; P. falciparum ; P. malariae ; P. ovale; P. ovale ; monkey fever, P. The present invention was completed by confirming a primer set capable of detecting . knowlesi and a differentiation method using the same.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 열대열 말라리아(Plasmodium falciparum)에 대한 서열번호 1을 포함하는 정방향 프라이머; 서열번호 2를 포함하는 역방향 프라이머; 및 서열번호 3을 포함하는 프로브와 삼일열 말라리아(Plasmodium vivax)에 대한 서열번호 4를 포함하는 정방향 프라이머; 서열번호 5를 포함하는 역방향 프라이머; 및 서열번호 6을 포함하는 프로브를 포함하는 말라리아 검출용 프라이머 세트를 제공한다. In order to solve the above problem, the present invention provides a forward primer containing SEQ ID NO: 1 for Plasmodium falciparum ; Reverse primer comprising SEQ ID NO: 2; And a probe containing SEQ ID NO: 3 and a forward primer containing SEQ ID NO: 4 for Plasmodium vivax; Reverse primer comprising SEQ ID NO: 5; and a primer set for malaria detection including a probe containing SEQ ID NO: 6.
다른 예로서, 사일열 말라리아(Plasmodium malariae)에 대한 서열번호 7을 포함하는 정방향 프라이머; 서열번호 8을 포함하는 역방향 프라이머; 및 서열번호 9를 포함하는 프로브, 난형열 말라리아(Plasmodium ovale)에 대한 서열번호 10을 포함하는 정방향 프라이머; 서열번호 11을 포함하는 역방향 프라이머; 및 서열번호 12를 포함하는 프로브와 원숭이열 말라리아(Plasmodium knowlesi)에 대한 서열번호 13을 포함하는 정방향 프라이머; 서열번호 14를 포함하는 역방향 프라이머; 및 서열번호 15를 포함하는 프로브를 포함하는 말라리아 검출용 프라이머 세트를 제공한다.As another example, a forward primer comprising SEQ ID NO: 7 for Plasmodium malariae ; Reverse primer comprising SEQ ID NO: 8; and a probe containing SEQ ID NO: 9, a forward primer containing SEQ ID NO: 10 for Plasmodium ovale malaria; Reverse primer comprising SEQ ID NO: 11; and a probe comprising SEQ ID NO: 12 and a forward primer comprising SEQ ID NO: 13 for monkey fever malaria ( Plasmodium knowlesi ); Reverse primer comprising SEQ ID NO: 14; and a primer set for malaria detection including a probe containing SEQ ID NO: 15.
또 다른 예로서, 상기 프라이머 세트를 모두 포함하는 말라리아 검출용 다중 실시간 중합효소 연쇄반응(multiplex real-time PCR) 프라이머 세트를 제공한다.As another example, a multiplex real-time PCR primer set for malaria detection including all of the above primer sets is provided.
상기 프라이머 세트는 내부 대조군(internal control)으로 서열번호 16을 포함하는 정방향 프라이머; 서열번호 17을 포함하는 역방향 프라이머 및 서열번호 18을 포함하는 프로브를 포함할 수 있다.The primer set includes a forward primer containing SEQ ID NO: 16 as an internal control; It may include a reverse primer containing SEQ ID NO: 17 and a probe containing SEQ ID NO: 18.
다른 예로서, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 개별적으로 또는 모두 포함하는 말라리아 종 감별용 조성물을 제공한다. As another example, the present invention provides a composition for distinguishing malaria species comprising individually or all of the above primer sets.
또 다른 예로서, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 개별적으로 또는 모두 포함하는 말라리아 감염증 진단용 조성물을 제공한다. As another example, the present invention provides a composition for diagnosing malaria infection comprising individually or all of the above primer sets.
상기 조성물에서 사용하는 시료는 분변, 혈액, 뇌척수액, 혈청, 객담, 소변 또는 생체 조직으로부터 분리된 것일 수 있다.The sample used in the composition may be separated from feces, blood, cerebrospinal fluid, serum, sputum, urine, or biological tissue.
상기 말라리아 감염증은 두통, 열, 몸서림, 관절 통증, 구토, 용혈성 빈혈, 황달, 망막 손상 및 경련으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있다.The malaria infection may be one or more selected from the group consisting of headache, fever, shivering, joint pain, vomiting, hemolytic anemia, jaundice, retinal damage, and convulsions.
추가적으로, 본 발명은 분리된 DNA 시료를 준비하는 단계; 상기 프라이머 세트를 개별적으로 또는 모두 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 실시간 중합효소 연쇄반응으로 증폭하는 단계; 및 실시간 증폭 결과를 형광으로 획득하는 단계;를 포함하는 말라리아 종 감별방법을 제공한다. Additionally, the present invention includes the steps of preparing an isolated DNA sample; amplifying by real-time polymerase chain reaction using the primer sets individually or including all of the primer sets; and obtaining real-time amplification results using fluorescence.
본 발명의 말라리아 5종(삼일열, Plasmodium vivax; 열대열, P. falciparum; 사일열, P. malariae; 난형열, P. ovale; 원숭이열, P. knowlesi)을 검출할 수 있는 프라이머 세트와 이를 이용한 조성물 또는 방법은 기존 검사법의 문제점을 보완한 다중 실시간 유전자 증폭(multiplex Real-time PCR) 방법의 확립과 표준화된 시약의 공급을 통해서 말라리아 질환의 신속한 검사체계 구축에 기여할 수 있을 것이다.A primer set capable of detecting five types of malaria (Plasmodium vivax; Plasmodium vivax ; P. falciparum ; P. malariae ; P. ovale ; Monkey fever, P. knowlesi ) of the present invention and a primer set using the same. The composition or method could contribute to the establishment of a rapid testing system for malaria disease through the establishment of a multiplex real-time PCR method that complements the problems of existing testing methods and the supply of standardized reagents.
도 1은 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. falciparum 특이적 검출용 프라이머 및 프로브의 in silico cross-reactivity 확인 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. vivax 특이적 검출용 프라이머 및 프로브의 in silico cross-reactivity 확인 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. ovale 특이적 검출용 프라이머 및 프로브의 in silico cross-reactivity 확인 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. malariae 특이적 검출용 프라이머 및 프로브의 in silico cross-reactivity 확인 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. knowlesi 특이적 검출용 프라이머 및 프로브의 in silico cross-reactivity 확인 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 구현 예에 따른 설정된 프로브 형광 종류를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 구현 예에 따른 프라이머 및 프로브 성능 확인 결과를 나타낸 것이다. (a) P. falciparum 프라이머/프로브 세트, (b) P. vivax 프라이머/프로브 세트, (c) P. ovale 프라이머/프로브 세트, (d) P. malariae 프라이머/프로브 세트, (e) P. knowlesi 프라이머/프로브 세트.
도 8은 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. falciparum 및 P. vivax 프라이머/프로브 세트의 다중 효율 확인 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. falciparum 및 P. vivax 프라이머/프로브 세트의 다중 효율 확인 시험 Ct값 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. ovale, P. malariae 및 P. knowlesi 프라이머/프로브 세트의 다중 효율 확인 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. ovale, P. malariae 및 P. knowlesi 프라이머/프로브 세트의 다중 효율 확인 시험 Ct값 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. falciparum 및 P. vivax 프라이머/프로브 세트의 내부양성대조군 첨가 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. falciparum 및 P. vivax 프라이머/프로브 세트의 내부 양성 대조군 첨가 시험 Ct값 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. ovale, P. malariae 및 P. knowlesi 프라이머/프로브 세트의 내부 양성 대조군 첨가 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명의 일 구현 예에 P. ovale, P. malariae 및 P. knowlesi 프라이머/프로브 세트의 내부 양성 대조군 첨가 시험 Ct값 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. falciparum 및 P. vivax 세트에서 P. falciparum 양성 시료를 이용한 마스터믹스 별 검출 효율 비교 테스트 결과 결과를 나타낸 것이다(빨간색 곡선 : P. falciparum, 검정색* 곡선 : IC).
도 17은 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. falciparum 및 P. vivax 세트에서 P. vivax 양성 시료를 이용한 마스터믹스 별 검출 효율 비교 테스트 결과를 나타낸 것이다(파란색 곡선 : P. vivax, 검정색 곡선 : IC).
도 18은 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. ovale, P. malariae 및 P. knowlesi 세트에서 P. ovale 양성 시료를 이용한 마스터믹스 별 검출 효율 비교 테스트 결과를 나타낸 것이다(빨간색 곡선 : P. ovale, 검정색 곡선 : IC).
도 19는 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. ovale, P. malariae 및 P. knowlesi 세트에서 P. malariae 양성 시료를 이용한 마스터믹스 별 검출 효율 비교 테스트 결과를 나타낸 것이다(파란색 곡선 : P. malariae, 검정색 곡선 : IC).
도 20은 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. ovale, P. malariae 및 P. knowlesi 세트에서 P. knowlesi 올리고를 이용한 마스터믹스 별 검출 효율 비교 테스트 결과를 나타낸 것이다(초록색 곡선 : P. malariae, 검정색 곡선 : IC).
도 21은 본 발명의 일 구현 예에 따른 플라스미드 DNA 확인 결과를 나타낸 것이다. (a) P. falciparum (b) P. vivax (c) P. ovale (d) P. malariae (e) P. knowlesi (f) IC.
도 22는 본 발명의 일 구현 예에 따른 양성 대조군 제작 결과를 나타낸 것이다. (a) Malaria multiplex Ⅰ kit (b) Malaria multiplex Ⅱ kit
도 23은 본 발명의 일 구현 예에 따른 교차반응 시험 결과(Malaria multiplex Ⅰ kit)를 나타낸 것이다.
도 24는 본 발명의 일 구현 예에 따른 교차반응 시험 결과(Malaria multiplex Ⅱ kit)를 나타낸 것이다.
도 25는 본 발명의 일 구현 예에 따른 Malaria multiplex Ⅰ kit 검출한계 Ct 측정값 결과를 나타낸 것이다.
도 26은 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. falciparum 양성표준물질을 이용한 표준곡선(Malaria multiplex Ⅰ kit)을 나타낸 것이다.
도 27은 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. vivax 양성표준물질을 이용한 표준곡선(Malaria multiplex Ⅰ kit)을 나타낸 것이다.
도 28은 본 발명의 일 구현 예에 따른 IC 양성표준물질을 이용한 표준곡선(Malaria multiplex Ⅰ kit)을 나타낸 것이다.
도 29는 본 발명의 일 구현 예에 따른 Malaria multiplex Ⅱ kit 검출한계 Ct 측정값 결과를 나타낸 것이다.
도 30은 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. ovale 양성표준물질을 이용한 표준곡선(Malaria multiplex Ⅱ kit) 결과를 나타낸 것이다.
도 31은 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. malariae 양성표준물질을 이용한 표준곡선(Malaria multiplex Ⅱ kit) 결과를 나타낸 것이다.
도 32는 본 발명의 일 구현 예에 따른 P. knowlesi 양성표준물질을 이용한 표준곡선(Malaria multiplex Ⅱ kit) 결과를 나타낸 것이다.
도 33은 본 발명의 일 구현 예에 따른 IC 양성표준물질을 이용한 표준곡선(Malaria multiplex Ⅱ kit) 결과를 나타낸 것이다.
도 34는 본 발명의 일 구현 예에 따른 정밀도 시험 결과(Malaria multiplex Ⅰ kit) 결과를 나타낸 것이다.
도 35는 본 발명의 일 구현 예에 따른 정밀도 시험 결과(Malaria multiplex Ⅱ kit) 결과를 나타낸 것이다.
도 36은 본 발명의 일 구현 예에 따른 정밀도 시험의 Ct 측정값(Malaria multiplex Ⅰ kit) 결과를 나타낸 것이다.
도 37은 본 발명의 일 구현 예에 따른 정밀도 시험의 Ct 측정값(Malaria multiplex Ⅱ kit) 결과를 나타낸 것이다.
도 38은 본 발명의 일 구현 예에 따른 말라리아 기존진단법과의 성능 비교 테스트(Malaria multiplex Ⅰ kit) 결과를 나타낸 것이다.
도 39는 본 발명의 일 구현 예에 따른 말라리아 기존진단법과의 성능 비교 테스트(Malaria multiplex Ⅱ kit) 결과를 나타낸 것이다.Figure 1 shows the results of in silico cross-reactivity confirmation of primers and probes for P. falciparum specific detection according to an embodiment of the present invention.
Figure 2 shows the results of in silico cross-reactivity confirmation of primers and probes for specific detection of P. vivax according to an embodiment of the present invention.
Figure 3 shows the results of in silico cross-reactivity confirmation of primers and probes for P. ovale specific detection according to an embodiment of the present invention.
Figure 4 shows the results of in silico cross-reactivity confirmation of primers and probes for P. malariae- specific detection according to an embodiment of the present invention.
Figure 5 shows the results of in silico cross-reactivity confirmation of primers and probes for P. knowlesi- specific detection according to an embodiment of the present invention.
Figure 6 shows set probe fluorescence types according to an embodiment of the present invention.
Figure 7 shows the results of checking the performance of primers and probes according to an embodiment of the present invention. (a) P. falciparum primer/probe set, (b) P. vivax primer/probe set, (c) P. ovale primer/probe set, (d) P. malariae primer/probe set, (e) P. knowlesi Primer/probe set.
Figure 8 shows the results of multiple efficiency confirmation tests of P. falciparum and P. vivax primer/probe sets according to an embodiment of the present invention.
Figure 9 shows the Ct value results of a multiple efficiency confirmation test of P. falciparum and P. vivax primer/probe sets according to an embodiment of the present invention.
Figure 10 shows the results of multiple efficiency confirmation tests of P. ovale , P. malariae , and P. knowlesi primer/probe sets according to an embodiment of the present invention.
Figure 11 shows the Ct value results of a multiplex efficiency confirmation test of P. ovale , P. malariae , and P. knowlesi primer/probe sets according to an embodiment of the present invention.
Figure 12 shows the results of an internal positive control addition test of the P. falciparum and P. vivax primer/probe sets according to one embodiment of the present invention.
Figure 13 shows the Ct value results of the internal positive control addition test of the P. falciparum and P. vivax primer/probe sets according to one embodiment of the present invention.
Figure 14 shows the results of an internal positive control addition test of P. ovale , P. malariae , and P. knowlesi primer/probe sets according to an embodiment of the present invention.
Figure 15 shows the Ct value results of the internal positive control addition test of the P. ovale , P. malariae , and P. knowlesi primer/probe sets in one embodiment of the present invention.
Figure 16 shows the results of a comparison test of detection efficiency for each master mix using P. falciparum positive samples in the P. falciparum and P. vivax set according to an embodiment of the present invention (red curve: P. falciparum , black * curve) :IC).
Figure 17 shows the results of a comparison test of detection efficiency for each mastermix using P. vivax positive samples in the P. falciparum and P. vivax set according to an embodiment of the present invention (blue curve: P. vivax , black curve: IC ).
Figure 18 shows the results of a comparison test of detection efficiency for each master mix using P. ovale positive samples in the P. ovale, P. malariae and P. knowlesi sets according to an embodiment of the present invention (red curve: P. ovale , Black curve: IC).
Figure 19 shows the results of a comparison test of detection efficiency for each master mix using P. malariae positive samples in the P. ovale, P. malariae and P. knowlesi sets according to an embodiment of the present invention (blue curve: P. malariae , Black curve: IC).
Figure 20 shows the results of a comparison test of detection efficiency for each master mix using P. knowlesi oligos in the P. ovale, P. malariae , and P. knowlesi sets according to an embodiment of the present invention (green curve: P. malariae , black curve) Curve: IC).
Figure 21 shows the results of plasmid DNA confirmation according to an embodiment of the present invention. (a) P. falciparum (b) P. vivax (c) P. ovale (d) P. malariae (e) P. knowlesi (f) IC.
Figure 22 shows the results of producing a positive control group according to an embodiment of the present invention. (a) Malaria multiplex Ⅰ kit (b) Malaria multiplex Ⅱ kit
Figure 23 shows the results of a cross-reaction test (Malaria multiplex I kit) according to an embodiment of the present invention.
Figure 24 shows the results of a cross-reaction test (Malaria multiplex II kit) according to an embodiment of the present invention.
Figure 25 shows the detection limit Ct measurement results of the Malaria multiplex I kit according to an embodiment of the present invention.
Figure 26 shows a standard curve (Malaria multiplex I kit) using a P. falciparum positive standard material according to an embodiment of the present invention.
Figure 27 shows a standard curve (Malaria multiplex I kit) using a P. vivax positive standard material according to an embodiment of the present invention.
Figure 28 shows a standard curve (Malaria multiplex Ⅰ kit) using an IC positive standard material according to an embodiment of the present invention.
Figure 29 shows the results of the detection limit Ct measurement value of the Malaria multiplex II kit according to an embodiment of the present invention.
Figure 30 shows the results of a standard curve (Malaria multiplex II kit) using a P. ovale positive standard material according to an embodiment of the present invention.
Figure 31 shows the results of a standard curve (Malaria multiplex II kit) using a P. malariae positive standard material according to an embodiment of the present invention.
Figure 32 shows the results of a standard curve (Malaria multiplex II kit) using a P. knowlesi positive standard material according to an embodiment of the present invention.
Figure 33 shows the results of a standard curve (Malaria multiplex II kit) using an IC positive standard material according to an embodiment of the present invention.
Figure 34 shows the results of a precision test (Malaria multiplex I kit) according to an embodiment of the present invention.
Figure 35 shows the results of a precision test (Malaria multiplex II kit) according to an embodiment of the present invention.
Figure 36 shows the Ct measurement results (Malaria multiplex I kit) of a precision test according to an embodiment of the present invention.
Figure 37 shows the Ct measurement results (Malaria multiplex II kit) of a precision test according to an embodiment of the present invention.
Figure 38 shows the results of a performance comparison test (Malaria multiplex I kit) with existing malaria diagnostic methods according to an embodiment of the present invention.
Figure 39 shows the results of a performance comparison test (Malaria multiplex II kit) with existing malaria diagnostic methods according to an embodiment of the present invention.
이하, 본 발명의 바람직한 구현예에 대하여 상세히 설명한다. 또한, 하기의 설명에서는 구체적인 구성요소 등과 같은 많은 특정 사항들이 도시되어 있는데, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐 이러한 특정 사항들 없이도 본 발명이 실시될 수 있음은 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명하다 할 것이다. 그리고, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in detail. In addition, in the following description, many specific details, such as specific components, are shown, but this is provided to facilitate a more general understanding of the present invention, and it is known in the art that the present invention can be practiced without these specific details. It will be self-evident to those who have the knowledge. Additionally, in describing the present invention, if it is determined that a detailed description of a related known function or configuration may unnecessarily obscure the gist of the present invention, the detailed description will be omitted.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 열대열 말라리아(Plasmodium falciparum)에 대한 서열번호 1을 포함하는 정방향 프라이머; 서열번호 2를 포함하는 역방향 프라이머; 및 서열번호 3을 포함하는 프로브와 삼일열 말라리아(Plasmodium vivax)에 대한 서열번호 4를 포함하는 정방향 프라이머; 서열번호 5를 포함하는 역방향 프라이머; 및 서열번호 6을 포함하는 프로브를 포함하는 말라리아 검출용 프라이머 세트를 제공한다. In order to achieve the object of the present invention, the present invention provides a forward primer containing SEQ ID NO: 1 for Plasmodium falciparum ; Reverse primer comprising SEQ ID NO: 2; And a probe containing SEQ ID NO: 3 and a forward primer containing SEQ ID NO: 4 for Plasmodium vivax; Reverse primer comprising SEQ ID NO: 5; and a primer set for malaria detection including a probe containing SEQ ID NO: 6.
다른 예로서, 사일열 말라리아(Plasmodium malariae)에 대한 서열번호 7을 포함하는 정방향 프라이머; 서열번호 8을 포함하는 역방향 프라이머; 및 서열번호 9를 포함하는 프로브, 난형열 말라리아(Plasmodium ovale)에 대한 서열번호 10을 포함하는 정방향 프라이머; 서열번호 11을 포함하는 역방향 프라이머; 및 서열번호 12를 포함하는 프로브와 원숭이열 말라리아(Plasmodium knowlesi)에 대한 서열번호 13을 포함하는 정방향 프라이머; 서열번호 14를 포함하는 역방향 프라이머; 및 서열번호 15를 포함하는 프로브를 포함하는 말라리아 검출용 프라이머 세트를 제공한다.As another example, a forward primer comprising SEQ ID NO: 7 for Plasmodium malariae ; Reverse primer comprising SEQ ID NO: 8; and a probe containing SEQ ID NO: 9, a forward primer containing SEQ ID NO: 10 for Plasmodium ovale malaria; Reverse primer comprising SEQ ID NO: 11; and a probe comprising SEQ ID NO: 12 and a forward primer comprising SEQ ID NO: 13 for monkey fever malaria ( Plasmodium knowlesi ); Reverse primer comprising SEQ ID NO: 14; and a primer set for malaria detection including a probe containing SEQ ID NO: 15.
또 다른 예로서, 상기 프라이머 세트를 모두 포함하는 말라리아 검출용 다중 실시간 중합효소 연쇄반응(multiplex real-time PCR) 프라이머 세트를 제공한다.As another example, a multiplex real-time PCR primer set for malaria detection including all of the above primer sets is provided.
상기 프라이머 세트는 내부 대조군(internal control)으로 서열번호 16을 포함하는 정방향 프라이머; 서열번호 17을 포함하는 역방향 프라이머 및 서열번호 18을 포함하는 프로브를 포함할 수 있다.The primer set includes a forward primer containing SEQ ID NO: 16 as an internal control; It may include a reverse primer containing SEQ ID NO: 17 and a probe containing SEQ ID NO: 18.
다른 예로서, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 개별적으로 또는 모두 포함하는 말라리아 종 감별용 조성물을 제공한다. As another example, the present invention provides a composition for distinguishing malaria species comprising individually or all of the above primer sets.
또 다른 예로서, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 개별적으로 또는 모두 포함하는 말라리아 감염증 진단용 조성물을 제공한다. As another example, the present invention provides a composition for diagnosing malaria infection comprising individually or all of the above primer sets.
실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)은 기존의 PCR과는 달리 유전자의 증폭산물에 결합된 형광물질로부터 방출되는 형광량을 실시간으로 측정하는 원리이다. 이는 전기영동이 필요 없어 신속하고 간편하게 결과를 해석할 수 있으며, 검출 특이도와 민감도가 매우 높고 교차 오염의 위험성이 적어 질병의 진단검사법으로 유용하게 사용될 수 있다. Real-time polymerase chain reaction (real-time PCR), unlike conventional PCR, measures the amount of fluorescence emitted from a fluorescent substance bound to a gene amplification product in real time. This does not require electrophoresis, so the results can be interpreted quickly and easily, and the detection specificity and sensitivity are very high and the risk of cross-contamination is low, so it can be useful as a diagnostic test for diseases.
프로브는 이 분야에 알려진 실시간 중합효소연쇄반응용 모든 프로브를 포함하고, 바람직하게는 5' 및 3' 말단에는 검출이 가능한 형광 표지인자 및 소광자가 결합되어 있는 프로프를 사용한다. 일반적으로 5' 및 3' 말단에는 검출이 가능한 형광 표지인자 (Reporter) 및 소광자 (Quencher)가 결합되어 있으므로, 사용가능한 모든 형광 표지인자 및 소광자를 사용할 수 있다. 형광 표지 인자의 예로는 FAM, VIC, TAMRA, JOE, ROX, HEX, Cy3, Cy5, Texas Red 등이 있으며 종류에 따라 emission 및 exitation 파장이 다르므로 각각의 파장 간 중첩을 최소로 하는 형광표지자를 선택하여 한 번의 반응에서 다양한 병원체의 특이 유전자 검출을 가능케 하나, 이에 제한되는 것은 아니다. The probe includes all probes for real-time polymerase chain reaction known in the art, and preferably has a detectable fluorescent label and a quencher bound to the 5' and 3' ends. Generally, a detectable fluorescent marker (reporter) and quencher (quencher) are bound to the 5' and 3' ends, so all available fluorescent markers and quenchers can be used. Examples of fluorescent labeling factors include FAM, VIC, TAMRA, JOE, ROX, HEX, Cy3, Cy5, Texas Red, etc. Since the emission and exit wavelengths are different depending on the type, select a fluorescent marker that minimizes the overlap between each wavelength. This allows detection of specific genes of various pathogens in a single reaction, but is not limited to this.
형광검출법으로는 인터킬레이팅(interchelating) 방법, TaqMan™ 프로브법 및 분자비콘(Molecular becon) 방법 등이 있다. 이들은 각각 다른 원리를 이용하여 형광의 증가를 검출하는데, 바람직하게는 TaqMan™ 프로브법을 사용할 수 있다. TaqMan™ 프로브법은 5' 말단을 형광 표지인자(FAM 등)로 3' 말단을 quencher 물질(TAMRA, Blacke hole chencher 등)로 수식한 올리고뉴클레오티드(TaqManTM probe)를 PCR 반응액에 첨가하는 방법으로, TaqManTM probe가 어닐링 단계에서 주형 DNA에 특이적으로 혼성화하지만, 프로브상의 quencher에 의해 형광 발생이 억제되고, 연장 단계에서 Taq DNA 중합효소가 갖는 5'→ 3'엑소뉴클레아제 활성으로 주형에 혼성화한 TaqMan™ 프로브만 분해되어 형광색소가 프로브에서 유리되므로서 quencher에 의한 억제가 해제되어 형광을 발하게 된다. Fluorescence detection methods include interchelating method, TaqMan ™ probe method, and molecular becon method. They each detect an increase in fluorescence using different principles, preferably using the TaqMan ™ probe method. The TaqMan ™ probe method is a method of adding an oligonucleotide (TaqMan ™ probe) whose 5' end is modified with a fluorescent marker (FAM, etc.) and the 3' end with a quencher material (TAMRA, Blacke hole chencher, etc.) to the PCR reaction solution. , the TaqMan TM probe specifically hybridizes to the template DNA in the annealing step, but fluorescence is suppressed by the quencher on the probe, and in the extension step, the 5' → 3' exonuclease activity of Taq DNA polymerase binds to the template. Only the hybridized TaqMan™ probe is decomposed and the fluorescent dye is released from the probe, thereby releasing the inhibition by the quencher and emitting fluorescence.
상기 프라이머 또는 프로브의 농도는 실험 조건에 따라 통상의 기술자가 다양하게 선택하여 사용할 수 있고, 바람직하게는 각각 1 내지 1000 nM일 수 있고, 더욱 바람직하게는 각각 100 내지 500 nM일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The concentration of the primer or probe can be selected in various ways by a person skilled in the art depending on the experimental conditions, and may preferably be 1 to 1000 nM, and more preferably 100 to 500 nM, but is limited thereto. It doesn't work.
상기 실시간 중합효소 연쇄반응을 실시하는 단계는 30 내지 50 사이클, 30 내지 46 사이클, 30 내지 44 사이클, 33 내지 50 사이클, 33 내지 46 사이클, 33 내지 44 사이클, 36 내지 50 사이클, 36 내지 46 사이클, 36 내지 44 사이클, 38 내지 50 사이클 또는 38 내지 46 사이클, 예를 들어, 38 내지 44 사이클 조건으로 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The step of performing the real-time polymerase chain reaction is 30 to 50 cycles, 30 to 46 cycles, 30 to 44 cycles, 33 to 50 cycles, 33 to 46 cycles, 33 to 44 cycles, 36 to 50 cycles, and 36 to 46 cycles. , 36 to 44 cycles, 38 to 50 cycles, or 38 to 46 cycles, for example, may be performed under 38 to 44 cycle conditions, but are not limited thereto.
본 발명의 프라이머 세트는 통상적인 실시간 PCR 방법 및 장치를 사용하여 실시할 수 있다. PCR 종료시, 실시간 PCR 기기의 레이저는 증폭된 PCR 산물의 프로브에 표지된 형광 표지인자를 감지하여 피크를 구현한다. 이때, 전기영동 과정 없이 기기에 내장된 프로그램을 실행시켜 자동으로 결과를 분석할 수 있다. 분석된 결과는 Ct (Threshold cycle)로 나타나 비숙련자라도 분석된 결과를 쉽게 알 수 있다. The primer set of the present invention can be performed using conventional real-time PCR methods and devices. At the end of PCR, the laser of the real-time PCR device detects the fluorescent marker labeled on the probe of the amplified PCR product and creates a peak. At this time, the results can be analyzed automatically by running the program built into the device without the electrophoresis process. The analyzed results are displayed as Ct (Threshold cycle), so even unskilled users can easily understand the analyzed results.
상기 조성물에서 사용하는 시료는 분변, 혈액, 뇌척수액, 혈청, 객담, 소변 또는 생체 조직으로부터 분리된 것일 수 있다.The sample used in the composition may be separated from feces, blood, cerebrospinal fluid, serum, sputum, urine, or biological tissue.
상기 말라리아 감염증은 두통, 열, 몸서림, 관절 통증, 구토, 용혈성 빈혈, 황달, 망막 손상 및 경련으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있다.The malaria infection may be one or more selected from the group consisting of headache, fever, shivering, joint pain, vomiting, hemolytic anemia, jaundice, retinal damage, and convulsions.
추가적으로, 본 발명은 분리된 DNA 시료를 준비하는 단계; 상기 프라이머 세트를 개별적으로 또는 모두 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응으로 증폭하는 단계; 및 실시간 증폭 결과를 형광으로 획득하는 단계;를 포함하는 말라리아 종 감별방법을 제공한다. Additionally, the present invention includes the steps of preparing an isolated DNA sample; amplifying by real-time reverse transcription polymerase chain reaction using the primer sets individually or including all of the primer sets; and obtaining real-time amplification results using fluorescence.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다The advantages and features of the present invention and methods for achieving them will become clear with reference to the embodiments described in detail below. However, the present invention is not limited to the embodiments disclosed below and will be implemented in various different forms, and the present embodiments are merely intended to ensure that the disclosure of the present invention is complete and to include common knowledge in the technical field to which the present invention pertains. It is provided to fully inform those who have the scope of the invention, and the invention is only defined by the scope of the claims.
<실시예 1> 프라이머 및 프로브 설계<Example 1> Primer and probe design
1-1. Plasmodium falciparum 검출용 프라이머/프로브 설계1-1. Primer/probe design for detection of Plasmodium falciparum
말라리아 5종의 PCR 분석 기술에 관한 선행 연구들을 조사한 결과 임상 시료에서 말라리아 검출에서는 18S rRNA 혹은 COX1 부위를 일반적으로 표적 유전자로 사용하고 있으며 AMA1 (apical membrane antigen 1) 유전자도 확인되었다. As a result of examining previous studies on PCR analysis technology for five types of malaria, 18S rRNA or COX1 region is generally used as a target gene in malaria detection in clinical samples, and the AMA1 (apical membrane antigen 1) gene was also identified.
18S rRNA 유전자는 특이성을 갖는 부위가 있었으나 3군데 모두 선행 연구들의 프라이머/프로브 부위였고, Tm값을 고려하여 선행 연구들의 프라이머/프로브 서열을 피해 디자인하기가 용이하지 않았다. The 18S rRNA gene had a site with specificity, but all three sites were primer/probe sites from previous studies, and considering the Tm value, it was not easy to design it to avoid primer/probe sequences from previous studies.
이 때문에 상대적으로 종간 특이적 검출이 가능할 것으로 예상된 COX1, AMA1을 타겟 유전자 후보로 하였다. 그 중 AMA1의 경우 다른 말라리아 4종과 구분이 가능한 부위가 한정적이며 AT가 많아서 최적의 Tm값을 확보할 수 있는 프로브 설계가 용이하지 않기 때문에 타겟 유전자에서 제외되었고, in silico 상 특이성이 확인된 COX1을 타겟 유전자로 선정하였다. For this reason, COX1 and AMA1, which were expected to enable relatively species-specific detection, were selected as target gene candidates. Among them, AMA1 was excluded from the target genes because the region that can be distinguished from the other four types of malaria is limited and it has many ATs, making it difficult to design a probe that can secure the optimal Tm value, and COX1, for which specificity was confirmed in silico was selected as the target gene.
COX1 유전자는 특이성을 갖는 부위가 존재하고 해당 지역 내의 선행연구들의 프라이머 및 프로브가 위치하지 않아 목표 유전자로 설정하고 프라이머 및 프로브 설계를 위한 염기서열 분석을 수행하였다. Since the COX1 gene has a region with specificity and primers and probes from previous studies were not located in the region, it was set as a target gene and sequence analysis was performed to design primers and probes.
Plasmodium falciparum을 특이적으로 검출하기 위해서 NCBI에 등록된 참조서열을 선정한 뒤, 이들의 다중서열 정렬 결과의 공통서열을 BLAST 하여 데이터베이스를 확장하였다. In order to specifically detect Plasmodium falciparum, reference sequences registered in NCBI were selected, and the database was expanded by BLASTing the common sequences of these multiple sequence alignment results.
COX1 부위의 공통서열을 BLAST한 결과로 유전적 상동성이 높은 말라리아 5종을 다중서열 정렬 결과 특이적 검출이 가능하며, 최적의 Tm 값이 확보도리 수 있는 부위가 발견되었으므로 이 구간에 프라이머 및 프로브를 설계하였다.As a result of BLASTing the consensus sequence of the COX1 region, specific detection of five types of malaria with high genetic homology was possible through multiple sequence alignment, and a region where the optimal Tm value could be secured was discovered, so primers and probes were used in this region. was designed.
TaqMan 프로브 제작 시 일반적으로 고려해야 할 사항으로 염기서열 길이, GC 비율 및 이합체의 형성 여부를 확인하였으며 5’ 말단에 G 염기가 있는 것은 프로브 선정에서 제외하였다.General factors to be considered when producing TaqMan probes were the base sequence length, GC ratio, and dimer formation, and those with a G base at the 5' end were excluded from probe selection.
프라이머의 Tm (melting temperature)값은 55~60℃, 길이는 18~29 mers, 프로브의 Tm은 68~70℃, 길이는 34 mers 이하의 범위로 디자인하였으며 Primer Express Software for Real-time PCR (Ver. 3.0.1)을 이용하여 Tm을 확인하였다(표 1).The primer's Tm (melting temperature) value was designed to be in the range of 55~60℃ and length of 18~29 mers, and the probe's Tm was designed to be in the range of 68~70℃ and length of less than 34 mers, and Primer Express Software for Real-time PCR (Ver. 3.0.1) was used to confirm Tm (Table 1).
1-2. Plasmodium vivax 검출용 프라이머/프로브 설계1-2. Primer/probe design for detection of Plasmodium vivax
P. falciparum과 동일한 방식으로 말라리아 5종 간의 18S rRNA 유전자를 검토한 결과, 최적의 성능을 위한 TaqMan 프로브의 위치를 확보할 수가 없었으므로 상대적으로 종간 특이적 검출이 가능할 것으로 예상된 AMA1에 프로브 및 프라이머 세트를 설계하였다. COX1 유전자에 디자인할 경우, P. falciparum와 유사한 부위를 공유하므로 프라이머에서 서로 교차반응이 일어날 시, 멀티플렉스 효율이 감소할 수 있기 때문에 타겟 유전자에서 제외 되었고, in silico 상 특이성이 확인된 AMA1을 타겟 유전자로 선정하였다.As a result of examining the 18S rRNA genes between five malaria species in the same manner as P. falciparum , it was not possible to secure the location of the TaqMan probe for optimal performance, so probes and primers were used in AMA1, which was expected to enable relatively species-specific detection. The set was designed. When designing on the COX1 gene, since it shares a similar region with P. falciparum, multiplex efficiency may decrease when cross-reaction occurs in the primers, so it was excluded from the target gene, and AMA1, for which specificity was confirmed in silico, was targeted. Gene was selected.
P. vivax의 AMA1 부위의 유전적으로 상동성이 높은 말라리아 5종의 서열을 다중 서열 정렬한 결과, P. vivax 특이적 검출이 가능하고 최적의 Tm 값이 확보될 수 있는 부위에 프라이머 및 프로브를 설계하였다.As a result of multiple sequence alignment of the sequences of five malaria species with high genetic homology to the AMA1 region of P. vivax , primers and probes were designed to enable specific detection of P. vivax and ensure optimal Tm values. did.
프라이머 및 TaqMan 프로브 제작 시 P. fapclparum과 동일한 방식으로 디자인하였으며, Primer Express Software for Real-time PCR (Ver. 3.0.1)을 이용하여 Tm을 확인하였다(표 2).Primers and TaqMan probes were designed in the same manner as for P. fapclparum , and Tm was confirmed using Primer Express Software for Real-time PCR (Ver. 3.0.1) (Table 2).
1-3. Plasmodium ovale 검출용 프라이머/프로브 설계1-3. Primer/probe design for detection of Plasmodium ovale
P. falciparum과 동일한 방식으로 말라리아 5종 간의 18S rRNA 유전자에 프라이머 프로브 설계가 용이하지 않았기 때문에 상대적으로 종간 특이적 검출이 가능할 것으로 예상된 COX1, AMA1을 타겟 유전자 후보로 하였다. 이 중 AMA1은 다른 말라리아 4종과 구분이 가능한 부위가 한정적이며 AT가 많아서 최적의 Tm값을 확보할 수 있는 프로브 설계가 용이하지 않았다. 이 때문에 in silico 상 특이성이 확인된 COX1을 타겟 유전자로 선정하였다.Since it was not easy to design primer probes for the 18S rRNA genes of the five malaria species in the same way as P. falciparum, COX1 and AMA1, which were expected to enable relatively species-specific detection, were used as target gene candidates. Among these, AMA1 had a limited distinguishable region from the other four types of malaria and had many ATs, making it difficult to design a probe that could secure the optimal Tm value. For this reason, COX1, whose specificity was confirmed in silico, was selected as the target gene.
P. ovale의 COX1 부위의 유전적으로 상동성이 높은 다른 말라리아 4종의 서열을 다중 서열 정렬한 결과, P. ovale 특이적 검출이 가능하고 최적의 Tm 값이 확보될 수 있는 부위에 프라이머 및 프로브를 설계하였다.As a result of multiple sequence alignment of the sequences of four other malaria species with high genetic homology to the COX1 region of P. ovale , primers and probes were applied to regions where P. ovale specific detection was possible and optimal Tm values could be secured. It was designed.
프라이머 및 TaqMan 프로브 제작 시 P. fapclparum과 동일한 방식으로 디자인하였으며, Primer Express Software for Real-time PCR (Ver. 3.0.1)을 이용하여 Tm을 확인하였다(표 3).Primers and TaqMan probes were designed in the same manner as for P. fapclparum , and Tm was confirmed using Primer Express Software for Real-time PCR (Ver. 3.0.1) (Table 3).
1-4. Plasmodium malariae 검출용 프라이머/프로브 설계1-4. Primer/probe design for Plasmodium malariae detection
P. falciparum과 동일한 방식으로 18S rRNA 유전자에서 프라이머 프로브 설계가 용이하지 않기 때문에 상대적으로 종간 특이적 검출이 가능할 것으로 예상된 COX1, AMA1을 타겟 유전자 후보로 하였다. 그 중 COX1 유전자에 디자인할 경우 P. malariae와 서로 교차반응이 일어날 시, 멀티플렉스 효율이 감소할 수 있기 때문에 타겟 유전자에서 제외 되었고, in silico 상 특이성이 확인된 AMA1을 타겟 유전자로 선정하였다.Since it is not easy to design primer probes in the 18S rRNA gene in the same way as for P. falciparum , COX1 and AMA1, which were expected to enable relatively species-specific detection, were selected as target gene candidates. Among them, when designing on the COX1 gene, multiplex efficiency may be reduced when cross-reactivity with P. malariae occurs, so it was excluded from the target gene, and AMA1, whose specificity was confirmed in silico, was selected as the target gene.
P. malariae의 AMA1 부위의 유전적으로 상동성이 높은 말라리아 5종의 서열을 다중 서열 정렬한 결과, P. malariae 특이적 검출이 가능하고 최적의 Tm 값이 확보될 수 있는 부위에 프라이머 및 프로브를 설계하였다.As a result of multiple sequence alignment of the sequences of five malaria species with high genetic homology to the AMA1 region of P. malariae , primers and probes were designed in the region where P. malariae specific detection is possible and optimal Tm values can be secured. did.
프라이머 및 TaqMan 프로브 제작 시 P. fapclparum과 동일한 방식으로 디자인하였으며 Primer Express Software for Real-time PCR (Ver. 3.0.1)을 이용하여 Tm을 확인하였다(표 4).Primers and TaqMan probes were designed in the same manner as for P. fapclparum, and Tm was confirmed using Primer Express Software for Real-time PCR (Ver. 3.0.1) (Table 4).
1-5. Plasmodium knowlesi 검출용 프라이머/프로브 설계1-5. Primer/probe design for detection of Plasmodium knowlesi
P. falciparum과 동일한 방식으로 18S rRNA 유전자에서 프라이머 프로브 설계가 용이하지 않기 때문에 상대적으로 종간 특이적 검출이 가능할 것으로 예상된 COX1, AMA1을 타겟 유전자 후보로 하였다. 그 중 COX1의 경우 다른 말라리아 4종과 구분이 가능한 부위가 한정적이며 AT가 많아서 최적의 Tm값을 확보할 수 있는 프로브 설계의 한계가 있어 타겟 유전자에서 제외 되었고, in silico 상 특이성이 확인된 AMA1을 타겟 유전자로 선정하였다.Since it is not easy to design primer probes in the 18S rRNA gene in the same way as for P. falciparum , COX1 and AMA1, which were expected to enable relatively species-specific detection, were selected as target gene candidates. Among them, in the case of COX1, the region that can be distinguished from the other four types of malaria is limited and there are many ATs, so there are limitations in designing probes that can secure optimal Tm values, so it was excluded from the target gene, and AMA1, whose specificity was confirmed in silico, was used. It was selected as the target gene.
P. knowlesi의 AMA1 부위의 유전적으로 상동성이 높은 말라리아 5종의 서열을 다중 서열 정렬한 결과, P. knowlesi 특이적 검출이 가능하고 최적의 Tm 값이 확보될 수 있는 부위에 프라이머 및 프로브를 설계하였다.As a result of multiple sequence alignment of the sequences of five malaria species with high genetic homology to the AMA1 region of P. knowlesi , primers and probes were designed in the region where P. knowlesi specific detection is possible and optimal Tm values can be secured. did.
프라이머 및 TaqMan 프로브 제작 시 P. fapclparum과 동일한 방식으로 디자인하였으며 Primer Express Software for Real-time PCR (Ver. 3.0.1)을 이용하여 Tm을 확인하였다(표 5).Primers and TaqMan probes were designed in the same manner as for P. fapclparum, and Tm was confirmed using Primer Express Software for Real-time PCR (Ver. 3.0.1) (Table 5).
1-6. 프라이머 및 프로브의 in silico 분석1-6. In silico analysis of primers and probes
말라리아 5종과 유사 증상의 원인이 될 수 있는 감염 원충 및 바이러스들과 교차 반응성을 확인하기 위하여 말라리아 5종 특이적 검출을 목적으로 설계한 프라이머 및 프로브들과의 서열 일치도를 분석하였다.To confirm cross-reactivity with infectious parasites and viruses that may cause symptoms similar to the five types of malaria, sequence identity with primers and probes designed for specific detection of the five types of malaria was analyzed.
선정한 원충 및 바이러스들과 프라이머 및 프로브 염기서열의 일치율이 낮아 다른 종과의 비특이적 증폭 시그널이 발생하지 않을 것으로 예측되었다(표 7-11).It was predicted that non-specific amplification signals with other species would not occur due to the low identity rate of primer and probe base sequences with the selected protozoa and viruses (Table 7-11).
서열 일치도는 80% 기준으로 이하일 경우, 결합 가능성이 낮아 증폭이 발생되지 않을 것으로 예상되고, 프라이머의 서열 일치도가 80~90%이고 프로브의 서열 일치도가 80% 미만이면 증폭산물이 생길 가능성은 있지만 프로브 결합이 생기지 않아 형광이 발생되지 않을 것으로 예상되었다. If the sequence identity is less than 80%, the possibility of binding is low and amplification is not expected to occur. If the sequence identity of the primer is 80-90% and the sequence identity of the probe is less than 80%, there is a possibility of an amplification product occurring, but the probe It was expected that no binding would occur and therefore no fluorescence would be generated.
<실시예 2> Multiplex Real-time RT-PCR 조건 최적화<Example 2> Optimization of Multiplex Real-time RT-PCR conditions
2-1. 제작된 프라이머 및 프로브 세트 성능확인2-1. Check the performance of the manufactured primer and probe set
P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae, P. knowlesi 및 내부 양성 대조군(Internal control; GAPDH) 검출용 프라이머 및 프로브의 올리고를 합성하였다(서열 16-Forward primer: aataaatcat aacctcccgc ttcgctctct; 서열번호 17-Reverse primer: aataaatcat aagctggcga cgcaaaaga; 서열번호 18-Probe: cctcctgttc gacagtcagc cgc). 이 때 프로브의 형광 종류는 다음과 같다(도 6).Oligos of primers and probes for detection of P. falciparum , P. vivax , P. ovale , P. malariae , P. knowlesi and internal positive control (GAPDH) were synthesized (SEQ ID NO: 16-Forward primer: aataaatcat aacctcccgc ttcgctctct; SEQ ID NO: 17-Reverse primer: aataaatcat aagctggcga cgcaaaaga; SEQ ID NO: 18-Probe: cctcctgttc gacagtcagc cgc). At this time, the fluorescence types of the probe are as follows (Figure 6).
합성된 프라이머 및 TaqMan 프로브 세트를 이용해 각 양성 시료(질병관리청으로부터 말라리아 5종에 대한 각 1개씩의 핵산을 제공 받았음)에 대한 Real-time PCR 증폭곡선을 확인한 결과, 각각 검출 타겟인 유전체 DNA에서만 정상적인 증폭곡선을 나타냈다(도 7).As a result of checking the real-time PCR amplification curve for each positive sample (one nucleic acid for each of the five types of malaria was provided by the Korea Disease Control and Prevention Agency) using the synthesized primer and TaqMan probe set, only the genomic DNA, which was the detection target, was normal. An amplification curve was shown (Figure 7).
Real-time PCR 반응액은 5 pmol/㎕로 희석한 정방향 및 역방향 프라이머 각 1 ㎕ 와 2 pmol/㎕로 희석한 TaqMan 프로브 1 ㎕, 2X Real-time PCR MasterMix (Kogenebiotech) 10 ㎕에 주형 DNA 5 ㎕ 및 TE 버퍼를 첨가하여 최종 볼륨을 20 ㎕로 제조하였다. 이때 사용한 주형 DNA은 질병관리청으로부터 제공받은 말라리아 5종(P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae, P. knowlesi)의 DNA로 각 1개씩 제공받았다. PCR 조건은 50℃에서 2분간 교차오염 방지를 위한 UDG 처리 과정을 진행하고 95℃에서 10분간 중합효소를 활성화시킨 후, 95℃ 15초 및 60℃ 1분을 1 반복으로 하여 총 40 반복을 수행하였다. 사용한 Real-time PCR 장비는 QuantStudio 5 Real-Time PCR Instrument (Thermo Fisher Scientific, USA)이고 설정은 base line 3 to 15, threshold 25,000였다.Real-time PCR reaction solution contains 1 μl each of forward and reverse primers diluted to 5 pmol/μl, 1 μl of TaqMan probe diluted to 2 pmol/μl, and 5 μl of template DNA in 10 μl of 2X Real-time PCR MasterMix (Kogenebiotech). and TE buffer was added to bring the final volume to 20 μl. The template DNA used at this time was DNA from five types of malaria ( P. falciparum , P. vivax , P. ovale , P. malariae , and P. knowlesi ) provided by the Korea Disease Control and Prevention Agency. PCR conditions include UDG treatment at 50℃ for 2 minutes to prevent cross-contamination, activating the polymerase at 95℃ for 10 minutes, and performing a total of 40 repetitions of 15 seconds at 95℃ and 1 minute at 60℃. did. The real-time PCR equipment used was QuantStudio 5 Real-Time PCR Instrument (Thermo Fisher Scientific, USA), and the settings were baseline 3 to 15 and threshold 25,000.
2-2. 프라이머/프로브 농도조건 확립2-2. Establishment of primer/probe concentration conditions
Multplex 조건 최적화 시 고려할 사항으로 각 타겟 별 증폭 곡선의 △Rn 값 및 linear phase의 기울기를 유사하게 조절하고, 각 TaqMan 프로브의 형광물질들의 교차반응 현상을 최소화하기 위해서 프로브의 농도를 조절할 것, 단일 프라이머/프로브 조건에서와 증폭 효율을 유사하게 맞출 것 등이 있다.Things to consider when optimizing multiplex conditions: adjust the △Rn value and slope of the linear phase of the amplification curve for each target to be similar, adjust the concentration of the probe to minimize the cross-reaction phenomenon of the fluorescent substances of each TaqMan probe, and single primer. /The amplification efficiency should be similar to that of the probe conditions.
최적화된 프라이머/프로브 농도 조건 및 PCR 저해 확인 시험 데이터는 도8 내지 11과 같으며, 실험 결과 단일 프라이머/프로브 반응액과 다중 프라이머/프로브 반응액에서의 각 타겟 DNA 검출 Ct 값에 큰 차이가 없으며 증폭 곡선 모양에도 유의미한 차이점이 없었다. The optimized primer/probe concentration conditions and PCR inhibition test data are shown in Figures 8 to 11. As a result of the experiment, there was no significant difference in the Ct value of each target DNA detection in the single primer/probe reaction solution and the multiple primer/probe reaction solution. There were no significant differences in the shape of the amplification curve.
P. falciparum 및 P. vivax 의 단일 프라이머 프로브 세트 반응액과 두 가지의 프라이머/프로브 세트가 혼합된 멀티플렉스 반응액 간에 증폭 곡선의 효율을 Ct 값과 증폭곡선 모양을 통해 비교한 결과, 각 타겟 DNA 검출 Ct 값에 큰 차이가 없으며 증폭 곡선 모양에도 유의미한 차이가 없음을 확인하였음(도 8, 9).As a result of comparing the efficiency of the amplification curve between the single primer probe set reaction solution of P. falciparum and P. vivax and the multiplex reaction solution mixed with two primer/probe sets through Ct value and amplification curve shape, each target DNA It was confirmed that there was no significant difference in the detection Ct value and no significant difference in the shape of the amplification curve (Figures 8 and 9).
P. ovale, P. malariae 및 P. knowlesi 의 단일 프라이머 프로브 세트 반응액과 세 가지의 프라이머/프로브 세트가 혼합된 멀티플렉스 반응액 간에 증폭 곡선의 효율을 Ct 값과 증폭곡선 모양을 통해서 비교한 결과, 각 타겟 DNA 검출 Ct 값에 큰 차이가 없으며 증폭 곡선 모양에도 유의미한 차이가 없음을 확인하였음(도 10, 11).The result of comparing the amplification curve efficiency between the single primer probe set reaction solution of P. ovale , P. malariae and P. knowlesi and the multiplex reaction solution mixed with three primer/probe sets through Ct value and amplification curve shape. , it was confirmed that there was no significant difference in the detection Ct value of each target DNA and no significant difference in the shape of the amplification curve (Figures 10 and 11).
2-3. 내부 양성 대조군 첨가2-3. Addition of internal positive control
내부 양성 대조군이 첨가된 최종 프라이머/프로브 농도 조건 및 PCR 저해 확인 시험 데이터는 도 12-15와 같으며 내부 양성 대조군 첨가 여부에 따른 각 타겟 DNA 검출 Ct 값에 큰 차이가 없으며 증폭 곡선 모양에도 유의미한 차이점이 없었음. The final primer/probe concentration conditions and PCR inhibition confirmation test data with the addition of the internal positive control are as shown in Figures 12-15. There is no significant difference in the detection Ct value of each target DNA depending on whether the internal positive control is added, and there is a significant difference in the shape of the amplification curve. There was no such thing.
P. falciparum 및 P. vivax 의 두 가지의 프라이머/프로브 세트가 혼합된 멀티플렉스 반응액과 내부 양성 대조군 프라이머/프로브 세트가 첨가된 반응액 간에 증폭 곡선의 효율을 Ct 값과 증폭곡선 모양을 통해서 비교한 결과, 각 타겟 DNA 검출 Ct 값에 큰 차이가 없으며 증폭 곡선 모양에도 유의미한 차이가 없음을 확인하였음(도 12, 13).Comparison of amplification curve efficiency between the multiplex reaction solution containing two primer/probe sets of P. falciparum and P. vivax and the reaction solution containing the internal positive control primer/probe set through Ct value and amplification curve shape. As a result, it was confirmed that there was no significant difference in the detection Ct value of each target DNA and no significant difference in the shape of the amplification curve (FIGS. 12 and 13).
P. ovale, P. malariae 및 P. knowlesi 의 세 가지의 프라이머/프로브 세트가 혼합된 멀티플렉스 반응액과 내부 양성 대조군 프라이머/프로브 세트가 첨가된 반응액 간에 증폭 곡선의 효율을 Ct 값과 증폭곡선 모양을 통해서 비교한 결과, 각 타겟 DNA 검출 Ct 값에 큰 차이가 없으며 증폭 곡선 모양에도 유의미한 차이가 없음을 확인하였다(도 14, 15).The efficiency of the amplification curve between the multiplex reaction solution mixed with the three primer/probe sets of P. ovale , P. malariae and P. knowlesi and the reaction solution to which the internal positive control primer/probe set was added was measured by Ct value and amplification curve. As a result of comparing shapes, it was confirmed that there was no significant difference in the detection Ct value of each target DNA and no significant difference in the shape of the amplification curve (FIGS. 14 and 15).
2-4. 마스터믹스 선정2-4. Master mix selection
최적의 성능을 확보할 수 있는 마스터믹스를 선정하기 위해서 동일한 프라이머/프로브 혼합 조건을 이용해 3종류 마스터믹스 간의 성능 비교 테스트를 수행하였다.In order to select a master mix that can ensure optimal performance, a performance comparison test was performed between three types of master mixes using the same primer/probe mixing conditions.
3종류 마스터믹스 반응액은 각 농도로 혼합한 프라이머 및 프로브 시약 5 ㎕, ２X Real-time MasterMix 10 ㎕와 단계적으로 Human genomic DNA로 희석한 DNA 5 ㎕를 첨가하여 최종 볼륨을 20 ㎕로 제조하였다(표 6, 7). PCR 조건은 50℃에서 2분간 교차오염 방지를 위한 UDG 처리 과정을 진행하고 95℃에서 10분간 중합효소를 활성화시킨 후, 95℃ 15초 및 60℃ 1분을 1 반복으로 하여 총 40 반복을 수행하였다. 사용한 Real-time PCR 장비는 QuantStudio 5 Real-Time PCR Instrument (Thermo Fisher Scientific, USA)이고 설정은 base line 3 to 15, threshold 25,000였다.The three types of master mix reaction solutions were prepared by adding 5 ㎕ of primer and probe reagents mixed at each concentration, 10 ㎕ of ２ Tables 6 and 7). PCR conditions include UDG treatment at 50℃ for 2 minutes to prevent cross-contamination, activating the polymerase at 95℃ for 10 minutes, and performing a total of 40 repetitions of 15 seconds at 95℃ and 1 minute at 60℃. did. The real-time PCR equipment used was QuantStudio 5 Real-Time PCR Instrument (Thermo Fisher Scientific, USA), and the settings were baseline 3 to 15 and threshold 25,000.
P. falciparum 양성 시료를 이용한 마스터믹스 별 성능 비교 시험에서 2번이 1, 3 번과 비교 시 Ct 값이 밀리고, 성능이 떨어지는 것이 확인되었다. P. vivax 양성 시료를 이용한 마스터믹스 별 성능 비교 시험에서도 2번이 1, 3 번과 비교 시 민감도가 10배 이상 차이나는 것이 확인되었다(도 16, 17). In a performance comparison test for each master mix using P. falciparum positive samples, it was confirmed that number 2 had a lower Ct value and poorer performance when compared to number 1 and 3. In a performance comparison test for each master mix using P. vivax positive samples, it was confirmed that the sensitivity of No. 2 was more than 10 times different from No. 1 and No. 3 (Figures 16 and 17).
P. ovale 양성 시료를 이용한 MasterMix 별 성능 비교 시험에서는 2, 3번이 1번과 비교 시 민감도가 10배 이상 차이나는 것이 확인되었다. P. malariae 양성 시료를 이용한 MasterMix 별 성능 비교 시험에서 2번이 1, 3 번과 비교 시 Ct 값이 밀리는 것이 확인되었다. P. knowlesi 올리고를 이용한 MasterMix 별 성능 비교 시험에서는 Mastermix에 따른 Ct값과 Rn값 차이가 없었다(도 18-20). In a performance comparison test for each MasterMix using P. ovale positive samples, it was confirmed that the sensitivity of Nos. 2 and 3 was more than 10 times different from No. 1. In a performance comparison test for each MasterMix using P. malariae positive samples, it was confirmed that the Ct value of No. 2 was lower than No. 1 and No. 3. In a performance comparison test for each MasterMix using P. knowlesi oligo, there was no difference in Ct and Rn values depending on the Mastermix (FIGS. 18-20).
마스터믹스 별 성능 비교 결과를 종합하였을 때, 2번 시약과 비교해 1,3번의 성능이 우수한 것으로 판단되었다. 1, 3번 마스터믹스 사용 조건에서의 Ct 값이 유사하게 검출이 되었으나 3번 시약에 UDG가 포함되지 않기 때문에 UDG까지 포함된 1번 마스터믹스를 본 발명의 주성분으로 최종 결정하였다.When combining the performance comparison results for each master mix, the performance of reagents 1 and 3 was judged to be superior compared to reagent 2. Similar Ct values were detected under the conditions of using master mixes 1 and 3, but since reagent No. 3 did not contain UDG, master mix No. 1, which also included UDG, was finally decided as the main ingredient of the present invention.
최정 선정된 마스터믹스 조성과 확립된 프라이머 및 프로브 농도는 다음과 같다(표 8-10).The final selected master mix composition and established primer and probe concentrations are as follows (Table 8-10).
No. 1Mastermix
No. One
<실시예 3> 양성표준물질 제작<Example 3> Production of positive standard material
확립된 P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae, P. knowlesi 동시 검출용 multiplex Real-time PCR 시스템의 양성표준물질을 제작하였으며 사용 목적은 검출한계 및 정밀도 시험에 표준물질로 사용하고, 키트 제작 시 프라이머와 프로브 염기서열 및 효소 등의 시약 구성물들이 정상적으로 작동하는지 여부를 확인하는 양성 대조군으로써 활용하였다.A positive standard for the established multiplex real-time PCR system for simultaneous detection of P. falciparum , P. vivax , P. ovale , P. malariae , and P. knowlesi was produced. The purpose of use was to use it as a standard for detection limit and precision tests. When producing the kit, it was used as a positive control to check whether reagent components such as primers, probe base sequences, and enzymes were operating normally.
양성표준물질의 성상은 각 프라이머의 증폭 서열을 포함한 플라스미드 DNA이며 이의 제조 방법은 다음과 같다.The nature of the positive standard material is plasmid DNA containing the amplification sequence of each primer, and its preparation method is as follows.
제공받은 양성시료를 본 키트의 프라이머로 증폭한 후 pGEM T-Easy Vector System (Promega, Madison, USA)의 사용법에 따라 벡터 내에 삽입하였다(표 11). 재조합된 DNA를 DH5a (Intron, Korea) 세포에 도입하고 배양한 후 플라스미드 DNA를 추출하였다.The provided positive sample was amplified with the primers of this kit and then inserted into the vector according to the instructions for pGEM T-Easy Vector System (Promega, Madison, USA) (Table 11). The recombinant DNA was introduced into DH5a (Intron, Korea) cells, cultured, and plasmid DNA was extracted.
재조합된 플라스미드 DNA를 시퀀싱 전문 업체에 의뢰하여 M13 프라이머로 양방향 시퀀스 분석을 진행한 후 NCBI (National center for Biotechnology information)의 Global Align tool을 또는 Geneious 프로그램을 이용하여 삽입된 프라이머 및 프로브의 매치 여부를 확인하였다(data not shown).Request the recombinant plasmid DNA to a sequencing company, conduct bidirectional sequence analysis using M13 primers, and then check whether the inserted primers and probes match using the Global Align tool of NCBI (National center for Biotechnology information) or the Geneious program. (data not shown).
염기서열 분석이 완료된 플라스미드는 제한효소를 처리하여 linearization 시켰고, NanoDrop Spectrophotometer를 이용하여 플라스미드의 농도를 측정하였다. 사용하는 제한 효소 제품 및 조성은 표 12, 13과 같다. 37℃에서 1시간 반응한 뒤, 65℃에서 20분간 방치하여 효소를 불활성시켰다. The plasmid for which base sequence analysis was completed was linearized by treatment with restriction enzymes, and the concentration of the plasmid was measured using a NanoDrop Spectrophotometer. The restriction enzyme products and compositions used are shown in Tables 12 and 13. After reacting at 37°C for 1 hour, the enzyme was inactivated by standing at 65°C for 20 minutes.
효소 처리한 DNA를 Qiaquick PCR purification Kit (Qiagen, Germany)를 사용하여 DNA purification을 제품 매뉴얼에 따라서 수행하였다. DNA 정량은 정제가 완료된 DNA를 NanoDrop Spectrophotometer를 이용하여 플라스미드의 농도를 측정하였고, 측정된 DNA 농도와 염기서열 길이를 이용하여 카피 수를 계산하였다. DNA purification of the enzyme-treated DNA was performed using the Qiaquick PCR purification Kit (Qiagen, Germany) according to the product manual. For DNA quantification, the plasmid concentration was measured using the purified DNA using a NanoDrop Spectrophotometer, and the copy number was calculated using the measured DNA concentration and base sequence length.
DNA 카피 수 = (DNA 농도 x 6.022 x 1023) / {플라스미드 사이즈 (벡터 사이즈 + 증폭산물 사이즈) x 1 x 109 x 650}DNA copy number = (DNA concentration x 6.022 x 10 23 ) / {Plasmid size (vector size + amplification product size) x 1 x 10 9 x 650}
합성된 양성표준 플라스미드 DNA를 Real-time PCR로 확인, 증폭 곡선을 확인하였다. The synthesized positive standard plasmid DNA was confirmed by real-time PCR and the amplification curve was confirmed.
키트 제작 시 양성대조군을 제작하였다(도 22). 제작된 양성대조군은 Ct 값 23±3 범주가 되도록 제작 완료하였다. When producing the kit, a positive control group was produced (FIG. 22). The positive control group produced was completed so that the Ct value was in the 23±3 range.
<실시예 4> 성능평가<Example 4> Performance evaluation
4-1. 분석적 특이도(Analytical specificity)4-1. Analytical specificity
개발한 multiplex Real-time PCR 시스템의 특이성을 교차반응시험을 통해 평가하였다. 유사한 증상의 원인이 될 수 있는 감염 원충과 바이러스 및 Human genomic DNA를 포함한 다양한 생물 종의 핵산을 이용하여 Real-time PCR을 수행한 후 각각의 시료에 대한 검출 결과를 분석하였다. 시험에 사용한 물질은 질병관리청, NCCP 국가병원체자원은행, ATCC (American Type Culture Collection)에서 분양 받거나 Vircell S.L (Santafe, Spain)에서 핵산을 구입하였다.The specificity of the developed multiplex real-time PCR system was evaluated through a cross-reaction test. Real-time PCR was performed using nucleic acids from various biological species, including infectious protozoa, viruses, and human genomic DNA, which can cause similar symptoms, and the detection results for each sample were analyzed. Materials used in the test were distributed by the Korea Disease Control and Prevention Agency, NCCP National Pathogen Resource Bank, and ATCC (American Type Culture Collection), or nucleic acids were purchased from Vircell S.L (Santafe, Spain).
교차반응 시험 결과 타겟인 P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae, P. knowlesi 에서만 각각의 형광 채널에서 검출 반응이 일어났고 다른 종의 핵산에서는 검출반응이 일어나지 않았다(도 23, 24). 또한 IC는 질병관리청에서 제공한 핵산과 Human genomic DNA에서만 증폭됨을 확인하였다.As a result of the cross-reaction test, a detection reaction occurred in each fluorescence channel only for the targets P. falciparum , P. vivax , P. ovale , P. malariae , and P. knowlesi, but no detection reaction occurred for nucleic acids of other species (Figure 23, 24). Additionally, it was confirmed that IC was amplified only from nucleic acids and human genomic DNA provided by the Korea Disease Control and Prevention Agency.
4-2. 검출한계(limit of detection) 측정 4-2. Limit of detection measurement
검출한계 확인 시험 시 제작한 양성표준물질을 음성검체를 이용해 10배씩(105~100 copies/㎕) 순차적으로 희석하여 사용하였다. 직선성이란 검체 중에 함유되어 있는 분석 대상물질(target analyte)의 양에 정비례하는 결과를 제공할 수 있는 능력을 말하며 시험 기준은 최소 5농도 이상 단계 희석한 시험물질을 이용하며 표준곡선을 작성하여 R2값이 0.99 이상일 경우 유효하다고 판단한다.The positive standard material prepared during the detection limit confirmation test was sequentially diluted 10 times (10 5 to 10 0 copies/㎕) using negative samples. Linearity refers to the ability to provide results that are directly proportional to the amount of target analyte contained in the sample. The test standard is to use test substances diluted in steps of at least 5 concentrations or more and create a standard curve to determine R 2 If the value is 0.99 or higher, it is considered valid.
측정 Ct 값과 농도를 이용해 표준곡선을 작성한 결과 모두 R2값이 0.99 이상이었고, slope로부터 계산된 PCR 효율도 90%~100%에 근접한 것으로 나타나 시스템의 직선성과 효율성을 확인하였다(도 25-33).As a result of creating a standard curve using the measured Ct value and concentration, all R 2 values were above 0.99, and the PCR efficiency calculated from the slope was also close to 90% to 100%, confirming the linearity and efficiency of the system (Figures 25-33 ).
[계산식] PCR Efficiency = 10(-1/slope)-1[Calculation Formula] PCR Efficiency = 10 (-1/slope) -1
Malaria multiplex Ⅰ kit에서 타겟 별 검출한계는 P. falciparum, P. vivax, IC 가 모두 1.0 x 101 copies/㎕ 으로 확인 되었고, Malaria multiplex Ⅱ kit에서 타겟 별 검출한계는 P. ovale, P. knowlesi, IC 가 1.0 x 101 copies/㎕ 이고, P. malariale 가 1.0 x 100 copy/㎕으로 확인 되었음(도 25-33).In the Malaria multiplex Ⅰ kit , the detection limit for each target was confirmed to be 1.0 IC was 1.0
4-3. 정밀도(Precision)4-3. Precision
정밀도는 규정된 조건 하에서 얻어진 독립적인 검사 결과들 가운데 일치도의 근접성을 측정하는 것으로써 시험법의 정밀성은 표준편차(Standard deviation, SD) 또는 변동계수(Coefficient of variation, CV)로 표시하며 CV 5% 미만일 경우 정밀성이 확보된다고 판단할 수 있다. 본 발명 시약의 정밀도는 날짜 간(between day), 시험 간(between run) 반복성으로 평가하였다.Precision measures the closeness of agreement among independent test results obtained under specified conditions. The precision of the test method is expressed as standard deviation (SD) or coefficient of variation (CV), and CV is 5%. If it is less than that, it can be judged that precision is secured. The precision of the reagent of the present invention was evaluated by repeatability between days and between runs.
각 타겟 별 3가지 농도의 양성표준물질을 시험하였으며 분석적 민감도 시험 결과를 바탕으로 저농도(low positive), 중간 농도(middle positive) 및 고농도(high positive)를 각각 설정하였다. 타겟 별 시료를 5일 동안 1일 1회, 시료의 농도 당 2반복 시험하였다.Three concentrations of positive standard substances were tested for each target, and low positive, middle positive, and high positive concentrations were set based on the analytical sensitivity test results. Samples for each target were tested once a day for 5 days, 2 times per concentration of the sample.
정밀도 시험 결과 산출된 검사 날짜 간(between-day), 검사 간(between-run) CV (%)는 5% 미만으로 산출되어 본 시약 시스템의 정밀성을 입증하였다(도 37 및 38 참조).As a result of the precision test, the calculated between-day and between-run CV (%) was calculated to be less than 5%, proving the precision of this reagent system (see Figures 37 and 38).
4-4. 판정기준치 설정4-4. Judgment standard setting
본 발명 시약의 판정기준치 설정은 양성으로 확인된 검체(질병관리청에서 제공한 5종의 양성검체를 사용, IC의 경우 copy수를 알고 있는 양성 대조군을 사용하였음)를 이용해 시험하였으며, 1차 단계적 10배씩 단계적 희석 테스트를 수행하고, 불검출 나오는 단계 바로 전 단계를 2차 실험에 사용하였다. The criteria for establishing the reagent of the present invention were tested using samples confirmed to be positive (five types of positive samples provided by the Korea Disease Control and Prevention Agency were used; for IC, a positive control with known copy number was used), and the first step was 10. A stepwise dilution test was performed doubly, and the step immediately before the non-detection step was used in the second experiment.
2차 실험에서는 선정된 단계를 포함해서 4/5, 2/5 단계로 추가 희석하여 총 3단계 이상에서 각각 40회 반복 실험을 수행하였다. 선정된 최종 단계 구간에서 50%는 양성, 50%는 음성 결과를 보이는 농도에서의 Ct값을 판정 기준치로 선정하였다(결과 생략).In the second experiment, the selected stage was further diluted to 4/5 and 2/5 stages, and a total of 40 repetitions were performed at a total of 3 stages or more. In the selected final stage section, the Ct value at a concentration where 50% of the results were positive and 50% of the results were negative was selected as the criterion value (results omitted).
4-5. 기존 진단법과의 성능 비교 평가4-5. Comparative evaluation of performance with existing diagnostic methods
기존 진단법과의 성능 비교 평가는 질병관리청에서 제공받은 양성시료 5개 핵산을 이용해 시험하였으며, 기존 진단법의 PCR 조성 및 온도 조건은 질병관리청에서 제공한 조건으로 진행하였다. 기존 진단법은 Nested PCR로 1차 PCR의 산물 1 ㎕를 주형으로 이용하여 2차 PCR을 수행하였다(표 14는 말라리아 기존진단법 프라이머; 표 15는 말라리아 기존진단법 1차 PCR 조성; 표 16은 말라리아 기존진단법 1차 PCR 조건; 표 17은 말라리아 기존진단법 2차 PCR 조성; 표 18(rVIV1/2, rFAL1/2, rMAL1/2), 19(rOVA1/2)는 말라리아 기존진단법 2차 PCR 조건).The performance comparative evaluation with existing diagnostic methods was tested using five positive sample nucleic acids provided by the Korea Disease Control and Prevention Agency, and the PCR composition and temperature conditions of the existing diagnostic method were conducted under the conditions provided by the Korea Disease Control and Prevention Agency. The existing diagnostic method is Nested PCR, and a second PCR was performed using 1 ㎕ of the product of the first PCR as a template (Table 14 shows primers for the existing malaria diagnosis method; Table 15 shows the composition of the first PCR for the existing malaria diagnosis method; Table 16 shows the composition of the first PCR for the existing malaria diagnosis method. 1st PCR conditions; Table 17 is the 2nd PCR composition of the existing malaria diagnosis method; Tables 18 (rVIV1/2, rFAL1/2, rMAL1/2), 19 (rOVA1/2) are the 2nd PCR conditions of the existing malaria diagnosis method.
P. falciparum, P. ovale, P. malariae 성능평가 결과, 기존 진단법 보다 본 과제 개발품의 성능이 우수하고(도 38), P. vivax, P. knowlesi 의 경우는 성능이 동등한 것으로 확인되었다(도 39). 종합적으로 본 과제 개발품이 기존진단법과 비교 시 성능이 동등 이상을 최종 확인하였다.As a result of the performance evaluation of P. falciparum , P. ovale , and P. malariae , the performance of the product developed for this project was superior to the existing diagnostic method (Figure 38), and in the case of P. vivax and P. knowlesi, the performance was confirmed to be equivalent (Figure 39) ). Overall, it was confirmed that the product developed for this project had equal or better performance when compared to existing diagnostic methods.
<110> KCDC <120> Primer set for the detection of 5 species of malaria <130> M21-0000 <160> 18 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P. falciparum forward primer <400> 1 atgtaatttc tactaattat tgcagaaatc 30 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P. falciparum reverse primer <400> 2 ctagtatcaa cttctaaacc agtagtg 27 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P. falciparum probe <400> 3 ttgctatggg atgtatagct gttttaggaa gc 32 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P. vivax forward primer <400> 4 attatccgag ttgaatgcac cc 22 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P. vivax reverse primer <400> 5 ctcagatcaa ccaactcagt atgaaga 27 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P. vivax probe <400> 6 ctctcggttg ttttgtctaa acccttgttg t 31 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P. ovale forward primer <400> 7 ttttggtatt actcatagtt catctt 26 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P. ovale reverse primer <400> 8 tgtatcatgt aatgctatat caatagc 27 <210> 9 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P. ovale probe <400> 9 ctttcggagg aactacaggt gttattttag gt 32 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P. malariae forward primer <400> 10 gaaaacggac aattttaagc attatg 26 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P. malariae reverse primer <400> 11 gacccataaa ccaaatttag caaca 25 <210> 12 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P. malariae probe <400> 12 agtgattggg atgttaagtg ccctcgtaaa ag 32 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P. knowlesi forward primer <400> 13 aacaacagcg ttatctcacc ctc 23 <210> 14 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P. knowlesi reverse primer <400> 14 cactgtacag attcatattt ctcgactg 28 <210> 15 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P. knowlesi probe <400> 15 caatgaattt ccatgcagca tatacaaaga tg 32 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Internal control(IC) forward primer <400> 16 aataaatcat aacctcccgc ttcgctctct 30 <210> 17 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Internal control(IC) reverse primer <400> 17 aataaatcat aagctggcga cgcaaaaga 29 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Internal control(IC) probe <400> 18 cctcctgttc gacagtcagc cgc 23 <110> KCDC <120> Primer set for the detection of 5 species of malaria <130>M21-0000 <160> 18 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P. falciparum forward primer <400> 1 atgtaatttc tactaattat tgcagaaatc 30 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P. falciparum reverse primer <400> 2 ctagtatcaa cttctaaacc agtagtg 27 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P. falciparum probe <400> 3 ttgctatggg atgtatagct gttttaggaa gc 32 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P. vivax forward primer <400> 4 attatccgag ttgaatgcac cc 22 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P. vivax reverse primer <400> 5 ctcagatcaa ccaactcagt atgaaga 27 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P. vivax probe <400> 6 ctctcggttg ttttgtctaa acccttgttg t 31 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P. ovale forward primer <400> 7 ttttggtatt actcatagtt catctt 26 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P. ovale reverse primer <400> 8 tgtatcatgt aatgctatat caatagc 27 <210> 9 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P. ovale probe <400> 9 ctttcgggagg aactacaggt gttattttag gt 32 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P. malariae forward primer <400> 10 gaaaacggac aattttaagc attatg 26 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P. malariae reverse primer <400> 11 gacccataaa ccaaatttag caaca 25 <210> 12 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P. malariae probe <400> 12 agtgattggg atgttaagtg ccctcgtaaa ag 32 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P. knowlesi forward primer <400> 13 aacaacagcg ttatctcacc ctc 23 <210> 14 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P. knowlesi reverse primer <400> 14 cactgtacag attcatattt ctcgactg 28 <210> 15 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P. knowlesi probe <400> 15 caatgaattt ccatgcagca tatacaaaga tg 32 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Internal control (IC) forward primer <400> 16 aataaatcat aacctcccgc ttcgctctct 30 <210> 17 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Internal control (IC) reverse primer <400> 17 aataaatcat aagctggcga cgcaaaaga 29 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Internal control (IC) probe <400> 18 cctcctgttc gacagtcagc cgc 23
Claims (8)
사일열 말라리아(Plasmodium malariae)에 대한 서열번호 10을 포함하는 정방향 프라이머; 서열번호 11을 포함하는 역방향 프라이머; 및 서열번호 12를 포함하는 프로브, 및
원숭이열 말라리아(Plasmodium knowlesi)에 대한 서열번호 13을 포함하는 정방향 프라이머; 서열번호 14를 포함하는 역방향 프라이머; 및 서열번호 15를 포함하는 프로브를 포함하는 말라리아 검출용 프라이머 세트 및 프로브 조성물Forward primer containing SEQ ID NO: 7 for Plasmodium ovale ; Reverse primer comprising SEQ ID NO: 8; And a probe comprising SEQ ID NO: 9,
Forward primer containing SEQ ID NO: 10 for Plasmodium malariae ; Reverse primer comprising SEQ ID NO: 11; and a probe comprising SEQ ID NO: 12, and
Forward primer containing SEQ ID NO: 13 for monkey fever malaria ( Plasmodium knowlesi ); Reverse primer comprising SEQ ID NO: 14; and a primer set and probe composition for malaria detection comprising a probe comprising SEQ ID NO: 15.
제1항의 프라이머 세트를 사용하여 실시간 중합효소 연쇄반응으로 증폭하는 단계; 및
실시간 증폭 결과를 형광으로 획득하는 단계;를 포함하는 말라리아 종 감별방법Preparing an isolated DNA sample;
Amplifying by real-time polymerase chain reaction using the primer set of claim 1; and
Method for differentiating malaria species, including obtaining real-time amplification results using fluorescence.
The method of claim 7, wherein the sample is separated from feces, blood, cerebrospinal fluid, serum, sputum, urine, or biological tissue.
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Patent Citations (1)
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Non-Patent Citations (1)
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